JP2010515464A - Hiv細胞表面受容体の標的化不活性化のための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
HIVに対する細胞表面受容体の標的化突然変異誘発のための組成物およびそれらの使用方法を本発明において提供する。該組成物は、標的部位において配列特異的に二重らせんDNAに結合して三本鎖構造を形成する三重らせん形成性分子を含む。該三重らせん形成性分子は三重らせん形成性オリゴヌクレオチド(TFO)またはペプチド核酸(PNA)でありうる。該三重らせん形成性分子は、供与オリゴヌクレオチドと組合せて使用された場合に哺乳類細胞において部位特異的相同組換えを誘導するのに有用である。該三重らせん形成性分子は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)に対する細胞表面受容体をコードする遺伝子内の又は該遺伝子に隣接した部位を標的化する。この結合は供与オリゴヌクレオチドの相同組換えを刺激して、HIV細胞表面受容体遺伝子における突然変異を引き起こし、該突然変異は、HIVに結合し該細胞へのその輸送を可能にするコード化受容体の能力における1以上の欠損をもたらす。開示されている組成物を使用するHIV感染のエクスビボおよびインビボ予防および治療方法も提供する。
Description
本開示は、全般的には、HIVの細胞表面受容体をコードするDNAに結合する組成物、およびこれらの組成物を使用する方法の分野に関する。
HIV−1は、レンチウイルス属に属するレトロウイルス科のメンバーである。レトロウイルス科は、点突然変異およびゲノム間組換えの両方により分離体の多様性をもたらすエラー高頻発ウイルス逆転写酵素によりdsDNAに変換される2つのプラス鎖RNAを含有する包膜ウイルスである。HIV−1分離体は3つの群、すなわち、M(主要/中心的)、N(非M、非O/新規)およびO(アウトライアー)に分けられ、これらのうち、示唆されるとおり、M群が最も一般的である。M群は幾つかのサブタイプまたはクレード(A〜D、F〜H、JおよびK)に細分され、これらのうち、Bが西洋では最も一般的であり、Cが、インド、中国およびサハラ以南のアフリカにおいて主として見出される最も優勢なサブタイプである。残りのサブタイプ、および幾つかの異なるサブタイプ、いわゆる循環組換え形態(CRF)の特性を有するHIV−1変異体は、アフリカおよび世界のその他の地域に散在している。
HIV−1は外部エンベロープ糖タンパク質gp120および膜貫通糖タンパク質gp41を含有する。これらのタンパク質は、ゴルジ装置を通る輸送中にフリン様酵素による高グリコシル化前駆体タンパク質gp160の切断により生じる。細胞表面に輸送されたら、三量体gp120/gp41エンベロープ糖タンパク質スパイクが、新たなHIV−1粒子の放出のために出芽ウイルス内に取り込まれる。外部エンベロープ糖タンパク質gp120が、潜在的標的細胞の表面上の細胞膜に包埋されている一次受容体CD4に結合すると、それぞれの新たな感染周期が開始する。gp120とCD4との相互作用の後、Envにおける一連のコンホメーション変化が生じて、該スパイクがその受容体(通常はCCR5またはCXCR4)と相互作用するのを可能にする一過性結合部位の露出が生じる。これが今度は、gp41がその融合ペプチドを標的細胞膜内に挿入してプレヘアピン構造を形成するのを可能にする更なるコンホメーション変化を促し、ついで該プレヘアピン構造は、エネルギー的に安定な6ヘリックス束状構造へと崩壊し、ウイルス−細胞膜融合および標的細胞内へのHIV−1コアの侵入を導く。この一連の事象は中性pHで細胞膜において生じる。
最近、治療状況を潜在的に変化させうるHIV療法の新規クラスとして、侵入インヒビターが登場している。これらの薬物は、T細胞内へのHIVの侵入に必要な細胞表面受容体、例えば、CCR5遺伝子によりコードされるタンパク質を遮断する。CCR5ケモカイン受容体は、初期急性HIV感染のほとんどのケースをもたらすR5指向性HIV−1株に対する主要共受容体である。CCR5遺伝子内にホモ接合不活性化突然変異(デルタ32突然変異と称される)を有する個体は、R5指向性HIV−1株による感染に対してほぼ完全に抵抗性であり、他の有意な悪影響を伴わない。エイズに罹患しながら現在生きている4000万を超える人々に関して、産業アナリストは、CCR5を標的化する療法の成功は年間500〜700MMドルの売上高をもたらすと推定している。多数の製薬会社が、該受容体タンパク質を遮断する侵入インヒビター薬を開発しようと現在試みているが、毒性、効力および薬物耐性により進展が阻まれている。
かなり以前にFelsenfeldら,J.Am.Chem.Soc.79:2023(1957)により三本鎖DNAが初めて観察されて以来、オリゴヌクレオチド指向性三重らせん形成が分子生物学における重要な手段として登場している。現在の知見は、オリゴヌクレオチドは、二重らせんDNA内のポリプリン/ポリピリミジン伸長における主溝において、配列特異的に、DNAの第3鎖として結合しうることを示唆している。MoserおよびDervan,Science 238:645(1987),Praseuthら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:1349(1988)ならびにMergnyら,Biochemistry 30:9791(1991)に記載されているとおり、1つのモチーフにおいて、ポリピリミジンオリゴヌクレオチドは該二重らせん内のプリン鎖に平行な方向で結合する。BealおよびDervan,Science 251:1360(1991)に記載されているとおり、代わりのプリンモチーフにおいては、ポリプリン鎖が該プリン鎖に逆平行で結合する。三重らせん形成の特異性は、水素結合により形成される塩基トリプレット(該プリンモチーフ内のAATおよびGGC)から生じ、ミスマッチは該三重らせんを不安定化する(Mergnyら,Biochemistry 30:9791(1991)ならびにBealおよびDervan,Nuc.Acids Res.11:2773(1992)に記載されている)。
三重らせん形成性オリゴヌクレオチド(TFO)は幾つかの分子生物学技術に有用である。例えば、DNA結合性タンパク質を遮断し、インビトロおよびインビボの両方で転写を遮断するために、遺伝子プロモーター内の部位に結合するよう設計された三重らせん形成性オリゴヌクレオチドが使用されている(Maherら,Science 245:725(1989),Orsonら,Nucleic Acids Res.19:3435(1991),Postalら,Proc.Natl.Acad Sci.USA 88:8227(1991),Cooneyら,Science 241:456(1988),Youngら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10023(1991),Maherら,Biochemistry 31:70(1992),Duval−Valentinら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:504(1992),Blumeら,Nucleic Acids Res.20:1777(1992),Durlandら,Biochemistry 30:9246(1991),Grigorievら,J.of Biological Chem.267:3389(1992)およびTakasugiら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:5602(1991))。EDTA−Fe(II)のような反応性部分に結合した三重らせん形成性オリゴヌクレオチドを使用することにより、またはDNA修飾酵素と共に三重らせん形成性オリゴヌクレオチドを使用することにより、DNAの部位特異的切断が達成されている(Perrouaultら,Nature 344:358(1990),Francoisら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9702(1989),Linら,Biochemistry 28:1054(1989),Peiら,Proc.Natl Acad.Sci.USA 87:9858(1990),Strobelら,Science 254:1639(1991)ならびにPosvicおよびDervan,J.Am.Chem.Soc.112:9428(1992))。三重らせんアフィニティー捕捉を利用する配列特異的DNA精製も示されている(Itoら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:495(1992))。アクリジンのようなインターカレーション剤またはp−アジドフェナシルおよびプソラレンのような架橋剤に結合した三重らせん形成性オリゴヌクレオチドが使用されているが、三重らせん結合の安定性を増強するために使用されているに過ぎない(Praseuthら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:1349(1988),Grigorievら,J.of Biological Chem.267:3389(1992),Takasugiら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:5602(1991))。
遺伝子治療は、宿主細胞内に異種DNAを導入するために用いる方法により、または細胞内の内在性遺伝子の発現を改変するために用いる方法により定義されうる。そのようなものとして、遺伝子治療は、細胞の表現型および/または遺伝子型を改変するために用いられうる。
遺伝子置換によるゲノムの標的化修飾は研究手段として及び遺伝子治療において重要である。しかし、哺乳類細胞内に新規遺伝子を導入するための簡便な方法が存在するが、相同組換えの頻度は限られたものであり(Hansonら,(1995) Mol.Cell.Biol.15(1),45−51)、部位特異的遺伝子挿入を有する細胞の単離は典型的には選択操作を要する(Capecchi,M.R.,(1989)Science 244(4910),1288−1292)。稀有切断エンドヌクレアーゼによる二本鎖切断の形態の部位特異的DNA損傷は幾つかの細胞系における染色体遺伝子座における相同組換えを促進しうるが、このアプローチは該遺伝子座内への該認識配列の前挿入を要する。
Felsenfeldら著,J.Am.Chem.Soc.79:2023(1957)
MoserおよびDervan著,Science 238:645(1987)
Praseuthら著,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:1349(1988)
Mergnyら著,Biochemistry 30:9791(1991)
BealおよびDervan著,Science 251:1360(1991)
BealおよびDervan著,Nuc.Acids Res.11:2773(1992)
Maherら著,Science 245:725(1989)
Orsonら著,Nucleic Acids Res.19:3435(1991)
Postalら著,Proc.Natl.Acad Sci.USA 88:8227(1991)
Cooneyら著,Science 241:456(1988)
Youngら著,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10023(1991)
Maherら著,Biochemistry 31:70(1992)
Duval−Valentinら著,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:504(1992)
Blumeら著,Nucleic Acids Res.20:1777(1992)
Durlandら著,Biochemistry 30:9246(1991)
Grigorievら著,J.of Biological Chem.267:3389(1992)
Takasugiら著,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:5602(1991)
Perrouaultら著,Nature 344:358(1990)
Francoisら著,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9702(1989)
Linら著,Biochemistry 28:1054(1989)
Peiら著,Proc.Natl Acad.Sci.USA 87:9858(1990)
Strobelら著,Science 254:1639(1991)
PosvicおよびDervan著,J.Am.Chem.Soc.112:9428(1992)
Itoら著,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:495(1992)
Praseuthら著,Mol.Cell.Biol.15(1),45−51
Takasugiら著,(1989)Science 244(4910),1288−1292
細胞の遺伝子型を改変する方法は、典型的には、ヒト、動物および植物の遺伝的障害を治療するために欠損遺伝子の完全置換コピー、異種遺伝子または小核酸分子(例えば、オリゴヌクレオチド)を細胞内に導入することに基づく。導入された遺伝子または核酸分子は遺伝的組換えにより内在性遺伝子を置換する。このアプローチは、遺伝的に操作されたウイルスまたはウイルスベクターのような、置換遺伝子を細胞内に導入するための複雑な運搬系を要する。
あるいは、内在性遺伝子の発現を改変するために遺伝子治療方法が用いられうる。このタイプの方法の一例はアンチセンス療法である。アンチセンス療法においては、特異的タンパク質をコードするmRNAにハイブリダイズまたは結合するよう、特異的核酸配列の核酸分子である核酸分子を細胞内に導入する。mRNA種へのアンチセンス分子の結合は該mRNAの翻訳の効率および速度を減少させる。
ヒトのよく知られた遺伝的障害、例えば網膜芽細胞腫、嚢胞性線維症、およびグロビン異常、例えば鎌状赤血球貧血を治療するために、遺伝子治療が実験的に用いられている。しかし、欠損遺伝子の置換を実際に引き起こす組換え事象の数が限られているため、インビボ効率は低い。
HIVに対する細胞表面受容体をコードする遺伝子の標的化突然変異誘発のための組成物および方法は、エクスビボおよびインビボでの予防および治療用途において用いる遺伝子治療の手段として有用であろう。そのような組成物および方法は、研究手段として用いる、HIVに対する細胞表面受容体をコードする遺伝子における或るスペクトルの突然変異を有する細胞を作製するのにも有用であろう。
