JP2022058776A - 系統特異的抗原の阻害のための組成物および方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】造血器悪性腫瘍を治療する方法を提供する。【解決手段】被験体に（ｉ）系統特異的細胞表面抗原を標的にする作用物質の効果的な量であって、ここで前記作用物質が前記系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメントを含む、作用物質の効果的な量、および（ｉｉ）前記系統特異的細胞表面抗原を欠く造血細胞集団、を投与することを含む、方法である。【選択図】図１

Description

関連案件の相互参照
本出願は、２０１５年１０月１６日出願、米国特許仮出願第６２／２４２，６８５号の
優先権をＵ．Ｓ．Ｃ．§１１９に基づき主張し、その全体が参考として本明細書に援用さ
れる。
数十年の試みにも関わらず、癌に対する治癒的な免疫学的療法は達成することが非常に
困難であり、基本的なベースは抗体またはＴ細胞（Ｔ細胞受容体を介した）のいずれかに
よる抗原認識能力である（Ｃｏｕｓｉｎ－Ｆｒａｎｋｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）
３４２：１４３２）。抗体をベースとした免疫療法は癌に対して、標的抗原が腫瘍細胞で
正常細胞と比べて上方調節されている場合（例えば、Ｈｅｒ－２増殖性乳癌におけるＨｅ
ｒ－２）、あるいは腫瘍細胞が抗体または抗体毒素共役体によって認識される抗原を発現
する場合（例えば、ＣＤ２０に対するリツキシマブ）、広範に使用されている（Ｂａｓｅ
ｌｇａら，Ａｎｎａｌｓ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２００１）１２：Ｓ３５）。抗体をベース
とした免疫療法を用いた臨床試験が、限定された数の癌タイプにおける改善された患者生
存を示しているが（通常、標準的な化学療法と併用されたとき）、これらの効果はしばし
ば重大な安全性および効能の問題を伴う（Ｃｏｕｓｉｎ－Ｆｒａｎｋｅｌ Ｃａｎｃｅｒ
， Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）３４２：１４３２）。
癌に対する効果的なＴ細胞療法は、臨床的に達成することがさらに困難である（Ｓｃｈ
ｍｉｔｔら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２００９）２０（１１）：１２４０）。癌
に対する効果的なＴ細胞療法は、癌細胞上の抗原に対して高い親和性結合を有するＴ細胞
に依存する。キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）は広く使用されており、細胞上
の抗原を高い親和性と特異性の両方で認識し、ペプチドを「提示する」ＨＬＡ抗原などの
補助認識分子を必要としない。ＣＡＲ Ｔ細胞のＴ細胞受容体は、抗原結合性重鎖および
軽鎖と「交換」されており、従って、ＨＬＡ補助分子の必要性が除かれる。組換えＣＡＲ
Ｔ受容体は、標的抗原へのＣＡＲ Ｔ受容体の結合によってＴ細胞の活性化をもたらす
シグナル領域に融合される。
ＣＡＲ Ｔ細胞の臨床的使用は、狭い範囲の細胞表面抗原を標的とすることに限定され
ており、癌の治療における改善された新規方法の必要性をさらに裏付ける。特に、新規方
法は、治療の現標準である強い化学療法を受けることができない高齢患者における転帰が
、５～１０ヶ月のみの中央生存で、非常に乏しいままである急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）
などの疾患のために必要である（Ｄｏｈｎｅｒら，ＮＥＪＭ（２０１５）３７３：１１３
６）。
腫瘍細胞上の系統特異的細胞表面抗原の特定クラスを標的にする癌免疫療法に対する新
規方法が本明細書で開示される。ＣＡＲ Ｔ細胞治療がまた、系統特異的細胞表面抗原を
欠如している改変細胞集団の注入または再注入による非腫瘍細胞の交換と組み合わされる
。腫瘍の再発は、ＣＡＲ Ｔ細胞によりインビボで患者の監視を維持することによって防
止または低下される。
本開示は、系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメントを含む作用物質（
例えば、ＣＤ３３を標的にするキメラ受容体を発現する免疫細胞）が、系統特異的細胞表
面抗原を発現する細胞の細胞死を選択的にもたらすが、一方、抗原を欠く細胞（例えば、
遺伝子工学処理された造血細胞）はこれによって生じる細胞死を逃れるという発見に、少
なくとも部分的に基づいている。このような発見に基づき、系統特異的細胞表面抗原を標
的にする作用物質、例えば、ＣＤ３３を標的にするＣＡＲ－Ｔ細胞と、系統特異的細胞抗
原（例えば、ＣＤ３３）を欠く造血細胞との組み合わせを含む免疫療法が、造血器悪性腫
瘍の有効な治療方法をもたらすことが期待されている。
本開示の一つの態様は造血器悪性腫瘍を治療するための方法を提供し、本方法はこの方
法を必要とする被験体に、（ｉ）系統特異的細胞表面抗原を標的とする作用物質の効果的
な量、ここで作用物質は系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメントを含み
、および（ｉｉ）系統特異的細胞表面抗原を欠く造血細胞の集団、を投与することを含む
。いくつかの実施形態では、作用物質は系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラ
グメントを含むキメラ受容体を発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）であってよい。いく
つかの実施形態では、免疫細胞、造血細胞、またはこの両方は、同種異系または自家であ
る。いくつかの実施形態では、造血細胞は造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋／ＣＤ３３－
ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態では、造血幹細胞は骨髄細胞または末梢血単核細胞
（ＰＢＭＣ）から得ることができる。
いくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントは２型系統特異的細胞表面抗原（例え
ば、ＣＤ３３）である系統特異的細胞表面抗原を結合する。いくつかの実施形態では、抗
原結合フラグメントは１型系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ１９）である系統特異
的細胞表面抗原を結合する。
いくつかの実施形態では、キメラ受容体における抗原結合フラグメトは、ヒトＣＤ３３
またはＣＤ１９などのヒトタンパク質であり得る系統特異的細胞表面抗原を特異的に結合
する単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖはヒ
トＣＤ３３に結合し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２中のものと同じ相補的決定領域（ＣＤＲ
）を有する重鎖可変領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３中のものと同じＣＤＲを有す
る軽鎖可変領域を含む。一つの例では、ｓｃＦｖはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸
配列を有する重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸配列を有する軽鎖
可変領域を含む。
キメラ受容体はさらに、（ａ）ヒンジ領域、（ｂ）膜貫通領域、（ｃ）少なくとも１つ
の共刺激領域、（ｄ）細胞質シグナル伝達領域、または（ｅ）これらの組み合わせを含み
得る。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領
域を含み、それはＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、Ｐ
Ｄ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧ
ＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、またはこれらの組み合わせの共刺
激受容体由来であってよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの共刺激シグナル
伝達領域は、ＣＤ２８のシグナル伝達領域およびＩＣＯＳのシグナル伝達領域を含むハイ
ブリッド共刺激領域である。一つの例では、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域は
ＣＤ２８由来であり、キメラ受容体は４－１ＢＢまたはＩＣＯＳ由来の第二共刺激シグナ
ル伝達領域をさらに含む。
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ３ζ由来である細胞質シグナル伝達領
域を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８αまたはＣＤ２８α由来で
あるヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体抗体は、ＣＤ８、ＣＤ２
８、またはＩＣＯＳ由来である膜貫通領域を含む。
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、Ｎ端からＣ端へと、（ｉ）系統特異的細胞
表面抗原（例えば、ＣＤ３３またはＣＤ１９）に結合するｓｃＦｖ、ＣＤ８α由来ヒンジ
領域、ＣＤ８由来膜貫通領域、４－１ＢＢ由来共刺激領域、およびＣＤ３ζ由来細胞質シ
グナル伝達領域、（ｉｉ）系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３またはＣＤ１９）
に結合するｓｃＦｖ、ＣＤ８α由来ヒンジ領域、ＣＤ２８由来膜貫通領域、ＣＤ２８由来
共刺激領域、およびＣＤ３ζ由来細胞質シグナル伝達領域、または（ｉｉｉ）系統特異的
細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３またはＣＤ１９）に結合するｓｃＦｖ、ＣＤ８α由来ヒ
ンジ領域、ＣＤ２８由来膜貫通領域、ＣＤ２８由来第一共刺激領域、４－１ＢＢ由来第二
共刺激領域、およびＣＤ３ζ由来細胞質シグナル伝達領域を含む。
本明細書で説明される方法のいずれかでは、被験体はホジキンリンパ腫、非ホジキンリ
ンパ腫、白血病、または多発性骨髄腫を有し得る。いくつかの例では、被験体は急性骨髄
性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、または慢性リンパ芽球性白血病
である白血病を有する。
別の態様では、本開示は本明細書で説明されるキメラ受容体のいずれかをコードするヌ
クレオチド配列を含む核酸を提供する。キメラ受容体は、ＣＤ３３を結合する抗原結合フ
ラグメント、膜貫通領域、およびＣＤ３ζ由来細胞質シグナル伝達領域などの細胞質シグ
ナル伝達領域を含み得る。抗原結合フラグメント（例えば、ｓｃＦｖフラグメント）は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２中のものと同じＣＤＲを有する重鎖可変領域、およびＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１３中のものと同じＣＤＲを有する軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形
態では、ｓｃＦｖは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、
およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
本開示の他の態様は、本明細書で示される核酸のいずれかを含むベクターを提供する。
本明細書で説明される核酸によってコードされるキメラ受容体およびこのようなキメラ受
容体を発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）もまた本開示の範囲内である。いくつかの実
施形態では、免疫細胞は造血器悪性腫瘍を有する患者から得ることができる。
本開示の別の態様は、遺伝子工学処理前には造血細胞に存在する系統特異的細胞表面抗
原（例えば、ＣＤ３３、ＣＤ１９）を欠く、遺伝子工学処理された造血細胞（例えば、Ｈ
ＳＣ）を提供する。いくつかの実施形態では、系統特異的細胞表面抗原をコードする内因
性遺伝子のすべてまたは一部が、例えばゲノム編集（例えば、ジンクフィンガーヌクレア
ーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エファクターベースヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ま
たはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む）によって除去される。いくつかの実施形態では、系
統特異的細胞表面抗原はＣＤ３３であり、ＣＤ３３の免疫グロブリン定常（ＩｇＣ）領域
の一部が除去される。いくつかの実施形態では、造血細胞は造血幹細胞（例えば、ＣＤ３
４＋／ＣＤ３３－細胞）である。
いくつかの実施形態では、造血幹細胞は骨髄細胞または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）か
ら得ることができる。
本明細書で説明される系統特異的細胞表面抗原を欠く細胞を産生する方法もまた本明細
書で提供される。本方法は細胞を用意すること、および細胞中に（ｉ）系統特異的細胞表
面抗原（例えば、ＣＤ３３、ＣＤ１９）をコードするヌクレオチド配列の一部にハイブリ
ダイズするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）のヌクレオチド配列を含む
核酸、および（ｉｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）を
導入することを含む。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ｇＲＮＡのヌクレオチド配列を含む核酸お
よびＣａｓヌクレアーゼは、例えば、同じ核酸または異なる核酸にコードされる、あるい
は前形成されたリボヌクレオタンパク質複合体として細胞中に導入され得る。いくつかの
実施形態では、ｇＲＮＡがハイブリダイズするヌクレオチド配列の一部は１８～２２個の
ヌクレオチドからなる。いくつかの例では、ｇＲＮＡはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１または
ＮＯ：２８～３１のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、細胞は造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋）などの造血細胞で
ある。
（ｉ）系統特異的細胞表面抗原を標的とし、系統特異的な細胞表面抗原を結合する抗原
結合フラグメントを含む作用物質を含む免疫細胞、および（ｉｉ）系統特異的細胞表面抗
原を欠く造血細胞（例えば、造血幹細胞）の集団、を含むキットも本開示の範囲内である
。いくつかの実施形態では、系統特異的な細胞表面抗原を標的にする作用物質はキメラ細
胞を発現する免疫細胞であり、それは系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグ
メントを含む。
さらに、本開示は、造血器悪性腫瘍を治療する使用のために系統特異的表面抗原を標的
にする免疫細胞のいずれか、および／または系統特異的細胞表面抗原を欠く造血細胞のい
ずれかを含む医薬組成物、ならびに造血器悪性腫瘍を治療する使用のための医薬品を製造
するための当該免疫細胞および造血細胞の使用を提供する。
本開示の１つ以上の実施形態の詳細が下の説明で示される。本開示の他の特徴または利
点は、いくつかの実施形態の詳細な説明および添付の請求からも明らかである。
次の図は本明細書の一部をなし、本開示の特定の態様をさらに実証するために含まれ、
それは本明細書で提示される具体的な実施形態の詳細な説明とともにこれらの図の１つ以
上を参考にしてよりよく理解できる。
０型、１型、２型、および３型系統特異的抗原の例示的な説明を示す図である。 ０型系統特異的細胞表面抗原であるＣＤ３０７を標的にするキメラ受容体を発現する免疫細胞を図式的に示す図である。ＣＤ３０７を発現する多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞、さらに形質細胞などのＣＤ３０７を発現する他の細胞が、抗ＣＤ３０７キメラ受容体を発現する免疫細胞によって標的にされる。 ２型系統特異的細胞表面抗原であるＣＤ３３を標的とするキメラ受容体を発現する免疫細胞を図式的に示す図である。急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞はＣＤ３３を発現する。ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）はＣＤ３３を欠くように遺伝子工学処理され、従って抗ＣＤ３３キメラ受容体を発現する免疫細胞によって認識されない。ＨＳＣは骨髄細胞を増加させることができる。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いたゲノム編集を図式的に示す図である。ｓｇＲＮＡは系統特異的細胞表面抗原のエクソンの一部にハイブリダイズし、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列（５’－ＮＧＧ－３’）の上流を切断する。配列は、上から下へ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５および４６に相当する。 ＣＤ３３を破壊するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を用いたゲノム編集方法を図式的に示す図である。Ｃａｓ９タンパク質をコードするＰＸ４５８ベクターおよびＣＤ３３を標的にするガイドＲＮＡを、ヒト白血病細胞株であるＫ－５６２細胞中に核導入した。フローサイトメトリーを、細胞へのＣａｓ９およびガイドＲＮＡの送達前（上図）および送達後（下図）に抗ＣＤ３３抗体を用いて細胞集団で実施した。ゲノム編集は遺伝子のコード領域の欠失および細胞表面からのＣＤ３３の著しい低下をもたらした。 ＣＤ４５ＲＡを破壊するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を用いたゲノム編集方法を図式的に示す図である。Ｃａｓ９タンパク質をコードするＰＸ４５８ベクターおよびＣＤ４５ＲＡを標的にするガイドＲＮＡを、ＴＩＢ－６７細網細胞肉腫マウスマクロファージ様細胞中に核導入した。フローサイトメトリーを、細胞へのＣａｓ９およびガイドＲＮＡの送達前（上図）および送達後（下図）に抗ＣＤ４５ＲＡ抗体を用いて細胞集団で実施した。ゲノム編集は遺伝子のコード領域の欠失および細胞表面からのＣＤ４５ＲＡの著しい低下をもたらした。 ＣＤ３３を標的とする抗原結合フラグメントを含む例示的なキメラ受容体の概要を示す図である。Ａ：抗ＣＤ３３ｓｃＦｖ、ヒンジ領域、膜貫通領域、共刺激領域、およびシグナル伝達領域を含む、ＣＤ３３を標的とする包括的なキメラ受容体。Ｂ：抗ＣＤ３３ｓｃＦｖ、ＣＤ８由来ヒンジ領域、ＣＤ８由来膜貫通領域、ならびにＣＤ２８およびＣＤ３ζ由来細胞内領域を含む、ＣＤ３３を標的とするキメラ受容体。Ｃ：抗ＣＤ３３ｓｃＦｖ、ＣＤ８由来ヒンジ領域、ＣＤ８由来膜貫通領域、ならびにＩＣＯＳ（またはＣＤ２７、４－１ＢＢ、またはＯＸ－４０）およびＣＤ３ζ由来細胞内領域を含む、ＣＤ３３を標的とするキメラ受容体。Ｄ：抗ＣＤ３３ｓｃＦｖ、ＣＤ８由来ヒンジ領域、ＣＤ８由来膜貫通領域、ならびにＯＸ－４０、ＣＤ２８、およびＣＤ３ζ由来細胞内領域を含む、ＣＤ３３を標的とするキメラ受容体。 免疫毒素を図式的に示す図である。 空ベクターまたは抗ＣＤ３３キメラ受容体をコードするベクターによって形質導入されたＫ５６２で発現される抗ＣＤ３３キメラ受容体の発現を示す図である。Ａ：ＣＤ３ζを認識する一次抗体を用いたウェスタンブロット。表は試験したキメラ受容体それぞれの推定される分子量を示す。Ｂ：抗ＣＤ３３キメラ受容体で陽性に染色される細胞集団の増加を示すフローサイトメトリー分析。 ＣＤ３３に結合する抗ＣＤ３３キメラ受容体を示す図である。Ａ：ポンソー染色したタンパク質ゲル。レーン１、３、５：ＣＤ３３分子。レーン２、４、６：ＣＤ３３分子＋ＡＰＣ共役体。Ｂ：ＣＤ３ζを認識する一次抗体を用いたウェスタンブロット。レーン１、３、および５はＣＤ３３分子と共インキュベーションされたキメラ受容体を含み、レーン２、４、および６はＣＤ３３－ＡＰＣ共役体化と共インキュベーションされたキメラ受容体を含む。Ｃ：抗ＣＤ３３キメラ受容体を発現してＣＤ３３を結合する細胞集団の増加を示すフローサイトメトリー分析。 表示のキメラ受容体を発現するＮＫ９２細胞によるＫ５６２細胞の細胞毒性を示す。Ａ：空ＨＩＶｚｓＧベクターと比較したＣＡＲＴ１およびＣＡＲＴ２。Ｂ：空ＨＩＶｚｓＧベクターと比較したＣＡＲＴ３。 表示のキメラ受容体を発現するＮＫ９２細胞によるＣＤ３３を欠くＫ５６２細胞の細胞毒性（ｙ軸で細胞毒性パーセントとして表示）を示す。Ａ：ＣＤ３３標的化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ試薬で前処理されたＫ５６２細胞の未分類集団。Ｂ：ＣＤ３３を欠くＫ５６２細胞の単独クローン。棒グラフは左から右に、空ＨＩＶｚｓＧベクター、ＣＡＲＴ１、ＣＡＲＴ２、およびＣＡＲＴ３に相当する。 一次Ｔ細胞集団のフローサイトメトリー分析を示す図である。Ａ：Ｔ細胞マーカーＣ４＋、ＣＤ８＋、または両ＣＤ４＋ＣＤ８＋の発現に基づいた細胞の分類。Ｂ：一次Ｔ細胞の表示した集団におけるＣＤ３３の相対的発現。 表示のキメラ受容体を発現する一次Ｔ細胞によるＫ５６２細胞の細胞毒性。Ａ：ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｂ：ＣＤ４＋／ＣＤ８＋（ＣＤ４／８）およびＣＤ８＋（ＣＤ８）。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系および２つの異なるｇＲＮＡを用いたＫ６５２細胞におけるＣＤ３３編集のフローサイトメトリー分析を示す図である（Ｃｒｉｓｐｒ３、右上図、およびＣｒｉｓｐｒ５、右下図）。 ＣＤ３３を欠くＫ５６２細胞が正常な細胞増殖および赤血球形成分化を示すことを示す図である。Ａ：表示の細胞集団の＋５０μＭヘミンの１日目のフローサイトメトリー分析。Ｂ：表示の細胞集団の９日目のフローサイトメトリー分析。Ｃ：ＭＴＴ細胞増殖アッセイ。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系および２つの異なるｇＲＮＡを用いたヒトＣＤ３４＋細胞におけるＣＤ３３編集のフローサイトメトリー分析を示す図である（ｃｒｉｓｐｒ３、左下図、およびｃｒｉｓｐｒ５、右下図）。Ａ：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を用いたヒトＣＤ３４＋細胞におけるＣＤ３３編集のフローサイトメトリー分析。Ｂ：ｃｒｉｓｐｒ３。Ｃ：ｃｒｉｓｐｒ５。 ヒトＣＤ３４＋／ＣＤ３３－細胞のコロニー形成をヒトＣＤ３４＋／ＣＤ３３＋と比較して示す図である。棒グラフは左から右に、レンチウイルス未感染、空ベクターコントロール、ｃｒｉｓｐｒ１、ｃｒｉｓｐｒ３、およびｃｒｉｓｐｒ５に相当する。
癌細胞の細胞表面に存在する抗原を標的にする癌免疫療法は、被験体の発達および／ま
たは生存に必要とされるか大いに関与する正常な非癌細胞の表面にも標的抗原が存在する
とき、特に困難である。これらの抗原を標的化することは、癌細胞に加えてこのような細
胞に対する免疫療法の細胞毒性効果のために、被験体において有害な効果をもたらし得る
。
本明細書で説明される方法、核酸、および細胞は、癌細胞だけでなく、被験体の発達お
よび／または生存に重要な細胞にも存在する抗原（例えば、１型または２型抗原）を標的
することを可能にする。本方法は、（１）標的系統特異的細胞表面抗原を有する細胞の数
を、当該抗原を標的とする作用物質を用いて低下させること、および（２）抗原を提示し
そのため作用物質の投与によって殺され得る正常細胞（例えば、非癌細胞）の、系統特異
的細胞表面抗原を欠く造血細胞との置換を含む。本明細書で説明される方法は、対象の系
統特異的細胞表面抗原を発現する癌細胞を含む標的細胞の監視を維持でき、そしてまた、
被験体の発達および／または生存に重要であり得る系統特異的抗原を発現する非癌細胞集
団を維持できる。
従って、造血器悪性腫瘍を治療するために、ＣＤ３３またはＣＤ１９などの系統特異的
細胞表面抗原を標的にする抗原結合フラグメントを含むキメラ受容体を発現する免疫細胞
、および系統特異的細胞表面抗原を欠く造血幹細胞（ＨＳＣ）などの造血細胞の共使用が
本明細書で説明される。また、キメラ受容体、これをコードする核酸、これを含むベクタ
ー、およびそのようなキメラ受容体を発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）が本明細書で
提供される。本開示はまた、本明細書で説明されるような系統特異的抗原を欠く遺伝子工
学処理された造血細胞、ならびにその作製方法（例えば、ゲノム編集方法）を提供する。
定義
用語「被験体」、「個体」、および「患者」は交換可能に使用され、脊椎動物、好まし
くはヒトなどの哺乳動物を指す。哺乳動物は、限定されないが、ヒト霊長類、非ヒト霊長
類、あるいはネズミ、ウシ、ウマ、イヌまたはネコ種を含む。本開示の文脈では、用語「
被験体」はまた、インビトロまたは体外で培養できる、あるいはインビボで操作できる組
織または細胞を包含する。用語「被験体」は、用語「生物」と交換可能に使用され得る。
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、お
よび「オリゴヌクレオチド」は交換可能に使用される。これらは、任意の長さのデオキシ
リボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、あるいはこれらのアナログであるヌクレオチ
ドの重合型を指す。ポリヌクレオチドの例は、限定されないが、遺伝子または遺伝子フラ
グメントのコードまたは非コード領域、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（
ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、
短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮ
Ａ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配
列の分離されたＤＮＡ、任意の配列の分離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマ
ーを含む。ポリヌクレオチド内の１つ以上のヌクレオチドはさらに改変されてよい。ヌク
レオチドの配列は非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドはまた、
標識物質との共役体化によってなど、重合化後に修飾され得る。
用語「ハイブリダイゼーション」は、１つ以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレ
オチド残基の塩基間の水素結合によって安定化される複合体を形成する反応を指す。水素
結合は、ワトソンクリック塩基対形成、フーグスティーン結合、またはいずれかの他の配
列特異的様式によって生じ得る。複合体は、二本鎖構造を形成する２本のストランド、複
数ストランド複合体を形成する３本以上のストランド、単一自己ハイブリダイゼーション
ストランド、またはこれらのいずれかの組み合わせを含み得る。ハイブリダイゼーション
反応は、ＰＣＲの開始、または酵素によるポリヌクレオチドの切断などの、さらに広範な
工程におけるステップを構成し得る。所定の配列とハイブリダイズできる配列は、所定配
列の「相補体」と呼ばれる。
用語「組換え発現ベクター」は、構築体がｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、また
はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、かつベクターが細胞内で発現されるｍ
ＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを有するのに十分な条件下で細胞と
接触される場合に、ホスト細胞によるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプ
チドの発現を可能にする遺伝子改変されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド構
築体を意味する。本開示のベクターは総じて自然発生的ではない。ベクターの一部は自然
発生であってよい。本開示の非自然発生組換え発現ベクターは、ヌクレオチドのいずれか
のタイプを含んでよく、限定されないが、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、それは一本鎖また
は二本鎖であってよく、合成されるか一部は自然源から得られ、かつ天然の、非天然の、
または変異したヌクレオチドを含んでよい。
本明細書で使用される「トランスフェクション」、「形質転換」、または「形質導入」
は、物理的または化学的方法によるホスト細胞中への１つ以上の外因性ポリヌクレオチド
の導入を指す。
「抗体」、「抗体のフラグメント」、「抗体フラグメント」、「抗体の機能的フラグメ
ント」、または「抗原結合部分」は交換可能に使用され、特定抗原に特異的に結合する能
力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントまたは部分を意味する（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら
，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００５）２３（９）：１１２６）。本抗体は抗体および
／またはそのフラグメントであり得る。抗体フラグメントはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓ
ｃＦｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、Ｆｃ、または変異体、および／または混合物を含む。抗
体は、キメラ、ヒト化、単鎖、または二重特異的であり得る。すべての抗体アイソタイプ
