UA123257C2 - Виділений поліпептид, що кодує антитіло до рецептора фолієвої кислоти 1 - Google Patents

Виділений поліпептид, що кодує антитіло до рецептора фолієвої кислоти 1 Download PDF

Info

Publication number
UA123257C2
UA123257C2 UAA201507804A UAA201507804A UA123257C2 UA 123257 C2 UA123257 C2 UA 123257C2 UA A201507804 A UAA201507804 A UA A201507804A UA A201507804 A UAA201507804 A UA A201507804A UA 123257 C2 UA123257 C2 UA 123257C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
amino acid
acid sequence
sequence
zeo
Prior art date
Application number
UAA201507804A
Other languages
English (en)
Inventor
Ольга Аб
Деніел Таварес
Лінгюн Руї
Гілліан Пейн
Віктор С. Голдмахер
Original Assignee
Іммуноджен, Інк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Іммуноджен, Інк. filed Critical Іммуноджен, Інк.
Publication of UA123257C2 publication Critical patent/UA123257C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5365—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/537—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines spiro-condensed or forming part of bridged ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545—Heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0002—General or multifunctional contrast agents, e.g. chelated agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3038—Kidney, bladder
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/624—Disulfide-stabilized antibody (dsFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)

Abstract

Винахід стосується виділеного полінуклеотиду, що кодує антитіло, яке специфічно зв'язується з рецептором 1 фолату людини, у тому числі полінуклеотиду, що кодується плазмідою, депонованою в АТСС за номером PTA-10772, та плазмідою, депонованою в АТСС за номером PTA-10773, а також виділеної клітини-хазяїна, що кодує такий полінуклеотид.

Description

(54) ВИДІЛЕНИЙ ПОЛІПЕПТИД, ЩО КОДУЄ АНТИТІЛО ДО РЕЦЕПТОРА ФОЛІЄВОЇ КИСЛОТИ 1 (57) Реферат:
Винахід стосується виділеного полінуклеотиду, що кодує антитіло, яке специфічно зв'язується з рецептором 1 Фолату людини, у тому числі полінуклеотиду, що кодується плазмідою, депонованою в АТСЄ за номером РТА-10772, та плазмідою, депонованою в АТС за номером
РТА-10773, а також виділеної клітини-хазяїна, що кодує такий попінуклеотид.
Дана заявка претендує на пріоритет заявки на патент США Мо 61/307797, поданої 24 лютого 2010, заявки на патент США Мо 61/346595, поданої 20 травня 2010, і заявки на патент США Мо 61/413172, поданої 12 листопада 2010, зміст яких включений в дану заявку за допомогою посилання у всій повноті.
Галузь техніки
Галузь техніки винаходу в цілому належить до антитіл, їх антигензв'язуючих фрагментів, поліпептидів, імунокон'югатів, що з'єднуються з людським рецептором фолієвої кислоти 1, а також до способів застосування антитіл й імунокон'югатів для терапії захворювань, наприклад, онкологічних захворювань.
Рівень техніки
Онкологічні захворювання - одна з основних причин смертності в розвинених країнах; за один рік тільки в США діагноз онкологічного захворювання ставиться більш ніж одному мільйону людей, а помирають через онкологічні захворювання 500000 людей. По оцінках більш ніж у 1 людини з 3-х протягом життя розвинеться онкологічне захворювання. Відомо більше 200 різних видів раку, чотири з яких - рак молочної залози, легень, колоректальний і рак передміхурової залози - відзначаються в більш ніж половині нових випадків раку (ЧетаїЇ еї аї., 2003, Сапсег у.
Сів. 5325-26).
Рецептор фолієвої кислоти 1 (БОЇ КІ), також відомий як альфа-рецептор фолієвої кислоти або фолатзв'язуючий білок, являє собою М-глікозильований білок, який експресується на плазматичній мембрані клітин. РОЇ КІ має високу афінність до фолієвої кислоти і ряду її відновлених похідних. БОЇЖК! опосередковує доставку фізіологічного фолату 5- метилтетрагідрофолату всередину клітин.
ЕОЇ КІ надлишково експресується при більшості видів онкологічних захворювань яєчника, а також при великій кількості онкологічних захворювань матки, ендометрія, підшлункової залози, нирок, легенів і молочної залози, у той час як у нормальних тканинах РОЇ К1 експресується лише в апікальній мембрані епітеліальних клітин проксимальних канальців нирок, альвеолярних пневмоцитах легенів, у сечовому міхурі, яєчках, хоріоїдному сплетінні й у щитовидній залозі (М/ейтап 50, єї аі., Сапсег Вез 52: 3396-3401 (1992); Апіопу АС, Аппи Нем Миїг 16: 501-521 (1996); Каїїї КА, єї аІ.Супесої! Опсої 108: 619-626 (2008)). Завдяки цій схемі експресії, РОЇ К1 є
Зо підходящою мішенню для РОЇ К 1-спрямованої протипухлинної терапії.
Оскільки рак яєчника, як правило, протікає безсимптомно аж до пізньої стадії, його часто діагностують на пізній стадії з поганим прогнозом при терапії доступними на даний час процедурами, - як правило, хіміотерапією після циторедуктивного хірургічного втручання (моп
Стпепідеп М еї а!., Сапсег 112: 2221-2227 (2008); Аупап А єї аІ., Ат У ОбБвієї Супесої 196: 81 е81- 86 (2007); Нау УМ еї аї., Орзієї Супесо! Зигм 64: 548-560 (2009)). Таким чином, є чітка незадоволена медична потреба в більш ефективних засобах лікування онкологічних захворювань яєчника.
Як потенційні протипухлинні лікарські засоби було вивчено три антитіла проти ЕОЇК1.
Мишачі моноклональні антитіла Мом18 і Мом19 були виділені в пізніх 1980-х рр. (Міоці 5 еї аї., пі
У Сапсег 39: 297-303 (1987)), була підтверджена їх афінність проти БОЇ КІ (Сопеу ІК еї а!.,Сапсег Вез 51: 6125-6132 (1991)), а потім вони були протестовані в доклінічних дослідженнях на здатність у вигляді кон'югатів із цитотоксичним білком, що інактивиує рибосоми, ліквідувати ракові клітини, що експресують антиген (Сопаеє ЕР еїаї., Єиг У Віоспет 178: 795-802 (1989)).
Мом19 було протестовано як біспецифічне антитіло, націлене на цитотоксичні Т-клітини й клітини-натуральні кілери (Ме77аплапіса О еї аї., Іпї У Сапсег 41: 609-615 (1988); Еетіпі 5 еї аї.,
Іпї У Сапсег Зиррі 4: 53-55 (1989); Ретіпі 5 єї аї., Іпї У Сапсег 48: 227-233 (1991)), а також у вигляді злитого білка, що складається з одноланцюгового Ем (5СЕм) Мом19 і інтерлейкіну-2 іп мімо (Меїапі С єї аЇ., Сапсег Ве5 58: 4146-4154 (1998). Для химерних (мишача варіабельна/людська константна) антитіл проти БОЇ К1 Мом18 і Мом19 доклінічно була вивчена здатність опосередковувати цитотоксичну імунну клітиннозалежну загибель клітин пухлин, що експресують РОЇ КІ іп міїго (Сопеу ІК еї аІ.,Сапсег Кев 54: 2448-2455 (1994)), химерне Мом18-
ІЗЕ було протестовано в ІДЕ-залежних імунотерапевтичних доклінічних моделях (Кагадіаппів ЗМ еї аї., У Іттипої 179: 2832-2843 (2007); Стоціа НУ еї а!., Єиг У Іттипої 29: 3527-3537 (1999)).
Мом18 у вигляді кон'югатів з різними радіонуклідами пройшло доклінічні дослідження, а на початку 1990-х рр. - і клінічні (ласспеці А еї аї., Мисі Мей Віо! 36: 759-770 (2009)), за результатами яких жоден препарат не був затверджений.
МОРАБООЗ - гуманізована форма мишачого моноклонального антитіла проти РОЇ К1 І К26 - пройшла доклінічне дослідження у вигляді немодифікованого антитіла (Ебе! МУ еї аїЇ.,Сапсег
Ітітип 7:6 (2007)) і у вигляді кон'югата з радіонуклідом "п (Зтйй-Уопез РМ еї аї., Мис! Меа Віої!
35: 343-351 (2008)), і в даний час проходить клінічні дослідження як немодифіковане антитіло (Юр. К. Аттвігопа евї аї. у). Сііп. Опсої. 26: 2008, Мау 20 з!иррі; абзігасі 5500).
Суть винаходу
У даному винаході пропонуються нові антитіла, що зв'язуються з людським рецептором фолієвої кислоти 1, імунокон'югати, що містять ці антитіла, а також способи їх застосування.
Крім цього, у даному винаході пропонуються нові поліпептиди, наприклад антитіла, що зв'язуються з людським рецептором фолієвої кислоти 1, фрагменти таких антитіл і інші поліпептиди, зв'язані з такими антитілами. Також пропонуються полінуклеотиди, що містять нуклеотидні послідовності, що кодують поліпептиди, і вектори, що містять полінуклеотиди. Крім цього, пропонуються клітини, що містять поліпептиди й/або полінуклеотиди згідно з винаходом.
Також пропонуються композиції (наприклад, фармацевтичні композиції), що містять нові антитіла проти рецептора фолієвої кислоти 1. Крім цього, пропонуються способи одержання і застосування нових антитіл проти рецептора фолієвої кислоти 1 або імунокон'югатів, наприклад, способи, в яких нові антитіла проти рецептора фолієвої кислоти 1 або імунокон'югати використовуються для інгібування росту пухлини і/або для лікування раку.
Таким чином, в одному аспекті у винаході пропонується гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, які специфічно зв'язуються з рецептором фолієвої кислоти 1, які відрізняються тим, що антитіло містить (а) СОКІ важкого ланцюга, що містить ЗУЕММ (ЗЕО І
МО: 1); СОВ2 важкого ланцюга, що містить ВІНРУОСОТЕУМОХ аа ЕРХаагХааз (5ЕО ІО МО: 56); і
СОМЗ важкого ланцюга, що містить /ОС5КАМОМ (ЗЕО ІЮ МО: 3); і (6) СОКІ легкого ланцюга, що містить КАБОБУБЗЕАИат5І МН (5ЕО І МО: 7); СОК2 легкого ланцюга, що містить КАЗМІ ЕА (ЗЕБЕО І МО: 8); СОКЗ легкого ланцюга, що містить ООБКЕМРУТ (5БО ІЮ МО: 9); де Хаа! вибраний з К, С, Н і Е; Хааг вибраний з СО, Н, М і Е; і Хааз вибраний з с, Е, Т, 5, А і М. У певному варіанті втілення гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент зв'язуються з людським рецептором фолієвої кислоти 1 із практично такою самою афінністю, що й химерне антитіло Мом19. У певному варіанті втілення гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент містить послідовність СОВ2 важкого ланцюга ВІНРУСИОТЕУМОКРОС (5ЕО ІЮ МО: 2).
У певному варіанті втілення зв'язуючу здатність вимірюють способом проточної цитометрії,
Зо Віасоге або за допомогою радіоімунологічного аналізу.
В іншому варіанті втілення у винаході пропонується гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, які специфічно зв'язуються з людським рецептором фолієвої кислоти 1, що відрізняються тім, що антитіло містить: (аа СОКІ важкого ланцюга, що містить
СМЕММ (5ЕО І МО: 1), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; СОК2 важкого ланцюга, що містить ВІНРУИСЯОТЕММОКРОС (5ЕО ІО МО: 2), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; і СОКЗ важкого ланцюга, що містить УОС5КАМОМ (ЗЕО ІЮ МО: 3), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; іабо (6) СОР! важкого ланцюга, що містить
КАБОБМУ5БЕАСТОЇ МН (5ЕО ІО МО: 7), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; СОК2 важкого ланцюга, що містить КАБМІЕА (ЗЕО ІО МО: 8), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; СОКЗ важкого ланцюга, що містить ООБКЕМРУТ (5ЕО ІЮ МО: 9), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни.
У певному варіанті втілення у винаході пропонується гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, які специфічно зв'язуються з людським рецептором фолієвої кислоти 1, що містять важкий ланцюг з БЕО ІЮ МО: 6. В іншому варіанті втілення гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент кодуються плазмідною ДНК, депонованою в
АТСС 7 квітня 2010 під номерами депонентів АТСС РТА-10772 і РТА-10773 або 10774.
У певному варіанті втілення у винаході пропонується гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, які конкурують по зв'язуванню з РОЇ К1 з антитілом, що містить (а)
СОКТ важкого ланцюга, що містить ЗМЕММ (ЗЕО ІЮО МО: 1); СОК2 важкого ланцюга, що містить
ВІНРУСОаОЮТЕУМО»ХаатЕХаагХааз (5ЕБО І МО: 56); і СОКЗ важкого ланцюга, що містить
МрОБКАМОМ (5ЕО ІЮ МО: 3); і (6) СОК1 легкого ланцюга, що містить КАБОЗУЗЕАСТЗІ МН (ЗЕО ІО МО: 7); СОМК2 легкого ланцюга, що містить КАЗМІЕА (5ЕО ІО МО: 8); СОКЗ легкого ланцюга, що містить ООБКЕМРУТ (ЗЕО ІЮО МО: 9); де Хааї вибраний з К, 0, Н і ЕК; Хаа? вибраний з О, Н, М ї ЕК; їі Хааз вибраний з с, Е, Т, 5, А і М. У певному варіанті втілення гуманізоване антитіло містить послідовність СОК2 важкого ланцюга КІНРУОСОТЕУМОКРОС (ЗЕО ІО МО: 2).
У певному варіанті втілення у винаході пропонується поліпептид, гуманізоване антитіло або бо його антигензв'язуючий фрагмент, що містять варіабельний домен важкого ланцюга,
щонайменше на приблизно 90 95 ідентичний 5ЕО ІЮО МО: 4, і варіабельний домен легкого ланцюга, щонайменше на приблизно 90 95 ідентичний 5ЕО ІЮО МО: 10 або 5ЕО ІЮ МО: 11. В іншому варіанті втілення гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент містять варіабельний домен важкого ланцюга, щонайменше на приблизно 95 95 ідентичний ЗЕО ІЮ МО: 4, і варіабельний домен легкого ланцюга, щонайменше на приблизно 95 95 ідентичний 5ЕО ІЮ
МО: 10 або 5ЕО ІО МО: 11. У ще одному варіанті втілення гуманізоване антитіло містить варіабельний домен важкого ланцюга, щонайменше на приблизно 99 95 ідентичний ЗЕО ІЮ МО: 4, і варіабельний домен легкого ланцюга, щонайменше на приблизно 99 95 ідентичний 5ЕО ІЮ
МО: 10 або 5ЕО ІЮ МО: 11. У певному варіанті втілення гуманізоване антитіло містить варіабельний домен важкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮО МО: 4, і варіабельний домен легкого ланцюга послідовності ЗЕО ІЮО МО: 10 або 5ЕО ІЮО МО: 11. У певних варіантах втілення у винаході пропонується поліпептид, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент, що містять варіабельний домен важкого ланцюга, щонайменше на приблизно 90 95 ідентичний 5ЕО ІЮ
МО»: 88-119. У певних варіантах втілення у винаході пропонується поліпептид, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент, що містять варіабельний домен важкого ланцюга, щонайменше на приблизно 95 95 ідентичний 5ЕО ІЮ МО5: 88-119. У певних варіантах втілення у винаході пропонується поліпептид, антитіло або антигензв'язуючий фрагмент, що містять варіабельний домен важкого ланцюга, щонайменше на приблизно 99 95 ідентичний ЗЕО ІЮ МО: 88-119.
У певному варіанті втілення у винаході пропонується гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, які в клітинах еукаріотів експресуються щонайменше більш ніж удесятеро інтенсивніше в порівнянні з СПмМОом19. У певному варіанті втілення еукаріотні клітини - клітини НЕК-293Т.
У певних варіантах втілення у винаході пропонується антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, які специфічно зв'язуються з людським рецептором фолієвої кислоти 1, що відрізняються тим, що антитіло містить: (ах СОКІ важкого ланцюга, що містить Б3ЗЖОМ5 (5ЕО
ІЮО МО: 30); СОМК2 важкого ланцюга, що містить ТІЗ5ОО5УТМ (5БО ІЮ МО: 31); або СОКЗ важкого ланцюга, що містить ОСЕСОСЇ МАМОМ (5ЕО ІЮО МО: 32); і/або (6) СОКІ1 легкого ланцюга, що містить КАБОНІММУМІА (ЗЕО 1О МО: 27); СОК2 легкого ланцюга, що містить САТ5І ЕТ (ЗЕО
ІЮО МО: 28); і СОКЗ легкого ланцюга, що містить ОСОУМУЗТРЕТ (БО ІЮ МО: 29). В іншому
Зо варіанті втілення у винаході пропонується антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, які специфічно зв'язуються з людським рецептором фолієвої кислоти 1, що відрізняються тим, що антитіло містить: (а) СОТ важкого ланцюга, що містить ТМУМ/МО (ЗЕБО ІЮ МО: 60); СОМК2 важкого ланцюга, що містить АЇІМРОМОЮЗЕ (ЗЕО ІО МО: 61); або СОКЗ важкого ланцюга, що містить КОСМУААМ (5ЕО ІО МО: 62); і/або (6) СОМКІ1 легкого ланцюга, що містить КАБЗЕМІУЗМІ А (ЗЕО ІЮ МО: 57); СОК2 легкого ланцюга, що містить ААТМІ АЮ (ЗЕО ІЮ МО: 58); і СОКЗ легкого ланцюга, що містить ОНЕУМАБРУТ (ЗЕБО ІЮ МО: 59). В іншому варіанті втілення у винаході пропонується антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, які специфічно зв'язуються з людським рецептором фолієвої кислоти 1, що відрізняються тим, що антитіло містить: (а) СОК1 важкого ланцюга, що містить ТМУУММУ (5ЕО І МО: 66); СОК2 важкого ланцюга, що містить АЇМРОМ5ЗОТТ (ЗЕО І МО: 67); і/або СОКЗ важкого ланцюга, що містить КЕНОМОАМОМ (ЗЕО ІЮ
МО: 68); і/або (б) СОКІ1 легкого ланцюга, що містить КАЗЕМІМТМІСА (ЗЕО ІЮ МО: 63); СОК2 легкого ланцюга, що містить ТАМ АЮ (5ЕО ІО МО: 64); і СОКЗ легкого ланцюга, що містить
ОНЕМ/УЗРУТ (ЗЕО ІЮ МО: 65). В іншому варіанті втілення у винаході пропонується антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, які специфічно зв'язуються з людським рецептором фолієвої кислоти 1, що відрізняються тим, що антитіло містить: (а) СОКІ важкого ланцюга, що містить
ЗЗЕОМН (5ЕО ІЮ МО: 72); СОК2 важкого ланцюга, що містить УІ5505551Т15 (БО ІЮО МО: 73); або СОКЗ важкого ланцюга, що містить ЕАУО5З5ЗМЕМ (ЗЕО ІЮО МО: 74); і/або (б) СОМК1 легкого ланцюга, що містить КАБОМІМММІН (5ЕБЕО І МО: 69); СОК2 легкого ланцюга, що містить
УМ5ОБМ5 (5ЕБО ІЮ МО: 70); і СОКЗ легкого ланцюга, що містить О0ОЗМЗУМРНУТ (ЗЕО ІО МО: 71). В іншому варіанті втілення у винаході пропонуються антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, які специфічно зв'язуються з людським рецептором фолієвої кислоти 1, що відрізняються тим, що антитіло містить: (а) СОК1 важкого ланцюга, що містить Т2УТМН (ЗЕО І
МО: 78); СОК2 важкого ланцюга, що містить МІМРІЗОМУТМ (5ЕО ІЮ МО: 79); і/або СОКЗ важкого ланцюга, що містить ОСАМОККРМОМ (5ЕО ІО МО: 80); і/або (б) СОК1 легкого ланцюга, що містить КАБОММОРММА (ЗЕО ІЮ МО: 75); СОКа2 легкого ланцюга, що містить БАБУКУ5 (5ЕО І
МО: 76); і СОКЗ легкого ланцюга, що містить ФООММОМРМУТ (5ЕО ІЮО МО: 77).
У певних варіантах втілення поліпептиди по винаходу є повнорозмірним антитілом або антигензв'язуючими фрагментами. У певних варіантах втілення антитіла або антигензв'язуючі фрагменти є Раб, Раб, Е(ав)2, га, одноланцюговим Ем або 5сЕм, дисульфідно-зв'язаним Ем,
доменом М-МАК, Ідмаг, інтратілом, ІДОДСНАа, мінітілом, Е(ар)З3, тетратілом, триатілом, діатілом, однодоменним антитілом, ОМО-Ід, Есаб, тАб2, (5сЕм)2 або зсЕгм-Ес..
У певних варіантах втілення антитіло або поліпептид згідно з винаходом зв'язуються з людським рецептором фолієвої кислоти 1 з Ка від приблизно 1,0 до приблизно 10 нМ. В одному варіанті втілення антитіло або поліпептид згідно з винаходом зв'язуються 3 людським рецептором фолієвої кислоти 1 з Ка приблизно 1,0 нМ або краще. У певному варіанті втілення зв'язуючу здатність вимірюють способом проточної цитометрії, Віасоге або радіоімунологічним аналізом.
У винаході також пропонується спосіб одержання антитіла згідно з винаходом, який полягає в культивуванні клітини, що експресує зазначене антитіло; і (б) виділенні антитіла із зазначеної культивованої клітини. У певному варіанті втілення клітина є еукаріотною клітиною.
У винаході також пропонується імунокон'югат з формулою (А)-(І)-(С), де: (А) - антитіло, антигензв'язуючий фрагмент або поліпептид згідно з винаходом, (1) - лінкер, і (С) - цитотоксичний агент, причому згаданий лінкер (І) з'єднує (А) з (С).
В одному варіанті втілення лінкер вибраний з групи, що складається з розщеплюваного лінкера, нерозщеплюваного лінкера, гідрофільного лінкера і лінкера на основі двохосновної карбонової кислоти. У ще одному варіанті втілення лінкер вибраний із групи, яка складається з:
М-сукцинімідил. 4-(2-піридилдитіо)упентаноату (ЗРР) або М-сукцинімідил 4-(2-піридилдитіо)-2- сульфопентаноату (5йМОо-5РР), М-сукцинімідил. 4-(2-піридилдитіо)бутаноату (ЗРОВ) або М- сукцинімідил 4-(2-піридилдитіо)-2-сульфобутаноату (5ийо-5РОВ), М-сукцинімідил 4- (малеімідометил) циклогексанкарбоксилату (ЗМОС), М-сульфосукцинімідил 4-(малеімідометил) циклогексанкарбоксилату (виИтОо5МСС), М-сукцинімідил-4-(йодацетил)-амінобензоату (БІАВ) і М- сукцинімідил-((М-малеімідопропіонамідо)-тетраєтиленгліколевого| ефіру (МНЗ-РЕСЯ4-малеіміду).
В певному варіанті втілення лінкер являє собою М-сукцинімідил-((М-малеімідопропіонамідо)- тетраетиленгліколевий| ефір (МНЗ-РЕС 4-малеімід).
В одному варіанті втілення імунокон'югати містять цитотоксичний агент, який вибраний із групи, що складається з майтансиноїду, аналога майтансиноїду, бензодіазепіну, таксоїду, СС- 1065, аналога СС-1065, дуокарміцину, аналога дуокарміцину, каліхеаміцину, доластатину, аналога доластатину, ауристатину, похідного томаіїміцину і похідного лептоміцину або
Зо пролікарської форми агента. У ще одному варіанті втілення цитотоксичний агент є майтансиноїдом. В іншому варіанті втілення цитотоксичний агент може бути М(2)-деацетил-
М(23-(З-меркапто-1-оксопропіл)у-майтансином або М(23-деацетил-М2-(4-меркапто-4-метил-1- оксопентил)-майтансином.
В одному варіанті втілення у винаході пропонується імунокон'югат, що містить: (А) гуманізоване антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ
МО: 4 і варіабельний домен легкого ланцюга з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 10 або ЗЕО ІЮ МО: 11; (3 0/0 М-сукцинімідил-(М-малеімідопропіонамідо)-тетраетиленгліколевий| ефір (МН5О-РЕС4- малеїіміду); і (С) М(2-деацетил-М2-(4-меркапто-4-метил-1-оксопентил)-майтансин; де (І) зв'язує (А) і (С).
В одному варіанті втілення у винаході пропонується імунокон'югат, що містить: (А) гуманізоване антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга з послідовністю ЗЕО ІЮ
МО: 4 і варіабельний домен легкого ланцюга з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 10 або ЗЕО ІЮ МО: 11; ()9 (3) М-сукцинімідил 4-(2-піридилдитіо)бутаноат (5РОВ); і (С) М(2-деацетил-М2-(4-меркапто-4- метил-1-оксопентил)-майтансин; де (І) зв'язує (А) і (С).
В одному варіанті втілення у винаході пропонується імунокон'югат, що містить: (А) гуманізоване антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ
МО: 4 і варіабельний домен легкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 10 або 5ЕО ІО МО: 11(у) М-сукцинімідил 4-(2-піридилдитіо)2-сульфобутаноат (зиМо-5РОВ); і (С) М(2-деацетил-М2- (4-меркапто-4-метил-1-оксопентил)-майтансин; де (І) зв'язує (А) і (С).
В одному варіанті втілення у винаході пропонується імунокон'югат, що містить: (А) гуманізоване антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ
МО: 4 і варіабельний домен легкого ланцюга з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 10 або ЗЕО ІЮ МО: 11; (у М-сукцинімідил 4-(2-піридилдитіо)-2-сульфопентаноат (зиМо-5РР); і (С) М(2-деацетил-М(2- (З-меркапто-1-оксопропіл)-майтансин; де (І) зв'язує (А) і (С).
В одному варіанті втілення у винаході пропонується імунокон'югат, що містить: (А) гуманізоване антитіло, що містить варіабельний домен важкого ланцюга з послідовністю ЗЕО ІЮ
МО: 4 і варіабельний домен легкого ланцюга з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 10 або ЗЕО ІЮ МО: 11; (у) М-сукцинімідил 4-(2-піридилдитіо)пентаноат (РР); і (С) М(2')-деацетил-М(2")-(З-меркапто-1- оксопропіл)-майтансин; де (І) зв'язує (А) і (С).
У винаході також пропонується фармацевтична композиція, що містить антитіло, антигензв'язуючий фрагмент, поліпептид або імунокон'югат, згідно 3 винаходом, (і фармацевтично прийнятний носій. У певному варіанті втілення фармацевтична композиція, крім цього, містить другий протипухлинний агент.
У винаході також пропонується діагностичний реактив, що містить мічені антитіло, антигензв'язуючий фрагмент, поліпептид або імунокон'югат згідно з винаходом. В одному варіанті втілення мітка вибрана із групи, що складається з радіомітки, флуорофору, хромофору, візуалізуючого засобу й іона металу.
У винаході також пропонується набір, що містить антитіло, антигензв'язуючий фрагмент, поліпептид або імунокон'югат згідно з винаходом.
У винаході також пропонується спосіб інгібування росту пухлини в суб'єкта, що включає введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості антитіла, антигензв'язуючого фрагмента, поліпептиду, імунокон'югата або фармацевтичної композиції згідно з винаходом. У певному варіанті втілення у винаході пропонується спосіб інгібування росту пухлини у суб'єкта, що включає введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості імунокон'югата з формулою (А)- ()-(С), де: (А) - антитіло або антигензв'язуючий фрагмент, які специфічно зв'язуються з людським рецептором фолієвої кислоти 1; (І) - лінкер; ії (С) - цитотоксин, вибраний із групи, що складається з майтансиноїду і аналога майтансиноїду; причому лінкер (І) з'єднує (А) з (С), а імунокон'югат зменшує середній об'єм пухлини на моделі ксенотрансплантата КВ щонайменше удвічі. У певному варіанті втілення спосіб включає введення антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, що містять (а) СОКІ1 важкого ланцюга, що містить ЗМЕММ (ЗЕО
ІО МО: 1); СОК2 важкого ланцюга, що містить ВІНРУРИОТЕУМОХ аа! ЕХаагХааз (5ЕО ІО МО: 56); і СОКЗ важкого ланцюга, що містить ХОСЗКАМОМ (ЗЕБЕО ІЮ МО: 3); і (б) СОР1 легкого ланцюга, що містить КАБОБМ5ЕАСТБІ МН (ЗЕО ІО МО: 7); СОК2 легкого ланцюга, що містить
ЕА5БМІ ЕА (ЗЕО ІО МО: 8); СОКЗ легкого ланцюга, що містить ООБКЕМРУТ (5ЕО ІЮ МО: 9); де
Хаа!1 вибраний з К, С), Н і Е; Хаа2 вибраний з СО, Н, М і Е; і ХааЗ вибраний з С, Е, Т, 5, А ЇМ. У ще одному варіанті втілення антитіло містить послідовність СОК2 важкого ланцюга, що містить
ВІНРУВаОЮТтТЕММОКРОа (5ЕО ІО МО: 2).
У певному варіанті втілення у винаході пропонується спосіб інгібування росту пухлини, що містить введення антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, кодованого плазмідною
ДНК, депонованою в АТСС 7 квітня 2010 під номерами депонентів АТСС РТА-10772 і РТА-10773 або 10774.
В іншому варіанті втілення в способі пропонується введення імунокон'югата, що містить гуманізоване антитіло, яке містить варіабельний домен важкого ланцюга з послідовністю 5ЕО
ІО МО: 4 і варіабельний домен легкого ланцюга з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 10 або 5ЕО ІЮ МО: 11; (у) М-сукцинімідил-(М-малеімідопропіонамідо)-тетраетиленгліколевий| ефір (МН5-РЕС4- малеїіміду); і (С) М(2-деацетил-М2-(4-меркапто-4-метил-1-оксопентил)-майтансин.
В іншому варіанті втілення в способі пропонується введення імунокон'югата, що містить (А) гуманізоване антитіло, яке містить варіабельний домен важкого ланцюга з послідовністю 5ЕО
ІО МО: 4 і варіабельний домен легкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 10 або 5ЕО ІО МО: 11; (у) М-сукцинімідил 4-(2-піридилдитіо)бутаноат (5РОВ); і (С) М(2-деацетил-М2-(4-меркапто-4- метил-1-оксопентил)-майтансин;; де (І) зв'язує (А) і (С).
В іншому варіанті втілення в способі пропонується введення імунокон'югата, що містить (А) гуманізоване антитіло, яке містить варіабельний домен важкого ланцюга з послідовністю 5ЕО
ІО МО: 4 і варіабельний домен легкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 10 або 5ЕО ІО МО: 11; (у) М-сукцинімідил 4-(2-піридилдитіо)2-сульфобутаноат (зипо-5РОВ); і (С) М(2-деацетил-М2- (4-меркапто-4-метил-1-оксопентил)-майтансин; де (І) зв'язує (А) і (С).
В іншому варіанті втілення в способі пропонується введення імунокон'югата, що містить (А) гуманізоване антитіло, яке містить варіабельний домен важкого ланцюга з послідовністю 5ЕО
БО ІО МО: 4 і варіабельний домен легкого ланцюга з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 10 або 5ЕО ІЮ МО: 11; (у) М-сукцинімідил 4-(2-піридилдитіо)-2-сульфопентаноат (5йПо-5РР); і (С) М(2-деацетил-
М(23-(З-меркапто-1-оксопропіл)-майтансин; де (І) зв'язує (А) і (С).
В іншому варіанті втілення в способі пропонується введення імунокон'югата, що містить (А) гуманізоване антитіло, яке містить варіабельний домен важкого ланцюга з послідовністю 5ЕО
ІО МО: 4 і варіабельний домен легкого ланцюга з послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 10 або 5ЕО ІО МО: 11; () М-сукцинімідил 4-(2-піридилдитіо)пентаноат (РР); і (С) М(2-деацетил-М(23-(З-меркапто- 1-оксопропіл)-майтансин; де (І) зв'язує (А) і (С).
В іншому варіанті втілення спосіб включає введення імунокон'югата, що містить антитіло
ПиЕВ-1-21, депоноване в АТСС 7 квітня 2010 під номерами депонентів АТСС РТА-10775 і РТА- бо 10776. У певному варіанті втілення антитіло пиЕК-1-21 включає (а) СОКІ важкого ланцюга, що містить Б5УСМ5 (ЗЕБО ІЮ МО: 30); СОК2 важкого ланцюга, що містить ТІБ5ОСЗУТУ (5ЕО 10
МО: 31); і СОКЗ важкого ланцюга, що містить ОСЕССІ МАМОМ (ЗЕБЕО ІЮО МО: 32); і (6) СОК!1 легкого ланцюга, що містить КАБОНІММУМА (5БО ІЮ МО: 27); СОК2 легкого ланцюга, утримуючу САТ5БІ ЕТ (5ЕО ІЮ МО: 28); і СОКЗ легкого ланцюга, що містить ОО'УМ/ЗТРЕТ (5ЕО
ІО МО: 29). У певних варіантах втілення спосіб включає введення імунокон'югата, що містить антитіло, що є антитілом пПиРК1-48, яке містить: (ай СОКІ важкого ланцюга, що містить
ТМУМУМО (5ЕО ІЮ МО: 60); СОК2 важкого ланцюга, що містить АЇМРОМООБЗК (5ЕО ІО МО: 61); і
СОМЗ важкого ланцюга, що містить КОСМУААМ (ЗЕО ІЮО МО: 62); і (6) СОМК1 легкого ланцюга, що містить КАЗБЕМІУЗМІ А (5ЕО ІЮ МО: 57); СОК2 легкого ланцюга, що містить ААТМІГАО (ЗЕО
ІЮО МО: 58); ії СОКЗ легкого ланцюга, що містить ОНЕУМАБРУТ (З5ЕБО ІО МО: 59). У певних варіантах втілення спосіб включає введення імунокон'югата, що містить антитіло, що є антитілом пиЕК1-49, яке містить: (а) СОКІ1 важкого ланцюга, що містить ТМ'ЄМ/МУ (5ЕО ІЮ МО: 66); СОК2 важкого ланцюга, що містить АЇІМРОМ5ОТТ (5ЕО ІЮО МО: 67); і СОКЗ важкого ланцюга, що містить КЕНОМСАМОМ (5ЕБО І МО: 68); і (6) СОКІ! легкого ланцюга, що містить
КАБЕМІУТМГА (5ЕО ІЮ МО: 63); СОК2 легкого ланцюга, що містить ТАБМІ АЮ (5ЕО ІЮО МО: 64); і
СОКЗ легкого ланцюга, що містить ОНЕМУМЗРУТ (5ЕО ІЮ МО: 65). У певних варіантах втілення спосіб включає введення імунокон'югата, що містить антитіло, що є антитілом пиЕМК1-57, яке містить: (ад СОКІ важкого ланцюга, що містить 55ЕОМН (5ЕБЕО ІЮО МО: 72); СОМК2 важкого ланцюга, що містить МІ550555115 (5БО ІЮ МО: 73); і СОКЗ важкого ланцюга, що містить
ЕАУО5ЗМЕМ (5ЕО ІЮ МО: 74); і (б) СОКІ1 легкого ланцюга, що містить КАБОМІМММІ-Н (ЗЕО ІЮ
МО: 69); СОК2 легкого ланцюга, що містить УУ5ОБМ5 (ЗЕО ІЮО МО: 70); ії СОКЗ легкого ланцюга, що містить ООБМЗУМРНМУТ (ЗЕО ІЮ МО: 71). У певних варіантах втілення спосіб включає введення імунокон'югата, що містить антитіло, що є антитілом пиЕК 1-65, яке містить: (а) СОКІ1 важкого ланцюга, що містить Т2УТМН (5ЕО ІЮ МО: 78); СОК2 важкого ланцюга, що містить
МІМРІБОМУТМ (5ЕО ІЮО МО: 79); і СОКЗ важкого ланцюга, що містить ОБСАУОККРМОУ (5ЕО ІЮ
МО: 80); і (6) СОКІ легкого ланцюга, що містить КАБОММОРММА (ЗЕО ІЮ МО: 75); СОК2 легкого ланцюга, що містить ЗБАБУКУЗ (5БО ІЮО МО: 76); їі СОМКЗ легкого ланцюга, що містить
ОООММ5УРМУТ (5ЕО ІО МО: 77).
В одному варіанті втілення спосіб інгібує ріст пухлини яєчника, пухлини мозку, пухлини молочної залози, пухлини матки, пухлини ендометрія, пухлини підшлункової залози, пухлини нирки або пухлини легенів. У певному варіанті втілення спосіб інгібує ріст пухлини яєчника. В іншому варіанті втілення, згідно з винаходом, відбувається інгібування росту пухлини легенів. У певному варіанті втілення інгібування росту пухлини використовується для лікування онкологічного захворювання. У ще одному варіанті втілення спосіб містить введення другого протипухлинного препарату суб'єкту. У певному варіанті втілення другий протипухлинний агент є хіміотерапевтичним агентом.
У винаході також пропонується ізольована клітина, яка продукує антитіло, антигензв'язуючий фрагмент або поліпептид згідно з винаходом.
У винаході також пропонується ізольований полінуклеотид, що містить послідовність, щонайменше на 90 95 ідентичну послідовності, вибраній із групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО5: 5, 14, 15, 37, 38, 43, 44, А7, 48 ії 120-127. У певному варіанті втілення ізольований полінуклеотид щонайменше на 95 95 ідентичний послідовності, вибраній із групи, що складається з ЗЕО ІЮ
МО5: 5, 14, 15, 37, 38, 43, 44, 47, 48 і 120-127. В іншому варіанті втілення ізольований полінуклеотид щонайменше на 99595 ідентичний послідовності, вибраній із групи, що складається з 5ЕО ІЮ МоО5: 5, 14, 15, 37, 38, 43, 44, 47, 48 ії 120-127. У винаході також пропонується вектор, що містить будь-який полінуклеотид з 5ЕО ІЮ МО5: 5, 14, 15, 37, 38, 43, 44, 47, 48 і 120-127. В іншому варіанті втілення у винаході пропонується клітина-хазяїн, що містить вектор, що включає полінуклеотид з БЕО ІЮО МО: 5, 14, 15, 37, 38, 43, 44, А7, 48 і 120- 127.
Короткий опис креслень
Фігура 1. Поверхневі залишки мишачого (тиМом19) і гуманізованого (пиМом19) Мом'19. (А)
Поверхневі залишки легкого ланцюга мишачого і гуманізованого Мом19. Представлені поверхневі варіабельні залишки каркасного регіону легких ланцюгів мишачого і гуманізованого
Мом19, і номер позиції (система Кара). Людські залишки, які відрізняються від оригінальних мишачих послідовностей підкреслені. "Положення 74 не є поверхневим положенням, але для того, щоб позбутися консенсусного М-зв'язаного сайту глікозилювання у версії 1.00, це положення було замінено на Треонін (найчастіший людський залишок у цьому положенні), в результаті чого була одержана версія 1.60. (В) Поверхневі залишки важких ланцюгів мишачого й людського Мом19. Представлені поверхневі варіабельні залишки важких ланцюгів каркасного бо регіону мишачого й гуманізованого Мом19 і номер позиції (система Кара). Людські залишки, що відрізняються від вихідних мишачих послідовностей, підкреслені. Аналогічні поверхневі залишки представлені для ЕК1-21 (С) і (0).
Фігура 2. Вирівнювання варіабельних доменів важкого і легкого ланцюгів химерного Мом19 і пиМом19 і варіабельних доменів важкого і легкого ланцюгів тиЕВ1-21 ії пШЕВ1-21. Вирівнювання перебудованих послідовностей варіабельних регіонів Мом19 і Ег1-21 з їх мишачими еквівалентами. А) і С) варіабельні домени легкого ланцюга; В) і Ю) варіабельний домен важкого ланцюга. Рисками "-" показані ідентичні з мишачою послідовністю залишки. Регіони, що визначають комплементарність (визначення Кабаї) підкреслені.
Фігура 3. Експресія химерного Мом19 і пиМом19 у клітинах НЕК. Плазміди експресії химерного і людського Мом19 були транзієнтно трансфіковані в суспензію клітин НЕК293-Т, зібрані через 7 днів, експресоване антитіло було визначено способом кількісного ІФА. Плазміди легкого ланцюга і важкого ланцюга були трансфіковані в співвідношенні або 3:1, або 6:1, відповідно.
Фігура 4. Специфічність зв'язування антитіл проти БОЇ КІ, визначена за їх зв'язуванням з клітинами 300-19, що експресують РОЇК 1. Зв'язування пиМом19 із клітинами 300-19-ЕОЇ В1 відповідно до проточної цитометрії. Батьківські клітини 300-19, що експресують ЕГО К-1.
Суцільне сіре заливання показує клітинну власну флуоресценцію; чорні пунктирні лінії показують клітини, інкубовані із вторинним анти-людським антитілом, кон'югованим з РІТС; чорні суцільні лінії показують клітини, інкубовані з антитілом пиМом-19 і вторинним анти- людським антитілом, кон'югованим з РІТС.
Фігура 5. Зв'язуюча здатність і цитотоксична активність іп міго антитіл проти ЕГОГК1 і імунокон'югатів. Зв'язуюча здатність пиМом19 і різних мишачих і гуманізованих антитіл ЕК-1 була визначена на клітинах 5КОМ3. Також вимірювалась цитотоксична активність іп міго кон'югатів РЕС4-Ма!-ОМА з перерахованими антитілами.
Фігура 6. Антитіло-залежна клітинна цитотоксичність імунокон'югатів. АЗКЦ-активність пиМом19, пиЕВ1-21 і Мог0О03 визначалася на клітинах Ідгом1. Ідгом 1 були інкубовані при 15000 клітин/ямку зі співвідношенням клітин-мішеней: НК-клітин 1:4.
Фігура 7. Цитотоксична активність при тривалому експонуванні пиЕК1-21-РЕС4-та!-ОМА і пиМом19-РЕСІ4-таІ-ОМ4 она клітини КВ. Надлишок некон'югованих антитіл пригнічував
Зо активність імунокон'югатів при їх спільному інкубуванні в присутності клітин КВ, що свідчить про антиген-залежний характер цитотоксичної активності.
Фігура 8. Ефективність іп мімо кон'югатів, націлених на пПиМомі9 у моделі ксенотрансплантата КВ. На встановленій ксенотрансплантатній моделі клітин КВ, імплантованих підшкірно мишам з ТКІН, були протестовані РОЇ ЕЕ 1-націленний, розщеплюваний кон'югат пПимМом19-5РОВ-ОМА (В) у порівнянні з ненаціленим на БОЇ КТ пис242-5Р08-ОМА (0), а, що також нерозщеплюваний кон'югат пиМом19-РЕС4-Ма!-ОМА (С) в порівнянні з ненаціленим пис242-РЕСЯМаї!-ОМА (Е). Націлювання РОЇ К1 на пиМом19 приводило до істотного зменшення середнього об'єму пухлини.
Фігура 9. Ефективність іп мімо пимМом19-РЕС4-Ма!-ОМА у порівнянні з мишачими антитілами проти РОЇ К1 ЕК-1 у моделі ксенотрансплантата КВ. Серія антитіл ЕК-1, як некон'югованих, так і кон'югованих з РЕСЯ-МаІ-ЮОМ4, була протестована на здатність знижувати середній об'єм пухлини в порівнянні з пПимМом19-РЕС4-Ма!-ОМА у моделі ксенотрансплантатної пухлини КВ. (А)
ЕВ-1-9, (В) ЕВ-1-13, (С) ЕВ-1-22 ї (Б) ЕК-1-23.
Фігура 10. Ефективність іп мімо кон'югатів пиМом19-РЕС4-Ма!І-ОМА ії пиЕК1-21-РЕС4-Маї!-
ОМА у моделі ксенотрансплантата КВ. На 6 день після інокуляції проводились однократні ін'єкції по 10 мг/кг пиМом19-РЕС4-МаІ-ОМА4 ії пиЕК1-21-РЕС4-МаІ-ОМ4. І пиМом19-РЕС4-Ма!-ОМА, і пиЕВ1-21-РЕС4-МаІ-0ОМ4 приводили до істотного зменшення середнього об'єму пухлини. "Середній ОП" позначає середній об'єм пухлини.
Фігура 11. НиМом19-РЕСЯ4-таІ-0ОМ4 проявляє залежну від дози активність у моделі ксенотрансплантата КВ. Залежна від дози активність імунокон'югата оцінювалась для інтервалу перевірених доз. При введенні раз на тиждень спостерігалось підвищення протипухлинної активності. Високі навантаження препарату лише незначною мірою підвищували активність у групах дозування 10 мг/кг, у групах менших дозувань активність знижувалась. 3,7 АК означає 3,7 молекул препарату на антитіло.
Фігура 12. Ефективність іп мімо пиМом19, кон'югованого з ОМІ і ОМА через різні лінкери. пиМом19 було кон'юговане з ЗМСС-ОМІ при 3,9 молекул препарату на антитіло; зийо-таІ-ОМА - при 3,7 молекул препарату на антитіло (В), а зийо-таІ-ОМА - при 8,23 молекул препарату на антитіло (С), потім була досліджена їх здатність знижувати середній об'єм пухлини при різних концентраціях у порівнянні з пПиИмМом19-РЕСІ4-та!-ОМА.
Фігура 13. Ефективність іп мімо пиМом19, кон'югованого з ОМІ1 ії ОМА через різні лінкери. пиМом19 було кон'юговане з 5РР-ОМІ при 4,3 молекул препарату на антитіло; зхито-5РОВ-ОМА - при 3,8 молекул препарату на антитіло, а 5РОВ-ОМА - при 3,8 молекул препарату на антитіло, і з ЗХиМо-5РОВ-ОМА - при 6,8 молекул препарату на антитіло; потім була досліджена їх здатність знижувати середній об'єм пухлини. Миші одержували по 5 мг/кг (А) їі 2,5 мг/кг (В) одного з кон'югатів, наведених вище, або тільки фосфатно-сольовий буфер.
Фігура 14. Ефективність іп мімо пиМом19-5ийто-5РОВ-ОМА4 у моделі ксенотрансплантатної пухлини ОМСАК-3. Миші одержували по 25, 50 або 100 мкг/кг пиМом19-5000-5РОВ-ОМА4 або тільки фосфатно-сольовий буфер.
Фігура 15. Ефективність іп мімо пиМом19-5ийто-5РОВ-ОМА4 у моделі ксенотрансплантатної пухлини ІЇЗКОМ-1. Миші одержували по 25, 50 або 100 мкг/кг пПиМом19-50йо-5РОВ-ОМА4 або тільки фосфатно-сольовий буфер.
Фігура 16. Ефективність іп мімо пиМом19-5ийто-5РОВ-ОМА4 у моделі ксенотрансплантатної пухлини 0-90. Миші одержували по 25, 50 або 100 мкг/кг пимМом19-зийто-5РОВ-ЮОМА або тільки фосфатно-сольовий буфер.
Фігура 17. Вплив розщеплюваних і нерозщеплюваних лінкервв на ефективність імунокон'югатів в в ксенотрансплантатних моделях КВ.
Фігура 18. Вплив розщеплюваних лінкерів на ефективність імунокон'югатів в (А) ксенотрансплантатній моделі КВ, (В) ксенотрансплантатній моделі ОМСАК-3.
Фігура 19. Ефективність іп міо і іп мімо пчЕК1-48, пШЕВ1-49, пиЕВ1-57 ії пиЕК1-65-5МО0-
ОМ! у ксенотрансплантатних моделях пухлини КВ. Миші одержували 200 мкг/кг однократно.
Детальний опис винаходу
У даному винаході пропонуються нові агенти, включаючи такі поліпептиди як антитіла й імуноглобуліни, які з'єднуються з людським рецептором фолієвої кислоти 1 (БОЇ МК1), не обмежуючись перерахованим. Також пропонуються споріднені поліпептиди і полінуклеотиди, композиції, що містять РОЇК 1-зв'язуючі агенти, і способи одержання РОЇК 1-зв'язуючих агентів. Крім цього, пропонуються способи використання нових ЕОЇ К 1-зв'язуючих агентів, такі як способи інгібування пухлинного росту і/або лікування онкологічного захворювання.
І. Визначення
Зо Для полегшення розуміння даного винаходу нижче дані визначення ряду термінів і оборотів.
Терміни "людський рецептор фолієвої кислоти 1" або "БОЇ МК1" при використанні тут відносяться до будь-якого нативного людського БОЇ МК1, якщо не зазначене інше. Термін "РОКІ" охоплює "повнорозмірний" непроцесований РОЇ КІ, а також будь-яку форму ЕОЇ МК, що виходить при процесингу в клітині. Термін також охоплює природні варіанти БОЇ КІ, наприклад, сплайс-варіанти, алельні варіанти й ізоформи. Поліпептиди ЕГОЇ КІ, описані тут, можуть бути виділені з великої кількості джерел, наприклад, з тканин людини або з інших джерел, або можуть бути одержані рекомбінантними або синтетичними способами. Прикладами послідовностей РОЇ К1 служать, не обмежуючись перерахованим, ідентифікаційні номери МСВІ
РІ5328, МР 001092242.1, ААХ29268.1, ДААХЗ7119.1, МР 05793711 МР 0579361.