したがって、HIVに対する細胞表面受容体をコードする遺伝子の部位または隣接部位におけるインビボおよびエクスビボ標的化組換えのための組成物およびその使用方法を提供することが、本発明の目的である。
HIVに対する細胞表面受容体をコードする遺伝子の部位または隣接部位における標的化突然変異誘発を誘導する組成物およびその使用方法を提供することが、本発明のもう1つの目的である。
HIVに対する細胞表面受容体をコードする遺伝子の部位または隣接部位に突然変異を含有する細胞を提供することが、本発明のもう1つの目的である。
ウイルスベクターの必要性を伴わない遺伝子治療によりHIV感染を治療または予防するための組成物および方法を提供することが、本発明のもう1つの目的である。
エクスビボ遺伝子治療によりHIV感染を治療または予防するための組成物および方法を提供することが、本発明のもう1つの目的である。
インビボ遺伝子治療によりHIV感染を治療または予防するための組成物および方法を提供することが、本発明のもう1つの目的である。
発明の要約
HIVに対する細胞表面受容体の標的化突然変異誘発のための組成物およびそれらの使用方法を本発明において提供する。該組成物は、標的部位において配列特異的に二重らせんDNAに結合して三本鎖構造を形成する三重らせん形成性分子を含む。
HIVに対する細胞表面受容体の標的化突然変異誘発のための組成物およびそれらの使用方法を本発明において提供する。該組成物は、標的部位において配列特異的に二重らせんDNAに結合して三本鎖構造を形成する三重らせん形成性分子を含む。
該標的部位は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)に対する細胞表面受容体をコードする遺伝子内に存在するか、または該遺伝子に隣接している。HIV細胞表面受容体は、CXCR4、CCR5、CCR2b、CCR3およびCCR1を含むケモカイン受容体でありうる。該標的部位は該遺伝子のコード領域内に存在しうる。該標的配列は、好ましくは、細胞内へのHIV侵入を可能にするHIV細胞表面受容体遺伝子の機能に重要な、該HIV細胞表面受容体遺伝子の部分(例えば、該受容体の効率的発現、該細胞表面への該受容体の輸送、該受容体の安定性、該受容体によるウイルス結合または該受容体のエンドサイトーシスに関与するヌクレオチドまたはヌクレオチド配列)内に存在するか、または該部分に隣接している。1つの実施形態においては、該三重らせん形成性分子の標的部位はヒトCCR5遺伝子内に存在するか、または該遺伝子に隣接している。好ましい実施形態においては、該標的部位は、Δ32突然変異と称される、天然に存在するナンセンス突然変異の部位を含むか、または該部位に隣接している。
該三重らせん形成性分子は三重らせん形成性オリゴヌクレオチド(TFO)でありうる。TFOは、約7〜約40ヌクレオチド長の一本鎖オリゴヌクレオチドである。TFOは、二重らせんDNAの主溝内にポリプリン、ホモプリン、ポリピリミジンまたはホモピリミジン塩基組成を含有する標的部位に結合する。TFOは、それらのヌクレオチド構成成分に対する化学修飾、例えば、それらの複素環塩基、糖部分またはホスファート部分の化学修飾を含有しうる。これらの修飾は標的部位へのTFOの結合アフィニティーまたは形成される三重らせんの安定性を増加させうる。
該三重らせん形成性分子はまた、ペプチド核酸(PNA)でありうる。2本のPNA鎖での二重らせんDNAの鎖侵入により、非常に安定なPNA:DNA:PNA三重らせん構造が形成されうる。その2本のPNA鎖は互いに結合してビスPNA分子を形成しうる。また、PNAは、ポリプリンまたはホモプリン配列を有する標的部位に結合するが、TFOより短い標的配列において、より大きな安定性で結合しうる。
供与オリゴヌクレオチドと組合せて使用された場合に該三重らせん形成性分子は、哺乳類細胞において部位特異的相同組換えを誘導するのに有用である。供与オリゴヌクレオチドは三重らせん形成性分子に係留されることが可能であり、あるいは該三重らせん形成性分子から分離していることが可能である。該供与オリゴヌクレオチドは、標的二重らせんDNAと比較して少なくとも1つのヌクレオチド突然変異、挿入または欠失を含有しうる。コード化受容体がHIVに結合し細胞内へのその輸送を可能にする能力における1以上の欠損をもたらす、HIV細胞表面受容体遺伝子における突然変異を引き起こすために、供与オリゴヌクレオチドと共に三重らせん形成性分子が使用されうる。適当な突然変異としては、細胞表面HIV受容体の発現、細胞表面へのその輸送、その安定性、HIVへのその結合能またはそのエンドサイトーシス能の低下を引き起こすものが挙げられる。
また、HIVに対する細胞表面受容体における少なくとも1つの突然変異を含有する供与オリゴヌクレオチドおよび三重らせん形成性分子と細胞を接触させることにより作製される細胞系を提供する。該細胞は、好ましくは、造血細胞由来である。有用な造血細胞には、T細胞、および造血幹細胞、例えばCD34+細胞が含まれる。該細胞系は、他のHIV治療剤、例えば、細胞内へのHIVの侵入を軽減または抑制する他の物質のスクリーニングおよび開発のために使用されうる。
また、HIV感染を有する又はその発生のリスクを有する対象を、本明細書に開示されている組成物を使用して治療するための予防および治療方法を提供する。該方法は、HIVでの個体の感染を予防するために、またはHIVに既に感染している個体のウイルス負荷を減少させるために使用されうる。1つの実施形態においては、HIV感染の治療または予防のために、本明細書に開示されている組成物を使用するエクスビボ療法が用いられる。これらの方法は、標的細胞を単離し、該標的細胞を三重らせん形成性分子および供与オリゴヌクレオチドとエクスビボで接触させてHIV細胞表面受容体遺伝子の標的化突然変異誘発を引き起こし、該修飾細胞を培養内で増殖させ、該修飾細胞を、その投与を要する対象に投与することを含む。該細胞は、治療すべき対象から単離されることが可能であり、あるいは同系または同種異系宿主から単離されることが可能である。該細胞は造血幹細胞であることが可能であり、好ましくは、CD34+細胞である。もう1つの実施形態においては、該修飾細胞をエクスビボ培養内で分化させ、対象への投与前に多数に増殖させる。該細胞を、好ましくは、CD4+ T細胞に分化させる。また、本明細書に開示されている組成物を投与することによりHIV感染を治療または予防するための方法も提供する。
発明の詳細な説明
I.HIVに対する細胞表面受容体をコードする二本鎖DNAに結合する組成物
二重らせんDNAに配列特異的に結合して三本鎖構造を形成する「三重らせん形成性分子」と称される分子を含有する組成物を本明細書において開示する。該三重らせん形成性分子は、供与DNA分子と組合された場合に哺乳類細胞において部位特異的相同組換えを誘導するために使用されうる。該供与DNA分子は標的DNA配列に対する突然変異核酸を含有しうる。これは、標的化二重らせんDNAによりコードされるポリペプチドまたはタンパク質の機能を活性化、不活性化または改変するのに有用である。三重らせん形成性分子には、三重らせん形成性オリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸が含まれる。
I.HIVに対する細胞表面受容体をコードする二本鎖DNAに結合する組成物
二重らせんDNAに配列特異的に結合して三本鎖構造を形成する「三重らせん形成性分子」と称される分子を含有する組成物を本明細書において開示する。該三重らせん形成性分子は、供与DNA分子と組合された場合に哺乳類細胞において部位特異的相同組換えを誘導するために使用されうる。該供与DNA分子は標的DNA配列に対する突然変異核酸を含有しうる。これは、標的化二重らせんDNAによりコードされるポリペプチドまたはタンパク質の機能を活性化、不活性化または改変するのに有用である。三重らせん形成性分子には、三重らせん形成性オリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸が含まれる。
A.三重らせん形成性分子で標的化される遺伝子
三重らせん形成性分子が結合する所定領域は、本明細書においては、「標的配列」、「標的領域」または「標的部位」と称される。本明細書に開示されている三重らせん形成性分子の標的配列は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)に対する細胞表面受容体をコードするヒト遺伝子内に存在するか、または該遺伝子に隣接している。好ましくは、該三重らせん形成性分子の標的配列は、細胞内へのHIV侵入を可能にするHIV受容体遺伝子の機能に重要な、該HIV受容体遺伝子の部分(例えば、該受容体の効率的発現、該細胞表面への該受容体の輸送、該受容体の安定性、該受容体によるウイルス結合または該受容体のエンドサイトーシスに関与する配列)内に存在するか、または該部分に隣接している。標的配列は該遺伝子のコードDNA配列内またはイントロン内に存在しうる。標的配列は、プロモーターまたはエンハンサー配列を含む、該標的遺伝子の発現を調節するDNA配列内にも存在しうる。
三重らせん形成性分子が結合する所定領域は、本明細書においては、「標的配列」、「標的領域」または「標的部位」と称される。本明細書に開示されている三重らせん形成性分子の標的配列は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)に対する細胞表面受容体をコードするヒト遺伝子内に存在するか、または該遺伝子に隣接している。好ましくは、該三重らせん形成性分子の標的配列は、細胞内へのHIV侵入を可能にするHIV受容体遺伝子の機能に重要な、該HIV受容体遺伝子の部分(例えば、該受容体の効率的発現、該細胞表面への該受容体の輸送、該受容体の安定性、該受容体によるウイルス結合または該受容体のエンドサイトーシスに関与する配列)内に存在するか、または該部分に隣接している。標的配列は該遺伝子のコードDNA配列内またはイントロン内に存在しうる。標的配列は、プロモーターまたはエンハンサー配列を含む、該標的遺伝子の発現を調節するDNA配列内にも存在しうる。
標的配列は、細胞内へのHIVの侵入を促進する細胞表面受容体をコードする任意の遺伝子内に存在する、または該遺伝子に隣接しうる。細胞内へのHIV侵入の分子的メカニズムはウイルスエンベロープ糖タンパク質(env)と2つの標的細胞タンパク質(CD4およびケモカイン受容体)との間の特異的相互作用を含む。HIV細胞指向性は、7回膜貫通伸長Gタンパク質共役受容体である個々のケモカイン受容体に対するenvの特異性により決定される(Steinbergerら,Proc.Natl.Acad,Sci.USA,97:805−10(2000))。ケモカイン受容体の2つの主要ファミリーはCXCケモカイン受容体およびCCケモカイン受容体(CCR)であり、これらは、それぞれCXCおよびCCケモカインに結合することにちなんで命名されている。CXCケモカイン受容体は伝統的には急性炎症応答に関連づけられており、一方、CCRは、大抵は、慢性炎症およびT細胞媒介性炎症反応に関連して見出される細胞型(好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞およびT細胞)上で発現される(Nansenら,2002,Blood 99:4)。1つの実施形態においては、標的配列は、CXCR4、CCR5、CCR2b、CCR3およびCCR1を含む(これらに限定されるものではない)ケモカイン受容体をコードするヒト遺伝子内に存在するか、または該遺伝子に隣接している。
好ましい実施形態においては、標的配列はヒトCCR5遺伝子内に存在するか、または該遺伝子に隣接している。CCR5ケモカイン受容体は、初期急性HIV感染のほとんどのケースをもたらすR5指向性HIV−1株に対する主要共受容体である。Δ32突然変異と称されるホモ接合不活性化突然変異をCCR5遺伝子内に有する個体は、R5指向性HIV−1株による感染に対してほぼ完全に抵抗性である。Δ32突然変異はCCR5コード領域内に32塩基対の欠失を生成する。
CCR5遺伝子内のもう1つの天然に存在する突然変異は、ヌクレオチド303における、オープンリーディングフレームの単一のTからAへの塩基対トランスバージョンにより特徴づけられるm303突然変異であり、これは、アミノ酸101(C101X)における、ケモカイン受容体タンパク質の最初の細胞外ループにおけるシステインから終止コドンへの変化を示す(Carringtonら,1997)。突然変異誘発アッセイは、感染アッセイにおいてHIV−1 R5分離体に対して非感受性であることが判明したCCR5ヌルトランスフェクト化細胞の表面上のm303共受容体の発現を検出していない(Blanpainら,(2000))。
CCR5遺伝子内にホモ接合Δ32不活性化突然変異を有する個体は有意な有害な表現型を示さない。このことは、この遺伝子が、正常なヒトの健康にほとんど必要でないことを示唆している。これは、該CCR5遺伝子を、本明細書に開示されている三重らせん形成性分子を使用する標的化突然変異誘発のための特に魅力的な標的とする。ヒトCCR5の遺伝子は当技術分野で公知であり、GENBANKアクセッション番号NM 000579として提供される。ヒトCCR5遺伝子のコード領域はGENBANKアクセッション番号NM 000579のヌクレオチド358−1416により提供される。
B.三重らせん形成性オリゴヌクレオチド(TFO)
1つの実施形態においては、該三重らせん形成性分子は三重らせん形成性オリゴヌクレオチドである。三重らせん形成性オリゴヌクレオチド(TFO)は、配列特異的に二重らせんDNAに第3鎖として結合するオリゴヌクレオチドと定義される。該オリゴヌクレオチドは、細胞表面HIV受容体をコードするヒト遺伝子内または該遺伝子に隣接した所定標的配列、標的領域または標的部位に選択的に結合またはハイブリダイズして三本鎖構造を形成する合成または単離された核酸分子である。
1つの実施形態においては、該三重らせん形成性分子は三重らせん形成性オリゴヌクレオチドである。三重らせん形成性オリゴヌクレオチド(TFO)は、配列特異的に二重らせんDNAに第3鎖として結合するオリゴヌクレオチドと定義される。該オリゴヌクレオチドは、細胞表面HIV受容体をコードするヒト遺伝子内または該遺伝子に隣接した所定標的配列、標的領域または標的部位に選択的に結合またはハイブリダイズして三本鎖構造を形成する合成または単離された核酸分子である。