が本開示によって包含され、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭを含む。適
切なＩｇＧサブタイプはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む。抗体軽
鎖または重鎖可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの超可変領域によっ
て中断されるフレームワークからなる。本抗体または抗原結合部分のＣＤＲは、非ヒトの
またはヒトの起源からであってよい。本発明の抗体または抗原結合部分のフレームワーク
は、ヒト、ヒト化、非ヒト（例えば、ヒトにおける抗原性を低下するように改変されたネ
ズミフレームワーク）、または合成フレームワーク（例えば、共通配列）であってよい。
本抗体または抗原結合部分は、約１０－７Ｍ未満、約１０－８Ｍ未満、約１０－９Ｍ未
満、約１０－１０Ｍ未満、約１０－１１Ｍ未満、または約１０－１２Ｍ未満の解離定数（
ＫＤ）で特異的に結合できる。本開示による抗体の親和性は、従来技術を用いて容易に測
定できる（Ｓｃａｔｃｈａｒｄら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９４９）５
１：６６０、および米国特許第５，２８３，１７３号、第５，４６８，６１４号、または
同等文献）。
用語「キメラ受容体」、「キメラ抗原受容体」、またはこれに代えて「ＣＡＲ」は、全
体を通して交換可能に使用され、少なくとも細胞外抗原結合領域、膜貫通領域、および下
記で定められる刺激分子由来の機能的シグナル伝達領域を含む細胞質シグナル伝達領域（
本明細書では「細胞内シグナル伝達領域」ともいう）を含む組換えポリペプチド構築体を
指す。Ｌｅｅら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１２）１８（１０）：２７８
０、Ｊｅｎｓｅｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．（２０１４）２５７（１）：１２７、ｗ
ｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ａｂｏｕｔ－ｃａｎｃｅｒ／ｔｒｅａｔｍｅｎｔ／ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ／ｃａｒ－ｔ－ｃｅｌｌｓ。一つの実施形態では、刺激分子はＴ細胞受容体複
合体と関連するゼータ鎖である。一つの態様では、細胞質シグナル伝達領域は、下記で定
められる少なくとも１つの共刺激分子由来の１つ以上の機能的シグナル伝達領域をさらに
含む。共刺激分子はまた、４－１ＢＢ（例えば、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、および／また
はＣＤ２８、またはこれら分子のフラグメントであり得る。別の態様では、ＣＡＲは、細
胞外抗原認識領域、膜貫通領域、および刺激分子由来の機能的シグナル伝達領域を含む細
胞内シグナル伝達領域を含む、キメラ融合タンパク質を含む。ＣＡＲは、細胞外抗原認識
領域、膜貫通領域、ならびに共刺激分子由来の機能的シグナル伝達領域および刺激分子由
来の機能的シグナル伝達領域を含む細胞内シグナル伝達領域を含む、キメラ融合タンパク
質を含む。あるいは、ＣＡＲは、細胞外抗原認識領域、膜貫通領域、ならびに１つ以上の
共刺激分子由来の２つの機能的シグナル伝達領域および刺激分子由来の機能的シグナル領
域を含む細胞内シグナル伝達領域を含む、キメラ融合タンパク質を含む。ＣＡＲはまた、
細胞外抗原認識領域、膜貫通領域、ならびに１つ以上の共刺激分子由来の少なくとも２つ
の機能的シグナル領域および刺激分子由来の機能的シグナル伝達領域を含む、キメラ融合
タンパク質を含む。核酸配列によってコードされるＣＡＲの抗原認識部分は、いずれかの
系統特異的な抗原結合抗体フラグメントを含んでよい。抗体フラグメントは、１つ以上の
ＣＤＲ、可変領域（またはこの一部）、定常領域（またはこの一部）、または上記のいず
れかの組み合わせを含んでよい。
用語「シグナル伝達領域」は、細胞内で情報を伝達することにより、第二メッセンジャ
ーを生じることにより、またはこのようなメッセンジャーに応答することによりエフェク
ターとして機能して、定められたシグナル伝達経路を介して細胞活性を調節するように作
用するタンパク質の機能的部分を指す。
用語「ゼータ」またはこれに代えて「ゼータ鎖」、「ＣＤ３－ゼータ」、または「ＴＣ
Ｒ－ゼータ」は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿９３２１７０、ＮＰ＿０００７２５、ま
たはＸＰ＿０１１５０８４４７で示されるタンパク質、または非ヒト種、例えば、マウス
、げっ歯類、モンキー、サルなどに由来する同等の残基として定められ、「ゼータ刺激領
域」またはこれに代えて「ＣＤ３－ゼータ刺激領域」、あるいは「ＴＣＲ－ゼータ刺激領
域」は、Ｔ細胞活性化のために必要な初期シグナルを機能的に伝達するのに適しているゼ
ータ鎖の細胞質領域由来のアミノ酸残基として定められる。
用語「遺伝子工学処理された」または「遺伝子改変された」は、遺伝子工学技術によっ
て、例えばゲノム編集によって操作される細胞を指す。すなわち、細胞はこの細胞に本来
発生しない異種配列を含む。一般的に、異種配列はベクター系、またはリボソームを含む
細胞に核酸分子を導入するための他の手段を介して導入される。異種核酸分子は細胞のゲ
ノムに統合され得、あるいはプラスミドの形態などで染色体外に存在し得る。本用語はま
た、遺伝子工学処理され分離されたＣＡＲポリペプチドを細胞中に導入する実施形態も含
む。
用語「自家」は、同一個体中に後に再導入される、同一個体由来の任意の材料を指す。
用語「同種異系」は、材料が導入される個体と同一種の異なる動物由来の任意の材料を
指す。２つ以上の個体は、１つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でないとき、互いに同種異
系であるといわれる。
用語「細胞系統」は、共通祖先を有し、識別可能な細胞の同一タイプから特定の識別可
能／機能性細胞へと発達している細胞を指す。本明細書で使用される細胞系統は、限定さ
れないが、呼吸器、前立腺、乳房、腎臓、腸、神経、骨格、血管、肝臓、造血、筋肉また
は心臓の細胞系統を含む。
用語「阻害」は、系統特異的抗原の遺伝子発現または機能に関連して使用されるとき、
系統特異的抗原の遺伝子発現の量または機能における低下を指し、ここで阻害は遺伝子発
現または機能に対する干渉の結果である。阻害は完全であり得、その場合は検出可能な発
現または機能がなく、または阻害は部分的であり得る。部分的阻害はほとんど完全な阻害
からほとんど阻害がない範囲であってよい。特定の標的細胞を排除することによって、Ｃ
ＡＲ Ｔ細胞は特定の細胞系統の全発現を効果的に阻害し得る。
「系統特異的抗原を欠く」造血細胞などの細胞は、それらの自然発生する相対物、例え
ば、同じタイプの内因性造血細胞と比べて系統特異的抗原の著しく低下した発現量を有す
る細胞、または系統特異的抗原を発現しない、すなわち、ＦＡＣＳなどの定型的測定によ
って検出できない細胞を指す。いくつかの例では、「抗原を欠く」細胞の系統特異的抗原
の発現量は、自然発生する相対物の同一系統特異的抗原の発現量の約４０％未満（例えば
、３０％、２０％、１５％、１０％、５％、またはそれより低い）であってよい。本明細
書で使用されるとき、用語「約」は特定の値±５％を指す。例えば、約４０％の発現量は
、３５～４５％の間のいずれかの発現量を含み得る。
系統特異的細胞表面抗原を標的にする作用物質
本開示の態様は、例えば標的癌細胞上の、系統特異的細胞表面抗原を標的とする作用物
質を提供する。このような作用物質は、系統特異的細胞表面抗原を結合し標的にする抗原
結合フラグメントを含み得る。いくつかの例では、抗原結合フラグメントは系統特異的抗
原に特異的に結合する単鎖抗体（ｓｃＦｖ）であってよい。
Ａ．系統特異的細胞表面抗原
本明細書で使用されるとき、用語「系統特異的細胞表面抗原」および「細胞表面系統特
異的抗原」は交換可能に使用され得、細胞の表面に十分存在し、細胞系統の１種類以上の
集団と関連する任意の抗原を指す。例えば、抗原は細胞系統の１種類以上の集団に存在し
得、他の細胞集団の細胞表面には不在で（または低下した量で）あり得る。
一般的に、系統特異的細胞表面抗原は、抗原および／または抗原を提示する細胞集団が
ホスト生物の生存および／または発達に必要とされるかどうかなどの多くの要因に基づい
て分類できる。系統特異的抗原の例示的なタイプのまとめを下表１に示す。図１も参照す
る。
Figure 2022058776000002
表１および図１に示すように、０型系統特異的細胞表面抗原は組織恒常性および生存の
ために必要であり、０型系統特異的細胞表面抗原を有する細胞型も被験体の生存のために
必要であり得る。このため、恒常性および生存における０型系統特異的細胞表面抗原、ま
たは０型系統特異的細胞表面抗原を有する細胞の重要性を考えると、このような抗原また
はこのような抗原を有する細胞の阻害または除去は被験体の生存に有害であり得るため、
この範疇の抗原を標的にすることは、従来のＣＡＲ Ｔ細胞免疫療法を用いては困難であ
り得る。結果として、系統特異的細胞表面抗原（０型系統特異的抗原など）および／また
はこのような抗原を有する細胞は、例えばそれが被験体における生命の非冗長的機能を実
施するため、生存のために必要とされ得、そのためこの型の系統特異的抗原はＣＡＲ Ｔ
細胞をベースとした免疫療法には不十分な標的であり得る。
０型抗原に反し、１型細胞表面系統特異的抗原および１型細胞表面系統特異的抗原を有
する細胞は、被験体の組織恒常性または生存のために必要とされない。１型細胞表面系統
特異的抗原を標的にすることは、被験体に有害な結果をもたらす可能性がない。例えば、
正常形質細胞および多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞の両方で特異的に発現される１型抗原であ
るＣＤ３０７を標的にするように工学処理されたＣＡＲ Ｔ細胞は、両細胞型の除去をも
たらす（図２）（Ｅｌｋｉｎｓら，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１０：２２２２（
２０１２））。しかし、形質細胞系統は生物の生存のために犠牲にしてもよいため、ＣＤ
３０７および他の１型系統特異的抗原は、ＣＡＲ Ｔ細胞をベースとした免疫療法に適し
ている抗原である。１型クラスの系統特異的抗原は、卵巣、精巣、前立腺、乳房、子宮内
膜、および膵臓を含む幅広い様々な異なる組織で発現され得る。いくつかの実施形態では
、作用物質は１型抗原である細胞表面系統特異的抗原を標的にする。
２型抗原を標的にすることは、１型抗原と比べて著しい困難さを示す。２型抗原は、（
１）抗原は生物の生存のために重要でない（すなわち、生存のために必要とされない）、
および（２）抗原を有する細胞系統は生物の生存のために欠くことができない（すなわち
、特定の細胞系統が生存のために必要とされる）ことによって特徴付けられる。例えば、
ＣＤ３３は正常骨髄細胞ならびに急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞の両方で発現される２
型抗原である（Ｄｏｈｎｅｒら，ＮＥＪＭ３７３：１１３６（２０１５））。結果として
、ＣＤ３３抗原を標的するように工学処理されたＣＡＲ Ｔ細胞は、正常細胞ならびにＡ
ＭＬ細胞の両方の死滅をもたらし得、これは被験体の生存と両立し得ない（図３）。いく
つかの実施形態では、作用物質は２型抗原である細胞表面系統特異的抗原を標的にする。
幅広く様々な抗原が本開示の方法および組成物によって標的にされ得る。これらの抗原
に対するモノクローナル抗体は、市販品を購入でき、または前述のように、対象抗原によ
る動物の免疫に続く標準的なモノクローナル抗体方法論、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５の標準的な体細胞ハイブ
リダイゼーション技術を含む、標準的な方法を用いて作製され得る。抗体または抗体をコ
ードする核酸は、いずれかの標準的なＤＮＡまたはタンパク質シークエンシング技術を用
いて配列決定され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書で説明される方法および細胞を用いて標的にされる
細胞表面系統特異的抗原は、白血球または白血球のサブ集団の細胞表面系統特異的抗原で
ある。いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原は骨髄細胞と関連する抗原であ
る。いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原は分化抗原群（ＣＤ）である。Ｃ
Ｄ抗原の例は、限定されないが、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｅ、
ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３ｄ、ＣＤ３ｅ、ＣＤ３ｇ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、Ｃ
Ｄ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、 ＣＤ１
１ｄ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ１７、
ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、
ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２
ｂ、ＣＤ３２ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ
３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４
３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＣ、ＣＤ４５ＲＯ、
ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、Ｃ
Ｄ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５
、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６０ａ、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ
６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４ａ、ＣＤ６５、ＣＤ６５ｓ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ
６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６Ｆ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２
、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７５Ｓ、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、Ｃ
Ｄ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５Ａ、ＣＤ８５Ｃ、ＣＤ８５
Ｄ、ＣＤ８５Ｅ、ＣＤ８５Ｆ、ＣＤ８５Ｇ、ＣＤ８５Ｈ、ＣＤ８５Ｉ、ＣＤ８５Ｊ、ＣＤ
８５Ｋ、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、Ｃ
Ｄ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ９９Ｒ、
ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０
６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、
ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１
８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２
１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、
ＣＤ１２７、ＣＤ１２９、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３
４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３６、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０ａ、Ｃ
Ｄ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤｗ１４５、ＣＤ１
４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５０、ＣＤ１５２、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、Ｃ
Ｄ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６ａ、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１５６ｃ、ＣＤ１５７、ＣＤ
１５８ｂ１、ＣＤ１５８ｂ２、ＣＤ１５８ｄ、ＣＤ１５８ｅ１／ｅ２、ＣＤ１５８ｆ、Ｃ
Ｄ１５８ｇ、ＣＤ１５８ｈ、ＣＤ１５８ｉ、ＣＤ１５８ｊ、ＣＤ１５８ｋ、ＣＤ１５９ａ
、ＣＤ１５９ｃ、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ
１６６、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１６８、ＣＤ１６９、ＣＤ１７０、ＣＤ１７１、ＣＤ１７２
ａ、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ１７２ｇ、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ
、ＣＤ１７６、ＣＤ１７７、ＣＤ１７８、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ１７９ｂ、ＣＤ１８０、Ｃ
Ｄ１８１、ＣＤ１８２、ＣＤ１８３、ＣＤ１８４、ＣＤ１８５、ＣＤ１８６、ＣＤ１９１
、ＣＤ１９２、ＣＤ１９３、ＣＤ１９４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９６、ＣＤ１９７、ＣＤｗ
１９８、ＣＤｗ１９９、ＣＤ２００、ＣＤ２０１、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２
０４、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０８、ＣＤ２０９、ＣＤ２１０ａ、
ＣＤｗ２１０ｂ、ＣＤ２１２、ＣＤ２１３ａ１、ＣＤ２１３ａ２、ＣＤ２１５、ＣＤ２１
７、ＣＤ２１８ａ、ＣＤ２１８ｂ、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ２２３、
ＣＤ２２４、ＣＤ２２５、ＣＤ２２６、ＣＤ２２７、ＣＤ２２８、ＣＤ２２９、ＣＤ２３
０、ＣＤ２３１、ＣＤ２３２、ＣＤ２３３、ＣＤ２３４、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２３５ｂ、
ＣＤ２３６、ＣＤ２３６Ｒ、ＣＤ２３８、ＣＤ２３９、ＣＤ２４０、ＣＤ２４１、ＣＤ２
４２、ＣＤ２４３、ＣＤ２４４、ＣＤ２４５、ＣＤ２４６、ＣＤ２４７、ＣＤ２４８、Ｃ
Ｄ２４９、ＣＤ２５２、ＣＤ２５３、ＣＤ２５４、ＣＤ２５６、ＣＤ２５７、ＣＤ２５８
、ＣＤ２６１、ＣＤ２６２、ＣＤ２６３、ＣＤ２６４、ＣＤ２６５、ＣＤ２６６、ＣＤ２
６７、ＣＤ２６８、ＣＤ２６９、ＣＤ２７０、ＣＤ２７１、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３、Ｃ
Ｄ２７４、ＣＤ２７５、ＣＤ２７６、ＣＤ２７７、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８０
、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８４、ＣＤ２８６、ＣＤ２８８、ＣＤ２
８９、ＣＤ２９０、ＣＤ２９２、ＣＤｗ２９３、ＣＤ２９４、ＣＤ２９５、ＣＤ２９６、
ＣＤ２９７、ＣＤ２９８、ＣＤ２９９、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３００ｃ、ＣＤ３００ｅ、Ｃ
Ｄ３０１、ＣＤ３０２、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ＣＤ３０５、３０６、ＣＤ３０７ａ、
ＣＤ３０７ｂ、ＣＤ３０７ｃ、Ｄ３０７ｄ、ＣＤ３０７ｅ、ＣＤ３０９、ＣＤ３１２、Ｃ
Ｄ３１４、ＣＤ３１５、ＣＤ３１６、ＣＤ３１７、ＣＤ３１８、ＣＤ３１９、ＣＤ３２０
、ＣＤ３２１、ＣＤ３２２、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３２６、ＣＤ３２７、ＣＤ３
２８、ＣＤ３２９、ＣＤ３３１、ＣＤ３３２、ＣＤ３３３、ＣＤ３３４、ＣＤ３３５、Ｃ
Ｄ３３６、ＣＤ３３７、ＣＤ３３８、ＣＤ３３９、ＣＤ３４０、ＣＤ３４４、ＣＤ３４９
、ＣＤ３５０、ＣＤ３５１、ＣＤ３５２、ＣＤ３５３、ＣＤ３５４、ＣＤ３５５、ＣＤ３
５７、ＣＤ３５８、ＣＤ３５９、ＣＤ３６０、ＣＤ３６１、ＣＤ３６２、およびＣＤ３６
３を含む。ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ＢＤ＿
Ｒｅａｇｅｎｔｓ＿ＣＤＭａｒｋｅｒＨｕｍａｎ＿Ｐｏｓｔｅｒ．ｐｄｆを参照する。
いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原はＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１１、
ＣＤ１２３、ＣＤ５６、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ３３、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ４１、ＣＤ６
１、ＣＤ６２、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ１４６、ＣＤ３２６、ＬＭＰ２、ＣＤ２２、ＣＤ５２
、ＣＤ１０、ＣＤ３／ＴＣＲ、ＣＤ７９／ＢＣＲ、およびＣＤ２６である。いくつかの実
施形態では、細胞表面系統特異的抗原はＣＤ３３またはＣＤ１９である。
これに代えて、または追加で、細胞表面系統特異的抗原は癌抗原、例えば、癌細胞に差
次的に存在する細胞表面系統特異的抗原であり得る。いくつかの実施形態では、癌抗原は
組織または細胞系統に特異的な抗原である。癌の特定タイプと関連する細胞表面系統特異
的抗原の例は、限定されないが、ＣＤ２０、ＣＤ２２（非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リン
パ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ））、ＣＤ５２（Ｂ細胞ＣＬＬ）、ＣＤ３３（急性骨
髄性白血病（ＡＭＬ））、ＣＤ１０（ｇｐ１００）（共通（前駆Ｂ細胞）急性リンパ性白
血病および悪性骨髄腫）、ＣＤ３／Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）（Ｔ細胞リンパ腫および白血
病）、ＣＤ７９／Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）（Ｂ細胞リンパ腫および白血病）、ＣＤ２６（
上皮性およびリンパ性悪性腫瘍）、ヒトリンパ球抗原（ＨＬＡ）－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ、
およびＨＬＡ－ＤＱ（リンパ性悪性腫瘍）、ＲＣＡＳ１（婦人科癌、胆管腺癌、および膵
臓の管状腺癌）、ならびに前立腺特異的膜抗原を含む。いくつかの実施形態では、細胞表
面抗原ＣＤ３３はＡＭＬ細胞と関連する。
Ｂ．抗原結合フラグメント
任意の抗体またはその抗原結合フラグメントを、本明細書で説明される系統特異的細胞
表面抗原を標的にする作用物質を構築するために使用できる。このような抗体または抗原
結合フラグメントは、従来法、例えば、ハイブリドーマ技術または組換え技術によって調
製できる。
例えば、対象の系統特異的抗原に特異的な抗体は、従来のハイブリドーマ技術によって
作製できる。ＫＬＨなどのキャリアタンパク質に連結され得る系統特異的抗原を使用して
、この複合体に結合する抗体を作製するためにホスト動物を免疫できる。ホスト動物の免
疫接種の経路または計画は、本明細書でさらに説明されるように、抗体刺激および産生の
ために確立された従来技術に一般的に従う。マウス抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体の
産生のための一般的技術は従来技術で知られており、本明細書で説明される。ヒトを含む
任意の哺乳動物被験体またはそれに由来する抗体産生細胞を、ヒトを含む哺乳動物のハイ
ブリドーマ細胞株の産生のための土台となるように操作できることが考えられる。一般的
に、ホスト動物を、本明細書で説明されるようなものを含むある量の免疫原で腹腔内、筋
肉内、経口、皮下、足底内、および／または皮内に接種する。
ハイブリドーマは、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｂ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９７５）
Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５－４９７の、またはＢｕｃｋ，Ｄ．Ｗ．ら，Ｉｎ Ｖｉｔｒ
ｏ，１８：３７７－３８１（１９８２）によって改良された一般的な体細胞ハイブリドー
マ技術を用いて、リンパ球および不死化骨髄腫細胞から調製できる。利用可能な骨髄腫株
は、限定されないが、Ｘ６３－Ａｇ８．６５３および米国カリフォルニア州サンディエゴ
のソーク研究所細胞頒布センター（Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔ
ｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ）から入手されるものを含み、ハイブリダイゼーション
に使用され得る。一般的に、本技術は、ポリエチレングリコールなどの融合誘起剤、また
は従来技術の当業者に良く知られている電気的方法によって、骨髄腫細胞とリンパ球を融
合することを含む。融合後に、細胞を融合メディウムから分離してヒポキサンチン－アミ
ノプテリン－チミジン（ＨＡＴ）培地などの選択増殖培地中で増殖させて、ハイブリダイ
ズされていない親細胞を取り除く。血清が添加されたまたは無添加の本明細書で開示され
る培地のいずれかを、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを培養するために使
用できる。細胞融合技術の別の選択肢として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞を使用して本明細書で
説明されるＴＣＲ様モノクローナル抗体を産生し得る。ハイブリドーマを拡張しおよび必
要に応じてサブクローニングし、上清を従来の免疫アッセイ方法（例えば、ラジオイムノ
アッセイ、酵素イムノアッセイ、または蛍光イムノアッセイ）によって抗免疫原活性につ
いて測定する。
抗体源として使用され得るハイブリドーマは、系統特異的抗原に結合できるモノクロー
ナル抗体を産生する親ハイブリドーマの子孫細胞であるすべての派生物を包含する。この
ような抗体を産生するハイブリドーマは、既知の方法を用いてインビトロまたはインビボ
で増殖され得る。モノクローナル抗体は、必要に応じて、硫酸アンモニウム沈殿法、ゲル
電気泳動、透析、クロマトグラフィー、および限外ろ過などの従来の免疫グロブリン精製
法によって、培養培地または体液から分離され得る。不要な活性が存在する場合、例えば
、調製物を、固相に付着された免疫原からなる吸着剤上を通し、所望の抗体を免疫原から
溶出または放出させることによって、取り除くことができる。免疫される種において免疫
原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、
ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビターに、二官能基または誘導体
化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を
介した共役体化）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基による）、グルタルアル
デヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲであってＲおよびＲ１が独立
したアルキル基を用いて共役体化された標的アミノ酸配列を含む標的抗原またはフラグメ
ントでのホスト細胞の免疫は、抗体の集団（例えば、モノクローナル抗体）を生じること
ができる。
必要に応じて、対象の抗体（例えば、ハイブリドーマによって産生された）は配列決定
され得、ポリヌクレオチド配列は発現または伝播用のベクター中に次いでクローニングさ
れ得る。対象の抗体をコードする配列はホスト細胞中でベクターに維持され得、かつホス
ト細胞は次いで将来の使用のために拡張され凍結され得る。あるいは、ポリヌクレオチド
配列は、抗体を「ヒト化する」ためあるいは抗体の親和性（親和性成熟）または他の特性
を改善するための遺伝子操作に使用され得る。例えば、抗体が臨床試験またはヒトにおけ
る治療で使用される場合、定常領域をより類似したヒト定常領域に工学処理して免疫応答
を回避し得る。抗体配列を遺伝子操作して系統特異的抗原に対する高い親和性を得ること
は望ましいことであり得る。１つ以上のポリヌクレオチド変更を抗体に実施して、かつ標
的抗原に対するその結合特異性をなお維持できることは、従来技術の当業者に明らかであ
ろう。
他の実施形態では、完全なヒト抗体を、特定のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現す
るように工学処理されている市販マウスを用いて得ることができる。より望ましい（例え
ば、完全なヒト抗体）またはより頑強な免疫応答を生じるように設計された遺伝子導入動
物もまた、ヒト化抗体またはヒト抗体の産生のために使用され得る。このような技術の例