Термін "антитіло" означає молекулу імуноглобуліну, яка розпізнає і специфічно зв'язується з мішенню, наприклад, білком, поліпептидом, пептидом, вуглеводом, полінуклеотидом, ліпідом або комбінацією перерахованого, через щонайменше один сайт розпізнавання антигену у варіабельному регіоні молекули імуноглобуліну. При використанні тут термін "антитіло" охоплює незмінені поліклональні антитіла, незмінені моноклональні антитіла, фрагменти антитіл (наприклад, фрагменти Бар, Раб, Б(авБ)2 і Рм), одноланцюгові мутанти м (5сгм), мультиспецифічні антитіла, наприклад, біспецифічні антитіла, одержані щонайменше із двох незмінених антитіл, химерні антитіла, гуманізовані антитіла, людські антитіла, злиті білки, що містять антиген-визначальну частину антитіла, і інші модифіковані молекули імуноглобулінів, що містять антигенрозпізнавальний сайт, за умови прояву антитілами бажаної біологічної активності. Антитіло може належати до одного з п'яти основних класів імуноглобулінів: ІдА, дО,
ІЧЕ, до і ДМ або їх підкласів (ізотипів) (наприклад, Ідс1, Іде2, дез, Іде, ІДА1 і ІдАг), залежно від типу константних доменів важкого ланцюга, називаних альфа, дельта, епсилон, гама і мю, відповідно. Різні класи імуноглобулінів мають різні і добре відомі структури субодиниць і тривимірні конфігурації. Антитіла можуть бути вільними або кон'югованими з іншими молекулами, наприклад, токсинами, радіоізотопами і т.д. "Блокувальне" антитіло або "антитіло-антагоніст" являє собою антитіло, яке інгібує або зменшує біологічну активність антигену, який воно зв'язує, наприклад, БОЇК1І. У деяких варіантах втілення блокувальні антитіла або антитіла-антагоністи частково або повністю інгібують біологічну активність антигену. Бажано, щоб біологічна активність була зменшена на
Гс10) 10 то, 20 то, Зо то, 50 то, 70 то, 80 то, 90 то, 95 95 або навіть на 100 95.
Терміни "антитіло проти БОЇ КІ" або "антитіло, яке зв'язується з РОЇКІ1" стосуються антитіла, яке здатне зв'язувати БОЇ К1з афінністю, достатньою для застосування антитіла в діагностичних або терапевтичних цілях у відношенні РОЇ К1. Зайве зв'язування антитіла проти
ЕОЇКІ1з невідповідним білком, що не є БОЇК1, становить менше ніж приблизно 10 95 від зв'язування антитіла з РОЇ К1 згідно з даними, наприклад, радіоімунологічного аналізу (РІА). У певних варіантах втілення антитіло, яке зв'язується з БОЇ К1, має константу дисоціації (Ка)х1
МКМ, «100 НМ, «10 НМ, «1 нМ або х0,1 НМ.
Термін "фрагмент антитіла" стосується частини незміненого антитіла і стосується антигенвизначальних варіабельних регіонів інтактного антитіла. Прикладами фрагментів антитіл служать, не обмежуючись перерахованим, фрагменти Рар, Рар', Е(аб)2 їі Гм, лінійні антитіла, одноланцюгові антитіла, мультиспецифічні антитіла, утворені із фрагментів антитіл. "Моноклональне антитіло" стосується гомогенної популяції антитіл, залученої у високоспецифічне розпізнавання і зв'язування однієї антигенної детермінанти - епітопу. Цим вони відрізняються від поліклональних антитіл, які звичайно включають різні антитіла, спрямовані проти різних антигенних детермінант. Термін "моноклональне антитіло" охоплює незмінені повнорозмірні антитіла, а також фрагменти антитіл (наприклад, фрагменти Раб, Раб",
Кар)2 ї Ем), одноланцюгові мутанти (5СЕм), злиті білки, що містять частину антитіла і інші модифіковані молекули імуноглобулінів, що містять сайт, який розпізнає антиген. Крім того, "моноклональне антитіло" стосується таких антитіл, виготовлених за допомогою будь-якої кількісті способів, включаючи, але не обмежуючись перерахованим, використання гібридом, фагової селекції, рекомбінантної експресії і трансгенних тварин.
Термін "гуманізоване антитіло" стосується форм нелюдських (наприклад, мишачих) антитіл, що є специфічними імуноглобуліновими ланцюгами, химерними імуноглобулінами або їх фрагментами, які містять мінімальні нелюдські (наприклад, мишачі) послідовності. Як правило, гуманізовані антитіла є людськими імуноглобулінами, у яких залишки із регіону, що визначає комплементарність (СОК) замінені на залишки СОК нелюдського виду (наприклад, миші, щура, кролика, хом'ячка), що мають бажані специфічнісь, афінність, здатність (допеб еї аї., 1986,
Маїшге, 321:522-525; Віеснтапп еї а!., 1988, Маїшге, 332:323-327; Метоеуеп еї а!., 1988, Зсієпсе, 239:1534-1536). У деяких випадках залишки Ем-каркасного регіону (ЕК) людського імуноглобуліну замінені на відповідні залишки антитіла нелюдського виду, які мають бажану специфічність, афінність і здатність. Гуманізоване антитіло може бути далі модифіковане заміщенням додаткових залишків в Ем-каркасному регіоні або в замінюваних нелюдських залишках для покращення і оптимізації специфічності, афінності і/або здатності антитіла.
Загалом гуманізоване антитіло містить всі з щонайменше одного, а як правило - двох або трьох варіабельних доменів, які містять всі або практично всі СОБК-регіони, що відповідають нелюдському імуноглобуліну, в яких практично всі з ЕК-регіонів походять від людської консенсусної послідовності імуноглобуліну. Гуманізоване антитіло також може містити щонайменше частину константного регіону або домену імуноглобуліну (Ес), як правило, людського імуноглобуліну. Приклади і способи одержання гуманізованих антитіл описані в патентах США 5225539 або 5639641. "Варіабельний регіон" антитіла стосується варіабельного регіону легкого ланцюга антитіла або до варіабельного регіону важкого ланцюга, окремо або в комбінації. Варіабельні регіони важкго і легкого ланцюгів складаються із чотирьох каркасних регіонів (ЕК), з'єднаних трьома регіонами, що визначають комплементарність (СОК), також відомими як гіперваріабельні регіони. Регіони, що визначають комплементарність, у кожному ланцюзі тримаються близько з каркасними регіонами і з регіонами, що визначають комплементарність іншого ланцюга, утворюючи антигензв'язуючий сайт антитіла Відомо щонайменше дві техніки визначення СОБК: (1) підхід, заснований на перехресно-видовій варіабельності послідовностей (наприклад, Кабаї еї ам. Зедоепсез ої Ргоївїп5 ої Іттипоіодісаї! Іпієгеві, (Бій ей., 1991, Маїйопаї! Іпзійшев ої Неапцй,
ВеїШпезаа Ма.)); і (2) підхід, заснований на кристалографічному дослідженні комплексів антиген- антитіло (АІ-ІагіКапі еї а! (1997) У. Моїес. Віої. 273:927-948)). Крім цього, для визначення СОК у даній галузі техніки іноді ці підходи застосовуються в комбінації.
Система нумерації Караї, як правило, використовується для позначення залишку у варіабельному домені (приблизно залишки 1-107 легкого ланцюга і залишки 1-113 важкого ланцюга) (наприклад, Кабаї еї а)., б5едоепсев ої Іттипоіодіса! Іпіегеві. Бій Ей. Рибіїс Неаїшт зЗегмісе, Майопаї Іпзійшез ої Неанй, Веїпезаа, Ма. (1991)).
Нумерація позицій амінокислот Кабвраї належить до системи нумерації, що використовується для варіабельних доменів важкого ланцюга або варіабельних доменів легкого ланцюга в огляді антитіл Кабаї єї аіІ., Зедоепсез ої Ргоївіп5 ої Іттипоїодісаї Іпіегеві, 5 Ей. Рибіїс Неакй зЗегмісе, бо Маїопаї! Іпзійшез ої Неайй, Віфезда, Мериленд. (1991). При використанні цієї системи нумерації актуальна лінійна амінокислотна послідовність може містити меншу кількість амінокислот або додаткові амінокислоти, що відповідає укорочуванню або впровадженню варіабельного домену в ЕК або в СОК. Наприклад, варіабельний домен важкого ланцюга може містити вставку однієї амінокислоти (залишок 52а згідно з Кара) після залишку 52 Н2 і впроваджені залишки (наприклад, залишки 82а, 8265 і 82с, і т.д., згідно з Кара) після 82 залишку ЕК. Нумерація залишків Караї може бути визначена для заданого антитіла шляхом вирівнювання послідовності в гомологічних ділянках з антитілом із "стандартною" нумерацією послідовності
Кабвраї. Система Споїйіа використовує замість цього розташування структурних петель (Споїпіа,
Ї езК У. Мої. Вісі. 196:901-917 (1987)). Кінець петлі Споїйіа СОВ-НІ по нумерації Кабаї відповідає
НЗ2-НЗ4, залежно від довжини петлі (тому що в системі нумерації Кабраї вставки розташовуються між НЗ5БА і НЗ5В; якщо З5А і 35В відсутні, петля закінчується на 32; якщо є присутнім тільки З5А, петля закінчується на 33; якщо присутні і З5А, і 358, петля закінчується на 34). Гіперваріабельні регіони АБМ представляють компроміс між СОК КаБбаї і структурними петлями СпоїПіа і використовуються ПЗ моделювання антитіл ОхТога МоїІесшаг"5 АВМ.
Термін "людське антитіло" означає антитіло, що продукується людиною, або антитіло з амінокислотною послідовністю, яка є відповідною до антитіла, що продукується людиною, виготовленому згідно з будь-якою технікою, відомою у даній галузі техніки. Це визначення людського антитіла включає незмінені або повнорозмірні антитіла, їх фрагменти і/або антитіла, що містять щонайменше один поліпептид людського важкого і/або легкого ланцюгів, наприклад, антитіло, що містить поліпептиди мишачого легкого ланцюга і людського важкого ланцюга.
Термін "химерні антитіла" стосується антитіл, у яких амінокислотна послідовність молекули імуноглобуліну походить від двох і більше видів. Як правило, варіабельні регіони легкого і важкого ланцюгів відповідають варіабельним регіонам антитіл, одержаних від одного виду ссавців (наприклад, миші, щура, кролика і т.д.), з бажаною специфічністю, афінністю і активністю, у той час як константні регіони є гомологічними послідовностям антитіл, одержаних від іншого виду (звичайно людини) для виключення формування імунної відповіді у цього виду.
Терміни "епітоп" або "антигенна детермінанта" використовуються тут як взаємозамінні й
Зо стосуються тієї частини антигену, яка може бути розпізнана і специфічно зв'язана з конкретним антитілом. Якщо антиген є поліпептидом, епітопи можуть бути утворені як послідовними амінокислотами, так і непослідовними, але розташованими поруч у третинній структурі білка.
Епітопи, утворені послідовними амінокислотами, як правило, зберігаються при денатурації білка, у той час як епітопи, що утворюються в третинній структурі білка, як правило, не зберігаються при денатурації білка. Епітоп, як правило, включає щонайменше 3, а частіше щонайменше 5 або 8-10 амінокислот в унікальній просторовій конформації. "Зв'язуюча здатність" взагалі стосується сумарної сили всіх нековалентних взаємодій між одиночним зв'язуючим сайтом молекули (наприклад, антитіла) і її партнером у зв'язуванні (наприклад, антигеном). Якщо не зазначене інше, при використанні тут, "зв'язуюча здатність" означає природну зв'язуючу здатність, що віддзеркалює 1:11 взаємодію між членами пари, що зв'язується (наприклад, антитіла і антигену). Афінність молекули Х до її партнера У може бути охарактеризована константою дисоціації (Ка). Афінність може бути виміряна звичайними способами, відомими в даній галузі техніки, включаючи ті, які описані тут. Низькоафінні антитіла, як правило, зв'язують антиген повільно і легко дисоціюють, у той час як високоафінні антитіла, як правило, швидко зв'язують антиген і залишаються зв'язаними довше. У даній галузі техніки відома велика кількість способів вимірювання зв'язуючої афінності, будь-який з яких може використовуватися для цілей даного винаходу. Специфічні ілюстративні варіанти втілення описані нижче.
Вислів "або краще", при використанні тут, стосується більш сильного зв'язування між молекулою і її партнером по зв'язуванню. "Або краще", при використанні тут, стосується більш сильного зв'язування, що характеризується меншим чисельним значенням величини Ка.
Наприклад, у антитіла, що має афінність до антигену "0,6 нМ або краще", афінність антитіла до антигену дорівнює «0,6 НМ, наприклад, 0,59 нМ, 0,58 нМ, 0,57 нМ або будь-якій величині, меншій ніж 0,6 нМ.
Фрази "практично однаковий" або "практично такий самий" при використанні тут означають значно високу міру подібності двох цифрових величин (як правило, однієї, що характеризує антитіло згідно з винаходом, і іншої, що характеризує референтне антитіло або антитіло порівняння), таку, що фахівець у даній галузі техніки буде вважати різницю між двома величинами малою або такою, що не має біологічного і/або статистичного значення в контексті біологічних характеристик, що вимірюються згаданими величинами (наприклад, Ка- величинами). Різниця між зазначеними двома величинами дорівнює менше ніж приблизно 50 95, менше ніж приблизно 40 95, менше ніж приблизно 30 95, менше ніж приблизно 20 95 або менше ніж приблизно 10 95 в порівнянні з величиною референтного антитіла або антитіла порівняння.
Поліпептид, антитіло, полінуклеотид, вектор, клітина або композиця, які "ізольовані" - це поліпептид, антитіло, полінуклеотид, вектор, клітина або композицяї, які знаходяться у формі, яка є невиявною в природі. Ізольовані поліпептиди, антитіла, полінуклеотиди, вектори, клітини або композиції включають ті, які були очищені настільки, що вони більше не присутні у формі, що виявляється в природі. У деяких варіантах втілення ізольовані антитіло, полінуклеотид, вектор, клітина або композиція є практично чистими.
При використанні тут термін "практично чистий" стосується матеріалу, який щонайменше на 50 95 чистий (тобто вільний від домішок), щонайменше на 90 95 чистий, щонайменше на 95 95 чистий, щонайменше на 98 95 чистий або щонайменше на 99 95 чистий.
Термін "імунокон'югат" або "кон'югат" при використанні тут, стосується сполуки або похідного, яке пов'язане з агентом, що з'єднується з клітиною (наприклад, з антитілом проти
ЕОЇ КІ або його фрагментом), і визначається загальною формулою: С-І-А, де С-цитотоксин,
Ї -«лінкер, А-:агент, що з'єднується з клітиною, або антитіло проти РОЇ К1 або його фрагмент.
Імунокон'югати також можуть бути визначені зворотною загальною формулою: А-1 -0. "Лінкер" являє собою будь-яку хімічну групу, яка може стабільно, ковалентно зв'язувати сполуку, як правило, препарат, наприклад, майтансиноїд, з агентом, що з'єднується з клітиною,
Зо наприклад антитілом проти РОЇ К1 або його фрагментом. Лінкери можуть бути чутливими або частково стійкими до кислотного розщеплення, світлового розщеплення, пептидазного розщеплення, естеразного розщеплення, розщеплення дисульфідних зв'язків в умовах, при яких сполука або антитіло залишаються активними. Відповідні лінкери добре відомі в даній галузі техніки і включають, наприклад, дисульфідні групи, тіоефірні групи, кислотолабільні групи, фотолабільні групи, пептидаза-лабільні групи і естераза-лабільні групи. Лінкери також включають заряджені лінкери і їх гідрофільні форми, як описано тут і відомо в даній галузі техніки.
Терміни "онкологічне захворювання" і "раковий" стосуються фізіологічного стану у ссавців або описують фізіологічний стан у ссавців, при якому популяція клітин характеризується нерегульованим клітинним ростом. Приклади онкологічних захворювань включають, не обмежуючись перерахованим, карциному, лімфому, бластому, саркому, лейкемію. Більш конкретними прикладами таких онкологічних захворювань служать сквамозно-клітинний рак, дрібноклітинний рак легенів, недрібноклітинний рак легенів аденокарцинома легенів, сквамозна карцинома легенів, рак очеревини, печінково-клітинний рак, рак шлунково-кишкового тракту, рак підшлункової залози, гліобластома, рак цервікального каналу, рак яєчника, рак печінки, рак сечового міхура, гепатома, рак молочної залози, рак товстого кишечнику, колоректальний рак, карцинома ендометрія або матки, карцинома слинної залози, рак нирки, рак печінки, рак передміхурової залози, рак вульви, рак щитовидної залози, карцинома печінки і різні типи пухлин голови й шиї. "Пухлина" і "новоутворення" стосуються будь-якої кількості тканини, що виникла внаслідок надлишкового клітинного росту або проліферації, як доброякісного (неракового), так і злоякісного (ракового), включаючи передраковв ураження.
Терміни "ракова клітина", "пухлинна клітина" і їх граматичні еквіваленти стосуються загальної популяції клітин, що походять від пухлинного або передракового ураження, які включають як непухлиногенні клітини, що містять популяцію пухлинних клітин, так і пухлиногенні стовбурові клітини (ракові стовбурові клітини). При використанні тут термін "пухлинна клітина" буде замінений на термін "непухлиногенний" у випадку позначення лише тих пухлинних клітин, які не можуть поновлюватись, щоб відрізняти їх від пухлинних клітин зі стовбурових ракових клітин.
Термін "суб'єкт" стосується будь-якої тварини (наприклад, до ссавця), включаючи, але не обмежуючись перерахованим, людей, нелюдиноподібних приматів, гризунів і т. ін., що є реципієнтом конкретного лікування. Як правило, терміни "суб'єкт" і "пацієнт" використовуються тут взаємозамінно відносно людського суб'єкта.
Введення "у комбінації з" одним і більш додаткових терапевтичних агентів включає одночасне (супутнє) і послідовне введення в будь-якому порядку.
Термін "фармацевтична композиція" стосується такої форми препарату, у якій ефективно проявляється біологічна активність активного інгредієнта і яка не містить додаткових компонентів з неприйнятною токсичністю у відношенні до суб'єкта, якому вводиться композиція.
Така композиція може бути стерильною. "Ефективна кількість" антитіла тут розуміється як кількість, достатня для досягнення потрібної мети. "Ефективна кількість" може бути визначена емпірично звичайним способом залежно від встановленої мети.
Термін "терапевтично ефективна кількість" стосується кількості антитіла або іншого препарату, ефективної для "лікування" захворювання або порушення у суб'єкта або ссавця. У випадку раку терапевтично ефективна кількість препарату може зменшувати кількість ракових клітин, зменшувати розмір пухлини, інгібувати (наприклад, певною мірою сповільнювати і, у деяких варіантах втілення, зупиняти) інфільтрацію ракових клітин у периферичні органі, інгібувати (наприклад, певною мірою сповільнювати і, у деяких варіантах втілення, зупиняти) метастазування пухлини, інгібувати певною мірою пухлинний ріст і/або послаблювати певною мірою один або більше симптомів, асоційованих з раком. Див. визначення терміна "лікування", наведене тут. У випадку, якщо препарат здатний запобігати росту і/або вбивати існуючі пухлинні клітини, він може бути цитостатичним і/або цитотоксичним. "Профілактично ефективна кількість" стосується такої кількості, яка, при необхідних дозуваннях і періодах введення, є ефективною для досягнення бажаного профілактичного результату. Як правило, але не обов'язково, якщо профілактична доза застосовується у суб'єктів до розвитку захворювання або на його ранніх стадіях, профілактично ефективна кількість є нижчою в порівнянні з терапевтично ефективною кількістю.
Слово "мітка", при використанні тут, стосується виявлюваної сполуки або композиції, які
Зо кон'югуються прямо або непрямо з антитілом, утворюючи "мічене" антитіло. Мітка може бути виявлювана прямо (наприклад, радіоїзотопні або флуоресцентні мітки) або, у випадку ферментної мітки, може каталізувати хімічне змінення субстрату або речовини, або композиції, які вже є виявлюваними. "Хіміотерапевтичний агент" являє собою хімічну сполуку, що підходить для лікування онкологічного захворювання, незалежно від механізму дії. Класи хіміотерапевтичних агентів включають, не обмежуючись перерахованим: алкілуючі агенти, антиметаболіти, рослинні алкалоїди, що є веретенними отрутами, цитотоксичні/протипухлинні антибіотики, інгібітори топоіїзомерази, антитіла, фотосенсибілізатори й інгібітори кінази. Хіміотерапевтичні агенти включають сполуки, використовувані в "націленій терапії" і у звичайній хіміотерапії.
Такі терміни як "лікування" або "терапія", або "лікувати"? або "полегшення", або "полегшувати" стосуються двох пунктів, що включають: 1) терапевтичні заходи, які виліковують, сповільнюють, послабляють симптоми і/або зупиняють прогресування діагностованого патологічного стану або порушення, і 2) профілактичні або запобіжні заходи, які запобігають іабо сповільнюють розвиток цільового патологічного стану або порушення. Таким чином, до тих хто потребує лікування, належать ті особи, у яких уже спостерігається захворювання; ті особи, які схильні до розвитку захворювання; і ті особи, у яких захворювання необхідно попередити. У певних варіантах втілення, суб'єкта успішно "лікують" від онкологічного захворювання, згідно зі способами даного винаходу, якщо у пацієнта спостерігається одне або більше із наступного: зменшення кількості ракових клітин або повна їх відсутність; зменшення розміру пухлини; інгібування або відсутність інфільтрації ракових клітин у периферичні органи, включаючи, наприклад, поширення раку в м'які тканини й кістки; інгібування або відсутність метастазів пухлин; інгібування або відсутність росту пухлини; ослаблення одного або більшої кількості симптомів, асоційованих зі специфічним онкологічним захворюванням; зниження захворюваності й смертності; підвищення якості життя; зниження пухлиногенності, пухлиногенної частоти або пухлиногенної ємності пухлини; зниження кількості стовбурових ракових клітин у пухлині; диференціація пухлиногенних клітин у непухлиногенний стан; або будь-яка комбінація ефектів.
Терміни "полінуклеотид" і "нуклеїнова кислота" тут використовуються як взаємозамінні й відносяться до полімерів нуклеотидів будь-якої довжини, включаючи ДНК і РНК. Нуклеотиди 60 можуть бути дезоксирибонуклеотидами, рибонуклеотидами, модифікованими нуклеотидами або основами і/або їх аналогами, або будь-яким субстратом, який може бути впроваджений у полімер ДНК- або РНК-полімеразою. Полінуклеотид може містити модифіковані нуклеотиди, наприклад, метиловані нуклеотиди і їх аналоги. Якщо вони присутні, то зміни в структурі нуклеотидів можуть бути внесені до або після їх з'єднання в полімер. Послідовність нуклеотидів може перериватися ненуклеотидними компонентами. Полінуклеотид може бути, крім цього, модифікований після полімеризації, наприклад, за допомогою кон'югування з компонентом- міткою. Інші типи модифікацій включають, наприклад, "кепи", заміщення одного і більше природніх нуклеотидів на аналоги, міжнуклеотидні модифікації, наприклад, з незарядженими зв'язками (наприклад, метилфосфонати, фосфотриефіри, фосфоамідати, кабамати і т.д.) і із зарядженими зв'язками (наприклад, фосфоротіоати, фосфородитіоати і т.д.), з вільними фрагментами, наприклад, білками (наприклад, нуклеазами, токсинами, антитілами, сигнальними пептидами, ріу-І-лізином і т.д.), з інтеркаляторами (наприклад, акридином, псораленом і т.д.), з хелаторами (наприклад, металами, радіоактивними металами, бором, металами-окиснювачами і т.д.), з алкіляторами, наприклад, модифікованими зв'язками (наприклад, альфа-аномірними нуклеїновими кислотами і т.д.), а також з немодифікованими формами полінуклеотиду(ів). Крім цього, будь-яка гідроксильна група, що є звичайно присутньою в цукрах, може бути замінена, наприклад, на фосфонатні групи, фосфатні групи, захищені стандартними захисними групами, або може бути активована для того, щоб одержати додаткові зв'язки з додатковими нуклеотидами, або може бути кон'югована із твердими субстратами. 5'- і 3-термінальні ОН можуть бути фосфорильовані або заміщені на аміни, або кеповані органічними фрагментами, що містять 1-20 атомів вуглецю. Також інші гідроксили можуть бути заміщені на стандартні захисні групи. Полінуклеотиди також можуть містити аналоги рибози або дезоксирибози, добре відомі в даній галузі техніки, наприклад, 2'-О-метиля-, 2-О-алліл, 2'-фтор- або 2'-азидо-рибозу, карбоциклічні аналоги цукрів, альфа.-аномерні цукри, епімерні цукри, наприклад, арабінозу, ксилозу або ліксозу, піранозні цукри, фуранозні цукри, седогептулози, ациклічні аналоги і нуклеозидні аналоги з видаленими азотистими основами, наприклад, метилрибозид. Один і більше фосфодіефірних зв'язків можуть бути заміненими на альтернативні зв'язуючі групи. Дані альтернативні зв'язуючі групи включають, не обмежуючись перерахованим, варіанти втілення, в яких фосфат заміщений на Р(О)5 (Стіоат"), Р(Б)5
Зо ("дитіоат"), " (ООМЕ» ("амідат"), РІОЖК, РІК, СО або СН» ("формацеталь"), де кожний К або
Е" є, незалежно, Н або заміщеним або незаміщеним алкілом (1-20 С), що необов'язково містить простий ефірний (--0О--) зв'язок, арильний, алкенільний, циклоалкільний, циклоалкенільний або аральдильний. Не всі зв'язки в полінуклеотиді повинні бути ідентичними. Попередній опис відноситься до всіх полінуклеотидів, що згадуються тут, включаючи РНК і ДНК.
Термін "вектор" означає конструкцію, яка здатна доставляти і, необов'язково, експресувати один або більше генів або послідовностей, що цікавялять у клітині-хазяїні. Приклади векторів включають, не обмежуючись перерахованим, вірусні вектори, вільні ДНК- або РНК-вектори експресії, плазміди, косміди або фагові вектори, ДНК- або РНК-вектори експресії, з'єднані з катіонними конденсуючими агентами, ДНК- або РНК-вектори експресії, поміщені в ліпосоми, певні еукаріотні клітини, наприклад, клітини-продуценти.
Терміни "поліпептид", "пептид" і "білок" використовуються як взаємозамінні для позначення полімерів амінокислот будь-якої довжини. Полімер може бути лінійним або розгалуженим, він може містити модифіковані амінокислоти і може містити вставки, відмінні від амінокислотних.
Терміни також охоплюють амінокислотний полімер, який був модифікований природньо, або згідно з винаходом, наприклад, з утворенням дисульфідного зв'язку, глікозилюванням, ліпідуванням, ацетилуванням, фосфорилюванням або іншою маніпуляцією або модифікацією, наприклад, кон'югуванням з компонентом-міткою. Також у визначення включені, наприклад, поліпептиди, що містять один або більше аналогів амінокислот (включаючи, наприклад, неприродні амінокислоти і т.д.), а також інші модифікації, відомі в даній галузі техніки. Необхідно розуміти, що, оскільки поліпептиди згідно з даним винаходом грунтуються на антитілах, у деяких варіантах втілення поліпептиди можуть бути присутніми у вигляді одинарних ланцюгів або зв'язаних ланцюгів.
Терміни "ідентичний" або відсоткова "ідентичність", у контексті двох або більшої кількості нуклеїнових кислот або поліпептидів, відносяться до двох або більше послідовностей, які однакові або мають певну відсоткову кількість однакових нуклеотидів, або амінокислот при порівнянні й вирівнюванні (при необхідності - з введенням проломів) для максимальної відповідності, причому консервативні амінокислотні заміни не розглядаються як ідентичні.
Відсоткова ідентичність може бути виміряна за допомогою ПЗ або алгоритмів для порівняння послідовностей або за допомогою ручного підрахунку. У даній галузі техніки відомі різні бо алгоритми і ПЗ, які можуть бути використані для вирівнювання нуклеотидних або амінокислотних послідовностей. Один нелімітуючий приклад алгоритму вирівнювання послідовностей - алгоритм, описаний в роботі Кагіїп еї аї, 1990 Маї|!. Асай. 5сі., 87:2264-2268, зі змінами згідно з Каїіїйп еї аї., 1993, Ргос. Маї!. Асай. з5сі., 90:5873-5877, який застосовується в програмах МВІ АТ і ХВІГА5Т (Ай5спиї еї аї., 1991, Мисієвїс Асіаз Ке5., 25:3389-3402). У деяких варіантах втілення може використовуватися Сарреа ВГАФЗТ згідно з Ак5спПиЇ еї а!., 1997, Мисівїс
Асід5 Нев. 25:3389-3402. ВІ АБЗТ-2, УМО-ВІ АБТ-2 (Авспиї еї аї., 1996, Меїйодв5 іп Епгутоіоду, 266:460-480), АСОМ, АГІСМ-2 (Сепепіесп, Зоцій Зап Егапсізсо, Саійогпіа) і Медаїдп (ОМАЗТАК) - додаткові вільні програми, які можуть використовуватися для вирівнювання послідовностей. У певних варіантах втілення відсоткова ідентичність двох нуклеотидних послідовностей визначається за допомогою програми САР у ПЗ СО (наприклад, з використанням показників
МУузЗдарапа.СМР таїгіх і дар уеїідні, які дорівнюють 40, 50, 60, 70 або 90, показника Іепдій меїдні, який дорівнюєї, 2, 3, 4, 5 або 6). У певних альтернативних варіантах втілення програма
САР у пакеті ССО, у якій використовується алгоритм МееаІетап і М/сп5сп (9. Мої. Віо!. (48):444- 453 (1970)), може застосовуватися для визначення відсоткової ідентичності двох амінокислотних послідовностей (наприклад, з використанням або матриці Віо55ит 62, або матриці РАМ250 і показника дар меїдні, який дорівнює 16, 14, 12, 10, 8, 6 або 4, а також показника Іепдій уеідні, який дорівнює 1, 2, З, 4, 5). Альтернативно в певних варіантах втілення відсоткова ідентичність нуклеотидних або амінокислотних послідовностей визначається згідно з алгоритмом Муег5 і МіПег (САВІО5, 4:11-17 (1989)). Наприклад, відсоткова ідентичність може бути визначена за допомогою програми АГІСМ (версії 2.0) і використанні РАМ120 з таблицею залишків, параметром дар Іепоїй репацпу, який дорівнює 12, і дар репану, який дорівнює 4.
Параметри, що підходять для максимального вирівнювання в конкретному ПЗ для вирівнювання, можуть бути визначені фахівцем у даній галузі техніки. У певних варіантах втілення застосовуються параметри за замовчуванням, визначені в ПЗ для вирівнювання. У певних варіантах втілення відсоткова ідентичність "Х" першої амінокислотної послідовності із другою амінокислотною послідовністю розраховується згідно з формулою 100х(У/2), де У - кількість амінокислотних залишків, визначених як ідентичні у вирівнюванні першої і другої послідовностей (при ручному вирівнюванні або конкретною програмою вирівнювання послідовностей), а 2 - загальна кількість залишків у другій послідовності. Якщо довжина першої послідовності більше довжини другої, відсоткова ідентичність першої послідовності з другою буде вище відсоткової ідентичності другої послідовності з першою.
Як необмежувальний приклад, наявність певної відсоткової ідентичності (наприклад, щонайменше 8095 ідентичності, щонайменше 8595 ідентичності, щонайменше 90 95 ідентичності, а в деяких варіантах втілення - щонайменше 95 95, 96 95, 97 Уо, 98 90 або 99 95 ідентичності) конкретного поліпептиду з референтною послідовністю в певних варіантах втілення може бути встановлене за допомогою програми Везійї (Пакет М/і5сопбзіп Зедиепсе
Апаїузіз РасКаде, Версія 8 для Мпіх, Сепеїййс5 Сотршиїег Сгоир, Опімегейу Кезеагсп Рак, 575 зсіепсе Огіме, Мадізоп, УМІ 53711). В програмі ВЕ5ТРЇТ використовується алгоритм "локальної гомології" Зтіййп і Умаїеппап, Адмапсе5 іп Арріїєй Маїйпетаїйіс5 2: 482-489 (1981) для пошуку найкращого сегмента гомології між двома послідовностями. При використанні Вевійї або іншої програми вирівнювання послідовностей для визначення того, чи є конкретна послідовність ідентичною, наприклад, на 95595 референтній послідовності згідно з даним винаходом, параметри встановлюються так, щоб відсоткова ідентичність розраховувалась по повній довжині референтної нуклеотидної послідовності і щоб були дозволені проломи в гомологічності аж до 5 95 від загальної кількості нуклеотидів референтної послідовності.
У деяких варіантах втілення дві нуклеїнові кислоти або два поліпептиди згідно з винаходом є значною мірою ідентичними, маючи щонайменше 7095, щонайменше 7595, щонайменше 80 96, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, а в деяких варіантах втілення - щонайменше 95 96, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 нуклеотидної або амінокислотної ідентичності при порівнянні й максимальному вирівнюванні, згідно з алгоритмом порівняння послідовностей або з ручним підрахунком. В певних варіантах втілення ідентичність спостерігається в регіоні послідовності, що має щонайменше приблизно 10, приблизно 20, приблизно 40-60 залишків або будь-яку цілу величину в цьому інтервалі, або в регіоні послідовності довжиною більше ніж 60-80 залишків, щонайменше приблизно 90-100 залишків, або ж послідовності практично ідентичні по всій довжині порівнюваних послідовностей; наприклад, можуть бути ідентичні кодуючі регіони, нуклеотидної послідовності. "Консервативна амінокислотна заміна" - це така заміна, при якій одна амінокислота замінюється на іншу амінокислоту зі схожим бічним ланцюгом. Сімейства амінокислотних залишків за схожістю бічних ланцюгів визначені в даній галузі техніки і включають основні бічні бо ланцюги (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислотні бічні ланцюги (наприклад, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незаряджені полярні бічні ланцюги (наприклад, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн), неполярні бічні ланцюги (наприклад, гліцин аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан), бета-розгалужені бічні ланцюги (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) і ароматичні бічні ланцюги (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Наприклад, заміна фенілиаланіну на тирозин є консерватиною заміною. У певних варіантах втілення консервативні заміни в послідовностях поліпептидів і антитіл згідно з винаходом не приводять до зникнення зв'язування поліпептиду або антитіла, що містить амінокислотну послідовність, з антигеном(іами), з яким(и) вони звичайно зв'язуються, наприклад, з БОЇВ. Способи ідентифікації нуклеотидних і амінокислотних консервативних замін, що не приводять до зникнення зв'язування з антигеном, добре відомі в даній галузі техніки (див., наприклад, Вгиттеї! еї аїІ., Віоспет. 32: 1180-1187 (1993); Кобауабвні еї аї. Ргоївїп Епд. 12(10):879-884 (1999); і Вигкз5 еї а. Ргос. Май. Асай. зЗсі. ОБА 94:412-417 (1997)).
При використанні в даній заявці й формулі винаходу, форми однини включають і форми множини, якщо з контексту явно не випливає інше.
Необхідно розуміти, що будь-які варіанти втілення, описані тут із вживанням слова "що містить", є аналогами варіантів втілення, описаних термінами "що складається з" і/або "що переважно складається з".
Термін "і/або" при використанні тут у фразі типу "А і/або В" включає і тА і В", і "А або В", і "А" і "В". Аналогічно термін "і/або" у такій фразі як "А, В, і/або С" охоплює кожний з наступних варіантів втілень: А, Ві С; А, В або СїАабо СїАабоВ;Вабо СА іс; А ІВ; В і С; А (одне), В (одне) і С (одне).
ІІ. РОГ-А 1-зв'язуючі агенти
У даному винаході пропонуються агенти, які специфічно зв'язуються з людським РОЇ К1. Ці агенти називаються тут "БОЇ К 1-зв'язуючими агентами". Повнорозмірні амінокислотні (аа) і нуклеотидні (п!) послідовності для ЕОЇ КІ відомі в даній галузі техніки й представлені тут в ЗЕО
ІО МО: 25 і 26, відповідно.
У певних варіантах втілення БОЇ К 1-зв'язуючі агенти є антитілами, імунокон'югатами або поліпептидами. У деяких варіантах втілення РОЇК 1-зв'язуючі агенти є гуманізованими
Зо антитілами. У певних варіантах втілення РОЇК 1-зв'язуючі агенти є гуманізованими версіями мишачого антитіла Мом19 (варіабельні важкий і легкий ланцюги представлені в 5ЕО ІЮО МО5: 17 і 18, відповідно).
У певних варіантах втілення РОЇК 1-зв'язуючі агенти виявляють один або більше із наступних ефектів: інгібування проліферації пухлинних клітин, зменшення пухлиногенності пухлини шляхом зменшення частотності ракових стовбурових клітин у пухлині, інгібування росту пухлини, підвищення виживаності, запуск клітинної смерті пухлинних клітин, диференціація пухлиногенних клітин у непухлинний стан або запобігання метастазуванню пухлинних клітин...
У певних варіантах втілення імунокон'югати або інші агенти, які специфічно зв'язуються з людським РЕОЇ ВІ, запускають клітинну смерть за допомогою цитотоксичного агента. Наприклад, у деяких варіантах втілення антитіло проти людського ЕОЇ В1 є кон'югованим з майтансиноїдом, який активується в пухлинних клітинах, що експресують ЕОЇ ВІ, при інтерналізації білка. У певних альтернативних варіантах втілення агент або антитіло не кон'юговані..
У певних варіантах втілення РОЇК 1-зв'язуючі агенти здатні інгібувати ріст пухлини. У певних варіантах втілення РОЇК 1-зв'язуючі агенти здатні інгібувати ріст пухлини іп мімо (наприклад, у ксенотрансплантатній мишачій моделі й/або у людей, що страждають на ракове захворювання). У певних варіантах втілення РОЇК 1-зв'язуючі агенти здатні інгібувати ріст пухлини у людини.
Таким чином, у винаході пропонуються гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, які специфічно зв'язуються з людським рецептором фолієвої кислоти 1, причому антитіло містить: (а) СОКІ1 важкого ланцюга, що містить ЗМЕММ (5ЕО ІЮ МО: 1); СОК2 важкого ланцюга, що містить ВІНРУСООТЕУМОХаатЕХаагХааз (ЗЕБЕО І МО: 56); і СОКЗ важкого ланцюга, що містить УОСЗКАМОМ (5ЕО ІЮ МО: 3); ії (6) СОКІ легкого ланцюга, що містить
КАБОБЗМЗЕАСТБІ МН (ЗЕО ІО МО: 7); СОК2 легкого ланцюга, що містить КАЗМІЕА (5ЕО ІЮ
МО: 8); СОКЗ легкого ланцюга, що містить ООБКЕМРУТ (5ЕО І МО: 9); де Хааї вибраний з К,
О, Н ї Е; Хааг вибраний з 0, Н, М і Е; і Хааз вибраний з 0, Е, Т, 5, А і М. У певних варіантах втілення антитіло є антитілом пиИМом19, яке є описаним вище антитілом, що містять СОК2 важкого ланцюга КІНРУОСОТЕУМОКРО (5ЕО ІО МО: 2).
У певних варіантах втілення у винаході пропонуються гуманізовані антитіла або антигензв'язуючі фрагменти, які специфічно зв'язуються з БОЇ КІ, що включають регіони які 60 визначають комплементарність пиМом19, які містять до чотирьох (тобто 0, 1, 2, З або 4)
консервативних амінокислотних замін на регіон, що визначає комплементарність. Таким чином, у певних варіантах втілення у винаході пропонуються гуманізовані антитіла або антигензв'язуючі фрагменти, які специфічно зв'язуються з людським рецептором фолієвої кислоти 1, що відрізняються тим, що антитіло містить: (аа СОКІ важкого ланцюга, що містить
СУЕММ (ЗЕО ІО МО: 1), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; СОМК2 важкого ланцюга, що містить КІНРУОСОТЕУМОКРОСсС (5ЕБЕО ІЮ МО: 2), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; і СОКЗ важкого ланцюга, що містить УОС5КАМОМ (5ЕО ІЮО МО: 3), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або (6) СОМ! легкого ланцюга, що містить
КАБОБУЗЕАСТОІ МН (5ЕО ІО МО: 7), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; СОМ2 легкого ланцюга, що містить КАЗМІЕА (5ЕО ІЮ МО: 8), або її варіант, що включає 1, 2, 3 або 4 консервативних амінокислотних заміни; СОКЗ легкого ланцюга, що містить ООБКЕМРУТ (5ЕО ІЮ МО: 9), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни.
У винаході також пропонується гуманізоване антитіло (пиЕК1-21) або його антигензв'язуючий фрагмент, які специфічно зв'язуються з людським рецептором фолієвої кислоти 1, що відрізняються тим, що антитіло містить: (аа СОКІ важкого ланцюга, що містить
ЗЗУСМ5 (5ЕО ІЮ МО: 30); СОК2 важкого ланцюга, що містить ТІБ5ОО5УГУ (ЗЕБО ІО МО: 31); і
СОРЗ важкого ланцюга, що містить ОСЕССІЇ МАМОМ (5ЕО ІЮО МО: 32); і/або (6) СОКІ1 легкого ланцюга, що містить КАБОНІММУМСА (ЗЕБЕО ІЮ МО: 27); СОК2 легкого ланцюга, що містить
САТ5ЗІ ЕТ (5ЕО ІО МО: 28); і СОКЗ легкого ланцюга, що містить ООМУУЗТРЕТ (5ЕО ІО МО: 29).
У певних варіантах втілення у винаході пропонуються гуманізовані антитіла або антигензв'язуючі фрагменти, які специфічно зв'язуються з БОЇ К!, що включають регіони, що визначають комплементарність пиЕМ1-21, які містять до чотирьох (тобто 0, 1, 2, З або 4) консервативних амінокислотних замін на регіон що визначає комплементарність. Таким чином, у певних варіантах втілення у винаході пропонуються гуманізовані антитіла або антигензв'язуючі фрагменти, які специфічно зв'язуються з людським рецептором фолієвої кислоти 1, що відрізняються тим, що антитіло містить: (аа СОКІ важкого ланцюга, що містить
ЗЗУОМ5 (ЗБО І МО: 30), або її варіант, що включає 1, 2, 3 або 4 консервативних
Зо амінокислотних заміни; і/або СОК2 важкого ланцюга, що містить ТІЗ5ООЗУТУ (5ЕО ІО МО: 31), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або СОКЗ важкого ланцюга, що містить ОСЕССІ МАМОМ (ЗЕО ІО МО: 32), або її варіант, що включає 1, 2,
З або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або (б) СОМК1 легкого ланцюга, що містить
КАБОНІММУМ А (ЗЕО ІЮ МО: 27), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або СОК2 легкого ланцюга, що містить ЗАТ5І ЕТ (5ЕО ІЮО МО: 28), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або СОКЗ легкого ланцюга, що містить ООУУМУ5ТРЕТ (ЗЕО ІО МО: 29), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни.
У певних варіантах втілення у винаході пропонуються гуманізовані антитіла або антигензв'язуючі фрагменти, які специфічно зв'язуються з РОЇ КІ, що включають регіони що визначають комплементарність пи 1-48, які містять до чотирьох (тобто 0, 1, 2, З або 4) консервативних амінокислотних замін на регіон що визначає комплементарність. Таким чином, у певних варіантах втілення у винаході пропонуються гуманізовані антитіла або антигензв'язуючі фрагменти, які специфічно зв'язуються з людським рецептором фолієвої кислоти 1, що відрізняються тим, що антитіло містить: (а) СОКІ важкого ланцюга, що містить
ТМУМУМО (5ЕБЕО ІЮ МО: 60), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або СОК2 важкого ланцюга, що містить ІМРОМОЮБЗК (5ЕО ІО МО: 61), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або СОКЗ важкого ланцюга, що містить КВОСМУААМ (5ЕО ІО МО: 62), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або (6) СОКІ! легкого ланцюга, що містить
ЕАЗЕМІУЗМІА (ЗЕО ІЮ МО: 57), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або СОМК2 легкого ланцюга, що містить ААТМІ АЮ (ЗЕО ІЮ МО: 58), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або СОКЗ легкого ланцюга, що містить ОНЕМУАЗРУТ (5ЕО ІЮО МО: 59), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни.
У певних варіантах втілення у винаході пропонуються гуманізовані антитіла або антигензв'язуючі фрагменти, які специфічно зв'язуються з РОЇ КІ, що включають регіони що визначають комплементарність пи 1-49, які містять до чотирьох (тобто 0, 1, 2, З або 4) консервативних амінокислотних замін на регіон що визначає комплементарність. Таким чином, бо у певних варіантах втілення у винаході пропонуються гуманізовані антитіла або антигензв'язуючі фрагменти, які специфічно зв'язуються з людським рецептором фолієвої кислоти 1, що відрізняються тим, що антитіло містить: (аа СОКІ важкого ланцюга, що містить
ТМУМУММ (5ЕО 10 МО: 66), або його варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або СОК2 важкого ланцюга, що містить АЇМРОМ5ОТТ (5ЕО ІЮ МО: 67), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або СОКЗ важкого ланцюга, що містить ЕНОМСЗАМОМ (ЗЕО ІЮ МО: 68), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або (б) СОКІ легкого ланцюга, що містить
ЕАЗЕМІУТМІА (5ЕО ІО МО: 63), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або СОК2 легкого ланцюга, що містить ТА5МІ АЮ (5ЕО ІЮ МО: 64), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або СОМКЗ легкого ланцюга, що містить ОНЕМ/УМЗРУТ (5ЕО ІЮО МО: 65), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни.
У певних варіантах втілення у винаході пропонуються гуманізовані антитіла або антигензв'язуючі фрагменти, які специфічно зв'язуються з РОЇ КІ, що включають регіони що визначають комплементарність пиЕМ1-57, які містять до чотирьох (тобто 0, 1, 2, З або 4) консервативних амінокислотних замін на регіон, що визначає комплементарність. Таким чином, у певних варіантах втілення у винаході пропонуються гуманізовані антитіла або антигензв'язуючі фрагменти, які специфічно зв'язуються з людським рецептором фолієвої кислоти 1, що відрізняються тим, що антитіло містить: (аа СОКІ важкого ланцюга, що містить
З5РОМН (ЗЕБЕО І МО: 72), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або СОМК2 важкого ланцюга, що містить МІ55055Т1І5 (ЗЕО ІО МО: 73), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або СОКЗ важкого ланцюга, що містить ЕАХО5ЗМЕМ (ЗЕО ІЮ МО: 74), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або (б) СОКІ легкого ланцюга, що містить
ЕАЗОМІМММІН (ЗЕО ІЮ МО: 69), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або СОК2 легкого ланцюга, що містить УУ5О5М5 (5ЕО ІЮО МО: 70), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або СОКЗ легкого ланцюга, що містить ООЗМЗУУРНУТ (ЗЕО ІО МО: 71), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни.
Зо У певних варіантах втілення у винаході пропонуються гуманізовані антитіла або антигензв'язуючі фрагменти, які специфічно зв'язуються з РОЇ КІ, що включають регіони що визначають комплементарність пиЕК1-65, які містять до чотирьох (тобто 0, 1, 2, З або 4) консервативних амінокислотних заміни на регіон що визначає комплементарність. Таким чином, у певних варіантах втілення у винаході пропонуються гуманізовані антитіла або антигензв'язуючі фрагменти, які специфічно зв'язуються з людським рецептором фолієвої кислоти 1, що відрізняються тим, що антитіло містить: (аа СОКІ важкого ланцюга, що містить
Т5МТМН (ЗЕБЕО І МО: 78), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або СОМК2 важкого ланцюга, що містить МІМРІБОМТМ (5ЕО ІЮ МО: 79), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або СОКЗ важкого ланцюга, що містить ЗОСАМОЕКРМОМ (ЗЕО ІЮ МО: 80), або її варіант, що включає 1, 2,
З або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або (б) СОМК1 легкого ланцюга, що містить
КАБОММОРММА (ЗЕО ІЮ МО: 75), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або СОК2 легкого ланцюга, що містить ЗАЗУКУ5 (ЗЕО ІЮ МО: 76), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни; і/або СОКЗ легкого ланцюга, що містить ООУМОУРМУТ (5ЕО ІЮО МО: 77), або її варіант, що включає 1, 2, З або 4 консервативних амінокислотних заміни.
Крім цього, пропонуються поліпептиди, що містять один з індивідуальних легких ланцюгів або важких ланцюгів, описаних тут, а також поліпептиди (наприклад, антитіла), що містять як легкий, так і важкий ланцюги. Поліпептиди з ЗЕО ІЮ МО: 4 і 6 містять варіабельний домен важкого ланцюга пиМом19 і важкий ланцюг пиМом19, відповідно. Поліпептиди з БЕО ІЮО МО: 10- 13 містять варіабельний домен легкого ланцюга версії 1.00, варіабельний домен легкого ланцюга версії 1.60, легкий ланцюг версії 1.00 і легкий ланцюг версії 1.60 пиМом'19, відповідно.
Поліпептиди з ЗЕО ІЮ МО: 42 і 46 містять варіабельний домен важкого ланцюга пише 1-21 і важкий ланцюг пиЕК 1-21, відповідно. Поліпептиди з 5ЕО ІЮ МО5: 41 і 45 містять варіабельний домен легкого ланцюга і легкий ланцюг пиЕКІ1-21, відповідно. Поліпептиди з БЕО ІЮО МО5: 97 і 113 містять варіабельний домен важкого ланцюга пиЕК1-48 і важкий ланцюг пшиЕм1-48, відповідно. Поліпептиди з БЕО ІЮ МО5: 96 і 112 містять варіабельний домен легкого ланцюга і легкий ланцюг пиЕК1-48, відповідно. Поліпептиди з ЗЕО ІЮО МО5: 99 і 115 містять варіабельний домен важкого ланцюга пиЕК1-49 і важкий ланцюг пиЕК1-49, відповідно. Поліпептиди з 5ЕО ІЮ бо МО5: 98 їі 114 містять варіабельний домен легкого ланцюга і легкий ланцюг йшЕмК1-49,
відповідно. Поліпептиди з БЕО ІЮ МО: 101 і 117 містять варіабельний домен важкого ланцюга пПиЧЕВ1-57 і важкий ланцюг пиЕК1-57, відповідно. Поліпептиди з ЗЕО ІЮ МО: 100 і 116 містять варіабельний домен легкого ланцюга і легкий ланцюг пиЕК1-57, відповідно. Поліпептиди з ЗЕО
ІЮО МО: 103 ї 119 містять варіабельний домен важкого ланцюга пиЕК1-65 і важкий ланцюг пПЧЕВ1-65, відповідно. Поліпептиди з ЗЕО ІО МО5: 102 і 118 містять варіабельний домен легкого ланцюга і легкий ланцюг пиЕК 1-65, відповідно.