好ましくは、該オリゴヌクレオチドは、7〜40ヌクレオチド長、最も好ましくは、インビトロ突然変異誘発には10〜20ヌクレオチド長、インビボ突然変異誘発には20〜30ヌクレオチド長の一本鎖核酸分子である。その塩基組成はホモプリンまたはホモピリミジンでありうる。あるいは、該塩基組成はポリプリンまたはポリピリミジンでありうる。しかし、他の組成も有用である。
該オリゴヌクレオチドは、好ましくは、公知DNA合成法を用いて作製される。1つの実施形態においては、オリゴヌクレオチドは合成により作製される。また、オリゴヌクレオチドは、当技術分野でよく知られた標準的な方法を用いて化学修飾されうる。
該オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、標的配列の配列、標的領域の主溝内の該オリゴヌクレオチドの結合を達成するための必要性により課される物理的制約、およびオリゴヌクレオチド/標的配列に関する低い解離定数(Kd)を有する必要性に基づいて選択される。該オリゴヌクレオチドは、三重らせん形成に適した塩基組成を有し、第3鎖結合のための公知構造モチーフの1つに基づいて作製される。最も安定な複合体は、哺乳類ゲノムに比較的豊富に存在するポリプリン:ポリピリミジン要素上で形成される。TFOによる三重らせん形成は、二重らせんのプリン鎖に平行または逆平行に配向した第3鎖と共に生じうる。逆平行プリンモチーフにおいては、トリプレットはG.G:CおよびA.A:Tであり、平行ピリミジンモチーフにおいては、規定(canonical)トリプレットはC+.G:CおよびT.A:Tである。三重らせん構造は、TFO鎖と二重らせん内のプリン鎖とにおける塩基間の2つのフーグスティーン水素結合により安定化される。第3鎖結合オリゴヌクレオチドのための塩基組成の総説が米国特許第5,422,251号に記載されている。
好ましくは、該オリゴヌクレオチドは、高いストリンジェンシーおよび特異性の条件下、標的配列に結合またはハイブリダイズする。最も好ましくは、該オリゴヌクレオチドは、配列特異的に、二重らせんDNAの主溝内に結合する。核酸配列に対するオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーのインビトロ三重らせん形成のための反応条件は、オリゴヌクレオチド長、G:CおよびA:T塩基対の数およびハイブリダイゼーション反応において使用されるバッファーの組成のような要因に応じて、オリゴヌクレオチドによって異なる。二本鎖核酸分子の標的領域に第3鎖結合コードに基づいた実質的に相補的なオリゴヌクレオチドが好ましい。
本明細書において用いるオリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドが、標的領域と三重らせん形成を可能にする複素環塩基組成を有する場合に、該標的領域に実質的に相補的であると言える。そのようなものとして、オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチド中に非相補的塩基が存在する場合であっても、標的領域に実質的に相補的である。前記のとおり、実質的に相補的なオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するために使用されうる、利用可能な種々の構造モチーフが存在する。
1つの実施形態においては、標的領域は、CXCR4、CCR5、CCR2b、CCR3およびCCR1を含むケモカイン受容体をコードする遺伝子内の又は該遺伝子に隣接したポリプリン部位である。好ましい実施形態においては、標的領域はヒトCCR5遺伝子のコード領域内のポリプリンまたはホモプリン部位である。三重らせん形成性分子に対する標的部位として特に有用であるCCR5遺伝子のコード領域内の3つのホモプリン部位はATG開始コドンに対して509−518位、679−690位および900−908位である。
679−690位のホモプリン部位は、Δ32突然変異により生成されるナンセンス突然変異の部位を部分的に含む。この標的部位に結合するTFOは特に有用である。CCR5遺伝子に結合させるために使用される代表的なTFOには、限定的なものではないが、以下の配列が含まれる。
括弧内の数字は、示されているTFOが結合する、開始ATGに対するCCR5遺伝子の位置を示す。
化学修飾
本明細書中で用いる「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、定められた塩基配列の複数のヌクレオチドサブユニットを含む核酸重合体である。オリゴヌクレオチドは、リン酸エステル結合により互いに結合したヌクレオチドの鎖を含む。各ヌクレオチドは、典型的には、複素環塩基(核酸塩基)、該複素環塩基に結合した糖部分、および該糖部分のヒドロキシル基をエステル化するホスファート部分を含む。天然に存在する主なヌクレオチドは、ウラシル、チミン、シトシン、アデニンおよびグアニンを複素環塩基として含み、リボースまたはデオキシリボースを糖部分として含む。
本明細書中で用いる「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、定められた塩基配列の複数のヌクレオチドサブユニットを含む核酸重合体である。オリゴヌクレオチドは、リン酸エステル結合により互いに結合したヌクレオチドの鎖を含む。各ヌクレオチドは、典型的には、複素環塩基(核酸塩基)、該複素環塩基に結合した糖部分、および該糖部分のヒドロキシル基をエステル化するホスファート部分を含む。天然に存在する主なヌクレオチドは、ウラシル、チミン、シトシン、アデニンおよびグアニンを複素環塩基として含み、リボースまたはデオキシリボースを糖部分として含む。
三重らせん形成性オリゴヌクレオチドは、それらのヌクレオチド構成成分に対する化学修飾を含みうる。当技術分野で公知の修飾された塩基および塩基類似体、修飾された糖および糖類似体ならびに/またはホスファート類似体および修飾されたホスファート部分も、三重らせん形成性オリゴヌクレオチドにおける使用に適している。生理的条件下ではカリウムレベルは高く、マグネシウムレベルは低く、pHは中性である。これらの条件は、一般に、二重らせんDNAへのTFOの有効な結合を可能にするのに不利である。例えば、高いカリウムはグアニン(G)四分子(quartet)形成を促進し、これは、Gに富むプリンモチーフTFOの活性を抑制する。また、生理的条件下で低濃度で存在するマグネシウムは、電荷の中和により第3鎖の結合を補助する。最後に、中性pHは、ピリミジンモチーフ第3鎖結合に必要なシトシンプロトン化に不利に働く。隣接シトシンを有する標的配列は特に問題である。三重らせんの安定性は、連続的なシトシンにより、著しく損なわれる。これは、N3プロトン化から生じる正電荷間の反発によるもの、または恐らくは隣接シトシンによるプロトンに関する競合によるものであると考えられている。
TFOを含むヌクレオチドの化学修飾は、生理的条件下でのTFOの結合アフィニティーおよび/または三重らせんの安定性を増加させるのに有用でありうる。修飾ヌクレオチドは、三重らせん形成性オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチドの1以上を含みうる。本明細書中で用いる「修飾ヌクレオチド」または「化学修飾ヌクレオチド」は、複素環塩基、糖部分またはホスファート部分構成成分の1以上の化学修飾を有するヌクレオチドを意味する。好ましくは、TFOにおける修飾オリゴヌクレオチドは、標的配列の塩基とフーグスティーン型および/または逆フーグスティーン型塩基対を形成しうる。より好ましくは、修飾オリゴヌクレオチドは標的二重らせんDNAに対するTFOの結合アフィニティーまたは形成された三重らせんの安定性を増加させる。
複素環塩基または複素環塩基類似体の化学修飾は、ヌクレオチドの結合アフィニティーまたは三重らせんにおけるその安定性を増加させるのに有効でありうる。化学修飾複素環塩基には、イノシン、5−(1−プロピニル)ウラシル(pU)、5−(1−プロピニル)シトシン(pC)、5−メチルシトシン、8−オキソ−アデニン、プソイドシトシン、プソイドイソシトシン、5および2−アミノ−5−(2’−デオキシ−β−D−リボフラノシル)ピリジン(2−アミノピリジン)ならびに種々のピロロ−およびピラゾロピリミジン誘導体が含まれるが、これらに限定されるものではない。TFOにおいてシトシンの代わりに5−メチルシトシンまたはプソイドイソシトシンを使用することは、単離シトシンを含有するTFOにおいては特に、中性pHにおける三重らせん形成を安定化するのを助ける。これは、正電荷がTFOと標的二重らせんとの間の負電荷反発を部分的に減少させるからである。シチジンの代わりに2’−O−メチルプソイドシチジンを使用することは、標的配列が隣接シチジンを含有する場合に、TFOおよび標的二重らせんにより形成された三重らせんを安定化するのに特に有用である。
また、三重らせん形成性オリゴヌクレオチドは、修飾糖部分または糖部分類似体を伴うヌクレオチドを含有しうる。糖部分の修飾には、2’−O−アミノエトキシ、2’−O−アモニオエチル(2’−OAE)、2’−O−メトキシ、2’−O−メチル、2−グアニドエチル(2’−OGE)、2’−O,4’−C−メチレン(LNA)、2’−O−(メトキシエチル)(2’−OME)および2’−O−(N−(メチル)アセトアミド)(2’−OMA)が含まれるが、これらに限定されるものではない。2’−O−アミノエチル糖部分の置換は特に好ましい。なぜなら、それらは中性pHにおいてプロトン化されて、TFOと標的二重らせんとの間の電荷反発を抑制するからである。この修飾は該リボースまたはデオキシリボースのC3’−エンドコンホメーションを安定化し、また、該二重らせんのプリン鎖におけるi−l ホスファートとの架橋を形成する。
三重らせん形成性オリゴヌクレオチドのホスファートバックボーンの修飾もTFOの結合アフィニティーを増加させ、またはTFOと標的二重らせんとの間で形成された三重らせんを安定化しうる。ジエチル−エチレンジアミド(DEED)またはジメチル−アミノプロピルアミン(DMAP)を含む(これらに限定されるものではない)カチオン性修飾は、TFOと二重らせん標的ホスファートとの間の静電的反発の減少のため、特に有用でありうる。
該ホスファートバックボーンの修飾は、ホスホジエステル結合における非架橋酸素の1つの、硫黄原子での置換をも含みうる。この置換は、ホスホジエステル結合の代わりにホスホロチオアートヌクレオシド間結合を生成する。ホスホロチオアートヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドは、インビボで、より安定であることが示されている。
オリゴヌクレオチドは、3’プロピルアミン基を使用して分解を防ぐために末端キャップ化されるよう、更に修飾されうる。オリゴヌクレオチドの3’または5’キャップ化のための方法は当技術分野でよく知られている。
C.ペプチド核酸
もう1つの実施形態においては、該三重らせん形成性分子はペプチド核酸(PNA)である。ペプチド核酸は、オリゴヌクレオチドのホスファートバックボーンの全体が反復性N−(2−アミノエチル)−グリシン単位により置換されており、ホスホジエステル結合がペプチド結合により置換されている分子である。種々の複素環塩基がメチレンカルボニル結合により該バックボーンに連結される。PNAは、オリゴヌクレオチドに類似した複素環塩基の配置を維持しているが、アキラルな中性荷電分子である。ペプチド核酸はペプチド核酸単量体から構成される。複素環塩基は、標準的な塩基(ウラシル、チミン、シトシン、アデニンおよびグアニン)のいずれか、または三重らせん形成性オリゴヌクレオチドにおける使用に関して前記で説明した修飾複素環塩基のいずれかでありうる。
もう1つの実施形態においては、該三重らせん形成性分子はペプチド核酸(PNA)である。ペプチド核酸は、オリゴヌクレオチドのホスファートバックボーンの全体が反復性N−(2−アミノエチル)−グリシン単位により置換されており、ホスホジエステル結合がペプチド結合により置換されている分子である。種々の複素環塩基がメチレンカルボニル結合により該バックボーンに連結される。PNAは、オリゴヌクレオチドに類似した複素環塩基の配置を維持しているが、アキラルな中性荷電分子である。ペプチド核酸はペプチド核酸単量体から構成される。複素環塩基は、標準的な塩基(ウラシル、チミン、シトシン、アデニンおよびグアニン)のいずれか、または三重らせん形成性オリゴヌクレオチドにおける使用に関して前記で説明した修飾複素環塩基のいずれかでありうる。
PNAはワトソン・クリック型水素結合を介してDNAに結合しうるが、対応オリゴヌクレオチドの場合より有意に高い結合アフィニティーでDNAに結合しうる。PNAの中性バックボーンはPNAと標的DNAホスファートとの間の静電的反発を減少させる。二重らせんDNAの開裂を促進するインビトロまたはインビボ条件下、PNAは、Dループを形成するよう一方のDNAの置換を引き起こす二重らせんDNAの鎖侵入を媒介しうる。
ホモプリンDNA鎖および2つのPNA鎖から、高安定性三重らせんPNA:DNA:PNA構造が形成されうる。それらの2つのPNA鎖は一緒になって、二重らせん標的の他方の鎖を置換する一方で標的二重らせんの鎖の1つと三重らせん「クランプ」を形成するビス−PNA分子を形成するのに十分な柔軟性のリンカーに結合しうる。この構造においては、一方の鎖は逆平行配向でDNA鎖とワトソン・クリック型塩基対を形成し、もう一方の鎖は該DNA−PNA二重らせんにおけるホモプリン鎖に対してフーグスティーン型塩基対を形成する。三重らせん形成性オリゴヌクレオチドの場合と同様に、安定なPNA/DNA/PNA三重らせんの形成を可能にするためにはホモプリン鎖が必要であるが、PNAクランプは、三重らせん形成性オリゴヌクレオチドに要求されるものより短いホモプリン配列において形成可能であり、また、より大きな安定性でこれを行いうる。
ビス−PNA分子のリンカーにおける使用に適当な分子には、O−リンカーと称される8−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸、および6−アミノヘキサン酸が含まれるが、これらに限定されるものではない。ポリ(エチレン)グリコール単量体もビス−PNAリンカーにおいて使用されうる。ビス−PNAリンカーは任意の組合せで複数のリンカー分子単量体を含有しうる。
また、PNAは、該PNAの溶解度を増加させるため及び二重らせんDNAに対する該PNAのアフィニティーを増加させるための他の正荷電部分を含みうる。一般に使用される正荷電部分は、アミノ酸であるリシンおよびアルギニンを含むが、他の正荷電部分も有用でありうる。リシンおよびアルギニン残基はビス−PNAリンカーに付加されることが可能であり、あるいはPNA鎖のカルボキシ末端に付加されることが可能である。