は、Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．（フリーモント，カリフォルニア州）のＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（
登録商標）ならびにＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（プリンストン，ニュージャージ州）のＨ
ｕＭＡｂ－Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＴＣ Ｍｏｕｓｅ（登録商標）である。別の選
択肢では、抗体はファージディスプレイまたは酵母技術による組換えによって作製され得
る。例えば、米国特許第５，５６５，３３２号、第５，５８０，７１７号、第５，７３３
，７４３号、および第６，２６５，１５０号、ならびにＷｉｎｔｅｒら，（１９９４）Ａ
ｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３－４５５を参照する。あるいは、ファー
ジディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５
２－５５３）を使用して、非免疫ドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）領域遺伝子レパ
ートリーからインビトロでヒト抗体および抗体フラグメントを産生できる。
インタクト抗体（全長抗体）の抗原結合フラグメントは、定型化された方法によって調
製できる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは抗体分子のペプシン消化によって産生
でき、ＦａｂはＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド結合を還元することによって
生じることができる。
ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、および二重特異的抗体などの遺伝子工学処理され
た抗体は、例えば従来の組換え技術によって産生できる。一つの例では、標的抗原に特異
的なモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の方法を用いて容易に分離および配
列決定できる（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異
的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）。ハイブリドーマ細
胞はこのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一度分離されると、ＤＮＡは１種
類以上の発現ベクター中に配置され得、これは次いで大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャ
イニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または他の形では免疫グロブリンタンパク質を
産生しない骨髄腫細胞などのホスト細胞中にトランスフェクションされて、組換えホスト
細胞中でモノクローナル抗体の合成を得る。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８７／０４４６
２を参照する。ＤＮＡを次いで、例えば、相同なネズミ配列の代わりにヒト重鎖および軽
鎖定常領域をコードする配列で置換することによって、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，（１９８４
）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１、または免疫グロブリンコード
配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列のすべてまたは一部を共有結合させる
ことによって、改変できる。この方法では、「キメラ」または「ハイブリッド」抗体など
の遺伝子工学処理された抗体は、標的抗原の結合特異性を有するものとして作製できる。
「キメラ抗体」の産生のために開発された技術は従来技術で良く知られている。例えば
、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１
，６８５１、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１２，６０４、および
Ｔａｋｅｄａら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ３１４：４５２を参照する。
ヒト化抗体を構築するための方法は従来技術で良く知られている。例えば、Ｑｕｅｅｎ
ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１００２９－１００３３（
１９８９）を参照する。一つの例では、親非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬの可変領域を、従
来技術で知られている方法による三次元分子モデル化分析に供する。次に、正確なＣＤＲ
構造の形成に重要であると予測されるフレームワークアミノ酸残基を、同じ分子モデル化
分析を用いて特定する。並行して、親非ヒト抗体と相同であるアミノ酸配列を有するヒト
ＨＶおよびＨＬ鎖を、検索質問として親ＶＨおよびＶＬ配列を用いていずれかの抗体遺伝
子データベースから特定する。ヒトＶＨおよびＶＬアクセプター遺伝子を次いで選択する
。
選択されたヒトアクセプター遺伝子内のＣＤＲ領域を、親非ヒト抗体由来のＣＤＲ領域
またはその機能的変異体で置換できる。必要に応じて、ＣＤＲ領域との相互作用において
重要であると予測される親鎖のフレームワーク領域内の残基を使用して、ヒトアクセプタ
ー遺伝子中の相当する残基と置換できる。
単鎖抗体は組換え技術を介して、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列および軽
鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を連結することによって作製できる。好ましく
は、フレキシブルリンカーが２つの可変領域の間に組み込まれる。あるいは、単鎖抗体の
産生のために報告されている技術（米国特許第４，９４６，７７８号および第４，７０４
，６９２号）を、ファージまたは酵母ｓｃＦｖライブラリーを作製するために適応でき、
系統特異的抗原に特異的なｓｃＦｖクローンを定型的な手順に従ってライブラリーから特
定できる。陽性クローンをさらなるスクリーニングに供して、系統特異的抗原を結合する
ものを特定できる。
いくつかの例では、対象の系統特異的抗原はＣＤ３３であり、抗原結合フラグメントは
ＣＤ３３、例えば、ヒトＣＤ３３を特異的に結合する。抗ヒトＣＤ３３抗体の例示的な重
鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸および核酸配列を下記に示す。ＣＤＲ配列をア
ミノ酸配列中で太字と下線で示す。
Figure 2022058776000003
Figure 2022058776000004
Figure 2022058776000005
Figure 2022058776000006
本明細書で説明されるＣＤ３３を標的にする作用物質を構築する上で使用する抗ＣＤ３
３抗体結合フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３
と同じの重鎖および／または軽鎖ＣＤＲを含み得る。このような抗体は１つ以上のフレー
ムワーク領域にアミノ酸残基変異を含み得る。いくつかの例では、抗ＣＤ３３抗体フラグ
メントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２と少なくとも７０％配列同一性（例えば、７５％、
８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれを超える）を共有する重鎖可変領域を含み
得、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３と少なくとも７０％配列同一性（例えば、
７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれを超える）を共有する軽鎖可変領
域を含み得る。
２つのアミノ酸配列の「パーセント同一性」は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈ
ｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２６４－６８，１９９０
の、 改良されたＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３－７７，１９９３のアルゴリズムを用いて決定さ
れる。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５
：４０３－１０，１９９０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２
．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴタンパク質検索をＸＢＬＡＳＴプログラム、スコ
ア＝５０、ワード長＝３で実施して、本開示のタンパク質分子と相同的なアミノ酸配列を
得ることができる。２つの配列の間にギャップが存在する場合、ギャップ化ＢＬＡＳＴを
Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－
３４０２，１９９７で報告されているように使用できる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ化Ｂ
ＬＡＳＴプログラムを使用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬ
ＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用できる。
Ｃ．キメラ受容体を発現する免疫細胞
いくつの実施形態では、本明細書で説明される系統特異的細胞表面抗原を標的にする作
用物質は、系統特異的抗原（例えば、ＣＤ３３またはＣＤ１９）に結合できる抗原結合フ
ラグメント（例えば、単鎖抗体）を含むキメラ受容体を発現する免疫細胞である。キメラ
受容体の抗原結合フラグメントによる、細胞表面上の系統特異的抗原を有する標的細胞（
例えば、癌細胞）の認識は、キメラ受容体のシグナル伝達領域（例えば、共刺激シグナル
伝達領域および／または細胞質シグナル伝達領域）に活性化シグナルを伝達し、これはキ
メラ受容体を発現する免疫細胞中でエファクター機能を活性化し得る。
本明細書で使用されるとき、キメラ受容体はホスト細胞の表面で発現され得、かつ細胞
表面系統特異的抗原に結合する抗原結合フラグメントを含む、非自然発生分子を指す。一
般的に、キメラ受容体は、異なる分子由来である少なくとも２つの領域を含む。本明細書
で説明される抗原結合フラグメントに加え、キメラ受容体はヒンジ領域、膜貫通領域、少
なくとも１つの共刺激領域、および細胞質シグナル伝達領域の１つ以上をさらに含み得る
。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、Ｎ端からＣ端へと、細胞表面系統特異的抗
原に結合する抗原結合フラグメント、ヒンジ領域、膜貫通領域、および細胞質シグナル伝
達領域を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は少なくとも１つの共刺激領域を
さらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で説明されるキメラ受容体はヒンジ領域を含み、こ
れは抗原結合フラグメントと膜貫通領域の間に位置し得る。ヒンジ領域は一般的にタンパ
ク質の２つの領域の間で認められ、タンパク質の可撓性および領域の１つまたは両方の相
互の動きを可能にし得る。このような可撓性およびキメラ受容体の別領域に対する抗原結
合フラグメントの動きをもたらす、任意のアミノ酸配列を使用できる。
ヒンジ領域は約１０～２００個のアミノ酸、例えば、１５～１５０個のアミノ酸、２０
～１００個のアミノ酸、または３０～６０個のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態
では、ヒンジ領域は、長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、
１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４
０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１
１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２０
０個のアミノ酸であり得る。
いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は自然発生タンパク質のヒンジ領域である。ヒン
ジ領域を含むことが従来技術で知られているいずれかのタンパク質のヒンジ領域は、本明
細書で説明されるキメラ受容体における使用に適合する。いくつかの実施形態では、ヒン
ジ領域は自然発生タンパク質のヒンジ領域の少なくとも一部であり、キメラ受容体に可撓
性を付与する。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域はＣＤ８αまたはＣＤ２８αのもの
である。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域はＣＤ８αのヒンジ領域の一部であり、例
えば、ＣＤ８αまたはＣＤ２８αのヒンジ領域の少なくとも１５個（例えば、２０、２５
、３０、３５、または４０個）の連続したアミノ酸を含むフラグメントである。
ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ抗体などの抗体のヒンジ領域もまた、
本明細書で説明されるキメラ受容体における使用に適合する。いくつかの実施形態では、
ヒンジ領域は抗体の定常領域ＣＨ１とＣＨ２をつなぐヒンジ領域である。いくつかの実施
形態では、ヒンジ領域は抗体のものであり、抗体のヒンジ領域および抗体の１つ以上の定
常領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は抗体のヒンジ領域および抗体のＣ
Ｈ３定常領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は抗体のヒンジ領域および抗
体のＣＨ２およびＣＨ３定常領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体はＩｇＧ、Ｉｇ
Ａ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はＩｇＧ
抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩ
ｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域はＩｇＧ１抗体のヒンジ領域な
らびにＣＨ２およびＣＨ３定常領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域はＩｇ
Ｇ１抗体のヒンジ領域およびＣＨ３定常領域を含む。
非自然発生ペプチドであるヒンジ領域を含むキメラ受容体も本開示の範囲内である。い
くつかの実施形態では、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合領域のＣ端と膜貫通領域のＮ端
の間のヒンジ領域は、（ＧｌｙｘＳｅｒ）ｎリンカーなどのペプチドリンカーであり、こ
こでｘおよびｎは独立して３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２を含む３～１
２、またはそれを超える整数であってよい。
本明細書で説明されるキメラ受容体のヒンジ領域で使用され得るさらなるペプチドリン
カーは、従来技術で知られている。Ｗｒｉｇｇｅｒｓら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｒｅｎｄｓ
ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００５）８０（６）：７３６－７４６、お
よびＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／０８８４６１を参照する。
いくつかの実施形態では、本明細書で説明されるキメラ受容体は膜貫通領域を含み得る
。キメラ受容体における使用のための膜貫通領域は、従来技術で知られているいずれかの
形態であってよい。本明細書で使用されるとき、「膜貫通領域」は細胞膜、好ましくは真
核細胞膜で熱力学的に安定である任意のタンパク質構造を指す。本明細書で使用されるキ
メラ受容体における使用に適合する膜貫通領域は、自然発生タンパク質から得ることがで
きる。あるいは、膜貫通領域は合成の、非自然発生タンパク質セグメント、例えば、細胞
膜中で熱力学的に安定である疎水性タンパク質セグメントであり得る。
膜貫通領域は、膜貫通領域が膜を横断する通過回数およびタンパク質の配向を含む、膜
貫通領域の位相に基づいて分類される。例えば、単回通過膜タンパク質は細胞膜を１回横
断し、多回通過膜タンパク質は細胞膜を少なくとも２回（例えば、２、３、４、５、６、
７回またはそれより多い回数）横断する。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は単回通
過膜貫通領域である。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、キメラ受容体のＮ端が細
胞の細胞外側に、キメラ受容体のＣ端が細胞の細胞内側に向いている単回通過膜貫通領域
である。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は単回通過膜貫通タンパク質から得られる
。いくつかの実施形態では、膜貫通領域はＣＤ８αのものである。いくつかの実施形態で
は、膜貫通領域はＣＤ２８のものである。いくつかの実施形態では、膜貫通領域はＩＣＯ
Ｓのものである。
いくつかの実施形態では、本明細書で説明されるキメラ受容体は、１つ以上の共刺激シ
グナル伝達領域を含む。用語「共刺激シグナル伝達領域」は、本明細書で使用されるとき
、細胞内シグナル伝達を仲介してエファクター機能などの免疫応答を誘発するタンパク質
の少なくとも一部を指す。本明細書で説明されるキメラ受容体の共刺激シグナル伝達領域
は、共刺激タンパク質由来の細胞質シグナル伝達領域であってよく、これはシグナルを伝
達してＴ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、または好酸球などの免疫細胞によっ
て仲介される応答を調節する。
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は１つより多い（少なくとも２つ、３つ、４つ
、またはそれより多い）の共刺激シグナル伝達領域を含む。いくつかの実施形態では、キ
メラ受容体は異なる共刺激タンパク質から得られる１つより多い共刺激シグナル伝達領域
を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は共刺激シグナル伝達領域を含まない。
一般的に、多くの免疫細胞は、細胞増殖、分化および生存を促進するために、ならびに
細胞のエファクター機能を活性化するために、抗原特異的シグナルの刺激に加えて、共刺
激を必要とする。ホスト細胞（例えば、免疫細胞）中の共刺激シグナル伝達領域の活性化
は、細胞がサイトカインの産生および分泌、マクロファージ特性、増殖、分化、生存、お
よび／または細胞毒性を増加または低下するのを誘発し得る。任意の共刺激タンパク質の
共刺激シグナル伝達領域は、本明細書で説明されるキメラ受容体における使用に適合し得
る。共刺激シグナル伝達領域のタイプは、キメラ受容体が発現される免疫細胞のタイプ（
例えば、一次Ｔ細胞、Ｔ細胞株、ＮＫ細胞株）および所望の免疫エファクター機能（例え
ば、細胞毒性）などの要因に基づいて選択される。キメラ受容体における使用のための共
刺激シグナル伝達領域の例は、共刺激タンパク質の細胞質シグナル伝達領域であってよく
、限定されないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、Ｃｄ４０、
ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩ
ＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３を含む。いくつかの実施形態では、共刺激領域は４－１
ＢＢ、ＣＤ２８、またはＩＣＯＳ由来である。いくつかの実施形態では、共刺激領域はＣ
Ｄ２８由来であり、キメラ受容体は４－１ＢＢまたはＩＣＯＳ由来の第二共刺激領域を含
む。
いくつかの実施形態では、共刺激領域は１つを超える共刺激領域または１つを超える共
刺激領域の部分を含む融合領域である。いくつかの実施形態では、共刺激領域はＣＤ２８
およびＩＣＯＳ由来の共刺激領域の融合である。
いくつかの実施形態では、本明細書で説明されるキメラ受容体は細胞質シグナル伝達領
域を含む。任意の細胞質シグナル伝達領域を本明細書で説明されるキメラ受容体に使用で
きる。一般的に、細胞質シグナル伝達領域は、細胞外リガンド結合領域とそのリガンドの
相互作用などのシグナルを伝えて、細胞のエフェクター機能（例えば、細胞毒性）を誘発
するなどの細胞応答を刺激する。
従来技術の当業者に明らかなように、Ｔ細胞活性化に含まれる因子は細胞質シグナル伝
達領域の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）のリン酸化である。従来技術で
知られている任意のＩＴＡＭ含有領域を使用して、本明細書で説明されるキメラ受容体を
構築し得る。一般的に、ＩＴＡＭモチーフは６～８個のアミノ酸で分離されるアミノ酸配
列ＹｘｘＬ／Ｉの２つの反復を含み、ここで各ｘは独立して任意のアミノ酸であり、保存
モチーフＹｘｘＬ／Ｉｘ（６～８）ＹｘｘＬ／Ｉを生じ得る。いくつかの実施形態では、
細胞質シグナル伝達領域はＣＤ３ζ由来である。
例示的なキメラ受容体を次の表２および３に示す。
Figure 2022058776000007
キメラ受容体の構築のための例示的な構成要素の核酸配列を次に示す。
ＣＤ２８細胞内シグナル伝達領域－ＤＮＡ－ヒト（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
ＡＴＴＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＡＣＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＡ
ＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴ
ＴＴＧＴＣＣＡＡＧＴＣＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＣＴＴＴ
ＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡ
ＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧ
ＧＡＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣ
ＡＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＴＴＡＣＣ
ＡＧＣＣＣＴＡＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＡＧＣＣＴＡＴＣＧＣＴＣ
ＣＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＡＣ
ＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧ
ＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧ
ＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣ
ＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡ
ＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＧ
ＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣ
ＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣ
ＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣ
ＩＣＯＳ細胞内シグナル伝達領域－ＤＮＡ－ヒト（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
ＣＴＡＴＣＡＡＴＴＴＴＴＧＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＴＴＡＡＡＧＴＡＡＣＴＣＴＴＡ
ＣＡＧＧＡＧＧＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴＡＴＴＴＡＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＣＴＴＴＧＴＴＧ
ＣＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＴＣＴＧＧＴＴＡＣＣＣＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＴＴ
ＧＴＴＧＴＡＧＴＣＴＧＣＡＴＴＴＴＧＧＧＡＴＧＣＡＴＡＣＴＴＡＴＴＴＧＴＴＧＧＣ
ＴＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＴＡＴＴＣＡＴＣＣＡＧＴＧＴＧＣＡＣＧＡＣＣＣＴＡＡ
ＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＡＧＡＧＣＡＧＴＧＡＡＣＡＣＡＧＣＣＡＡＡ
ＡＡＡＴＣＴＡＧＡＣＴＣＡＣＡＧＡＴＧＴＧＡＣＣＣＴＡＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡ
ＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡ
ＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧ
ＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡ
ＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴ
ＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣ
ＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧ
ＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡ
ＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴ
ＣＧＣ
ＣＤ２８／ＩＣＯＳ共刺激シグナル伝達領域－ＤＮＡ－ヒト（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
ＡＴＴＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＡＣＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＡ
ＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴ
ＴＴＧＴＣＣＡＡＧＴＣＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＣＴＴＴ
ＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡ
ＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧ
ＧＡＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＴＧＴＴＣ
ＡＴＧＡＧＡＧＣＡＧＴＧＡＡＣＡＣＡＧＣＣＡＡＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＣＴＣＡＣＡＧ
ＡＴＧＴＧＡＣＣＣＴＡＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣ
ＣＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧ
ＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡ
ＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＡＧ
ＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧ
ＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡ
ＡＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡ
ＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣ
ＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣ
いくつかの実施形態では、核酸はＣＤ３３に結合する抗原結合フラグメントをコードし
、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２中のＣＤＲと同一のＣＤＲを有する重鎖可変領域およびＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１３中のＣＤＲと同一のＣＤＲを有する軽鎖可変領域を含む。いくつか
の実施形態では、抗原結合フラグメントはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２によって示される重
鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３によって示される軽鎖可変領域を含む。いく