Також пропонуються поліпептиди, які містять: (а) поліпептид, що має щонайменше приблизно 90 95 ідентичність послідовності з зЗЕО ІЮ МО: 4 або 6; і/або (б) поліпептид, що має щонайменше приблизно 9095 ідентичність послідовності з 5ЕБЕО ІЮ МО5: 10-13. Також пропонуються поліпептиди, які містять: (а) поліпептид, що має приблизно 90 95 ідентичність послідовності з ЗЕО ІЮ МО: 42 або 46; і/або (б) поліпептид, що має щонайменше приблизно 90 95 ідентичність послідовності з БЕО ІЮ МО5: 41 і 45. Також пропонуються поліпептиди, які містять: (а) поліпептид, що має щонайменше приблизно 90 95 ідентичність послідовності з ФЗЕО
ІОЮО МО: 97 або 113; і/або (б) поліпептид, що має щонайменше приблизно 90 95 ідентичність послідовності з ЗЕО ІЮО МО5: 96 або 112. Також пропонуються поліпептиди, які містять: (а) поліпептид, що має щонайменше приблизно 90 95 ідентичність послідовності з зЗЕО ІЮ МО5: 99 або 115; і/або (б) поліпептид, що має щонайменше приблизно 90 95 ідентичність послідовності з
ЗЕО ІЮО МО: 98 або 114. Також пропонуються поліпептиди, які містять: (а) поліпептид, що має щонайменше приблизно 90 95 ідентичність послідовності з «ЕО ІЮ МО: 101 або 117; і/або (б) поліпептид, що має щонайменше приблизно 90 95 ідентичність послідовності з з«ЕО ІЮ МО5: 100 або 116. Також пропонуються поліпептиди, які містять: (а) поліпептид, що має щонайменше приблизно 90 95 ідентичність послідовності з ЗЕО ІЮ МО: 103 або 119; і/або (б) поліпептид, що має щонайменше приблизно 90 95 ідентичність послідовності з ЗЕО ІЮ МО5: 102 або 118. У певних варіантах втілення поліпептид містить поліпептид, який має щонайменше приблизно 9595, щонайменше приблизно 96 9565, щонайменше приблизно 97 96, щонайменше приблизно 98 95 або щонайменше приблизно 99 95 ідентичність послідовності з ЗЕО ІЮ МО5: 4, 6, 10-13, 41, 42, 45 або 46. Таким чином, у певних варіантах втілення поліпептид містить (а) поліпептид із щонайменше приблизно 95 95 ідентичністю послідовності з ЗЕО ІЮО МО5: 4 або 6, і/або (б) поліпептид із щонайменше приблизно 95 95 ідентичністю послідовності з ЗЕО ІЮ МО: 10-13. У
Зо певних варіантах втілення поліпептид містить (а) поліпептид із щонайменше приблизно 95 95 ідентичністю послідовності з ЗЕО ІЮ МО5: 42 або 46; і/або (б) поліпептид із щонайменше приблизно 95 95 ідентичністю послідовності з ЗЕО ІЮ МО5: 41 або 45. Також пропонуються поліпептиди, які містять: (а) поліпептид, що має щонайменше приблизно 95 95 ідентичність послідовності з зЗЕО ІЮ МО: 97 або 113; і/або (б) поліпептид, що має щонайменше приблизно 95 95 ідентичність послідовності з ФЕО ІЮ МО5: 96 або 112. Також пропонуються поліпептиди, які містять: (а) поліпептид, що має щонайменше приблизно 95 95 ідентичність з зЗЕО ІЮ МО5: 99 або 115; і/або (б) поліпептид, що має щонайменше приблизно 95 95 ідентичність послідовності з
ЗЕО ІЮО МО: 98 або 114. Також пропонуються поліпептиди, які містять: (а) поліпептид, що має щонайменше приблизно 95 95 ідентичність послідовності з «ЕО ІЮ МО: 101 або 117; і/або (б) поліпептид, має щонайменше приблизно 95 95 ідентичність послідовності з 5ЕО ІЮ МО5: 100 або 116. Також пропонуються поліпептиди, які містять: (а) поліпептид, що має щонайменше приблизно 95 95 ідентичність послідовності з «ЕО ІЮ МО: 103 або 119; і/або (б) поліпептид, має щонайменше приблизно 95 95 ідентичність послідовності з ЗЕО ІЮ МО5: 102 або 118. У певних варіантах втілення поліпептид містить (а) поліпептид з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ
МО: 4; і/або (б) поліпептид з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:10 або 5ЕО ІО МО: 11. У певних варіантах втілення поліпептид містить (а) поліпептид з амінокислотною послідовністю
ЗЕО ІЮО МО: 45; і/або (б) поліпептид з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮО МО: 46. У певних варіантах втілення поліпептид містить (а) поліпептид з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ
МО: 6; і/або (б) поліпептид з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 12 або 5ЕО ІО МО: 13. У певних варіантах втілення поліпептид є антитілом і/або поліпептидом, що специфічно зв'язуються з людським рецептором фолієвої кислоти 1. У певних варіантах втілення поліпептид є гуманізованим антитілом, що специфічно зв'язується з людським рецептором фолієвої кислоти 1. Наприклад, у винаході пропонується антитіло або гуманізоване антитіло, яке специфічно зв'язується з людським ЕОЇ КІ, яке містить (а) поліпептид з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮО МО: 4; і (б) поліпептид з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 10 або 5ЕО ІО МО: 11. У певних варіантах втілення поліпептид, що містить ЗЕО ІЮ МО: 4, являє собою варіабельний регіон важкого ланцюга. У певних варіантах втілення поліпептид, що містить ЗЕО ІЮО МО: 10 або 11, являє собою варіабельний регіон легкого ланцюга. У винаході також пропонується антитіло або гуманізоване антитіло, яке специфічно зв'язується з людським 60 ЕОЇ КІ, яке містить (а) поліпептид з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 6 і (б)
поліпептид з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 12 або 5ЕО ІЮО МО: 13. У винаході також пропонується антитіло або гуманізоване антитіло, яке специфічно зв'язується з людським
ЕОЇ КІ, яке містить (а) поліпептид з амінокислотною послідовністю 5ЕСО ІЮО МО: 45 і (б) поліпептид з амінокислотною послідовністю ЕС ІЮ МО: 46. У винаході також пропонується антитіло або гуманізоване антитіло, яке специфічно зв'язується з людським ЕОЇ КІ, яке містить (а) поліпептид з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІО МО: 112 і (б) поліпептид з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 113. У винаході також пропонується антитіло або гуманізоване антитіло, яке специфічно зв'язується з людським БОЇКІ!, яке містить (а) поліпептид з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 114 і (б) поліпептид з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 115. У винаході також пропонується антитіло або гуманізоване антитіло, яке специфічно зв'язується з людським ЕБОЇКІ!, яке містить (а) поліпептид з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 116 і (б) поліпептид з амінокислотною послідовністю
ЗБО ІЮ МО: 117. У винаході також пропонується антитіло або гуманізоване антитіло, яке специфічно зв'язується з людським РОЇК, яке містить (а) поліпептид з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 118 і (б) поліпептид з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 119.
У певних варіантах втілення поліпептид з певною відсотковою ідентичністю послідовності з хЕО
ІО МОЗ: 4, 6, 10-13, 41, 42, 45, 46, 96-103 ї 112-119 відрізняється від 5ЕО ІЮ МО: 4, 6, 10-13, 41, 42, 45, 46, 96-103 і 112-119 тільки консервативними замінами амінокислот.
У певних варіантах втілення РОЇК 1-зв'язуючий агент містить, переважно складається, винятково складається або складається з антитіла проти БОЇКІ, вибраного із групи, що складається з антитіл пиМом19, ЕК-1-21, ЕНІ1-48, ЕВ1-49, ЕН1-57 і ЕК1-65.
У певних варіантах втілення антитіло пПиМом19 закодовано плазмідами, депонованими в
Американській Колекції Типових Культур (АТСС) 7 квітня 2010 під номерами депонентів АТС
РТА-10772 і РТА-10773 або 10774.
У певних варіантах втілення антитіло ЕК-1-21 закодовано плазмідами, депонованими в
АТСС 7 квітня 2010 під номерами депонентів РТА-10775 і 10776.
У певних втіленнях гуманізовані антитіла зв'язують БОЇКІ із практично такою самою афінністю, що і химерне антитіло Мом19. Афінність або авідність антитіла до антигену може бути визначена експериментально за допомогою будь-якого способу, добре відомого в даній
Зо галузі техніки, наприклад, проточної цитометрії, ензим-зв'язаного імуносорбентного способу дослідження (ЕГІ5А), радіоїмунного аналізу (КІА) або кінетичного аналізу (наприклад, аналізу
ВІАСОКЕ "М). Аналізи у форматі прямого зв'язування, а також конкурентного зв'язування можуть бути легко виконані. (Див., наприклад, Веглої5Ку, еї аї., "Апіїбоду-Апіїдеп Іпіегасіюп5, " п
Еипдатепіа! Іттипоіоду, Раш, МУ. Е., Ед., Бамеп Ргеб55: Мем мок, М.У. (1984); Кибу, дапів
Іттипоіоду, М. Н. Егеетап апа Сотрапу: Мем Могк, М.У. (1992) і способи, описані тут. Виміряна афінність конкретної взаємодії антитіло-антиген може варіюватися при виконанні вимірювань у різних умовах (концентрації солі, рН, температурі). Таким чином, вимірювання афінності й інших антигензв'язуючих параметрів (наприклад, КО або Ка, Коп, Кої) необхідно виконувати зі стандартизованими розчинами антитіла і антигену в стандартизованому буфері, як прийнято в даній галузі техніки, наприклад, можна використовувати буфер, описаний тут.
В одному аспекті аналізи зв'язування можуть проводитися з використанням проточної цитометрії на клітинах, що експресують антиген РОЇК! на поверхні. Приміром, РОЇК 1- позитивні клітини, такі як 5КОМЗ3, були інкубовані з різними концентраціями антитіл проти
ЕОЇ КІ з використанням 1 х 105 клітин на зразок в 100 мкл буфера ГАС5 (середовище КРМІ- 1640 з добавкою 2 95 нормальної козячої сироватки). Потім клітини були осаджені, промиті й інкубовані протягом 1 год. з 100 мкл РІТС-кон'югованих козячих анти-мишачих або козячих анти- людських Ідсі-антитіл (наприклад, комерційно доступні від компанії Часкзхоп І арогайогу, 6 мкг/мл у буфері ЕАС5). Клітини були знову осаджені, промиті буфером ЕАСЗ5 і ресуспендовані в 200 мкл фосфатно-сольового буфера, що містить 195 формальдегід. Зразки були зібрані, наприклад, за допомогою проточного цитометра ЕАСзСаїїбиг із багатоямковим самплером НТЗ і проаналізовані за допомогою СеПОицеві Рго (все обладнання від ВО Віозсіепсе5, Сан-Дієго,
США). Для кожного зразка знімали середню інтенсивність флуоресценції для РІ 1 (МЕ), після чого будували криву зв'язування у вигляді напівлогарифмічного графіка залежності інтенсивності від концентрації антитіла. Сигмовидну криву дозової залежності порівнюють із кривими зв'язування за допомогою СтарипРай Ріїзт м4 (СтарпРайд зоймагеє, Сан-Дієго,
Каліфорнія) з параметрами за замовчуванням і розраховують величини ЕС50О. Величини ЕС5О можуть використовуватися для вимірювання позірної константи дисоціації "Ка" або "КО" для кожного антитіла.
Моноклональні антитіла можуть бути приготовлені гібридомними способами, наприклад, 60 описаними в роботі Копіег і Міїєтеїп (1975) Маїшге 256:495. Використовуючи гібридомний спосіб,
миша, хом'ячок або інша підходяща тварина-носій імунізується так, як описано вище, для того, щоб досягти виділення лімфоцитами антитіл, які специфічно зв'язуються з імунізуючим антигеном. Лімфоцити також можуть бути імунізовані іп мійго. Після імунізації лімфоцити виділяють і зливають з підходящою мієломною клітинною лінією, використовуючи, наприклад, поліетиленгліколь, для утворення гібридомних клітин, які потім можуть бути відділені від лімфоцитів, що не злились, і мієломних клітин. Гібридоми, які продукують моноклональні антитіла, спрямовані специфічно проти вибраного антигену, згідно даним імунопреципітації, імуноблотингу або аналізу зв'язування іп міго (наприклад, радіоіїмунологічного аналізу (РІА); ензим-зв'язаного імуносорбентного аналізу (ЕГІЗА)), потім можуть бути розмножені в культурі іп міго стандартними способами (Содіпуд, Мопосіопа! Апііродієв: Ргіпсіріеє5 апа Ргасіісе, Асадетіс
Рге55, 1986) або іп мімо у вигляді асцитних пухлин у тварин. Моноклональні антитіла потім можуть бути очищені з живильного середовища або асцитної рідини так, як описано вище для поліклональних антитіл.
Альтернативно моноклональні антитіла можуть також бути виготовлені способами, що використовують рекомбінантну ДНК, як описано в патенті США 4816567. Полінуклеотиди, що кодують моноклональне антитіло, виділяють зі зрілих В-клітин або клітин гібридоми, наприклад, способом ЗТ-ПЛР із використанням олігонуклеотидних праймерів, які специфічно підсилюють гени, що кодують важкі й легкі ланцюги антитіла, а їх послідовності визначають звичайними процедурами. Ізольовані полінуклеотиди, що кодують важкий і легкий ланцюги, потім клонують у підходящі вектори експресії, якими трансфікують клітини-хазяї, наприклад, клітини Е. соїї, клітини СО5, клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), або мієломні клітини, які в інших випадках не продукують імуноглобулінові білки, моноклональні антитіла утворюються клітинами-хазяїнами. Також рекомбінантні моноклональні антитіла бажаних видів або їх фрагменти можуть бути ізольовані з фагових дисплейних бібліотек, що експресують регіони, які визначають комплементарність бажаних видів, як було описано в роботах (МссайПепу еї аї., 1990, Майте, 348:552-554; СІаскзоп еї а!., 1991, Маїште, 352:624-628; і Магкз еї аї., 1991, 9. Мої.
Віо!., 222:581-597).
Полінуклеотид(и), що кодують моноклональне антитіло можуть, крім цього, бути модифіковані за допомогою великої кількості різних способів з використанням технології
Зо рекомбінантних ДНК для одержання альтернативних антитіл. У деяких варіантах втілення константні домени легкого і важкого ланцюгів, наприклад, мишачого моноклонального антитіла, можуть бути заміщені 1) на регіони, наприклад, людського антитіла - для одержання химерного антитіла або 2) на неімуноглобуліновий поліпептид - для одержання злитого антитіла. У деяких варіантах втілення константні регіони усічені або видалені для одержання бажаного фрагмента моноклонального антитіла. Сайт-спрямований або високощільний мутагенез варіабельного регіону може застосовуватися для оптимізації специфічності, афінності і т.д. моноклонального антитіла...
У деяких варіантах втілення моноклональне антитіло проти людського БОЇК1 є гуманізованим антитілом. У певних варіантах втілення подібні антитіла застосовуються терапевтично для зменшення антигенності й відповідей НАМА (людське анти-мишаче антитіло) при введенні людському суб'єкту.
Також можуть застосовуватися способи конструювання, гуманізації й перебудови нелюдських і людських антитіл, які добре відомі в даній галузі техніки. Гуманізоване, перебудоване або аналогічним чином сконструйоване антитіло може мати один або більшу кількість амінокислотних залишків нелюдського походження, наприклад, але не обмежуючись перерахованим, від миші, щура, кролика, нелюдиноподібних приматів або інших ссавців. Ці нелюдські амінокислотні залишки замінюються залишками, часто називаними "імпортними" залишками, які звичайно беруться з "імпортного" варіабельного, константного або іншого домену відомої людської послідовності.
Подібні імпортовані послідовності можуть використовуватися для зменшення імуногенності, зменшення, посилення або змінення зв'язування, афінності, швидкості асоціації, швидкості дисоціації, авідності, специфічності, періоду напівжиття й інших підходящих характеристик, відомих у даній галузі техніки. Загалом залишки регіонів, що визначають комплементарність, прямо й найбільше суттєво впливають на БОЇ 1-зв'язування. Відповідно, частина всіх нелюдських або людських послідовностей регіонів, що визначають комплементарність, зберігається, у той час як нелюдський послідовності варіабельних і константних регіонів можуть бути замінені на людські або інші амінокислоти.
Антитіла, необов'язково, можуть бути гуманізовані, перебудовані, конструйовані в людські антитіла з високої афінністю до антигену РОЇ КІ і іншими кращими біологічними властивостями. бо Для досягнення цієї мети гуманізовані (або людські) або сконструйовані антитіла проти БОЇ К1 Її перебудовані антитіла, необов'язково, можуть бути виготовлені згідно з процесом аналізу батьківських послідовностей і різних концептуальних гуманізованих і сконструйованих продуктів із застосуванням тривимірних моделей батьківських, конструйованих і гуманізованих послідовностей. Тривимірні моделі імуноглобулінів широкодоступні й відомі фахівцям у даній галузі техніки. Є в наявності комп'ютерні програми, які ілюструють і показують імовірні тривимірні конформаційні структури вибраних кандидатних послідовностей імуноглобулінів.
Вивчення цих проявів дозволяє провести аналіз імовірної ролі залишків у функціонуванні кандидатної імуноглобулінової послідовності, тобто аналіз залишків, що впливають на здатність кандидатного імуноглобуліну зв'язуватися з його антигеном, наприклад, РОЇ К1. Таким чином, каркасні залишки (ЕК) можуть бути вибрані й скомбіновані з консенсусних і імпортних послідовностей так, щоб одержати бажані характеристики антитіла, наприклад, підвищену афінність до цільового(их) антигену(ів).
Гуманізування, перебудовування й конструювання антитіл згідно з даним винаходом можуть здійснюватися відповідно до будь-якого відомого способу, наприклад, але не обмежуючись перерахованим, способом описаним в Уміпіег (опез еї аї!., Майшге 321:522 (1986); Кіесптапп еї а!., Майте 332:323 (1988); Метовеуеєп еї аі!., Зсіеєпсе 239:1534 (1988)), бітв еї аї., У. Іттипої. 151: 2296 (1993); Споїпіа апа І евК, У. Мої. Вісі. 196:901 (1987), Сапег еї аї!., Ргос. Май). Асад. 5сі.
О.5.А. 89:4285 (1992); Ргезміа еї аї., 9. Іттипої. 151:2623 (1993), Патентах США під номерами 5639641, 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539, 4816567, РСТ/ И5ОВ8/16280,
О5Об6/18978, 0591/09630, 0591/05939, 0594/01234, (1889/01334, (891/01134, с892/01755,
УМО90/14443, МО90/14424, МО90/14430, ЕР 229246, 7557189, 7538195 і 7342110, причому кожне джерело включене у всій повноті в цей документ за допомогою посилання, включаючи згадані в них джерела.
У певних альтернативних варіантах втілення антитіло проти БОЇ К1 є людським антитілом.
Людські антитіла можуть бути прямо одержані з використанням різних технік, відомих у даній галузі техніки. Іморталізовані людські В-лімфоцити імунізовані іп мійго або виділені від імунізованого індивідуума, який створює антитіло проти антигену-мішені (Див, наприклад, Соїе еї аї., Мопосіопа! Апіїбодієх апа Сапсег Тнегару, Аїап В. і івв, р. 77 (1985); Воетег" єї аї., 1991, у.
Іттипої!., 147 (1):86-95; і Патент США 5750373). Також людське антитіло може бути вибране з фагової бібліотеки, у якій експресуються людські антитіла, наприклад, згідно Мацйднап еї аї., 1996, Маї. Віоїєсн., 14:309-314, ЗНеєї5 єї аЇ., 1998, Рос. Маїі!. Асад. Зсі., 95:6157-6162,
Ноодепроот і МуУіпієї, 1991, 9. Мої. Віої., 227:381, і Маї/Кк5 еї аї., 1991, 9. Мо). Війо)|., 222:581). Техніки одержання й використання фагових бібліотек антитіл також представлені в патентах США під номерами 5969108, 6172197, 5885793, 6521404, 6544731, 6555313, 6582915, 6593081, 6300064, 6653068, 6706484 і 7264963 і КоїШе єї аїЇ.,, 2007, 9. Мої. Віо., дої:10.1016/)Діпр.2007.12.018 (кожне джерело включене у всій повноті шляхом посилання).
Також у даній галузі техніки відомі стратегії дозрівання афінності й перетасування ланцюгів (Мак: сеї аї., 1992, Віо/Тесппоіоду 10:779-783, включене у всій повноті шляхом посилання), які можуть використовуватися для одержання високоафінних людських антитіл.
Гуманізовані антитіла також можуть бути одержані в трансгенних мишах, що містять локуси людських імуноглобулінів, які після імунізації здатні виробляти повний репертуар людських антитіл за відсутністю ендогенної продукції імуноглобуліну. Цей підхід описаний у патентах США 5545807, 5545806, 5569825, 5625126, 5633425 і 5661016.
Винахід також охоплює біспецифічні антитіла, які специфічно розпізнають людський рецептор фолієвої кислоти 1. Біспецифічні антитіла являють собою антитіла, які здатні специфічно розпізнавати і зв'язуватися із щонайменше двома різними епітопами. Різні епітопи можуть знаходитися або в одній і тій же молекулі (наприклад, в людському рецепторі фолієвої кислоти 1), або в різних молекулах, наприклад, антитіла можуть специфічно розпізнавати і зв'язуватися з людським рецептором фолієвої кислоти 1, а також, наприклад, 1) з ефекторною молекулою лейкоцита, наприклад, Т-клітинним рецептором (наприклад, СОЗ3) або БЕс- рецептором (наприклад, СО64, СО32 або СО16), або 2) із цитотоксичним агентом, що детально описане нижче.
Типові біспецифічні антитіла можуть зв'язуватися із двома різними епітопами, щонайменше один з яких походить від поліпептиду згідно з винаходом. Альтернативно анти-антигенне плече молекули імуноглобуліну може бути комбіноване із плечем, що зв'язується з триггерною молекулою лейкоцита, наприклад, Т-клітинною рецепторною молекулою (наприклад, СО2, СОЗ, сО028 або В7) або з Ес-Рецепторами до Ідс, так, щоб спрямовано діяти на механізми клітинного захисту клітини, що експресує конкретний антиген. Біспецифічні антитіла також можуть бо використовуватися для локалізації цитотоксичних агентів у клітин, що експресують конкретний антиген. Дані антитіла мають антигензв'язуюче плече і плече, що зв'язує цитотоксичний агент або радіонуклідний хелатор, наприклад, ЕОТОВЕ, ОРТА, РОТА або ТЕТА. Техніки одержання біспецифічних антитіл добре відомі в даній галузі техніки (Мійеїеїп еї аї., 1983, Маїиге 305:537- 539; Вгеппап еї аї., 1985, Зсієпсе 229:81; Бигевзп еї аі), 1986, МеїшШйоав5 іп Епгутої. 121:120;
ТгташпескКег єї аїІ., 1991, ЕМВО У. 10:3655-3659; Знаїабу еї аї., 1992, 9. Ехр. Мед. 175:217-225;
Козівіпу еї аї!., 1992, у). Іттипої. 148:1547-1553; Стибег еї аї., 1994, 9. Іттипої. 152:5368; патент
США 5731168). Також охоплюються антитіла з більше ніж двома валентностями. Наприклад, можуть бути одержані триспецифічні антитіла (Тий еї аї., У. Іттипої. 147:60 (1991)). Таким чином, у певних варіантах втілення антитіла проти БОЇ К1 є мультиспецифічними.
У певних варіантах втілення фрагмент антитіла пропонується для підвищення проникнення в пухлину. Для одержання фрагментів антитіл відомі різні техніки. Традиційно подібні фрагменти одержували за допомогою протеолітичного розщеплення цілих антитіл (див, наприклад, Могітоїо еї аї., 1993, Чдоигпа! ої Віоспетіса! апа Віорпузіса! Меїподь5 24:107-117;
Вгеппап еї аї.,, 1985, Зсіепсе, 229:81). У певних варіантах втілення фрагменти антитіл одержують рекомбінантними способами. Фрагменти Раб, Ем і з5сЕм можуть бути експресовані й секретовані з Е. соїї або інших клітин-хазяїв, що дозволяє виділяти більші кількості даних фрагментів. Подібні фрагменти антитіл можуть бути виділені з бібліотек антитіл фагів, які обговорювались вище. Наприклад, фрагмент антитіла може бути лінійним антитілом, описаним у патенті США 5641870, а також може бути моноспецифічним або біспецифічним. Інші техніки одержання фрагментів антитіл є очевидними для досвідченого фахівця.
Техніки можуть бути адаптовані, згідно із даним винаходом, для одержання одноланцюгових антитіл, специфічних до людського рецептора фолієвої кислоти 1 (див. патент США Мо 4946778). Крім цього, способи можуть бути адаптовані для конструювання бібліотек експресії
Раб (Низе, єї аїЇ., 5сівпсе 246:1275-1281 (1989)) для швидкої і ефективної ідентифікації моноклональних Баб-фрагментів з бажаною специфічністю до рецептора фолієвої кислоти 1 або їх похідних, фрагментів або гомологів. Фрагменти антитіл можуть бути одержані способами, відомими в даній галузі техніки, включаючи, але не обмежуючись перерахованим: (а) фрагмент
Карв)2г, одержаний при розщепленні молекули антитіла пепсином; (б) фрагмент Раб, утворений відновленням дисульфідних містків фрагмента К(аб)2, (в) фрагмент Раб, одержаний обробкою
Зо молекули антитіла папіном і відновником, і (г) фрагменти Гм.
Крім цього, може бути бажаним, особливо у випадку фрагментів антитіл, модифікувати антитіло, щоб збільшити його період напівжиття в сироватці. Цього можна досягти, наприклад, впровадженням епітопа зв'язування рятувального рецептора у фрагмент антитіла шляхом мутуванням відповідного регіону фрагмента антитіла або впровадженням епітопа в пептидний тег, який потім зливається з фрагментом антитіла на будь-якому кінці або всередині (наприклад, за допомогою ДНК-синтезу або пептидного синтезу)...
Даним винаходом також охоплюються гетерокон'югатні антитіла. Гетерокон'югатні антитіла складені двома ковалентно зв'язаними антитілами. Подібні антитіла були запропоновані для націлювання імунних клітин на небажані клітини (патент США Мо 4676980). Передбачається, що антитіла можуть бути приготовлені іп міго способами, відомими в синтетичній хімії білків, включаючи способи, у яких застосовуються перехресно-зшиваючі агенти. Наприклад, імунотоксини можуть бути сконструйовані з використанням дисульфідної обмінної реакції або шляхом створення тіоефірного зв'язку. Прикладами реактивів, придатних для цієї мети, служать імінотиолят і метил-4-меркаптобутиримідат.
Для цілей даного винаходу необхідно зазначити, що модифіковані антитіла можуть містити будь-який тип варіабельного регіону, який пропонується для зв'язування антитіла з поліпептидами людського РОЇ К1. У цьому зв'язку варіабельний регіон може містити або може походити від будь-якого типу ссавця, у якого може бути індукована гуморальна відповідь і можуть бути створені імуноглобуліни проти бажаного антигену, асоційованого з пухлиною. В силу цього варіабельний регіон модифікованих антитіл може, наприклад, походити від людини, миші, нелюдиноподібних приматів (наприклад, яванських мавп, макаків і т.д.) або вовків. У деяких варіантах втілення і варіабельний, і константний регіони модифікованих імуноглобулінів є людськими. В інших варіантах втілення варіабельні регіони порівнянних антитіл (які звичайно походять з нелюдських джерел) можуть бути сконструйовані або специфічно пристосовані так, щоб покращити зв'язуючу здатність або понизити імуногенність молекули. У цьому зв'язку варіабельні регіони, використовувані в даному винаході, можуть бути гуманізовані або змінені іншим способом за допомогою впровадження імпортованих амінокислотних послідовностей.
У певних варіантах втілення варіабельні домени і у важкому, і в легкому ланцюгах змінені щонайменше частковою заміною одного або більшої кількості регіонів, що визначають 60 комплементарність, і, при необхідності, заміною каркасного регіону і зміною послідовності. Хоча регіони, що визначають комплементарність, можуть походити від антитіла того ж класу або навіть підкласу, що й антитіло, від якого походить каркасний регіон, передбачається, що регіони, що визначають комплементарність, будуть походити від антитіла іншого класу і, в деяких варіантах втілення, від антитіла іншого виду. Може не бути необхідним заміняти всі регіони, що визначають комплементарність повним регіоном, що визначає комплементарність від донорського варіабельного регіону, щоб передати антигензв'язуючу здатність одного варіабельного домену іншому. Замість цього може бути необхідним тільки перенести ті залишки, які необхідні для підтримки активності антигензв'язуючого сайту. Пояснення представлені в патентах США під номерами 5585089, 5693761 і 5693762; у компетенції фахівця в даній галузі техніки проводити звичайні експерименти або дослідження і тести помилок для одержання функціонального антитіла зі зниженою імуногенністю.
Незважаючи на зміни у варіабельному регіоні, фахівцю в даній галузі техніки зрозуміло, що модифіковані антитіла згідно з даним винаходом охоплюють антитіла (наприклад, повнорозмірні антитіла або їх імунореактивні фрагменти), у яких щонайменше частина одного або більшої кількості константних доменів була видалена або змінена іншим способом для одержання бажаних біохімічних характеристик, наприклад, підвищення локалізації пухлини або зниження часу напівжиття в сироватці в порівнянні з антитілом із приблизно такою самою імуногенністю, яке має нативний або незмінений константний регіон. У деяких варіантах втілення константний регіон модифікованого антитіла містить людський константний регіон. Модифікації константного регіону, сумісні з даним винаходом, включають вставки, делеції або заміщення однієї або більше амінокислот в одному або більшій кількості доменів. Іншими словами, модифіковані антитіла, описані тут, можуть містити зміни або модифікації одного або більше із трьох константних доменів важкого ланцюга (СНІ, СН2 або СНЗ) і/або константних доменів легкого ланцюга (СІ). У деяких варіантах втілення маються на увазі модифіковані константні регіони, в яких один або більше доменів частково або повністю видалені. У деяких варіантах втілення модифіковані антитіла містять конструкції або варіанти з видаленими доменами, у яких був повністю видалений домен СН2 (ДСН 2-конструкції). У деяких варіантах втілення відсутній константний домен заміщений коротким амінокислотним спейсером (наприклад, з 10 залишками), який забезпечує деяку молекулярну гнучкість, що звичайно надається відсутнім
Зо константним регіоном.
Крім конфігурування, у даній галузі техніки відомо, що константний регіон опосередковує деякі ефекторні функції. Наприклад, зв'язування С1-компонента комплементу з антитілом запускає систему комплементу. Активація комплементу важлива для опосонізації і лізису клітинних патогенів. Активація комплементу також стимулює запальну відповідь і може бути залучена в аутоїмунну гіперчутливість. Крім цього, антитіла зв'язуються через Ес-регіон за допомогою Ес-рецепторного сайту в Ес-регіоні, що зв'язується з Ес-рецептором (ЕСЕ) на клітині.
Є ряд Ес-рецепторів, специфічних для різних класів антитіл, включаючи Ідс (гама-рецептори),
ІДЕ (ета-рецептори), ІДА (альфа-рецептори) і (ЯМ (мю-рецептори). Зв'язування антитіла з Ес- рецепторами на клітинних поверхнях запускає велику кількість важливих і різноманітних біологічних відповідей, включаючи поглинання і розщеплення покритих антитілом часток, виведення імунних комплексів, лізис клітинами-кілерами покритих антитілом клітин (називаний антитіло-залежною клітинно-опосередкованою цитотоксичністю або АЗКЦ), вивільнення запальних медіаторів, плацентарне перенесення і контроль продукції імуноглобулінів.
У певних варіантах втілення РОЇ К1-зв'язуючі антитіла забезпечують змінені ефекторні функції, що, у свою чергу, впливає на біологічний профіль антитіла, що вводиться. Наприклад, делеція або інактивація (через точкові мутації або інші способи) домену константного регіону може зменшувати Ес-рецепторне зв'язування циркулюючого модифікованого антитіла, підвищуючи локалізацію пухлини. В інших випадках модифікування константних регіонів, згідно з винаходом, може змінювати зв'язування з комплементом, зменшуючи період напівжиття в сироватці й приводячи до неспецифічного асоціювання кон'югованого цитотоксину. Можуть використовуватися й інші модифікації константного регіону для видалення дисульфідних зв'язків або олігосахаридних фрагментів, що підвищують локалізацію внаслідок підвищення антигенної специфічності або гнучкості антитіла. Аналогічним чином, модифікації константного регіону, відповідно до даного винаходу, можуть бути легко зроблені за допомогою відомих біохімічних технік або технік молекулярного інжинірингу, відомих досвідченому фахівцю.
У певних варіантах втілення РОЇ В1-зв'язуючий агент, який є антитілом, не має однієї або більшої кількості ефекторних функцій. Наприклад, у деяких варіантах втілення антитіло не проявляє антитіло-залежної клітинної цитотоксичності (АЗКЦ) і/або не проявляє комплемент- залежної цитотоксичності (КЗЦ). У певних варіантах втілення антитіло не зв'язується з Ес-
рецептором і/або факторами комплементу. У певних варіантах втілення антитіло не має ефекторної функції.
Необхідно зауважити, що в деяких варіантах втілення модифіковані антитіла можуть бути сконструйовані таким чином, що СН З-домен є злитим безпосередньо із шарнірним регіоном відповідних модифікованих антитіл. В інших конструкціях може бути бажаним впроваджувати пептидний спейсер між шарнірним регіоном і модифікованими доменами СН2 і/або СНЗ.
Наприклад, сумісні конструкції можуть експресуватися з видаленим СН 2-доменом і збереженим
СН З-доменом (модифікованим або немодифікованим), приєднаним до шарнірного регіону через спейсер, що містить 5-20 амінокислот. Подібний спейсер може бути доданий, наприклад, для того, щоб регуляторні елементи константного домену залишалися вільними і доступними, або для того, щоб шарнірний регіон залишався гнучким. Однак, необхідно зауважити, що амінокислотні спейсери в деяких випадках можуть бути імуногенними і викликати небажану імунну відповідь проти конструкції. Відповідно, у певних варіантах втілення будь-який спейсер, доданий до конструкції, буде відносно неімуногенним або навіть повністю неімуногенним, щоб забезпечити бажані біохімічні властивості модифікованих антитіл.
Крім делеції цілих доменів константних регіонів, необхідно прийняти до уваги, що антитіла згідно з даним винаходом можуть бути одержані за допомогою часткової делеції або заміни декількох або навіть однієї амінокислоти. Наприклад, мутація однієї амінокислоти в вибраних регіонах СН 2-домену може бути достатньою для часткового зменшення Ес-зв'язування і, як наслідок, для підвищення локалізації в пухлину. Аналогічно може бути бажаним видалити ту частину одного або більше доменів константних регіонів, яка контролює ефекторну функцію, що модулюється (наприклад, С1О)-зв'язування з комплементом). Подібні часткові делеції константних регіонів можуть покращувати вибрані характеристики антитіла (період напівжиття в сироватці), не торкаючи інші бажані функції, асоційовані з доменом константного регіону суб'єкта. Більше того, як показано вище, константні регіони пропонованих антитіл можуть бути модифіковані за допомогою мутування або заміщення однієї або більше амінокислот, покращуючи профіль одержаної конструкції. У цьому зв'язку можливо порушити активність, забезпечувану збереженим сайтом зв'язування (наприклад, Ес-зв'язування), частково зберігши конфігурацію й імуногенний профіль модифікованого антитіла. Деякі втілення можуть включати додавання однієї або більше амінокислот у константний регіон для покращення бажаних характеристик, наприклад, для зниження або підвищення ефекторної функції або для приєднання більшої кількості цитотоксинів або вуглеводів. У таких варіантах втілення може бути бажаним впроваджувати або реплікувати специфічні послідовності, що походять з вибраних доменів константних регіонів.
Даний винахід, крім цього, охоплює варіанти і еквіваленти, які є значною мірою гомологічними химерним, гуманізованим і людським антитілам або їх фрагментам, описаним далі. Вони можуть містити, наприклад, мутації консервативного заміщення, тобто заміщення однієї або більше амінокислот на споріднені. Наприклад, консервативне заміщення належить до заміщення амінокислоти на іншу амінокислоту, яка належить до того ж класу, наприклад, заміщення однієї кислотної амінокислоти на іншу кислотну амінокислоту, однієї основної амінокислоти на іншу основну амінокислоту або однієї нейтральної амінокислоти на іншу нейтральну амінокислоту. Те, що розуміється під консервативним заміщенням амінокислоти, є добре відомим в даній галузі техніки.
Поліпептиди згідно з даним винаходом можуть бути рекомбінантними поліпептидами, натуральними поліпептидами або синтетичними поліпептидами, що містять антитіло проти людського БОЇ 21 або його фрагмент. Деякі амінокислотні послідовності згідно з винаходом можуть варіюватися без істотного впливу на структуру і функцію білка. Таким чином, винахід, крім цього, включає варіації поліпептидів із вираженою активністю або варіації, що містять регіони антитіла проти білка людського рецептора фолієвої кислоти. Такі мутанти містять делеції, вставки, інверсії, повтори і типові заміни.
Поліпептиди і аналоги можуть бути далі модифіковані із впровадженням додаткових хімічних груп, які звичайно не входять до складу білків. Ці дериватизовані групи можуть покращувати розчинність, біологічний період напівжиття або абсорбцію білка. Групи також можуть знижувати або усувати небажані побічні ефекти білків і т. п. Огляд таких груп представлений в
ВЕМІМатТОМ'є РНАВМАСЕШТІСАЇ ЗСІЕМСЕ5, 201й єд., Маск Рибіїзніпу Со., Еавіюп, РА (2000).
Ізольовані поліпептиди, описані тут, можуть виготовлятися будь-яким придатним способом, відомим у даній галузі техніки. Такі способи варіюються від способів прямого синтезу білка до конструювання ДНК-послідовності, що кодує ізольовані поліпептидні послідовності й що експресує ці послідовності в підходящому трансформованому носії. У деяких варіантах втілення 60 ДНК-послідовність конструюється за допомогою рекомбінантної технології з виділенням або синтезом ДНК-послідовності кодуючої білок дикого типу, що становить інтерес. Необов'язково послідовність може бути мутагенізована сайт-специфічним мутагенезом для одержання її функціональних аналогів. Див., наприклад, 2оеїег еї аї., Ргос. Маг. Асай. сі. ОБА 81:5662-5066 (1984) і патент США Мо 4588585.
У деяких варіантах втілення ДНК-послідовність, кодуюча поліпептид, що становить інтерес, конструюється хімічним синтезом з використанням олігонуклеотидного синтезатора. Такі олігонуклеотиди можуть бути розроблені на підставі амінокислотної послідовності бажаного поліпептиду з вибором тих кодонів, які кращі у клітини-хазяїна, в якій виробляється рекомбінантний поліпептид, що становить інтерес. Можуть використовуватися стандартні способи синтезу ізольованої полінуклеотидної послідовності, кодуючої ізольований поліпептид, що становить інтерес. Наприклад, для конструювання зворотньо-трансльованого гена може використовуватися повна амінокислотна послідовність. Крім цього, може бути синтезований
ДНК-олігомер, що містить нуклеотидну послідовність, кодуючу окремий ізольований поліпептид.
Наприклад, можуть бути синтезовані, а потім зв'язані декілька малих олигонуклеотидів, кодуючих частини бажаного поліпептиду. Індивідуальні олігонуклеотиди, як правило, містять 5'- або 3'-липкі кінці для комплементарного з'єднання.
Після складання (за допомогою синтезу, сайт-спрямованого мутагенезу або іншого способу), полінуклеотидні послідовності, кодуючі конкретний поліпептид, який становить інтерес, будуть впроваджені у вектор експресії і оперативно зв'язані з послідовністю контролю експресії, необхідною для експресії білка в бажаному хазяїні. Правильність складання може бути підтверджена секвенуванням нуклеотидної послідовності, рестрикційним мапуванням (« експресією біологічно активного поліпептиду в підходящому хазяїні. Як відомо в даній галузі техніки, щоб досягти високих рівнів експресії трансфікованого гена у хазяїна, ген повинен бути оперативно пов'язаний з послідовностями контролю транскрипції і трансляції, функціональних у вибраного хазяїна.
У певних варіантах втілення для ампліфікації і експресії ДНК, що кодує антитіла проти людського БОЇВ! або їх фрагменти, використовуються рекомбінантні вектори експресії.
Рекомбінантні вектори експресії являють собою ДНК-конструкції, що реплікуються, які містять синтетичні або одержані із КДНК фрагменти ДНК, що кодують поліпептидний ланцюг антитіла
Зо проти РОЇ ВІ або його фрагмент, оперативно пов'язані з підходящими транскрипційними або трансляційними регуляторними елементами, що походять з генів ссавців, мікробів, вірусів або комах. Транскрипційна одиниця, як правило, містить об'єднання (1) генетичного елемента або елементів, які мають регуляторну роль при експресії гена, наприклад, транскрипційні промотори або енхансери, (2) структурної або кодуючої послідовності, що транскрибується у мРНК і транслюється в білок, і (3) підходящих послідовностей запуску і зупинника транскрипції і трансляції як детально описане нижче. Подібні регуляторні елементи можуть включати операторну послідовність для контролю транскрипції. Додатково можуть передбачатися: здатність до реплікації в хазяїні, обумовлена, як правило, джерелом реплікації, і селекційний ген для полегшення розпізнавання трансформантів. ДНК-регіони є оперативно зв'язаними, якщо вони функціонально відносяться один до одного. Наприклад, ДНК сигнального пептиду (секреторного лідера) оперативно пов'язана із ДНК поліпептиду, якщо вона експресується у вигляді прекурсору, який бере участь у секреції поліпептиду; промотор оперативно пов'язаний з кодуючою послідовністю, якщо він контролює транскрипцію послідовності; або рибосомний зв'язуючий сайт оперативно пов'язаний з кодуючою послідовністю, якщо він розташований таким чином, щоб дозволяти трансляцію. Структурні елементи, призначені для використання в системі експресії дріжджів, включають лідерну послідовність, що дозволяє позаклітинну секрецію клітиною-хазяїном трансльованого білка. Альтернативно, якщо рекомбінантний білок експресується без лідерної або транспортної послідовностей, він може містити М-термінальний залишок метіоніну. Цей залишок може потім відщеплюватися від рекомбінантного білка що експресується, для одержання кінцевого продукту.
Вибір послідовності, що контролює експресію, і вектора експресії залежить від вибору хазяїна. Може використовуватися велика кількість комбінацій хазяїв і векторів експресії.
Придатні вектори експресії для еукаріотних хазяїв включають, наприклад, вектори, що містять контрольні послідовності експресії з 5М40, бичачого вірусу папіломи, аденовірусу і цитомегаловірусу. Придатні вектори експресії в бактеріальних хазяїнах включають відомі бактеріальні плазміди, наприклад, плазміди з ЕхПегіспіа соїї, включаючи рем 1, рвВкК322, рМВе і їх похідні, більш широкий інтервал плазмід, наприклад, М1З3 і одноланцюгові ДНК нитчастих фагів.
Придатні клітини-хазяї для експресії РОЇ В1-зв'язуючого поліпептиду або антитіла (або бо ЕОЇ В1-білка для використання як антигену) включають клітини прокаріотів, дріжджів, комах і клітини вищих еукаріотів під контролем відповідних промоторів. Прокаріоти включають грамнегативні й грампозитивні організми, наприклад, Е. соїї або бацили. Вищі еукаріотні клітини включають установлені лінії клітин ссавців, описані вище. Також можуть використовуватися безклітинні системи трансляції. Підходящі вектори клонування і експресії для використання із клітинами-хазяїнами бактерій, грибів, дріжджів, ссавців були описані в роботі Рошмеїв5 еї аї. (Сіопіпд Месіогє: А І арогаїогу Мапиаї, ЕІсеміег, М.М., 1985), сутність якої включена в даний документ у всій повноті шляхом посилання. Додаткова інформація про способи одержання білків, включаючи одержання антитіл, доступна, наприклад, у патентній заявці США Мо 2008/0187954, патентах США під номерами 6413746 і 6660501, а також у міжнародній патентній заявці Мо УМО 04009823, кожна з яких включена в даний документ у всій повноті шляхом посилання.
Для експресії рекомбінантного білка також можуть успішно використовуватися різні культури клітин ссавців або комах. Експресія рекомбінантних білків у клітинах ссавців може проводитися тому, що такі білки піддаються правильному фолдингу, модифікуванню і повністю функціональні. Прикладами підходящих клітин-хазяїв ссавців служать лінії НЕК-293 ї НЕК-293Т,
СО5-7 клітин нирки мавпи, описані Сіитап (СеїЇ 23:175, 1981), інші клітинні лінії, здатні до експресування відповідного вектора, включаючи, наприклад, І-клітини, С127, ЗТ3, клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), клітинні лінії Неа і ВНК. Вектори експресії у ссавців можуть містити елементи, що не транскрибуються, наприклад, точку початку реплікації, відповідні промотор і енхансер, пов'язані з геном, що експресується, інші 5' або 3" фланкуючі послідовності, що не транскрибуються і 5' або 3' нетрансльовані послідовності, наприклад, необхідні сайти зв'язування з рибосомами, сайт поліаденилювання, донорний і акцепторний сайти сплайсингу і транскрипційні послідовності зупинника. Огляд бакуловірусних систем виробництва гетерологічних білків у клітинах комах представлений в роботі І исКом і Зиттегв,
Віо/Тесппоіоду 6:47 (1988).
Білки, що продукуються трансформованим хазяїном, можуть бути очищені будь-яким придатним способом. Такі стандартні способи включають хроматографію (наприклад, іонний обмін, афінну і ексклюзійну колоночну хроматографію), центрифугування, диференціальну розчинність або інші стандартні техніки очищення білків. Для полегшення очищення в афінній колонці, до білка можуть бути приєднані афінні мітки, наприклад, гексагістидин, домен, що зв'язує мальтозу, поверхнева послідовність вірусу грипу і глутатіон-5-трансфераза. Ізольовані білки можуть бути досліджені фізичними способами з використанням таких технік, як протеоліз, ядерний магнітний резонанс і рентгенівська кристалографія.
Наприклад, супернатанти із систем, що виділяють рекомбінантний білок у живильне середовище, можуть бути спочатку сконцентровані з використанням комерційно доступного фільтра для концентрації білків, наприклад, установок ультрафільтрації Атісоп або Міпйіроге
Реїїїсоп. Після етапу концентрації, концентрат може бути нанесений на придатний матрикс для очищення. Альтернативно може використовуватися аніонообмінна смола, наприклад, матрикс або субстрат з вільними діетиламіннетильними групами (ДЕАЕ). Матрикси можуть бути акриламідного, агарозного, декстранового, целюлозного або іншого типу, звичайно використовуваного при очищенні білків. Альтернативно може застосовуватися етап катіонного обміну. Придатні катіонообмінні агенти включають різні нерозчинні матрикси, що містять сульфопропільні або карбоксиметильні групи. Нарешті, для подальшого очищення РОЇ В1- зв'язуючого агента може застосовуватися один або більше етапів високоефективної рідинної хроматографії зі зворотними фазами (3Ф-ВЕРХ) з використанням гідрофобного ЗФ-ВЕРХ середовища, наприклад, силікагелю з вільними метильними або іншими аліфатичними групами.
Для одержання гомогенного рекомбінантного білка також можуть застосовуватися деякі або всі з викладених вище етапів очищення в різних комбінаціях.
Рекомбінантний білок, який продукується в бактеріальній культурі, може бути виділений, наприклад, за допомогою первинної екстракції із клітинних гранул з наступними одним і більшою кількістю етапів концентрування, висалювання, іонного обміну у водяному розчині або ексклюзійнної хроматографії. Для остаточного очищення може застосовуватися високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ). Мікробні клітини, що брати участь в експресії рекомбінантного білка можуть бути зруйновані будь-яким зручним способом, включаючи циклічне заморожування-відтавання, руйнування ультразвуком, механічне руйнування або використання агентів, що розщеплюють клітини.
Відомі в даній галузі техніки способи очищення антитіл і інших білків також включають способи, описані в патентних заявках США Мо 2008/0312425, 2008/0177048 і 2009/0187005, кожна з яких включена в даний документ у всій повноті за допомогою посилання.
У певних варіантах втілення РОЇ ВІ1-зв'язуючий агент являє собою поліпептид, що не є антитілом. У даній галузі техніки відома велика кількість способів ідентифікування і продукування поліпептидів, які не є антитілами, але які зв'язуються з високою афінністю з білками-мішенями. Див., наприклад, ЗКеїта, Сигг. Оріп. Віотесппої., 18:295-304 (2007), Ноззе евї аї., Ргоївіп бсівепсе, 15:14-27 (2006), СІіЇ! еї аІ., Си. Оріп. ВіоїесНпої., 17:653-658 (2006), Мудгеп,
ЕЕВ5 9., 275:2668-76 (2008) і ЗКеіта, РЕВ5 .)., 275:2677-83 (2008), кожне джерело включене в даний документ у всій повноті за допомогою посилання. У певних варіантах втілення для ідентифікації і продукування ЕОЇ В1-зв'язуючого поліпептиду застосовують технологію фагового дисплея. У певних варіантах втілення поліпептид містить каркасний білок, що належить до типу, вибраного із групи, яка складається з білка А, ліпокаліну, домену фібронектину, консенсусного повторного домену анкірину і тіоредоксину.
У деяких варіантах втілення агент є небілюовою молекулою. У деяких варіантах втілення агент є малою молекулою. Комбінаторні хімічні бібліотеки і техніки, що підходять для ідентифікації небілкових РОЇ Н1-зв'язуючих агентів, відомі фахівцям у даній галузі техніки. Див., наприклад, роботи Кеппеаду еї а!., У. Сотр. Спет, 10:345-354 (2008), Боїе евї аї, У. боть. Спет., 9:855-902 (2007) і Впацаспагууа, Си. Мей. Спет., 8:1383-404 (2001), які включені в даний документ у всій повноті за допомогою посилання. Ще в деяких варіантах втілення агент є вуглеводом, глікозаміногліканом, глікопротеїном або протеогліканом.