1つの実施形態においては、PNAによる結合のための標的領域は、CXCR4、CCR5、CCR2b、CCR3およびCCR1を含むケモカイン受容体をコードする遺伝子内の又は該遺伝子に隣接したポリプリン部位である。好ましい実施形態においては、標的領域はヒトCCR5遺伝子のコード領域内のポリプリンまたはホモプリン部位である。三重らせん形成性分子に対する標的部位として特に有用であるCCR5遺伝子のコード領域内の3つのホモプリン部位はATG開始コドンに対して509−518位、679−690位および900−908位である。
679−690位のホモプリン部位は、Δ32突然変異により生成されるナンセンス突然変異の部位を部分的に含む。この標的部位に結合するPNAは特に有用である。この標的配列に結合する1つのPNAはP−679と称され、以下の配列により表される:JTJTTJTTJT−e−e−e−TCTTCTTCTC−Lys−Lys−Lys(ここで、J=プソイドイソシトシンおよびe=柔軟性リンカー)(配列番号7)。該柔軟性リンカー分子は8−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸、6−アミノヘキサン酸またはポリ(エチレン)グリコール単量体でありうる。この二量体ビス−PNAは2つの結合PNAセグメントを含有し、674部位のプリンに富むDNA鎖上(特に679位)でPNA/DNA/PNA三重らせんクランプを形成するよう設計される。細胞内の染色体標的においてビス−PNAがそのようなクランプ構造を形成しうることは既に実証されている。PNA−679の、CCR5遺伝子内のその結合部位に対するアフィニティーをインビトロで試験するためにゲル移動度シフトアッセイを用いる後記実施例は、この分子によるCCR5遺伝子内のその標的部位への強力な結合を示した。対立遺伝子特異的PCRを用いる後記実施例も、PNA−679(ナンセンス突然変異を含有するDNA供与体と組合せたもの)がヒト単球性急性白血病細胞系THP−1における内在性CCR5遺伝子の突然変異を誘導しうることを示している。
ヒトCCR5遺伝子に結合しうる追加的な典型的なPNAには、以下の配列:Lys−Lys−Lys−JTJTTJTTJT−e−e−e−TCTTCTTCTC−Lys−Lys−Lys(679−688)(ここで、J=プソイドイソシトシンおよびe=柔軟性リンカー)(配列番号8)により表されるビス−PNA、および以下の配列:CTTGTCATGG−Lys−Lys−Lys(522−531)により表されるPNA(配列番号9)が含まれるが、これらに限定されるものではない。括弧内の数字は、PNAが結合する、開始ATGに対する部位を示す。
D.供与オリゴヌクレオチド
該三重らせん形成性オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸は、供与オリゴヌクレオチドと組合せて、または混合配列リンカーを介して供与オリゴヌクレオチドに係留して投与されることが可能であり、あるいは標的配列に相同である非係留供与オリゴヌクレオチドと共に使用されることが可能である。供与オリゴヌクレオチドは本明細書においては供与断片、供与核酸、供与DNAまたは供与DNA断片とも称される。この方法は、三重らせん自体がDNA修復を誘発して相同供与DNAとの組換えの確率を潜在的に増加させうることを利用するものである。供与断片内の相同位置が多くなるほど、該供与断片が標的配列、標的領域または標的部位内に組換えられる確率が増加する、と当技術分野において理解されている。三重らせん形成性分子への供与オリゴヌクレオチドの係留は三重らせんの形成により標的部位の認識を促し、同時に、該係留供与断片を、可能な組換え及び情報転移のために配置する。また、三重らせん形成性分子は非係留供与オリゴヌクレオチドの相同組換えを有効に誘導する。本明細書中で用いる「組換え誘発性」なる語は、DNA断片、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸または組成物を、標的部位または配列内に組換え可能であり別のDNA断片、オリゴヌクレオチドまたは組成物の組換えを誘導しうるものと定めるために用いられる。
該三重らせん形成性オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸は、供与オリゴヌクレオチドと組合せて、または混合配列リンカーを介して供与オリゴヌクレオチドに係留して投与されることが可能であり、あるいは標的配列に相同である非係留供与オリゴヌクレオチドと共に使用されることが可能である。供与オリゴヌクレオチドは本明細書においては供与断片、供与核酸、供与DNAまたは供与DNA断片とも称される。この方法は、三重らせん自体がDNA修復を誘発して相同供与DNAとの組換えの確率を潜在的に増加させうることを利用するものである。供与断片内の相同位置が多くなるほど、該供与断片が標的配列、標的領域または標的部位内に組換えられる確率が増加する、と当技術分野において理解されている。三重らせん形成性分子への供与オリゴヌクレオチドの係留は三重らせんの形成により標的部位の認識を促し、同時に、該係留供与断片を、可能な組換え及び情報転移のために配置する。また、三重らせん形成性分子は非係留供与オリゴヌクレオチドの相同組換えを有効に誘導する。本明細書中で用いる「組換え誘発性」なる語は、DNA断片、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸または組成物を、標的部位または配列内に組換え可能であり別のDNA断片、オリゴヌクレオチドまたは組成物の組換えを誘導しうるものと定めるために用いられる。
非係留または非連結断片は20ヌクレオチド長〜数千ヌクレオチド長の範囲でありうる。供与オリゴヌクレオチド分子は、連結されているか連結されていないかには無関係に、一本鎖または二本鎖形態で存在しうると理解されるべきである。組換えられるべき供与断片は三重らせん形成性オリゴヌクレオチドに連結されても連結されなくてよいと理解されるべきである。該連結供与断片は4ヌクレオチド長〜100ヌクレオチド長、好ましくは4〜50ヌクレオチド長の範囲でありうる。しかし、非連結供与断片は20ヌクレオチド〜数千ヌクレオチドの遥かに広い範囲を有する。三重らせん形成性組換え誘発性オリゴヌクレオチドは少なくとも10ヌクレオチド長であることが好ましい。該オリゴヌクレオチドは少なくとも20ヌクレオチド長であることが、より好ましい。
供与オリゴヌクレオチドは、標的DNA配列と比べて、少なくとも1つの突然変異した、または挿入された、または欠失したヌクレオチドを含有する。標的配列は、好ましくは、細胞内へのHIV侵入におけるHIV受容体遺伝子の機能に重要な、該HIV受容体遺伝子の部分(例えば、該受容体の効率的発現、該細胞表面への該受容体の輸送、該受容体の安定性、該受容体によるウイルス結合または該受容体のエンドサイトーシスに関与する配列)内に存在するか、または該部分に隣接している。標的配列は該遺伝子のコードDNA配列内またはイントロン内に存在しうる。標的配列は、プロモーターまたはエンハンサー配列を含む、該標的遺伝子の発現を調節するDNA配列内にも存在しうる。
供与オリゴヌクレオチドは、標的配列と比べて、種々の突然変異を含有しうる。代表的なタイプの突然変異には、点突然変異、欠失および挿入が含まれるが、これらに限定されるものではない。点突然変異はミスセンスまたはナンセンス突然変異を引き起こしうる。欠失および挿入はフレームシフト突然変異または欠失を引き起こしうる。そのような突然変異は、HIVに結合して細胞内へのその輸送を可能にする細胞表面HIV受容体の能力における1以上の欠損を引き起こしうる。標的配列内の又は標的配列に隣接した突然変異の最終的な効果は、ウイルス粒子に結合し細胞内への該ウイルス粒子の侵入を可能にする細胞表面HIV受容体の能力を抑制または軽減することである。
E.三重らせん形成の決定方法
三本鎖構造が形成する好ましい条件はインビトロ突然変異誘発のための標準的なアッセイ条件およびインビボ突然変異誘発のための生理的条件である(例えば、MoserおよびDervan,Science 238:645(1987);Praseuthら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:1349(1988);Mergnyら,Biochemistry 30:9791(1991);BealおよびDervan,Science 251:1360(1991);Mergnyら,Biochemistry 30:9791(1991)ならびにBealおよびDervan,Nuc.Acids Res.11:2773(1992)を参照されたい)。
三本鎖構造が形成する好ましい条件はインビトロ突然変異誘発のための標準的なアッセイ条件およびインビボ突然変異誘発のための生理的条件である(例えば、MoserおよびDervan,Science 238:645(1987);Praseuthら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:1349(1988);Mergnyら,Biochemistry 30:9791(1991);BealおよびDervan,Science 251:1360(1991);Mergnyら,Biochemistry 30:9791(1991)ならびにBealおよびDervan,Nuc.Acids Res.11:2773(1992)を参照されたい)。
三重らせん形成の有用な尺度は、三重らせん形成が半最大である三重らせん形成性分子の濃度として推定されうる、三重らせんの平衡解離定数Kdである。好ましくは、該三重らせん形成性分子は、生理的相互作用の範囲内の、標的配列に対する結合アフィニティーを有する。好ましい結合アフィニティーは、約10−7M未満またはそれに等しいKdである。最も好ましくは、有意な分子内相互作用を達成するために、Kdは2×10−8M未満またはそれに等しい。
オリゴヌクレオチド/標的ペアのKdを決定するためには、種々の方法が利用可能である。後記の実施例においては、ゲル移動度シフトアッセイ(R.H.Durlandら,Biochemistry 30,9246(1991))を用いてKdを推定した。この方法を用いる後記実施例においては、ヒトCCR5遺伝子の(ATG開始コドンに対して)674位に位置する配列に対応するビス−ペプチド核酸(PNA)をアニーリングさせて、標的部位のプリンに富む鎖上でPNA/DNA/PNA三重らせんクランプを形成させた。アリーリングしたオリゴヌクレオチドを、既知制限酵素部位に隣接したPNA結合部位を含有する2μgのプラスミドおよび漸増濃度のビス−PNAと共に、37℃で一晩(約18〜24時間)インキュベートした。ついで該反応を制限酵素に付し、ついで、BioRad Mini PROTEAN 3装置を65Vで〜4時間使用して、89mM Tris、89mM ホウ酸(pH7.2)および10mM MgCl2(pH7.2の条件のため)を含有する10% 非変性ポリアクリルアミド(19:1 アクリルアミド:ビスアクリルアミド)ゲル中のゲル電気泳動に付した。ついで可視化のために該ゲルを銀染色で染色した。半分が標的配列に結合し半分が未結合であったビス−PNAの濃度として、解離定数(Kd)が決定されうる。
F.細胞標的化部分およびタンパク質トランスダクションドメイン
三重らせん形成性分子の製剤は該三重らせん形成性分子または該三重らせん形成性分子の修飾体の融合体を含み、ここで、該三重らせん形成性分子は別の部分に融合している。そのような類似体は、改善された特性、例えば、細胞膜透過性、活性および/または安定性の増強を示しうる。該オリゴヌクレオチドに連結している又は連結していないことが可能である部分の具体例には、例えば、特定の細胞へのオリゴヌクレオチドの運搬をもたらす標的化部分、例えば、造血幹細胞、CD34+細胞、T細胞または任意の他の好ましい細胞型に対する抗体、ならびに好ましい細胞型上で発現される受容体およびリガンドが含まれる。好ましくは、該部分は造血幹細胞を標的化する。該オリゴヌクレオチドが具備しうる他の部分には、タンパク質トランスダクションドメイン(PTD)が含まれ、これらは、細胞膜を横切る輸送を媒介する多数の細胞性およびウイルス性タンパク質に存在する短い塩基性ペプチド配列である。当技術分野でよく知られているタンパク質トランスダクションドメインの具体例には、アンテナペディア(Antennapedia)PTDおよびTAT(転写のトランスアクチベーター)PTDが含まれる。
三重らせん形成性分子の製剤は該三重らせん形成性分子または該三重らせん形成性分子の修飾体の融合体を含み、ここで、該三重らせん形成性分子は別の部分に融合している。そのような類似体は、改善された特性、例えば、細胞膜透過性、活性および/または安定性の増強を示しうる。該オリゴヌクレオチドに連結している又は連結していないことが可能である部分の具体例には、例えば、特定の細胞へのオリゴヌクレオチドの運搬をもたらす標的化部分、例えば、造血幹細胞、CD34+細胞、T細胞または任意の他の好ましい細胞型に対する抗体、ならびに好ましい細胞型上で発現される受容体およびリガンドが含まれる。好ましくは、該部分は造血幹細胞を標的化する。該オリゴヌクレオチドが具備しうる他の部分には、タンパク質トランスダクションドメイン(PTD)が含まれ、これらは、細胞膜を横切る輸送を媒介する多数の細胞性およびウイルス性タンパク質に存在する短い塩基性ペプチド配列である。当技術分野でよく知られているタンパク質トランスダクションドメインの具体例には、アンテナペディア(Antennapedia)PTDおよびTAT(転写のトランスアクチベーター)PTDが含まれる。
G.追加的な突然変異誘発因子
本明細書に開示されている三重らせん形成性分子は、単独で、または他の突然変異誘発因子と組合せて使用されうる。この場合に用いる2つの因子が、組合せて使用される、と表現されるのは、それらの2つの因子が共投与される場合、または両方の因子が細胞または血清中に同時に存在するような様式でそれらの2つの因子が投与される場合である。好ましい実施形態においては、追加的な突然変異誘発因子は三重らせん形成性分子にコンジュゲート化または連結される。三重らせん形成性分子と組合せて使用されうる追加的な突然変異誘発因子には、突然変異誘発を導きうる因子、核酸架橋剤である因子、放射活性物質である因子、アルキル化基である因子、DNA損傷細胞酵素を呼び寄せうる分子である因子が含まれる。他の適当な因子には、化学的突然変異誘発因子、例えばアルキル化、ビアルキル化またはインターカレーション因子が含まれるが、これらに限定されるものではない。共投与のための好ましい因子は、Yale UniversityによりPCT/US/94/07234に記載されているプソラレン連結オリゴヌクレオチドである。