つかの実施形態では、キメラ受容体は少なくとも膜貫通領域および細胞質シグナル伝達領
域をさらに含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体はヒンジ領域および／または共
刺激シグナル伝達領域をさらに含む。
表３は本明細書で説明される例示的なキメラ受容体を示す。例示的な構築体はＮ端から
Ｃ端へと、抗原結合フラグメント、膜貫通領域、および細胞質シグナル伝達領域を有する
。いくつかの例では、キメラ受容体は抗原結合フラグメントと膜貫通領域の間に位置する
ヒンジ領域をさらに含む。いくつかの例では、キメラ受容体は１つ以上の共刺激領域をさ
らに含み、それは膜貫通領域と細胞質シグナル伝達領域の間に位置し得る。
Figure 2022058776000008
上表３でリスト化された例示的なキメラ受容体のアミノ酸配列を次に示す。
ＣＡＲＴ１アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）
ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳＥＩＶＬＴＱＳＰＧＳＬＡＶＳＰＧＥＲＶＴＭＳＣ
ＫＳＳＱＳＶＦＦＳＳＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＩＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧ
ＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＬＡＩＹＹＣＨＱＹＬＳＳＲＴＦ
ＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＶＶ
ＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨＷＩＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＶＧＶＩＹ
ＰＧＮＤＤＩＳＹＮＱＫＦＱＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＴＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡ
ＶＹＹＣＡＲＥＶＲＬＲＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰ
ＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧ
ＡＶＨＴＲＧＬＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦ
ＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤ
ＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰ
ＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬ
ＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
ＣＡＲＴ２アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）
ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳＥＩＶＬＴＱＳＰＧＳＬＡＶＳＰＧＥＲＶＴＭＳＣ
ＫＳＳＱＳＶＦＦＳＳＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＩＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧ
ＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＬＡＩＹＹＣＨＱＹＬＳＳＲＴＦ
ＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＶＶ
ＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨＷＩＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＶＧＶＩＹ
ＰＧＮＤＤＩＳＹＮＱＫＦＱＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＴＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡ
ＶＹＹＣＡＲＥＶＲＬＲＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＡＬＳＮＳＩＭＹＦＳＨＦＶＰＶ
ＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＳＲＰＡＡＧＧＡ
ＶＨＴＲＧＬＤＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲ
ＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＲＶＫ
ＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰ
ＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧ
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ＣＡＲＴ３アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）
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ＣＡＲＴ８アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）
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ＣＡＲＴ４ｄｕａｌアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）
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ＣＡＲＴ５ｄｕａｌアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）
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ＣＡＲＴ６アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）
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ＣＡＲＴ７アミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）
ＭＷＬＱＳＬＬＬＬＧＴＶＡＣＳＩＳＥＩＶＬＴＱＳＰＧＳＬＡＶＳＰＧＥＲＶＴＭＳＣ
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上表３でリスト化された例示的なキメラ受容体の核酸配列を次に示す。
ＣＡＲＴ１核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）
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ＣＡＲＴ２核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）
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ＣＡＲＴ３核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）
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ＣＡＲＴ４ｄｕａｌ核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）
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ＣＡＲＴ５ｄｕａｌ核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）
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ＣＡＲＴ６核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）
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ＣＡＲＴ７核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）
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本明細書で説明されるキメラ受容体のいずれかは、組換え技術などの定型的方法によっ
て調製できる。本明細書におけるキメラ受容体を調製するための方法は、抗原結合フラグ
メント、ならびに任意にヒンジ領域、膜貫通領域、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達
領域、および細胞質シグナル伝達領域を含む、キメラ受容体のそれぞれの領域を含むポリ
ペプチドをコードする核酸の作製を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体の構成
要素のそれぞれをコードする核酸は、組換え技術を用いて互いに連結される。
キメラ受容体の構成要素それぞれの配列は、定型的な技術、例えば、従来技術で知られ
ている様々な供給源のいずれか１つからＰＣＲ増幅によって得ることができる。いくつか
の実施形態では、キメラ受容体の構成要素の１つ以上の配列はヒト細胞から得られる。あ
るいは、キメラ受容体の１つ以上の構成要素は合成できる。それぞれの構成要素の配列（
例えば、領域）を、ＰＣＲ増幅またはライゲーションなどの方法を用いて、直接的にまた
は間接的に（例えば、ペプチドリンカーをコードする核酸を用いて）連結してキメラ受容
体をコードする核酸配列を形成できる。あるいは、キメラ受容体をコードする核酸は合成
され得る。いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡである。他の実施形態では、核酸はＲ
ＮＡである。
構成要素それぞれの配列を連結する前または後における、キメラ受容体の１つ以上の構
成要素（例えば、抗原結合フラグメントなど）内の１つ以上の残基の変異。いくつかの実
施形態では、キメラ受容体の構成要素における１つ以上の変異が、標的に対する構成要素
（例えば、標的抗原に対する抗原結合フラグメント）の親和性を調節する（増加するまた
は低下する）および／または構成要素の活性を調節するために作製され得る。
本明細書で説明されるキメラ受容体のいずれかは、従来技術によって発現のため適切な
免疫細胞中に導入できる。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、一次Ｔ細胞またはＴ細
胞株などのＴ細胞である。あるいは、免疫細胞は、確立されたＮＫ細胞株（例えば、ＮＫ
－９２細胞）などのＮＫ細胞であってよい。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＣＤ
８（ＣＤ８＋）またはＣＤ８およびＣＤ４（ＣＤ８＋／ＣＤ４＋）を発現するＴ細胞であ
る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、確立されたＴ細胞株のＴ細胞、例えば、２９３
Ｔ細胞またはジャーカット細胞である。
一次Ｔ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、脾臓などの組織、リンパ節、胸腺
、または腫瘍組織などの任意の供給源から得ることができる。所望される免疫細胞型を得
るのに適した供給源は、従来技術の当業者に明らかであろう。いくつかの実施形態では、
免疫細胞集団は、患者から得られる骨髄またはＰＢＭＣ由来などの、造血器悪性腫瘍を有
するヒト患者由来である。いくつかの実施形態では、免疫細胞集団は健常ドナー由来であ
る。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、キメラ受容体を発現する免疫細胞が後に投与
される被験体から得られる。そこから細胞を得た同一被験体に投与される免疫細胞は、自
家細胞と呼ばれ、一方、細胞が投与される被験体ではない被験体から得られる免疫細胞は
、同種異系細胞と呼ばれる。
所望されるホスト細胞のタイプは、細胞を刺激分子と共培養することによって得られる
細胞集団内で増殖され得、例えば、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体がＴ細胞の増殖のため
に使用され得る。
本明細書で説明されるキメラ受容体構築体のいずれかを発現する免疫細胞を構築するた
めに、キメラ受容体の安定的または一時的な発現のためのベクターを本明細書で説明され
る従来方法によって構築し、免疫ホスト細胞中に導入し得る。例えば、キメラ受容体をコ
ードする核酸は、適切なプロモーターに操作可能な連結状態にあるウイルスベクターなど
の、適切な発現ベクター中にクローニングされ得る。核酸およびベクターを適切な条件下
で制限酵素と接触させて、互いに対を形成しリガーゼでつながれ得る各分子上の相補端を
生じ得る。あるいは、合成核酸リンカーを、キメラ受容体をコードする核酸の末端にライ
ゲートできる。合成リンカーはベクター中の特定の制限部位に相当する核酸配列を含み得
る。発現ベクター／プラスミド／ウイルスベクターの選択は、キメラ受容体発現のための
ホスト細胞のタイプに依存するが、真核細胞中での統合および複製に適しているべきであ
る。
様々なプロモーターを本明細書で説明されるキメラ受容体の発現のために使用でき、限
定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中初期プロモーター、ウイルスＬＴＲで
ラウス肉腫ＬＴＲ、ＨＩＶ－ＬＴＲ、ＨＴＬＶ－１ ＬＴＲ、モロニ―マウス白血病ウイ
ルス（ＭＭＬＶ）ＬＴＲ、骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）ＬＴＲ、脾限局巣形成ウ
イルス（ＳＦＦＶ）ＬＴＲなど、サルウイルス４０（ＳＶ４０）中初期プロモーター、単
純ヘルペスｔｋウイルスプロモーター、ＥＦ１－αイントロンを含有するまたは含有しな
い伸長因子１－α（ＥＦ１－α）プロモーターを含む。キメラ受容体の発現用の追加プロ
モーターは、免疫細胞での任意の構成的に活性なプロモーターを含む。あるいは、その発
現が免疫細胞内で調節され得るような、任意の調節可能プロモーターが使用され得る。
さらに、ベクターは、例えば、以下の：ホスト細胞における安定なまたは一時的な形質
移入体の選択のためのネオマイシン遺伝子などの選択可能マーカー遺伝子；高量転写のた
めのヒトＣＭＶ中初期遺伝子由来のエンハンサー／プロモーター配列；ｍＲＮＡ安定性の
ためのＳＶ４０由来の転写終結およびＲＮＡ処理シグナル；α－グロビンまたはβ－グロ
ビンのような高発現される遺伝子由来のｍＲＮＡ安定性および転写のための５’－および
３’－非翻訳領域；複製のＳＶ４０ポリオーマ起点および適切なエピソーム複製のためＣ
ｏｌＥ１；内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）、多用途複数クローニング部位；センス
およびアンチセンスＲＮＡのインビトロ転写のためのＴ７およびＳＰ６ ＲＮＡプロモー
ター；誘発されたときにベクターを有する細胞に死を生じる「自殺スイッチ」または「自
殺遺伝子」（例えば、ＨＳＶチミジンキナーゼ、ｉＣａｓｐ９などの誘導性カスパーゼ）
、ならびにキメラ受容体の発現を評価するためのレポーター遺伝子のいくつかまたはすべ
てを含み得る。後述のセクションＶＩを参照する。適切なベクターおよび導入遺伝子を含
むベクターを作製するための方法は、従来技術で良く知られており利用可能である。キメ
ラ受容体の発現のためのベクターの調製の例は、例えば、ＵＳ２０１４／０１０６４４９
に見出され、その全体が参考によって本明細書に組み込まれている。
いくつかの実施形態では、キメラ受容体構築体またはそのキメラ受容体をコードする核
酸はＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、キメラ受容体構築体またはそのキメラ
受容体をコードする核酸はＤＮＡベクターであり、免疫細胞にエレクトロポレーションさ
れ得る（例えば、Ｔｉｌｌら，Ｂｌｏｏｄ（２０１２）１１９（１７）：３９４０－３９
５０を参照する）。いくつかの実施形態では、キメラ受容体をコードする核酸はｍＲＮＡ
分子であり、これは免疫細胞にエレクトロポレーションされ得る。
本明細書で説明されるキメラ受容体構築体をコードする核酸配列を含むベクターのいず
れかもまた、本開示の範囲内である。このようなベクターは適切な方法によってホスト免
疫細胞などのホスト細胞中に送達され得る。ベクターを免疫細胞に送達する方法は、従来
技術で良く知られており、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはトランスポゾンエレクトロポレーショ
ン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはトランスポゾンを送達するリポソームまたはナノ粒子などの
トランスフェクション試薬；機械的変形によるＤＮＡ、ＲＮＡ、またはトランスポゾンあ
るいはタンパク質の送達（例えば、Ｓｈａｒｅｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ（２０１３）１１０（６）：２０８２－２０８７を参照）；あるいはウイル
ス形質導入を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体の発現のためのベクターは、
ウイルス形質導入によってホスト細胞に送達される。送達のための例示的なウイルス法は
、限定されないが、組換えレトロウイルス（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／０７９３
６、ＷＯ９４／０３６２２、ＷＯ９３／２５６９８、ＷＯ９３／２５２３４、ＷＯ９３／
１１２３０、ＷＯ９３／１０２１８、ＷＯ９１／０２８０５、米国特許第５，２１９，７
４０号および第４，７７７，１２７号、ＧＢ特許第２，２００，６５１号、および欧州特
許第０３４５２４２号を参照）、アリファウイルスをベースとするベクター、およびアデ
ノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１２６４９、Ｗ
Ｏ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９
８４およびＷＯ９５／００６５５を参照）を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容
体の発現用ベクターはレトロウイルスである。いくつかの実施形態では、キメラ受容体の
発現用ベクターはレンチウイルスである。いくつかの実施形態では、キメラ受容体の発現
用ベクターはアデノ関連ウイルスである。
キメラ受容体をコードするベクターがウイルスベクターを用いてホスト細胞に導入され
る例では、免疫細胞に感染できベクターを運ぶウイルス粒子が、従来技術で知られており
、例えば、ＰＣＴ出願番号ＷＯ１９９１／００２８０５Ａ２、ＷＯ１９９８／００９２７
１Ａ１、および米国特許第６，１９４，１９１号に見出される任意の方法によって産生さ
れ得る。ウイルス粒子は細胞培養上清から収集され、ウイルス粒子を免疫細胞と接触させ
る前に分離されおよび／または精製され得る。
本明細書で説明されるキメラ受容体のいずれかを発現するホスト細胞を調製する方法は
、生体外で免疫細胞を活性化することおよび／または増加することを含み得る。ホスト細
胞を活性化することは、細胞がエファクター機能（例えば、細胞毒性）を実施できる活性
化状態へとホスト細胞を刺激することを意味する。ホスト細胞を活性化する方法は、キメ
ラ受容体の発現のために使用されるホスト細胞のタイプに依存する。ホスト細胞を拡張す
ることは、キメラ受容体を発現する細胞数の増加をもたらす任意の方法を含み得、例えば
、ホスト細胞を増殖させる、またはホスト細胞を刺激して増殖させる。ホスト細胞の拡張
を刺激するための方法は、キメラ受容体の発現のために使用されるホスト細胞のタイプに
依存し、従来技術の当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態では、本明細書で説
明されるキメラ受容体のいずれかを発現するホスト細胞は、被験体への投与前に体外で活
性化および／または拡張される。
いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原を標的にする作用物質は抗体－薬剤
共役体（ＡＤＣ）である。従来技術の当業者に明らかなように、用語「抗体－薬剤共役体
」は「免疫毒素」と交換可能に使用でき、毒素または薬剤分子に共役体化された抗体（ま
たは、その抗原結合フラグメント）を含む融合分子を指す。相当する抗原への抗体の結合
は、その細胞表面（例えば、標的細胞）に抗原を提示する細胞への毒素または薬剤分子の
送達を可能にし、これによって標的細胞の死をもたらす。
いくつかの実施形態では、作用物質は抗体－薬剤共役体である。いくつかの実施形態で
は、抗体－薬剤共役体は抗原結合フラグメントおよび標的細胞中で細胞毒性を誘発する毒
素または薬剤を含む。いくつかの実施形態では、抗体－薬剤共役体は２型抗原を標的にす
る。いくつかの実施形態では、抗体－薬剤共役体はＣＤ３３またはＣＤ１９を標的にする
。
いくつかの実施形態では、抗体－薬剤共役体の抗原結合フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１２によって示される重鎖可変領域と同一の重鎖ＣＤＲ、およびＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１３によって示される軽鎖可変領域と同一の軽鎖ＣＤＲを有する。いくつかの実施
形態では、抗体－薬剤共役体の抗原結合フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２によ
って示される重鎖可変領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３によって示される軽鎖可変
領域を有する。
抗体－薬剤共役体における使用に適合する毒素または薬剤は、従来技術で良く知られて
おり、従来技術の当業者に明らかであろう。Ｐｅｔｅｒｓら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．（
２０１５）３５（４）：ｅ００２２５を参照する。いくつかの実施形態では、抗体－薬剤
共役体は抗体と薬剤分子を付着するリンカー（例えば、切断可能なリンカーなどのペプチ
ドリンカー）をさらに含み得る。
本明細書で説明されるＡＤＣは、本明細書で説明される併用療法が実施される被験体に
継続治療として使用され得る。
系統特異的細胞表面抗原を欠く造血細胞
本開示はまた、系統特異的細胞表面抗原を欠くように遺伝子改変されているＨＳＣなど
の造血細胞を提供する。いくつかの実施形態では、造血細胞は造血幹細胞である。造血幹
細胞（ＨＳＣ）は、骨髄およびリンパ系の前駆細胞の両方を上昇させることができ、これ
らはそれぞれ骨髄細胞（例えば、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、樹状細胞、
赤血球、血小板など）およびリンパ系細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）をさら
に上昇させる。ＨＳＣは、ＨＳＣの特定および／または分離のために使用できる細胞表面
マーカーＣＤ３４（例えば、ＣＤ３４＋）の発現、および細胞系統への関与と関連する細
胞表面マーカーが存在しないことによって特徴付けられる。
いくつかの実施形態では、ＨＳＣは哺乳動物被験体などの被験体から得られる。いくつ
かの実施形態では、哺乳動物被験体は非ヒト霊長類、げっ歯類（例えば、マウスまたはラ
ット）、ウシ、ブタ、ウマ、または愛玩動物である。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは
造血器悪性腫瘍を有するヒト患者などの、ヒト患者から得られる。いくつかの実施形態で
は、ＨＳＣは健常ドナーから得られる。いくつかの実施形態では、ＨＳＣはキメラ受容体
を発現する免疫細胞が後に投与される被験体から得られる。そこから細胞が得られた同一
被験体に投与されるＨＳＣは自家細胞と呼ばれ、一方、細胞が投与される被験体ではない
被験体から得られるＨＳＣは同種異系細胞と呼ばれる。
ＨＳＣは従来技術で知られている標準的手段を用いていずれかの適切な供給源から得る
ことができる。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは骨髄サンプルまたは血液サンプルなど
の被験体由来のサンプルから得られる。これに代えて、または追加で、ＨＳＣは臍帯から
得ることができる。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは骨髄または末梢血単核細胞（ＰＢ
ＭＣ）から得られる。一般的に、骨髄細胞は被験体の腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊柱骨、肋
骨または他の骨髄腔から得ることができる。骨髄は患者から採取して、従来技術で知られ
ている様々な分離および洗浄方法によって分離され得る。骨髄細胞の分離のための例示的
な方法は以下のステップ：ａ）骨髄サンプルの抽出、ｂ）骨髄懸濁液の３分画での遠心分
離ならびに中間分画およびバフィーコートの収集、ｃ）ステップ（ｂ）からのバフィーコ
ート分画を分離溶液、一般的にはＦｉｃｏｌｌ（登録商標）中でもう１回遠心分離し、骨
髄細胞を含む中間分画を収集する、ｄ）再注入可能な骨髄細胞の回収のためにステップ（
ｃ）からの収集した分画の洗浄、を含む。
ＨＳＣは一般的には骨髄に存在するが、末梢血液からＨＳＣを収集するために、動員剤
を投与することによって循環血液中に動員できる。いくつかの実施形態では、ＨＳＣが採
取される被験体は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）などの動員剤を投与される。
動員剤を用いる動員によって収集されるＨＳＣの数は、動員剤を使用せずに得られる細胞
の数より一般的には多い。
いくつかの実施形態では、サンプルは被験体から得られ、所望の細胞タイプ（例えば、
ＣＤ３４＋／ＣＤ３３－細胞）が次いで豊富化される。例えば、ＰＢＭＣおよび／または
ＣＤ３４＋造血細胞は本明細書で説明されるように血液から分離できる。細胞はまた、他
の細胞から、例えば、所望の細胞タイプの細胞表面のエピトープに結合する抗体での分離
および／または活性化によって分離できる。使用できる別の方法は、受容体関与による細
胞活性化を伴わずに特定細胞型を選択的に豊富化するために細胞表面マーカーに対する抗
体を用いるネガティブ選択を含む。
ＨＳＣ集団は、ＨＳＣを遺伝子工学処理して系統特異的細胞表面抗原を欠如させる前ま
たは後に拡張できる。細胞は、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ－３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ
）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン３（ＩＬ－３）、またはインター
ロイキン６（ＩＬ－６）などの１種類以上のサイトカインを含有する拡張培地を含む条件
下で培養され得る。細胞は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、
１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５日ま
たはいずれかの必要な範囲の間、拡張され得る。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは被験
体から得られたサンプルからの所望の細胞集団（例えば、ＣＤ３４＋／ＣＤ３３－）の分
離後かつ遺伝子工学処理前に拡張される。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは遺伝子工学
処理後に拡張され、これによって遺伝子改変を受けて系統特異的細胞表面抗原を欠く細胞
を選択的に拡張する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変の後で所望の特性（例えば、
表現型または遺伝型）を有する一つの細胞（「一つのクローン」）またはいくつかの細胞
が選択され独立して拡張され得る。
いくつかの実施形態では、造血細胞は遺伝子改変されて細胞表面系統特異的抗原を欠く
。いくつかの実施形態では、造血細胞は遺伝子改変されて、作用物質によって標的化され
る同一細胞表面系統特異的抗原を欠く。本明細書で使用されるとき、造血細胞が、遺伝子
改変された造血細胞と同一タイプの自然発生する造血細胞（例えば、ＣＤ３４などの同一
細胞表面マーカーの存在によって特徴付けられる）と比べて細胞表面系統特異的抗原の著
しく低下した発現を有する場合、造血細胞は細胞表面系統特異的抗原を欠いているとみな
される。いくつかの実施形態では、造血細胞は細胞表面系統特異的抗原の検出可能な発現
を有さない。細胞表面系統特異的抗原の発現量は従来技術で知られている任意の手段によ
って評価できる。例えば、細胞表面系統特異的抗原の発現量は、抗原特異的抗体を用いて
抗原を検出することによって評価できる（例えば、フローサイトメトリー法、ウェスタン
ブロッティング）。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変された造血細胞上の細胞表面系統特異的抗原の発
現は、自然発生する造血細胞上の細胞表面系統特異的抗原の発現と比べられる。いくつか
の実施形態では、遺伝子工学処理は、自然発生造血細胞上の細胞表面系統特異的抗原の発
現と比べて、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、
９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の細胞表面系統特異的
抗原の発現量における低下をもたらす。
いくつかの実施形態では、造血細胞は細胞表面系統特異的抗原をコードする全内因性遺
伝子を欠く。いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原をコードする全内因性遺