У деяких варіантах втілення агент є аптамером нуклеїнової кислоти. Аптамери це полінуклеотидні молекули, ви (наприклад, з випадкових або мутагенізованих пулів) на підставі їх здатності зв'язуватися з іншою молекулою. У деяких варіантах втілення аптамер містить ДНК- полінуклеотид. У певних альтернативних варіантах втілення аптамер містить РНК- полінуклеотид. В певних варіантах втілення аптамер містить один або більше модифікованих залишків нуклеїнових кислот. Способи одержання і скринінгу аптамерів нуклеїнових кислот на зв'язування з білками добре відомі в даній галузі техніки. Див., наприклад, патент США Мо 5270163, патент США Мо 5683867, патент США Мо 5763595, патент США Мо 6344321, патент
США Мо 7368236, патент США Мо 5582981, патент США Мо 5756291, патент США Мо 5840867, патент США Мо 7312325, патент США Мо 7329742, Міжнародну Патентну Публікацію Мо УМО 02/077262, Міжнародну Патентну Публікацію Мо УМО 03/070984, Патентну Заявку США Мо
Зо 2005/0239134, Патентну Заявку США Мо 2005/0124565 і Патентну Заявку США Мо 2008/0227735; кожне джерело включене в даний документ у всій повноті шляхом посилання.
І. Імунокон'югати
Даний винахід також спрямований на кон'югати (також називані тут імунокон'югатами), що містять антитіла проти БОЇК1І, фрагменти антитіл, функціональні еквіваленти, покращені антитіла і їх аспекти, описані тут, зв'язані або кон'юговані з цитотоксином (препаратом) або його пролікарським засобом. Таким чином, у певному варіанті втілення у винаході пропонується імунокон'югат, що містить гуманізоване антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, які специфічно зв'язуються з людським рецептором фолієвої кислоти 1, причому антитіло містить: (а) СОКІ важкого ланцюга, що містить СУЕММ (5ЕБЕО ІЮО МО: 1); СОК2 важкого ланцюга, що містить ВІНРУМОСОТЕУМО»Х аа ЕХаагХааз (ЗЕО ІЮО МО: 56); і СОКЗ важкого ланцюга, що містить
МрОБКАМОМ (5ЕО ІЮ МО: 3); і (6) СОК1 легкого ланцюга, що містить КАБОЗУЗЕАСТЗІ МН (ЗЕО ІО МО: 7); СОМК2 легкого ланцюга, що містить КАЗМІЕА (5ЕО ІО МО: 8); СОКЗ легкого ланцюга, що містить ООБКЕМРУТ (5ЕБО ІЮ МО: 9); де Хааї вибраний з К, 0, Н і ЕК; Хаа? вибраний з О, Н, М і КЕ; і Хааз вибраний з С, Е, Т, 5, А і М. У певних варіантах втілення антитіло є антитілом пиМом19, яке є описаним вище антитілом, що містить СОК2 важкого ланцюга
ВІНРУВаОЮТтТЕММОКРОа (5ЕО ІО МО: 2). В інших варіантах втілення антитіло є ЕК1-21 і містить (а) СОК1 важкого ланцюга, що містить З5УСМ5 (5ЕБО ІО МО: 30); СОК2 важкого ланцюга, що містить ТІЗБОСОБУТМ (ЗЕБО ОО МО: 31); і/або СОМКЗ важкого ланцюга, що містить рагааі МАМОМ (5ЕО ІЮ МО: 32); і (6) СОКІ1 легкого ланцюга, що містить КАЗОНІММУМГ А (ЗЕО
ІЮ МО: 27); СОК2 легкого ланцюга, що містить ЗАТ ЕТ (ЗЕО ІЮ МО: 28); і СОКЗ легкого ланцюга, що містить ОО'МУЗТРЕТ (ЗЕО ІЮО МО: 29). В інших варіантах втілення антитіло є ЕК1- 48 і містить: (аа СОКІ1 важкого ланцюга, що містить ТМУМ/МО (5ЕО ІЮ МО: 60); СОК2 важкого ланцюга, що містить АІМРОМООЗЕК (ЗЕО ІЮО МО: 61); або СОКЗ важкого ланцюга, що містить
КОСМУААХ (5ЕО ІО МО: 62); і/або (6) СОМКІ1 легкого ланцюга, що містить КАБЕМІУЗМІ А (ЗЕО
ІЮО МО: 57); СОВ2 легкого ланцюга, що містить ААТМАЮ (ЗЕО ІЮ МО: 58); і СОКЗ легкого ланцюга, що містить ОНЕУМАБРУТ (ЗЕО ІЮО МО: 59). В інших варіантах втілення антитіло є ЕК1- 49 і містить: (ах СОК1 важкого ланцюга, що містить ТМУУММУ (ЗЕО ІЮ МО: 66); СОК2 важкого ланцюга, що містить АІМРОМЗОТТ (ЗЕО ІО МО: 67); і/або СОКЗ важкого ланцюга, що містить
ЕНОУСАМОХУ (ЗЕО ІО МО: 68); і/або (6) СОКІ1 легкого ланцюга, що містить КАЗЕМІМТМІ А (ЗЕО 60 ІЮО МО: 63); СОМК2 легкого ланцюга, що містить ТАЗМАЮ (ЗЕО ІО МО: 64); і СОКЗ легкого ланцюга, що містить ОНЕУМУМ5РУТ (ЗЕО ІЮ МО: 65). В інших варіантах втілення антитіло є ЕК1- 57 і містить: (а) СОКІ важкого ланцюга, що містить Б5ЕОМН (5ЕО ІЮО МО: 72); СОМ2 важкого ланцюга, що містить МІЗ5О55ТІ5 (ЗЕО ІО МО: 73); або СОКЗ важкого ланцюга, що містить
ЕАМО5ЗМЕМХУ (5ЕО ІО МО: 74); і/або (6) СОК!І1 легкого ланцюга, що містить КАБОМІМММІ Н (ЗЕО
ІЮО МО: 69); СОК2 легкого ланцюга, що містить УУБОБМ5 (5БО ІЮ МО: 70); і СОКЗ легкого ланцюга, що містить ООЗМ5УМРНУТ (5ЕО ІО МО: 71). У ще одному варіанті втілення антитіло є
ЕВ1-65 і містить: (а) СОКІ важкого ланцюга, що містить Т2МТМН (5ЕБО ІЮ МО: 78); СОК2 важкого ланцюга, що містить МІМРІЗОМТМ (ЗЕО ІЮ МО: 79); і/або СОКЗ важкого ланцюга, що містить ССБАМУСОККРМОМ (5ЕБЕО ІЮ МО: 80); і/або (6) СОКІ легкого ланцюга, що містить
КАБОММОРММА (ЕС ІЮ МО: 75); СОК2 легкого ланцюга, що містить БАБУКУЗ (5ЕБЕО ІЮО МО: 16); і СОКЗ легкого ланцюга, що містить ООУМЗУРУТ (ЗЕО ІЮ МО: 77).
Підходящі препарати і їх пролікарські засоби відомі в даній галузі техніки. В певних варіантах втілення препарати або пролікарські засоби можуть бути цитотоксичними агентами.
Цитотоксичний агент, використовуваний у цитотоксичному кон'югаті згідно із даним винаходом, може бути будь-якою сполукою, що приводить клітину до загибелі або індукує загибель клітини, або таким, що деяким чином зменшує життєздатність клітини, і може включати, наприклад, майтансиноїди і аналоги майтансиноїдів, бензодіазепіни, таксоїди, СС-1065 і аналоги СС-1065, дуокарміцин і аналоги дуокарміцину, енедіїни, наприклад, каліхеаміцини, доластатин і аналоги доластатину, включаючи ауристатини, похідні томаїміцину, похідні лептоміцину, метотрексат, цисплатин, карбоплатин, даунорубіцин, доксорубіцин, вінкристин, вінбластин, мелфалан, мітоміцин С, хлорамбуцил і морфоліно-доксорубіцин. В певних варіантах втілення цитотоксичні агенти являють собою майтансиноїди і аналоги майтансиноїдів.
Такі кон'югати можуть бути одержані з використанням зшиваючої групи, щоб з'єднати препарат або його пролікарський засіб з антитілом або його функціональним еквівалентом.
Придатні зшиваючі групи добре відомі в даній галузі техніки і включають, наприклад, дисульфідні групи, тіоефірні групи, кислото-лабільні групи, фотолабільні групи, пептидаза- лабільні групи і естераза-лабільні групи.
Препарат або його пролікарський засіб можуть бути, наприклад, з'єднані з антитілом проти
РОЇВ або з його фрагментом через дисульфідний зв'язок. Зшиваюча молекула або
Зо перехресно-зшиваючий агент містять реактивну хімічну групу, яка може взаємодіяти з антитілом проти БОЇ ВТ або з його фрагментом. В певних варіантах втілення реактивними хімічними групами для взаємодії з агентом, що зв'язуються із клітиною є М-сукцинімідилові складні ефіри і
М-сульфосукцинімідилові складні ефіри. Додатково зшиваюча молекула містить реактивну хімічну групу, в деякихз втіленнях - дитіопіридильну групу, здатну до взаємодії з препаратом з утворенням дисульфідного зв'язку. В певних варіантах втілення зшиваючі молекули включають, наприклад, М-сукцинімідил 3-(2-піридилдитио) пропіонат (5РОР) (див., наприклад, Сагібззоп еї аІ., Віоснет. 9., 173: 723-737 (1978)), М-сукцинімідил 4-(2-піридилдитіо)бутаноат (ЗРОВ) (див., наприклад, патент США Мо 4563304), М-сукцинімідил 4-(2-піридилдитіо)2-сульфобутаноат (5йІо-
ЗРОВ) (див. публікацію США Мо 20090274713), М-сукцинімідил 4-(2-піридилдитіо) пентаноат (ЗРР) (див., наприклад, САБЗ 341498-08-6), 2-імінотіолан або оцтовоянтарний ангідрид.
Наприклад, антитіло або агент, що зв'язує клітину, може бути модифікований перехресно- зшиваючими реагентами, і антитіло або агент, що зв'язує клітину, який містить вільні або захищені тіолові групи, потім взаємодіє з майтансиноїдом, що містить дисульфід або тіол з утворенням кон'югатів. Кон'югати можуть бути очищені за допомогою хроматографії, включаючи, але не обмежуючись перерахованим, ВЕРХ, ексклюзійну, адсорбційну, іонообмінну і афінну хроматографію, або за допомогою фільтрації в тангенційному потоці. В певних варіантах втілення антитіло проти РОЇ КІ зв'язане із цитотоксином через лінкер 5РОВ або 5!о-
ЗРОВ. У певному втіленні антитіло пиМом19 зв'язане із цитотоксином через лінкер 5РОВ або 5о-5РОВ.
В іншому аспекті даного винаходу антитіло проти РОЇ ВІ з'єднане із цитотоксичними препаратами через дисульфідні зв'язки і поліетиленгліколевий спейсер для збільшення активності, розчинності або ефективності імунокон'югата. Подібні гідрофільні розщеплювані лінкери описані в М/О02009/0134976. Додатковою перевагою такого типу лінкерів є бажана висока кількість мономерів і мінімальна агрегація кон'югатів антитіло-препарат. У даному аспекті специфічно розглядаються кон'югати агентів, що зв'язують клітини, і препаратів, з'єднаних через дисульфідну групу (-5-5-), що несуть полієтиленгліколеві спейсери (СНоСНгО) п-1-14) з вузьким інтервалом навантаження препаратом в 2-8, які мають відносну високу активність проти пухлинних клітин і мають бажані біохімічні властивості, а саме - високий вихід кон'югації і високий вміст мономера з мінімальною агрегацією білка.
У даному аспекті специфічно розглядається кон'югат антитіла проти РОЇ ВІ і препарату формули (І) або кон'югат формули (1:
А-ІХА(-СНАСНгО-)и-Х-СДт (І)
ІС-х--СНАСНг2О-)и-АХЦт-А (Г), де:
А позначає антитіло проти РОЇ ВІ або його фрагмент;
С позначає цитотоксин або препарат;
Х позначає аліфатичну, ароматичну або гетероциклічну одиницю, приєднану до агента, що зв'язується з клітиною через тіоефірний зв'язок, амідний зв'язок, карбаматний зв'язок або ефірний зв'язок;
У позначає аліфатичну, ароматичну або гетероциклічну одиницю, приєднану до препарату через дисульфідний зв'язок;
І дорівнює 0 або 1; т є цілим числом від 2 до 8; і п є цілим числом від 1 до 24.
У певних варіантах втілення т є цілим числом від 2 до 6.
У певних варіантах втілення т є цілим числом від З до 5.
У певних варіантах втілення п є цілим числом від 2 до 8. Альтернативно, як показано, наприклад, у патентах США під номерами 6441163 і 7368565, препарат спочатку може бути модифікований із впровадженням реактивної складноефірної групи, здатної взаємодіяти з агентом, що зв'язується з клітиною. Взаємодія даних препаратів, що містять активований зшиваючий фрагмент з агентом, що зв'язуються із клітиною - ще один способ одержання кон'югата агента, що зв'язується з клітиною і препарату. Майтансиноїди також можуть бути зшиті з антитілом проти РОЇ ВТ або його фрагментом за допомогою зшиваючих ПЕГ груп, як описано, наприклад, у патенті США 6716821. Ці нерозщеплювані ПЕГ-групи є розчинними у воді і неводних розчинниках і можуть використовуватись для з'єднання одного і більше цитотоксичних агентів з агентом, що зв'язується з клітиною. Прикладами ПЕГ-зв'язуючих груп служать гетеробіфункціональні ПЕГ-лінкери, що реагують із цитотоксичними агентами і агентами, які зв'язуються із клітиною на протилежних кінцях лінкерів через функціональну
Зо сульфгідрильну або дисульфідну групу на одному кінці і активну складноефірну групу на іншому кінці. Як загальний приклад синтезу цитотоксичного кон'югату з використанням ПЕГ-лінкерних груп, дається посилання на патент США 6716821, який включений у даний документ у всій повноті шляхом посилання. Синтез починається з взаємодії одного або більше цитотоксичних агентів, що несуть реактивний ПЕГ-фрагмент із агентом, що зв'язується з клітиною, що приводить до заміщення термінальної активної складноефірної групи кожного реактивного ПЕГ- фрагмента на амінокислотний залишок агента, що зв'язується з клітиною, з утворенням цитотоксичного кон'югата, що містить один або більше цитотоксичних агентів, ковалентно зв'язаних з агентом, що зв'язуються із клітиною через ПЕГ-лінкерну групу. Альтернативно клітинне зв'язування може бути модифіковане біфункціональним ПЕГ-перехресно-зшиваючим агентом для введения реактивного дисульфідного фрагмента (например, піридилдисульфіду), який потім може бути оброблений майтансиноїдом, що містить тіол з утворенням кон'югата. В іншому способі клітинне зв'язування може бути модифіковане біфункціональним ПЕГ- перехресно-зшиваючим агентом для введения тіолового фрагмента, який потім може бути оброблений реактивним майтансиноїдом, що містить дисульфід (наприклад, що містить піридилдисульфід) з утворенням кон'югата.
Також можуть бути одержані кон'югати антитіло-майтансиноїд з нерозщеплюваними зв'язками. Подібні перехресно-зшиваючі агенти описані у даній галузі техніки (див. ТНегто
Зсіепійіс Рієгсе СтозвіїпКкіпд Тесппіса! Напароок і публікацію США Мо 2005/0169933) і включають, не обмежуючись перерахованим, М-сукцинімідил-4-(малеімідометил) циклогексанкарбоксилат (5МОС), М-сукцинімідил-4-(М-малеїмідометил)-циклогексан-1-карбокси-(б-амідокапроат), який є "довголанцюжковим" аналогом МОСС (10-5МСС), к-малеіїмідоундеканової кислоти /М- сукцинімідиловий складний ефір (КМИОА), В-малеімідопропанової кислоти М-сукцинімідиловий складний ефір (ВМРБ), у-малеіїмідобутанової кислоти М-сукцинімідиловий складний ефір (СМВ5), є-малеімідокапронової кислоти М-гідроксисукцинімідиловий складний ефір (ЕМСО5), т- малеімідобензоїл-М-гідроксисукцинімідиловий складний ефір (МВ5), М-(а-малеїмідоацетокси)- сукцинімідний складний ефір (АМА5), сукцинімідил-6-(ВД-малеімідопропіонамідо)гексаноат (5МРН), М-сукцинімідил-4-(р-малеімідофеніл)-бутират (ЗМРВ) і М-(р-малеімідофеніл)ізоціанату (РМРІ), М-сукцинімідил-4-(йодоацетил)-амінобензоат (5ІАВ), М-сукцинімідилиодоацетат (БА), М- сукцинімідилбромацетат (5ВА) і М-сукцинімідил-3-(бромацетамідо)пропіонат (5ВАР). У певних бо варіантах втілення антитіло модифікують перехресно-зшиваючими реагентами, наприклад,
сукцинімідил и 4-(М-малеімідометил)-циклогексан-і-кабоксилатом (ЗМСОСС), сульфо-5МОС, малеїімідобензоїл-М-гідроксисукцинімідним складним ефіром (МВ5), сульфо-МВ5 або сукцинімідил-йодоацетатом, як описано в літературі, для впровадження 1-10 реактивних груп (уозпаке еї аї, Єик. 9. Віоспет., 101:395-399 (1979); Назпіда еї аї, 9. Арріїєй Віоспет., 56-63 (1984); ї и еї аї, Віоспет., 18:690-697 (1979)). Модифіковане антитіло потім взаємодіє з похідним майтансиноїду, що містить тіол з одержанням кон'югата. Кон'югат може бути очищений за допомогою гель-фільтрації через колонку Зерпадех 525 або діалізом, або фільтрацією в тангенціальному потоці. Модифіковані антитіла обробляють майтансиноїдом, що містить тіол (1-2 молярних еквівалента/малеіїмідну групу), кон'югати антитіло-майтансиноїд очищають шляхом гель-фільтрації через колонку зерпадех 0-25, хроматографією на керамічній колонці з гідроксиапатитом, діалізом або фільтрацією в тангенціальному потоці, або за допомогою комбінації способів. Звичайно до одного антитіла приєднується 1-10 майтансиноїдів.
Один спосіб полягає в модифікації антитіл із сукцинімідил 4-(М-малеіїмідометил)- циклогексан-1- карбоксилатом (5МСС) для впровадження малеіїмідних груп з наступною взаємодією модифікованого антитіла з майтансиноїдом, що містиь тіол з утворенням тіоефір-зв'язаного кон'югата. У ньому також виходять кон'югати, що містять 1-10 молекул препарату на одну молекулу антитіла. Кон'югати майтансиноїдів з антитілами, фрагментами антитіл, білюовими гормонами, білковими факторами росту і іншими білками одержують аналогічним способом.
У іншому аспекті винаходу ЕОЇ В1-антитіло (наприклад, пиМом19, ЕВ1-21, ЕВ1-48, ЕВ1-49,
ЕВ1-57 або ЕН1-65) з'єднано з препаратом через нерозщеплюваний зв'язок, за допомогою ПЕГ- спейсеру. Придатні перехресно-зшиваючі реактиви, що містять гідрофільні ланцюги ПЕГ, які утворюють зшивки між препаратом і антитілом проти РОЇ НІ, добре відомі в даній галузі техніки або є комерційно доступними (наприклад, від компанії Оцапіа Віодезідп, Пауеєлл, Огайо).
Придатні перехресно-зшиваючі реактиви, що містять ПЕГ, також можуть бути синтезовані з комерційно доступних ПЕГ з застосуванням стандартних технік хімічного синтезу, відомих фахівцям у даній галузі техніки. Препарати можуть взаємодіяти з біфункціональними лінкерами, що містять ПЕГ з утворенням сполук з наступною формулою: 72-ХА(-СН»А-СНе-оО-)-Ур-0 способами, докладно описаними у патентній публікації США 20090274713 ї в УМО2009/0134976, які потім можуть взаємодіяти з агентом, що зв'язується з клітиною з утворенням кон'югата.
Зо Альтернативно клітинне зв'язування може бути модифіковане біфункціональним ПЕГ- перехресно-зшиваючим агентом для введення тіол- реактивної групи (наприклад, малеїімідної або галоацетамідної), який потім може бути оброблений майтансиноїдом, що містить тіол з утворенням кон'югата. В іншому способі клітинне зв'язування може бути модифіковане біфункціональним ПЕГ-перехресно-зшиваючим агентом для введення тіол-реактивного майтансиноїду (наприклад, майтансиноїду, що несе малеїімідну або галоацетамідну групу) з утворенням кон'югата.
Відповідно, інший аспект даного винаходу - кон'югат антитіла проти БОЇ К1 формули (ІІ) або формули (ІІ):
А-ІХА-СНА СНо-О-)и-МУр-СІт (ІІ)
Іб-Же-(-СНАСН-О-)и-АХЦт-А (І), де А позначає антитіло проти БОЇ К1 або його фрагмент;
С позначає цитотоксин або препарат;
Х позначає аліфатичну, ароматичну або гетероциклічну одиницю, приєднану до агента, що зв'язується з клітиною через тіоефірний зв'язок, амідний зв'язок, карбаматний зв'язок або простий ефірний зв'язок;
У позначає аліфатичну, ароматичну або гетероциклічну одиницю, приєднану до препарату через ковалентний зв'язок, вибраний із групи, яка складається з тіоефірного зв'язку, амідного зв'язку, карбаматного зв'язку, простого ефірного зв'язку, амінного зв'язку, вуглець-вуглецевого зв'язку і гідразонового зв'язку;
БО І дорівнює 0 або 1; р дорівнює 0 або 1; т є цілим числом від 2 до 15; і п є цілим числом від 1 до 2000.
У певному варіанті втілення т є цілим числом від 2 до 8; і
У певному варіанті втілення п є цілим числом від 1 до 24.
У певному варіанті втілення т є цілим числом від 2 до 6.
У деяких варіантах втілення п є цілим числом від 2 до 8.
У деяких варіантах втілення т є цілим числом від З до 5. У певному варіанті втілення антитіло є пиМом19. В іншому варіанті втілення антитіло є ЕК-1-21. В іншому варіанті втілення
Зо антитіло є ЕК-1-48. В іншому варіанті втілення антитіло є ЕК-1-49. В іншому варіанті втілення антитіло є ЕК-1-57. В іншому варіанті втілення антитіло є ЕК-1-65.
Прикладами придатних лінкерів, що містять ПЕГ служать лінкери, що мають М-сукцинімідил складноефірним або М-сульфосукцинімідил складноефірним фрагментом, здатні взаємодіяти з антитілом проти РОЇ ВІ або з його фрагментом, а також малеіїмідний або галоацетиловий фрагмент для реакції із сполукою. ПЕГ-спейсер може бути впроваджений у будь-який перехресно-зшиваючий агент, відомий у даній галузі техніки, за допомогою способів, описаних тут.
Велика кількість лінкерів докладно описана в патентних публікаціях США під номерами 20050169933 і 20090274713, а також в УМО2009/0134976, вміст яких включений в даний документ у всій повноті шляхом посилання..
Даний винахід включає аспекти, в яких приблизно від 2 до приблизно 8 молекул препарату ("навантаження препарату"), наприклад, майтансиноїду, приєднані до антитіла проти ЕОЇ В1 або до його фрагменту, причому протипухлинний ефект кон'югата набагато більш високий, ніж у випадку навантаження препарату меншою або більшою кількістю молекул препарату, приєднаних до такого ж агента, що з'єднується з клітиною. "Навантаження препарату", при використанні тут, відноситься до кількості молекул препарату (наприклад, майтансиноїду), які можуть бути приєднані до агента, що зв'язується з клітиною (наприклад, з антитілом проти
ЕОГ ВІ або його фрагментом). В одному аспекті кількість молекул препарату, які можуть бути приєднані до агента, що зв'язується з клітиною, може дорівнювати в середньому від приблизно 2 до приблизно 8 (наприклад, 1,9,2,0,2,1,22,2,3,24,2,5,2,6,2,7,2,8,2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8,3,9,4,0,4,1,42,4,3,4,4,4,5,4,6,4,7,4,8,4,9,5,0,5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8,5,9,6,0,6,1,6,2,6,3,6,4,6,5,6,6,6,7,6,8,6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1). В певних варіантах втілення препарат являє собою М2-деацетил-М2-(З-меркапто-1- оксопропіл)-майтансин (ОМІ1) або М2-деацетил-М2-(4-меркапто-4-метил-1-оксопентил) майтансин (ОМА). Таким чином, у певному варіанті втілення антитіло пПиМом19 кон'юговане з
ОМІ1 або ОМУа. В іншому варіанті втілення антитіло ЕК-1-21 кон'юЮюговане з ОМІ або ОМА. В іншому варіанті втілення антитіло ЕК-1-44 кон'юговане з ОМІ або ОМ4. В іншому варіанті втілення антитіло ЕК-1-49 кон'юговане з ОМІ1 або ОМА. В іншому варіанті втілення антитіло ЕК-
Зо 1-57 кон'юговане з ОМІ або ОМА. В іншому варіанті втілення антитіло ЕК-1-65 кон'юговане з
ОМ або ОМА.
Таким чином, в одному аспекті імунокон'югат містить 1 майтансиноїд на антитіло. В іншому аспекті імунокон'югат містить 2 майтансиноїди на антитіло. В іншому аспекті імунокон'югат містить З майтансиноїди на антитіло. В іншому аспекті імунокон'югат містить 4 майтансиноїди на антитіло. В іншому аспекті імунокон'югат містить 5 майтансиноїдів на антитіло. В іншому аспекті імунокон'югат містить 6 майтансиноїдів на антитіло. В іншому аспекті імунокон'югат містить 7 майтансиноїдів на антитіло. В іншому аспекті імунокон'югат містить 8 майтансиноїдів на антитіло.
В одному аспекті імунокон'югат містить від приблизно 1 до приблизно 8 майтансиноїдів на антитіло. В іншому аспекті імунокон'югат містить від приблизно 2 до приблизно 7 майтансиноїдів на антитіло. В іншому аспекті імунокон'югат містить від приблизно 2 до приблизно 6 майтансиноїдів на антитіло. В іншому аспекті імунокон'югат містить від приблизно 2 до приблизно 5 майтансиноїдів на антитіло. В іншому аспекті імунокон'югат містить від приблизно З до приблизно 5 майтансиноїдів на антитіло. В іншому аспекті імунокон'югат містить від приблизно З до приблизно 4 майтансиноїдів на антитіло.
В одному аспекті в композиції, що містить імунокон'югати, міститься в середньому від приблизно 2 до приблизно 8 (наприклад, 1,9,2,0,2,1,22,2,3,24,2,5,26,2,7,2,8,2,9, 3,0, 31, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9,4,0,4,1,42, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6,4,7,4,68,4,9,5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6,5,7,5,8,5,9,6,0,6,1,6,2,6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1) молекул препарату (наприклад, майтансиноїдів), приєднаних до антитіла. В одному аспекті в композиції, що містить імунокон'югати, міститься в середньому від приблизно 1 до приблизно 8 молекул препарату (наприклад, майтансиноїдів) на антитіло. В одному аспекті в композиції, що містить імунокон'югати, міститься в середньому від приблизно 2 до приблизно 7 молекул препарату (наприклад, майтансиноїдів) на антитіло. В одному аспекті в композиції, що містить імунокон'югати, міститься в середньому від приблизно 2 до приблизно б молекул препарату (наприклад, майтансиноїдів) на антитіло. В одному аспекті в композиції, що містить імунокон'югати, міститься в середньому від приблизно 2 до приблизно 5 молекул препарату (наприклад, майтансиноїдів) на антитіло. В одному аспекті в композиції, що містить імунокон'югати, міститься в середньому від приблизно З до приблизно 5 молекул препарату бо (наприклад, майтансиноїдів) на антитіло. В одному аспекті в композиції, що містить імунокон'югати, міститься в середньому від приблизно З до приблизно 4 молекул препарату (наприклад, майтансиноїдів) на антитіло. В одному аспекті композиція, що містить імунокон'югати, містить від приблизно 3,5 до приблизно 4 молекул препарату (наприклад, майтансиноїдів) на антитіло.
В одному аспекті в композиції, що містить імунокон'югати, міститься в середньому приблизно 220,5, приблизно 2,5240,5, приблизно 320,5, приблизно 3,5:20,5, приблизно 40,5, приблизно 4,5:20,5, приблизно 520,5, приблизно 5,520,5, приблизно 620,5, приблизно 6,5:0,5, приблизно 720,5, приблизно 7,5240,5 або приблизно 85240,5 молекул препарату (наприклад, майтансиноїдів), приєднаних до антитіла. В одному аспекті в композиції, що містить імунокон'югати, міститься в середньому приблизно 3,54-0,5 молекул препарату (наприклад, майтансиноїдів) на антитіло.
Антитіло проти РОЇ В1 або його фрагмент можуть бути модифіковані при взаємодії антитіла проти РОЇ ВІ або його фрагмента з біфункціональним перехресно-зшиваючим реагентом, утворюючи ковалентно зв'язану молекулу лінкера з антитілом проти БОЇВ або його фрагментом. При використанні тут, термін "біфункціональний перехресно-зшиваючий реагент" являє собою будь-який хімічний фрагмент, який ковалентно з'єднує агент, що з'єднується з клітиною, з препаратом, наприклад, препаратом, описаним тут. В іншому способі частина зв'язуючого фрагмента надається препаратом. У цьому зв'язку препарат містить зв'язуючий фрагмент, що є частиною більшої молекули лінкера, який використовується для зчленування агента, що з'єднується з клітиною, з препаратом. Наприклад, для утворення майтансиноїду
ОМІ, бічний ланцюг С-З3-гідроксильної групи майтансину модифікується таким чином, щоб у ньому містилась вільна сульфгідрильна група (5Н). Дана тіольована форма майтансину може взаємодіяти з модифікованим агентом, що зв'язуються із клітиною, з утворенням кон'югата.
Таким чином, у підсумку лінкер складається з двох компонентів: одного, наданого перехресно- зшиваючим реактивом, і другого, наданого бічним ланцюгом ОМ.
Молекули препаратів також можуть бути пов'язані з молекулами антитіл через проміжну молекулу-носій, наприклад, альбумін сироватки.
При використанні тут вислів "зв'язаний з агентом, що з'єднуються із клітиною" або "зв'язаний з антитілом проти РОЇ ВТ або його фрагментом" стосується кон'югатної молекули, що містить щонайменше одне похідне препарату, пов'язане з агентом, що з'єднується з клітиною, антитілом проти БОЇВ або його фрагментом через відповідну зшиваючу групу, або її прекурсор. У певних варіантах втілення зшиваюча група являє собою 5МСОС.
У певних варіантах втілення цитотоксичні агенти, що використовуються в даному винаході, являють собою майтансиноїди і аналоги майтансиноїдів. Приклади придатних майтансиноїдів включають складні ефіри майтансинолу і аналоги майтансинолу. Також включені будь-які препарати, що інгібують утворення мікротрубочок, високотоксичні для клітин ссавців, такі як майтансинол і його аналоги.
Прикладами підходящих складних ефірів майтансинолу служать ефіри з модифікованим ароматичним кільцем і ефіри з модифікаціями в інших позиціях. Такі підходящі майтансиноїди описані в патентах США під номерами 4424219, 4256746, 4294757, 4307016, 4313946, 4315929, 4331598, 4361650, 4362663, 4364866, 4450254, 4322348, 4371533, 5208020, 5416064, 5475092, 5585499, 5846545, 6333410, 7276497 і 7473796.
У певному варіанті втілення в імунокон'югатах згідно з даним винаходом як цитотоксичний агент використовується майтансиноїд, що містить тіол (ОМІ), який за номенклатурою називається М2-деацетил-М2-(З-меркапто-1-оксопропілу-майтансином. ОМ'і має наступну структурну формулу (ІП): в) кл ах оо і мео М о (в) й мч
Меб" (І)
В іншому варіанті втілення в кон'югатах згідно з даним винаходом як цитотоксичний агент використовується /М--деацетил-М-(4-метил-4-меркапто-1-оксопентил)-майтансин (наприклад,
ОМа4). ОМА має наступну структурну формулу (ІМ):
Ж о Х вн ва о.
М | у, А ч й й їх 5 М є) ме НО /Н (М
Іншим майтансиноїдом, що містить бічний ланцюг із стеричним тіоловим зв'язком, є М2- деацетил-М-2(4-меркапто-1-оксопентил)у-майтансин (називаний ОМ3), що має наступну структурну формулу (М): (6) (в) ЗН ах бо
Мео. М о) (6) ка чо он
Мео - (М)
Будь-який майтансиноїд, описаний у патентах США під номерами 5208020 і 7276497, може використовуватися в кон'югаті згідно з даним винаходом. У цьому зв'язку розкриття 5208020 і 7216697 повністю включені в даний документ шляхом посилання.
Велика кількість позицій у майтансиноїдах може служити для хімічного зв'язування з лінкером. Наприклад, пердбачається, що підходящим буде положення С-3 з гідроксильною групою, положення С-14, модифіковане гідроксиметильною групою, положення С-15, модифіковане гідроксильною групою, і положення С-20 з гідроксильною групою. У певних варіантах втілення використовується положення С-3. В певних варіантах втілення використовується положення С-3 майтансинолу.
Структури певних кон'югатів показані нижче:
Ар-Антитіло
ВАН або Ме в
А ов
М З д о МмлллАЬ с оо о! сер х мео, М ' о в (в)
А ня мес но м о АЬ - Антитело е Н Е - Н или Ме
ОМ: В-Н, д-1
Ома: кК- СНз,д-2 п -1-24 2-8
АБ-РЕО-МаІ-ЮМ1/0ЮМА4 (м)
Ар-Антитіло
У Ху (в) (в)
М 8 Н сеї | й ни мили АВ
Мео М о н Ге! о (о!
ДЕН мо АЬ - Антитело меОо НО НН 2-5
АБ-РЕС4-МаІ-ЮМІ (МІ)
Ар-Антитіло
В-Н або Ме в іч уунь
М 8 (в) млагдо се її | " а п
МеО М о В о о шт мо меОо НО н АЬ - Антитело
КЕ - Нили Ме
ОМ: В-Н, д-1 рма: в- СНУ, 4-2 п - 1-24 2-8
АВБ-РЕС-БІА-ЮМ1І/ЮМА ; (МИ)
Ар-Антитіло
Е (в) о А Ж о о ва 5
М М сі у ІН | ж
МеОо М " Х х о
КЗ
(в) -- дн | А АЬ - Антитело я ЕСсМо меб НО нН 2-5
АЬ-5МОСС-ОМІ ЩО
Ар-Антитіл
С (Ф)
Ж Н ів) Х р Ар ва 8 9) (9) ау ке й
Мео, М
Ж
(9)
ДЕ
КЕ: чо мес НО нН
АЬ - Антитело 2-5
АЬ-5БІА-ЮОМІ (Х)
Ар-Антитіло ж о о і) і Ж 8
ІФ) (6) су Ко
Ме, М х (в) ш- поу | А АДЬ - Антитело
Еш ЕСМООо ме НО нн 2-5
АЬ-БРР-ЮМІ (Х)
Ар-Антитіло
Е Ге) (є) Я ЩІ уд Мом ДО в) |в) су Ко й
Мед, М х о -- пу. І А АЬ - Антитело я ам го меб НО нн 2-5
АБ-5РОВ-ОМА (Хі)
Ар-Антитіло ж о 8Оз'Ма" о х Н ва 8. в Млл/ АЬ о о о (в; су ШК)
Мео М
ХХ о - по. | А АЬ - Антитело я ЕМО
Мео но нн 2-8
АЬ-зо-5РОВ-ОМА й (ХІ)
У певному варіанті втілення антитіло є пПиМом19. В іншому варіанті втілення антитіло є ЕК1- 21.
Ряд описів одержання подібних кон'югатів антитіло-майтансиноїд представлений у патентах
США під номерами 6333410, 6441163, 6716821 і 7368565, кожний з яких включений у даний документ у всій повноті.
Загалом розчин антитіла у водному буфері може бути інкубований з молярним надлишком майтансиноїдів з дисульфідною групою, що несе реактивну групу. Реакція може бути зупинена додаванням надлишку аміну (наприклад, етаноламіну, таурину і т. д.). Кон'югат майтансиноїд- антитіло потім може бути очищений за допомогою гель-фільтрації. Число молекул майтансиноїду, що зв'язалися з молекулою антитіла, може бути визначене спектрофотометричним вимірюванням співвідношення абсорбції при довжині хвилі 252 нм і 280 нм. У середньому використовується 1-10 молекул майтансиноїду/молекул антитіла, у певних втілення використовується в середньому 2-5. Середня кількість молекул майтансиноїду/антитіло може становити, приміром, приблизно 1-10, 2-5, 3-4, 3,5-4 або 3,5. В одному аспекті середня кількість молекул майтансиноїду/антитіло дорівнює приблизно 3,5:0,5.
В одному аспекті середня кількість молекул майтансиноїду/антитіло дорівнює приблизно 3,5-4.
Кон'югати антитіл з майтансиноїдними препаратами можуть бути оцінені на їх здатність пригнічувати проліферацію різних небажаних клітин іп мійго. Наприклад, для оцінювання цитотоксичності даних сполук із легкістю може використовуватися людська клітинна лінія КВ.
Досліджувані клітини можуть бути піддані впливу речовин протягом 4-5 днів, фракції клітин, що вижили, вимірюють прямим аналізом відомими способами. Потім за даними аналізів можуть бути обчислені величини ІСво.
Також для одержання кон'югатів з антитілами проти БОЇКІ можуть застосовуватися бензодіазепінові сполуки, описані, наприклад, у Патентній публікації США Мо 2010/0203007 (наприклад, індолінобензодіазепіни або оксазолідинобензодіазепіни), їх похідні й інтермедіати.
Придатні бензодіазепіни включають сполуки з формулами (ХІМ), (ХМ) і (ХМІ), у яких дімерні сполуки, необов'язково, несуть зв'язуючу групу, що дозволяє зв'язування з агентами, які зв'язуються із клітинами.
Х Х Х У уч НИ Мат ' 7 А-0-І-0-А ж й дю СЮ
М М
В; тм Ве Не Мт В, зо ВВ Ве Аз (хм)
В. Ве
Ва В " мох х л
Ву рим А-Ю-І-Ю0" А. Мите, Аз
М. Фе у фі -М
Ве М Ве Ве М В, (ХМ)
У, /й Х У 7 у А-0-І-0-А: Мі ' ге '
М й хм в мех в Не (ХМ), де подвійна лінія -- між М і С позначає одинарний зв'язок або подвійний зв'язок, причому, якщо вона подвійна, - Х відсутній, а ХМ являє собою Н, а якщо вона одинарна, - Х-Н або амінна захисна група, що перетворює сполуку в неактивну форму;
М вибраний з -ОК, ефіру виду -ОСОК, карбонату виду -ОСООК, карбамату виду -
ОСОМЕА НК", аміну або гидроксиламіну виду МЕ'К", аміду виду -МЕСОК", пептиду виду МЕСОР, де Р - амиінокислота або поліпептид, що містить 2-20 амінокислотних залишків, тіоефіру виду
ЗА, сульфоксиду виду 5ОК, сульфону виду -502К, сульфіту -503, бісульфіту. -0503, галогену, ціано-, азидо-, тіолової групи, де К, Кі К" - однакові або різні й вибрані з Н, заміщеного або незаміщеного лінійного, розгалуженого або циклічного алкілу, алкенілу або алкінілу з 1-10 атомами вуглецю, поліетиленгліколевої одиниці (-«ОСН2СНІ)П, де п - ціле число від 1 до 2000, арилу з 6-10 атомами вуглецю, гетероциклічного кільця з 3-10 атомами вуглецю, в якому замісник вибраний з галогену, ОК7, МК8КО, МО2, МКСОР, 5К10, сульфоксиду виду 5ОК, сульфону виду -502К, сульфіту -503, бісульфіту - 0503, сульфонаміду виду БО2МЕ, ціано-, азидо-, -СОК11, ОСОКІ11 або ОСОМК11К12, у яких К7, К8, КУ, К10, К11 і К12 такі, як визначено вище, необов'язково К" - ОН; М/-С-О, С-5, СН2, ВН, 50 або 502;
К1, К2, КЗ, К4, КТ, К2, КУ ї КА, кожний незалежно, вибрані з Н, заміщеного або незаміщеного лінійного, розгалуженого або циклічного алкілу, алкенілу або алкінілу з 1-10 атомами вуглецю, поліеєтиленгліколевої одиниці (-ОСН2СНІ)П, де п - ціле число від 1 до 2000, або замісника, вибраного з галогену, гуанідію (-МН(С-МН)ІМН2І|, ОВ, МА8А89, МО2, МАСОН,
ЗА10, сульфоксиду виду ЗОК, сульфону виду -502К, сульфіту -503, бісульфіту - 0503, сульфонаміду виду 5О2МЕК;, ціано-, азидо-, -СОК11, ОСОМ11 або ОСОМК11К12, у яких К7,
К8, КУ, К10, К11 і К12, кожний незалежно, вибраний з Н, лінійного, розгалуженого або циклічного алкілу, алкенілу або алкінілу з 1-10 атомами вуглецю, поліетиленгліколевої одиниці (-ОСН2СН)П, де п - ціле число від 1 до 2000, арилу з 6-10 атомами вуглецю, гетероциклічного кільця з 3-10 атомами вуглецю, необов'язково К10-5К13 або СОК13, де К13 вибраний з лінійного, розгалуженого або циклічного алкілу, алкенілу або алкінілу з 1-10 атомами вуглецю, поліетиленгліколевої одиниці (-ОСН2СНІ2)п, де п - ціле число від 1 до 2000, арилу з 6-10 атомами вуглецю, гетероциклічного кільця з 3-10 атомами вуглецю, необов'язково К11-ОНА14,
Ко) де К14 має таке ж значення, як і КЕ, необов'язково будь-який з К1, К2, КЗ, 4, КТ", К2", КЗ або
КА є зшиваючою групою, яка дозволяє зв'язати агент, що з'єднується із клітиною через ковалентний зв'язок або вибраний з поліпіроло, поліїндоліл, поліїмідазоліл, поліпіроло- імідазоліл, поліпіроло-індоліл або поліїмідазоло-індоліл одиниць, що необов'язково несуть зшиваючу групу, яка дозволяє зв'язування з агентом, що з'єднуються з клітиною; 2 вибраний з (СНаг)п, де п-1, 2 або 3, СК15К16, МК17, О або 5, де К15, К16 і К17, кожний незалежно, вибраний з Н, лінійного, розгалуженого або циклічного алкілу з 1-10 атомами вуглецю, поліетиленгліколевої одиниці (-ОСН2СНЗ)П, де п - ціле число від 1 до 2000;
В6-ОК, 5К або МЕ, де К і ЕК" мають таке ж значення, як визначено вище;
Х вибраний з СН2, МК, СО, ВН, 50 або 502, де Е має таке ж значення, як визначено вище;
У - О, СН2, МК або 5, де К має таке ж значення, як визначено вище; 2 - СН? або (СНО) Пп, де п дорівнює 2, З або 4, причому Х", Х і 2 не є СН2 одночасно;
А і А" однакові або різні й вибрані з О, -САРО, 5, -САВ'5, -МК15 або СЕЕМНК15, дек і мають таке ж значення, як визначено вище, і де К15 має таке ж значення, як визначено вище для КЕ;
Бі р' - однакові або різні й незалежно вибрані з лінійного, розгалуженого або циклічного алкілу, алкенілу або алкінілу з 1-40 атомами вуглецю, необов'язково заміщеного галогеном,
ОВ7, МА8АУ9, МО2, МАСОВ'", ЗК10, сульфоксиду виду ОК, сульфону виду -502Е, сульфіту - 503, бісульфіту -0503, сульфонаміду виду 5О2МКЕ", ціано-, азидо-, -СОК11, ОСОМ11 або
ОСОМК11К12, у яких К7, К8, КУ, К10, К11 і К12 такі, як визначено вище, поліетиленгліколевої
БО одиниці (-ОСН2СНа) п, де п - ціле число від 1 до 2000;
Ї - необов'язкова фенільна група або гетероциклічне кільце з 3-10 атомами вуглецю, необов'язково заміщені, де замісник являє собою зв'язуючу групу, що дозволяє зв'язування з агентом, що з'єднується із клітиною через ковалентний зв'язок, або вибрані з лінійного, розгалуженого або циклічного алкілу, алкенілу або алкінілу з 1-10 атомами вуглецю, необов'язково заміщеного галогеном, ОК7, МА8КУ, МО2, МКСОК, 5К10, сульфоксиду виду
5ОК, сульфону виду -502К, сульфіту -503, бісульфіту - 0503, сульфонаміду виду БО2МЕ, ціано-, азидо-, -СОК11, ОСОКІ11 або ОСОМА11К12, у яких К7, К8, К9, К10, К11 їі К12 такі, як визначено вище, поліетиленгліколевої одиниці (-ОСН2СНІ) п, де п - ціле число від 1 до 2000; необов'язково Ї саме по собі є зв'язуючою групою, що дозволяє зв'язування з агентом, що з'єднується із клітиною через ковалентний зв'язок; або їх фармацевтично прийнятними сольватами, солями, гідратами або гідратованими солями, їх оптичними ізомерами, рацематами, діастереомерами, енантіомерами або поліморфними кристалічними структурами цих сполук; причому сполука має не більш однієї зв'язуючої групи, що дозволяє зв'язування з агентом, що з'єднується із клітиною через ковалентний зв'язок.
В одному аспекті подвійна лінія - між М ії С позначає одинарний зв'язок або подвійний зв'язок, причому, якщо вона подвійна, - Х відсутній, а Х являє собою Н, а якщо вона одинарна, -
Х-Н або амінна захисна група, що перетворює сполуку в неактивну форму;
М вибраний з -ОВ, МАВ", сульфіту -503 або бісульфіту -0503, причому К вибраний з Н, лінійного, розгалуженого або циклічного алкілу з 1-10 атомами вуглецю, поліетиленгліколевої одиниці (-ОСН2СН2)п, де п - ціле число від 1 до 2000, арилу з 6-10 атомами вуглецю, гетероциклічного кільця з 3-10 атомами вуглецю;
М/-С-О, СН2 або 502;
К1, К2, КЗ, 4, КТ, 2, КЗ ії ВК, кожний незалежно, вибраний з Н, МО2 або зв'язуючої групи, що дозволяє зв'язування з агентом, що з'єднується із клітиною через ковалентний зв'язок;
Вб6-ОКТ18, де К18 має таке ж значення, як ЕК; 2 вибраний з (СН2)п, де п-1, 2 або 3, СКЕ15К16, МАК17, О або 5, де К15, К16 і К17, кожний незалежно, вибраний з Н, лінійного, розгалуженого або циклічного алкілу з 1-10 атомами вуглецю, поліетиленгліколевої одиниці (-ОСН2СНЗ)П, де п - ціле число від 1 до 2000;
Х вибраний з СН2 або С-5О;
У - О, МК або 5, де К має таке ж значення, як визначено вище; 2 - СН? або (СН2)2;
А Її А обидва - 0;
Ор ї р' однакові або різні й незалежно вибрані з лінійного, розгалуженого або циклічного
Зо алкілу, алкенілу або алкенілу з 1-10 атомами вуглецю;
Ї - необов'язкова фенільна група або гетероциклічне кільце з 3-10 атомами вуглецю, необов'язково заміщені, де замісник являє собою зв'язуючу групу, що дозволяє зв'язування з агентом, що з'єднується із клітиною через ковалентний зв'язок, або вибрані з лінійного, розгалуженого або циклічного алкілу, алкенілу або алкінілу з 1-10 атомами вуглецю, необов'язково заміщеного галогеном, ОК7, МА8КУ, МО2, МКСОК, 5К10, сульфоксиду виду 5ОК, сульфона виду -502Е, сульфіту -503, бісульфіту -0503, сульфонаміду виду БО2МЕ, ціано-, азидо-, -СОК11, ОСОМК1І1 або ОСОМАК11К12, поліетиленгліколевої одиниці (-
ОСН2СНО), де п - ціле число від 1 до 2000; необов'язково І. саме по собі є зв'язуючою групою, що дозволяє зв'язування з агентом, що з'єднується із клітиною через ковалентний зв'язок; або їх фармацевтично прийнятними сольватами, солями, гідратами або гідратованими солями, їх оптичними ізомерами, рацематами, діастереомерами, енантиомерами або поліморфними кристалічними структурами цих сполук.
В іншому аспекті сполука описується формулою (ХМІ!Ї):
І і" І" м х й і х л дн -- о Мет, (Є;
М М
СИ ей (6, б, ; (ХМІ) де подвійна лінія -- між М і С позначає одинарний зв'язок або подвійний зв'язок, причому, якщо вона подвійна, - Х відсутній, а МУ є Н, а якщо вона одинарна, - Х-Н або амінна захисна група, що перетворює сполуку в неактивну форму, а У вибраний з ОН, ефіру, представленого -
ОЕК, сульфіту -503, бісульфіту -0О503, де ЕК вибраний з лінійного, розгалуженого або циклічного алкілу, алкенілу або алкінілу з 1-10 атомами вуглецю; один з К2, КЗ є зв'язуючою групою, що дозволяє зв'язування з агентом, що з'єднується із клітиною через ковалентний зв'язок, а інший являє собою Н; один 3", 1" або І" є зв'язуючою групою, що дозволяє зв'язування з агентом, що з'єднується із клітиною, а решта являє собою Н; І!" може бути зв'язуючою групою, а О-СН або М. Інші приклади описані в патентній заявці США Мо 61/150201, яка включена в даний документ у повному об'ємі за допомогою посилання. Таким чином, у певному варіанті втілення антитіло пиМом19 кон'юговане з бензодіазепіном, що має структуру, показану на ХІХ-ХХІ! вище. В іншому варіанті втілення антитіло ЕК-1-21 кон'юговане з бензодіазепіном, що має структуру, показану на ХІХ-ХХІЇ!Ї вище.
ЇМ. Полінуклеотиди
У певних варіантах втілення винахід охоплює полінуклеотиди, які кодують поліпептид, що специфічно зв'язується з людським рецептором РОЇ ВІ або фрагментом цього поліпептиду.