本明細書に開示されている三重らせん形成性分子は、単独で、または他の突然変異誘発因子と組合せて使用されうる。この場合に用いる2つの因子が、組合せて使用される、と表現されるのは、それらの2つの因子が共投与される場合、または両方の因子が細胞または血清中に同時に存在するような様式でそれらの2つの因子が投与される場合である。好ましい実施形態においては、追加的な突然変異誘発因子は三重らせん形成性分子にコンジュゲート化または連結される。三重らせん形成性分子と組合せて使用されうる追加的な突然変異誘発因子には、突然変異誘発を導きうる因子、核酸架橋剤である因子、放射活性物質である因子、アルキル化基である因子、DNA損傷細胞酵素を呼び寄せうる分子である因子が含まれる。他の適当な因子には、化学的突然変異誘発因子、例えばアルキル化、ビアルキル化またはインターカレーション因子が含まれるが、これらに限定されるものではない。共投与のための好ましい因子は、Yale UniversityによりPCT/US/94/07234に記載されているプソラレン連結オリゴヌクレオチドである。
H.追加的な予防用または治療用物質
本明細書に開示されている三重らせん形成性分子は、単独で、または他の予防用もしくは治療用物質と組合せて使用されうる。この場合に用いる2つの物質が、組合せて使用される、と表現されるのは、それらの2つの物質が共投与される場合、または両方の物質が細胞または血清中に同時に存在するような様態でそれらの2つの物質が投与される場合である。適当な追加的な予防用または治療用物質には、HIV感染を治療または予防するのに有用な物質が含まれる。適当な治療用物質には、「HAART」(これは、HIV−1感染の治療のための高活性抗レトロウイルス療法の頭字語である)のために典型的に使用される物質が含まれる。HAART療法は、典型的には、二重ヌクレオシド(NRTI)バックボーンに加え、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター(NNRTI)またはリトナビル薬理学的増強プロテアーゼインヒビター(PI/r)のいずれかとを含む。しかし、クラスおよび活性物質の両方の点での実際の治療用組成物は、とりわけ、各物質の利用可能性、および各成分に関する患者の個々の耐性に応じて様々である。したがって、「HAART」なる語の使用は、当技術分野においてこの語に該当するものとされている活性治療用物質の全ての組合せを広く包含する意である。典型的なHAART治療用物質には、ヌクレオシドおよびヌクレオチド逆転写酵素インヒビター(NRTI)、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター(nNRTI)、プロテアーゼインヒビター、インテグラーゼインヒビター、侵入インヒビターおよび成熟インヒビターが含まれる。
本明細書に開示されている三重らせん形成性分子は、単独で、または他の予防用もしくは治療用物質と組合せて使用されうる。この場合に用いる2つの物質が、組合せて使用される、と表現されるのは、それらの2つの物質が共投与される場合、または両方の物質が細胞または血清中に同時に存在するような様態でそれらの2つの物質が投与される場合である。適当な追加的な予防用または治療用物質には、HIV感染を治療または予防するのに有用な物質が含まれる。適当な治療用物質には、「HAART」(これは、HIV−1感染の治療のための高活性抗レトロウイルス療法の頭字語である)のために典型的に使用される物質が含まれる。HAART療法は、典型的には、二重ヌクレオシド(NRTI)バックボーンに加え、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター(NNRTI)またはリトナビル薬理学的増強プロテアーゼインヒビター(PI/r)のいずれかとを含む。しかし、クラスおよび活性物質の両方の点での実際の治療用組成物は、とりわけ、各物質の利用可能性、および各成分に関する患者の個々の耐性に応じて様々である。したがって、「HAART」なる語の使用は、当技術分野においてこの語に該当するものとされている活性治療用物質の全ての組合せを広く包含する意である。典型的なHAART治療用物質には、ヌクレオシドおよびヌクレオチド逆転写酵素インヒビター(NRTI)、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター(nNRTI)、プロテアーゼインヒビター、インテグラーゼインヒビター、侵入インヒビターおよび成熟インヒビターが含まれる。
適当な侵入インヒビターには、CCR5を含むHIV細胞表面受容体のアンタゴニストとして機能する他の治療用物質が含まれる。CCR5アンタゴニストには、TAK−779、TAK−220、TAK−652、アプラビロック(aplaviroc)、マラビロック(maraviroc)およびビクロビロック(vicroviroc)を含む(これらに限定されるものではない)、CCR5タンパク質の幾つかの膜貫通ヘリックス間で形成される腔において結合する小分子非競合性アロステリックアンタゴニストが含まれる。
II.使用方法
A.HIVに対する細胞表面受容体の不活性化
三重らせん形成性分子は、HIVに対する細胞表面受容体をコードするヒト遺伝子内の又は該遺伝子に隣接した標的配列に結合/ハイブリダイズして、三重らせん構造を形成する。標的領域への該三重らせん形成性分子の結合は、細胞性DNA合成、組換え及び修復メカニズムを用いて、標的領域内の又は標的領域に隣接した突然変異を刺激する。標的化組換えにおいては、三重らせん形成性分子は、標的領域または標的領域に隣接する領域に実質的に相補的な配列を最小限度に含有する別の供与オリゴヌクレオチド断片(本明細書においては供与断片と称される)と組合せて細胞に投与される。該供与断片は、標的領域内に挿入すべき核酸配列を更に含有しうる。組換えられるべき断片との三重らせん形成性オリゴヌクレオチドの共投与は、三重らせん形成性オリゴヌクレオチドを使用しない方法と比較して、標的領域内の該供与断片の挿入の頻度を増加させる。
A.HIVに対する細胞表面受容体の不活性化
三重らせん形成性分子は、HIVに対する細胞表面受容体をコードするヒト遺伝子内の又は該遺伝子に隣接した標的配列に結合/ハイブリダイズして、三重らせん構造を形成する。標的領域への該三重らせん形成性分子の結合は、細胞性DNA合成、組換え及び修復メカニズムを用いて、標的領域内の又は標的領域に隣接した突然変異を刺激する。標的化組換えにおいては、三重らせん形成性分子は、標的領域または標的領域に隣接する領域に実質的に相補的な配列を最小限度に含有する別の供与オリゴヌクレオチド断片(本明細書においては供与断片と称される)と組合せて細胞に投与される。該供与断片は、標的領域内に挿入すべき核酸配列を更に含有しうる。組換えられるべき断片との三重らせん形成性オリゴヌクレオチドの共投与は、三重らせん形成性オリゴヌクレオチドを使用しない方法と比較して、標的領域内の該供与断片の挿入の頻度を増加させる。
供与オリゴヌクレオチドと組合された三重らせん形成性分子は、標的配列内の又は標的配列に隣接した核酸配列の部位特異的突然変異または改変を誘発する。標的配列は、好ましくは、細胞内へのHIV侵入におけるHIV受容体遺伝子の機能に重要な、該HIV受容体遺伝子の部分(例えば、該受容体の効率的発現、該細胞表面への該受容体の輸送、該受容体の安定性、該受容体によるウイルス結合または該受容体のエンドサイトーシスに関与する配列)内に存在するか、または該部分に隣接している。標的配列は該遺伝子のコードDNA配列内またはイントロン内に存在しうる。標的配列は、プロモーターまたはエンハンサー配列を含む、該標的遺伝子の発現を調節するDNA配列内にも存在しうる。
供与オリゴヌクレオチドと組合された三重らせん形成性分子は、標的配列内で又は標的配列に隣接して、ある範囲の突然変異のいずれかを誘発しうる。代表的なタイプの突然変異には、点突然変異、欠失および挿入が含まれるが、これらに限定されるものではない。点突然変異はミスセンスまたはナンセンス突然変異を引き起こしうる。欠失および挿入はフレームシフト突然変異または欠失を引き起こしうる。そのような突然変異は、HIVに結合して細胞内へのその輸送を可能にする細胞表面HIV受容体の能力における1以上の欠損を引き起こしうる。例えば、突然変異は標的遺伝子の発現(転写および/または翻訳)の低下を引き起こしうる。また、突然変異は細胞表面への該受容体の輸送における欠損または該タンパク質の安定性の低下を引き起こして、細胞表面におけるその提示を軽減または抑制しうる。また、突然変異は、該受容体がエンドサイトーシスによりインターナリゼーションされ又は適切なエンドサイトーシス経路を介して輸送される能力を低下させうる。また、突然変異は該細胞表面受容体によるHIVウイルス粒子の結合を軽減または抑制しうる。
標的配列内の又は標的配列に隣接した突然変異の最終的な効果は、ウイルス粒子に結合し細胞内への該ウイルス粒子の侵入を可能にする細胞表面HIV受容体の能力を抑制または軽減することである。三重らせん形成性分子により標的化される個々のHIV細胞表面受容体遺伝子は、どのHIV株が結合および細胞内侵入の軽減または抑制を示すのかを決定する。HIV−1分離体は、CD4+T細胞に感染するそれらの能力における顕著な相違を示す。すべての株が一次CD4+T細胞に感染し、一方、ほとんどの一次分離体がマクロファージにも感染するが(M指向性)、形質転換されたCD4+T細胞系には感染しない。他の分離体はCD4+T細胞系において良好に複製されるが(T指向性)、マクロファージには感染しない。MおよびT指向性ウイルスに対する寛容性の根拠は、HIV株により用いられる共受容体により決定される。CCR5は、あるM指向性(R5指向性)HIV−1株による感染に対する感受性を付与し、CXCR4は、T指向性(X4指向性)HIV−1株に対する補因子として働く。したがって、CCR5遺伝子内の突然変異は、R5指向性ウイルス耐性細胞である細胞を生成することが可能であり、CXCR4遺伝子内の突然変異は、X4指向性ウイルス耐性細胞である細胞を生成することが可能である。いくつかの実施形態においては、2以上の細胞表面HIV受容体において突然変異を誘発するために、三重らせん形成性分子の2以上の種を使用する。これは、2以上の指向性を有するHIV株に耐性である細胞を与えうる。
1つの実施形態においては、ヒトCCR5遺伝子内に突然変異を引き起こすために、本明細書に開示されている組成物および方法を用いる。好ましい実施形態においては、該突然変異は、CCR5受容体の32塩基対の欠失(当技術分野においては一般に、CCR5 Δ32突然変異と称される)を引き起こす、ヒトCCR5遺伝子における天然に存在する多型を模擬する。この突然変異はCCR5タンパク質の最後の3つの膜貫通ドメインの欠失およびフレームシフトを引き起こす。
B.HIV受容体突然変異細胞系の作製
本明細書に開示されている三重らせん形成性分子は、細胞表面HIV受容体をコードする遺伝子における多様な範囲の突然変異を含有する細胞系の作製に有用である。細胞系は、細胞表面受容体をコードする1以上の遺伝子内の若しくは該遺伝子に隣接した突然変異を含有することが可能であり、および/またはHIVに対する細胞表面受容体をコードする単一の遺伝子内の若しくは該遺伝子に隣接した1以上の突然変異を含有することが可能である。そのような細胞系は、細胞内へのHIVの侵入を抑制または軽減する他の物質を含む他のHIV治療剤のスクリーニングおよび開発に有用である。HIVに対する少なくとも1つの細胞表面受容体を発現し三重らせん形成性分子でトランスフェクトまたはトランスデュースされうる任意の細胞、例えば初代分離細胞および不死化細胞系が使用されうる。該細胞は、好ましくは、造血細胞由来であり、造血幹細胞でありうる。他の適当な造血細胞には、T細胞が含まれる。T細胞には、CD4およびCD8をも発現するT細胞サブセットを含む、CD3を発現する全ての細胞が含まれる。T細胞には、ナイーブ細胞および記憶細胞の両方、ならびにエフェクター細胞、例えばCTLが含まれる。T細胞には、調節細胞、例えばTh1、Tc1、Th2、Tc2、Th3、TregおよびTr1細胞も含まれる。細胞表面HIV受容体をコードする遺伝子における突然変異を含有する細胞系の作製に使用するT細胞は、好ましくは、CD4+T細胞である。
本明細書に開示されている三重らせん形成性分子は、細胞表面HIV受容体をコードする遺伝子における多様な範囲の突然変異を含有する細胞系の作製に有用である。細胞系は、細胞表面受容体をコードする1以上の遺伝子内の若しくは該遺伝子に隣接した突然変異を含有することが可能であり、および/またはHIVに対する細胞表面受容体をコードする単一の遺伝子内の若しくは該遺伝子に隣接した1以上の突然変異を含有することが可能である。そのような細胞系は、細胞内へのHIVの侵入を抑制または軽減する他の物質を含む他のHIV治療剤のスクリーニングおよび開発に有用である。HIVに対する少なくとも1つの細胞表面受容体を発現し三重らせん形成性分子でトランスフェクトまたはトランスデュースされうる任意の細胞、例えば初代分離細胞および不死化細胞系が使用されうる。該細胞は、好ましくは、造血細胞由来であり、造血幹細胞でありうる。他の適当な造血細胞には、T細胞が含まれる。T細胞には、CD4およびCD8をも発現するT細胞サブセットを含む、CD3を発現する全ての細胞が含まれる。T細胞には、ナイーブ細胞および記憶細胞の両方、ならびにエフェクター細胞、例えばCTLが含まれる。T細胞には、調節細胞、例えばTh1、Tc1、Th2、Tc2、Th3、TregおよびTr1細胞も含まれる。細胞表面HIV受容体をコードする遺伝子における突然変異を含有する細胞系の作製に使用するT細胞は、好ましくは、CD4+T細胞である。
C.HIV感染を有する又はその発生のリスクを有する対象の治療
一般に、本明細書に記載されている組成物および方法は、HIV感染を有する又はその素因を有する対象を治療するのに有用である。該組成物は、対象におけるHIVに対する耐性(抵抗性)を付与する予防用組成物として有用である。該組成物は、HIV感染に対する対象の耐性を始動または増強するために使用されうる治療用組成物としても有用である。該組成物および方法は、HIVに対する少なくとも1つの細胞表面受容体の発現、局在化、安定性、結合活性および/またはエンドサイトーシスを改変することにより、HIVによる感染に耐性であるCD4+免疫細胞を与える。本明細書に開示されている組成物および方法での治療の結果は、HIVによる個体の感染を予防すること、または既にHIVに感染している対象におけるウイルス負荷を減少させることである。治療のもう1つの結果は、HIVに感染した対象におけるCD4数の増加でありうる。HIVウイルス負荷およびCD4数を評価するための方法は当技術分野でよく知られている。