伝子が除去されている。いくつかの実施形態では、造血細胞は細胞表面系統特異的抗原を
コードする内因性遺伝子の一部を含む。いくつかの実施形態では、造血細胞は細胞表面系
統特異的抗原の一部（例えば、切り詰められたタンパク質）を発現する。他の実施形態で
は、細胞表面系統特異的抗原をコードする内因性遺伝子の一部が除去されている。いくつ
かの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原をコードする遺伝子の少なくとも１０％、２
０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％またはそれより多くが除去されている。
従来技術の当業者によって認識されるように、細胞表面系統特異的抗原をコードするヌ
クレオチド配列の一部は、除去されている、または１つ以上の非コード配列であり得、そ
のため造血細胞は抗原を欠く（例えば、著しく低下した抗原の発現を有する）。
いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原はＣＤ３３である。ＣＤ３３の予測
される構造は、２つの免疫グロブリン領域であるＩｇＶ領域およびＩｇＣ２領域を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＤ３３の免疫グロブリンＣ領域の一部が除去される。
細胞表面系統特異的抗原を欠く、ＨＳＣなどの遺伝子工学処理された造血細胞のいずれ
かは、定型的な方法によりまたは本明細書で説明される方法によって調製できる。いくつ
かの実施形態では、遺伝子工学処理はゲノム編集を用いて実施される。本明細書で使用さ
れるとき、「ゲノム編集」は、生物の、任意のタンパク質コードまたは非コードヌクレオ
チド配列を含む、ゲノムを改変して標的遺伝子の発現を破壊する方法を指す。一般的に、
ゲノム編集法は、ゲノムの核酸を、例えば標的とされるヌクレオチド配列で切断できるエ
ンドヌクレアーゼの使用を含む。ゲノム中の二本鎖切断の修復は変異を導入して修復され
得、および／または外来の核酸が標的化部位に挿入され得る。
ゲノム編集法は一般的に、標的核酸中で二本鎖切断を生じることに関与するエンドヌク
レアーゼのタイプに基づいて分類される。これらの方法は、ジンクフィンガーヌクレアー
ゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターをベースとしたヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ
）、メガヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の使用を含む。
本開示の一つの態様では、改変された正常細胞集団による腫瘍細胞の置換は、系統特異
的抗原が改変される正常細胞を用いて実施される。このような改変は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃ
ａｓ９系を用いる任意の系統特異的抗原の枯渇または阻害を含み得、ここでクラスター化
規則的配置の短回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）Ｃａｓ９系は工学処理された非自然発生Ｃ
ＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系である。（図４）。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、限定されないが、細菌、ヒト、ショウジョウバエ、ゼブラ
フィッシュおよび植物を含む様々な生物のゲノムを編集するためにうまく使用されている
。例えば、Ｊｉａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１３）３１
（３）：２３３、Ｑｉら，Ｃｅｌｌ（２０１３）５：１１７３、ＤｉＣａｒｌｏら，Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１３）７：４３３６、Ｈｗａｎｇら，Ｎａｔ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１３），３：２２７）、Ｇｒａｔｚら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（
２０１３）１９４：１０２９、Ｃｏｎｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）６１２１：８１
９、Ｍａｌｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）６１２１：８２３、ＣｈｏらＮａｔ．Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１３）３：２３０、およびＪｉａｎｇら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１３）４１（２０）：ｅｌ８８を参照する。
本開示は系統特異的抗原ポリヌクレオチド中の標的配列とハイブリダイズするＣＲＩＳ
ＰＲ／Ｃａｓ９系を利用し、ここでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系はＣａｓ９ヌクレアーゼお
よび工学処理されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（または単鎖ガイドＲＮＡ）を含む。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体は系統特異的抗原ポリヌクレオチドに結合でき、抗原ポリ
ヌクレオチドの切断を可能にし、これによってポリヌクレオチドを改変する。
本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、コードまたは非コード領域中の細胞表面系統特異
的抗原内で、遺伝子内またはその付近で、例えばリーダー配列、トレーラ配列、またはイ
ントロンなど、あるいは非転写化領域内で、コード領域の上流または下流のいずれかにお
いて、対象の領域に結合する／または対象の領域を切断し得る。本開示で使用されるガイ
ドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ｇＲＮＡがゲノム中の所定の切断部位（標的部位）へのＣａｓ
９－ｇＲＮＡ複合体の結合を指示するように設計され得る。切断部位は、未知配列領域を
、またはＳＮＰ、ヌクレオチド挿入、ヌクレオチド欠失、再配列などを含む領域を含むフ
ラグメントを放出するように選択され得る。
遺伝子領域の切断は、Ｃａｓ酵素によって標的配列の位置で一本鎖または二本鎖を切断
することを含み得る。一つの実施形態では、このような切断は、標的遺伝子の転写の低下
をもたらし得る。別の実施形態では、切断は外来の鋳型ポリヌクレオチドを用いた相同組
換えによって、切断された標的ポリヌクレオチドを修復することをさらに含み、ここで修
復は、標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を生じ
る。
用語「ｇＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ」、および「ＣＲＩＳＰＲガイド配列」は全体を通
して交換可能に使用され得、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＣａｓ ＤＮＡ結合タンパク質の
特異性を決定する配列を含む核酸を指す。ｇＲＮＡはホスト細胞のゲノム中の標的核酸配
列に（相補的、部分的、または完全に）ハイブリダイズする。標的核酸にハイブリダイズ
するｇＲＮＡまたはその一部は、長さが１５～２５個のヌクレオチド、１８～２２個のヌ
クレオチド、または１９～２１個のヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、
標的核酸にハイブリダイズするｇＲＮＡ配列は、長さが１５、１６、１７、１８、１９、
２０、２１、２２、２３、２４、または２５個のヌクレオチドである。いくつかの実施形
態では、標的核酸配列にハイブリダイズするｇＲＮＡ配列は、長さが１０～３０個、また
は１５～２５個のヌクレオチドである。
標的核酸に結合する配列に加え、いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡはスキャホルド配
列も含む。標的核酸に相補的な配列およびスキャホルド配列の両方をコードするｇＲＮＡ
の発現は、標的核酸に結合する（ハイブリダイズする）機能および標的核酸にエンドヌク
レアーゼを補充する機能の二重機能を有し、これは部位特異的なＣＲＩＳＰＲ活性を生じ
得る。いくつかの実施形態では、このようなキメラｇＲＮＡは一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇ
ＲＮＡ）と呼ばれる。
本明細書で使用されるとき、「スキャホルド配列」はｔｒａｃｒＲＮＡとも呼ばれ、相
補的ｇＲＮＡ配列に結合された（ハイブリダイズした）標的核酸にＣａｓエンドヌクレア
ーゼを補充する核酸配列を指す。少なくとも１つのステムループ構造を含み、エンドヌク
レアーゼを補充する任意のスキャホルド配列は、本明細書で説明される遺伝子エレメント
およびベクターで使用され得る。例示的なスキャホルド配列は、従来技術の当業者に明ら
かであり、例えば、Ｊｉｎｅｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）３３７（６０９６）：８
１６－８２１、Ｒａｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２０１３）８：２２８１
－２３０８、ＰＣＴ出願番号ＷＯ２０１４／０９３６９４、およびＰＣＴ出願番号ＷＯ２
０１３／１７６７７２に見出される。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列はスキャホルド配列を含まず、スキャホルド配
列は別の転写として発現される。このような実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、スキャホル
ド配列の一部に相補的であり、かつスキャホルド配列に結合（ハイブリダイズ）し標的核
酸にエンドヌクレアーゼを補充するように機能する追加の配列をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は標的核酸に少なくとも５０％、５５％、６０
％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８
％、９９％、または少なくとも１００％相補的である（標的ポリヌクレオチド配列とのｇ
ＲＮＡ配列の相補性の教示のために参考によって組み込まれる米国特許第８，６９７，３
５９号を参照する）。ＣＲＩＳＰＲガイド配列と標的核酸の３’端付近の標的核酸との間
のミスマッチはヌクレアーゼ切断活性を消失し得ることが実証されている（Ｕｐａｄｈｙ
ａｙら，Ｇｅｎｅｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１３）３（１２）：２２３
３－２２３８）。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は標的核酸の３’端（例えば、
標的核酸の３’端の最後の５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチド）に少なく
とも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５
％、９６％、９７％、９８％、９９％、または少なくとも１００％相補的である。
標的核酸は、エンドヌクレアーゼと相互作用し標的核酸にエンドヌクレアーゼ活性を標
的化することにさらに関与し得るプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に３’端で隣
接される。一般的に、標的核酸配列に隣接するＰＡＭ配列は、エンドヌクレアーゼおよび
エンドヌクレアーゼが由来する起源に依存する。例えば、Ａ群溶血レンサ球菌由来である
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼでは、ＰＡＭ配列はＮＧＧである。黄色ブドウ球菌由来のＣ
ａｓ９エンドヌクレアーゼでは、ＰＡＭ配列はＮＮＧＲＲＴである。髄膜炎菌を由来であ
るＣａｓ９エンドヌクレアーゼでは、ＰＡＭ配列はＮＮＮＮＧＡＴＴである。スタフィロ
コックス・サーモフィルス由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼでは、ＰＡＭ配列はＮＮＡ
ＧＡＡである。トレポネーマ・デンティコーラ由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼでは、
ＰＡＭ配列はＮＡＡＡＡＣである。Ｃｐｆ１ヌクレアーゼでは、ＰＡＭ配列はＴＴＮであ
る。
いくつかの実施形態では、細胞を遺伝子工学処理することは、Ｃａｓエンドヌクレアー
ゼを細胞中に導入することも含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ
およびｇＲＮＡをコードする核酸は、同一核酸（例えば、ベクター）上で提供される。い
くつかの実施形態では、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡをコードする核酸は異
なる核酸（例えば、異なるベクター）上で提供される。これに代えて、または追加で、Ｃ
ａｓエンドヌクレアーゼは細胞中にタンパク質形態で提供または導入され得る。
いくつかの実施形態では、ＣａｓエンドヌクレアーゼはＣａｓ９酵素またはその変異体
である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼはＡ群溶血レンサ球菌、
黄色ブドウ球菌、髄膜炎菌、スタフィロコックス・サーモフィルス、またはトレポネーマ
・デンティコーラ由来である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコ
ードするヌクレオチド配列は、ホスト細胞中での発現のためにコドン最適化され得る。い
くつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼはＣａｓ９ホモログまたはオルソログである
。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列
はタンパク質の活性を変えるためにさらに改変される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ
９エンドヌクレアーゼは触媒的に不活性なＣａｓ９である。例えば、ｄＣａｓ９は触媒的
に活性な残基（Ｄ１０およびＨ８４０）の変異を含み、ヌクレアーゼ活性を有さない。こ
れに代えて、または追加で、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは別のタンパク質またはその一
部に融合され得る。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９はＫＲＡＢ領域などのリプレッ
サー領域に融合される。いくつかの実施形態では、このようなｄＣａｓ９融合タンパク質
は、多重遺伝子抑制（例えば、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ））のために本明細書
で説明される構築体で使用される。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９はＶＰ６４また
はＶＰＲなどのアクチベーター領域に融合される。いくつかの実施形態では、このような
ｄＣａｓ９融合タンパク質は、遺伝子活性化（例えば、ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰ
Ｒａ））のために本明細書で説明される構築体で使用される。いくつかの実施形態では、
ｄＣａｓ９はヒストンデメチラーゼ領域またはヒストンアセチルトランスフェラーゼ領域
などのエピジェネティック調節領域に融合される。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９
はＬＳＤ１またはｐ３００、あるいはこれらの一部に融合される。いくつかの実施形態で
は、ｄＣａｓ９融合はＣＲＩＳＰＲをベースとするエピジェネティック調節のために使用
される。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９またはＣａｓ９はＦｏｋ１ヌクレアーゼ領
域に融合される。いくつかの実施形態では、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼ領域に融合されたＣａ
ｓ９またはｄＣａｓ９は、ゲノム編集のために使用される。いくつかの実施形態では、Ｃ
ａｓ９またはｄＣａｓ９は蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙな
ど）に融合される。いくつかの実施形態では、蛍光タンパク質に融合されたＣａｓ９／ｄ
Ｃａｓ９タンパク質は、ゲノム遺伝子座の標識および／または可視化、あるいはＣａｓエ
ンドヌクレアーゼを発現する細胞を特定するために使用される。
これに代えて、または追加で、ＣａｓエンドヌクレアーゼはＣｐｆ１ヌクレアーゼであ
る。いくつかの実施形態では、ホスト細胞はプレボテラ種またはフランシセラ種由来のＣ
ｐｆ１ヌクレアーゼを発現する。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼをコー
ドするヌクレアーゼ配列は、ホスト細胞における発現のためにコドン最適化され得る。
いくつかの実施形態では、本開示はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を用いる造血細胞中の細
胞表面系統特異的抗原を阻害するための組成物および方法を提供し、ここでガイドＲＮＡ
配列は細胞表面系統特異的抗原をコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズする。い
くつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原はＣＤ３３であり、ｇＲＮＡはＣＤ３３
をコードするヌクレオチド配列の一部にハイブリダイズする（図５）。ＣＤ３３を標的に
するｇＲＮＡの例が表４で示されるが、ＣＤ３３にハイブリダイズし本明細書で説明され
る方法で使用できる追加のｇＲＮＡが開発され得る。
表４はＣＤ３３の一部にハイブリダイズする、またはハイブリダイズすることが予測さ
れる例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
Figure 2022058776000009
いくつかの実施形態では、ＨＳＣ、特に同種異系ＨＳＣをさらに遺伝子工学処理して移
植片対宿主効果を低下することが望まれ得る。例えば、再発したＡＭＬの標準療法は造血
幹細胞移植（ＨＳＣＴ）である。しかしＨＳＣＴの成功を制限する要因の少なくとも１つ
は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）であり、これには細胞表面分子ＣＤ４５の発現が関与し
ている。例えば、Ｖａｎ Ｂｅｓｉｅ，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｈｅｍａ
ｔｏｌ Ｅｄｕｃ Ｐｒｏｇｒａｍ（２０１３）５６、Ｍａｗａｄ Ｃｕｒｒ．Ｈｅｍａ
ｔｏｌ．Ｍａｌｉｇ．Ｒｅｐ．（２０１３）８（２）：１３２を参照する。ＣＤ４５ＲＡ
およびＣＤ４５ＲＯはＣＤ４５のアイソフォームである（赤血球以外のすべての造血細胞
で認められる）。Ｔリンパ球では、ＣＤ４５ＲＡはナイーブ細胞上で発現され、一方、Ｃ
Ｄ４５ＲＯは記憶細胞上で発現される。ＣＤ４５ＲＡ Ｔ細胞は、ＨＳＣＴによるレシピ
エント特異的抗原に対して反応性である可能性が高く、ＧＶＨＤをもたらす。このため、
移植拒絶またはＧＶＨＤの可能性も低減する効率的で安全なＡＭＬ治療が依然として必要
とされている。ＣＤ４５を有する細胞は生存のために必要とされるが抗原はＣＲＩＳＰＲ
を用いて幹細胞から除去され得るため、ＣＤ４５は１型系統抗原である。
ＨＳＣＴに続くＧＶＨＤの進行に起因して合併症が生じることを考慮し、本開示はＣＤ
４５ＲＡを標的にする組成物および方法も提供する。このような組成物および方法は、Ｇ
ＶＨＤの発生または広がりを予防および／または低下することを意図される。
このため、ＧＶＨＤの場合、患者の治療は以下のステップ：（１）患者に治療上効果的
な量のＴ細胞を投与することであって、ここでＴ細胞はＣＤ４５ＲＡ系統特異的抗原を標
的にするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む、および（２）患者に
造血幹細胞を注入することであって、ここで造血細胞はＣＤ４５ＲＡ系統特異的抗原の発
現を低下させている、を含み得る。
さらに、本開示はＣＤ３３およびＣＤ４５ＲＡ系統特異的抗原の組み合わせ阻害のため
の組成物および方法を提供する。このような治療処方計画は以下のステップ：（１）患者
に治療上効果的な量のＴ細胞を投与することであって、ここでＴ細胞はＣＤ３３およびＣ
Ｄ４５ＲＡ系統特異的抗原を標的にするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配
列を含む、および（２）患者に自家または同種異系のどちらかで造血幹細胞を注入または
再注入することであって、ここで造血細胞はＣＤ３３およびＣＤ４５ＲＡ系統特異的抗原
の発現を低下させている、を含み得る。
いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原ＣＤ４５ＲＡはまた、ＣＲＩＳＰＲ
／Ｃａｓ９系を用いて造血細胞中で除去または阻害される。いくつかの実施形態では、ｇ
ＲＮＡ配列はＣＤ４５ＲＡをコードするヌクレオチド配列の一部にハイブリダイズする（
図６）。ＣＤ４５ＲＡを標的にするｇＲＮＡの例を表５に示すが、ＣＤ４５ＲＡにハイブ
リダイズして本明細書で説明される方法で使用できる追加のｇＲＮＡが開発され得る。
表５はヒトＣＤ４５のエクソン４またはエクソン５にハイブリダイズする、またはハイ
ブリダイズすることが予測される例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
Figure 2022058776000010
本明細書において、細胞表面系統特異的抗原を欠く細胞を産生する方法も提供され、細
胞を用意することおよびゲノム編集のためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の構成要素を細胞中
に導入することを含む。いくつかの実施形態では、系統特異的細胞表面抗原をコードする
ヌクレオチド配列の一部にハイブリダイズする、またはハイブリダイズすることが予測さ
れるＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む核酸が、細胞中に導入される
。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡはベクターで細胞中に導入される。いくつかの実施
形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが細胞中に導入される。いくつかの実施形態では、
Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする核酸として細胞中
に導入される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼをコ
ードするヌクレオチド配列は、同一核酸（例えば、同一ベクター）で細胞中に導入される
。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、タンパク質の形態で細胞中に
導入される。いくつかの実施形態では、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡはイン
ビトロで前形成され、複合体として細胞中に導入される。
本開示はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体の１つ以上の構成要素をコードできる、工学処
理された非自然発生ベクターおよびベクター系をさらに提供し、ここでベクターは、（ｉ
）系統特異的抗原配列にハイブリダイズする（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡ、
および（ｉｉ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む。
本開示のベクターは、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞中で１つ以上の配列
の発現を誘導できる。哺乳動物発現ベクターの例は、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｎａｔｕｒ
ｅ（１９８７）３２９：８４０）、およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら，ＥＭＢＯ
Ｊ．（１９８７）６：１８７）を含む。哺乳動物細胞が使用される場合、発現ベクターの
コントロール機能は、一般的には１つ以上の制御エレメントによってもたらされる。例え
ば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロ
ウイルス、サルウイルス４０、ならびに本明細書で開示される、および従来技術で知られ
ている他のもの由来である。原核細胞および真核細胞の両方に適した他の発現系について
、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲ
Ｙ ＭＡＮＵＡＬ（分子クローニング：実験室マニュアル）．２ｎｄ ｅｄｓ．，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９、第１６章と第１７章、を参照する。
本開示のベクターは、特定の細胞タイプにおいて優先的に核酸の発現を指示できる（例
えば、組織特異的制御エレメントが核酸を発現するために使用される）。このような制御
エレメントは、組織特異的または細胞特異的であり得るプロモーターを含む。用語「組織
特異的」はプロモーターに適用されるとき、対象のヌクレオチド配列の選択的発現を特定
タイプの組織（例えば、種子）に指示でき、異なるタイプの組織では対象の同一ヌクレオ
チド配列の発現を相対的に欠くプロモーターを指す。用語「細胞型特異的」はプロモータ
ーに適用されるとき、対象のヌクレオチド配列の選択的発現を特定の細胞型に指示でき、
同一組織内の異なる型の細胞では対象の同一ヌクレオチド配列の発現を相対的に欠くプロ
モーターを指す。用語「細胞型特異的」はプロモーターに適用されるとき、単一組織内の
領域で対象のヌクレオチド配列の選択的発現を促進できるプロモーターも意味する。プロ
モーターの細胞型特異性は、従来技術で良く知られた方法、例えば、免疫組織化学染色を
用いて評価され得る。
従来のウイルスおよび非ウイルスに基づいた遺伝子移入方法を使用して、ＣＲＩＳＰＲ
／Ｃａｓ９をコードする核酸を哺乳動物細胞または標的組織に導入できる。このよう方法
を使用して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の構成要素をコードする核酸を培養で細胞、または
ホスト生物に投与できる。非ウイルス送達系はＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明
細書で説明されるベクターの転写物）、ネイキッド核酸、および送達ベヒクルと複合体化
された核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含み、こ
れらは細胞への送達後にエピソームゲノムまたは統合されたゲノムのいずれかを有する。
遺伝子療法手順の見直しについて。
ウイルスベクターは患者に直接的に投与され得る（インビボ）か、それらはインビトロ
または体外で細胞を操作するために使用でき、ここで改変された細胞が患者に投与され得
る。一つの実施形態では、本開示は、限定されないが、遺伝子移送のためにレトロウイル
ス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスおよび単純ヘルペスウイルス
を含むウイルスをベースとした系を利用する。さらに、本開示は、レトロウイルスまたは
レンチウイルスなどの、ホストゲノム中で統合が可能なベクターを提供する。好ましくは
本開示のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の発現のために使用されるベクターはレンチウイルスベ
クターである。
一つの実施形態では、本開示はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓをコードする１つ以上のベクター
を真核細胞中に導入することを提供する。細胞は癌細胞であってよい。あるいは、細胞は
造血幹細胞などの造血細胞である。幹細胞の例は、多能性、複数能性および単能性幹細胞
を含む。多能性幹細胞の例は、胚幹細胞、胚性生殖細胞、胚性癌細胞および誘導多能性幹
細胞（ｉＰＳＣ）を含む。好ましい実施形態では、本開示はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を造
血幹細胞中に導入することを含む。
本開示のベクターは、被験体における真核細胞に送達される。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９
系を介した真核細胞の改変は、細胞培養で実施でき、ここで本方法は改変前に被験体から
真核細胞を分離することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は当該真核細胞および
／またはそれから派生した細胞を被験体に戻すことをさらに含む。
併用療法
本明細書で説明されるように、細胞表面系統特異的抗原に結合する抗原結合フラグメン
トを含む作用物質は、細胞表面系統特異的抗原を欠く造血細胞と併せて患者に投与され得
る。本明細書で使用されるとき、「被験体」、「個体」、および「患者」は交換可能に使
用され、脊椎動物、好ましくはヒトなどの哺乳動物を指す。哺乳動物は、限定されないが
、ヒト霊長類、非ヒト霊長類、あるいはネズミ、ウシ、ウマ、イヌまたはネコ種を含む。
いくつかの実施形態では、被験体は造血器悪性腫瘍を有するヒト患者である。
いくつかの実施形態では、作用物質および／または造血細胞は医薬品として許容可能な
担体と混合されて医薬組成物を形成し得、これもまた本開示の範囲内である。
本明細書で説明される方法を実施するため、細胞表面系統特異的抗原に結合する抗原結