Наприклад, у винаході пропонується полінуклеотид, що містить нуклеїнову послідовність, що кодує антитіло до людського БОЇ 21 або фрагмент такого антитіла. Полінуклеотиди згідно з винаходом можуть існувати у вигляді РНК або ДНК. ДНК включає кДНК, геномну ДНК і синтетичну ДНК і може бути дволанцюговою або одноланцюговою, у останньому випадоку ланцюжок може бути кодуючим або некодуючим (антизмістовним).
У певних варіантах втілення полінуклеотиди є ізольованими. У певних варіантах втілення полінуклеотиди є значною мірою очищеними.
У винаході пропонується полінуклеотид, що містить полінуклеотид, кодуючий послідовність, вибрану із групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МОЗ: 4, 10, 11, 41, 42 і 88-103. Також пропонується полінуклеотид, що кодує поліпептид, який має щонайменше 9595, щонайменше 96 965, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 ідентичність послідовності з ФЕО
ІО МОЗ: 4, 10, 11, 41, 42 і 88-103.
Полінуклеотиди з 5ЕО І МО»5: 5, 14 і 15 містять кодуючу послідовність варіабельного домену важкого ланцюга пПиМом19, варіабельного домену легкого ланцюга версії 1.00 і варіабельного домену легкого ланцюга версії 1.60, відповідно.
Крім цього, у винаході пропонується полінуклеотид, що включає послідовність, вибрану із групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО5: 5, 14, 15, 37, 38, 43, 44, 47, 48 і 120-127. Також пропонується полінуклеотид із щонайменше 9595, щонайменше 9695, щонайменше 97 95, щонайменше 9 8 95 або із щонайменше 99 95 ідентичністю послідовності з ЗЕО ІЮО МОб5: 5, 14, 15, 37, 38, 43, 44, 47, 48 ії 120-127. Таким чином, у певних варіантах втілення полінуклеотид містить (а) полінуклеотид із щонайменше 95 95 ідентичністю послідовності з «ЕО ІО МО: 5; і/або (б) полінуклеотид із щонайменше 95 95 ідентичністю послідовності з зЗЕО ІЮ МО: 14 або 15. У певних варіантах втілення полінуклеотид містить (а) полінуклеотид з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 5; і/або (б) полінуклеотид з амінокислотною послідовністю 5ЗЕО ІЮ
МО: 14 або ЗЕО ІЮ МО: 15.
У певних варіантах втілення полінуклеотиди містять кодуючу послідовність зрілого поліпептиду, злитого в одній рамці зчитування з полінуклеотидом, що сприяє, наприклад, експресії і секреції поліпептиду із клітини-хазяїна (наприклад, з лідерною послідовністю, яка працює як секреторна послідовність для контрольованого транспорту поліпептиду із клітини).
Поліпептид з лідерною послідовністю являє собою білок-попередник і може мати лідерну послідовність, яка відщеплюється клітиною-хазяїном від зрілої форми поліпептиду.
Полінуклеотиди також можуть кодувати пропротеїн, який являє собою зрілий білок з додатковими 5'-амінокислотними залишками. Зрілий білок із пропослідовністю являє собою пропротеїн, що є неактивною формою протеїну. При відщепленні пропослідовності залишається зрілий активний білок.
У певних варіантах втілення полінуклеотиди "містять кодуючу послідовність зрілого поліпептиду, злитого в одній рамці зчитування з маркерною послідовністю, що сприяє, наприклад, очищенню кодованого поліпептиду. Наприклад, у випадку бактеріального хазяїна маркерна послідовність може бути гексагістидиновим тегом від вектора роОЕеЕ-9, призначеним для очищення зрілого поліпептиду, злитого з маркером, а у випадку використання як хазяїнів клітин ссавців (наприклад, клітин СО5-7) маркерна послідовність може бути гемаглютининовим тегом (НА), одержаним з гемаглютинину вірусу грипу.
Даний винахід, крім цього, стосується варіантів описаних вище полінуклеотидів, що кодують, наприклад, фрагменти, аналоги і похідні.
Полінуклеотидні варіанти можуть містити зміни в кодуючих регіонах, некодуючих регіонах або в обох типах регіонів. У деяких варіантах втілення полінуклеотидні варіанти містять зміни, які приводять до мовчазних замін, вставок або делецій, що не впливають на властивості або активність кодованого поліпептиду. У деяких варіантах втілення нуклеотидні варіанти продукуються мовчазними замінами, обумовленими виродженістю генетичного коду.
Полінуклеотидні варіанти можуть бути одержані для великої кількості причин, наприклад, для бо оптимізації експресії кодонів у конкретного хазяїна (зміна кодонів людської мРНК на ті, які кращі для бактеріального хазяїна типу Е. соїЇї).
Також пропонуються вектори й клітини, що містять описані тут полінуклеотиди.
М. Способи застосування й фармацевтичні композиції
ЕОЇ ВІ1-зв'язуючі агенти (включаючи антитіла, імунокон'югати і поліпептиди) згідно з винаходом придатні для використання у великій кількості застосувань, включаючи, але не обмежуючись перерахованим, терапевтичні способи, такі як лікування раку, у тому числі В- клітинних злоякісних пухлин. У певних варіантах втілення агенти є корисними для інгібування росту пухлини, включаючи стимулювання диференціації, зменшення об'єму пухлини і/або зменшення пухлиногенності пухлини. Використовувані способи можуть бути способами іп міїго, ех мімо або іп мімо. У певних варіантах втілення РОЇ К1-зв'язуючий агент або антитіло, або імунокон'югат, або поліпептид є антагоністами людського РОЇ КІ, з яким вони зв'язуються.
В одному аспекті антитіла проти БОЇ КІ і імунокон'югати згідно з винаходом корисні для визначення присутності РОЇ К1 у біологічному зразку. Термін "детектування", при використанні тут, охоплює якісне або кількісне детектування. У певних варіантах втілення біологічний зразок містить клітину або тканину. У певних варіантах втілення подібні тканини включають нормальні іабо ракові тканини, які експресують БОЇ КТ більшою мірою, ніж інші тканини. У певних варіантах втілення надлишкова експресія БОЇ К1 дозволяє виявити наявність раку яєчника, раку легенів, раку мозку, раку молочної залози, раку матки, раку нирки або раку підшлункової залози.
В одному аспекті у винаході пропонується спосіб визначення присутності БОЇК1 у біологічному зразку. У певних варіантах втілення спосіб включає контактування біологічного зразка і антитіла проти РОЇ КІ в умовах, що дозволяють зв'язування антитіла проти БОЇ К1 з
ЕОГ КТ, і детектування утворення комплексу між антитілом проти РОЇ КІ і БОЇ К1.
В одному аспекті у винаході пропонується спосіб діагностування порушення, асоційованого з підвищеною експресією РОЇ МК1. У певних варіантах втілення спосіб містить контактування клітини, що тестується з антитілом проти РОЇ КІ, визначення рівня експресії (кількісно або якісно) РОЇ К1 клітиною, що тестується шляхом визначення зв'язування антитіла проти РОЇ КІ1 з
РОГ, і порівняння рівня експресії БОЇ К1 клітиною, що тестується з рівнем експресії БОЇ К1 контрольною клітиною (наприклад, нормальною клітиною з тієї ж тканини, що і клітина, яка тестується, або клітиною, що експресує БОЇМКІ1 на рівнях, порівнянних з нормальними
Зо клітинами), причому більший рівень експресії ОЇ КІ клітиною, що тестується, в порівнянні з контрольною клітиною свідчить про наявність порушення, пов'язаного з підвищеною експресією
ЕОЇ КІ. У певних варіантах втілення клітину, що тестується, одержують від суб'єкта з підозрою на порушення, пов'язане з підвищеною експресією БОЇК1І. У певних варіантах втілення порушення є клітинним проліферативним порушенням, наприклад раком або пухлиною.
У певних варіантах втілення спосіб діагностики або детектування, наприклад, описаний вище, включає детектування зв'язування антитіла проти БОЇ К1 з РОЇ К1, що експресується на поверхні клітини або, що міститься в препараті мембрани, одержаному із клітини, що експресує
ЕОЇКІ1 на її поверхні. У певних варіантах втілення спосіб включає контактування клітини і антитіла проти БОЇ К1 в умовах, що дозволяють зв'язування антитіла проти БОЇ К1 з РОЇК, Її детектування утворення комплексу між антитілом проти РОГ КІ і РОЇ К1 на клітинній поверхні.
Приклад аналізу, призначеного для детектування зв'язування антитіла проти БОЇ К1 з БОЇ К1, що експресується на поверхні клітини являє собою аналіз "ГАС 5".
Для детектування зв'язування антитіл проти БОЇ К1 з РОЇ К1 можуть використовуватися й інші способи. Подібні способи включають, не обмежуючись перерахованим, аналізи зв'язування антигенів, добре відомі в даній галузі техніки, наприклад, вестерн-блотинг, радіоімунологічні аналізи, ЕГІЗА (ензим-зв'язаний імуносорбентний аналіз), "сандвіч" -імуноаналізи, аналізи імунопреципітації, флуоресцентні імуноаналізи, імунсаналізи з протеїном А і імуногістохімічний спосіб (ІНС)
У певних варіантах втілення антитіла проти БОЇ КІ є поміченими. Мітки включають, не обмежуючись перерахованим, мітки або фрагменти, які детектуються безпосередньо (наприклад, флуоресцентні, хромофорні, електроннощільні, хемілюмінесцентні й радісактивні), а також фрагменти, наприклад, ферменти або ліганди, які детектуються непрямо, наприклад, за допомогою ферментної реакції або молекулярної взаємодії.
У певних варіантах втілення антитіла проти РОЇК1 іммобілізовані на нерозчинному матриксі. Іммобілізація приводить до відділення антитіла проти РОЇ К1 від будь-якого БОЇ К1, що залишається вільним у розчині. Як правило, це здійснюється або переведенням антитіла проти БОЇКІ1 у нерозчинну форму перед аналізом, або адсорбцією на водонерозчинному матриксі або поверхні (Веппісі еї аІ., Патент США Мо 3720760), або ковалентним спарюванням (наприклад, з використанням глутаральдегідного перехресного зшивання), або переведенням бо антитіла проти РОЇ К1 у нерозчинну форму після утворення комплексу антитіла проти РОЇ КІ і
ЕОГ КІ, наприклад, шляхом імунопреципітації.
Будь-яке з перерахованих вище втілень діагностики або детектування може здійснюватися з використанням імунокон'югата згідно з винаходом замість антитіла проти РОЇ К1 або разом з ним.
У певних варіантах втілення захворювання, яке піддають терапії з РОЇ К1-зв'язуючим агентом або антагоністом (наприклад, антитілом пиМом19 або імунокон'югатом), являє собою онкологічне захворювання. У певних варіантах втілення онкологічне захворювання характеризується наявністю клітин, що експресують рецептор фолієвої кислоти 1, з якими зв'язується РОЇ К1-зв'язуючий агент (наприклад, антитіло).
У даному винаході пропонуються способи терапії онкологічного захворювання, які включають введення терапевтично ефективної кількості БОЇ К1-зв'язуючого агента суб'єкту (наприклад, суб'єкту, що потребує лікування). У деяких варіантах втілення онкологічне захворювання вибране із групи, що складається з колоректального раку, раку підшлункової залози, раку легенів, раку яєчника, раку печінки, раку молочної залози, раку мозку, раку нирки, раку передміхурової залози, раку шлунково-кишкового тракту, меланоми, раку цервікального каналу, раку сечового міхура, гліобластоми і онкологічного захворювання голови й шиї. У певних варіантах втілення онкологічне захворювання є раком яєчника. У певних варіантах втілення онкологічне захворювання є раком легенів. У деяких варіантах втілення суб'єкт є людиною.
У даному винаході, крім цього, пропонуються способи інгібування росту пухлин, у яких застосовуються антитіла або інші агенти, описані тут. У певних варіантах втілення спосіб інгібування росту пухлини включає контактування клітини з РОЇК 1-зв'язуючим агентом (наприклад, антитілом) іп міго. Наприклад, імморталізованна клітинна лінія або лінія ракових клітин, яка експресує РОЇ К 1, культивуються в середовищі, до якого додаються антитіло або інший агент, що інгібують ріст пухлини. У деяких варіантах втілення пухлинні клітини виділені від зразка, взятого у пацієнта, такого як, наприклад, біоптат тканин, плевральна ефузія або зразок крові, і культивовані в середовищі, до якого доданий БОЇ ЖК 1-зв'язуючий агент для інгібування росту пухлини.
У деяких варіантах втілення спосіб інгібування росту пухлини включає контактування
Зо пухлини або пухлинних клітин з БОЇ К 1-зв'язуючим агентом (наприклад, антитілом) іп мімо. У певних варіантах втілення контактування пухлини або пухлинної клітини з БОЇ К 1-зв'язуючим агентом здійснюється у тваринній моделі. Наприклад, РОЇК 1-зв'язуючі агенти можуть вводитись в ксенотрансплантати, що експресують один або більше РОЇК 1, вирощених в імунокомпрометованих мишей (наприклад, мишей МОБ/ТКІН) для інгібування росту пухлини. У деяких варіантах втілення ракові стовбурові клітини є виділеними з узятого в пацієнта зразка, такого як, наприклад, біоптат тканин, плевральна ефузія або зразок крові, і введені імунокомпрометованим мишам, яким потім вводять БОЇ К 1-зв'язуючий агент для інгібування росту клітин пухлини. У деяких варіантах втілення БОЇЖК 1-зв'язуючий агент вводиться одночасно або через невеликий інтервал часу після введення пухлиногенних клітин тварині для запобігання росту пухлини. У деяких варіантах втілення БОЇ К 1-зв'язуючий агент вводиться як терапевтичний засіб після того, як пухлиногенні клітини доросли до певного розміру.
У певних варіантах втілення спосіб інгібування росту пухлини включає введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості РОЇК 1-зв'язуючого агента. У деяких варіантах втілення суб'єкт є людиною. У деяких варіантах втілення у суб'єкта є пухлина або суб'єкт мав пухлину, яка була згодом видалена.
У певних варіантах втілення пухлина експресує рецептор фолієвої кислоти, 3 яким зв'язується РОЇК 1-зв'язуючий агент або антитіло. У певних варіантах втілення пухлина надмірно експресує РОЇК 1.
У деяких варіантах втілення пухлина вибрана із групи, що складається з пухлини мозку, колоректальної пухлини, пухлини підшлункової залози, пухлини легенів, пухлини яєчника, пухлини печінки, пухлини молочної залози, пухлини нирки, пухлини передміхурової залози, пухлини шлунково-кишкового тракту, меланоми, пухлини цервікального каналу, пухлини сечового міхура, гліобластоми і пухлини голови і шиї. У певних варіантах втілення пухлина є пухлиною яєчника.
Крім цього, у винаході пропонується спосіб зниження пухлиногенності пухлини у суб'єкта, який включає введення терапевтично ефективної кількості ЕОЇ КЕ 1-зв'язуючого агента суб'єкту.
У певних варіантах втілення пухлина містить ракові стовбурові клітини. У певних варіантах втілення рівень ракових стовбурових клітин у пухлині знижується при введенні агента.
Таким чином, у певних варіантах втілення винаходу пропонуються способи терапії бо онкологічного захворювання з використанням антитіла пиМом19 і імунокон'югатів. У певних варіантах втілення імунокон'югат пиМом19 є пиМом19-5Р08-ОМ4, пиМом19-5й0о-5РР-ЮОМ'І, пиМом19-5РР-ОМІ1 або пиМом19-РЕСА-Маї!-ОМА.
Крім цього, у винаході пропонуються способи диференціювання пухлиногенних клітин у непухлиногенні клітини, які включають контактування пухлиногенних клітин з БОЇ К 1-зв'язуючим агентом (наприклад, введення РОЇК 1-зв'язуючого агента суб'єкту з пухлиною, що містить пухлиногенні клітини, або суб'єкту, що мав таку пухлину, яка була згодом видалена). У певних варіантах втілення пухлиногенні клітини являють собою клітини пухлини яєчника.
Крім цього, у даному винаході також пропонуються способи зниження активації міофібробластів у стромі солідної пухлини, що включають контактування строми, з ефективною кількістю ЕОЇ В 1-зв'язуючого агента, поліпептиду або антитіла
У даному винаході, крім цього, пропонуються фармацевтичні композиції, що містять один або більше БОЇК 1-зв'язуючих агентів, описаних тут. У певних варіантах втілення фармацевтичні композиції, крім цього, містять фармацевтично прийнятний носій. Дані фармацевтичні композиції застосовуються для інгібування росту пухлин і лікування раку у людей.
У певних варіантах втілення композиції виготовляються для зберігання і застосування шляхом комбінування очищеного антитіла або агента згідно з даним винаходом з фармацевтично прийнятним носієм (наприклад, середовищем, добавкою) (Кетіпдіоп, Те зсіепсе апа Ргасіїсе ої Рпагтасу 201п Еайіоп Маск Рибіїзпіпо, 2000). Придатні фармацевтично прийнятні носії включають, не обмежуючись перерахованим, нетоксичні буфери, наприклад, фосфатний, цитратний і на базі інших органічних солей; солі, наприклад, натрію хлорид; антиоксиданти, включаючи аскорбінову кислоту і метіонін; консерванти (наприклад, октадецилдиметилбензиламонію хлорид; гексаметонію хлорид; бензалконію хлорид; бензетонію хлорид; фенол, бутиловий або бензиловий спирт; алкілларабени, наприклад метил- або пропілпарабен; пірокатехін; резорцин; циклогексанол; З-пентанол; і м-крезол); низькомолекулярні поліпептиди (наприклад такі, що містять менше ніж 10 амінокислотних залишків); білки, наприклад альбумін сироватки, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, наприклад полівінілпірролідон; амінокислоти, наприклад гліцин, глутамін, аспарагін, гістидин, аргінін або лізин; вуглеводи, наприклад моносахариди, дисахариди, глюкозу, манозу або декстрини; хелатуючі агенти, наприклад ЕДТА; цукри, наприклад сахарозу, манітол, трегалозу або сорбітол; протиїіони, що утворюють солі, наприклад натрій; комплекси металів (наприклад, комплекси 2п-білок); і неіїонні ПАР, наприклад ТУУЕЕМ або поліетиленгліколь (ПЕГ).
Фармацевтичні композиції згідно з даним винаходом можуть вводитись будь-якою кількістю шляхів як для місцевої, так і для системної терапії. Введення може здійснюватися місцево (наприклад, через слизові оболонки, включаючи вагінальний і ректальний шляхи), наприклад, трансдермальними пластирами, мазями, лосьйонами, кремами, гелями, краплями, супозиторіями, спреями, рідинами і порошками; через легені (наприклад, інгаляцією або інсуфляцією порошків або аерозолів, включаючи небулайзери; інтратрахеально, інтраназально, епідермально і трансдермально); пероральної або парентерально, включаючи внутрішньовенне, внутрішнартеріальне, підшкірне, внутрішньоочеревинне або внутрішньом'язове введення або інфузії; або інтракраніально (наприклад, інтратекально або інтравентрикулярно).
Антитіло або імунокон'югат згідно з винаходом можуть бути комбіновані у фармацевтичній комбінованій композиції або в режимі дозування, наприклад, у вигляді комбінованої терапії, із другою сполукою, що має протипухлинні властивості. Друга сполука у фармацевтичній комбінованій композиції або в режимі дозування краще має синергічний ефект з кон'югатом антитіло-препарат у комбінації, не впливаючи негативно один на одного. Також пропонуються фармацевтичні композиції, що містять РОЇ К 1-зв'язуючий агент і другий протипухлинний агент.
При лікуванні захворювання потрібна доза антитіла або агента згідно з даним винаходом залежить від типу захворювання, від тяжкості і ходу захворювання, від чутливості захворювання, від того, чи вводяться антитіла або кон'югати в профілактичних або в терапевтичних цілях, від попередньої терапії, анамнезу пацієнта і відповіді на лікування і т.д., а також від висновків лікаря. Антитіло або агент можуть вводитись однократно або кілька разів протягом періоду часу від декількох днів до декількох місяців або аж до вилікування або до зменшення виразності захворювання (наприклад, зменшення розміру пухлини). Оптимальні режими дозування можуть бути розраховані, виходячи з вимірювань акумуляції препарату в організмі пацієнта, і будуть залежати від відносної активності індивідуального антитіла або агента. Лікар може з легкістю визначити оптимальні дози, принципи дозування і частоту введень. У певних варіантах втілення дозування знаходиться в межах 0,01 мкг-100 мг/кг маси 60 тіла, і препарат може вводитись один раз або більше разів на добу, тиждень, місяць або рік. У певних варіантах втілення антитіло або інший РОЇ Е 1-зв'язуючий агент вводиться один раз на два тижні або один раз на три тижні. У певних варіантах втілення дозування антитіла або іншого
ЕОІ АВ 1-зв'язуючого агента знаходиться в межах від приблизно 0,1 мг до приблизно 20 мг на кг маси тіла. Лікар може оцінити частоту введень на підставі виміряного часу виведення і виміряних концентрацій препарату в тканинах або рідинах тіла.
Комбінована терапія може проявляти " синергію" і бути " синергічною", тобто проявлятися в тому, що ефект при спільному застосуванні активних компонентів є вищим, ніж ефект, що виявляється при роздільному використанні сполук. Синергічний ефект може бути досягнутий, якщо активні компоненти: (1) знаходяться в одній композиції і вводяться або доставляються одночасно в комбінованій одиничній дозованій формулі; (2) доставляються чергуванням або паралельним введенням окремих формул, або (3) іншим режимом. При терапії, що чергується, синерічний ефект може бути досягнутий, якщо сполуку вводять або доставляють послідовно, наприклад, різними ін'єкціями окремими шприцами. Загалом при терапії, що чергується, ефективна доза кожного активного компонента вводиться послідовно, наприклад, серійно, у той час як при комбінованій терапії ефективні дози двох або більш активних компонентів вводяться разом.
МІ. Набори, що містять БОЇ К 1-зв'язуючі агенти
У даному винаході пропонуються набори, які містять антитіла, імунокон'югати або інші агенти, описані тут, і які можуть застосовуватися відповідно до способів, описаних тут. У певних варіантах втілення набір містить щонайменше одне очищене антитіло проти людського рецептора фолієвої кислоти в одному або в більшій кількості контейнерів. У деяких варіантах втілення набори містять всі компоненти, необхідні і/або достатні для проведення аналізу детектування, включаючи всі контрольні зразки, вказівки по проведенню аналізів і будь-яке ПЗ, необхідне для аналізу і надання результатів. Фахівець у даній галузі техніки легко зрозуміє, що запропоновані згідно з даним винаходом антитіла, імунокон'югати або інші агенти можуть бути з легкістю вбудовані в один із установлених форматів наборів, добре відомих у даній галузі техніки.
Крім цього, пропонуються набори, що містять РОЇ К 1-зв'язуючий агент (наприклад, РОЇ К 1- зв'язуюче антитіло), а також другий протипухлинний агент. У певних варіантах втілення другий
Зо протипухлинний агент є хіміотерапевтичним агентом (наприклад, гемцитабіном або іринотеканом).
Варіанти втілення даного винаходу можуть бути, крім цього, визначені посиланням на наступні необмежувальні приклади, в яких докладно описується одержання певних антитіл згідно з даним розкриттям і способи застосування антитіл згідно з цим розкриттям. Фахівцю в даній галузі техніки буде зрозуміло, що може бути внесена велика кількість змін як у матеріали, так і в способи без відхилення від об'єму даного винаходу.
Приклади
Необхідно розуміти, що приклади і варіанти втілення, описані тут, призначені лише для ілюстративних цілей, і що велика кількість модифікацій або змін, запропонованих фахівцями в даній галузі техніки, відповідають духу і перебувають у межах охоплення даної заявки.
Приклад 1
Химеризація мишачого моноклонального антитіла Мом19
Амінокислотні послідовності варіабельного регіону Мом19 були одержані з бази даних МСВІ (номери доступу СААбЄ8253 для легкого ланцюга (ЗЕО ІО МО: 24) і СААб8252 для важкого ланцюга (5ЕО ІЮ МО: 23)), а потім кодон-оптимізовані й синтезовані Віше Негоп Віоїесппоіоду.
Варіабельний регіон легкого ланцюга був клонований в сайти ЕсоВІ і Взім/! плазміди рАБК7 ео, варіабельний регіон важкого ланцюга був клонований в сайти Ніпай! ії Ара! плазміди рАбС т Мео.
Приклад 2
Гуманізація мишачих моноклональних антитіл Мом19 і ЕК1-21
Антитіло Мом19 було гуманізовано, згідно з методами перебудовування, описаними раніше (ВодизкКа М. вії. аї, Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 1994 Ребр; 91:969-973) і (КодизкКа еї аї., Ргоївіп Епа. 9(10):895-904 (1996)). Коротко, середня доступність розчинника до кожного каркасного залишку варіабельного регіону була розрахована за допомогою близькоспоріднених досліджених структур антитіл з бази даних РОВ, а позиції з більш ніж 30 95 середньою доступністю були визначені як поверхневі залишки (Редегзеп .).Т. еї. АЇ, У. Мої. Вісі. 1994; 235: 959-973). Людська поверхнева замісна послідовність була вибрана шляхом вирівнювання поверхневих позицій послідовностей мишачого антитіла з відповідними позиціями людських зародкових послідовностей антитіл у базі даних Кабраї (доппбоп, б. апа уми, Т. Т. (2001) Мисієїс Асійв5
Везеагсі, 29: 205-206). Найбільш гомологічний поверхневий варіабельний регіон людського бо легкого ланцюга (клон ОРК19, локус ІМОТ ІБКМ20-30701 для Мом'19 і локус ІМОТ ІБКМ1/ОКа2-
001 для ЕК 1-21) і найбільше гомологічний поверхневий варіабельний регіон людського важкого ланцюга (клон 8М27, локус ІМОТ ІЗНМ1-69708 для Мом'!19 і локус ІМОТ ІЗНМ5-51702 для ЕК1-21) були вибрані для заміни каркасних поверхневих положень мишачого Мом19 із залишенням 6
СОК (Таблиця 1) незміненими. Мишачі й людські поверхневі послідовності Мом19 і ЕК1-21, а також залишки представлені на Фігурах 1А-О0.
Таблиця 1
Мишачий Мишачий
НО СОвг: ВІНРУРИОЮТЕУМОМЕКО (5ЕО ІО МО: | НО СОовг: ТІБЗССаБУ ГУМРрИаМУКа (5ЕО І 128 МО: 33
Людський Людський
НО СОВ2г: ВІНРУРИОТЕУМОКРОС (5ЕО Ір МО: | НО СОовг: ТІБЗОСЗУ ГУМБРИОаБРОа (5ЕО І 2 МО: 34
Таблиця 1А: Представлені СОК легкого й важкого ланцюгів Мом19 і ЕК1-21, визначені для перебудовування. Також наведені визначення Кабаї для важкого ланцюга СОК2 як мишачих, так і людських антитіл
Жодна зміна залишків не впливала на взаємодію СОБ Мом19 або ЕР1-21 з їх епітопами- мішенями в рецепторі фолієвої кислоти 1, тому в гуманізовані послідовності обох антитіл зворотні поверхневі мутації не вносилися. У перебудованій послідовності Мом19 був присутній консенсусний сайт М-зв'язаного глікозилювання в М74 легкого ланцюга (легкий ланцюг версії 1.00), тому була виготовлена друга версія гуманізованого легкого ланцюга, позбавлена цього сайту. Перегляд бази даних Караї людських послідовностей легкого ланцюга показав, що в позиції 74 легкого ланцюга найчастіше зустрічається треонін, тому легкий ланцюг версії 1.60 гуманізованого Мом19 був побудований із треоніном у положенні 74. Положення 74 не є поверхневим, тому заміна цього залишку не впливає на гуманізацію при перебудовуванні.
Вирівнювання послідовностей варіабельного регіону мишачого й гуманізованого Мом19 і ЕК1-21 зображене на фігурі 2.
Послідовності варіабельних регіонів гуманізованих Мом19 і ЕК1-21 були кодон-оптимізовані й синтезовані Віше Негоп Віоїесппоіоду. Послідовності фланковані сайтами ферментативної рестрикції для полегшення клонування усередині рамки зчитування з відповідними константними послідовностями в одноланцюгових плазмідах експресії ссавців. Варіабельний регіон легкого ланцюга був клонований в сайти ЕсСоОКІ і В5імМІ плазміди рАБК7ео. Результуючі плазмідні ДНК, що кодують легкий ланцюг пиМом19, були депоновані в АТСС під номерами депонентів АТС РТА-10773 і РТА-10774, а результуюча плазмідна ДНК, що кодує легкий ланцюг пиЕК1-21, була депонована під номером депонента АТСС РТА-10776. Варіабельний регіон важкого ланцюга був клонований в сайти Ніпапі їі Ара! плазміди рАра т Мео. Результуюча плазмідна ДНК, що кодує важкий ланцюг пиМом19, була депонована в АТСС під номером депонента АТСС РТА-10772, а результуюча плазмідна ДНК, що кодує важкий ланцюг пиЕК1-21, була депонована під номером депонента АТСС РТА-10775. Потім ці плазміди були трансфіковані так, як описано в прикладі 3, щоб одержати пиМом19. Плазміда, що кодує будь- який з легких ланцюгів пПиМом19 (наприклад, депонований в АТСС під номером депонента РТА- 10773 або РТА-10774), може бути спарена із плазмідою, що кодує важкий ланцюг пиМом19, щоб одержати антитіло пиМом19 згідно зі способами, запропонованими тут, а також згідно зі способами, відомими звичайному фахівцю! в даній галузі техніки.
Приклад З
Експресія рекомбінантного антитіла
Химерні й гуманізовані конструкції антитіл були транзієнтно продуковані або в адгезивних клітинах НЕК-293Т згідно із стандартною кальцій-фосфатною процедурою (ВО Віозсіепсев,
Саїрпо5 Матитаййап Тгапетесіп Кії, Саї Мо 631312), або в суспендованих клітинах НЕК-2937Т згідно їз модифікованою процедурою ПЕЇ |Оигоспег У, Реїтеї 5, Катеп А Нідн-Ієме! апа підн-
Шгоцдприї гесотбіпапі ргоївїп ргодисіп ру їШшапвіепі іапвеіесіп ої 5зибрепвіоп-дгом/іпуд питап 293-ЕВМАТ сеїЇ5. Мисієвїс Асід5 Ке5. 2002 дап 15; 30(2):Е9| у ролерних колбах. ПЕЇІ-транзієнтні трансфекції проводилися так, як описано раніше (ЮОигоспег, У. еї аїЇ., Мисієеїс Асіа5 Ке5. 30(2):ЕЗ9 (2002)), за винятком того, що клітини НЕК-293Т були вирощені в Егеевіуіе 293 (Іпмігодеп), а об'єм культури не розбавляли після додавання комплексів ПЕІ-ДНК. І адгезивна, і суспензійна транзієнтні трансфекції були інкубовані протягом тижня, потім прояснений супернатант був очищений у колонці із Протеїном А з наступною СМ колоною іонообмінною хроматографією, так, як описано нижче. Як показано на Фігурі 3, у трансфікованих клітинах експресія пПиИМОом19 була щонайменше в 10 разів вищою в порівнянні з експресією химерного Мом19.
Приклад 4
Виділення антитіл
Антитіла були виділені із прояснених супернатантів клітинної культури з використанням стандартних способів, наприклад, хроматографії з протеїном А або С (Ніігар Ргоївїіп А або С НР, 1 мл, Атегепат Віозсіепсе5). Коротко, супернатант був підготовлений для хроматографії шляхом додавання 1/10 об'єму 1 М Трис/НСІ буфера, рН 8,0. рН-скоректований супернатант був профільтрований через фільтрувальну мембрану 0,2 мкм і завантажений у колонку, урівноважену зв'язуючим буфером (фосфатно-сольовий буфер, рН 7,3). Колонка була промита зв'язуючим буфером до досягнення стабільного рівня фону без абсорбції на 280 нм. Антитіла були елюйовані 0,1 М буфером з оцтовою кислотою, що містять 0,15 М Масі, рН 2,8, на швидкості потоку 0,5 мл/хв. Фракції об'ємом приблизно 0,25 мл були зібрані й нейтралізовані шляхом додавання 1/10 об'єму 1М Трис/НСІ, рН 8,0. Пікова(ї) фракція(її) була діалізована протягом ночі двічі відносно їх фосфатно-сольового буфера й стерилізована фільтруванням через 0,2 мкм фільтрувальну мембрану. Кількість очищених антитіл визначали, судячи з абсорбції на Агво.
Фракції, очищені з протеїном А, були далі доочищені способами іонообмінної хроматографії
Зо (ЕХ) ії хроматографії із сорбентом з карбоксиметильними групами (СМ). Коротко, зразки, очищені із протеїном А, були обміняні в стартовому буфері (10 мМ калію фосфату, 10 мМ натрію хлориду, рН 7,5) і профільтровані через фільтр калібру 0,22 мкм. Підготовлений зразок був потім завантажений на смолу СМ (СЕ І іГезсіепсе5), урівноважену зі стартовим буфером при потоці 120 см/год. Розмір колонки підбирався таким чином, щоб зв'язати всі антитіла в зразку.
Потім колонка була промита зв'язуючим буфером до досягнення стабільного рівня фону без абсорбції на 280 нм. Антитіла елюювали градієнтом від 10 ММ до 500 мМ натрію хлориду в кількості 20 об'ємів колонки (ОК). Збирали фракції з величиною М більше 50 тАи відносоно головного піка. Чистота (відсотковий вміст мономера й розчинних високомолекулярних агрегатів) оцінювалась за допомогою ексклюзійної хроматографії (ЗЕС) на гелі Т5К
СЗО005МУХІ. у колонці 7,8х300 мм із запобіжною колонкою 5МУХІ., 6,0х40 мм (То5ойп Віозсіепсе,
Монтгомеривілль, Пенсільванія) з використанням ВЕРХ-системи Адіепі НРІ С 1100 (Ааіепі,
Санта-Клара, Каліфорнія). Фракції з бажаною чистотою (295 95) були об'єднані, буфер був замінений на фосфатно-сольовий буфер (рН 7,4), використовуючи систему ТЕЕ, а потім стерилізовані фільтруванням через фільтр із мембраною 0,2 мкм. Чистота очищених антитіл була далі визначена спсобом ексклюзійної хроматографії, концентрація (90 була визначена вимірюванням абсорбції при 280 нм із коефіцієнтом загасання 1,47. При необхідності виконували розведення. Альтернативно для доочищення як мишачих, так і гуманізованих антитіл з підвищеною селективністью, може застосовуватися керамічний гідроксиапатит (СНТ).
Смола СНТ І типу з розміром часток 40 мкм (Віо-Кай Іарогайгієб5) застосовувалась для доочищення антитіл аналогічно методиці для іонообмінної хроматографії. Як стартовий буфер для СНТ використовували 20 мМ натрію фосфату, рН 7,0, а антитіла елюювали градієнтом 20- 160 мМ натрію фосфату кількістю що дорівнювала 20 ОК.
Приклад 5
Розробка мишачих антитіл проти БОЇ К1
Були в наявності дві різні серії імунізації/скринінгу. Перша серія дала утворення клону ЕК1- 21, друга привела до утворення клонів ЕК1-48, ЕН1-49, ЕН1-57 і ЕК1-65. У першій серії миші проходили підшкірну імунізацію приблизно 5 х 1059 клітин КВ, що експресують БОЇК 1 (Американська Колекція Культур Тканин, АТСС ССІ-17). У другій серії клітини 300-19, що експресують на своїй поверхні людський РОЇ К1, застосовувалися для імунізації мишей. Для бо створення цих клітин була одержана амінокислотна послідовність людського БОЇ К1 з веб-сайту
МСВІ (номер доступу МР. 057937), далі вона була кодон-оптимізована і синтезована компанією
Віше Негоп Біоїесппоіодіех, фланкована сайтами рестрикції ЕсоК!І і Храї для полегшення клонування у вектор експресії ссавців роКа. Клітини 300-19 - попередник-В-клітинної лінії, одержані від мишей ВаїБ/с (Кей еї аїЇ, Маїиге, 317: 353-355 (1985)), - були піддані трансфекції плазмідою експресії роНа-БРоІй! для стабільного експресування високих рівнів людського
ЕОЇ КІ на клітинній поверхні. Для обох серій застосовували стандартні протоколи імунізації, використовувані в Іттипосеп, Іпс. Імунізовані миші були піддані бустингу антигеном за три дні до умертвіння для одержання гібридоми. Селезінки мишей були зібрані згідно зі стандартними протоколами по роботі із тваринами, наприклад перетиранням між двома стерильними замороженими мікроскопними стеклами до одержання окремоклітинної суспензії в середовищі
ВРМІ-1640. Клітини селезінки були центрифуговані, осад був відділений, промитий і з'єднаний із клітинами мієломи миші, наприклад, РЗ х 63А98.653 (Кеагпеу еї аї., У Іттипої, 123: 1548-1550 (1979)) з використанням поліетиленгликолю-1500 (Коспе 783 641). Злиті клітини були ресуспендовані в селекційному середовищі КРМІ-1640, що містить гіпоксантин-аміноптерин- тимідин (НАТ) (Зідта Н-0262), і селектовані по росту в 96-ямкових культуральних планшетах із пласким дном (Согпіпд-Совіаг 3596, 0,2 мл клітинної суспензії на ямку) при температурі 37 "С з 596 СО». Через 5 днів інкубації 0,1 мл супернатанту культури був видібраний з кожної ямки і замінений на 0,1 мл середовища КРМІ-1640, що містить добавку гіпоксантинну-тимідину (НТ) (бБідта Н-0137). Інкубування при температурі 37 "С з 595 СО: тривало доти, поки клони гібридоми не були готові для скринінгу антитіл. Також можуть використовуватися інші способи імунізації і одержання антитіл, включаючи ті, які описані в роботі Іапдопе єї аї. (Едв., "Іттипоспетіса! Тесппідое5, Рай І" Меїйод5 іп Епгутоіоду, Асадетіс Ргевв5, моїйте 121,
Ніогіда) і в роботі Напому єї аї. ("Апіїбодієв: А І арбогаюту Мапиа!"; Соїд 5ргіпд Нагброг І абогайгу
Ргез55, Мем Моїк (1988)).
Таблиця 18
Запропоновані СОК легкого й важкого ланцюга ЕК1-48, 49, 57 і 65. Також для СОК2 важкого ланцюга як мишачих, так і людських антитіл представлені визначення Кабаї
ЗЕО І МО: 57 ЗЕО ІЮ МО: 63 ЗЕО ІЮ МО: 69 ЗЕО ІО МО: 75
МО: 58 ІО МО: 64 ІО МО: 70 ІО МО: 76
ЗЕО ІЮ МО: 59 ЗЕО ІЮ МО: 65 ЗЕО ІО МО: 71 ЗЕО ІО МО: 77
ІО МО: 60 ІО МО: 66 ІО МО: 72 ІО МО: 78
ЗЕО ІЮО МО: 61 ЗЕО ІО МО: 67 ЗЕО ІО МО: 73 ЗЕО ІЮ МО: 79
ІО МО: 62 ЗЕО ІЮ МО: 68 ЗЕО ІО МО: 74 ЗЕО ІЮ МО: 80
Мишаче Мишаче Мишаче Мишаче
АМРОМарЗАМТОКЕКИЇ АІМРаМЗОТТУМІ КЕКа | мМІ5ИаЗЗТІЗМАЮТУКаї МІМРІЗЕМТМУМОКЕКО
ЗЕО І МО: 81 ЗЕО ІЮ МО: 130 ЗЕО ІЮ МО: 84 ЗЕО ІЮ МО: 86
Людське Людське Людське Людське
АІМРОМИарЗАМТОКРОСИІ АІМРаМЗОТТУМОКРОИї МІБЗИаЗОТІЗМАрБУКИЇ МІМРІЗЕМТМУМОКЕеОС
ЗЕО І МО: 82 ЗЕО ІО МО: 83 ЗЕО ІЮ МО: 85 ЗЕО ІЮ МО: 87
Приклад 6
Скрининг і селекція гібридом
Клітини РОЇ К1-300-19, трансфіковані людськими клітинами РОЇ КІ і КВ, використовувались
Зо в скринінгах першої й другої серії, відповідно. Супернатанти культур гібридоми були піддані скринінгу способом проточної цитометрії на предмет секреції мишачих моноклональних антитіл, що зв'язуються з РОЇ К 1-позитивними клітинами, наприклад з клітинами 300-19 або клітинами
КВ, що експресують БОЇК 1, але не з БОЇЖК 1-негативними клітинами, наприклад нетрансфікованими клітинами 300-19. 0,1 мл супернатанту гібридоми був інкубований протягом
З год. або з БОЇ К 1-позитивними клітинами 300-19, або з нетрансфікованими клітинами 300-19 (1 х 105 клітин у зразку) в 0,1 мл буфера РГАС5 (середовище КРМІ-1640 з добавкою 2 95 нормальної козиної сироватки). Потім клітини були центрифуговані, осаджені, промиті й інкубовані протягом 1 год. з 0,1 мл РЕ-кон'югованих козиних анти-мишачих Ідс-антитіл (наприклад, комерційно доступних від компанії Чдаскбоп І арогаїогу, б мкг/мл у буфері ЕАС5).
Клітини були центрифуговані знову осаджені, промиті буфером ЕАСЗ5 і ресуспендовані в 0,2 мл фосфатно-сольового буфера, що містить 1595 формальдегіду. Пов'язана з клітинами флуоресценція була виміряна за допомогою проточного цитометра ЕАсСбСаїйриг із багатоямковим самплером НТЗ або за допомогою матричного проточного цитометра ЕГАСЗ і проаналізована за допомогою СеїПОиеві Рго (все обладнання від компанії ВО Віозсіепсе5, Сан-
Дієго, США). Клони, позитивні по гібридомі, були субклоновані обмеженим розведенням. Для наступного аналізу було вибрано по одному субклону кожної гібридоми, який мав таку ж реактивність проти РОЇ КТ, як і батьківські клітини, згідно з проточною цитометрією. Стабільні субклони були культивовані, ізотип кожного секретуємого антитіла проти БОЇ К1 визначався за допомогою ізотипуючих реагентів, комерційно доступних (Коспе 1493027). Мишачі антитіла були виділені із протеїном А із проясненого середовища гібридоми, так, як описано вище. Ці антитіла були позначені як антитіла ЕК-1.
Приклад 7
Виділення мишачих моноклональних антитіл
Антитіла були виділені із субклонових супернатантів гібридоми з використанням стандартних способів, наприклад, хроматографії із протеїном А або с (НіТгар Ргоївєїп А або о
НЕ, 1 мл, Атегейат Віозсіепсе5). Коротко, супернатант був підготовлений для хроматографії шляхом додавання 1/10 об'єму 1 М Трис/НСІ буфера, рН 8,0. рН-скоректований супернатант був профільтрований через фільтрувальну мембрану 0,2 мкм і завантажений у колонку, урівноважену зв'язуючим буфером (фосфатно-сольовий буфер, рН 7,3). Колонка була промита зв'язуючим буфером до досягнення стабільного рівня фону без абсорбції на 280 нм. Антитіла були елюйовані 0,1 М буфером з оцтовою кислотою, що містить 0,15 М Масі, рН 2,8, на швидкості потоку 0,5 мл/хв. Фракції об'ємом приблизно 0,25 мл були зібрані й нейтралізовані
Зо шляхом додавання 1/10 об'єму 1М Трис/НСІ, рН 8,0. Пікова(ї) фракція(її) була діалізована протягом ночі двічі відносно їх фосфатно-сольового буфера і стерилізована фільтруванням через 0,2 мкм фільтрувальну мембрану. Кількість антитіл визначали, судячи з абсорбції на Агво.
Приклад 8
Визначення характеристик зв'язування способом проточної цитометрії
Специфічність зв'язування визначалася способом проточної цитометрії з використанням очищених антитіл. Діаграми БАС5, що демонструють зв'язування антитіл проти БОЇ К1 з клітинами 300-19, що експресують РОЇ КТ, за відсутності зв'язування з батьківськими клітинами 300-19, продемонстровані на фігурі 4. Кожне антитіло було інкубоване протягом З годин або з клітинами 300-19, що експресують РОЇ К1, або з нетрансфікованими клітинами 300-19 (1 х 105 клітин у зразку) в 0,1 мл буфера ГАС5 (середовище КРМІ-1640 з добавкою 2 95 нормальної козиної сироватки). Потім клітини були осаджені, промиті й інкубовані протягом 1 години з 0,1 мл РІТОС-кон'югованих козиних анти-мишачих Ідс-антитіл (наприклад, комерційно доступних від компанії Чдаскзоп І арогафогу, б мкг/мл у буфері РАС5). Клітини були знову осаджені, промиті буфером РГАС5 і ресуспендовані в 200 мкл фосфатно-сольового буфера, що містить 1 95 формальдегіду. Зразки були зібрані за допомогою проточного цитометра ЕБАСсС5зЗСаїїриг із багатоямковим самплером НТ5 або за допомогою матричного проточного цитометра ЕАСЗ і проаналізовані за допомогою СеїСицевбі Рго (все обладнання від ВО Віоб5сіепсе5, Сан-Дієго,
США). ЕАСсЗ-гістограми антитіл проти РОЇК, продемонстрували зсув флуоресценції, а батьківські клітини 300-19 його не продемонстрували. Також при інкубуванні будь-якої із цих клітинних ліній тільки з ЕІТС-кон'югованим козиним анти-мишачим Ідс-антитілом істотного зсуву флуоресценції не спостерігалось.
Приклад 9
Клонування і секвенування М - і МН-регіонів антитіла тиЕА1-21
Тотальна клітинна РНК була приготовлена із 5 х 105 клітин гібридоми з використанням набору КМеазу (О1Адеп) згідно з рекомендаціями виробника. Потім з тотальної РНК була синтезована кКДНК із використанням набору для синтезу кКДНК Зирегезсгірі І! (Іпмігодеп).
Процедура першого раунду ПЛР із виродженими праймерами на кДНК, що походить із клітин гіоридоми, грунтувалася на способах, описаних в роботі М/апад еї аї. (2000) ) Іттипої! Меїноа3в5.
Уап 13; 233(1-2):167-77) і Со еї аіІ. (1992) У Іттітипої. Рер 15; 148(4):1149-54). МН-послідовності бо були ампліфіковані ПЛР із використанням наступних вироджених праймерів: ЕсоМНІ1 стобапААТТОЗАНСТММАаСТавдавБАатТо (ЗЕО ІО МО: 50), Есомнаг сТтоСОаААТТОЗАНОЯТММАаСтТаБАОБАСТСМУСО (ЗБО 10 МО: 51) ії Ватідс1 садапАтТоСАТАаАСсАаАлтТасяавастТатсиа!тттасйо (5ЕО ІО МО: 52). МІ -послідовності були ампліфіковані ПЛР із використанням наступних вироджених праймерів: ЗасімМк садасСсТоапАМАТТаТамтТзАСМСАВМСТМСА (ЗЕО ІО МО: 53) і Ніпакі тТАТАСАССТСААаСсттасвСатааставсААсаАТацсАТАСАаТТасатТас (5ЕО ІО МО: 54). (Змішані основи позначаються в такий спосіб: МАсжАжТС, 5-5, У-СТ, МААжС, К-Ажо, М/-АТ).
ПЛР-реакційні суміші були потім витримані на 1 95 легкоплавкому агарозному гелі, ланцюжки з 300-400 парами основ були вирізані, виділені з використанням мініколонок 2уто ДНК, а потім направлені в Адепсошгі Віозсіепсе5 для секвенування. Відповідні 5 і 3 ПЛР-праймери використовувались як секвенуючі праймери для одержання варіабельного регіону кКДНК із обох напрямків. Амінокислотні послідовності МН- і Мі -регіонів були визначені транслюванням з результатів ДНК-секвенування за допомогою ПО МесіогМТІі.
Для ідентифікації 5'-кінцевих артефактів секвенуванняя праймерів у попередніх послідовностях кКДНК варіабельного регіону використовувався сайт МСВІ ІаВіаві (мумли.пеобі.піт.пій.дом/дбіабі/") для пошуку з метою виявлення зародкових мишачих послідовностей, від яких походили антитіла. Очищені послідовності варіабельних регіонів потім поєднували з референтними послідовностями МСВІ константних регіонів специфічних антитіл для одержання передбачуваної повнорозмірної послідовності мишачого антитіла. Потім розраховували ЕК1-21 молекулярну масу передбачуваних легкого і важкого ланцюгів мишачого антитіла і порівнювали з масою, виміряною згідно з аналізом рідинної хроматографії/мас- спектрометрії (РХ/МС). Важкий ланцюг мишачого ЕК1-21 відповідав виміряній масі, у той час як для легкого ланцюга було необхідне секвенування для визначення послідовності 5'-кінця. ПЛР- праймер СОЗ37-11І сієва!ї (ЩШодаансоссассаїдааашесснсісааснсї) був розроблений для відпалу із зародковою лідерною послідовністю мишачого антитіла таким чином, щоб нова ПЛР -реакція давала повний варіабельний регіон послідовності кДНК, не змінений праймерами. ПЛР -реакції, зональне очищення й секвенування проводились так, як описано вище; маса нової повної послідовності, що кодує легкий ланцюг, відповідну до легкого ланцюга Ег1-21, була визначена способом РХ/МС.
Приклад 10
Експресія референтних антитіл
Амінокислотна послідовність антитіла проти РОЇ КТ Могрпоїєсн!! Могаб-003 (Фарлетузумабу) була одержана з Міжнародного Переліку Непропрієтарних Найменувань Фармацевтичних
Субстанцій (ІММ) Всесвітньої Організації Охорони Здоров'я (ВООЗ), кодон-оптимізована і синтезована Вісе Негоп ВіоїесппоІоду. Послідовність варіабельного регіону легкогому ланцюга фланкована сайтами ферментативної рестрикції ЕсоВіІ і Ввім/І, послідовність варіабельного регіонуїі важкого ланцюга фланкована сайтами ферментативної рестрикції Ніпапш ї Араї для клонування в рамці зчитування з відповідними константними послідовностями в одноланцюговій плазміді експресії ссавців. Клонування, експресія і очищення проводилися так, як це описано для гуманізованих Мом19 і Ег1-21 вище.