一般に、本明細書に記載されている組成物および方法は、HIV感染を有する又はその素因を有する対象を治療するのに有用である。該組成物は、対象におけるHIVに対する耐性(抵抗性)を付与する予防用組成物として有用である。該組成物は、HIV感染に対する対象の耐性を始動または増強するために使用されうる治療用組成物としても有用である。該組成物および方法は、HIVに対する少なくとも1つの細胞表面受容体の発現、局在化、安定性、結合活性および/またはエンドサイトーシスを改変することにより、HIVによる感染に耐性であるCD4+免疫細胞を与える。本明細書に開示されている組成物および方法での治療の結果は、HIVによる個体の感染を予防すること、または既にHIVに感染している対象におけるウイルス負荷を減少させることである。治療のもう1つの結果は、HIVに感染した対象におけるCD4数の増加でありうる。HIVウイルス負荷およびCD4数を評価するための方法は当技術分野でよく知られている。
好ましくは、本明細書に記載されている組成物および方法は、HIV感染から生じるいずれかの疾患または状態、例えばエイズおよびARCを治療または予防するために用いられうる。本明細書に開示されている方法は、HIV感染ならびにHIV感染から生じる疾患および状態を有効に治療または予防するために、既存の抗ウイルス療法と共に実施されうると認識されるべきである。
i.HIV感染を治療または予防するためのエクスビボ遺伝子治療
1つの実施形態においては、対象におけるHIV感染の治療または予防のために、細胞のエクスビボ遺伝子治療を用いる。HIV感染のエクスビボ予防または治療のために、細胞を対象から単離し、本明細書に開示されている組成物とエクスビボで接触させて、CXCR4、CCR5、CCR2b、CCR3およびCCR1を含むHIV細胞表面受容体をコードする遺伝子内の又は遺伝子に隣接した突然変異を含有する細胞を得る。好ましい実施形態においては、治療すべき対象または同系宿主から該細胞を単離する。三重らせん形成性分子および供与オリゴヌクレオチドと接触させる前に、対象から標的細胞を取り出す。該細胞は造血前駆または幹細胞でありうる。好ましい実施形態においては、標的細胞はCD34+造血幹細胞である。CD34+造血幹細胞はHIV感染に耐性であることが示されている。HIV感染に対するCD34+細胞の耐性は、それを、本明細書に開示されている組成物および方法を用いるHIVの遺伝子治療のための特に魅力的な細胞型とする。なぜなら、それは、HIVの混入の恐れを伴うことなく、HIV感染個体から採取され、突然変異されうるからである。
1つの実施形態においては、対象におけるHIV感染の治療または予防のために、細胞のエクスビボ遺伝子治療を用いる。HIV感染のエクスビボ予防または治療のために、細胞を対象から単離し、本明細書に開示されている組成物とエクスビボで接触させて、CXCR4、CCR5、CCR2b、CCR3およびCCR1を含むHIV細胞表面受容体をコードする遺伝子内の又は遺伝子に隣接した突然変異を含有する細胞を得る。好ましい実施形態においては、治療すべき対象または同系宿主から該細胞を単離する。三重らせん形成性分子および供与オリゴヌクレオチドと接触させる前に、対象から標的細胞を取り出す。該細胞は造血前駆または幹細胞でありうる。好ましい実施形態においては、標的細胞はCD34+造血幹細胞である。CD34+造血幹細胞はHIV感染に耐性であることが示されている。HIV感染に対するCD34+細胞の耐性は、それを、本明細書に開示されている組成物および方法を用いるHIVの遺伝子治療のための特に魅力的な細胞型とする。なぜなら、それは、HIVの混入の恐れを伴うことなく、HIV感染個体から採取され、突然変異されうるからである。
そのような幹細胞は当業者により単離され富化されうる。CD34+および他の細胞のそのような単離および富化のための方法は当技術分野で公知であり、例えば米国特許第4,965,204号、第4,714,680号、第5,061,620号、第5,643,741号、第5,677,136号、第5,716,827号、第5,750,397号および第5,759,793号に開示されている。造血前駆および幹細胞において富化された組成物の文脈において本明細書中で用いる「富化」は、該細胞の天然源において見出されるものより高い、望ましい要素(例えば、造血前駆および幹細胞)の比率を示す。細胞の組成は、該細胞の天然源と比較して、少なくとも1桁、好ましくは2または3桁、より好ましくは10、100、200または1000桁、富化されうる。
ヒトにおいては、CD34+細胞は臍帯血、骨髄から取り出されることが可能であり、あるいは骨髄腔から末梢循環内への造血幹細胞の移動を引き起こすのに十分な量の例えば顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒球−単球コロニー刺激因子(GM−CSF)、幹細胞因子(SCF)のような造血増殖因子をドナーに皮下または静脈内注射することにより引き起こされるサイトカイン動員の後の血液から取り出されることが可能である。まず、任意の適当な骨髄源、例えば、けい骨、大腿骨、脊椎および骨腔から、骨髄細胞が得られうる。骨髄の単離のために、骨をフラッシュ(flush)するために適当な溶液が使用可能であり、該溶液は、低濃度(一般には約5〜25mM)の許容されるバッファーと組合されたウシ胎児血清または天然に存在する因子で簡便に補足された平衡化塩溶液である。簡便なバッファーには、ヘペス、リン酸バッファー、乳酸バッファーなどが含まれる。
細胞は正および負の選択技術により選択されうる。細胞は、当業者に公知の方法を用いて、造血前駆または幹細胞表面抗原、例えばCD34に結合する商業的に入手可能な抗体を使用して選択されうる。例えば、該抗体は磁気ビーズにコンジュゲート化されることが可能であり、所望の細胞型を回収するために免疫的操作が利用されうる。他の技術は蛍光標示式細胞分取(FACS)の利用を含む。CD34抗原は、非白血病個体の造血系内の前駆細胞上で見出され、モノクローナル抗体My−10により認識される(すなわち、CD34抗原を発現する)細胞の集団上で発現され、骨髄移植のための幹細胞を単離するために使用されうる。My−10はAmerican Type Culture Collection(Rockville,Md.)にHB−8483として寄託されており、抗HPCA 1として商業的に入手可能である。さらに、実質的に全ての所望の細胞マーカーに対して選択するために、ヒト骨髄からの分化した及び「専用の(dedicated)」細胞の負の選択が利用されうる。例えば、前駆または幹細胞、最も好ましくはCD34+細胞は、CD3−、CD7−、CD8−、CD10−、CD14−、CD15−、CD19−、CD20−、CD33−、クラスII HLA+およびThy−1+のいずれかであるものとして特徴づけられうる。
前駆または幹細胞を単離したら、それらを、任意の適当な培地内で成育させることにより、増殖させることが可能である。例えば、ストロマ細胞(例えば、因子の分泌を伴って、骨髄または肝臓から得られうるもの)からの馴らし培地内で、または幹細胞の増殖を支持する細胞表面因子を含む培地内で、前駆または幹細胞を増殖させることが可能である。望ましくない細胞の除去のための適当なモノクローナル抗体を使用して、ストロマ細胞から造血細胞を取り出すことが可能である。
単離された細胞を、HIVに対する細胞表面受容体をコードする遺伝子内の又は該遺伝子に隣接した所望の突然変異を引き起こすのに有効な量の供与オリゴヌクレオチドと三重らせん形成性分子との組合せと、エクスビボで接触させる。これらの細胞は、本明細書においては、修飾細胞と称される。オリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸での細胞のトランスフェクションのための方法は当技術分野でよく知られている(Koppelhusら,Adv.Drug Deliv.Rev.,55(2):267−280(2003))。
該修飾細胞を、対象への投与の前に、培養内で維持し又は増殖させることが可能である。培養条件は、細胞型に応じて、当技術分野で概ね公知である。特にCD34+の維持のための条件は十分に研究されており、いくつかの適当な方法が利用可能である。エクスビボ多能性造血細胞の増殖のための一般的なアプローチは、インターロイキン−3のような早期作用性サイトカインの存在下、精製された前駆または幹細胞を培養することである。また、造血前駆細胞をエクスビボで維持するための栄養培地内にトロンボポエチン(TPO)、幹細胞因子(SCF)およびflt3リガンド(Flt−3L;すなわち、flt3遺伝子産物のリガンド)の組合せを含有させることは、原始的(すなわち、比較的に未分化)なヒト造血前駆細胞をインビトロで増殖させるのに有用であったこと、ならびにそれらの細胞はSCID−huマウスにおいて移植可能であったことが示されている(Luensら,1998,Blood 91:1206−1215)。他の公知方法においては、マウスプロラクチン様プロテインE(mPLP−E)またはマウスプロラクチン様プロテインF(mPIP−F;ひとまとめに、mPLP−E/IF)を含む栄養培地内で細胞をエクスビボで維持することが可能である(例えば、数分間、数時間、または3、6、9、13日以上)(米国特許第6,261,841号)。他の適当な細胞培養および増殖方法も本発明において用いられうると理解されるであろう。米国特許第5,945,337号に記載されているとおり、無血清培地内でも細胞を増殖させることが可能である。
もう1つの実施形態においては、当技術分野でよく知られた方法を用いて、対象への投与の前に、インターロイキンと増殖因子との特定の組合せを用いて、該修飾造血幹細胞をCD4+細胞培養にエクスビボで分化させる。該細胞をエクスビボで多数の細胞に増殖させることが可能であり、好ましくは、単離された造血幹細胞の元の集団と比較して少なくとも5倍、より好ましくは少なくとも10倍、より一層好ましくは少なくとも20倍の細胞に増殖させることが可能である。
エクスビボ遺伝子治療のためのもう1つの実施形態の細胞においては、使用する細胞は、分化した体細胞でありうる。体細胞は、造血前駆細胞となるよう誘導されうる多能性幹様細胞となるよう再プログラムされうる。ついで、CD34+細胞に関して前記で説明したとおりに、該造血前駆細胞を三重らせん形成性分子および供与オリゴヌクレオチドで処理して、HIV感染に関与する機能性受容体を発現しない組換え免疫細胞を得ることが可能である。再プログラムされうる代表的な体細胞には、繊維芽細胞、脂肪細胞および筋細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。誘導された幹様細胞からの造血前駆細胞はマウスにおいて成功裏に発生されている(Hanna,J.ら,Science,318:1920−1923(2007))。
誘導された幹様細胞から造血前駆細胞を得るために、宿主から体細胞を集める。好ましい実施形態においては、該体細胞は自己繊維芽細胞である。該細胞を培養し、Oct4、Sox2、Klf4およびcMyc転写因子をコードするベクターを該細胞に導入する。その導入された細胞を培養し、胚幹細胞(ES)の形態、ならびにAP、SSEA1およびNanogを含む(これらに限定されるものではない)ES細胞マーカーをスクリーニングする。その導入されたES細胞を培養し、誘導された幹様細胞を産生するよう誘導する。ついで細胞をCD41およびc−kitマーカー(初期造血前駆マーカー)ならびに骨髄および赤芽球分化に関するマーカーをスクリーニングする。
ついで該修飾造血幹細胞、修飾分化CD4+細胞または修飾誘導造血前駆細胞を対象内に導入する。該細胞の運搬は種々の方法を用いて行われることが可能であり、最も好ましくは、注入による静脈内投与、ならびに骨膜、骨髄および/または皮下部位への直接的な蓄積注射を含む。
該修飾細胞の投与を受ける対象は、該細胞の移植を促進するために、骨髄のコンディショニングのために処理されうる。該受容者は、該細胞の投与の前に、放射線または化学療法的処理を用いて、移植を促進するために処理されうる。該細胞は、投与されると、一般に、移植するのに或る期間を要する。造血幹または前駆細胞の有意な移植の達成は、典型的には、数週間〜数ヶ月を要する。
有意な予防または治療効果を達成するためには、高率の修飾造血幹細胞または修飾分化CD4+細胞の移植が必要であるとは予想されない。後記実施例は、本明細書に記載されている組成物および方法を用いて遺伝子内に導入された突然変異が長期間にわたって安定であることを示している。移植された細胞は移植後に経時的に増殖して修飾細胞の比率を増加させると予想される。HIVに対する少なくとも1つの細胞表面受容体の発現、局在化、安定性、結合活性および/またはエンドサイトーシスの改変のため、該修飾細胞は、未処理細胞と比較して、HIVによる感染に耐性である。したがって、HIV感染を有する対象においては、該修飾細胞は、未修飾細胞と比較して競合的な利点を有すると予想される。予防または治療効果を得るためには少数または小さな比率の修飾造血幹細胞の移植が必要とされるに過ぎないと予想される。
好ましい実施形態においては、対象に投与すべき細胞は、自己細胞、例えば、対象に由来する細胞または同系細胞である。それでも、同種異系細胞移植も想定され、同種異系骨髄移植は常法で行われる。抗原的に一致し遺伝的に無関係なドナー(国内登録により特定される)からの骨髄を使用することにより、あるいは6個のヒト白血球抗原中の1〜3個が患者のものと異なる移植抗原を有する遺伝的に関連した同胞または親から得た又は誘導した造血前駆または幹細胞を使用することにより、適当な同胞ドナーを欠く患者に同種異系細胞移植が施されうる。
ii.HIV感染を治療または予防するためのインビボ遺伝子治療
もう1つの実施形態においては、HIV感染を有する又はその素因を有する対象に該三重らせん形成性分子を直接的に投与する。一般に、オリゴヌクレオチドおよび関連分子の投与方法は当技術分野でよく知られている。製剤を対象に投与するために、当業者に公知の任意の許容される方法が用いられうる。該投与は局所性(すなわち、特定の領域、生理的系、組織、器官または細胞型)または全身性でありうる。三重らせん形成性分子および供与オリゴヌクレオチドは、経口、吸入(鼻または肺)、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、皮下、局所、舌下または直腸手段を含む(これらに限定されるものではない)多数の経路により投与されうる。注射は、例えば静脈内、皮内、皮下、筋肉内または腹腔内でありうる。いくつかの実施形態においては、注射は複数の位置で行われうる。該組成物は直接的に骨髄に、または適当なリンパ組織、例えば脾臓、リンパ節もしくは粘膜関連リンパ組織に投与されうる。