合フラグメントを含む作用物質の効果的な量と、造血細胞の効果的な量とを、治療を必要
とする被験体に併用投与できる。本明細書で使用されるとき、用語「効果的な量」は用語
「治療上効果的な量」と交換可能で使用され得、それを必要とする被験体への投与で所望
の活性をもたらすのに十分な作用物質、細胞集団、または医薬組成物（例えば、作用物質
および／または造血細胞を含む組成物）の量を指す。本開示の文脈では、用語「効果的な
量」は、本開示の方法によって治療される障害の出現を遅延する、進行を停止する、少な
くとも１つの症状を軽減または緩和するのに十分である、化合物、細胞集団、または医薬
組成物の量を指す。有効成分の組み合わせが投与される場合、組み合わせの効果的な量は
、個別に投与される場合の効果的な量である各成分の量を含み得る、または含み得ないこ
とに留意すべきである。
効果的な量は、従来技術の当業者によって認識されるように、治療される特定の症状、
症状の重篤度、個別患者の年齢、身体的状態、サイズ、性別および体重を含むパラメータ
、治療期間、併用療法（実施される場合）の性質、投与の特定経路ならびに医療関係者の
知識および見解における要因などに依存して変化する。いくつかの実施形態では、効果的
な量は被験体におけるいずれかの疾患または障害の症状を緩和し、軽減し、回復し、改善
し、低減し、または進行を遅延する。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。い
くつかの実施形態では、被験体は造血器悪性腫瘍を有するヒト患者である。
本明細書で説明されるとき、キメラ受容体を発現する造血細胞および／または免疫細胞
は、被験体に対して自家であり得、すなわち、細胞が治療を必要とする被験体から得られ
、細胞表面系統特異的抗原の発現またはキメラ受容体構築体の発現を欠くように遺伝子工
学処理され、次いで同一被験体に投与される。被験体への自家細胞の投与は、非自家細胞
の投与と比べて、ホスト細胞の拒絶低下をもたらし得る。あるいは、ホスト細胞は同種異
系細胞であり、すなわち、細胞が第一の被験体から得られ、細胞表面系統特異的抗原の発
現またはキメラ受容体構築体の発現を欠くように遺伝子工学処理され、そして第一被験体
とは異なるが同種である第二の被験体に投与される。例えば、同種異系免疫細胞はヒトド
ナー由来であり得、このドナーとは異なるヒトレシピエントに投与される。
いくつかの実施形態では、免疫細胞および／または造血細胞は同種異系細胞であり、移
植片対宿主病を低下するようにさらに遺伝子工学処理されている。例えば、本明細書で説
明されるように、造血幹細胞はＣＤ４５ＲＡの発現が低下しているように遺伝子工学処理
され得る（例えば、ゲノム編集を用いて）。
いくつかの実施形態では、本明細書で説明されるキメラ受容体のいずれかを発現する免
疫細胞は、被験体に標的細胞（例えば、癌細胞）の数を少なくとも２０％、例えば、５０
％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍またはそれより
多く低下するのに効果的な量で投与される。
哺乳動物（例えば、ヒト）に投与される細胞、すなわち免疫細胞または造血細胞の一般
的な量は、例えば、１００万～１０００億個の細胞の範囲であってよいが、この例示的な
範囲を下回るまたは超える量も本開示の範囲内である。例えば、細胞の１日用量は、約１
００万～約５００億個の細胞（例えば、約５００万個、約２５００万個、約５億個、約１
０億個、約５０億個、約２００億個、約３００億個、約４００億個、または上記の値のい
ずれか２つによって定められる範囲）、好ましくは約１０００万～約１０００億個（例え
ば、約２０００万個、約３０００万個、約４０００万個、約６０００万個、約７０００万
個、約８０００万個、約９０００万個、約１００億個、約２５０億個、約５００億個、約
７５０億個、約９００億個、または上記の値のいずれか２つによって定められる範囲）、
より好ましくは約１億～約５００億個（例えば、約１億２０００万個、約２億５０００万
個、約３億５０００万個、約４億５０００万個、約６億５０００万個、約８億個、約９億
個、約３０億個、約３００億個、約４５０億個、または上記の値のいずれか２つによって
定められる範囲）であってよい。
一つの実施形態では、キメラ受容体（例えば、キメラ受容体をコードする核酸）は、免
疫細胞中に導入され、被験体（例えば、ヒト患者）はキメラ受容体を発現する免疫細胞の
初回投与または用量を受ける。作用物質（例えば、キメラ受容体を発現する免疫細胞）の
１回以上のその後の投与は、前回の投与後、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、
８、７、６、５、４、３、または２日の間隔で患者になされ得る。作用物質の１回を超え
る用量は、被験体に作用物質の投与を週あたり、例えば、２回、３回、４回、またはそれ
より多く投与できる。被験体は、週あたり１回を超える作用物質（例えば、キメラ受容体
を発現する免疫細胞）の投与、続いて作用物質の投与のない１週、そして最後に１回を超
える作用物質の追加投与（例えば、キメラ受容体を発現する免疫細胞の週あたり１回を超
える投与）を受け得る。キメラ受容体を発現する免疫細胞は、１日おきに週あたり３回投
与を２、３、４、５、６、７、８、またはそれより多い週の間投与され得る。
本開示の文脈では、本明細書で列挙される疾患症状のいずれかに関する限りにおいて、
用語「治療する」、「治療」、および同様の用語は、このような症状と関連する少なくと
も１つの徴候を緩和または軽減する、あるいはこのような症状の進行を遅延または逆転さ
せることを意味する。本開示の意味合いでは、用語「治療する」は発症（すなわち、疾患
の臨床所見前の期間）を停止、遅延する、および／または疾患を発症または悪化するリス
クを低下することも意味する。例えば、癌との関連では、用語「治療する」は、患者の腫
瘍負荷を排除または低下する、あるいは転移を防止、遅延、または阻害することなどを意
味し得る。
いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原を結合する抗原結合フラグメントを
含む作用物質および細胞表面系統特異的抗原を欠く造血細胞集団。従って、このような治
療方法では、作用物質は細胞表面系統特異的抗原を発現する標的細胞を標的として殺すた
めに認識（結合）する。抗原を欠く造血細胞は、作用物質によって標的にされる細胞型の
再増殖を可能にする。いくつかの実施形態では、患者の治療は以下のステップ：（１）細
胞表面系統特異的抗原を標的にする作用物質の治療上効果的な量を患者に投与すること、
および（２）自家または同種異系のいずれかの造血幹細胞を患者に注入または再注入する
ことであって、ここで造血細胞は低減された系統特異的な疾患関連抗原の発現を有する、
を含んでよい。いくつかの実施形態では、患者の治療は以下のステップ：（１）キメラ受
容体を発現する免疫細胞の治療上効果的な量を患者に投与することであって、ここで免疫
細胞は細胞表面系統特異的な疾患関連抗原を結合するキメラ受容体をコードする核酸配列
を含む、および（２）自家または同種異系のいずれかの造血細胞（例えば、造血幹細胞）
を患者に注入または再注入することであって、ここで造血細胞は低減された系統特異的疾
患関連抗原の発現を有する、を含んでよい。
細胞表面系統特異的抗原を結合する抗原結合フラグメントを含む作用物質および細胞表
面系統特異的抗原を欠く造血細胞集団を用いる治療方法の効能は、従来技術で知られてお
り習熟した医療専門家に明らかであるいずれかの方法によって評価され得る。例えば、治
療の効能は、被験体の生存、または被験体あるいはその組織またはサンプル中の癌負荷に
よって評価され得る。いくつかの実施形態では、治療の効能は、細胞の特定の集団または
系統に属する細胞の数を定量することによって評価される。いくつかの実施形態では、治
療の効能は細胞表面系統特異的抗原を提示する細胞の数を定量することによって評価され
る。
いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原に結合する抗原結合フラグメントを
含む作用物質および造血細胞集団が同時に投与される。
いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原を結合する抗原結合フラグメントを
含む作用物質（例えば、本明細書で説明されるキメラ受容体を発現する免疫細胞）は、造
血細胞の投与前に投与される。いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原を結合
する抗原結合フラグメントを含む作用物質（例えば、本明細書で説明されるキメラ受容体
を発現する免疫細胞）は、造血細胞の投与の少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日
、６日、１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、１
２週、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月またはそれより前に投与される。
いくつかの実施形態では、造血細胞は、細胞表面系統特異的抗原を結合する抗原結合フ
ラグメントを含む作用物質（例えば、本明細書で説明されるキメラ受容体を発現する免疫
細胞）の前に投与される。いくつかの実施形態では、造血細胞集団は、細胞表面系統特異
的抗原に結合する抗原結合フラグメントを含む作用物質の投与の少なくとも約１日、２日
、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、
１０週、１１週、１２週、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月またはそれより前に投与され
る。
いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原を標的にする作用物質および造血細
胞集団は実質的に同時に投与される。いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原
を標的にする作用物質が投与され、患者はある期間評価され、その後に造血細胞集団が投
与される。いくつかの実施形態では、造血細胞集団が投与され、患者はある期間評価され
、その後に細胞表面系統特異的抗原を標的にする作用物質が投与される。
作用物質および／または造血細胞集団の複数回投与（例えば、用量）も本開示の範囲内
である。いくつかの実施形態では、作用物質および／または造血細胞集団は被験者に一回
投与される。いくつかの実施形態では、作用物質および／または造血細胞集団は１回を超
えて（例えば、少なくとも２、３、４、５回、またはそれより多い回数）被験体に投与さ
れる。いくつかの実施形態では、作用物質および／または造血細胞集団は定期的に、例え
ば６ヶ月ごとに、被験体に投与される。
いくつかの実施形態では、被験体は造血器悪性腫瘍を有するヒト被験体である。本明細
書で使用されるとき、造血器悪性腫瘍は、造血細胞（例えば、前駆体および幹細胞を含む
血液細胞）を含む悪性の異常を指す。造血器悪性腫瘍の例は、限定されないが、ホジキン
リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、または多発性骨髄腫を含む。白血病は、急性骨
髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病または慢
性リンパ芽球性白血病、および慢性リンパ性白血病を含む。
いくつかの実施形態では、白血病は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。ＡＭＬは、主
要な分化および増殖制御経路を中断させる漸進的に獲得された重大な遺伝子変化を有する
形質転換された細胞を起源とする、異質でクローン性の新生物疾患として特徴付けられる
（Ｄｏｈｎｅｒら，ＮＥＪＭ，（２０１５）３７３：１１３６）。ＣＤ３３糖タンパク質
は大多数の骨髄性白血病細胞で、ならびに正常骨髄および単球前駆体で発現され、ＡＭＬ
療法の魅力的な標的であると考えられている（Ｌａｓｚｌｏら，Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．（
２０１４）２８（４）：１４３－５３）。抗ＣＤ３３モノクローナル抗体をベースとした
治療法を用いた臨床試験は、標準的な化学療法と併用されたときにＡＭＬ患者のサブセッ
トにおける生存の改善を示しているが、これらの効果は安全性および効能の問題も伴った
。
ＡＭＬ細胞を標的にすることが目的とされた他の試みは、ＡＭＬにおいて選択的にＣＤ
３３を標的にするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞の作製を含んでいる。Ｂ
ｕｃｋｌｅｙら，Ｃｕｒｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｍａｌｉｇ．Ｒｅｐ．（２）：６５（２０
１５）。しかし、データは限定的であり、患者を治療することにおいてこの方法がどれほ
ど効果的か（すべての標的化細胞が除去されるかどうか）不確かである。さらに、骨髄系
統細胞は生命に必須であるため、被験体から骨髄系統細胞を枯渇させることは、患者の生
存に有害な効果を有し得る。本開示は、少なくとも部分的に、ＡＭＬ治療と関連するこの
ような問題を解決することを目的とする。
これに代えて、または追加で、本明細書で説明される方法は、限定されないが、肺癌、
耳、鼻、および咽頭癌、結腸癌、メラノーマ、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、
基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸直腸癌、結合組織癌
、消化器系癌、子宮内膜癌、食道癌、眼の癌、頭頸部癌、胃癌、上皮内新生物、腎臓癌、
咽頭癌、肝臓癌、線維腫、神経芽細胞腫、口腔癌（例えば、唇、舌、口、および咽頭）、
卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、腎臓癌、呼吸器系の癌
、肉腫、皮膚癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、泌尿器系の癌、ならびに他の癌腫お
よび肉腫を含む、非造血性癌を治療するために使用され得る。
癌腫は上皮起源の癌である。本開示の方法による治療が意図される癌腫は、限定されな
いが、腺房癌腫、小葉癌腫、濾胞状腺癌腫（腺嚢胞癌腫、腺筋上皮腫、篩状癌腫および円
柱腫とも呼ばれる）、腺腫性癌腫、腺癌腫、副腎皮質癌腫、肺胞癌腫、肺胞細胞癌腫（気
管支肺癌腫、肺胞細胞腫瘍および肺腺腫症とも呼ばれる）、基底細胞癌腫（ｂａｓａｌ
ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、基底細胞癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｂａｓｏｃｅｌ
ｌｕｌａｒｅ）（バサローマ、またはバシローマ、および毛母癌腫とも呼ばれる）、類基
底細胞癌腫、基底有棘細胞癌腫、乳癌腫、細気管支肺胞癌腫、細気管支癌腫、気管支原性
癌腫、大脳様癌腫、胆管細胞癌腫（胆管癌腫および胆管性癌腫とも呼ばれる）、絨毛癌腫
、膠質癌腫、面皰癌腫、小体癌腫、篩状癌腫、鎧状癌腫、皮膚癌腫、円柱癌腫、円柱細胞
癌腫、腺管癌腫、緻密癌腫、胎児性癌腫、脳様癌腫、眼球上癌腫、類表皮癌腫、上皮アデ
ノイド癌腫、外向性癌腫、潰瘍癌腫、ゼラチン状癌腫、膠様癌腫、巨細胞癌腫、巨大細胞
癌腫、腺性癌腫、顆粒膜細胞癌腫、毛母癌腫、血液様癌腫、肝細胞癌腫（肝臓癌腫、悪性
肝臓癌腫および肝癌腫とも呼ばれる）、ヒュルトレ細胞癌腫、硝子様癌腫、副腎様癌腫、
乳児胎児性癌腫、上皮内癌腫、表皮内癌腫、上皮内癌腫、クルムペッヘル癌腫、クルチツ
キー細胞癌腫、レンズ状癌腫（ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、レンズ状
癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒｅ）、脂肪腺癌腫、リンパ上皮癌腫、
乳腺炎性癌腫、髄様癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｅｄｕｌｌａｒｅ）、髄様癌腫（ｍｅ
ｄｕｌｌａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｅｌａｎｏ
ｄｅｓ）、黒色癌腫（ｍｅｌａｎｏｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液性癌腫、粘液分
泌性癌腫、粘細胞性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、粘表皮
癌腫、粘液癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｏｓｕｍ）、粘液癌腫（ｍｕｃｏｕｓ ｃ
ａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液腫様癌腫、鼻咽頭癌腫、燕麦細胞癌腫、骨化性癌腫、類骨癌腫
、卵巣癌腫、乳頭癌腫、門脈周囲癌腫、前浸潤癌腫、前立腺癌腫、腎臓の腎細胞癌腫（腎
臓腺癌腫およびハイパーネホロイドとも呼ばれる）、保存細胞癌腫、肉腫様癌腫、シュナ
イダー癌腫、硬性癌腫、陰嚢癌腫、印環細胞癌腫、単純癌腫、小細胞癌腫、ソラノイド癌
腫、球状細胞精巣癌腫、紡錘細胞癌腫、海綿様癌腫、扁平上皮癌腫（ｓｑｕａｍｏｕｓ
ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、扁平上皮癌腫（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍ
ａ）、紐癌腫、毛細管拡張性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｔｉｃ
ｕｍ）、毛細管拡張性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔｏｄｅｓ）、移
行上皮癌腫、結節性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、結節性癌腫（ｔ
ｕｂｅｒｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、疣状癌腫、絨毛癌腫を含む。好ましい実施形態
では、本開示の方法は、乳房、子宮頸部、卵巣、前立腺、肺、結腸または直腸、膵臓、胃
あるいは腎臓の癌を有する被験体を治療するために使用される。
肉腫は骨および軟組織に生じる間葉性新生物である。異なる型の肉腫が認められており
、これらは脂肪肉腫（粘液様脂肪肉腫および多形性脂肪肉腫など）、平滑筋肉腫、横紋筋
肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍（悪性神経鞘腫、神経線維肉腫、または神経原性肉腫とも呼ば
れる）、ユーイング腫瘍（骨のユーイング肉腫、骨外（すなわち、非骨）ユーイング肉腫
、および原始神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）を含む）、滑膜肉腫、管肉腫、血管肉腫、リ
ンパ管肉腫、カポジ肉腫、血管内皮腫、線維肉腫、類腱腫（侵襲性線維腫症とも呼ばれる
）、隆起性皮膚線維肉腫（ＤＦＳＰ）、悪性線維性組織球腫（ＭＦＨ）、血管外皮細胞腫
、悪性間葉腫、胞状軟部肉腫、類上皮肉腫、明細胞肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、消
化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）（ＧＩ間質肉腫としても知られている）、骨肉腫（骨原性肉腫
としても知られている）－骨格および骨外、ならびに軟骨肉腫を含む。
いくつかの実施形態では、治療される癌は難治性癌であってよい。「難治性癌」は、本
明細書で使用されるとき、処方される標準治療に対して耐性である癌である。これらの癌
は、最初は治療に応答性であるように見え（そして再発する）、または治療に完全に非応
答性であり得る。一般的な標準治療は、癌のタイプ、および被験体における進行度合いに
応じて変わる。それは化学療法、または手術、または放射線照射、あるいはこれらの併用
であり得る。従来技術の当業者は、このような標準治療を承知している。難治性癌が本開
示に従って治療される被験体は、従って、これらの癌について別の治療を既に受けている
可能性がある。あるいは、癌が難治性である可能性がある場合（例えば、癌細胞の分析ま
たは被験体の病歴から考慮して）、被験体は別の治療を以前に受けていない可能性がある
。難治性癌の例は、限定されないが、白血病、メラノーマ、腎細胞癌腫、結腸癌、肝臓癌
（肝癌）、膵臓癌、非ホジキンリンパ腫および肺癌を含む。
本明細書で説明されるキメラ受容体を発現する免疫細胞のいずれかは、医薬組成物とし
て、医薬品として許容可能な担体または賦形剤中で投与され得る。
本開示の組成物および／または細胞と関連して使用されるフレーズ「医薬品として許容
可能な」は、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与される場合、生理学的に耐容性であり、不
都合な反応を一般的に生じないような組成物の分子実体または他の原料を指す。好ましく
は、本明細書で使用されるとき、用語「医薬品として許容可能な」は、哺乳動物、より好
ましくはヒトで使用するために、連邦または州政府の規制当局によって承認されている、
あるいは米国薬局方または他の一般的に認められている薬局方にリスト化されていること
を意味する。「許容可能な」は、担体が組成物の有効成分（例えば、核酸、ベクター、細
胞、または治療用抗体）と適合性であり、組成物が投与される被検体に負の影響を及ぼさ
ないことを意味する。本方法で使用される医薬組成物および／または細胞のいずれも、医
薬品として許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤を、凍結乾燥製剤または水性溶液の
剤形で含み得る。
緩衝剤を含む、医薬品として許容可能な担体は従来技術で良く知られており、リン酸、
クエン酸、および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤
；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタン
パク質；アミノ酸；疎水性ポリマー；モノサッカライド；ジサッカライド；他の炭水化物
；金属錯体；および／または非イオン性界面活性剤を含み得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔ
ｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（
薬学の科学および実践）２０ｔｈ Ｅｄ．（２０００）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌ
ｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｅｄ．Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒを参照する。
治療使用のためのキット
細胞表面系統特異的抗原を欠く造血細胞集団と組み合わせた細胞表面系統特異的抗原を
標的にする作用物質の使用のためのキットも本開示の範囲内である。このようなキットは
、細胞表面系統特異的抗原を結合する抗原結合フラグメントを含む任意の作用物質（例え
ば、本明細書で説明されるキメラ受容体を発現する免疫細胞）および医薬品として許容可
能な担体を含む第一医薬組成物と、細胞表面系統特異的抗原を欠く造血細胞（例えば、造
血幹細胞）集団および医薬品として許容可能な担体を含む第二医薬組成物とを含む、１つ
以上の容器を含み得る。
いくつかの実施形態では、キットは本明細書で説明される方法のいずれかでの使用のた
めの取扱説明書を含んでよい。含まれる取扱説明書は、被験体における意図された活性を
達成するための被験体への第一および第二医薬組成物の投与の説明を含み得る。キットは
、被験体が本治療を必要とするかどうか特定することに基づき、治療に適した被験体の選
択についての説明をさらに含む。いくつかの実施形態では、取扱説明書は本治療を必要と
する被検体に第一および第二医薬組成物を投与することの説明を含む。
本明細書で説明される細胞表面系統特異的抗原を標的にする作用物質ならびに第一およ
び第二医薬組成物の使用に関する取扱説明書は、意図された治療のための投与量、投与計
画、および投与経路についての情報を一般的に含む。容器は単位用量、大量包装（例えば
、複数回用量包装）または下位単位用量であり得る。本開示のキットに添付される取扱説
明書は、一般的にはラベルまたは包装インサートに記載された説明である。ラベルまたは
包装インサートは、医薬組成物が被験体における疾患または障害を治療する、発症を遅延
する、および／または緩和するために使用されることを示す。
本明細書で提供されるキットは、適切なパッケージング中にある。適切なパッケージン
グは、限定されないが、バイアル、ボトル、ジャー、フレキシブルパッケージングなどを
含む。吸入器、鼻腔投与デバイス、または注入容器などの特定のデバイスと併せて使用す
るための包装もまた考えられる。キットは無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器
は皮下注射針によって穿刺可能な栓を有する静脈用溶液バッグまたはバイアルであり得る
）。容器も無菌アクセスポートを有し得る。医薬組成物における少なくとも１種類の有効
成分は、本明細書で説明されるキメラ受容体変異体である。
キットは任意に緩衝剤などの追加成分および判断情報を提供し得る。通常、キットは容
器上にまたは容器と関連してラベルまたは包装インサートを含む。いくつかの実施形態で
は、本開示は上記キットの内容物を含む製品を提供する。
一般的技術
本開示の実施は、他に指示がない限り、従来技術の範囲内である分子生物学（組換え技
術を含む）、微生物学、細胞生物学、生物化学、および免疫学の標準的技術を使用する。
このような技術は文献で十分に説明されており、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング：実験室マニュアル），ｓ
ｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（
オリゴペプチド合成）（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における方法），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ
ｅｓｓ、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（細
胞生物学：実験室ノートブック）（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（動物細胞培養）（Ｒ
．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）、Ｉｎｔｒｏｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ
ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（細胞および組織培養入門）（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔ
ｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅ
ｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕ
ｒｅｓ（細胞および組織培養：実験室手順）（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔ
ｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ
Ｓｏｎｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（酵素学における方法）（Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅ
ｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（実験免疫学ハンドブック）（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎ
ｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔ
ｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（哺乳動物細胞のための遺伝子導入ベ
クター）（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）
、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（
分子生物学における最新プロトコル）（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，ｅｄｓ．１９８７）
、ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ：ポ
リメラーゼ連鎖反応），（Ｍｕｌｌｉｓら，ｅｄｓ．１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（免疫学における最新プロトコル）（Ｊ．
Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における簡単プロトコル）（Ｗｉｌ
ｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（免疫学）（Ｃ．Ａ
．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（
抗体）（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ
ａｐｐｒｏａｃｈ（抗体：実践的方法）（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓ
ｓ，１９８８－１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａ
ｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（モノクローナル抗体：実践的方法）（Ｐ．Ｓｈｅｐｈ
ｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒ
ｅｓｓ，２０００）、Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｍａｎｕａｌ（抗体の利用：実験室マニュアル）（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａ
ｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１
９９９）、Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（抗体）（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．
Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，
１９９５）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ
ＮＡクローニング：実践的方法），Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏ
ｖｅｒ ｅｄ．１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（
核酸ハイブリダイゼーション）（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅ
ｄｓ．（１９８５）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（
転写および翻訳）（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９
８４））、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（動物細胞培養）（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅ
ｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６））、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅ
ｎｚｙｍｅｓ（固定化細胞および酵素）（IＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６））、および
Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ（分子クローニングへの実践ガイド）（１９８４）Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅ
ｌら（ｅｄｓ．）が挙げられる。
さらに詳細がなくとも、従来技術の当業者は、前述に基づき、本開示をその最大限の範
囲まで利用できると考えられる。従って、後述の具体的な実施形態は、単に説明として構
成され、いかなるものであれ、本開示の他の部分を制限するものではない。本明細書に引
用されるすべての刊行物は、本明細書において参照される目的または主題のために参考に
よって組み込まれる。
例１：ヒト白血病細胞株におけるＣＤ３３のインビトロ除去
インビトロでＣＤ３３を標的とするＣＲＳＰＲ－Ｃａｓ９系の能力を試験するため、ヒ
ト白血病細胞Ｋ－５６２をＮｅｏｎ（登録商標）（Ｔｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ）を用いて、Ｃａｓ９－ＧＦＰ（ＰＸ４５８、Ｓ．ピオゲネス）およびＧＮ
Ｎ ＰＡＭ配列を含むガイドＲＮＡで共トランスフェクションし（図４）、ここでガイド
ＲＮＡはｈＣＤ３３ゲノム配列を標的にするように設計された。トランスフェクションの
４８時間後に、Ｃａｓ９を発現する細胞をＧＦＰのＦＡＣＳ分類を用いて特定し分離した
。細胞を次いで９６時間インキュベーションし、フローサイトメトリーによってＣＤ３３
発現を試験した（図５）。抗ＣＤ３３抗体を用いたフローサイトメトリープロットは、Ｃ
ａｓ９ベクターおよびガイドＲＮＡの送達前（上グラフ）および後（下グラフ）のＫ－５
６２細胞によるＣＤ３３発現を示す。図５に示すように、トランスフェクション後、細胞
の９８％がＣＤ３３発現を欠いた。
この例は、ヒト白血病細胞におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を用いるＣＤ３３の効率
的な除去を実証する。
例２：ヒト白血病細胞株におけるＣＤ４５のインビトロ除去
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を使用してインビトロでＣＤ４５ＲＡを標的にした。簡単に
説明すると、ＴＩＢ－６７細網肉腫マウスマクロファージ様細胞をＮｅｏｎ（登録商標）
試薬（Ｔｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、Ｃａｓ９－ＧＦＰ
（ＰＸ４５８、Ｓ．ピオゲネス）およびｈＣＤ４５ＲＡゲノム配列を標的にするＣＲＩＳ
ＰＲｓｇＲＮＡ（「ＮＧＧ」ＰＡＭ配列を含む）で共トランスフェクションした。トラン
スフェクションの４８時間後に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を発現する細胞をＧＦＰのＦ
ＡＣＳ分類を用いて特定して分離した。細胞を次いで９６時間インキュベーションし、Ｃ
Ｄ４５ＲＡ発現を試験した（図６）。抗ＣＤ４５ＲＡ抗体を用いたフローサイトメトリー
プロットは、Ｃａｓ９ベクターおよびガイドＲＮＡの送達前（上グラフ）および後（下グ
ラフ）のＣＤ４５ＲＡ発現を示す。
白血病細胞においてＣＤ３３発現がうまく低下された例１と同様に、本例の結果はＣＲ
ＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を用いるＣＤ４５ＲＡの効率的な標的化を示す。
例３：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）における細胞表面系統特異的ＣＤ３３の標的化
本例はＡＭＬにおけるＣＤ３３抗原の標的化を包含する。本例の具体的なステップを表
６に概説する。
Figure 2022058776000011
Ｉ．ＣＤ３３標的化キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法
Ａ．抗ＣＤ３３ ＣＡＲ構築体の作製
本明細書で説明されるＣＤ３３を標的にするキメラ抗原受容体は、５’から３’への順
で、ｐＨＩＶ－Ｚｓｇｒｅｅｎレンチウイルス骨格（ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／
１８１２１／）、ペプチドシグナル、ＣＤ３３ｓｃＦｖ、ヒンジ、ＣＤ２８分子の膜貫通
領域、ＣＤ２８の細胞内領域、およびＴＣＲ－ζ分子のシグナル伝達領域を含む。
最初に、ペプチドシグナル、抗ＣＤ３３軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、フレキシブ
ルリンカーおよび抗ＣＤ３３重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）をｐＨＩＶ－Ｚｓｇｒｅｅ
ｎのＥｃｏＲＩ部位に、任意にコザック配列とともにクローニングする。
軽鎖－リンカー－重鎖－ヒンジ－ＣＤ２８／ＩＣＯＳ－ＣＤ３ζの基本的構造を有する
、ＣＤ３３を結合する例示的なキメラ受容体の核酸構造を下記に示す。
パート１：軽鎖－リンカー重鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）：コザック開始部位を太
字で示す。ペプチドシグナルＬ１をイタリック体で示す。抗ＣＤ３３軽鎖および重鎖を太
字のイタリック体で示し、リンカーによって分けられる。
Figure 2022058776000012
パート２：ヒンジ－ＣＤ２８／ＩＣＯＳ－ＣＤ３ζ ＮｏｔＩ制限酵素認識部位を大文
字で示す。翻訳停止部位を太字で示す。ＢａｍＨＩ制限切断部位を下線で示す。
Figure 2022058776000013
Figure 2022058776000014
Figure 2022058776000015
次のステップでは、ヒンジ領域、ＣＤ２８領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、およびＴ
ＣＲ－ζの細胞質構成要素をｐＨＩＶ－Ｚｓｇｒｅｅｎ（既にペプチドシグナルおよびＣ
Ｄ３３ｓｃＦｖを含む）のＮｏｔＩおよびＢｍＨＩ部位にクローニングする。あるいは、
ＣＤ２８領域はＩＣＯＳ領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）で置換できる。
ＣＤ２８およびＩＣＯＳ領域に加えて、ＣＤ２８およびＩＣＯＳ細胞内シグナル伝達領
域のフラグメントを含む融合領域を工学処理して（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、追加のキ
メラ受容体を作製するために使用する。このような構成では、キメラ受容体は抗原結合フ
ラグメント、抗ＣＤ３３軽鎖可変領域、リンカー、抗ＣＤ３３重鎖可変領域、ＣＤ２８／
ＩＣＯＳハイブリッド領域（ＣＤ２８の膜貫通領域を含む）、およびＴＣＲ－ζ分子のシ
グナル伝達領域を含む。
キメラ受容体を作製するために使用され得る構成要素の例示的なアミノ酸配列が本明細
書で提供され、ＣＤ２８領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）、ＩＣＯＳ領域（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：７）、ＣＤ２８／ＩＣＯＳハイブリッド領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、およ
びＴＣＲ－ζなどが本明細書で示される。あるいは、キメラ受容体が同様に作製され得る
（セクションＢ）。
Ｂ．抗ＣＤ３３ ＣＡＲ構築体の作製のための代替法
例示的なキメラ受容体の概略を図７、パネルＡ～Ｄに示す。キメラ受容体は、細胞外Ｃ
Ｄ８ヒンジ領域、膜貫通および細胞質シグナル伝達領域、ならびにＣＤ３ζシグナル鎖に
連結された、ＣＤ３３抗原を認識する細胞外ヒト化ｓｃＦｖを用いて作製される（図７、
パネルＢ）。抗ＣＤ３３キメラ受容体をコードするＤＮＡは、ヒト化ｓｃＦｖを用いるこ
とによって作製される（Ｅｓｓａｎｄら，Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．（２０１３）２７
３（２）：１６６）。代替物は、ＣＤ２８またはＣＤ２８／ＯＸ１またはＣＤ２８／４－
１－Ｂ－Ｂハイブリッドの代わりにＯＸ－１または４１－ＢＢを含むＣＡＲ Ｔ細胞を含
む（図７、パネルＣおよびＤ）。
抗ＣＤ３３ｓｃＦｖ配列を作製するために、前述の抗ＣＤ３３抗体の可変領域の重鎖お
よび軽鎖のコード領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２）を、特異的プライマーによっ
て増幅し、細胞での発現用にｐＨＩＶ－Ｚｓｇｒｅｅｎベクター中にクローニングする。
標的抗原に対するｓｃＦｖ（単鎖可変フラグメント）の結合強度を評価するため、ｓｃＦ
ｖをＨｅｋ２９３Ｔ細胞で発現させる。この目的のため、ベクター（コード領域を含むｐ
ＨＩＶ－Ｚｓｇｒｅｅｎ）で大腸菌Ｔｏｐ１０Ｆを形質転換しプラスミドを調製する。ｓ
ｃＦｖ抗体をコードする得られた発現ベクターをＨｅｋ２９３Ｔ細胞中にトランスフェク
ションによって導入する。トランスフェクションした細胞を５日間培養した後、上清を取
り出して、抗体を精製する。
得られる抗体は、従来技術で知られているプロトコルによるフレームワーク置換を用い
てヒト化できる。例えば、ＢｉｏＡｔｌａ（サンディエゴ）によって提供されるプロトコ
ルを参照し、ここでは鋳型抗体に由来する合成ＣＤＲをコードするフラグメントライブラ
リーを、機能的に発現された抗体由来の生殖系列配列に限定されたヒトフレームワークの
プールからのヒトフレームワーク領域をコードするフラグメントに連結する（ｂｉｏａｔ
ｌａ．ｃｏｍ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｅｘｐｒｅｓｓ－ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ
／）。
抗原結合親和性を改善するために親和性成熟を実施し得る。これはファージ提示法など
の、従来技術で知られている一般的な技術を用いて実施できる（Ｓｃｈｉｅｒ Ｒ．，
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ（１９９６），２６３：５５１）。変異体はそれらの生物学的活性
（例えば、結合親和性）について、例えばＢｉａｃｏｒｅ分析を用いてスクリーニングさ
れてよい。改変の優れた候補であり得る超可変領域残基を特定するために、アラニンスキ
ャン変異を実施して、抗原結合に著しく関与する超可変領域残基を特定できる。さらに、
抗体の親和性を改善するために、上記の組み合わせライブラリーを使用できる（Ｒａｊｐ
ａｌら，ＰＮＡＳ（２００５）１０２（２４）：８４６６）。あるいは、ＢｉｏＡｔｌａ
が抗体の迅速で効率的な親和性変異のためのプラットフォームを開発しており、これを抗
体の最適化の目的のために使用してもよい（ｂｉｏａｔｌａ．ｃｏｍ／ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ／ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ－ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ／）。
Ｃ．ＣＡＲ構築体の組み立て
次に、抗ＣＤ３３ｓｃＦｖを細胞外ＣＤ８ヒンジ領域、膜貫通および細胞質ＣＤ２８シ
グナル伝達領域、ならびにＣＤ３ζシグナル伝達鎖に連結する。簡単に説明すると、抗Ｃ
Ｄ３３ｓｃＦｖ配列に特異的なプライマーを使用して前述のようにｓｃＦｖを増幅する。
完全なヒトＣＤ８コード配列を有するプラスミド（ｐＵＮ１－ＣＤ８）（ｗｗｗ．ｉｎｖ
ｉｖｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｐｕｎｏ－ｃｄ８ａ）を使用して、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通領
域（アミノ酸１３５～２０５位）を増幅する。ＣＤ３ζフラグメントを、完全なヒトＣＤ
３ζコード配列を有するＩｎｖｉｖｏｇｅｎプラスミドｐＯＲＦ９－ｈＣＤ２４７ａ（ｈ
ｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ＰＤＦ／ｐＯＲＦ９－ｈＣＤ２４７
ａ＿１０Ｅ２６ｖ０６．ｐｄｆ）から増幅する。最後に、ＣＤ２８（アミノ酸１５３～２
２０位、ＣＤ２８の膜貫通およびシグナル伝達領域に相当する）を、活性化Ｔ細胞からト
リゾール法によって収集したＲＮＡを用いて作製されたｃＤＮＡから増幅する。抗ＣＤ３
３－ｓｃＦｖ－ＣＤ８－ヒンジ＋膜貫通－ＣＤ２８－ＣＤ３ζを含むフラグメントを、ス
プライス重複伸長（ＳＯＥ）ＰＣＲを用いて組み立てる。得られるＰＣＲフラグメントを
次いでｐＥＬＰＳレンチウイルスベクター中にクローニングする。ｐＥＬＰＳは第三世代
レンチウイルスベクターｐＲＲＬ－ＳＩＮ－ＣＭＶ－ｅＧＦＰ－ＷＰＲＥの派生物であり
、ここでＣＭＶプロモーターがＥＦ－１αプロモーターで交換され、ＨＩＶの中央ポリプ
リントラクトがプロモーターの５’に挿入された（Ｍｉｌｏｎｅら，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．
（２００９）（８）：１４５３，Ｐｏｒｔｅｒら，ＮＥＪＭ（２０１１）（８）：７２５
）。すべての構築体はシークエンシングによって検証される。
あるいは、ＣＤ２８領域の代わりにＩＣＯＳ、ＣＤ２７、４１ＢＢ、またはＯＸ－４０
シグナル伝達領域を含むＣＡＲを作製し、Ｔ細胞中に導入してＣＤ３３陽性細胞を根絶す
る能力について試験する（図７、パネルＣ）。「第三世代」キメラ受容体の作製も考えら
れ（図７、パネルＤ）、これはＣＤ３ｚ－ＣＤ２８－４１ＢＢまたはＣＤ３ｚ－ＣＤ２８
－ＯＸ４０などの複数のシグナル伝達領域を組み合わせて、さらに能力を高める（Ｓａｄ
ｅｌａｉｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．（２０１３）４：３８８）。
Ｄ．抗ＣＤ３３ＣＡＲ Ｔ細胞調製
一次ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を、免疫磁性分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によっ
て患者の末梢血液から分離する。Ｔ細胞を完全培地（１０％熱不活性化ＦＢＳ、１００Ｕ
／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン硫酸塩、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ
を補充したＲＰＭＩ１６４０）中で培養し、既に報告されているように（Ｌｅｖｉｎｅら
，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）１５９（１２）：５９２１）抗ＣＤ３および抗ＣＤ
２８ｍＡｂでコートされたビーズ（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）によって刺激する。
パッケージング細胞株を使用してウイルスベクターを作製し、それは標的細胞に形質導
入でき抗ＣＤ３３キメラ受容体を含む。レンチウイルス粒子を作製するために、本例のセ
クション（１）で作製されたＣＡＲを、不死化正常胎児腎２９３Ｔパッケージング細胞中
に一緒にトランスフェクションする。細胞を１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、
および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含む高グルコースＤＭＥＭで培養する。ト
ランスフェクションの４８～７２時間後に、上清を収集し、組換えレンチウイルスをＦＢ
Ｓ無添加ＤＭＥＭ中で濃縮する。一次ＣＤ８＋Ｔ細胞を次いでポリブレンの存在下で、約
５～１０の感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入する。ヒト組換えＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓ
ｔｅｍｓ）を１日おきに加える（５０ＩＵ／ｍＬ）。Ｔ細胞を、刺激後約１４日間培養す
る。ヒト一次Ｔ細胞の形質導入効率を、ＺｓＧｒｅｅｎレポーター遺伝子（Ｃｌｏｎｔｅ
ｃｃｈ，マウンテンビュー、カリフォルニア州）の発現によって評価する。
Ｅ．患者へのＣＡＲ Ｔ細胞の注入
患者への抗ＣＤ３３ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボ注入前に、細胞をリン酸緩衝化生理食塩
水で洗浄し濃縮した。閉じた無菌系を備えるＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ ＣｅｌｌＳａｖｅ
ｒ（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ブレインツリー，マサチューセ
ッツ州）などのセルプロセッサーを、製剤化前に洗浄および濃縮ステップのために使用す
る。抗ＣＤ３３キメラ受容体を発現する最終Ｔ細胞を、ヒト血清アルブミンを補充した無
菌生理食塩水１００ｍＬに製剤化する。最後に、患者は１～３日間かけてＴ細胞を１～１
０×１０７個／ｋｇで注入される（Ｍａｕｄｅら，ＮＥＪＭ（２０１４）３７１（１６）
：１５０７）。注入される抗ＣＤ３３キメラ受容体を発現するＴ細胞の数は、癌患者の状
態、患者の年齢、前治療などの多くの要因に依存する。
さらに、本明細書では、ＡＭＬ患者においてＣＤ３３を標的にするキメラ受容体に加え
て、ＣＤ４５ＲＡを標的にするキメラ受容体を発現する免疫細胞も考えられる。これは２
つの異なる方法：１）抗ＣＤ３３キメラ受容体を発現する免疫細胞および抗ＣＤ４７ＲＡ
キメラ受容体を発現する免疫細胞を別々に作製すること、および患者に両タイプの免疫細
胞を別々に注入すること、または２）ＣＤ３３およびＣＤ４５ＲＡの両方を同時に標的に
する免疫細胞を作製すること、によって達成できる（Ｋａｋａｒｌａら，Ｃａｎｃｅｒ（
２）：１５１（２０１４））。
ＩＩ．ＣＤ３４＋ＣＤ３３－細胞を用いる自家造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）
患者からの幹細胞分離、前処置レジメン、ならびに幹細胞の患者への注入に関するプロ
トコルは、患者の年齢、症状、治療歴、および治療が実施される施設に大きく依存して変
動することが理解される。そのため、後述のプロトコルは単なる例であり、従来技術の当
業者によって定期的な最適化がなされる。
Ａ．抗ＣＤ３３ＣＡＲ Ｔ細胞の養子移入に続く末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）動員を用い
る造血幹細胞の分離
ＡＭＬ患者を、顆粒球コロニー形成因子（Ｇ－ＣＳＦ）の１日あたり１０ｍｇ／ｋｇの
静脈投与によって刺激する。ＣＤ３４＋細胞陽性選択を、免疫磁性ビーズおよび免疫磁性
豊富化デバイスを用いて実施する。ＣＤ３４＋細胞の２×１０６個／ｋｇ体重の最小量が
、Ｆｅｎｗａｌｌ ＣＳ ３０００＋細胞セパレーターを用いて収集されることが予期さ
れる（Ｐａｒｋら，Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（２００
３）３２：８８９）。
Ｂ．患者の前処置レジメン
自家末梢血幹細胞移植（ＰＢＳＣＴ）のための前処置レジメンを、エトポシド（ＶＰ－
１６）＋シクロホスファミド（ＣＹ）＋全身放射線照射（ＴＢＩ）を用いて実施する。簡
単に説明すると、処方計画は、単回投与として２６時間にわたる１．８ｇ／ｍ２静脈内一
定注入（ｃ．ｉ．ｖ）でのエトポシド（ＶＰ－１６）、続いて３日間の２時間にわたる一
日あたり静脈内６０ｍｇ／ｋｇ体重でのシクロホスファミド（ＣＹ）、続いて次の３日間
の一日あたり３００ｃＧｙでの全身放射線照射（ＴＢＩ）からなる。
用量を計算するため、理想体重または実際の体重のいずれか小さい方を使用する。前述
されたように、癌患者の状態、患者の年齢、前治療、ならびに処置が実施される施設のタ
イプなどの要因は、正確な前処置レジメンを決定するときにすべて考慮される。
Ｃ．ＣＤ３３を標的にするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系のプラスミド構築
インサートＣａｓ９およびプロマイシン耐性を含むレンチＣＲＩＳＰＲｖ２をＡｄｄｇ
ｅｎｅ（プラスミド＃５２９６１）から得る（Ｓａｎｊａｎａら，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ（２０１４）（８）：７８３）。単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）ＣＤ３３ガイド配列
をクローニングするため、レンチＣＲＩＳＰＲｖ２をＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ ＢｓｍＢＩ
およびＦａｓｔＡＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）によって３７℃、２時間で切断し脱リン酸化
する。ＣＤ３３を標的にするｇＲＮＡをｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕのオンライン最適
化設計ツールを用いて設計する。あるいは、ｇＲＮＡは図１２に示す配列を有する（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１１）。ＣＤ３３ ｇＲＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔ
ｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から得られ、ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて３７℃で３０分間リン酸化し、９５℃で５分間の加
熱および１．５℃／分で２５℃までの冷却によってアニーリングする。Ｔ７リガーゼを使
用してオリゴヌクレオチドをアニーリングし、その後アニーリングしたオリゴヌクレオチ
ドをゲル精製したベクター（Ｑｉａｇｅｎ）中に２５℃で５分間ライゲートする。得られ
るプラスミドを次いでエンドトキシンフリーｍｉｄｉ－ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）
を用いて増幅できる（Ｓａｎｊａｎａら，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ （２０１４）（８）
：７８３）。
あるいは、２つのベクター系を既に報告されているプロトコル（Ｍａｎｄａｌら，Ｃｅ
ｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ（２０１４）１５（５）：６４３）に従って使用し得る（ｇＲ
ＮＡおよびＣａｓが別々のベクターから発現される場合）。ここで、Ｍａｎｄａｌらは非
ウイルスベクターから発現されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を用いてヒト造血幹細胞中の遺
伝子の効率的な除去を達成した。
簡単に説明すると、Ｃ端ＳＶ４０核局在化シグナルを含むヒトコドン最適化Ｃａｓ９遺
伝子を、２Ａ－ＧＦＰを有するＣＡＧ発現プラスミドにクローニングする。対象のＣＤ３
３配列を切断するようにＣａｓ９を指示するため、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１１））はヒトＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含むプラスミドから別
々に発現される。ｇＲＮＡ配列オリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から得られ、アニーリングして、ＢｂｓＩ制限部位
を用いてプラスミド中に導入する。ヒトＵ６プロモーターでの「Ｇ」塩基の転写開始の必
要条件、ならびにＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）の必要条件のため、ゲノム標
的はＧＮ２０ＧＧヌクレオチド配列を含む。
患者にＣＤ３３枯渇造血幹細胞ＨＳＣを注入することに加えて、患者が続いてＣＤ４５
ＲＡ枯渇ＨＳＣを注入されるプロトコルが進められる。あるいは、本発明者らはＣＲＩＳ
ＰＲ－Ｃａｓ９系を用いてＣＤ３４＋ＣＤ３３－ＣＤ４５ＲＡ－細胞を作製して、ＣＤ３
３およびＣＤ４５ＲＡ遺伝子の両方を同時に低減する。ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ３３のた
めの例示的なガイドＲＮＡ配列を表４および５に示す。
Ｄ．ＣＤ３４＋ＣＤ３３－細胞を作製するためのＣＤ３４＋細胞ＨＳＣのトランスフェ
クション
新たに分離した末梢血由来ＣＤ３４＋細胞（ステップ４より）を、細胞培養グレードの
Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）３００ｎｇ／ｍＬ、ＦＬＴ３－Ｌ ３００
ｎｇ／ｍＬ、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）１００ｎｇ／ｍＬ、およびＩＬ－３６０ｎｇ
／ｍＬの存在下で、血清フリーＣｅｌｌＧｒｏ ＳＣＧＭ培地中で細胞１×１０６個／ｍ
Ｌで接種する。前刺激の２４時間後、ＣＤ３４＋ＨＳＣをＣａｓ９およびＣＤ３３ ｇＲ
ＮＡを含むレンチＣＲＩＳＰＲｖ２で、Ａｍａｘａ Ｈｕｍａｎ ＣＤ３４ ｃｅｌｌ
Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ｋｉｔ（Ｕ－００８）（＃ＶＰＡ－１００３）を用いてトラ
ンスフェクションする（Ｍａｎｄａｌら，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ（２０１４）１
５（５）：６４３）。トランスフェクションの２４～４８時間後に、ＣＤ３４＋ＣＤ３３
－細胞を１．２μｇ／ｍＬプロマイシンによって選択する。プロマイシン選択後に、ＣＤ
３４＋ＣＤ３３－細胞をプロマイシンフリー培地中で２、３日間維持する。
Ｅ．患者へのＣＤ３４＋ＣＤ３３－細胞の再注入
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ＣＤ３３で体外でトランスフェクションされたＣＤ３４＋細
胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３３－細胞）を直ちに、標準的な血液投与セットをフィルターなしで
用いて、ヒックマンカテーテルを通して再注入する（Ｈａｃｅｉｎ－Ｂｅｙ Ａｂｉｎａ
ら，ＪＡＭＡ（２０１５）３１３（１５）：１５５０）。
一般的に、上記概要の治療プロトコルを受けた患者は、循環性芽球および血球減少の再
出現についてモニタリングされる。さらに、特定患者におけるＡＭＬの潜在的なメカニズ
ムに応じて、治療の達成は、情報をもたらす分子または細胞遺伝学的マーカーの再出現、
あるいは情報をもたらすフローサイトメトリーパターンを試験することによってモニタリ
ングされる。例えば、フィラデルフィア染色体陽性ＡＭＬにおけるＢＣＲ－ＡＢＬシグナ
ルの再出現は、ＢＣＲ（染色体２２上）およびＡＢＬ（染色体９上）に対するプローブに
よる蛍光インシツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて検出される。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系を介したＣＤ３３除去の達成を評価するため、末梢血ＣＤ３
４＋細胞を患者から分離して（移植後）、ＣＤ３３発現を、例えば、フローサイトメトリ
ー、ウェスタンブロッティング、または免疫組織化学を用いて評価する。
本明細書で説明されるように、本例で報告されるＨＳＣＴは自家または同種異系のいず
れかであってよく、両手段とも適切であり本開示で説明される方法に取り入れることがで
きる。
ＩＩＩ．随意のステップ：毒素に付着されたＣＤ３３抗体による患者の継続治療
Ａ．ＣＤ３３免疫毒素ゲムツズマブオゾガマイシン（ＧＯ）による患者の治療
患者を、２週間隔てた２回投与で２時間静脈注入として９ｍｇ／ｍ２の抗ＣＤ３３抗体
ゲムツズマブオゾガマイシン（ＧＯ）で治療する（Ｌａｒｓｏｎら，Ｃａｎｃｅｒ（２０
０５），１０４（７）：１４４２－５２）。ＧＯは、細胞増殖阻害剤カリケアマイシンと
共役体化されたＣＤ３３に対するヒト化モノクローナル抗体からなる（図８）。
あるいは、抗ＣＤ３３抗体は、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素Ａ（ＰＥ）、またはリシ