Приклад 11
АЗКЦ активність пПиМом19
Аналіз вивільнення лактатдегідрогенази (ОН) використовувався для вимірювання антитіло- залежної клітинно-опосередкованої цитотоксичності (АЗК) ліній пухлинних клітин з використанням свіжовиділених клітин-натуральних кілерів (НК) як ефекторних клітин (наприклад, ЗпПівїав, у). ВіоЇ. Спет., 276(9):6591-6604 (2001)). НК-клітини були спочатку виділені з людської крові здорового донора (Кезеагспй Віоой Соптропепів, Іпс., Брайтон, МА) згідно з модифікованим протоколом, що використовується для МК Ізоїайоп Кії І! (Міпепуї Віотесі, 130- 091-152). Кров була в 2 рази розведена їх фосфатно-сольовим буфером. 25 мл розведеної крові було обережно налите поверх 25 мл Рісої Радие в 50 мл конічну пробірку і центрифуговано на 400 г протягом 45 хвилин при кімнатній температурі. Мононуклеарні клітини периферичної крові (МКПК) були відібрані із межі поділу, перенесені в нову конічну пробірку місткістю 50 мл і однократно промиті їх фосфатно-сольовим буфером. МКПК були ресуспендовані в 2 мл НК-ізолюючого буфера (їх фосфатно-сольового буфера, 0,595 альбуміну бичачої сироватки, 2 мМ ЕДТА), потім до клітинної суспензії було додано 500 мкл коктейлю біотин-антитіло. Коктейль біотин-антитіло містить біотинільовані антитіла, що зв'язуються з лімфоцитами, за винятком НК-клітин, що дає негативну селекцію НК-клітин. Суміш інкубували при температурі 4 "С протягом 10 хвилин, потім додавали 1,5 мл НК-ізолюючого буфера і 1 мл мікрогранул Апії-Віоїїп Місго Веад5. Суміш клітин і антитіл інкубували ще 15 бо хвилин при температурі 4 "С. Потім клітини були один раз промиті 50 мл НК-ізолюючого буфера і ресуспендовані в З мл НК-ізолюючого буфера. Потім у сепаратор амомМАсз5 (Мінепуї Віотесп) була установлена колонка МАС5 І 5, яку попередньо промили З мл НК-ізолюючого буфера.
Клітинну суспензію автоматично вводили в колонку, промивали фракцію, що виходить, з неміченими НК-клітинами, збирали в нову конічну пробірку місткістю 50 мл. Одержані НК- клітини висівали в 30 мл повного середовища КРМІ (КРМІ-1640 з добавками 5 95 фетальної телячої сироватки, 1 90 пеніциліну-стрептоміцину, 1 мМ НЕРЕЗ5, 1 мМ натрію пірувату, 1 95 100Х
МЕМ розчину незамінних амінокислот) і витримували протягом ночі. Наступні аналізи і розведення проводилися в середовищі КНВР (КРМІ-1640 з добавками 20 мМ НЕРЕФЄ, рі 7,4, 0,1 95 альбуміну бичачої сироватки і 1 95 пеніциліну - стрептоміцину). Різні концентрації розчинів антитіл у середовищі ЕНВР були аліквотовані у двох повтореннях по 50 мкл/ямку в 96-ямковий круглодонний планшет. Клітини-мішені були ресуспендовані по 106 клітин/мл у середовищі
ЕНВР ї додані по 100 мкл/ямку в кожну ямку з розведеннями антитіл. Планшет із клітинами- мішенями і розведеннями антитіл інкубували протягом 30 хвилин при температурі 37 "С. Потім у ямки із клітинами-мішенями додавали НК-клітини по 50 мкл/ямку. Типове співвідношення становило 1 клітина-мішень на 3-4 НК-клітини. Для кожного експерименту застосовувалися щонайменше наступні контролі: тільки НК-клітини, тільки клітини-мішені (спонтанне вивільнення
ІГОН), клітини-мішені із НК-клітинами (антитіло-незалежне вивільнення ІОН), клітини-мішені з 10 96 ТийопХ-100 (максимальне вивільнення ОН). Суміші інкубували при температурі 37 С протягом 4 год. для лізису клітин. Планшети центрифугували 10 хвилин при 1200 обертів/хв, 100 мкл супернатанту обережно переносили в новий 9б-ямковий пласкодонний планшет. У кожну ямку додавали І ОН-реакційну суміш (100 мкл/ямку) з набору Суюїохісйу Оеїесіоп Кії (Коспе 1 644 793), інкубували при кімнатній температурі протягом 5-30 хв. Оптичну щільність зразків вимірювали на 490 нм (00490). Відсотковий специфічний лізис кожного зразка визначали згідно з наступною формулою: відсотковий специфічний лізис-(величина зразка - спонтанне вивільнення)/ (максимальне вивільнення - спонтанне вивільнення)"100
При інкубуванні з з пиМом19 спостерігалась виражена АКЗЦ-активність проти клітин ІСНОМ- 1 у присутності людських ефекторних НкК-клітин. АКЗЦ-активність проти клітин ІШВОМ-1 порівнювалвсь для пиМом19, пиЕН-1-21, Мог003 ї сиТКІ1 (ізотипний контроль) (Фігура 6). При обробці 0,9 нг/мл пиМом19 спостерігався лізис приблизно 30 95 клітин ІСКОМ-1, що аналогічно
Зо активності, яка спостерігалась у інших антитіл проти БОЇК1. АЗКЦ-активність пиМом19 характеризувалася величиною ЕСзхо, яка дорівнювала 0,20 нг/мл, пиЕК-1-21-ЕСво 0,11 нг/мл,
Мог003-0,16 нг/мл, а СИТК1 не мало активності проти клітин ІЗКОМ-1.
Приклад 12
Одержання імунокон'югатів проти РОЇ К1
Одержання пиМом19м1 6-5:0Мто-5608-0М4
Лінкер 2-5йио-5РОВ був розчинений в ДМА. Антитіло пиИМОМ19м1.6 було інкубовано в концентрації 8 мг/мл з 12-кратним молярним надлишком лінкера 2-50о-5РОВ протягом приблизно 2 годин при температурі 25 "С при рівні рН 7,5. Реакційна суміш була очищена з використанням колонки ЗЕРНАЮЕХ М (325Е, урівноваженої 50 мМ калій-фосфатним буфером, що містить 50 мМ МасСі, 2 мМ ЕДТА, з рН 6,5. Майтансиноїд ЮМ4 був розчинений у диметилацетаміді (ОМА, кінцева концентрація 5 95), потім по краплях був доданий його 1,7- кратний молярний надлишок відносно лінкера до зйи/о-5РОВ-модифікованого антитіла. Рівень рН реакційної суміші був скоригований до 7,5 за допомогою 1 м буфера НЕРЕ5 Після інкубування протягом ночі при кімнатній температурі кон'юЮпговане антитіло було очищено хроматографією на колонці ЗЕРНАОЕХ "м (525Е, урівноваженій 10 мМ гістидину, 250 мМ гліцину, 195 сахарози з рН 5,5. Кількість молекул ЮМ4, приєднаних до однієї молекули антитіла визначалась з використанням описаних раніше коефіцієнтів ослаблення для антитіла і майтансиноїду (М/ідаізоп, М/С, єї а.) Мей Спет, 49:4392-4408 (2006)). Відсоткова кількість вільних майтансиноїдів, визначалась так, як описано вище. Були одержані кон'югати з 3,5-4 молекулами ОМА на антитіло пиМом19м1.6, було присутнє «1 95 некон'югованих майтансиноїдів.
Одержання пиМом19м1 6-5РР-ЮОМ1
Лінкер, М-сукцинімідил 4- (2-піридилдитіо)пентаноат (5РР) був розчинений в етанолі.
Антитіло пиИМОМ19м1.6 було інкубовано в концентрації 8 мг/мл з 6,5-6-кратним молярним надлишком лінкера 5РР протягом приблизно 2 годин при кімнатній температурі в 50 мМ калій- фосфатного буфера (рН 6,5), що містить 50 мМ Масі, 2 мМ ЕДТА і 595 етанолу. ЗРР- модифіковане антитіло було розведено 2-кратно фосфатно-сольовим буфером, рН 6,5, і модифіковано 1,5-кратним молярним надлишком майтансиноїду ЮОМІ шляхом додавання концентрованого розчину (15-30 мМ) ОМІ1 у диметилацетаміді (ДМА). Концентрація ДМА була скоригована до 5 95, і після інкубування протягом ночі при кімнатній температурі кон'юговане бо антитіло було очищено хроматографією на колонці ЗЕРНАЮЕХ М С25Е, урівноваженій 10 мм,
250 мМ гліцину, 1 95 сахарози з рН 5,5. Кількість молекул ОМ, приєднаних до однієї молекули антитіла визначалась з використанням описаних раніше коефіцієнтів ослаблення для антитіла і
ОМІ (Ши еї аї., Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА, 93, 8618-8623 (1996)). Відсоткова кількість вільного майтансиноїду, присутнього після реакції кон'югації, визначалась шляхом інжектування 20-50 мкг кон'югата в колонку НізерТМ, урівноважену 25 95 ацетонітрилу в 100 мм амоній-ацетатного буфера, рівень рН 7,0, з наступним елююванням ацетонітрилом. Площа піка загальних вільних майтансиноїдів різних видів (елюйованих у градієнті й ідентифікованих порівнянням часу елюювання з відомими еталонами) вимірювалась з використанням детектора абсорбції, настроєного на довжину хвилі 252 нм, потім вона порівнювалась з піком, обумовленим зв'язаним майтансиноїдом (елюйованим у піку кон'югата в проточних фракціях), і розраховувався відсотковий вміст вільних майтансиноїдів. Були одержані кон'югати з 3,5-4 молекулами ОМ'і на молекулу ПиМом19м1.6, було присутнє «195 некон'югованих майтансиноїдів.
Одержання пПиМом19м1 6 ЗРОВ-ОМА
Типовий лінкер М-сукцинімідил 4-(2-піридилдитіо)бутаноат (5РОВ) був розчинений в етанолі.
Антитіло пиИМОМ19м1.6 було інкубовано в концентрації 8 мг/мл з 5,5-5-кратним молярним надлишком лінкера 5РОВ протягом приблизно 2 годин при кімнатній температурі в50 мМ калій- фосфатному буферірі (рН 6,5), що містить 50 мМ Масі, 2 мМ ЕДТА, і 3 95 етанолу. 5РОВ- модифіковане антитіло було розведено 2-кратно фосфатно-сольовим буфером, рН 6,5, і модифіковано 1,5-кратним молярним надлишком майтансиноїду ЮОМ4 шляхом додавання концентрованого розчину (15-30 мМ) ОМ4 у диметилацетаміді (ДМА). Після інкубування протягом ночі при кімнатній температурі кон'юговане антитіло було очищено хроматографією на колонці БЗЕРНАЮЕХ М (325РЕ, урівноваженій буфером, що містить 10 мМ гістидину, 250 мМ гліцину, 1 9о сахарози з рН 5,5. Кількість молекул ОМА, приєднаних до однієї молекули антитіла визначалась з використанням описаних раніше коефіцієнтів ослаблення для антитіла і майтансиноїду (М/ідаізоп, М/С, єї а.) Мей Спет, 49:4392-4408 (2006)). Відсоткова кількість вільних майтансиноїдів, визначалась так, як описано вище. Були одержані кон'югати з 3,5-4 молекулами ОМА на антитіло пиМом19м1.6, було присутнє «1 95 некон'югованих майтансиноїдів.
Одержання ПИМОМ19м1.0-3-вио-таІ-ЮОМА
Зо Лінкер МН5-3-5иМо-таї і ОМА були окремо розчинені в ДМА. Лінкер і тіоло-ЮОМА були змішані один з одним у розчині ДМА, що містить до 40 95 200 мМ сукцинатного буфера, 2 мМ ЕДТА, з рн 5,0, у молярному співвідношенні ОМА та лінкеру, яке дорівнює 1,6:1, з кінцевою концентрацією
ОМА, що дорівнює 10 мМ. Суміш взаємодіяла протягом 2 годин при температурі 25 "С. Без очищення реакційну суміш додавали таким чином, щоб досягти еквівалента 9,б-молярного надлишку лінкера до антитіла в розчині антитіла ПИМОМ19м1.0у фосфатному буфері (рН7,5) у кінцевих умовах кон'югування 4мг/мл антитіла, 90 95 фосфатного буфера/10 95 ДМА, рн 7,5 (об'єм/об'єм). Після інкубування протягом ночі при кімнатній температурі кон'югована суміш була очищена хроматографією на 5БЕРНАЮЕХ "М (325, урівноваженою фосфатно-сольовим буфером, рН 7,5. Потім пИМОМ19м1.0-3-вио-та!І-ОМА був підданий діалізу в буфері, що містить 9,55 мМ фосфату, 139,6 мм масі, рн 6,5. Кількість молекул ОМА, приєднаних до однієї молекулі антитіла, визначалась з використанням описаних раніше коефіцієнтів ослаблення для антитіла й майтансиноїду (Уміадізоп, УС, еї аї. У. Мей Спет, 49:4392-4408 (2006)). Відсоткова кількість вільних майтансиноїдів, визначалась так, як описано вище. Були одержані кон'югати з 3,5-4 молекулами ОМА на антитіло пиМом19м1.6, було присутнє «1 95 некон'югованих майтансиноїдів.
Одержання пПИМОМ19м1.0-5МОС-ОМ'1
Лінкер МНО-5ийо-5МОС і ОМІ були окремо розчинені в ДМА. Лінкер і тіоло-ЮОМІ1 були змішані один з одним у розчині ДМА, що містить до 40 95 200 мМ сукцинатного буфера, 2 мМ
ЕДТА, з рН 5,0, у молярному співвідношенні ОМІ до лінкеру, яке дорівнює 1,2:1, з кінцевою концентрацією ОМ'І, що дорівнює 3,75 мМ. Суміш взаємодіяла протягом 75 хвилин при температурі 209С. Без очищення реакційну суміш додавали таким чином, щоб досягти еквівалента 6,4-молярного надлишку лінкера до антитіла в розчині антитіла НИМОМ19м1.0 у фосфатному буфері (рн7,5) у кінцевих умовах кон'югування 4мг/мл антитіла, 88 95 50 мМ калію фосфату, 50 мМ Масі, 2 мМ ЕДТА, рН 7,5/12 95 ДМА, рН 7,5, (об'єм/об'єм). Після 2 годин інкубування при температурі 20 С кон'югована суміш була очищена хроматографією на
ЗЕРНАОЕХ"М (525, урівноваженою фосфатно-сольовим буфером, рН 7,5. Кон'югат пиИМОМ19м1.0-5МОСС-ОМІ1 був далі діалізований в буфері, що містить 250 мМ гліцину, 10 мМ гістидину, рН 5,5. Кількість молекул ОМІ, приєднаних до однієї молекулі антитіла, визначалась з використанням описаних раніше коефіцієнтів ослаблення для антитіла й майтансиноїду (М/ідаівоп, МУС, єї ам. У. Мей Спет, 49:4392-4408 (2006)). Відсоткова кількість вільних 60 майтансиноїдів, визначалась так, як описано вище. Були одержані кон'югати з 3,5-4 молекулами 5О0
ОМІ на антитіло пиМом19м1.0, було присутнє «2,8 95 некон'югованих майтансиноїдів.
Одержання пПИМОМ19м1.0-РЕС4-та!І-ЮОМІ1
Реактив 1 етапу МНЗ-РЕС4-таІ-4т1 був розчинений у ДМА. Антитіло пиМом19м1.0 було інкубоване в концентрації 5 мг/мл з 5,7-кратним молярним надлишком МНЗ-РЕСІЯ4-та!І-ЮОМІ1 протягом ночі при температурі 25 "С в 50 мМ Крі, 50 мМ Масі, 2 мМ ЕДТА, рН 7,5 і 10 96 ДМА за об'ємом. Реакційна суміш була очищена на ЗЕРНАОЕХ С25, урівноваженій фосфатно-сольовим буфером, рН 7,5. Кон'югат пиИМОМ19м1.0-РЕС4-та!І-ОМІ був діалізований у буфері, що містить 250 мМ гліцину, 10 мМ гістидину, рН 5,5. Кількість молекул ОМ'І, приєднаних до однієї молекули антитіла визначалась з використанням описаних раніше коефіцієнтів ослаблення для антитіла й майтансиноїду (УУідаіїзоп, УС, еї а.) Мей Спет, 49:4392-4408 (2006)). Відсоткова кількість вільних майтансиноїдів визначалась так, як описано вище. Були одержані кон'югати з 3,5-4 молекулами ОМ'і на антитіло ПпПиМом19м1.0, було присутнє «1,195 некон'югованих майтансиноїдов.
Приклад 13
Зв'язуюча здатність антитіл і кон'югатів
Зв'язуюча здатність антитіл проти РОЇ КІ і їх кон'югатів з ЗХРОВ-ОМ4, РЕС4АМа!І-ЮОМА4, 5МОС-
ОМ або проти РОЇ К1-5и1о-5РОВ-ЮОМА досліджувалась способом проточної цитометрії. Клітини
ЗКОМЗ, що експресують ГО Е 1 були інкубовані з різними концентраціями антитіл проти БОЇ К1 або їх кон'югатів і оброблені так, як описано вище для аналізу способом проточної цитометрії.
Аналіз даних проводився з використанням СепОпеві Рго (ВО Віозсіепсе5, Сан-Дієго, США), для кожного зразка знімалась середня інтенсивність флуоресценції для РІ/1 (МЕ), після чого будувався напівлогарифмічний графік її залежності від концентрації антитіла. Крива залежності ефекту від дози була побудована нелінійною регресією, і величини позірної рівноважної константи дисоціації (Ка) досліджуваних зразків при зв'язуванні із клітинами 5КОМЗ були розраховані за допомогою СгарпРай Ргізт м4 (СгарпРайд зопмуаге, Сан-Дієго, Каліфорнія) і представлені на Фігурі 5. Результати показують, що кон'югування як з ОМ'І, такі з ОМА за допомогою будь-якого використаного лінкера не впливає значущим чином на афінність кожного антитіла (наприклад, пПиМом'19).
Приклад 14
Зо Аналізи цитотоксичності іп міго
Здатність типових кон'югатів тиЕА1-9, тиЕА1-13, тиЕВ1-22, тиЕА1-23, пиЕВ1-23, тиЕА1- 21 ії пиЕВ 1-21 інгібувати клітинний ріст вимірювалась з використанням аналізів цитотоксичності іп міго способами, описаними Комип УМ еї аІ. (Сапсег Ке5 66: 3214-3221 (2006)). Кон'югат
РЕСІ4-та!-ОМА був доданий у різних концентраціях до клітин КВ, що експресують РОЇ К 1 в 96- ямковому планшеті, що знаходиться по 1000 клітин на ямку в 100 мкл повного середовища
АРМІ (АРМІ-1640, 10 95 фетальної телячої сироватки, 2 мМ глутаміну, 1 до гентаміцину, всі реактиви від Іпмігодеп). Антитіла й кон'югати були розведені повним середовищем КРМІ з використанням серій З-кратного розведення і додані по 100 мкл у ямку. Підсумкова концентрація, як правило, варіювалася від З х 102 М до 4,6 х 1072 М. На кожному планшеті були контрольні ямки, що містять клітини й середовище, але не містять кон'югатів, а також ямки, що містять тільки середовище. Планшети були інкубовані від чотирьох до шести днів при температурі 37 "С в інкубаторі зі зволоженою атмосферою, що містить 5 95 СО». Потім у ямки був доданий реактив УУЗТ-8, 10 95 об'єм/об'єм (Оо|їпдо Моїіесшаг Тесппоїодієв, Сайнетгтзрига,
Мериленд, США), планшети були інкубовані при температурі 37 "С протягом 2-6 годин. МУЗТ-8 відновлювався дегідрогеназами живих клітин до жовтогарячого кольору (максимальний формазановий продукт, розчинний у живильному середовищі). Кількість формазану, що утворюється, прямо залежала від кількості живих клітин. Планшети були проаналізовані шляхом вимірювання абсорбції на 450 нм (Аз5о) і на 650 нм (Авзо) у багатоямковому планшет-ридері.
Спочатку фонову опалесценцію клітин (Авєзо) віднімали з Авво. Одержану величину А"45о потім використовували для визначення фракції клітин, що вижила. За фонову абсорбцію А"»450 приймали абсорбцію ямок, що містять тільки середовище й М/5Т-8. Фракцію, що вижила, розраховували в такий спосіб: Відсоткова виживаність - 100х(А"45о обробленого зразка - А"450 фонова)/(А"45о необробленого зразка - А"л5о фонова). Для кожної обробки були побудовані напівлогарифмічні графіки залежності величини фракції, що вижила від концентрації антитіла або кон'югата. Виходячи із цих даних, були визначені величини ІСсо за допомогою сСгарпРаа
Ргізт м4 (СгтарпРай з5зойпуаге, Сан-Дієго, Каліфорнія), які показані на Фігурі 5. Результати, показані на Фігурі 5, демонструють, що всі кон'югати приблизно однакові за своєю цитотоксичною активностю проти клітин КВ що експресують РОЇК 1. Для подальшого підтвердження специфічності кон'югатів антитіл проти БОЇ К1 з майтансиноїдами проти БОЇ К1, бо величини їх активності оцінювалися в присутності надлишку некон'югованих антитіл проти клітин КВ. При додаванні надлишку конкуруючого некон'югованого антитіла до кон'югатів спостерігалося придушення їх цитоткосичності, що показано на Фігурі 7. Ці дані свідчать про те, що кон'югати обумовлюють загибель клітин КВ антиген-залежним способом. Додаткові дані показали, що пимМом19-5РОВ-ОМА індукувало зупинник клітинного циклу у фазі С2/М для клітин
КВ при дослідженнях іп міїго.
Приклад 15
Ефективність іп мімо кон'югатів пимМом19-РЕСАМа!-ОМА ї пиМом19-5Р0ОВ-ОМА у порівнянні зі схожими ненаціленими кон'югатами на моделі ксенотрансплантата КВ.
На встановленій ксенотрансплантатній моделі клітин КВ, імплантованих підшкірно мишам з
ТКІН, був протестований РОЇК 1-націлений, розщеплюваний кон'югат пимМом19-5РОВ-ОМА4 у порівнянні з ненаціленим пиС242-5РОВ-ОМ4, а також нерасщеплюваний кон'югат пиМом19-
РЕС4-Ма!-ОМА у порівнянні з ненаціленим пиС242-РЕСАМа!-ОМ4. Миші були рандомізовані в терапевтичні групи згідно з масою тіла і одержували терапію або однократно (кон'югати 5РОВ) на З день після інокуляції клітин, або три рази щотижня на 3, 10 і 17 день після інокуляції клітин по 5 і 10 мг/кг кон'югата, відповідно. Медіанний об'єм пухлини в різних терапевтичних групах показаний на Фігурі 8. При терапії пиМом19-5Р08-0М4 або пиМом19-РЕС4Ма!І-ОМ4 спостерігалось зменшення медіанного об'єму пухлини в порівнянні з контрольною терапією фосфатно-сольовим буфером, у той час як при терапії ненаціленим кон'югатом значущого ефекту не спостерігалось.
Приклад 16
Ефективність іп мімо кон'югатів проти ЕОЇ В1-РЕСАМа!-ОМА на моделі ксенотрансплантата
Кв
Кон'югати РЕС4Ма!І-0ОМА4 типових антитіл проти БОЇ ВТ пиМом19, тиЕВ-1-9, тиЕВ-1-13, тиЕВ-1-22, тивА-1-23 їі НиЕВ-1-21 були протестовані з використанням встановленої ксенотрансплантатної моделі клітин КВ, імплантованих підшкірно мишам із ТКІН. Миші були рандомізовані згідно з масою тіла в терапевтичні групи і одержували однократно на З день після інокуляції клітин по 10 мг/кг один з перерахованих вище кон'югатів або тільки фосфатно- сольовий буфер. Як було показано вище, пиМом19-РЕСАМа!-ОМА за цитотоксичною активністю іп мйго схожий з кон'югатами РЕС4АМа!-ОМА ї тиЕВ-1-9, тиЕВ-1-13, тиЕВ-1-22, тиЕВв-1-23,
Зо ПиЕВ-1-21. НимМом19-РЕСАМа!-ОМА ї пиеВ-1-21-РЕСЯМа!-ОМА були суттєво більш активними іп мімо, ніж будь-який з інших кон'югатів, забезпечуючи більш виражене зменшення медіанного об'єму пухлини (Фігури 9 ї 10). Як було показано, активність має залежний від дози характер (Фігура 11), також на неї впливає вибір лінкера (Фігури 12 і 13).
Приклад 17
Ефективність іп о мімо кон'югатів проти РОЇ В1-5зиИйо-5РОВ-ОМ4 она моделях ксенотрансплантатів
Кон'югати проти БОЇВ пиМом19-5000о-5РОВ-ОМ4 були протестовані на трьох ксенотрансплантатах серозної аденокарциноми яєчника: ОМСАК-3, ІЖВОМ-1 ії ОМ-90. В кожній із цих ксенотрансплантатних пухлин спостерігалися рівні експресії РОЇ К1, порівнянні з пухлинами у пацієнтів при вимірюванні з використанням способу каліброваного імуногістохімічного забарвлювання (ІНС) зафіксованих у формаліні залитих парафіном зрізів. Миші із установленими підшкірними ксенотрансплантатними пухлинами (приблизно 100 мм3У) одержували однократну внутрішньовенну ін'єкцію кон'югата пиМом19-500о-5РОВ-ОМА по 1,2, 2,5 і 5,0 мг/кг (грунтуючись на концентрації антитіл; на Фігурах 14-16 показана концентрація майтансиноїдного кон'югата в мкг/кг). Кон'югат був активний у всіх трьох досліджених моделях.
Для ксенотрансплантатів ОМСАК-3 мінімальна ефективна доза (МЕД) становила 1,2 мг/кг (Фігура 14). Більш високі рівні доз були високосактивні, приводячи до повних регресій (ПР) у 4/6 і 2/6 мишей у терапевтичних групах 2,5 і 5,0 мг/кг, відповідно. При терапії кон'югатом спостерігалась сильна протипухлинна активність для обох моделей ксенотрансплататів ІСКОМ- 11 ОМУ-90 з МЕД при однократному введенні 2,5 мг/кг (Фігури 15 і 16). Ці дані свідчать про сильну протипухлинну активність кон'югатів пиМом19-5010-5РОВ-ОМА4 проти ксенотрансплантатних пухлин яєчника з рівнями експресії РОЇ К1, порівнянними з пухлинами пацієнтів.
Приклад 18
Вплив лінкерів на ефективність імунокон'югата
Антитіл пПимМом19 проти РОЇ К1 було з'єднано з ОМІ1 або ОМА через розщеплювані лінкери, що містять дисульфід, 5РР, ЗРОВ або зийо-5РОВ або через нерозщеплюваний лінксеромМоб.
Вивчалась цитотоксична активність іп міго цих кон'югатів на клітинних лініях КВ, ІЗ3КОМ-1 і УЕО- 3. Аналіз ЕАС5 показав, що клітини КВ (цервікальні) мали 22000000 антитілозв'язуючих сайтів на клітину. Клітини ІЗКОМ-1 (яєчника) мали 260000 антитілозв'язуючих сайтів на клітину, а бо клітини УЕО-3 (хоріокарциономи) мали 40000 антитілозв'язуючих сайтів на клітину. Результати вивчення цитотоксичности іп міго представлені в Таблиці 2 нижче. У розщеплюваних кон'югатів спостерігалась суттєво більша активність іп міїго у порівнянні з ЗХМСС-кон'югатом.
Таблиця 2
Вплив імунокон'югатних лінкерів на цитотоксичність іп міго
Кпітини ІСво, НМ (п--3), з розрахунку на антитіло
ЗРР-ЮОМІ ЗРОВ-ОМА ЗзШо-5РОМ-ОМА ЗМОоС-ОМ1
Також була визначена активність кон'югатів іп мімо на моделях БОЇ К 1-позитивних КВ- і
ОМСАНВ-З-пухлин. Результати, представлені на Фігурі 17, свідчать про більш очевидній дії, розщеплюваних кон'югатів ЗРОВ-ОМ4 й 5ийо-5РОВ-ОМА4 у порівнянні з нерозщеплюваними кон'югатами ЗМОС-ОМІ іп мімо. Крім цього, серед, розщеплюваних кон'югатів кон'югат ЗРР-ЮОМІ був менш активний, ніж кон'югати ЗХРОВ-ОМА або зийто-5РОВ-ОМА в обох ксенотрансплантатних моделях (Фігура 18). Два останні кон'югати мали приблизно однакову активність проти пухлин
КВ, у той час як в моделі ОМСАМК-3 був більш активним кон'югат 5ийо-5РОВ-ЮОМА4. Дані, одержані з використанням моделі ОМСАК-3, представлені в Таблиці З нижче.
Таблиця З
Вплив імунокон'югатних лінкерів на розмір пухлини в моделі ксенотрансплантата ОМСАК-3
Кон'югат Неконтрольованих Часткова відповідь| Повна відповідь Відповідь пухлин (95)
ЗРР-ОМІ
ЗРОВ-ОМА 77778. 66 | 7/6 |Високоактивна.:/
Зио-ОРОВ-ОМА | 07777717 Ї77717171176/6777711 1771111 4/6 |Високоактивна:С
Ці дані свідчать про те, що імунокон'югати, що містять, розщеплюваний лінкер, мають підвищену ефективність як іп міїго, так і іп мімо, і що імунокон'югати проти БОЇ К1, що містять 5йиМо-5РОВ, високоактивні на пухлинних моделях.
Приклад 19
Ефективність кон'югата антитіла ПЕК з БМСС-ОМІ іп міїго і іп мімо
Антитіла проти РОЇВ НиЕА1-48, пиЕА1-49, пиШЕВ1-57 ії НиШЕНІ1-65 були кон'юговані з ліннеером МОСС і ОМІ, за допомогою описаних вище ксенотрансплантатних моделей аналізувався вплив на клітини КВ і іп мімо, так, як це описано вище. Хоча кожне з антитіл мало приблизно однакову ефективність у моделі клітин КВ, імунокон'югати пиШЕН1-48,. пиЕВ1-49,
ПиЕА1-57 і пшЕНА1-65 проявляли різну, але виражену ефективність іп мімо при дозі 200 мкг/кг у ксенотрансплантатній моделі (Таблиця 4 і Фігура 19).
Таблиця 4
Ефективність кон'югата антитіла ПиЕКТ з ЗМСС-ОМІ іп міїго і іп мімо
Активність пПиАб-втсс-ОМ1 Активність пиАБ-єтес-
Клон Позірна афінність (нм) (|по відношенню до КВ іп міо ОМІ іп мі (нм) іп мімо) пив -48 пигВ1-49 пиЕВ1-57 поЕВІ-65 пиМомт9 00677771 00Мо 11111111 їн
Всі публікації, патенти, патентні заявки, інтернет-сайти й номера доступу/послідовності в базі даних (включаючи як полінуклеотидні, так і поліпептидні послідовності), згадані тут, включені за допомогою посилання у всій повноті для всіх цілей і в межах такого ж охоплення,
що й кожна індивідуальна публікація, патент, патентна заявка, інтернет-сайт або номер доступу/послідовності в базі даних, специфічно й індивідуально зазначені як включена за допомогою посилання.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105» Іттиподеп, Іпс.
АВ, Ода
ТАМАНВЕЗ5, Папієвєї!
ВИШІ, Спдушп
РАУМЕ, СійПап
СОЇ ОМАКНЕН, МіКог 5. «120» АНТИТІЛА ПРОТИ РЕЦЕПТОРА ФОЛІЄВОЇ КИСЛОТИ 1, ЇХ ІМУНОКОН'ЮГАТИ І
ЗАСТОСУВАННЯ
«130» 2921.002Р0204 «140» Повинно бути задано «141» Тут «1505 05 61/413,172 -1515 2010-11-12 «1505 05 61/346,595 -151» 2010-05-20 «1505 05 61/307,797 -1515 2010-02-24 -1605 130 «170» Патентна версія 3.5 «-2105 1 «-21155 212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» пиМом19 УНС СОНВІ1 «4005» 1 п бек Був Ва дак «-21052 -211517 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» пиМом19 УНС СОНа2 «4005» 2 дкч ті МЩМвж Би Тек дер дім деЮ о ТнжЖ Бое ТУук Аа б пух вБпЕ аа
МАУ
2105 З «-21159 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» пиМом19 уНС СОВЗ «400» З
ТУХ ав осіуУ Беж Ач вів Меб ово ОтеК «21054 «2115118 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020»
мо нь и чень НН НК ІН Не о На А НЕ А Не НН НЕ Ж жах Же КЛ кю мкА ЯК УА АЮ МА АХ БЖ ОА У А МАМ Юма МУ ЕЕ ККУ
З к а чі
Я ш М ЛХЕ тиха ЖК тож ув тд што тд тм Же СА о жи Ар дю Жюля Кук гу ку Уют их хау а меж Ж В туш ЕМ хе ж Пак и ку КМУ Ук хийх ща цу ША ЕК Є ШЕ щу ТКА що ах А у Ж ожикх ЕпЕеотевю с Ж ОА УХ слух тк ко щей не о жан жи Мои жк їж гоже хх ож Пен и ше деки сома УК М дехя Ян, це мес век бо чаї БУВ бій пек Бус бфу ЗА бек ви Зм ТкЕ о Їе
К-е ЕН З
ТЛ я щих СК их ЖЖ юю Жуля може іму КМ ху ку Ьешу Букі бмжах о бу КЗ у ся ук УМО мешУ в ОКУ КК КОХ Ук БМ Доза ле ШКО МО ЄЕМА СЕ Ук МЕТ АЗАТЬ ОМ У ВЕН
ЗУ о ж: оз чн но нн НН НЕ НН НН НН НН Но НН
МВЖК Ос ХУДІ РККХЮ Ка Мо ЕН Кр КА ім У ож о се НИ а З Я и Я о У 5 міш. ТЛ юю окт тод У дІду ж сам. Меч де у МК хна МО пр г. з о ни и НА Я
САУЖКТХУ шим МИШКУ КОЖ ТОЖТМ ХАТА АлАХ ЕКО з ММЮ АХ г КЗ В: ЯН м МмО А ТуиХ ОО ОДУ ЕХ ща ЗЕ ик
Га Може Мих Молими ШК Живу 0 Кк - Маша е Тешую Ман Му ЕК м ЕМ п о Уч
ТО Баг г Яма (У меж Ж хів Мей днк отУужЖ ТЕ що КА Ск
З ЗУ їх яч І в -ї Оле В ки ло у хе
ОС ве но
КУ жи яри ли Кт а ІК яко УА БЕ Ума Беж ов 5 КОКО вен НН В В НИ плачемо мое ши зросла АН и ве НУ І КОН. ВИ й гео ЖЕКу с
Ще куки ми сретрж в рух дру й ге сек тугу ху Бесую уч сіуути фозтуй отих дух спиш сасанчк мосщоваевчск сасчоВКсс песо каз сеює ке есене та щи птф сечових мете пре вет ку в ли ве В Ко рив сви во гц кет их чия СМ СЕ КО ЕРА ТЯ БАЛОНИ ОА КК чик
НЕЗЯ и НВ Не Во Но о и им
ТО п ЧАН ИКІ ЛК КТ СЕК КІ БЕХА ЦИМ КИ М АКНЕ НК
В ен НН НН в НН пнажІн и В М п КК ОО У В КИ М С В КВ ОВ ВЕ КО
ЕЯНННЯ ен пакт дих лу т Ж тек и жи Морі их пеки люлі ех ех М ок Кров екк дм дур их вх Моя ФМ КК їх М як Ворона АК ке ра КЕ и не ВЕ МЕЖ три
У езіж в б лужузлуїук схов зику ких св чолов Форукхітуттем тв ругжпьузехтви ви коту свіч
МЕС ГАС С КАМ В ЕН ИН що КЕ ВЕ долу ке с а а ни А шоссе шищис ес ско их ню ЖЖ т делі Жук ху М тля ка жи таку Мем Б хи М цій щі біб іа УВО щі беж ші Мізв св бі Уві шо КЖ му г - не че ее
Я х МА щ птшум Етю тки но уч Ух Кох МК лу и жу сум хчя Мбіт Куда ба ЕЙ а роки
ИН и ж М нн з З м В ВК а в а з а и М і В В М В В З В в В Я що т ких
УТ ТМ, ККЗ ки У С ую Мжмию Мои ре НІ а ча Тео Жду іл яко й ую Как ує о Хо б та Мун Ж у
Еірй Би о МБ ж юю УА АЖ МУ АК КуКУ ло МЖК Же АТХ МКК АТ 3 м ко х хх У о ЧАН Не я гуде Я хе Не ж п з зе 4 хх ке як
Шк Мнию СКЗ дн Жкрчєя Убхах о Мах Му Щур МУКУ уя Тех о Мч ін ух МА шу боку. Тр
Мем ЯК КАЖЕ ЖЕК БЕ КУЖ АЮ У ск в ре у МЕ ЯМ у еВ оо Кл 7 ве гу З я З Я Х В хх - Щ ше по меча МУКУ шт кі г 4 ку св хх т г 2-х - які о чик п ілю Ми тм. ВВ т тра ЗЕ су: Ту Та баз ЩІ тн ЛЮ іш
МАХ ЖК Уу АЖ ЛКАФО СУТЬ ем ЖКЖж УМА вБІ СУК ОоБвшК Бех БИ ПЕ мів КІВ
Фо її їх щих
ТЗ У Бе щ- сли яку КУ ч - У ебтвяю Су - ж ол о Я «ту сх
Міккі салі б КМ Трек жішууУ її аз Мтури Жінх Ву т тата тки Є жу
МВ Ст хі ЕХ НН ЗК М МН З АНЯ А впЕ КУН У я Її ж Ам СХ ще «1 ТА
ХХ щи ШУЙ мом феииє М жмо Міші З єю хлекчх бу МУ йдху є бочок: Му ЗЛ хх у Ві шу Кук
МЖК Ки УЮ МУ АКТА ск п о с М З С З ЛЬ ЧІ ВУ Мк хх ї. ОО УКАОАК НЛО Х ХА, прожтю яв що
ІЙ ОК їову
Коен ЗАСАДАХ. КО
Чек фею Се е їеьуї шини Ж В Міф У лк Тк ее их що фа й кут
ЖЖ Ма АТМ. ще ЕХ шшжЕ АВ ММ ЛК МмУш АЖ КЕО шЕЖ ща ЖЕ ОККО чия ос доку кл ДВК хх
КА лИ Ку ке жоден ж жде Кк с Кот х. дою. їх ко - м М уж мух кл х У. ух
Тоді: Ж ду Хати: бли бли т охкшу дує ЗУруз дткуух Сам ЕЛ ях Мая в я ЛУ току МУ я ке ек ко а п о з м В ВК С В З У ХО Бе СХ У АА М САЛАЮ ЯМАДЮ ЯМА АН РА УХА У чотки сек тях
ОМ Кл ММ
Сасу У ще чу: ї х г. Мою. ВИ Ух ре уютя р ул Ьшх щч УУзф чле ОНИ ин, и Стою, т Ч пово їн Ущі Яоеов о вшю ек Ше: фе їн бйто Уві тв щі бек сБртї Вар ще в и и М ЕЕ М У ЯМ АКА Кк Ам ОюКО У Кг мах І ши ОЖТУКУІА що щи зо РУКУ
МТ КІ ООЖЕТВ и
Тон БК Мр Жоштяа Су у бу Й худ Жди ду білях Зіни Сем У Я хо хх КТ ще дідеюо Би ФЮ що Бищяа бик ббдуує газу І Ми КУ зізжо Ще; о Ше ямі Ттіх
МЕЖЙК ОО хи ЛА мм ХУ ЗМ КАМ МІК БИЬКО ОА КУН юЮЖже ек ХА ДМ УКХ ее ЯН КН туш їде ок Мод смакує дю Ж о ехк ги Жди: ЖЖ хи ма щТЬ аеи кщ Ж ніч
Тек ГУЕя КУ У ЗНА їчату Тіш У Ток ау адек У ме пьКк що кон о о ТО щу з» ех т за а кв и Кп В В п о в М зм м о В а М В В КЕ В М ВО М ПЕ М В ех НО г шк З їугх
Її І крену рт ері тя ЛЬ Му ую п Ж са ер щі Да Мі їла Шучю прищ ма а ка мс я ки м з Он В НЕ В ЕЕ МЕ ЖК емо ААШІЮ ть ЗА БА мУущш Ки Ом шко т тугу ке ММ М
Хай фе тохкс ет тою о бок тА т. Шере Хо оку» ба Сук Ті ТИХ яю АК КЕИО Мб шко ЛьЖеМ чу. хе Ж сх ЕжЖе СУБ БМ У ЯК МІД АМ ОО ЛАК
МОН ЗБ У
«кт М «КТ КМ «жд тт бод джох чи пляж и - с тах сих т жа жк туї дж У їх ша єю ЧТ; ах ги ЖЕ и уч г Бегу В йти у Ж ву: 7 мір ТК хх З жо Шчух су и А а ко МЕ и и У ЕКО ДАВ ЕКО ща ІМ лама с хм АУ АХ с мех сулюв в ть за я км же жия «ХУ уж вч о х. ти Качки Текля 2 за тим Жде од кур я пок ж вх С 5 Тосмах. у ТЕ божі ЖІ І ЩКютих ач КК Зою гл Зак КК хх ЗМК ї ше То пог
А дме АЖ ЖОВ ЖЕ УК БЮ АК ЖК ХК Мем Ме о ОК ОКХ Я су тк тю
КІКІХ хі шХ в не НН КК ЧИМ УтЖкю сю Сула Іл КО хх У НК АН сСтиз с Ек ам ЕМ ану х ФА кг шжс сода ЖЕК ОК УЮ У ЮЖНЕ Б АХ МВ ЮК ту Ех ЕЕ ц суть «КА ХЕ КЕ АНУ аа у нн нн нн о НН На о НН АЖ У Но НН НН ців Зв бе ЮЖпа;о АВГ ОТ Ю У мА УЮ е КО їх МВ мВ А да
ТЮТЕ ту су
ОХХ а В ти Мт сит лану со ж 24 жу сх кує До дк лу ФМ Му В ост М шк т. яяу т АЛАЖ ЯК л КА У ЖК КМ СМ їз Я У М НВ сви КК ЖЕщ Уді бді сг зу дощ
ХМ же НЯНЯ
Хлшш ху Ж діт У КІ Я 4 їл х - ех х. - ка г. ж Удрі де Не у ГЕН 4 ду хуя Мода сф тах тоаюую Лях Жди и я ру як мало ЖУК ЖІ ме вх ла зежю ве о-же мой веб ому мУБ СА БУХ заз їз ЗІ хі
КУА їх оч Ху о и не я НК НА Я я НН Є Тв ем КЛоем Ул я Ж дея М зум шум жук шк ЖК АР МУ ЛА НМ БЕХ їз Бкс жі с т; У де
ШК ам 5
Жде сю дим ФУ Жде КА А фу Мети ІЛ Хати У хо ти Тк . боАЇВО КАМ АЗУ ЦО А ЧУВ Хі Ж АВ КК АЮ ОМ БЖ КУ ів ді бек Тв їжа дою мч дити
УЖ «КІ до
Жінич о Жюля шум УТ ак Жири щк Мол ЖЖ у Ка сон нн НН ж юку ЗМ КМ ОХ це МУ адм ЗА У ех А КТК У
Кк ЗЕ т ах З ПУХ и хх Жооасчи ми сяк ЕК я, путюю го Ф м КУшч м Кк хх З ач УЖ при ил ям
Мши ЖІ МЖЩщ ААУ ЕІНЕ УЖЕ вис сш зав Аш ж У Ам ую СМ НЕ
Ки Я «ЕХ чи чт юн гул АТ я умму. Жомерх ЄТ у тку тухфкяно ИНА Тв пуху Ком дош іх аа мат ша оре сем а ЗЕ ТМ ЖУК МУВ ОЮВЕ ЖК КК ЕКО ЧК МЕМХ ОН зх а За що
Фтми Тау ТЮюю ум уві ню шу з на НН в в НН о НА Я шк бик У бах ІНВ Кі ОН Ух ек му и ЮБТНЄ ЖЕ І МУ се Ю
КУ ту я
ІМО Ам ах що рт ее мом КА Мою уми яйю С пул и ня Ко Но Не НУ р не НА Тл
МЕЧ Єжшжт АЮ сг У ЕХ УщА БІМе шк КА КО МдИиМ Беж. З зво лад до хви С сЕохт ххх о
Уста Мб умо віх ух ЖТЯ Фу СЖіюкі. Чбкуу ФУ Ху хе Ж Ши Тахії бах Жвехі. хх То їн. Ні АВ Між СУ дл Аа У Беж ЕМ о юшЕ їі БЕХ ШшЕКЛЬ ( яю Су яті дог ак ве Нм Ме ен япюдк ЛЮТ о тя Ер дж КУ Же уілах аю Б ва» Ся бик Жах ДдшУТО ЩІ шУуд й шк БА Бек УА ЗХ віме міш У СКК МЕЖ ВМО КОЖ - 2 5 чл ї ту ЩА А
Ако ла Жех ап о бен сій дів 1 5 «210» 9 «21159 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» пиМом19 мі Є СОВЗ «4005» 9 сть ії БЖ Вуз біс їтк Бео їх КБУ «2105» 10 «2115112 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» пиМом19 мі См1.00 «400» 10
Баг оїле Уві їв ТВК ів Беж вк ев Бех Бевз бів Узі сж Ям іх
Х В 18 І дій обро діє 115 їі Бек Су був Віз Чех бій бек Узі Зк Бо: ВІЗ ні; -У КУ ім о Жне бек їси МЕББ мів Ко бек Мі сів еж БВКкОа пі Біл осів бує 55 а ве вка їі їжа Тіз ТУкЕ Вч Аіа бек Вб їні ОПО віз Є я Бк дяю
І ко й ТУ щ дка бе бек Пі Бек о біу бею Бу бнж варю Бе Я їм) Ват фія ЕХ ді ПЕ у БЕ
Бус щі лю із си йяр дів вів Тв оБУю ТУЮ Сую Саю ЯМ щек йанх в5 зо зе шлю ек рЕС ТУЮ ЖБЕ бе пі обу Су ТБЖЕ їж Їм ЗАВ лів Тов АК ад тп5 я «2105 11 «2115112 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» пиМом19 мі Смі.60 «400» 11
- чо че КУ с-м БАЧ для Кох НН ин я жк ях я ло уж от хх Ід пло бю Фі кт ую й Лбаціх ляє їла ог шк баку ТП ки кв СК ю я АНА КМ ХК ж мус ця БЖ НМ УА УВА СН ак ЯКУ я у три зок ї 5 її їх же шиє щу М хуя глав Ж вк З ді кн ТІ ду ХК пд Шик МО ххх ЕКО кю ше БЕХ СБУ МУ маАЩ сИЖ ма еХ Ва се ше сю дк ж сих мг з ; тм т ЩЕ Б
ТМ ху Жах о «дує Боділої бджіл сЮкеую а вче ДХД ок жу Жах ти КА А ж «тв ку Ки меле КОМА. «А ЗамАХ БК фреш МО АЖ ЖЕ Хм МУ 5 А В нь Я с М а М В Я 4 З З 7 - З ти Ц КИ ОКХ
ХУ Би Я
Хе дя олия ем грек ом Вк Жах Мом статі 73 14 Ор ко хк Ж сжідним о отв
ЖАЖКК На зи ДАО ВАК КК СН В ХА МАЛА МмаАщое ЖУК ОБММУ
Б: Зо зи бек ЖІ хм СХ де кю М Іду Ж лам ср М ТжЕежМ ПК Жов че Ж их сід ух
КЕ ТІ хжЖ ек СХ їх ж КК У ЖОСХ Бе Аж ШО КЕНЕ То фаМд УЖ Бо БТ що, в в м ас ЕД ТІ то труни МК ит ЗМ м Їж дяк Ж А ЖК хх ху Ким Її У ік Же тю
ДК он р ЗЕ З ЗОН З С В НЕВІКЯ ЗНО їй ях Жах ФАК У ож МУ Кеули ХиЩМе о Хдиюх ета ха ух гром ФІ
Ол, КУ Б
МОЛЬ жи вда: у мех ху ше ж Уж му с Ко и т ож СЯ ж у
Ж у Же кат Щцуему стю МК ЖУКомО КА У ФЛ хг фо ую ує ефе хо ух ме че ЖЕ м У КА йо ЖОВТКИ Кі, Ту Ме лу КАК А сам АХ ке МУЛ ОКУ чок хе тах алу ОХ лю зош СК до кущ чую ян 1 ФСвшасю о Жовтих Ж ню Щи Моб РАе хи Ж. Ж 1 чу пу с-м щ о баиху КІ сі щем БК НК А вах Ук ЕК УМА Ю у 1: ч Си зо З щ 1. х 1 ан тіїт-т ее Щі жо ж Мих им Там З о де Ж ву. ша ж мк Жах ОО
МИ МАКИ лм ЛИМЖТ 0МОААТ ХУ ше Я ЖК АК А КЮ ИА о ко ри АК я НЯ
ТУ Ех лу пух
М ХІТЕ М
Безе ан и но ее Я сх У Ух хх. яжі - у - ех ни ща ги Тр Ме То ЗДУ ЛА юю Муз Ст ечи ХМ д ОАЕ ТохУсх ден ЇХ УЛ ЗУ ха лети кл на км я а В В п м З В я ЕК Я С о Св ЯКО ВК НК А з 45
Точки у болю болт СВ тт фо чн ННЯ мк м чо тич м я кода чату оф бо аж фр А юю ша Ка т кою ти хв те Жде
М НАХ Кн кВ УК АК ЖАВ НА ЕН Же КА КО КУ ши БИК уд пог Ос я во: Ух СН з Уся 2. кл ше БУ тк - з не х Ум що т. - яко ж
Тктж БУючшМ Єва тА щи БА вах му ю с Кри Мшжюх Жедх ТМ жу тіше Мак Лех лах фр МИ ХУ Коб ЕХ м М Х і: АЮ АН БУКВ ЗЕ зм гм аж БЮ о Ба У КУН ка и ни и вч ни А ще ке су я я о НИКІВ ее Уа с М Ло бр Мун СМ пк со нн А НН
КЕКС ж Я ськ А ВИ ла АВ АМКУ УК ли СИЛА АВ БЕ АК по сх ле а: г тк хх пу БЕЯау
КО пули Міо ен нн З в НН Я син с я з хи ск х Я
АЖ Хі рух Бі их ях зх її хх Чах о У Хм Таз Су ек гу ша ЖУК ЖЕ КК АТ гля ау ААУ У ЖЖ ме дев см дк у лк
Зої зе ее
АК у яке ук жи колод жлд ях ке уещи ху чл ещ Ух. що х их - хх Сн зустрі ххли м нене лют ле ХК о нь Не сон Уїатич ЖЖжеини Жде СМ ТР ОТ
КК мВ Фев ся Ко ех ща Б Є юКИш жшжо каст мех ЗЕМ оС А ї тех лу р я ах кет Мат
Жорж Лиш Ж дов тім М я сім хи чи бажаю ХМ жа Же іму ому х СНИ тру.