もう1つの実施形態においては、HIV感染を有する又はその素因を有する対象に該三重らせん形成性分子を直接的に投与する。一般に、オリゴヌクレオチドおよび関連分子の投与方法は当技術分野でよく知られている。製剤を対象に投与するために、当業者に公知の任意の許容される方法が用いられうる。該投与は局所性(すなわち、特定の領域、生理的系、組織、器官または細胞型)または全身性でありうる。三重らせん形成性分子および供与オリゴヌクレオチドは、経口、吸入(鼻または肺)、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、皮下、局所、舌下または直腸手段を含む(これらに限定されるものではない)多数の経路により投与されうる。注射は、例えば静脈内、皮内、皮下、筋肉内または腹腔内でありうる。いくつかの実施形態においては、注射は複数の位置で行われうる。該組成物は直接的に骨髄に、または適当なリンパ組織、例えば脾臓、リンパ節もしくは粘膜関連リンパ組織に投与されうる。
製剤
該組成物は、好ましくは、適当な医薬担体と組合せて、治療用途に使用される。そのような組成物は該化合物の有効量と医薬上許容される担体または賦形剤とを含む。該製剤は、投与方法に適合するよう製造される。医薬上許容される担体は、1つには、投与する個々の組成物により、および該組成物を投与するために用いる個々の方法により決定される。したがって、核酸を含有する医薬組成物の種々の適当な製剤が存在する。
該組成物は、好ましくは、適当な医薬担体と組合せて、治療用途に使用される。そのような組成物は該化合物の有効量と医薬上許容される担体または賦形剤とを含む。該製剤は、投与方法に適合するよう製造される。医薬上許容される担体は、1つには、投与する個々の組成物により、および該組成物を投与するために用いる個々の方法により決定される。したがって、核酸を含有する医薬組成物の種々の適当な製剤が存在する。
インビボで投与されたヌクレオチドは取り込まれ、細胞および組織に分布する、と当業者により理解されている(Huangら,FEBS Lett.558(l−3):69−73(2004))。例えば、Nyceらは、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ODN)が、吸入されると、内在性界面活性剤(肺細胞により産生される脂質)に結合し、追加的な担体脂質の必要性を伴うことなく肺細胞により取り込まれることを示している(NyceおよびMetzger,Nature,385:721−725(1997))。小さな核酸はT24膀胱癌組織培養細胞内に容易に取り込まれる(Maら,Antisense Nucleic Acid Drug Dev.8:415−426(1998))。
該化合物は、適当な医薬担体中の局所、局部または全身投与用の製剤中に含有されうる。E.W.Martin著,Remington’s Pharmaceutical Sciences,15th Edition(Mark Publishing Company,1975)は典型的な担体および製造方法を開示している。また、該化合物は、細胞に標的化するための、生分解性もしくは非生分解性高分子またはタンパク質から形成される適当な生体適合性マイクロカプセル、微粒子またはミクロスフェアまたはリポソーム内に封入されうる。そのような系は当業者によく知られており、適当な核酸との使用のために最適化されうる。
核酸運搬のための種々の方法が、例えば、Sambrookら,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York;およびAusubelら,1994,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New Yorkに記載されている。そのような核酸運搬系は、例えば(限定的なものではない)、「裸」核酸としての「裸」形態、または運搬に適したビヒクル中に製剤化された形態、例えば、陽イオン分子もしくはリポソーム形成性脂質との複合体中、またはベクターの成分もしくは医薬組成物の成分として、所望の核酸を含む。該核酸運搬系は、直接的に、例えばそれを細胞と接触させることにより、あるいは間接的に、例えばいずれかの生物学的過程の作用を介して、細胞に供与されうる。該核酸運搬系は、エンドサイトーシス、受容体標的化、天然または合成細胞膜断片との共役、物理的手段、例えばエレクトロポレーション、高分子担体、例えばコントロールリリースフィルムまたはナノ粒子または微粒子と核酸運搬系との組合せ、ベクターの使用、該細胞を囲む流体または組織内への核酸運搬系の注射、細胞膜を通過する核酸運搬系の単純核酸により、あるいは細胞膜を越えるいずれかの能動または受動輸送メカニズムにより、細胞に供与されうる。また、該核酸運搬系は、例えば、ウイルスベクターの抗体関連標的化および抗体媒介性固体化のような技術を用いて、細胞に供与されうる。
局所投与用の製剤には、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、シロップ剤、液剤および散剤が含まれうる。所望により、通常の医薬担体、水性、粉末または油性基剤あるいは増粘剤が使用されうる。
非経口投与、例えば関節内、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内および皮下経路に適した製剤には、水性および非水性の等張性無菌注射溶液(これは、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、および該製剤を、意図される被投与者の血液と等張にする溶質を含有しうる)、ならびに水性および非水性無菌懸濁剤、水剤(溶液剤)または乳剤(これらは、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、分散剤、安定剤および保存剤を含みうる)が含まれる。注射用製剤は、添加保存剤を含有する単位投与形、例えば、アンプル内または多用量容器内の形態で提供されうる。該組成物は、無菌水性または非水性溶液、懸濁液およびエマルションのような形態をとることが可能であり、ある実施形態においては、これらは対象の血液と等張でありうる。非水性溶媒の具体例としては、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、ゴマ油、ヤシ油、ラッカセイ油、ピーナッツ油、鉱油、注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチル、または硬化油、例えば合成モノもしくはジ−グリセリドが挙げられる。水性担体には、水、アルコール性/水性溶液、エマルションまたは懸濁液、例えば塩類液および緩衝媒体が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、1,3−ブタンジオール、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液または硬化油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体および栄養補給剤、および電解質補給剤(例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの)が含まれる。保存剤および他の添加剤、例えば抗微生物剤、キレート剤および不活性ガスも存在しうる。また、溶媒または懸濁化媒体として、通常、無菌硬化油が使用される。この目的には、合成モノ−またはジ−グリセリドを含む任意の弱刺激性硬化油が使用されうる。また、注射剤の製造においては、脂肪酸、例えばオレイン酸が使用されうる。担体の配合は、Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton, Pa.において見出されうる。当業者は、過度な実験に頼ることなく、該組成物を製造し製剤化するための種々のパラメーターを容易に決定することが可能である。
該化合物の単独体、または他の適当な成分との組合せは、吸入により投与されるエアゾール製剤(すなわち、それは「噴霧化」されうる)にも製されうる。エアゾール製剤は、加圧された許容されるプロペラント、例えばジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素および空気中に配置されうる。吸入による投与の場合、該化合物は、適当なプロペラントを使用して加圧パックまたはネビュライザーからエアゾール噴霧剤の形態で運搬される。
いくつかの実施形態においては、前記の化合物は、例えば塩、担体、緩衝剤、乳化剤、希釈剤、賦形剤、キレート剤、充填剤、乾燥剤、抗酸化剤、抗微生物剤、保存剤、結合剤、増量剤、シリカ、可溶化剤または安定剤のような製剤化成分と共に、医薬上許容される担体をも含みうる。1つの実施形態においては、該化合物は、コレステロールおよびラウリン酸およびリトコール酸誘導体(細胞取り込みを改善するためにC32官能性を有する)のような親油性基に連結される。例えば、コレステロールは、インビトロ(Lorenzら,Bioorg.Med.Chem.Lett.14(19):4975−4977(2004))およびインビボ(Soutschekら,Nature 432(7014):173−178(2004))でのsiRNAの取り込みおよび血清安定性を増強することが示されている。また、血流中の種々のリポタンパク質(例えば、LDL)へのステロイド連結オリゴヌクレオチドの結合は完全性を守り、生物分布を促進することが示されている(Rumpら,Biochem.Pharmacol 59(11):1407−1416(2000))。細胞取り込みを増加させるために前記の化合物に結合または連結されうる他の基には、アクリジン誘導体;架橋剤、例えばプソラレン誘導体、アジドフェナシル、プロフラビンおよびアジドプロフラビン;人工エンドヌクレアーゼ;金属複合体、例えばEDTA−Fe(II)およびポルフィリン−Fe(II);アルキル化部分;ヌクレアーゼ、例えばアルカリホスファターゼ;ターミナルトランスフェラーゼ;アブザイム;コレステリル部分;親油性担体;ペプチドコンジュゲート;長鎖アルコール;リン酸エステル;放射能マーカー;非放射能マーカー;炭水化物;ならびにポリリシンまたは他のポリアミンが含まれる。また、Levyら,米国特許第6,919,208号は、強化された運搬のための方法を記載している。これらの医薬製剤は、自体抗体の方法で、例えば、通常の混合、溶解、顆粒化、粉末化、乳化、カプセル化(封入)、捕捉または凍結乾燥法により製造されうる。
投与方法
一般に、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸および関連分子を含む化合物の投与方法は当技術分野でよく知られている。特に、現在使用されている製剤と共に、核酸治療剤に既に用いられている投与経路は、前記のオリゴヌクレオチドのための好ましい投与経路および製剤となる。好ましくは、該オリゴヌクレオチドは、遺伝的操作を受けている生物(例えば、HIV感染の治療または予防のために遺伝子治療を必要としているヒト)の体内に注射される。
一般に、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸および関連分子を含む化合物の投与方法は当技術分野でよく知られている。特に、現在使用されている製剤と共に、核酸治療剤に既に用いられている投与経路は、前記のオリゴヌクレオチドのための好ましい投与経路および製剤となる。好ましくは、該オリゴヌクレオチドは、遺伝的操作を受けている生物(例えば、HIV感染の治療または予防のために遺伝子治療を必要としているヒト)の体内に注射される。
組成物は、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、皮下、局所、舌下または直腸手段を含む(これらに限定されるものではない)多数の経路により投与されうる。好ましい投与経路は静脈内である。化合物はリポソームによっても投与されうる。そのような投与経路および適当な製剤は当業者に概ね公知である。
該製剤の投与は、三重らせん形成性オリゴヌクレオチドおよび場合によっては供与オリゴヌクレオチドがその標的に到達するのを可能にする任意の許容される方法により達成されうる。
製剤を対象に投与するためには、当業者に公知の任意の許容される方法が用いられうる。該投与は、治療される状態に応じて、局所性(すなわち、特定の領域、生理的系、組織、器官または細胞型)または全身性でありうる。
注射は、例えば静脈内、皮内、皮下、筋肉内または腹腔内でありうる。いくつかの実施形態においては、注射は複数の位置に行われうる。移植は、移植可能な薬物運搬系(ドラッグ・デリバリー・システム)、例えばミクロスフェア、ヒドロゲル、高分子レザバー、コレステロールマトリックス、高分子系、例えばマトリックス浸食および/または拡散系、ならびに非高分子系、例えば圧縮、融合または部分融合ペレットを挿入することを含む。吸入は、単独で又は吸収されうる担体に結合させて、吸入器内のエアゾールとして該組成物を投与することを含む。全身投与の場合、該組成物はリポソーム内に封入されるのが好ましいかもしれない。
該オリゴヌクレオチドは、該物質および/またはヌクレオチド運搬系の組織特異的取り込みを可能にする方法で運搬されうる。技術には、組織または器官局在化装置、例えば創傷包帯または経皮運搬系の使用、侵襲性装置、例えば血管または尿道カテーテルの使用、および介入装置、例えば、薬物運搬能を有し拡張装置またはステントグラフトとして設計されたステントの使用を含む。
該製剤は、生物浸食性インプラントを使用して、拡散により、または高分子マトリックスの分解により運搬されうる。ある実施形態においては、該製剤の投与は、三重らせん形成性オリゴヌクレオチドおよび場合によっては供与オリゴヌクレオチドの、ある期間、例えば数時間、数日間、数週間、数ヶ月または数年間にわたる連続的曝露がもたらされるよう設計されうる。これは、例えば、製剤の反復投与により、または反復投与を伴うことなく長期間にわたって該オリゴヌクレオチドが運搬される持続的もしくはコントロールリリース運搬系により達成されうる。そのような運搬系を使用する該製剤の投与は、例えば、経口剤形、ボーラス注射、経皮パッチまたは皮下移植によるものでありうる。いくつかの場合には、該組成物の濃度を実質的に一定に維持することが好ましいかもしれない。