ン毒素鎖（ＲＴＡ）などの異なる毒素と共役体され得、作製できる（Ｗａｙｎｅら，Ｂｌ
ｏｏｄ（２０１４）１２３（１６）：２４７０）。同様に、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体を毒素に
コンジュゲートし、治療処方計画に含み得る。
例４：抗ＣＤ３３キメラ受容体を発現するＴ細胞およびＮＫ細胞株はＣＤ３３を発現す
る標的細胞の細胞死を誘発する
ＣＤ３３へのキメラ受容体の結合
ＣＤ３３を結合するキメラ受容体（例えば、ＣＡＲＴ１、ＣＡＲＴ２、ＣＡＲＴ３）を
従来の組換えＤＮＡ技術を用いて作製し、ｐＨＩＶ－Ｚｓｇｒｅｅｎベクター（Ａｄｄｇ
ｅｎｅ，ケンブリッジ，マサチューセッツ州）中に挿入した。キメラ受容体を含むベクタ
ーを使用してレンチウイルス粒子を作製し、これを異なる細胞型、例えばＴ細胞株（例え
ば、２９３Ｔ細胞）およびＮＫ細胞株（例えば、ＮＫ９２細胞）を形質導入するために使
用した。キメラ受容体の発現をウェスタンブロッティング（図９、パネルＡ）およびフロ
ーサイトメトリー（図９、パネルＢ）によって検出した。
キメラ受容体を発現する細胞を蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によって選択
し、ＣＤ３３を結合するこれらの能力を評価した。簡単に説明すると、キメラ受容体を発
現する２９３Ｔ細胞の溶解物を、ＣＤ３３またはＣＤ３３－アロフィコシアニン（ＡＰＣ
）共役体と共インキュベーションした。サンプルをタンパク質電気泳動にかけ、ポンソー
タンパク質染色で染色する（図１０、パネルＡ）か、またはメンブランに移し抗ＣＤ３ζ
一次抗体によって探査した（図１０、パネルＢ）。どちらの場合も、キメラ受容体とそれ
らの標的ＣＤ３３の間で結合する。
キメラ受容体を発現するＫ５６２細胞も、プローブとしてＣＤ３３を用いるフローサイ
トメトリーによってＣＤ３３への結合について評価した（図１０、パネルＣ）。キメラ受
容体（ＣＡＲＴ１、ＣＡＲＴ２、またはＣＡＲＴ３）の発現が陽性である細胞の数および
ＣＤ３３結合が、空ベクターコントロールを含む細胞と比べて増加し、キメラ受容体がＣ
Ｄ３３に結合することを示した。
キメラ受容体を発現する細胞によって誘発される細胞毒性
キメラ受容体を発現するＮＫ－９２細胞を、細胞表面にＣＤ３３を提示する標的細胞（
例えば、Ｋ５６２細胞はＣＤ３３＋であるヒト慢性骨髄性白血病株である）の細胞毒性を
誘発する能力について機能的に特徴付けした。細胞毒性アッセイを実施するため、エフェ
クター細胞（ＮＫ－９２細胞などの免疫細胞）を、キメラ受容体をコードするレンチウイ
ルス粒子で感染させて増殖させた。感染数日後に、キメラ受容体を発現する細胞を、ＦＡ
ＣＳ分析を用いて、キメラ受容体コードベクターによってもコードされる蛍光マーカー（
例えば、ＧＦＰ＋、またはＲｅｄ＋）を選別することによって選択した。キメラ受容体を
発現する選択された細胞を１週間増殖させた。感染１４日後に、標的細胞（標的細胞表面
系統特異的抗原であるＣＤ３３を発現する細胞）をカルボキシフルオレセインスクシンイ
ミジルエステル（ＣＦＳＥ）で染色することおよび標的細胞およびキメラ受容体を発現す
る細胞の両方を計数することを含む細胞毒性アッセイを実施した。異なる比率の標的細胞
とキメラ受容体を発現する細胞を、丸底９６ウェルプレート中で４．５時間共インキュベ
ーションし、その後に７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）を加えて非生存細胞
を染色した。フローサイトメトリーを実施して、生存および非生存の標的細胞集団を数え
た。図１１のパネルＡおよびＢに示すように、キメラ受容体ＣＡＲＴ１、ＣＡＲＴ２、ま
たはＣＡＲＴ３を発現するＮＫ９２細胞は、評価した細胞比率それぞれで、標的Ｋ５６２
細胞の相当量の細胞死を誘発した。
Ｋ５６２細胞の細胞死がＣＤ３３へのキメラ受容体の特異的標的化に依存したことを決
定するため、Ｋ５６２細胞をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いてＣＤ３３を欠くよう遺伝子
工学処理した。簡単に説明すると、ヒトコドン最適化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼおよび
ＣＤ３３のＩｇＣ領域の一部を標的にするｇＲＮＡをＫ５６２細胞で発現させ、ＣＤ３３
欠損Ｋ５６２細胞集団を得た。細胞を増殖させキメラ受容体を発現するＮＫ９２細胞と共
インキュベーションし、細胞毒性アッセイを前述のように実施した。図１２のパネルＡに
示すように、プールしたＣＤ３３欠損Ｋ５６２細胞は、キメラ受容体を発現するＮＫ９２
細胞と共インキュベーションすることによって細胞死のわずかな低下を示した。しかし、
ＣＤ３３欠損Ｋ５６２細胞の単一クローンを分離して増殖させ、細胞毒性アッセイを実施
するために使用した場合、細胞毒性のさらに顕著な低下が認められた（図１２、パネルＢ
）。
一次Ｔ細胞におけるキメラ受容体の発現
一次Ｔ細胞集団を、ドナーから得られたＰＭＢＣからＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはＣＤ
４＋／ＣＤ８＋細胞を陽性によって選択するＦＡＣＳを用いて分離し、高純度集団を得た
（図１３、パネルＡおよびＢ）。一次Ｔ細胞集団（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはＣＤ４＋
／ＣＤ８＋細胞）のそれぞれを、キメラ受容体（例えば、ＣＡＲＴ１およびＣＡＲＴ８）
を含むレンチウイルスベクターで形質導入し、得られたキメラ受容体を発現する一次Ｔ細
胞を使用して前述のように細胞毒性アッセイを実施した。キメラ受容体を発現するＣＤ４
＋Ｔ細胞集団とＫ５６２細胞（１０００個の標的Ｋ５６２細胞）の共インキュベーション
は、Ｋ５６２細胞の細胞毒性をもたらさなかった（図１４、パネルＡ）。これに反し、キ
メラ受容体を発現するＣＤ８＋またはＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞のいずれか、および１００
０個の標的Ｋ５６２細胞を用いた細胞毒性アッセイでは、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋／ＣＤ
８＋細胞は、Ｋ５６２細胞の細胞死を低い細胞比率で誘発できた（図１４、パネルＢ）。
ヒト造血幹細胞の遺伝子工学処理
いくつかのｇＲＮＡを、ＣＤ３３のＩｇＣ領域にハイブリダイズするように設計した（
例えば、表４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１または２８～３１を参照）。ｇＲＮＡのそれぞ
れはＫ５６２細胞中でＣａｓ９エンドヌクレアーゼとともに発現された。ＣＤ３３の発現
をフローサイトメトリーで評価した（図１５）。Ｃｒｉｓｐｒ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
２８）およびＣｒｉｓｐｒ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）について示すように、ＣＤ３
３を発現するコントロール細胞と比べて、ＣＤ３３標的化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を発現
する細胞でＣＤ３３の顕著な低下が認められた。
ＣＤ３３欠如造血幹細胞を、増殖、赤血球形成分化、およびコロニー形成を含む、様々
な特性についても評価した。簡単に説明すると、ＣＤ３３欠損造血幹細胞およびコントロ
ール細胞を、ヘミンに細胞を暴露することによって分化するよう誘導し、赤血球前駆体の
マーカーであるＣＤ７１を、フローサイトメトリーによって異なる時点で評価した（図１
６、パネルＡおよびＢ）。ＣＤ３３欠損造血幹細胞は赤血球形成分化を起こし、フローサ
イトメトリープロファイルはコントロール細胞（ＣＤ３３＋）と類似しているように見え
た。細胞をＭＴＴアッセイにも供して、ＣＤ３３欠損造血幹細胞の代謝活性を測定した。
図１６のパネルＣに示すように、ＣＤ３３欠損造血幹細胞は、コントロールと同等にふる
まった。最後に、増殖および細胞コロニーを形成する細胞の能力を顕微鏡コロニー形成ア
ッセイによって観察した。再度、ＣＤ３３欠損造血幹細胞は、コントロール細胞と同様の
程度にコロニーを形成できた（図１８）。これらの結果は、ＣＤ３３の一部のＣＲＩＳＰ
Ｒ／Ｃａｓ除去が増殖、分化、またはコロニー形成する細胞の能力に顕著な影響を及ぼさ
ないことを示す。
他の実施形態
本明細書で開示される特徴のすべては、任意の組み合わせで併用され得る。本明細書で
開示されるそれぞれの特徴は、同一、同等、または類似の目的をもたらす代替えの特徴に
よって交換され得る。このため、他に明確な記載がない限り、開示されるそれぞれの特徴
は、包括的な一連の同等または類似の特徴の例にすぎない。
上の記載から、従来技術の当業者は本開示の本質的な特徴を容易に確認することができ
、この精神および範囲から逸脱せずに、本開示の様々な変更および改良を実施して、様々
な使用および条件にこれを適応することができる。そのため、他の実施形態も本請求内で
ある。
均等物
いくつかの発明の実施形態が本明細書で説明され例証されており、従来技術の当業者は
本明細書で説明される機能を実施する、および／または結果および／または１つ以上の利
点を得るために、様々な他の手段および構造を容易に想像するが、このような変更および
／または改善のそれぞれは本明細書で説明される発明の実施形態の範囲内であると考えら
れる。より一般的には、従来技術の当業者は、本明細書で説明されるすべてのパラメータ
、寸法、材料、および構成は例示的であることが意味され、実際のパラメータ、寸法、材
料、および／または構成は具体的な適用、または本発明の教示が使用される適用に依存す
ることを容易に認識するであろう。従来技術の当業者は、定型的な実験以外を用いて、本
明細書で説明される具体的な本発明の実施形態との多くの均等物を認識し、あるいは確認
することができる。従って、前述の実施形態は例としてのみ提示され、添付の請求および
この均等物の範囲内では、本発明の実施形態は具体的に説明されて請求される以外で実施
され得る。本開示の発明による実施形態は、本明細書で説明されるそれぞれの個別の特徴
、システム、物品、材料、キット、および／または方法に関するものである。さらに、こ
のような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の２つ以上の任意の
組み合わせは、このような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が
相互に不整合でない場合、本開示の発明の範囲内に含まれる。
本明細書で定められて使用されるすべての定義は、定められた用語の辞書による定義、
参考によって組み込まれている文書における定義、および／または通常の意味を網羅して
管理すると理解されるべきである。
本明細書で開示されるすべての参考文献、特許、および特許出願は、それぞれが引用さ
れる主題に関連して参考によって組み込まれ、いくつかの場合には、文書全体が包含され
得る。
不定冠詞「１つの（ａ、ａｎ）」は、本明細書および請求で使用されるとき、明確に反
する指示がない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
フレーズ「および／または」は、本明細書および請求で使用されるとき、このように結
合された構成要素の「どちらかまたは両方」、すなわち、ある場合には結合されて存在し
、他の場合には分離して存在する構成要素を意味すると理解されるべきである。「および
／または」によって示される複数の構成要素は、同一形態、すなわち、このように結合さ
れた構成要素の「１つ以上」と考えられるべきである。他の構成要素は、具体的に特定さ
れるこれらの構成要素と関連するまたは無関連であるかにかかわらず、句「および／また
は」によって具体的に特定される構成要素以外で任意に存在し得る。このため、非限定例
として、「Ａおよび／またはＢ」による意味は、「含む」のような制限のない用語と併せ
て使用されるとき、一つの実施形態ではＡのみ（任意にＢ以外の構成要素を含む）、別の
実施形態ではＢのみ（任意にＡ以外の構成要素を含む）を意味し、さらに別の実施形態で
はＡおよびＢの両方（任意に他の構成要素を含む）、などを意味することができる。
本明細書および本請求において使用されるとき、「または」は前述の「および／または
」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リストにおける項目を分けると
き、「または」または「および／または」は包含的であると解釈されるべきであり、すな
わち、少なくとも１つの包含だが、多数またはリストの構成要素の少なくとも１つ、任意
に追加のリスト外の項目も含む。これに反して明確に示される１つだけの項目、「の１つ
のみ」または「のまさに１つ」、あるいは本請求で使用されるときの「からなる」などは
、多数またはリストの構成要素の厳密に１つの構成要素の包含を意味する。一般的に、本
明細書で使用される「または」は、「どちらか」、「の１つ」、「の１つのみ」、または
「のまさに１つ」のような排他的な用語が先行するとき、排他的な選択肢（すなわち、「
１つまたは他の１つだが、両方ではない」）を示すとだけ解釈されるべきである。「基本
的にからなる」は、本請求で使用されるとき、特許法の分野で使用されるその通常の意味
を有する。
本明細書および本請求で使用されるとき、フレーズ「少なくとも１つ」は、１つ以上の
構成要素の１つのリストの参照において、構成要素のリストにおける構成要素のいずれか
１つ以上から選択される少なくとも１つの構成要素を意味するが、構成要素のリスト内に
具体的に列挙されるそれぞれおよびすべての構成要素の少なくとも１つを必ずしも含まず
、構成要素のリストの構成要素の任意の組み合わせを除外しない。この定義は、フレーズ
「少なくとも１つ」が意味する構成要素のリスト内で具体的に特定される構成要素以外で
構成要素が任意に存在し得ることも可能であり、具体的に特定されるこれらの構成要素と
関連するまたは無関連であるかに関わらない。そのため、非限定的な例として、「Ａおよ
びＢの少なくとも１つ」（または、同義として「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または
同義として「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一つの実施形態ではＢの存在
なしで（任意にＢ以外の構成要素を含む）、任意に１つを超えて含む少なくとも１つであ
るＡ、別の実施形態ではＡの存在なしで（任意にＡ以外の構成要素を含む）、任意に１つ
を超えて含む少なくとも１つであるＢ、さらに別の実施形態では、任意に１つを超えて含
む少なくとも１つであるＡ、および任意に１つを超えて含む少なくとも１つであるＢ（お
よび任意に他の構成要素）、などを意味する。
反する明確に指示がない限り、１つを超えるステップまたは行動を含む本明細書におい
て請求されるいずれかの方法において、本方法のステップまたは行動の順序は必ずしも引
用される方法のステップまたは行動の順序に限定されないことも理解されるべきである。

Claims (62)

  1. 造血器悪性腫瘍を治療する方法であって、その方法を必要とする被験体に
    （ｉ）系統特異的細胞表面抗原を標的にする作用物質の効果的な量であって、ここで前記
    作用物質が前記系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメントを含む、作用物
    質の効果的な量、および
    （ｉｉ）前記系統特異的細胞表面抗原を欠く造血細胞集団、
    を投与することを含む、方法。
  2. 前記作用物質が前記系統特異的細胞表面抗原を結合する前記抗原結合フラグメントを含
    むキメラ受容体を発現する免疫細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記免疫細胞、前記造血細胞、または両方が同種異系または自家である、請求項１また
    は２に記載の方法。
  4. 前記造血細胞が造血幹細胞である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記系統特異的細胞表面抗原が２型系統特異的細胞表面抗原である、請求項１～４のい
    ずれか一項に記載の方法。
  6. 前記２型系統特異的細胞表面抗原がＣＤ３３である、請求項５に記載の方法。
  7. 前記キメラ受容体中の前記抗原結合フラグメントが、ヒトタンパク質である前記系統特
    異的細胞表面抗原を特異的に結合する単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項
    １～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記ｓｃＦｖがヒトＣＤ３３に結合する、請求項７に記載の方法。
  9. 前記ｓｃＦｖが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２中のものと同じ相補的決定領域（ＣＤＲ）
    を有する重鎖可変領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３中のものと同じＣＤＲを有する
    軽鎖可変領域を含む、請求項８に記載の方法。
  10. 前記ｓｃＦｖがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項９に記載
    の方法。
  11. 前記系統特異的細胞表面抗原が１型系統特異的細胞表面抗原である、請求項１～４のい
    ずれか一項に記載の方法。
  12. 前記１型系統特異的細胞表面抗原がＣＤ１９である、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記キメラ受容体が、
    （ａ）ヒンジ領域、
    （ｂ）膜貫通領域、
    （ｃ）少なくとも１つの共刺激領域、
    （ｄ）細胞質シグナル伝達領域、または
    （ｅ）これらの組み合わせ、
    をさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記キメラ受容体が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４
    ０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、
    ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、およびこれらの組み合わせ
    から選択される共刺激受容体由来である、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域を含
    む、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域が４－１ＢＢ、ＣＤ２８、またはＩＣＯ
    Ｓ由来である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域が、ＣＤ２８のシグナル伝達領域および
    ＩＣＯＳのシグナル伝達領域を含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域がＣＤ２８由来でありかつ前記キメラ受
    容体が４－１ＢＢまたはＩＣＯＳ由来の第二共刺激シグナル伝達領域をさらに含む、請求
    項１６または１７に記載の方法。
  19. 前記キメラ受容体が、ＣＤ３ζ由来である細胞質シグナル伝達領域を含む、請求項１～
    １８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記キメラ受容体が、ＣＤ８αまたはＣＤ２８α由来であるヒンジ領域を含む、請求項
    １～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記キメラ受容体が、ＣＤ８、ＣＤ２８、またはＩＣＯＳ由来である膜貫通領域を含む
    、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記キメラ受容体が、Ｎ端からＣ端へと、
    （ｉ）系統特異的細胞表面抗原に結合するｓｃＦｖ、ＣＤ８α由来のヒンジ領域、ＣＤ８
    由来の膜貫通領域、４－１ＢＢ由来の共刺激領域、およびＣＤ３ζ由来の細胞質シグナル
    伝達領域、
    （ｉｉ）系統特異的細胞表面抗原に結合するｓｃＦｖ、ＣＤ８α由来のヒンジ領域、ＣＤ
    ２８由来の膜貫通領域、ＣＤ２８由来の共刺激領域、およびＣＤ３ζ由来の細胞質シグナ
    ル伝達領域、または
    （ｉｉｉ）系統特異的細胞表面抗原に結合するｓｃＦｖ、ＣＤ８α由来のヒンジ領域、Ｃ
    Ｄ２８由来の膜貫通領域、ＣＤ２８由来の第一共刺激領域、４－１ＢＢ由来の第二共刺激
    領域、およびＣＤ３ζ由来の細胞質シグナル伝達領域、
    を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記造血幹細胞がＣＤ３４＋／ＣＤ３３－である、請求項４～２２のいずれか一項に記
    載の方法。
  24. 前記造血幹細胞が骨髄細胞または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来である、請求項２３
    に記載の方法。
  25. 前記被験体がホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、または多発性骨髄腫を
    有する、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記被験体が、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、また
    は慢性リンパ芽球性白血病である白血病を有する、請求項２５に記載の方法。
  27. キメラ受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、ここで前記キメラ受
    容体がＣＤ３３を結合する抗原結合フラグメント、膜貫通領域、および細胞質シグナル伝
    達領域を含み、ここで前記抗原結合フラグメントがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２中のものと
    同じＣＤＲを有する重鎖可変領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３中のものと同じＣＤ
    Ｒを有する軽鎖可変領域を含む、核酸。
  28. 前記キメラ受容体が少なくとも１つの共刺激領域をさらに含む、請求項２７に記載の核
    酸。
  29. 前記少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域がＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、Ｏ
    Ｘ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ
    －１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、
    およびこれらの組み合わせから選択される共刺激受容体由来である、請求項２８に記載の
    核酸。
  30. 前記少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域が４－１ＢＢ、ＣＤ２８、またはＩＣＯ
    Ｓ由来である、請求項２９に記載の核酸。
  31. 前記少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域がＣＤ２８のシグナル伝達領域およびＩ
    ＣＯＳのシグナル伝達領域を含む、請求項３０に記載の核酸。
  32. 前記少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域がＣＤ２８由来でありかつ前記キメラ受
    容体が４－１ＢＢまたはＩＣＯＳ由来の第二共刺激シグナル伝達領域をさらに含む、請求
    項３０または３１に記載の核酸。
  33. 前記細胞質シグナル伝達領域がＣＤ３ζ由来である、請求項２７～３２に記載のいずれ
    か一項に記載の核酸。
  34. 前記ヒンジ領域がＣＤ８αまたはＣＤ２８α由来である、請求項２７～３３のいずれか
    一項に記載の核酸。
  35. 前記膜貫通領域がＣＤ８、ＣＤ２８、またはＩＣＯＳ由来である、請求項２７～３４の
    いずれか一項に記載の核酸。
  36. 前記キメラ受容体が、Ｎ端からＣ端へと、
    （ｉ）前記抗原結合フラグメント、ＣＤ８α由来のヒンジ領域、ＣＤ８由来の膜貫通領域
    、４－１ＢＢ由来の共刺激領域、およびＣＤ３ζ由来の細胞質シグナル伝達領域、
    （ｉｉ）前記抗原結合フラグメント、ＣＤ８α由来のヒンジ領域、ＣＤ２８由来の膜貫通
    領域、ＣＤ２８由来の共刺激領域、およびＣＤ３ζ由来の細胞質シグナル伝達領域、また
    は
    （ｉｉｉ）前記抗原結合フラグメント、ＣＤ８α由来のヒンジ領域、ＣＤ２８由来の膜貫
    通領域、ＣＤ２８由来の第一共刺激領域、４－１ＢＢ由来の第二共刺激領域、およびＣＤ
    ３ζ由来の細胞質シグナル伝達領域
    を含む、請求項２７～３５のいずれか一項に記載の核酸。
  37. 前記抗原結合フラグメントがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列を有する重鎖可
    変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、請
    求項２７～３６のいずれか一項に記載の核酸。
  38. 請求項２７～３７のいずれか一項の核酸を含む、ベクター。
  39. 請求項２７～３８のいずれか一項の核酸によってコードされる、キメラ受容体。
  40. 請求項３９のキメラ受容体を発現する、免疫細胞。
  41. Ｔ細胞である、請求項４０に記載の免疫細胞。
  42. 前記免疫細胞が造血器悪性腫瘍を有する患者から得られる、請求項４０または４１に記
    載の免疫細胞。
  43. 遺伝子工学処理された造血細胞であって、遺伝子工学処理の前に造血細胞上に存在する
    系統特異的細胞表面抗原を欠く、遺伝子工学処理された造血細胞。
  44. 前記系統特異的細胞表面抗原をコードする内因性遺伝子のすべてまたは一部が削除され
    る、請求項４３に記載の遺伝子工学処理された造血細胞。
  45. 前記系統特異的細胞表面抗原をコードする内因性遺伝子のすべてまたは一部がゲノム編
    集を用いて削除される、請求項４４に記載の遺伝子工学処理された造血細胞。
  46. 前記ゲノム編集がジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エファ
    クターベースヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む、請求
    項４５に記載の遺伝子工学処理された造血細胞。
  47. 前記系統特異的細胞表面抗原がＣＤ３３またはＣＤ１９である、請求項４３～４６のい
    ずれか一項に記載の遺伝子工学処理された造血細胞。
  48. 前記系統特異的細胞表面抗原がＣＤ３３でありかつＣＤ３３の免疫グロブリン定常（Ｉ
    ｇＣ）領域の一部が削除される、請求項４６に記載の遺伝子工学処理された造血細胞。
  49. 前記造血細胞が造血幹細胞である、請求項４３～４８のいずれか一項に記載の遺伝子工
    学処理された造血細胞。
  50. ＣＤ３４＋／ＣＤ３３－細胞である、請求項４９に記載の遺伝子工学処理された造血細
    胞。
  51. 骨髄細胞または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来である、請求項４３～５０のいずれか
    一項に記載の遺伝子工学処理された造血細胞。
  52. 系統特異的細胞表面抗原を欠く細胞を産生する方法であって、
    細胞を用意すること、ならびに
    前記細胞中に
    （ｉ）前記系統特異的細胞表面抗原をコードするヌクレオチド配列の一部にハイブリダイ
    ズするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）のヌクレオチド配列を含む核酸
    、および
    （ｉｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、
    を導入すること
    を含む、方法。
  53. 前記ＣａｓエンドヌクレアーゼがＣａｓ９またはＣｐｆ１である、請求項５２に記載の
    方法。
  54. （ｉ）および（ｉｉ）が同じ核酸上にまたは異なる核酸上にコードされる、請求項５２
    または５３に記載の方法。
  55. （ｉ）および（ｉｉ）が前形成リボヌクレオタンパク質複合体として前記細胞中に導入
    される、請求項５２～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記ｇＲＮＡがハイブリダイズする前記ヌクレオチド配列の前記一部が１８～２２個の
    ヌクレオチドからなる、請求項５２～５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記系統特異的細胞表面抗原がＣＤ３３またはＣＤ１９である、請求項５２～５６のい
    ずれか一項に記載の方法。
  58. 前記細胞が造血細胞である、請求項５２～５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記造血細胞が造血幹細胞である、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記造血幹細胞がＣＤ３４＋である、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記ｇＲＮＡがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１および２８～３１のいずれか１つのヌクレオ
    チド配列を含む、請求項５２～６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. （ｉ）請求項４０～４２のいずれか一項の免疫細胞および、系統特異的細胞表面抗原を
    標的にし、前記系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメントを含む作用物質
    、ならびに
    （ｉｉ）請求項４３～５１のいずれか一項に示される系統特異的細胞表面抗原を欠く造
    血細胞集団、
    を含む、キット。
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