ЇМ лук я хау АЮ МАЙ ЯК Мк жа ЖЕ Яма Ма ЗМ Ж Ме КУ дог 4 мг 4 В
МАХ КУ не в на Не а НА ВН режі Ж яка ХЕ тод и Не тахух Ж т Федя
Ки ак м Малі му м б КК ме УА ЕЕ ФММ А сам ж зе Х ення ТО а НОЯ ал ши Кен Ох и нн А НН Он я НН ее и. Ффеошхюо бен Тож Ж шт Хешат Пея сії хе пгу бле ух КА о че НН НАВИ хх зач Шехч сКдтюкі жк Шдшюе БЮ
МАУ АНТ ШК Ан с МАМОЮ Км Кг се АХ У АВ ВОК ЖОМУ Хе ЖАН Ж ОКЛІХ
Зо ч чи Маєнкня п гг НЕК
Тел о ОХ трея кла о м в на Не Урі ок Стою о хжо ЗСЖ ом ОМ У ЕК ЗА В НИК МЕ
Третє ех ста ди фік кт кум то Ку их оо М уж ма ЖЕК Я оку
КшЖш ЕК зм СМ ЩЕ КЛЕЮ НМ С Мет М ат Як А МК ЗК А ую хо оче ж шу
У буде М т
Каву АХ МИ ді ки пом ИН А шко кВ чн нн а З ЗА и З НН На о нн А ШЕ а таза Ех ЗК щ пу у ті Ух щем ЕМ м Пт
БЕ БЕ МК СКМ вк щоки ЕМ УА СУК МЕ беж хау БМ ККУ ЕК ОК хх: ни УКИКХ
У «Е й ву ОМ ХХ
НЯ хе « с кекл хх у, Я я ка -х кожи тру ож тах Жим о ТбюмаУх: Лю 14 023 хи
М СЮХУМ му ШО ЗУЮОЮ НІ ик АК КМ М су
ВЕН віх
Жоден Хв Жодаїя бух блю; Му Жуухиї тому ди стих хля тю дм жо КЛ ее ан НМ Бош Су ОК; ОКУ тут ОК пи г Ви кі ід Тож: 1517 ями аю до сечі ММК МАЛА ОО ККАЛ У шк ВМ ще Ки АВ МАЮ ЗЕМ Се КА У - ї зх дове ях - Ко З о з о А В НН де о Не и і а а и І В На Но А НН Уа на НН се ЗЕМ З В А М ВК ее В Я с я ВИ З ОН ЗО В А З З ЕК МИ ЕНН у о УЗ КК о З НН ННЯ туту «и зу шк м 1 в НН НН у НН о Но НН ХК НУ У я т с не 4
Ті ітд БЕК Хашал ЗМЕН То буу стаю Мо гі жу Тохх їжте (0147 їі; т бе
ПАМ ОАЖУК ШУ ма БВ УА АЖЮ Ку О Бюл МУ БЕ щу ЗАТ БІТ БК
ЕХ, її похо
І о 5 ки ни тота ККУ тиж чию А рання Мосмєх не нь У г Мак їх жмут Ту ух
ЖУК ще ом и к УМ ЖМК ав шНХ КМАЕНЬ ше їли ж У ма БК МИ
Оле КО су те ЗІ о зола хх Жук гору и Ух ; ж кю спе У ст жк 5-73. ту чо Уже ше фр иух
Мповсж о КУкуєь сф у можуе Кі хх ще ха ск В щх Зкма 77нє тах Сер Кв ду. цю
Ж КМ МК суду осижайХ дм ле БУ БЖВЕ ОБУ Бе дм Сем срею това МН шк х сх ту: пут ше, їх У М
Туз Б Т- хай о ШОВ лю Межі я можу М ож кл -я ін а М для ибж ук ЛЮТ по чн п и и С А а Ж В Я КО М ВК М С МАК Кк А У АЮ АЛЕ ВХ КК пог тт шо рід шо М
Тата ж Кат у Сяи бо ух внИи гії тії ші хх має ух ти тТокУфе ФО ал СТО жимі ких м МК Ку ах ши. Ах КхУКО ЖАМи АХА У ХА ТАТУ А ЖІ Мід Ох Кахтхх у жах КАЖЕ Ла ЛЮ АК з Ек У тщ й зо іс І
Як С МК ГИ ши дини Мк ч чи ел Се щи тех утри Жіджам. КУ Фо Ка бак зт М зу фа ех турі Мч: З о Сад фазу Жахи ках дозу 3 ХЛ ж
КК А а ЗК С а КЕ У и ЗІ В КТ ОКХ ВИЗ с З се ВИНЯ 1 Ф ши КК КО БЕХ А БО АВАМ ТМКХ яти лому чок
УНН КОН М
Талі бу Ми ФЛ дя Лю я у ХУ схо тод їні дат дат ОВ Тео Си ах
ІМК ОМ МО Ам М Кл о Мащ ошЕХ ЩЕ ВАХ ех КО Мш АХ ЯКА ЖЕ АХ ОЖкЕА Ж КУ АК
Ка тик чоло 1 ВЗ й
Херах Хом'я Кая щу стану хи уж ру Кох кю ку ен и Не В НН в На а КК М А ОК ЗНМ КЕ ОН С КИ С Я г БО УУхЮ УА НН ЗИМ Ха ЗА ЯТЬ зд -ропкух ом пок 1 ах ГЕРОЯ я НК
ЗК ЯкОУК ху ДОК ХУ. Кок ли пох пт хх я и їх ля нь Ук сесл чн -х Ко хо с х й У МУ
ІЗ ак Мат жук паз УЮ щу хх Ткомо фу оч ск екю бак бух днк СЕУ
УМО ЯКА МКМ АЛТАЮ АОК АЖУВА Ж КХ жи пі іп АК Ж ЖККВ Ух ж с БАК зи Ак дояж ух
КО ВК Не
КЕН ОК ю жі а А ННЯ Кк Мі Бо тт Ж оуу ї- не од с сторюаю Є ходтіх жк Кущ ТЯ ОМОдає Це СЕБЕ їм птах тод щу НУ дод Мих ках ЖБК же
МАХ Кос ши ЄЮ сн ге Аж СКК С ЕК у ЖЕ А ЯМЕю АК ШАХ МУ ХЕ яке пос кох и їв я: в нн но НН Ше о НВ ШЕ а На БАН НАВ НАШЕ тиху дам Жук
ТІ тхи Ед Не х. «хкю СЕЗ я Зп НЕ не А АН шує Кіш х КЕ дм еВ А и ни о в М ВОК З НН М В Я Б СМС ЗК го и А і А а КН НИ ШК че ск Мч 1 р зни ЗЕ
ОЙ «Ми «ЛИ ХХ
Ух Луч ох дих МЕ ху Ух Жозе Са 8 КМ зяб ща Кп БУ с Ки о яп; ме СУ зм Су піт ст
ІС Ку ха М чими ММА ол ЕЕ Я Ко вет юшоечиачостю меч ко ек чн и о СИ а УПМ НК м В С С КО у КИ п п м и МИ поузовсапоЗ воасосзЗсчоК часи сис оссесє Коша є век сая дох
Мих шиспшовшя мопосія ом иасея сш осцос точ чНанн вач а
Ми излюфежтиутжісвяз папу щиїечх Воекоричкчт ит пт чтиіи феод тю фе я тю фут сиву кл их
ШІ Мови ім во лм КООсчАКОВЛЯ ЗИМ мя ше БК С СЕН
УНН ие Ж кож орех вовки им хист ж М и уерсуг В соусу ск ох піде еру хв яю ох прю ВМ шим Аа Іри ик НИ М М ІК Ку АК КО А КІ Аа ан сюди
ЛИ сю ВІ пк фе у у тина ку ве пуску фе и и ри а о са о ОН ОК ВА КО КЕ ЕХ Я КМ КОНІ СКК ГО рН А
КН
У пиши о ОК Кір вив схема іа шу алея ен нд Не с ша
ОА саду фо дк у км ух р ач ЧК а п п а Ко о З М о п А я пав спеся сова ЗіЄсстзаиє всопосеє меч соя шо
БИ ши нев ри в и ихию пруц щі мі руту туту доліох хорі тих дм ииу і юю омщи Мофеуем М оду ян зи оре имя дух
Зоксвокост во осчо чаовоачесс ссссесяо оз сч Вс ексцес ком ла сон с ССП песо што пе СЕС ОоптчяН
Як
Ме прі аееткув юимию дратувати превелике ет сор Бога ще
МОЩІ МОГЛА МУ ОКА МО ЕФ У р Н У ЯМ САМОЮХА ТО «Бл ви Кн НН в и НН и НН ее в НН и о о
НН а ПИ СА ПОСЛИ У КУ МЕ А деле ОУХ до С ха - срекв щи лежите ужив типи вті ИМ спол уху в ек фу МИМО мус ке о у у СК ут у щих ящик чіНи Кому сала вав чашок вет ее
Ка
ТОХЮМ
Кора М. де тм дю КООООІШКьчИю уз кІждЮ В у пт ржедх М КІ ЕЕ тю км р
Пе НІ ТІ Я вх а хни СК ВХ В М
КУМ
Мк
Мате ЛЬ ЗД им, жи рію кат Бех Ле ще У ю Жан баян Ма й Мою сну ХУ кю
Ж же кро КЮЄ АжУК БИ лаку ЗМО ЛО КлЕ ГУК даппр Бій Деу Бра бле т х КК 5 ї
Ах М М Ку
Дж:
БИТИ се на Кн ни Не со НК НЯ ожини и не НН Ухахиуи ШУ ши ТАТ
Т.ОЯЮ Ух УА АВ м КІ лах шк ОА У ж АЛЕ ВМО В КЕ Ку МАУ кА ї З БЖ ї5
Міккі тя То до Музи бе Те Дів дує С Ж Ху аг юдУ СОВую За Ор с ан М су мн о но, м в а а з ни а ЕІ ЕЕ М я «Й А. ж А о Ж тт ХМ, при «й З А ти Кашу дошк СЖеуткни ММА Ст оджаж ВМ ЛЕ Ше Зам УТ фо и Моя КТ Маю КИ ками вне чи МК ФА МУ ВАЖЮ СК КО су дама шеЖж МА БА ЖЕК КК ах СЯ 45 шко оди МС ди ЖАКА нн КА и НН НН рН НН МОЖ до суки СТУ ау як У ЖЖ Не ХВО КК КК НМ у АСК ваш тю БК АТ КК КТНЕ ча Бе «й ки чн и НН А нн в ха на ни ни НУ Хот ох о А На ИНА Молот С ще їх мУше М руш лю БК ДНА КК МО ЯМ слухи КО ОО ЯМУ КАЄ АКЛлЯ ТЕЗ в тк тус тех
З го Б ще ек ЛЕ Ума у ехля паж Тех туту зи жи Мох Тех а ху Ух ет жує фтяехгх
Ме са мо А НМ ша М БЖ ше ЗАМОК КЕН Ж я Ві ДУ УЖ Ю М мл УНН Ех рек не на Жак ХД хх о но Не Мк Же Музи Жим їжак СЛ я В я пк овал КУХ ЕЕ ху се ви а Ме о КОСУ КХЮ БАКУ ж Тю у ЗХ
НН НН ше гірчити ЩО лих
УЮ ж САТЕК ще я ж т
Жоден СК де МУ і Жора хх жах їни ДО би тщі М лу тА шию Ж суха МОЛ хо
ФК ок А ди САЛО БАК Ж КЖУ У а Щек Пед вів че бек м щі У 2-х пом Б
А. во НЯ Ям по Кен НЬч ше жому Сила їх уєх бос пови ех о КН я Уа КУ шапок дій лі їе швЕ КЖУВЮ Був ЛІВ БЕЖ БІТ Щек ЩО Бек ККЕБ ЛЕВ но Х Х хр ук зе «М ОЗ М ьо ни нн нн и З о НН Три А ни а З НК Сни и у Ку Жуки по Жак БЕЖ їн Ме Бів те МОЮ М ть БУ кКжеУ КК КАТ АТ кю
Ї З й Я і:
Же Ка
БУ нн в но и На но ІН НО и ра У оо оон я Іа Я НН В А А пит ВА
Мол: ЛаМІКВ ОМА М ДОА ВО ЖИ ЖУК ХЕ їх ж жом ДОМА ЖУК КУА У ТАК іх ж КК мих пок пк шл що т мя я КУ
Тен ж ЛЯ кнх Шк т кс Жид Жук є дл МР ває стадії. дн Ж що ЩІ
УК ім че У ЖАН даю ЖЕК КУМ СМАК КЕ ВЧ КК Аж ФУ ОК ЕЕ
Зак тр тд тої
ЛУ СУ КД МО. ун КАТ сих іі жк т хі М ої пе р тиху ху СН т -ї дю плтищо УК сх ЕК хх і. Ма хх. ож пах хх Жйюуху їбхуєю Лу ФЛ м Сех жи
Ех Уві 5іц іш Єбїо дж ба мів Тк т Ух УК МУДАХ М АТ БЕХ М мч мох тої ща КН зх
МЕ ух а УЖЕ же УЖ лк реж паж Ух Аж Уже токукУ тоді шЕААОСЮ ММ ВЕК ЖК ЮК ЖК А О ї Кк ОшЕУ АМЕ му ж лету ах
МО БИ они хЯчНкЯ Тк м ви но АННИ НН НН В М НС 4 ти АЛ тожуєх нене Как о Не ок и жен ие м зн З пе МЕ НК и ВК М В Я В ЕНН З ВН І ВОМ З ВВЕ КВ НК ії М М ї5 ин и НН ННЯ оре и НН Ж дауц САТ яки МК он НН ях, Я вуз
ЖК Уж сбожиту То Мід то Же іде мМаь Зі тяж Жим Шрж» Ср ує ли пики
МАМО МА. ду ЄВ СУМИ УК А у но м ЕК М о В о МОН КІН І му Ух сх Шо КК хі КУ «І а нн нн ШІ НН Нв НН в хи Не НН НК НЕ рю тик
Тени Ми се ек щі бе бе гаю 14 ех У ху їх мя 5 раб С п ин о и І вм ик МЕ В в М З М В ВО З п В М В В з В о ВЕ КЕ З МН КН вк а а л о Бе ан с А о и НН НА А КН ня ан НН НН ШИ Ка зеу АЖ дове ТК ЄЖжЕМ ХЕ Мт У ДЕК КЛ ее юУЖ АВТ ша вт КІ шок ше мк о раку с
Би ях Ту з. г Аж вич що УК АЛЬШЯ Урі вн тому и о СТ якими Фа я т ч гухЕ по я ж
Тек йайжу Туснею М до Се КН не т обу Тіхсху Кмин дух дк пе В м ІА
БУЛЕ ЯК: Мудю ко МАК К ме КК УМ ИЮ мМуш ше ик ЗАБЕЮ УМХ А В с та -ї ех
УК г Ух и
Я т, я поши Фк в ї: МУК. Кк т. ТЕ їх че Уї- . 7 Чим. тілом речи птах
Миколі: Там Таня Щілек Там Ку Кі Брі Р о ощюохуї МКни 3 о ле гчКу Ге Кен
ММК що сами Б НМ 4 КМ С- ВЕ Ам ощо не щі щи ЕК МЕ ЮщКЕ гу Я х З их ЖИ З паче гр ках я їх юю уч що Мід Машу Сб бу (ях СУТ СХ хх рим ка а м а ж м у в я п М о Хв В з Кк ог Ах АК М КО я МУЖА ОХ А тт - ще ях
МУ КІ М щі ЖЖ УЖ дя ЖАТЬ ЧИ кож С дк УКЛ Коля їх учи М па пу пев Уді Тірчи що ЖЕК. ТЕ Дод де З чя ток я зи Кім МК Тік Же му
ТК ЖЕ САКЕ ж КО АЮ жа ВМ АНУ мущ Ам ЖЕ МК У КО БІ Кк
Яся п ре «ож
МА ку шк т щу я 2 пе -- сн сег ск, ники чл трі ВО « ях ху тих) й що Ше літу» щує їдеш дви є СЄбрРре Мбрдик іх (тя Св і Мі їм г У и в а з и и нн а ЕН ЕМ І нн І М І, ХМ М п М ОО ВЕ ЕК Ка Я Я З КУ ях Фр од в кю А Й пу оту руш ния сх ту чім ке т ьо ЧНУ Уч х
Фк окт Леди рок те Яке лає Бурмуу бфах Ше яА І ма їв бук руху оту а нн М ВУ ФУХУ може й НН З З фс У КЕ ОЧНА Ж ММ АН док ху зромовх Я сом
ЗМ ВПІ їв ВН
ЖЖ ЖЖ шк Ж уж о Мі Ж ЕХ хо дл У ТИ уз ЖУфЯ чуємо З лу тлу ХУ ма ою, пк а и пе п а п А ев м В ВЖИ хи Оу УА Ма СІ Бе Оту ИН ско М у ЗК Ко кн В ЗАЯВ
Ма їла я «ден МЕМ 5135 Живі бує Жах Жама щем Швую щі Корі баз яв сб ею ШЕУ. дн его я и кн и п В А М З а в о о КК М я КМ ЕХ ЕМ МО З ЕК НЕ и Во НЯ дод хх зх зо їх хх з,
М що М яЖбЕк Тахі: БУ юю Те КА ах тру тех ге ому ЗХ Хм з ех їх бури; Му пЖМК ОО ав хх асу Б ХХ МЖК ук сю ХУ Хе МЕХУЮ УФО Ю ЖУКА КМ ЕХ жі КД мМ ож ак хку
ТАТА хг. Ук ек и хм Кк а М о и НИ о НМ ОН тпжащ Код Хвощ "хх ючих Мои Сід Ки лк у Кору ноя шу Кк У, 51 пев ни ОХ М та х шкуу Го сохЕ КУ ї ІЗ хг ІАЕ ЕЛЕ
М АКЦУ му ха Р муш шу ЗМ а ЕКО Му мих муж З о МУМ о АЛЕ
КИЯНИ Ба дип
СечИчьк ки «Ух М
Ма саун зах ем Ди б кку их ТУ ох ї-к т ВУ у. шу б мії А ях тк Тими шику:
ТАКЕ ни ни са й ки з м м м п в ЕК п п в м в КЕ В п С п а м З В а МО М А п М ки В кури За
МІ «ТАМ «ТАМІЙ «Ж
Уві бвшо Бавро БР фбуту Шк їде бує» їж бах ТВк беж: Мет Її дек пу ові МЕ іш пе БЕ Бк му ки і; ше АЖ КК ЗАЖАХ ОМИАЖО УК АК ХИТ ЖМАЛЯ пд су ек
З ТА хі г « що . я ще ще ДОМИ, НКИ меш УР куту Бугом тини ню Хр Ж срує меш п ХЕ ХК Зидж Злдї МІ Зх (Ії: Дохт» Бесу
ММх жи м Ум АК и ни ана и нн п п п з п з В в ВК а ВВ
ВН Ех шк «ХХ ХЕ Й ку й п - - : г ще з ее че А и я и На НА слу хи кож МО ток бражюу сбМахух ХК З да іх а гін в Мі щ долу Мід
Ам ОА алу ЖИВЕ ЗМ КО УК зва М ша УВА АК ЗИ КА МН ТК крхут сер сх
Сива КО ЖАТЬ - ч Щ - їт- «хі -к х «ви км чо тра аи ох Жан Ще А Бія ЕМ, КЕ жу бю Дах Мах ММвкрр сЖугеє бю уу сл КУ тво Мую жо УТ Ам о сцам ав ждУКХ БО ожех ме уУЮ Ах ща МУБА туру «хі ши
СИХ ромен А - х --У хо Уч Фо сзУ НОЖІ т хм Ма шо кю Жаує ск б Ма хх. Тв у ух
Шви прі. ідма ВЖЕ Мцщі ля мл Сех ТА МК НЯМ АЛІ Ту Му шах сх «хх хз -а поза
Е ЗАМ вини вх що К х й у. ПЕ Пр ТК соня Жим Ти ток їх Кохух ХМ Се хх б оху МІ: Тож зу Ав КЕ їду ТУ Сх цУв ою бе в. шеж АТ Мт ЛК ім рю а КЕ Се ам МУ СКМ й й гло -ксчкх рю,
Я: Б Зх ; ж с ; ру суха нку чна пк ко 3 о нн кн Не АН КТ Ук Жосучим о ОТ Фе ку ЕЩОЮ кю: св ує бл:
Тіє Бекофлле Дів буулі АЖ сСріхт БЖ дк ФроОКВАЛА ОВК ХА А ЕКО СКХУК Са за з дощ
АК ЗЕ еле н Я сх ж шк че НН ох о прі же хх ких и ан НН НН КАН Не ЧУуюх їде ди гі я сїдут Тошута пут глек
ЕКО ЕМО АК МОЯ ел я ЛО УЖ ЯМ УЮ ЖЕ МН КУКА САМЕ Хе а м чук
ЮА 5 дл ко я ще г ху ке орні НН У ААШААЧННКЯ ши ше ни и не Нео нн КЕ: хх ШЕ шк Ж Віа Ма фс срасвь ХУТ3ї Ки
ММ Ж дау т лиш КУН КУКО КЖе. меш Ми АЖ ОК ЖЕК АЖАМО АК Ам ш пре че зе
БУМ ях ОС х. з п кт ху Ге Ух, рія Фах Док пря ШК Пам
Мости А ди шу ик ОМ у ит ен На о М Шету ЯЗ Злив Тем дк
АТ му АТ ЖК см дм ЕН БУК ме ВІЖО ККЖ ЖК жо У. ма ЛЮ се дич суду прккх з: З
ТЕЖ СНО: Силу І
ЛЮ лм З ее
Фо пн но и и 3 жу Ук тошхї саше бл жук Кама же 7 йорж ки пд ля евк ФурОох лі У. БННЖ Мун КИ Бу ре ха цу ш о ще ЕМ ж А г ХА с Ж шк св Ал с У ХЕ м хо ІЙ -ї й ч «ед й р до еще киди ж ду
Ом чн нн и НН НА хі Жах ки об'єк ск ух ХК Вдехх б оц БУТ Я 4:
Ак бХЮ осі Біб АЖ ап оУВІ КБ Ж СУ БеМ УДЮ Ме Бо сш вх 7 кох Кия ях ди амп ха лю ХО т КУН Зух З: рр ух ню жм Кл шиї їгаха бом бю Шев ТИ ях р о Ма а Між бек ЖвЕКОосЯюк бує беж Бей ек Бей осеЕ ЕКО шОУ БУВ пу хай Я
Ох л АЮ
НВ КУ Б о т. ЗО и Я ьо - Уа. очи Фе с ве ВИ що що з РУ хе Ки и тки ту
ЕК жк ТІ пд Кри ЕД х МщЕМЕ Я ОКХ Ам щі вві Ше тТапіту ЩІ: ещНа О0Кік ххАЛИ УВС ДЖЖ да вже ек яка ж сам ваіщ м ж зма у
М х хо їх зм х Й -х тету КУ их пх, « З че Ул чі дея у ху про ом не о НЕ ТО ку їх ШЕУ. брам їли А ли г са і ду лах іх
КУ ЖАКА ЛЬ о АОННАЖО МАК КУ А УІ ЯКМАФЮ УИМІМ КО ЯКО Ж ЖК ЖАВИ ЯКИХ тре рез т
Ко «КИ «сх , каш чн Не НН НУ Тр панам ува ЖЖ гу тА тоже Ту Б го шж Ж вм Жуля
КУ жк сно йде дя дво Р що пає я ЖЖ с ти гук бив Так гіТах 3 луг ж а уз нн ин в и В М В У Ж ОМА САМ ох Ух о кхх мАМ МАША ЗАТ УК
ЛЕ Ії З я АХ як
Ж я Ух У их з о Ше Ж. Жуля Кк з се УЯВІ и Чан бю М. тишЕи Туплу Жила їж сг ху уч щі зер Лю ижМ гдизх Сі1їх т 2135 І Таж Мр
МЖК ДК сип ОО юш ККО АКК ЯКАДЬ НИЖ ЖАХИ хви КА мІЩВОоюАУ Во Кук КТК
Б щ її
Молеим Ач Шо МАМ дою Жуки у о и нн НН ч Тож Сех УЖ фих Док ож в Вншя чи
Мт Пижанкя ЕС яв лЖОХ Наче Ук УСІ пух пт. па ЕК Кк ХУ божу М ол он нн о нн о а п о М С КЕ В НЕ Ком КАМ ЖАХИ ТА ХУХ КАК ЯМУ Ж ЖАХ ДОА СКК ЮК ж ух хе Ка до: З Е щу
Ха Б 5 п пек ХРО їі 5131 135 оце а до пиву и луку у ВІ у хи Ду
УА А ни НК Кк Чи Ну ОН КУ В М ВК СК ЗИ Со В З В З КЕ М ЗМ Я х й: У З
Фу с ке
Беж я ро село траю уче ж бр Шк а» и Уж щн че м ж тож ск,
Фа лорю тру чт их її Ех З т їх: як пе товка хі ЕХ я ж жу щу
МАО СКМ ЕТ У О ХКЖО ВЕ КАМ Ким ук У АТАК ш Ж МН слух В НІ МК пу ях ліц оо
Ме ЖІ А міжн ХХ ен Мово Жуех їди Маау ЛЬ ЖЖ СКС де Хм ких Шк Фесюк Мюжч А ти Лю
Я ще Б М ЕК щі МГ КО І ОБЖ ОМ ЖК МЖК сі 11
КАКМ СМ ЖКА ЖКАЯК ЖАЛА ОБЮ КУ ФАК ЖЕ АКТАМ ВЖК ІА КК ОК ЮК Ж ВОЮ СА А КА дов ре щи 1 хі ех
МО жі КО
Жди а де ЖК ху ть з Кк в З ху Тек СК чі ді Аля ща. ЖК ех
АХ аж ші УАСУ ОО КХЬК Бех МЕ ж Ку ЖІ МУК мн ЖОВТА КАМИ ОАЕ
Зою ве т
МАКИ «НЯ М ги уч. и сУНИ Жов жи Со ПЕТ ри я се: Щи те ех со Ся ко ох Тк ит
Ше ЕУКл С1зх дід дим ОМВО іх Ех ту ді 3 їх сі ти їі БМ вес ее см А ща У шк УМО ша що па ОлАЩщ мі хх ООН лк подех чи жк
АХ а ДЛ АЮ ке го Ух ях ех, ха мули ВМ мах - гу - Кк -х «ках сяк ок сук УР пі ж дю ху трюк Ма вч гр ех дж фожух Яр кує лою МАК МН КАПУ. МКАС а БІК б с ІЗ з в ЗК з Но ОМ Я я Ту хх
ЖК ЕМ КРТ ни не нен НН Ух т Я тр у чи Щи х. ке Молю ЖЖ уд Ж хх еко ет їні ек о мет Те їжи ТвеК о їдмі Шах яко М о аку худ 245 00Х км ж нн и м и п а АЖ Ом БК да ХМ ДУ жк ЕМО А МАО А АХМ хх ти че пкт
НЕ НЯ НН
Ж ЯМ АК
БА К их вч ЕК що тк СН хх Ух, я Ж хе ТЕ у тю Я Фу и ех з шу жо томи ЕІ Пе і хі На ве СЕ ох Ру (ті Тени ХК Бех ух
ЕКИЛИ дм шо махи УЖ ж КИ ЗА А АБО ку КК ШУ УА ЛІК КМ БИК з її ти КУ ії55 КЕКВ «А хв тах похукх Хід ЩЖехх діжу бю КА тех Ж худу
ЩА АК БУВ ЩЕ кош ММ МЕМ ож уУ СБ УЮ
НК ж
Ум хх Уй пе ше нн нн На нн НН НН НН НН гчавкио Ж що бно й іт тля ідо що т жи у ен НО хе хе Моро бчатки Кто 1 те тіху і кн ж м с и м п а В МЕ КК ПЕ ЗК ОК ВИ Я КЗ МУ м чне о п о о З Я В еп Ме НУ й ї ТЯ З
Ж о Мк Мр хі ху Зх Фр Є пьую ока коли кн ІНК; І-Ш Ва струю М до реє
ОКХ ММ КАС СМИАЄЮ ІН ООК Б ж КАХ БАД ОКЖАУ АКА А ККУ кокон о и и ср тю що ки хх в тздеумо йти СТЬ фужуєх Мкаає Мвт З яю бух че фаху. ЛА у птах фожухх о Фах Мем чия
СУуш о сСуУЮ ДВО сСУЮ Р КОХ тах сСув Бе осуеш КУ БИПжЖ СУ і уУ сСУуш мА ве жо БЖ
Щіщо жчЧв гео січ їх дід та би АТ Ох іх Со сія мах мо а ев и с С но о КВ В і З и М Й ЕЕ ЗЕ М МКМ ук лаку ке В С Ко
З ше о
Ви Му ще и на ни на На а Нв НН Кв ан у ни и НН НА НОВЕ хім ТИВ
Машу. АЛААХ зи ни а Се З В КЕ НК НЕ М. М ЗАМКАХ КЕ Бош БІЩ СУЩЕ що тре Ук зи с У КІЗ я нн НН ВН ОЇ А Ж Жук фо М Ух Схаси КА жио жхокшю Мік
ГТ кот ж що Еш дя Сб АЛ А де Січ б бл ЕЕ зби йо (1 ху бе фу
МН НК А ЩАЙШК МІ ВО ЯКЕ СА ТІХ Ж хи жк лику ФУ КУЄ хх хх у Ах ча трек -т
З ПУ Та ми сь ОС од схе Туя лужок ТІМ ж ТУ у хо З хл коми Ме МЕМ, кт
ТЯ щі АЛ лок рр худ (Ж ях Спуск у ві що що ху Може СБкррю (Щі хх
НК и м и п М ВО о и пк о ка М а п М, В з Кк п М а посох «ко хо
УКВ: яке ве тю що ЖК ях тюки МКУ бах Сб БУКА М ср ку і В о род пику
АЖ Кк сю У І щЩОсКл СВ уп о шу КУпЖ ОВК мощ аА Ащ КАВОЮ пож В «жк чи то аг Се
Мои ик Кік бли Мр ха ДК мо жує ФО и ру В АЛ що І їх М о РК ти Од
МАМ АЛ ДПУ ЖБК ОБЖ АЮ СМ ЖАВ яке дКлЛлН о бак КУУ ВИ жк М впиос ле Лк зу з Зк ке дл ва я г М чи 5. ко Мзшвум ТМ их с м сі оч коту ох У УК у сх
ТУ кІїхх М дю ть у чук Пра фухах М ярах Чу спр жх А о кт мах гі ях
УКАОЮКО ХА яд А їх ОВО СЕУ Му яка А мож спи А у Х БОАКЕКО ЗХ Кк - од її ом «ах в 1 о Мах зе
З дю жу МИ м ЛО Кіш рю МО ему Ол ее еВ НН ННІ В а сю Ло о Укх тен нав Ме рух шьУх х пк М КІ по 3 дв шу ТК Тл
ОНИ Клечи СБК кана СКІІО КК ЖУК Ж ож ух са у да ЕХО МОМ ЕК ЖММ ОМА ця ї75 УтЕ ех ях біо фтчк ук КМ ялю умуу ТКо ко р В ха спи ОТ м жимі о Ь Н ЕЬея ек з ие НК хо КІ ЩО хх КО щу т ща жк ФЛ ДУХ Ще так
САУ шу АХ Ум ло МЕ МАВ ОУУВ І А Кп о ЮУЮ Аз СУ БА КУЩ зт З КНУ
ДК КУМ зас
Соч ж ж яко я у чт же ех мо Ух мох ве пкт А ж ст. ож ки нм НН НН НН Ша НН їж ПУ Фк ку Укуує сл ях ща у ну
КУ А У Ми ЯЗМАси А жи УКХ кг СД КЕ лу КУ ду ложку НК Яна ек НЕ Ме У КУКИ
У сут т-во ук їх г ГКУ
А шо КТ хз НН АН АН ЧАННЯ ук АН НН п дк зукжи шо УЖ соч, що
ХА и жи КО до ЛА ре фвх ЖАЛЬ яю. Й кю Ж до ку Б Бах сЮкуме. що у ра Мія стхуткь
МАСОЮ МИ АГУ йо СА КК АЖ ХМ МУ Ся АК: ле ау ВКМ ОКА СКК ХА ХА ЮК ХХ сім ер жа
Іі пл З
ИН У «и ке ДИНЯ ми гу шою ту се ж тр іч З ке ск ху г о З Ин а а ее ЗВ о НН а в а НН ВН НН і з и НА Ж ОН А НН с ка З Но п В НН Я ЛЬ ре ян -Ущ шу ШУ УВО ЛК ва КИ Еж у г БЕК у шу КУ М АК АТ ххх их умов НК ху
ОР її їх їх і с
Аж ях МИ я «ЖАХ ох пепуясу Муки Ти не су тету З хх х т - - - не оз дедо ча Ту БЕ ик кре пк Ж чик ми ор о бтеду їх кю А ЩО І У Кр
А Ме КАХ КЯКЖя ТУ Х АХ ЕКО КК КУ ках дал УДО УУ Ж АЮ Ж МАУС ЖКАХА
Ех Уж "ХЕ хх У хх и ПА ях пет М хчї ех. ж ж о пт хо тек що я - 3 не щ-
Хід зи щ бика ру їЧехю Мід ДАО АД 1 щі ху ДІ І щооту г их се У ЗМ в і МИ КН МІХ а я Я МК п За а п о ЗК ЗМ ЗК У М ОО Ко М о А А М АХ М НК ЗИ ИН ОВУ ще коп ху
ЯН Ум КІН
ХУ МОЖ «хх пулу МО пк ях ста ил Мк, їх: зу кю сени а т тло Лі жк ко ск
Ви 5 ро шу Мов чи бою чек Ж лк СУ їз Тур рр ве гріху М мо тот яПЖ о А КОУЖХ в У Ви СУ ці ІМ ЮК АЖ ЕК КЛЕЮ ху ЕВ КУ Х
МУ гу они кх У хом ОЙ хз. чих. сь ке т кл чегу У Я чт пот шк. кл -- ях. у іл іа дій пу їчУхш іі сум їн вк ід Мід лох А шо йду сх гі
М М Ж МАЖА ук МАЛА АК У АХ ТУ УА ВАХ ОКО У ж ЖАХ ух ОО ЦКУ че еще чи
А Б СУКНЯ кит хо ще
Ач АНЯ к«к нн сх чен ко их «шля сем м кі У мит ЛИКУ лек ДО о бо У пах їла Кк ще АС дю у Ор аю жмх кі фл ру,
МОУ шу АК У ча Оле ХУ У Мк ж я жкнНя Юм О АК В СО МАК здо хг ях ередот
КУКенм У її ХМ г Ич Є Кеш «КИ ти Пре Емео В що ялюми брас длхуху. Ж жим АЛ Мч гл. Чат Жов КК щі
УК: Сг «до КІ що ВОСТІ ХЕ ЕЕ шо Ж ВЕК Те і МИ пом
МК Кл Сушж пай Се АЛ Кую мА СУш виш КПК СУ у ПЖ о У МА сет ке ак
ММЗ А ЯН в А о ким: бич брус жутю ли бояирв о Січ ХА ою тремо ЗЧкрує ФИжує Ток ря ря ху АКА СУ АЖ Я КУБ БА У КЛУНОК ме СКЛ БИ ЗК еКАЯВ ОСКТІХ А Е чок «ак Кия
КОЗУ УК Кене вів Ста ЖСвж спі ТВХ Бів СУуш ТНЕ Ві літ вів ТИХ бів СУуБш шою Квід я ще 55 тн ошвУ У Аів тах СУБ дів АВ Осі АК бує Се ЖЖ Аа ТИЖ ую бі віз Тих То віз ТУ тв бі піу пі Сі Вій Сув дів АївВ су за Я За ЯЕНЕ зіУу ла йів СПСУЖ Дія вів св о ів ЗУ ТЕ Су Дів СМ ів бі ТБЕ о ФВ ЗЕ йЧєжех Сем кує ВХ вує ас навко нан на С и хни о а ННЯ ен о На А шо КК СВ АВК СУ КМ Я УК МВ лю жи вАЩщ ЯМ Му ГО Хх хх се а» ШК аз У ж п ххх їжак М сх
Вів вів У У су Су Су ую Аа «2105 22 «2115 408 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» СИМом19 І С нуклеїнова кислота «4005» 22 чааскеесє осо ооо вЕс вопсесевовос Сови сором тує
БО шЕсовсссаз веб ссвасо свосасазісв ссвчсЕссес позови ес СссочояВ коасчовавосов сексі ва особова іа по еечаю Фени свосопсвассо восбсдазадааос соч чсаа Соозаастоє сао с дозор ко
КМ ут ем ик жук озехи ех селу М Мов овиувх сек М уз суто ту сліду гу о ке пе ем во пизвасцсач пок са ЕЕ вче зЗиИвсосалчав чес си еко нь
АУ вЕСсВОоБсВОс сСедіодвача повазі чов чок вето коваля щока. зб свіссвзксвов сви сочачея чечсвосавзва сисозавесв вас да
ПАСТ
«2105 23 «2115117 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» тиМом19 УНС СААбВ2г52 «400» 23 пе ж Кк рн нн и НО Ск Ух и Ж : ат я Ж ух хи Хот ки Ки ВО сі по АВ Од 33 охала ж КУ хів об Бец ад МКУ ХУ Кжое І М жбкАха ї х 1 їх а От Жак би ху ток Щоб лю шву МУ. КАЛ єю Же ках ду ЩШувке пк КАТ хостах щ-еж що мУуБШ фі СЕ СЮ о БУЄ вів шЕВЕ щу Ку сек БЕ ОБВХ ІМ МУК жо ж о вжи ВА Вот Тубнеяо ХУ Фожиу КТ ж «ню Я дж їла ломи Мем о аа треки тех
Бра Ме баб кв о УВА був сі ех нів щіУ бу дек ев же Тр Кв
Кк Б БК 4 с зх шо оче хуту ди жна их поджам о Ті АС СУД я Спутх кує Куди ох Ач т ум,
ПУ Ак ів Мі ВЕо ТуУХ Авр оці АвротТах бе ТуУжх Де обІв впро бен
ВО Б о г. її й К і тухх х тік кю ок, токах ситу» реж поп З ке КУ Кох
Ту Ер Бу вій БЖ інш Тв Уві Ав во і У їж ше бар Ще ів БЖ яВ то тв в
СЕ: сан хе х х т стУкуу: ик Мр о Мих М ие о Му Ме Мк
Мекс сі ей іїжні ВЕЖ іжшо Тл Бек Ой АВ Ббе дів щі Тек ЖУЮ Сув
Ух ну би ук пани нн в и нн НН НН аж у ро и ня Ка не НА НЯ
Ж о мЕщ о гУуЖЮ БЮ (НИ БИ ККУ ЯКА КМаХ АЮ КУМ 3 КАТІ ОБАУ ТК
ЩІ щи Мо
Уеря ху УМміи ху св
ТБ бтвіь Ти ба ех «2105» 24 -2115108 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» тиМом19 м С СААбВ253 «400» 24 суку ШИНКА ож У я ШВА цю Жана Ар Фін подути таку Жак ХЛ ку
ЩЕ же ФМ бе бак селі Зх БК бі Ж їегю ЛеВа Ущі БЕ Сем ау 4 к зх че
КУ х їй ве ке чн НН и КОМ ши ХОМ Фо лк ж Жожчум о КОТ я Меч КК тую дну Си Ж МО ху щі дж во Та 42 Бех Св фл мі щ жеК и БЕ Ух ше Бк У
Ме ТЕ па в: ЖАХ на
Є кю шу Хм чи ох ож Ко Фрези Мен ТД См КМ фу Моє Худ М я ж КТ Мучхх ша ЩївЕ Беж їж Ме Кін Сех І Тех Крейг сСкду МЕ КЖО ААУ АЛЬ СОБАК 30 35 тах Ук їх: вч С НО ХУ М ук Кок Ха УМ жу льщя кю шухк мМ ин їзе тек Жкч іа йЕЖШ Еш Себ ша мів Сі Уві ОККО СТЕ й ЕЕ що
Мт Бір бе так Фреш (а Жнжю бле ТВ ЕІ Бфше твк о їямі да їі Ві
Еш Бл бе У бах лі вЕКх УЮ ЖК дв ЕБе ж бемчі аа до КІВ
Жуки ХХІ оо я не КН ьо Мох че ие не суши Моди Ус ки Хо ТК де гання и ни шко Мн Ба зм ши даю Мі Зі Жах УЮ УЮ ФШуш ст пКкж обаех МУ щх ще З хх «фік я нд еФусуке УК ж со ке и: ен СН р ТЯ 1 чих че ку Тк ІЕЕ км біях ЖАХ БИ Мох Я с УЖЕ Ж КК ОЕМ В тео ЦФу У ЮК САУ я ЗИ Уж ка опр ЗК
ШМК АК У
Ми М лу ТУ У у Не АК НН АЕН кое У ех У шухя Хо які Жов ХУ муху мес Аів о зів Же ме тв тбве сіб ій бей їж бе їв Ме КЕЮ Зах їх 5 о 15 а: А о ше На ех як ІН нн НИ НИ Но уЧрек фуеих Се Ох ТіУкеомао СВО -х же СУТО С зів ті ві Зі Філ ові со ж дЕЗ бів ів Кв оАІВ Аж СТИК В буру же а яко ху їй АХ бат т онуєх о екю ж Жим Миша хім А аю то ху ляду 115 шо Жан МИТЬ току їхню Зх ти Мей аа УЗ Суш Мет дл Аа Був МІВ НІВ БУ САМ був КЕ КУ зх хх кю а: жа ЗУ
Туш ІА косу їжу гх о Мом Я ко КАТ ха МА жа феуєю Мошежо Мід самам Ми ххх фу жу М Ух вже БМ Аме МеВ Бей Бог озіМ би ств жо КжОо СКК вуЗ Був сим Вів що З ЗО хек тУкку сідеах Ялом фа Мія дару МУ жу Я 1: її їз оби Міут Ялк щем сраку
СУув Сувк ВежЖ ТБ дви ОТ веж бів піо Вів Ново бує ДврроУВі бек бек що сеї "я о у ТА Тх ММ тож че жу Жено Бе ришие тряеуо юку Я ку сук йон АТ. Іще МО фе Ох пк щем УЖ вс юЖме БД ОКО МЛе жтюю УМ Ку кА Вес ва же АВ СУ п КУ з оку хх ДЯ охто ЖУр и СЖ Р ня Ж щи мо ЗМ ей жу Зх юю Кі х з ШЕ ан Тухиу:
Мечх КІ А БІ аж фа У МК Св АН УЮ ша Клум ою шк ЯК
НУ е Е: Я З -ї дк дм в «чт щи Зо КУН жо УМ шу Ж МУулнкх я шщн ж у ем пуд Подюук моде Ж кю Хто Хати Жим Ку З тю
Кия бек м Ж Кт а їз да ша Ех Ат ми ЖЕО АЖ УФ А ККУ чек золу рол
А КЗ ок и: ИН ач а А НАНУ Духи ЧИ як роди яю боку ФМ Ка МЛ ну Уж Уроку їх
УФ без вить щі ОБО їм щи фу І ДА МОЖ САЯА Ххаа ЮК С АХ оч чок, дк ген ДО ке оуххе бю вих жи Муз (Зимує Тра шух МУіулея ЖхХутху СМ оса Мен Може З Маешм. ЖА ом жк кю пре аю оСуш вич чі сек КУХЖ Кп Сук дух еиж ла ж БОШ му У КЕ ке В; З 3 в; З 7 В; Я ча «ви я доти
МО М ДИКУ зо соду ши рр Шебдю є І хх Ж ди Я лк (тк в ше а ин у и НН в На НН ше ГешкЯ Мк ек У ЖЕ ОА Ммуюш ую В ж А У ЯМА ов ЛИЖ дош «ори чок
АБЗ М БИ тане ЗХ: ДМ У УВО баках ЖУМхМ Зіазех Су Жіани МУбуз ха Гоєує Км Зухму КІ Бач вх ЕТ: Ви о Бре ї чи пе Бжє жи БЕеК ОК Уві їхем ФбУшщ й Фа тів
З а рух
БО 155 33
Чтуєку ра жі оно СА жА Мчохао Жук ХУ Є ап Ходи ен в и и ав Но о ее НН
МК Блю тт ЗшекЕ УЮ цую мих НЕ БЕМУ Ук шк АЖ СУ ЖНАЖ С ВІ че ме «кол «КУ я мМ Ку зд Сл тк Ван пе МОМ К каухе плюм Ком п ж А ях свіжу куди Мих ОЕМ Мр
МЖК КАК їв оВекх ТЕ ож вЕфО го Б АТ Ам ММ БХСь ДЕН даю Їд щи та зу сет ху 3 З хе до ке Е
ЖУКА ук якіх - ж хо жо хх т- т Фк итрау т пет у
У Од ок Сх хІх Мі гл МІ: НУ Я байк КАТ ях ТЮ м и жу їли У Убпуєе У К заг ка яАКщ Не УЖ УЖ бю МАВ В БЕХ зЗіУу Мі Бу КЕКСУ із ччк суху УК Я суд ва ке 35 ие ло ХМууює ЖуУменахя Між Жах Ж хх пе а ач МАВ Жожі Жлемю тов хх Кутах ток Уч кат АЖ им ІН БМ Бета Хе ос а АЖ На Б б КЕ На Зм
УА в ух оче не ЕЗчеУ «КІЛ
Аж
МУ А о м я ху ху дк а крем ключу жу их о мкм роко тю КК стужутМ ккичи и ю вук М реве
Воно мова сао ема ше ок ТИ В Се
З и ЗЕ КУ с - а З Є ЖеО т т УКХ
Га
З скит се гір тих уфеетУм тот мету фа ворожу в уки часчзсссаоя сел кає зсщечесвн звсочатовКо хоп Коа що в же М че ве НН Ки НН В о ока дув мом тус тре «ех кі звчсзоснсв заЧававчес ззЗсасосовас часвачешчсє ес Єосоцеюея чур
ВУ
«куки м шк шах кю хм АДМ. хм нн и НН о НН и и НН З забава сосисок с Каса Оос вЗзосеаНя сопе КЕ ее стсвивевоне Ссвасісдзчав совссзасзав «сесласиосас еезоєсчзен вола Ки
І зсссвчачасв сс Зосооска со чексс посщасесо чо ссеща сспусацчки пен Бод гуси ту В и Фу ших лози Беж кута те те ких щік ЦНС ЖК се ЗАТЕ ОВ Ії Бе У го х Но хх Б дк Св ЕК і БУ ВК Б х Бу - к тв сосни х см слов ам Постава а Су ІК ца
ОЗ З та іе т Зх - Ух Ух ка
СК З ее КЕще и «І ше щ р Щі с ча ЖЕ і Хї МеВ ее ие как
ХК хоп м ех іти сич о НН поч пу ин аск осесе сассоеєче соктчесеєвях чезваескосчВ сЄбсеєстоска саавазесвоо ен и НН, НН в НН НН НН аа ЗК що ч Зх І ак г 59 их х ї в КМ Бе ав У се ак БВ їй її - Бе МОТО ех ВЕУ» ЗХ Чон ща счизух рус тклуємум сім счімуМету их свічок сухі из см ект уАК М ие хи м ук Кк стсввес «що чеснач песскщеє осн еча Со о чес отв спр, їж
Ел упра феонх им фу в фе лих ші гм рю я ЖК І чн нн А ЧАННЯ чехи ки ооо сома в асо сок є хе
Ел «2105» 27 «2115 11 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕВ1-21 м 6 СО «4005» 27
Ток, Ро ЗА Ка го Ся ож, Кох и Хо Мох Ес нуж ух пол ОХ м
Був йіяа вх дю Нє діє дей да сбЕю Бобові у їх ще -2105» 28 «21157 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕВ1-21 м 6 СОВ2 «400» 28 ее пк аж Жак суку маш ма клшї Ж Беца лу
В СЯ
«2105» 29
«212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» ЕВН1-21 м С СОВЗ «400» 29 чіт біт ту їКЮр беж ТВх Би Бе тНх -2105 30 -21155 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» ЕНІ1-21 «НС СОВІ1 «400» 30 щ--к о щек Жук су Ме ше - ї «-2105 31 -211510 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» ЕНІ1-21 уУнС СОов2 «400» З1 ах сів Бек бек пі пі пек ТК ТЕО ОтТує
Її х щі «-2105 32 «2115 11 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» ЕВ1-21 «НС СОВЗ
Зо «4005 32 дю осі СО ЗКУ Піт цем ТУЮ Ада Мес бр оту -2105 33 -211517 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» За Кабатом ЕВ1-21 СОВ-Н2 мишачий «4005» 33
ТнЕж Ті ше Бек піт сру БЖ Ту Тк Тую Жую ко й піУ Уа Суз ї 5 їб 5 «-210» 34 -211517 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» За Кабатом ЕН1-21 СОВ-Н2 людський «400» 34
ТЕ тТіє бву Беж стУ ЗУ бятг ТУ ТВ о Тую ТуУК Шеж бко бі Бр обі їй ке о ї5
ПТУ
«2105 35 -2115108 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» тиЕВ1-21м С «4005» 35 дАвю о жіє са ше: тах біб Бек Бек бек Жужю іно бах Уві Ббее ба ПР
ОБУ дДюЕс Уві ЖК Ті ТЕ був їжи Аїз шех АВ о Бів ТІ АвпоАать ТК тугі лм пог я ж НУ їз йів Їхр ТУЮ Сів бі ств Бе бі дзквоАтв Бко ве Їм: їжмі Ше зу з Ж Я ху
Я ЗО 45 цех Зі Віа ХЕ БЕЖ Пец осьо Тпк о сіу Уві бує йеж ву бір Бех пу пек осіуУу дек БіУ Це дю Тух ТИХ Гец) бек бі беж бек би» бів Те 55 КЕ ТО щї шпіц дво» Узі Мі тв тує ТтТух Сув пава біб тує ТхюЮ беж ТВж Бо БЕ
ЗЕ з З
Так Бре Зіу Век сіу ТВ буж ім п діє Бук ДК їсо 05 -2105» 36 «2115 120 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» тиИЕА1-21 ун «400» 36
Ж т че ее зар а ау Уж змраке о дритуих о Ух КЕ дух Тан Кк ЖАЛх
Філь м МУК жи ж УК же У А ЯМ кю А Му ж КУ ХА
ЖЖ ох Зою мл тм м бум АТО Кл Хі ША жу ТИ тів ує Ху их у жах ни кщеж ла МУ їм век УКВ МБіцп дір оче Ще Бе бак о Ббж бе 3 Ех СІ УЖЕ бут Б Зх
М хх ве
В но НА в НК о НИ р нов на нн о а о НА На о НН Но ее НВ НІ шу В НБК Ж УА АК хат уп БЕ др МеВ УК Там Ам ЛЕК МУ не - че 35 о яв
Мо чЧИмає лу и джує Ка ях Р хо пут жує Чмує Му буяє Женя Сохаучо аж кА АЖ да о Бек ЗКУ су ше АшЖЖ АЖ Кук УК ЖЖ Вр оБІу Ух ї-к З І їв ру Деу СБе ть тТієс цер вуз Ве вве Вів Був Ваг о ТвУ іму беж тв озКУу Ак пе жвх діє ек дз дек З Біо Був ВЕТО СТИХ фа Ух