適当な他の運搬系には、時限放出、遅延放出、持続放出または制御放出(コントロールリリース)運搬系が含まれる。そのような系は、多くの場合、反復投与を回避して、対象および医師にとっての簡便さを高める。多数のタイプの放出運搬系が利用可能であり、当業者に公知である。それらには、例えば、高分子に基づく系、例えばポリ乳酸および/またはポリグリコール酸、ポリ無水物、ポリカプロラクトン、コポリオキサラート、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸および/またはこれらの組合せが含まれる。核酸を含有する前記高分子のマイクロカプセルは、例えば米国特許第5,075,109号に記載されている。他の例には、ステロール、例えばコレステロール、コレステロールエステルおよび脂肪酸または中性脂肪、例えばモノ−、ジ−およびトリグリセリドを含む脂質に基づくものである非高分子系;ヒドロゲル放出系;リポソームに基づく系;リン脂質に基づく系;シラスチック(silastic)系;ペプチドに基づく系;ロウコーティング;通常の結合剤および賦形剤を使用する圧縮錠剤;または部分融合インプラントが含まれる。具体例には、マトリックス内の製剤中にmiRNAが含有されている浸食系(例えば、米国特許第4,452,775号、第4,675,189号、第5,736,152号、第4,667,013号、第4,748,034号および第5,239,660号に記載されているもの)、または活性成分が放出速度を制御する拡散系(例えば、米国特許第3,832,253号、第3,854,480号、第5,133,974号および第5,407,686号)が含まれる。該製剤は、例えば、マイクロスフェア、ヒドロゲル、高分子レザバー、コレステロールマトリックスまたは高分子系としてのものでありうる。いくつかの実施形態においては、該系は、例えば、該オリゴヌクレオチドを含有する製剤の拡散または浸食/分解速度の制御により、該組成物の持続的な又は制御された放出が生じることを可能にしうる。また、1以上の実施形態を運搬するために、ポンプに基づく機械的(ハードウェア)運搬系が使用されうる。
放出が爆発的に生じる系の具体例には、高分子マトリックス内に封入されたリポソーム(該リポソームは、特異的刺激、例えば温度、pH、光または分解酵素および系に対して感受性である)内に該組成物が捕捉されている系、およびイオン的に被覆されたマイクロカプセルによりマイクロカプセルコア分解酵素と共に該組成物が封入されている系が含まれる。インヒビターの放出が漸進的かつ連続的である系の具体例には、例えば、マトリックス内の形態で該組成物が含有されている浸食系、および制御された速度で該組成物が例えば高分子を介して浸透する浸出系が含まれる。そのような持続放出系はペレットまたはカプセルの形態でありうる。
いくつかの実施形態においては、長期放出インプラントの使用が特に適しているかもしれない。本明細書中で用いる「長期放出」は、該組成物を含有するインプラントが、少なくとも30または45日間、好ましくは少なくとも60または90日間、場合によってはそれより一層長期にわたって、治療的に有効なレベルの該組成物を運搬するよう構成され配置されていることを意味する。長期放出インプラントは当業者によく知られており、前記の放出系の幾つかを包含する。
特に示さない限り、本明細書中で用いられている全ての科学技術用語は、開示されている本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書中で引用されている刊行物およびそれらが引用している資料を参照により本明細書に組み入れることとする。
CCR5遺伝子の断片へのペプチド核酸の結合および供与オリゴヌクレオチド
ビス−PNAを、高いアフィニティーおよび特異性でCCR5に結合するよう設計した。該PNAは以下の配列により表される:JTJTTJTTJT−e−e−e−TCTTCTTCTC−Lys−Lys−Lys(ここで、J=プソイドイソシトシンおよびe=柔軟性リンカー)(配列番号7)。ゲルシフトアッセイを用いて、インビトロ結合を評価した。該アッセイは、該分子が標的部位にμM濃度で結合することを証明した。3つの一本鎖60マー供与オリゴヌクレオチドを設計し、合成した。全ての供与体は、終止コドンを含有する6個の中央塩基を除き、CCR5遺伝子の鋳型鎖(アンチセンス)と完全に相同であった。タンパク質のトランケート化および誤局在化によりCCR5を不活性化することが示されているΔ32突然変異を模擬するために、この終止コドンがΔ32突然変異部位の付近に配置されるよう、該供与体を設計した。6bp DdeI制限部位(これはインフレーム終止コドンをも含有する)を導入するよう、1つの供与体(983)を設計した。最初の6bp部位に直に隣接(5’または3’)する6塩基が突然変異するよう、残りの2つの供与体(980および987)を設計した。これらはcomp hetの作製のために使用される。全ての6bp突然変異は、完全長CCR5を含有するプラスミド内に、部位特異的に導入した。それらは対立遺伝子特異的PCR(ASPCR)の対照として使用される。
ビス−PNAを、高いアフィニティーおよび特異性でCCR5に結合するよう設計した。該PNAは以下の配列により表される:JTJTTJTTJT−e−e−e−TCTTCTTCTC−Lys−Lys−Lys(ここで、J=プソイドイソシトシンおよびe=柔軟性リンカー)(配列番号7)。ゲルシフトアッセイを用いて、インビトロ結合を評価した。該アッセイは、該分子が標的部位にμM濃度で結合することを証明した。3つの一本鎖60マー供与オリゴヌクレオチドを設計し、合成した。全ての供与体は、終止コドンを含有する6個の中央塩基を除き、CCR5遺伝子の鋳型鎖(アンチセンス)と完全に相同であった。タンパク質のトランケート化および誤局在化によりCCR5を不活性化することが示されているΔ32突然変異を模擬するために、この終止コドンがΔ32突然変異部位の付近に配置されるよう、該供与体を設計した。6bp DdeI制限部位(これはインフレーム終止コドンをも含有する)を導入するよう、1つの供与体(983)を設計した。最初の6bp部位に直に隣接(5’または3’)する6塩基が突然変異するよう、残りの2つの供与体(980および987)を設計した。これらはcomp hetの作製のために使用される。全ての6bp突然変異は、完全長CCR5を含有するプラスミド内に、部位特異的に導入した。それらは対立遺伝子特異的PCR(ASPCR)の対照として使用される。
PNAおよび供与オリゴヌクレオチドを使用するTHP−1ヒト白血病細胞におけるCCR5遺伝子の突然変異
突然変異体CCR5配列の特異的増幅のために、ASPCRプライマーを設計した。特異的な6bp突然変異体配列をその3’末端に含有する対立遺伝子特異的フォワードプライマーを設計した。遺伝子特異的リバースプライマーとペアになった場合に、該対立遺伝子特異的プライマーは突然変異体CCR5遺伝子を優先的に増幅するであろう。ASPCR条件を決定するために、該突然変異体配列の特異的増幅のための最適Tmを決定するために、プラスミド対照に関して勾配を用いた。ついで、相同組換えに関して試験するために、供与分子とビス−PNAとの組合せをTHP−1細胞内にトランスフェクトし、これらの細胞からのゲノムDNAをASPCRにより分析した。
突然変異体CCR5配列の特異的増幅のために、ASPCRプライマーを設計した。特異的な6bp突然変異体配列をその3’末端に含有する対立遺伝子特異的フォワードプライマーを設計した。遺伝子特異的リバースプライマーとペアになった場合に、該対立遺伝子特異的プライマーは突然変異体CCR5遺伝子を優先的に増幅するであろう。ASPCR条件を決定するために、該突然変異体配列の特異的増幅のための最適Tmを決定するために、プラスミド対照に関して勾配を用いた。ついで、相同組換えに関して試験するために、供与分子とビス−PNAとの組合せをTHP−1細胞内にトランスフェクトし、これらの細胞からのゲノムDNAをASPCRにより分析した。
THP−1細胞を、何も無し、5μgの983供与体、または2μM PNAを伴う5μgの983供与体でトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、約100万個の細胞のアリコートを採取し、ゲノムDNAを単離した。983対立遺伝子特異的プライマーを使用してDNAサンプルに関して対立遺伝子特異的PCRを行った。UP突然変異に対応するバンドが該処理サンプルにおいて認められる。野生型または6bpの983突然変異体配列を含有するプラスミドDNAも、PCR対照として移動させた。1%アガロースゲル上でサンプルを移動させた。リアルタイムASPCRアッセイを遺伝子特異的プライマーに対する正規化と共に用いて、該サンプルゲノムDNAサンプルをアッセイした。これらのトランスフェクションからのゲノムDNAのASPCRは、該突然変異体DNAに対応する特異的増幅を示した(図1)。このアニーリング温度およびサイクル閾値においては、低いバックグラウンドの増幅も認められうる。プラスミド対照は該突然変異体配列の特異的増幅を証明している。
980または987供与体で処理した細胞から集めたゲノムDNAのASPCRは、該突然変異が互いに隣接している場合であっても、このアッセイの特異性を示している。THP−1細胞を、何も無し、5μgの980供与体または5μgの987供与体でトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、約100万個の細胞のアリコートを採取し、ゲノムDNAを単離した。980または987特異的プライマーを使用して、ASPCRを行った。該PCR反応物を1%アガロースゲル上で移動させた。987供与体を使用した場合の980特異的プライマーにおいても、また、980供与体を使用した場合の987プライマーにおいても、増幅は認められなかった。
また、983突然変異の維持が500時間の時点でDNAレベルで検出され、220時間の時点でRNAレベルで検出されている。THP−1細胞を5μgの983供与体または何も無しでトランスフェクトし、与えられた時点でアリコートを採取した。ゲノムDNAを単離し、ASPCRを行い、1%アガロースゲル上で分析した。
本明細書に記載されている本発明の特定の実施実施形態の多数の均等物を当業者は認識するか又は単なる通常の実験を用いて確認しうるであろう。そのような均等物も以下の特許請求の範囲に含まれると意図される。
Claims (20)
- 二重らせんDNAに配列特異的に結合して三本鎖構造を形成する三重らせん形成性分子と、供与オリゴヌクレオチドとを含んでなる組換え誘発性または突然変異誘発性組成物であって、該三重らせん形成性分子が、HIVに対する細胞表面受容体をコードするヒト遺伝子内の又は該遺伝子に隣接した標的部位に結合する、組換え誘発性または突然変異誘発性組成物。
- 該三重らせん形成性分子が、三重らせん形成性オリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸よりなる群から選ばれる、請求項1記載の組換え誘発性または突然変異誘発性組成物。
- 該ペプチド核酸が二本鎖ビス−ペプチド核酸である、請求項2記載の組換え誘発性または突然変異誘発性組成物。
- 該三重らせん形成性オリゴヌクレオチドが1以上の化学修飾オリゴヌクレオチドを含む、請求項2記載の組換え誘発性または突然変異誘発性組成物。
- 該標的部位がヒトケモカイン遺伝子中又は該遺伝子内に存在する、請求項1記載の組換え誘発性または突然変異誘発性組成物。
- 該ヒトケモカイン遺伝子が、CXCR4、CCR5、CCR2b、CCR3およびCCR1よりなる群から選ばれる、請求項5記載の組換え誘発性または突然変異誘発性組成物。
- 該ヒトケモカイン遺伝子がCCR5である、請求項5記載の組換え誘発性または突然変異誘発性組成物。
- 該標的部位がCCR5遺伝子中のΔ32突然変異の部位を含む、請求項7記載の組換え誘発性または突然変異誘発性組成物。
- 該供与オリゴヌクレオチドが、該標的二重らせんDNAヌクレオチド配列と比較して1以上のヌクレオチド突然変異、欠失または挿入を含む、請求項1記載の組換え誘発性または突然変異誘発性組成物。
- 該供与オリゴヌクレオチドが、該標的二重らせんDNAヌクレオチド配列中のミスセンスまたはナンセンス突然変異を引き起こす1以上の点突然変異を含み、該ミスセンスまたはナンセンス突然変異が該標的二重らせんDNAにおいてフレームシフトまたは欠失を引き起こす、請求項9記載の組換え誘発性または突然変異誘発性組成物。
- 該突然変異、欠失または挿入が、HIVに対する細胞表面受容体欠損を引き起こし、該欠損が、該受容体の発現の低下、該細胞表面への該受容体の輸送の欠陥、該受容体タンパク質の安定性の低下、該受容体によるHIVの結合の低下および該受容体のエンドサイトーシスの欠陥よりなる群から選ばれる、請求項9記載の組換え誘発性または突然変異誘発性組成物。
- 細胞を請求項1記載の組成物と接触させることを含んでなる、HIVに対する細胞表面受容体をコードする遺伝子の標的化組換えまたは突然変異のための方法であって、該供与オリゴヌクレオチドが、該標的二重らせんDNAヌクレオチド配列と比較して1以上のヌクレオチド突然変異、欠失または挿入を含む、方法。
- HIV感染した又はその発生の危険性がある対象におけるHIV感染の予防または治療方法であって、
a)細胞を宿主から単離し、
b)該細胞を請求項1記載の組成物とエクスビボで接触させ(該供与オリゴヌクレオチドは、該標的二重らせんDNAヌクレオチド配列と比較して1以上のヌクレオチド突然変異、欠失または挿入を含む)、
c)該細胞を培養中で増殖させ、
d)該細胞を、それを要する対象に投与すること、を含んでなる方法。 - 該細胞が1以上のHIV株による感染に対して耐性である、請求項13記載の方法。
- 該細胞がR5指向性HIV株に対して耐性である、請求項14記載の方法。
- 治療すべき対象または同系宿主から該細胞を単離する、請求項13記載の方法。
- 該細胞がCD34+細胞である、請求項13記載の方法。
- 段階d)の前に該細胞をCD4+細胞に分化させることを更に含む、請求項15記載の方法。
- HIV感染した又はその発生の危険性がある対象におけるHIV感染の予防または治療方法であって、予防又は治療方法を必要とする対象に請求項1記載の組成物を投与することを含んでなり、該供与オリゴヌクレオチドが、該標的二重らせんDNAヌクレオチド配列と比較して1以上のヌクレオチド突然変異、欠失または挿入を含む、方法。
- 請求項12記載の方法により製造された細胞系。
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