КК Ук на а НЯ Сахє лекам Жах Толя Ширу (Я У Мк рам бах Воші сиг ік хх. іх
Кпіх си ПО НН ЗУ ІН У ЖЕ М ЗЕ ожили ХВ ВК сУХ Гу СУ
УЯ ща ЗЕ
Гах р НЄ У ТИ кі яроюю окт бріюум ВО дл А шк ху Тих сумує КТ я кю м се ж ВБІК ЗА У А КА шу Пн ше мів Ме дао тур прю КО кдд т че
МИ КК МАВ
ШК я тю ЖІдж ую ХК хр ох Сл КЖиля чу ЖЕ ех а Оп ча ж ож чик дожктх
АК КК сорт ух фкурлеч их ціни жи і фе квт дев их в хм ху іх пут е лі ижуч сих меле или зе Кіма емо КІсВвессови рога «Флори Х ма асе ща
ТОК
ЗІ КАТІ чин Хж а КчмУ ВУВК МК Ії МАМ ЖК ВВ КИ ЕК покер ось учи ям ЖК думки УК оІіхчумих Ву о смслуфощевокуфилихі фжичсцірухитиикв ої фсчурпущ вв сек гр М ес
ЕХ Ме Е воски шишок щрогносцк КК се. і ОО ЯК КК ав
КК срижтую в их і иж пт гум тів и Мох пьгттХІ т Бо м к і и ех КО фу их ж р из утии вес «росу дифе АСК ще шежпа КС чНик гук
З ж прифіюфнур фе ге лих в у о ом см еф своею о фе сте оку вхопив хіх ух ому их, пчайчвиечеКтч сеассовосвВ сота всач сзосчовВчив шко ровиМ пре коЗ вч
БВ кекічк уж су фу ж пт прут гру
Фени а КО МКМ НА ЕХКЯ й гжир сечі рве п ка а па п п п і ОН и ПЕК КК С ВН
СОН А С КЕ АКНО Кцоесочвео Мо щшащат пера ХМК Ос щас шля ге хам ур пики ум пихи найти аж а фо ик патрулі ужиті фен чити чук три
КессСссчся сЄсосааекЕ сосок що КАРЕН КСО ВХ
І
М кан п ка и а ча м и и м и Но а и по ПК А КИ МК М НИК тал озашщль пз мч паро не рус щеня УКХ Са ти
Какао стоку ри у М кхІв хто тЕетечи пре уривки Жовч ик кі и ому ем тлу ть рю фі лує ит уд гуру
ЕММА КІ ЧК ВТ и МИ минав Ха СИН КС С ЕХ
Кк Корми сту:у що КУЦ куска ником КМ в чоуртивим оз щІхуви су мкл уже Луч у Ех сбКфозансо ще со Кс ає зекацесвиче ЗО К ЩО ВЧ ВКЛ ето
У а АННОЮ ша в Во от чоспесвацча сю сВверимаю чяхщх Тен. пет
ЗОМ зам СК ду сит у ли УЖ АТ Ж А Фах ФІ КЕ Му ощадні чаш Кале шлак ю ті КК ав ЖЕ Зо Мек жк са Беж шжекКоБеЕ СУК Бевб сЖ Уа веж Сев о сє з г 3 зок
Х З ЗО В поши у НН ШЕ І: У МУКууч о бі якшо МО Ж шо Мих ек нн: М ех НН НН іш Вже кА ви жа Щи Суд ув Кі Бе Мо Мав Зі дЕшх дар ТЕ о го зв зо р я Фу З у оо Ше А Мк Са А сх МТ уки Хучниж Уожшхх ба г;
Баш Я, ОК БУ ст ть дм БЕ А У БЦ ОМ Кс Кт ем іш же чех пох «І ї5 дХ ча гл і Ту туго й ум ую зач ен ен» и Ши НЬ Ям Фен «кв Жемуч Жави е ЖЕ КК век оку МАВ ЇвБЖж ше іо А ви Фі Уве Буре Бек й впж сх сфе ге кох З
М І ша подошА МОМ су ж ож жу ому Мам Тож Мф ен о нь о ен З НК Я ен ная
ММ ААУ ЮК МУ ВО УК УК Е Ім Шеж Лів Бек век ев бів отих аж ока ях моОЄу
НО 5 щи паху ому хі Що Ж ку Му сук мА гу ср тран ух о НН Не ооо
КУ да по УА МО ЖЕ ГУК СЮ Се с М КУМ СХ у Бек ЖЕ ву спе ке «ак вух
ХУ ше ТІ
Єр мо СКУ тяж «дм Мк ся бою т АНУ Зх: т дей й З ик х Ше аж оКкле щу мех шу КАХ о мУД мМ Се Аж МЕ Еш я АМО ків МІВ ок вач Се
АХ ІННУ Ке. чн ОНИ їхахчи ЛИ м, ЖРТЬаим тую При Феншуй ХМ у тк сем ЖЖ дон Ли
ВЕС ТМ УЮ Шех біє Бе о бко Бу їж бек ба бю я ЖБК бек б У яр куту ЕЕ
ЗОМ Ки 35
Ку Че под ую ЖМ ХК фхузну Ин Солі Меч сАофхах роди бпбуку бек, тохуєю аю г їв аАВоваекК УБЩК СмЕ о шІя Аж ЕТ ЕТ КН дшК жжсоО еУК ВМО ат покох я жк мне
Мо 15 що
Доу й 7 леку базу столах Стих буру. г дя ба а. бах ЖІ Мем (ак Ха бах вапоУВва бУуш КЕ мушу ТАМ пе Еш І йпезЗ а АВГ СЛУ У їм чл я мк ян чЕй
Ки АЗО Її МЕ
Шоу ке сл. М ду жінк Ту а ож ше я Ж Зкоичю Же Ж не ду СЕ ях її рими шт -ек ЕКО КМЖ АЮ (ьМ ЗЕ БОМ щшУущш ями си жО жк лю мех МЖК ВК ї5о КО МЕ бен жа Кама МЕН ОК окт Ум Хо Ву КУТ У Ж уєх МЛ. Маха БРх Ум ВохуУ бух Мі укух шЕЖ дж вець АК нев жИпХ »Ув Бер сам УЖ жа ер Ма БЕ ЗХ А Е гг Зк дер 185 155 У зе блукає іл дх а Ба ни о НК ек НИ А тако сину
ТЕ Сук иа лі ж Чі ОБУ о СТЕ че ЖЕ Бек о Бу ді УВО мок тек Б хр
М «ТАМ М ро що Журн шк М сх кое,
ТУ бе Ду лофуг Н АНЯ
М'КІЖх ФАХ АЖ ЕХ БА ХУ щі жах жо те Твір 244 дує жу 2314 Щдту їде Злі їдещ ес уУ ТУ Іа ім УВА Був о Пец Уві ОС бех бу Му Ер о Бен Мзва муз БЕОо Бу сажу гу за хх з ї Ме То ї5
Же Тит кі току рда М о Ж що дви Фах ут. і ач биту дідкає Пра ххх
ЩщЕкоїжез БУВ ЇМ Бех Су ків Мій бю У мІМм: З КІМ Оз век Ух
Беж ев тр ки як Б
УМ де Клажає фюу чую Поязух Хв Хошлиж т рун Жіучих сМажух. тому бе кю Ж (345 бчуку ХКлуЗ їі МЕТ Бах ЩЕ оОЗщаА дже с дл вух Зак» цу ач на сах СУ Ух в Б кА ел. те ті Жах Жим (кіш а ча МК же жк їн Маха ж КАЛ ко Щи Аж беж ж бе УЮ Бех ГТ ж Ви МЕ Ї КОКО ЕМ хм Ма шк пох ях щі Гн Мі
А медиоя БУ
Божкнх Лю нт Журн у Ко ку уч их Ман Ви док Маха і я удо йУв су дкзч Ко тТКк ті Бех виз Адею ода Вів БУВ вви жлх ем ЩСУХ ді ху «Ех о т М Н що докт ТК ож Млшя їж чи у Ж «хх ШУМ 88434 Ві СУ я М Миті. Слім са ку де: ЩЕ де Сто А ШЕ ск 134 йо МБ я хом Гу яко бак
Кмпія ЗА БНО Б жи Да БУВ Бе А М МеокТаХ ян МЕ АЖ Ї ЖК А МЕ ща НЕ су се жУ Се мед ко. фена дк А жк їх я жМ шЖх уяд ущя АТР ОО днів Ме а на а Я НО я
КАМ КК МАК ААУ. Ма Ха: ЗАЛУ оц Ух вАЩ МК Ол Гея У кож су кю зр чу ча
Ка Кл: А
КА жу січ ше птн тан ту ху Же ЛУ о Ту мх Из ТК бут рек у Ждимо фл
МКУ ЕК ж У ТП Ущі ех ех Аа Гу ОА ХУ о шо Ух пе ча чол ие Ка хх
ЦК ж ох зі ж и То Ж Жим ли бу ХА ди бува. Ми Мк ФМ ки хе тд Кк прут
Тож Гена ху З у поки си чув ТТ я: Ех : тУку ке НЯ Ток хх Ук
УЖ КК БЮ ОВО КИ КК хм ВК ЯК ЛК БУ ОХ мих Ох ВА СБОХ зт хх косу З і Ж КК
Не Тл жк лук оку ЗК Жоєжемо Ян ач Мах Ме Туя жу У лю ху сему тих нем ем М Я НН хз М У ЕК А В и ВМ З М З З І а В В ЕК кома ХМК лХх зожолІ чок Си сок, ге М КІ й «ОБ ВЕУ вела ке
ТЕ ши Уж С и: що ту , МА ох, КЛ дети, Фк ОК - хх ЛЬ ач УК тик кет у ж. Ж о
Го ев зи трі би. Тихі вико Щіюк Ци) ТЕ ух кро Мр фе: до тм
МЕЖ РТ ЕМ КАСУ НВК КИ ЗНМ Щек БЕХ Уві Баш тТвЕжЖ Бе жо Мід сі оку хг НЯ
КД ЕН МОЇ ХЕ тбоакг ОКУ у Ек кВ ше Ан Сер км ща Яка ших у ная» ЖК Зоо чу ач Іде мат т КТ ХХ Мхоу і у Кай ЖКМК ЖвІУ КУ х ЯКЕ сх М.М АКАД ок кон и ЗК ек зх чер дос
ОМ У М
З перу р я селу їх сх и а СНУ дФедю вщОЗу ТІ іх Жіхх т ле тлюхух Ле срок Бурюрчую Хм 23 ее ах 12 Учеб вду Мих т жі м Мао Хан Ві
Бек сп жх МО ЕК ж ОК КК Ж жа Ал СУ дж ЗАМ ща Ма Ел КА
З вк ут тег «МТ КИ кА вчи Ж Мч же Ен Яку ож шемк Жені УМСЬУ: фл дім Фах Жде ет. Ст Жук пап УеяАЖ ЯКЕ ЮК ма дур ХУчах ї и я А В А МИНЕ Я Я Не Ж т со, НААН ях жим М М стає Ж ру Жду Хлахм бах да узи. їжу фохуку УЛ я лк фі У дж така ен КЛ
Али АВ АВ ЕЖО Су шко Еш УЮ МмуУМ е ЖВ БА мУуш КУБ БУС др яе овен туту хр тд га ей М Не ОТ КУ
Зими ог Ж кру ур ух кб иМ ин мо и І КУ м. Ку кУ. ри уки аж СКЗ дх
КІЗ фаз Там; (ОС ВА я жо сек Ук Би дав ЖК ЕЖжеХ КО АБ АХ зав же БУ Яея
Я КК «ХМ
Жожит о фаху ХУ б хх им. оду Ху Тодуїя СЕ біжу Срок ЮТЬ лу Хв хму
МУ ДВС Уда б МБ фе БЕЖ Бах дк ОБ му мА ТУ ЖЕК МВ Ж Х сік ух суд туї «ща «УЖЕ жо тУщо ких ЖЖ ха їх. Же жо ру вод УТ. Ж СК ех чих пряні Ані хи ж с а мн км в п з в З В в п в В о М Я КЕ Кз В М М М В С
Ух ши "КА «КІВ «ХМ «МКМ зом Том 8 тез кА жо Му ОТ. СТ му Му ІЗ г твоя Та Бод жо ЕД у ку ких Ж 15 Ка я ню : Мк Кі я зу Мі у Та жух м щи и Зал ох Кл ОТНХ ках АЛ Її І: по Тв Ні АХ БЕ Ок ЯМ
ТЕ ект пт шМ кАОЛКІА до тймух бу Микує кю СКМ Мотя Хр хжщ біо ум: фокмиі Жуузух СТБ ку СКЗ ую ВЕ іх У Фу їУК вав БЕ ТК о бош Ви УВУ У Ві ше ТК їм Бк бе сою Мі БІ зо з38 315 328 зд ср ВджКЯє буде КЖукко токах сх Кун еу 0Коюх о Маки фоюлеюм Ми Мох жо год ух ав ожжр омМек дек су Був Ка ве Св о се БУш о чад ва ЕВ Був вар ре ска «у жІй А ПК
У. с. вини У с їх з зи ШИ малим Мою ТЕ с. я ил м ч з му Н ще Ж ожжеж. СКЛ Ми чн хіт: Жівеч ббеуи уу Зав ж Ковгху Яббррюе Я ко флвуух бохукю З ше Тхек СТУ ж ої це; Еко Бак Ес р3є си А ч АЖ ле БЕХ Бу ща МУ оду без д 4 Би ща
Фежено Ж оцо ушеную я ж муки Ж таке бю. ун будли ре Шо не НА НН
В а КН ЗМ а м В АВ М І ЗК В МН А а А З ПЕ МН З НЕ С ОН ВЕ ЕЕ МЕ КЕ В МТК
Ук соки ЕЛЕ «КТ За ЖК
Ту ох Зону ЕІ ож пошу У ме жи Ж ож: МУ М ЖИ да ух пошук учи ТЕ Ж дЕч пух ер ув ї Бек Б ТВ Се Їїнм; МАЛ Мері й ВО бать Бк У як Я їх -к Са хх че уче КК кю АК еЯ Ка ша СК Таке У маш бріекюу х Стих ах В ою му рія М ем бога Мч те ав КАК СХ ха ж ЖК БУМ Хек АХ ХА У Во же ЩО Я она БУХ дела свіжу ре Шуджчея Ж ї Тодтія ех з ен нн АН А ШК НН о НН Па Та хх
СУ АЮ бу дів БО Ущі ізо бар цех бю ЗУ (ежЖ тТУух Бе бів Ух доку п з
М Ам МІ пек че Ж атшу року біжу. ДЯдУюво тоєуєх Тра ун феюж Жов прушиу Єр Ая Кох руч ух букУує ТВО
Кк Буш ів Ашту Ме Мев ве Вел о Буш Жир си бтв жвх АВ ОБшК Є Ен чия ат аж
За ри рЕНеЖкну п нь Не НЕ НУ Жииу ВЕ са нас на и НН НН сему тих Жук Жим жаху мат им Жу ХВ мМ КО МЕ зах ААУ АВМ шу щшОвхМЕ шк КК ДМА аж алу
ІЗ зи - ФС я оз, КУ Я лома я х т шо
ЇїпжоТіе Бек вич БЕК бе іУ Уж сбеужух СЯ умо Ка у Вам суєту Ти Саух. Шия Мох Кому см З поля з слух
В А АК ОК вро мет стр Єві бе жмеМ сш Бе бе ж ща я щи СКУ з х з Ех чі ах. ня ст ян
СТЮ ках Фосуля ХА «Ж Ах кум Між жо ОЗ Ха ос ЖЕК МО ж Уа оду Є
Піж дич УВО жнКЖ ле жа о сСтУЄ вуж йіщ Щек вже МВ ожфіе ема АякОТЕюЮ год ЗУ лу те пок Ку зо їх Ух ку Блкюо Жов фі те Ж под Ж хх мМ КЕ АК Її КОЗУ їх 5 я М МУ мук же Кк БУ БОДЖМЛ БВ ДОК
КУ ОО З бю З ку М пт дешюф Жовхіл ОКА У рю КАТ ду жи Жук жов воює Жим пи Я щи сшЕжЖ шу В МК шк мем ОоАМ ТЕХ - Уа Еш ее ЯК ЕТ ЕЕ У У
БО ЩЕ с
Си пекан Ф есмх УТ я Жодних Поокчиух пут дк: сут их Зоо Фу в ел зач Кот. ач или шк о век сом ув даю бує Лір бе ек Ж бек щеж бе Ода БК їх я ТЕ во ху. зооже че Кк уухїш 5 хм умі се шу М Ом чи хм я ум Ууї кох т щи А дво сур ух тах й ТЗ 3 Ж ку рев нях Мах: фемох ЖУВНх піс двроУЄІ вів КК ТУужЖ Ток Сую бід бі бек ЖКю ех ТВЖж Ба Ве
В ЗВ ЗБ
ВІМЕд хх о БУ НН кухня ч я ко 5 ш- Учня мож умо Шкала вач Кит р ср дея ЕЗ 5. СКЛ Жде уче
ТО оживе бу са Оу ЖВЖ муж би ша ді СУ ДКЗ
МІ Ж ех «ІА ух Жди Уч Беж он и о НН ЯН НИ ЯН зоішюк чати ЕК сечу ма КД; тд. ХЕ с ЩО ТК - ри ті хо М же тив ВУЕ УТЕ їх ко ЖА
ША ЕВ ХМ АКА МВА. МО ЮНИМ кв МУ ВЕ А ЩА УЖ И ит КОКОН « к р че ї З няно Хх
Бек ев їв без Бех Се ві АТЗ Бек бі ве тах Бе щежш бек фу че ту и
М о Кк
ТА жк ваш уки Пух ХЕ Мем Ло суки Жим ЗА юю боях КТ му. оду я Мк кім У
СУ В: сек їКЮ ові вже пів оваЕк Ба У Був Ша їжа Бі бе Мі.
їх З 4 жи УЖ сю Ж я, не нн в о не и На и НН На лю СЕК є сток жи мч ко жу іа тВх Лів бек ек піт сіє бек ТУЮ бвЖж тую бек век Бі спру Бе ща 55 що ши сі жа ра жЖБЕ жів Бекобкоа Аа бує Ше БУВ ВЕмх ТК Бе тую що те 7 щі
ММ са Ме Бех шех бец БУВ оліВ Зо АеюЮ о жМпк із мес обею ую сук шк ср ГеЖм дів вже ЕВ пі бів о сіУу У їжмі ТУЄ Дів Меє дво отУЮ ТЕ обі 032 ідо МО Що шу Тих бек о чаї ТЮО Уві бек бек 2105» 43 «2115 446 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» ПШЕНІ1-21УН со «400» 43 оо ум жук и пан пи и НН КИ НН КІ и В НН І НН и асссосоВ Сова спосо ос ВЕК речо чоесаю косо ще
БЖ
«Коса Кссса зочасасввеВ Саву вавоМ сосочцчоасч БОБ Сецавчоках. сСесау ее соскою човоє воскщезо пости дово дове кум ху кт КК де м кож мки лу вижив ут ик СК фуру их я дети жк претржіх Мих Мод всчесаЗаКс слову шо ше ос ЕКО шок Чи еко чо вессвесаК своеї ссазосаоце бе асвао сосуочаснь зсесчаонае
КЕ
ОК Би високе бсосвзоввч сс сКозач зорово сепеовоЗв ЕВ сНсХ зва почесне ч аочспачеое ЕВ сиве Кер сшооутео шву сууюцню
Я чес свою оч: зі «210» 44 «2115 396 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» ПШЕН2ІМІ. со «400» 44 секрету ве в пек ев аК сек Кеди сем дт уе
УНН ІЕЕ ши ЕК пасе Ва ЕК ЛО ен ОЧНА Я, пре вав дусі тет твдею стрів ду Кретов Кз щем ще ЕК оре ве чЕссвсЕссз всозессапас часова с ССомсєсачее цтво Секс
ХУ
КА пок на нн Ще пухир им си рути ог св ді щі о уд еру ки су езу ру шетчиаковВ Севистесна шили сссас свя Во ЯК КСВ ТлЛІ жу
ЇВ сощтудвіімиі гжкции и и Вод ще Кі чрх ки ки сту дух пен ан а ну ки а о он ко а а а и я ВІ ВЕ І С о ВЕН щи що ВХ к ким иа сою тки ру ср: суху може ув окиех і ето емо ВК зх ом ок
ЗЕцешсекссе чо ечо ав оє сан час ЗевоссЗа СВО
ПІ не: Зх Те У Ех ше х- З ат щи ех рзду ук в фрез ще Ко Б есте. М ет дько рих М Ко Больеих
СЕКТИ ВК с СІ МАЮ КТК ОМ ово ЧК АМКУ КАК
ЕХ і м окереждре Во жже де прощу Мо черг Міді тв ее се цливосвлч чес сзчасдасваеНе сис йошж Ж д Ма о ббкрю чу шіфвк хм Ще ев Чі Жак ЗЯщ тд ДІЮ У хх аю жа сот МЕЖ Ж сАвВ Бех Бех Ееж КЕ Бей беж У беж УА СБУ з т 18 15 хв хх фік Ху Січ ЖК ру Же їУхугу Ж хугх Або суч Мхх Я гу Ж дк Маму А гуух суху сзіу Ве Уві ЖТВЖ біз Тпх Св БУв Бі шЖеж АЮ Мів їі КЕО вва кр їх МУ За хе М ко М прое Мо ух біжи ТВ ще ух ХХ кує дк Й вх тей СТЮ во тусхє Зону Жоємії Ж щ їв Дів тТКюЮ ЖЖ АЖ шБАЖМ дир ЖЕ КАСИ ам ж ОКЖо Му кн мА АВ ях зо Б ок АН о Ен нен НН НЕННЯ 45 ух КУ ж хх поташ нн во а ОО НН ВН как ша яАщ ХМК ЖК М лах УК ЗУ щи КЕ с Ви КО ОК ЕК у шок пох іх що чн Ні: «де Ж 3 ЩШідУуУ бах т т іму Мане ах тк «ому СК пе ку у бю х ж сть: Ку чи
ЕК шА У веМх оду муж ВЕ КОСА УЖ ККІЖ БАХ ВМ КЕ юЮш хи К ла ЩІ ЖК
ГІ кт ти с тк КО Кк 3 т дих ді вх г ВОНА зх Ж о жу чих ски оди г че Ф зу
ТТ бах Зі кс се паче сб ж ЇЖА жу ЗЛ ву люк рану дики рух Туеми: ЗИ
Ас лем жа ськ МАЮ СКУ КК ут А да жк М ЮК МН Х ОО мшЕ ЕК що щи ТК три ПУ пи ж слу груд то жу Ач зер Куди Модем, УА ОА по
ВгЕ І їх ТЕЛ зу Її хо пУмух тт 2513 Ха Я кю Кок Ще ян мул ХО с
ЖЖ Бін У із Сіу тик Оу у мей ща бі Був ДК лк МВ Ві Аля чия зе лу ши Кен МАЮ
Ме гак о ної жари ее ия пух ех п ичтя и ож пром Сас з Ух м ся х я. я не і; у КЗ си Ах Ї З Кн а а І ин ан УЛ У тк М ЖІ ГДС берютютюх ЛЬ мис» шах мЕКі БІМме фе шк Ер Ома Мами 5 кока шеть Око му ех КУ
ЕЕ ли чо
Може ку и аж тет Ом о ША ЧУ уз хату коду т СК ока зу че рук в Мая Жені о БА хо дп ав о Бе Уа Ва дм и Ба в ЗІ У КІМ БУХ Екс ДЕ ож АВ т КУ В
Кен ик чо
ОД ке ЛІ ож йо ЄЮ рю Толя Хо Моз кі Лю уї Кран тлу пак на НН На НИ
ТУ Її Ожка хкАЖ КОДУ ж ВИЩ Мт ОМ Бе со ЕК Ку БИ ше АЖ чо зро ом ве щи я ;
НК АщИ 155 КАК зе НИ ка Мом кт ке х до ах Ж шк рос ук ух ще а -ч
Кі. Ша ха сМрою. гі у тру бух Жир Кт «ук бах ун Мр Лтхача Кот діжу стику у іс ек щі КЕ сам са да Мо мук ще Х пЕОоБУЖЮ ЩЕ інши Є
Ек ТЕ тих
КС шк КЗ»
Хна Се У шт Укр ух т ля ТУ що Жожжка хо М окзух бю Фа Ж шин ТД с с на НИ я хіх пугу пику Ук у НН Таж так ТМ т. З цдух хе їжи Лі Тихі ЗК ху шк Юм шх МЮ деж М НМ чу ох ж. ДОВ Ю 4 ЖОМУ Аж ЖК мух ОМ Її Ж ям вух т ї5и Кен їЗ ш ох. Керує ЖК и Ме ЖИ ші я Ж ру тку ту Моя Вин що ОА же пох іщ Сеш ів Уві бйжЖ Мів обі; біз» ївно Бер о беє жо Уві сам Їде мех ких чо хх МТУ т Фо дум М ух хх У
Кум да даси ру зу схуд те ВЕ ЗК бу БаАМмОСУВ ит ок
Ж ше жу У у шу оацуж М Ж р Фшеде вм М кю СМ дя ЖЖ ХА Ме уник Мр у кіп ща АК олаш мі о їі век КУ мМ я мах ев УЖЕ БО Ку АЮ
Ж - кт ке
А ЩЕ Ке які
Хажче Ж омх Як их Сбишеує флх хі ТО вьЯк Шевчик Сукаюх, Тр ЖлвмУ ую щем МКК ше би БУ аж ТУ МВ фа ЖА малю ж се ОЮА ІМ о УНа Ж Ж АК ті гу ХК г о. Ку рем и и «ум Є З Фк м Ммхіяє Жим ЕЛ юю токах Їх нм Му ххх удул
МЕ Ме меж СЕ ІМ оощі в от м жк іжау БУКВ КА АВ хх її С Наче у
З що Ее я лз Му
Ол: хх Ж «ач Ж Кі «ж чі ин граю ТМ тЧбюшчх личУ ку сх мах СМ Уті
Те кру НН» Ем Бр рія Ку НЕани пр ХК п МЕ ет Ї1138 ЩШкАд іа МКК Ка о УЯК хНиж шу мат век о жБУую ках КУЄ бУЮ Бек ко спі КДде
БАК реко ГО нс МЕТ ХУ
КУМ де СН х щ ТА я Оз КУ чо З с ня Ф є сих - --
Ма ЖУТ хю Моуччо Ме СТОею ен НН в А НН НА
МАКРО у Ау ЖЖ Я ОБЖ АЖ дае са ех ва ДУ Юма о Ум ММ ж мем у о то тА ща кош ан КН нн нн НА НН НН мч у Кк що МО щи см тв 2 тах ТК хк Ук Ха Хі їдмляї їн Дю і дою чу ЗУ що во смюкує рює ме ща хх ВИ ІК ОНКО ЦІ їгу в сі хмиз упж я ВО Как шк ОМ я щи сте
МО Зо пе хх ї поему зх «153 «її гук ЖК смію коту о М. х А з тт ау схе
Зіщ їі : ох пд Ка те гія» Там бра ею Дощ Ми бшуу Сб таж Єр ди
МАЛЕ ЯК еМЖЮ шу Се УЖ ва КУ М УК ТУКА Ме ода ої ОК Км АТ ав ій та у «МТ Кея г схе дк Жан го вия се и ву ек Та ЮК ШКЯ м кг Яни ні чл п х Ба м ку 7 хх їдя Же ЗЕМ ЕН суху Ех іщо Жде Ти Коюххх ЩЕ ке ех Сх КАЛ
С ж ЖК НК ЖМмл ЖІ Уща м шк міщ шшК ВЕ му БА КО Бе ма те дотрв зроу
ІН С уже
ЛАК хх ох ще же Хочу Дів ке бі Форвна Жешув Фари Я я г тка км віх
ІК Ка; шзу Др докт І Шах Тит Хіуюде Три о КЖфає ди БІЛ я ую КВ ж КжОо бето лЗ ЕС ве сшх мУШш Ж ЛК о ож о маУ ма Вих ЗІ А
ІК ак чи вже пе Я ог ЯМ т: т. - у яке Жоих Пошту нич ТМ я, ту, я ге МАУ Урок її щу ту кру. х М м діру КК дя хвЕж Тор ЗК чу се ж Жду Залиу Лю Тв, ЗР Ен ХК седііх їй ші ж ЖЕ ми А шу В БУХ БІТ БЕО зо КЕ УБО БЛЮЮ ЖК ОКХ х щої З ші Ук дод т 5 щі ща, в ке: а «ХІБА КО
ЕТ че р ШХ джин Са ж: о м му. ГУ паж аж ИН Її шк гр щ-У я се. Ук, рих Кожен тт ЗУ ММу рожа я щі тн ше Ми А км Ж 7 х ІтЕ у ТЕ Тижні дж
Аж ІМ дн му Ва без СКК са аю М БО ОЗ БИ Бу що ЕХ
ЗЕ злу 3 тк
ОХ Ем Ого
Тоу УЖ «и ква ТМ Ки Ж шкря Фрчуяио уняє Ж мух мг не Не о и а ЧИ а НШЬ ВУ ВІ махи
МНИХ М Сни зн ою Я УЮ о с лих ФМ ОЕМ иа ж БО мА ОК
ММА ШК Е ни ШМК у НИ УК сн лих КОКО ХК. ЗЛО я х. Же дог ячкх пох пи ще ЧО межи ик Ж Ж
Сб у Ж пн р сп МА у мя Маг ях жи МІХ му я Я ях од ек ек дк фр щі шлак ак ОфВЕ УЖ ж ку Вт Ук НН ВМО мух чо еру межи
АЖ я «ТАКТ дк Фін Мо хр ую Ж уми ЗАТ Жак Кук Ж хх дну ля Же Жодна МА зшх М хх ут пор Ме Ту км Ер пшрто Тек хр 32 т: дути жде Худ х; я, же чек хчВа ЗЛ ду УВУ дб УВО Бу о ШЕБА бдад мЕгю і с ЖО У АВ їЗ : Я В; зе ІЗ в Х - Ь
ТЕ хх Тех чно ки КО ме п їх м их схуд 8оожчкушу куди ох У ні - же «чую жк мож СУК 124 25 СБУ А га їду ин пмхУдкх фатох ша АН ди томах тя ТУР и не км нн ІВ з В у за з В а и З КК В МЕ ЗК ОВ з МАУ ЗА ж Ку
ЛК СЕП тугі зам
КОХ км кий шо ач ШЕУ ТА Ж3У Же их чи дум Тож Жуля Ж ик сту Му хх Длихї Ух
Ж ше УА ЖЕН иа БО Кжс юю КО МУ ню ж юбо БЕО КАЗЕ
БЖ х а зи
ЛЕ хе «Й тлшк я Дрю Ст юю Тл аз хащі аю п НЯ ху их З Ходуж ще сіже Ті ол гУЇ
УЖЕ. ЖК кЛАХ ка я я их в МНК З ЕК М У ОК о Кк м Я Ви М А о ЗК М ВЕ НН су их ки
ШУ т у
ТИ жк яОКХЙ ни ин а НН а НН На НН нн НН НН Не Ки В НО ха 3 ж Іо КЕ САТ УщОЮ дує КЕ вам ЩЕ ЖЕ Ж Яма су Ук їла а АК суУЖх І ті сх ц «КАХ «М ХК кн шана жом Ту юю Жожкшх Ки Худ 1 Мелао йМл е Мхюхих фу и Ср ск Вузи шт ТА ме ЮК У Же БЕ я БАЯН КАТЯ м ЯК БК ДЗК ХК МК «ушу те оку
Во ях 5 ач її Фо акоує ау ток тн В з Мт КУ Моди УЖ тод уко ак АН
УА УХА ХМК ЖІ ев МО КЛ ОУщ мшх БОБ КР ВЕ ХХХ меБах ТММ су У яр чо еру стук за зі 15 з35 оз я НН НН НН Я Тева Маха Ж Мр То пую Хм их я Ж шо ху си Ж ве ов пут щі БЕ ЗМК ди ЖК Бах ККЗ ЕМО МИ АК КД
Я Ж як як. х ах .
Зх ЯК 35
Жук си и и а в На Но НН Но НА о ОН пк ТА Жди ух М рин пу ТКжЖ дів Беж БУ ль муж (КУ жк Юус КО м шк АТ За СТУХ за ЯК ХМ а нн я вишки ка о нн Нв НН НН ин и НН ОН НН хасф7 Ста То
МУЖА МКК юЕЄ сеЖ ЖИ ММЗ Ам ем ХКпЕ Буш т КІ УМ шжешЖх и сук хх ви зи
І З Зах тку хг Тома ЗИ. Торюєю ЄВ а Ж би нти Ждере Щалту ко Ж що ХК ги Чех
ХКЖО жому ж ші У БЕ шУЖО ХК ТЕЖ сю. ЕМ Я УВУ Аа ККЮ яри ух ту рез т
ТВ 5 зо
Жах Ух Межі КЕ ФА Жуничо Є ену; Мод ха фах буму Что Жручч дЗ3ухлух чт
СЕМ о шНажЖ ЯК СКУ ба ОК» Аа М МНК ХУ ЖО Ку ЯК сБХУЮ жк Би ЕЕ -к тучних гу а сАт кан Ми лев Ме
Чала Ма Ж й ї хх Жах бриф ошзл СИХ; ШЩШЕхуУ Хм Уа че що ще
АБИ ОВ і «ОК ККУ хх ек ок БІВ ДК У Мом Ам КМ се Уві 5 КУ я г имя яр ащо
ЯН СВНа Я ятки Фев уж ух ко ее ння пк хх ж Тука дим гум МАМ як жди Ві
Бк КД Муха ть ке ГІ туї хх об ХЕ. ТУМІМ лем Беж ШЕ ЗУ МО Ми 535 аж х ик АХ що Кз КО АТІ АХА КЕ ос и и не м з ох с у кв М В и а А М В М долю ЕІ ОК
ЗК С А ту БУДА ан не А З о і НН Не в НААН ге рути ії Вів СеЗз Ні Мак Кіш ї ки и ви же ки с М з п М З А З а В В З
МС ду я нен ЗК ЕКО се су чен НН в В в в НН и ОН ВН щас ласвь Болена шипи Ук Ко гло З шари КАМ ХЯ ще що МОСК що ко ж ох и фс Уа ана АКА Ве поем фути юки тік кір ще сти туту ду ритм у кра аа Вч Уь БІС НА КЕММВК ЩЕС КО «Ви СВ гос В Ораня Кві сп
СПА
Ас як МЕ. густтчім пику ихівит сир ов це кт и ни и НН іі ситі дну шкі ну хи ик щур Ах ОНА ХК ЗК у вв вч КР КУРКОКИ КУ ТІХ
З
МК печери ехо вущетіссеущіеия фур гер др кешу футів пу ср сти Кт прау хв зач с пак ччасо сечо сао ес лм| СКС ре ха еротики июня тут Мох кузсжуту и БІК мою дру щи КК б очгу щу
ОК КМТ СА СКК потокам Тк АН хг ще зесигиаЗак бекпухаащи мікс рон ско осЕ сКепсемиов щен Мчч ха смт СІ Ста СИ КК КЕ 35 а кн в НН и На нн НН НН о сосен чего маша соч роки смс де як сви сно ді сало спади Сеча и КВ пе щчомач се Ва шрам А СЮ Км І ОВО МКУ ах
ЕТО маки НН І На НН туге кУМ сто мк Ів уки
НААН ОК Мчч слона освоює мА со речо сли Сонату аа
КК НИ НК УВО Мих ух гул оо нн с я КЕ ах пилу Коли ки
Ессе сезони сао сс соус ао пев
ОО іє: і іч Е іа ш и а: У ва
Беж ст кущи вич оит ух кру у п южавти й Кові претеіуж во сце хм фу и ю ОК ВКА подо х Я ше сток че Мітки и фофруизртУЖЬ і Уж М жі уро В труси ик етики М гу
ММК Ки ЕЕ З щащш КІ їх их сви к а Її чизвччкаКтч кеша що о м и м з п о і М В п В М КЕ СЕ В КМ М п и о п ОК М М М тиск АК Ж ОК КК КСО ща КОТ чК СеЕНе Ах пу
До ни кн и В НК А НН НН в НН НН шееччесванеІ часа км сСщесномх щежлненакоя пачки сна сиВ а вух
Ме ігру хв жу М Бк пеки ттьмти МВ гуд у р дики т пише трткі ту. МУтю то му фо тух
МЕЧЕМ БОШ уми ОВК ОК АКТА Кен ОВАЛ КТ КО ВАХ
МЕ ЯНІН ке КА сексу с орех А рою секту фр лтехицицих пресі ЕхИх пути пж Во тую Бути Кри шЕспецасе чок сю поемою іа ОЧКА С «жор хг
Мо ут чтткутуєтиттиє БМ оцдрехичуие пуф вже щу тест геофрухгх тет иреМ до тс еж й уд увх вві м дм у мії
ЗвочоавЗчас соб всслсак счассасечо засос сови сок се сфе греч омх лю ефруахре хе сів і ЖОВ кт умих Де Кгижуч вових Ку фу суп ок сво ут ичиуєчіе щит плоско ще Кросові чани «пав
ІЗ с хх З щі З ЕІ сх при ка плпдасластс састсмихаї сок тава са кит сб пасовищ
ВЛ ЕНТ Ст ЧО рН М же Фр УК МУ КОЧЕННЯ СТВ а
НЕ де тку етики ж мив і ут В дк ек т пружауютМою фею рах туф перуку йч в м кр ух поча ач мене Ка Кеш шви шою чес поь
ЗАЙ суч у рю у их жо и нн во а и НН АН АЙ Кр шила и ужити прик у рути засос вок бок асс ФчКоссвкссв чсашошся засос ні п зиск ди ВТМ МІХ ЛВ Кал фо В ВУ ПАК ЗБ ОН піді вмів Міріам оті че ут фу АІюаиі вк чи век ивеКЕ щвІиазчоскияка возачзовосва сасаКеооск «коси сосна се т хоч дк ехо ж о вм еУЕ Мов ніх дере у дідуути примх М Мк вуз я Ж реж дев
ІК КО Со мур КИ Ми Бі у ПС СО ХЕ КОМИ Мушу КК МИ ЕК МИ юХ кт м: сек их уєнум ЕМ Мои орі куті гшпреех АД ЕД МІУ и ут ур ку цехи вочог в ІВ р НК шо ее ЖМІКННВ ЗВККВНН 443
Феолучум в ху но Культ ж их вих ен чи суми лісжмими жи иу лм і кох
СЕМ м КА ЩЕ АНІ СМ МУ АНІ БИК КВК
ЗА
Зп
ХК пишеш осо песо сус Зевс ее ема онии аа
БАН нн і НН гЗІВсв Олі ІвІри в рми и им кеВ Моди с М Ху ух вишки ост е сиг ше ше щи и
МА З БУ ших БУ щу С іп і МТ соуси гетри их Хе щи КІВ ЩЕ ху рухів В вер дух пу аа сиве казан ЧТ ВИ СИ КМ ОКО ролу
АЛЛА еротики сік ет втім. Кит ри и ух чут учив; же В офорт ихо ом рах сша ВЕН М КАТ Я КО ЧК У СКУ ТАТ ВИ зло
ОМ КХ шисчгчаш «скаче паща лв щем свате Ода щасшес Село їй
ХОМ сус еууу в Мо гових Морі Му г Уж вуж ст Ковузд К є, ші венами зсссоссессво соСвасеКов сс Івова сова ея
Кая «ХІТИ Іво прут в ек им о віче лстуК т су фу статтю пути дуг лі джут М су прутех саезачзчав веж окс Сезессацеьв Зк оВосниУ шесросВиаВ сс се чоулум
Яку окре лЕсь п хау Бог чих про гли пути сачазвессвсо поста сто чо ук а «КОХ 5 і:
«400» 49 ху кими ик уки етиці шу труЗ Во рудити суохімічих в ихех фо ВО дю и учив Ку чвааскосссси сао с фев оо вУєлю БеКсбееяє зе
Би ще кс кКо Я см Фреска ОО ох чом ВС Ви т кв
КН фесту уві Зв е ги МохвІвІхеКІХУЄЛЬІІВ тиме жі еру солі В су це стул жим де
МОм Сом са ес сюМма ема жоНвя КК КН фМч ам Босак торфу е ій верес ем фосфату ог прі се чех ижерИВ фррувчі ел ліц
Мис х ума Фо Я СиК АсрИ МІ е чВНи В СНИ С оч роми В В та
КУ Ве
Ас ям КК БЖ ЕАК ЖК ОС ПОН ЯК ОКА ОО г ши АТ ВАМ ЦСМ пт
ХО
ОЧКИ хх Каса ЯЗ сш кх Кір шар ше га ет г М ККЗ зей док тлу ик ущию ок ех укус ке НН НН НН шим маще ам Коса Коць киш мо ТМ ча ее:
ОО ткож
УТІВИчІч лу ие гуру ве прожи 0 пре ех и рух еф фр ух ж и ту древо кт ща шесаечко Фчовачаече впав чор шосту
ВИ чів еретіВ 0 су и терези ев ВМ лхгуртщв с тку (пф прожи еру ут крутих своя ачиави Залаассччає аоседече завсзаасосич сеоппссчи шосе кап пк Кекс юк фе вовк очи спрей уми лук рен юр похижіивіу вв их ув итувить вв чи пове свсВ сода Кио васСптсоосВвие чис ЗсесаЗ гопак сечо виеВ век п
Мо плрІвВ их се ту вк ск ущих о феод и муку уирим фе яти і нн света вВ човин км опис Коля песо
ХЕ У - ТИЛУ ХХ І У їх ДК У й
У тЕуепризІужемеТх І дув укуее го сту ту Кене ан ен чу суху ух с ех ев у ит
САС мА ОО КА ОО КОМА КИ КИ ас с КВК М оз сни тржуєх Й ї ху тт хе кре о умі сфе сур КМ М во ех Мо усу ху ут мому вимі дв мов мож ик сою у
БЕЖ КОТИ аз сих ЗК ВОМ Сови кал бай "Би фоехлю пд ли чи
МИ БЕ тех
На 2105 50 «2115 32 «220» «4005» 50 бббижумо СУК ЇМ ба жжи жує КА ж у ТТ ВО. три ТУТ уко Фк ЩО Фосючож ТАТ ух
Ста тТвЕ Та сСув Св шу сбАЖ вів вів ща їв був беж віз БЕщ гу ін пу Ж КМ мМ) сек Міища МЖ; УхУ флхуюу ух. КЛ и Оу КЛ х вх «мм. СК г она ча гм АН: Ва ді щу ФУ І Уа А У З м з п В З я ВВ М В С в хх Ме лох хх. А АКА «2105 51 «2115 35
«212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Праймер ЕсомМН2 «4005 51 сСевз ТвВк о ТБе СУ Сбую ПУ жльУ віз лів ТВ ТВ Сув Зеж Вів Бк сгуУ 1 що ШИ ї2 ї5
Тв аАви мМеї Аз сЗіУ Сук о жМикойпіє ек дів бі Бе Ав паж ЖВх сл щи йо ЗО
ТЕСТУ СУ
35 «2105 52 «2115 36 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Праймер Ватідсі1 «4005 52 пі су дів щі сіУ Віа Же Сую Сб вів тах дів сі Аза Сов вів ї Б КЗ за аіу віз Тв су Стіу з фу бі Тв опіу Тк Су ЗР Те тТВх ТЕ щО що о
Тих шіу ЗУ се -2105 53 «2115 31 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» ЗасімкК «4005 53 і пт вів зі Суш ТЕЖ був пі Вів ТУЮ вав о уце ТЕ су ЖБК жу ї гу о 15 мак твх дек вів СуУв Ме був Ліз Ба Жкр був Жве Меб сбев Ва
Я кВ о «2105» 54 «2115 46 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Ніпакії. «4005» 54 бок вів ТвБЕ Аза сіУ Абе щі СУБ Тк Ст Аза вав се Сув ТИХ Кох піт бКУу Акз Тв ці бі ТКУ піт Біб ШлУ Кіз Аіз сії Азія ТвкоЄгу 20 пк Зо сі Віа ТВ Аза був Аф бьУ ТВкЕ тих Зі Біу ТЕ СКУ СуВв «2105 55 «2115 39 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» са37-11 СіІєаа «4005 55 есе Завво зЗесбасосвсЗа ацешЕссКте севасКес -2105 56 «2115 23 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» людський і химерний Мом19 УНС СОВ2 складний «220» «221» РІЗНЕ «222» (14)...(14) «223» Хаа1-0О, Н, К, або В «220» «221» РІЗНЕ «222» (15)...(15) «223» Хаа2-НВ, О, Н, або М «220» «221» РІЗНЕ «222» (16)... (16) «223» ХааЗз:-Е, Т, 5, С, А, або М «220» «221» РІЗНЕ
Зо «222» (18)...(18) «223» Хаа може бути будь-яка наявна в природі амінокислота «220» «221» РІЗНЕ «222» (21)...(21) «223» Хаа може бути будь-яка наявна в природі амінокислота «4005» 56 вка ліє Ні бхоз ТЕ деюопіУу Джо о тТОх о БОє Тек дам бів хай ів Вів
БЮе Хавз ліз бів Жах іа Аа «2105 57 «211511 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕН1-48м! СОВІ «4005 57 дже діа ех 010 дЕЮ іє ТУуЄ Шек бек їв АТ «-2105 58 -21157 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» ЕН1-48МІ СОВ2 «4005» 58
Лі Вів їж ав» ев Вів Акту «2105 59 «-21159 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» ЕН1-48мІ СОВЗ «4005» 59
Зі іє бе їТЕв дів Беж Ко тех Ту «2105» 60 -21155 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» ЕН1-48МН СОВІ1 «400» 60
Твж Ве Жук ТЕр ОМ і «-2105» 61 -211510 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» ЕН1І-48МН СОВ2 «400» 61 дів ті бук хо ЗіУ Авпобієж дво дек оду «-2105 62 «-2115 8 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» ЕН1І-48уН СОВЗ «400» 62 ка ав ЗіУ М бух ві діє теЕ «-2105 63 «2115 11 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» ЕНІ1-49МІ СОВІ1 «4005» 63 яко Віз бех біб вав оТіє Тук ЇТНЕ Ашев То Ді «210» 64 -21157 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕН1-49м! СОВ2 «400» 64
ТЕ лів пек Аяу фе вів АвЕ «2105 65 «21159 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕН1-49м! СОВЗ «4005» 65 ій Ні Бе Тер о За беж Вис бек Ве «2105» 66 «21156 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕН1-49уН СОН «400» 66 тТВї дехрсїек без Ме тех «2105» 67 -211510 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕН1-49уН СОВ2 «400» 67 віз Кі Тую хе ЗіУ ДЕи Веб АЕЮ ТОх ТпК «-2105» 68 «21159 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕН1-49уН СОВЗ «400» 68 дз Вів йо Тек спі Віва Меб дв оте «2105» 69 «2115 11 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» ЕН1-57м! СОВІ1 «4005» 69
Вюч дія беж ОМ вв ле вва зва Авроїжеа НІВ «210» 70 -21157 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» ЕН1-57МІ СОВ2 «400» 70
Туш Уа) Беж Щі Зк о УЩу пек «-2105 71 -211510 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» ЕНІ1-57МІ СОВЗ «400» 71 бів Зім цек давно беж ТюЕв оБжо Мі ТУЮ Те «-2105 72 -21155 «212» БІЛОК -213» Штучна послідовність «020» «223» ЕН1-57УН СОВІ1 «4005» 72 дек Бек Бі су Беж КВ «210» 73 -211510 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» ЕН1-57УН СОБ2 «400» 73 жЖУжЖ Хі ж Щек пі ще» Жех ЖЕ бе Бек «-210» 74 «-21159 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» ЕН1І-57УН СОВЗ «400» 74 із вій ТУую сі беж ех МЕ си тує «2105» 75 «2115 11 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» ЕНІ1І-65МІ СОВІ1 «400» 75 їв вів Бех сіб Аа Уві 0іУ БЕОо ДЕЙ а АТ «210» 76 -21157 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» ЕН1-65м! СОВ2 «4005» 76 «-2105 77 «-21159 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» ЕНІ1-65МІ СОВЗ «400» 77 зі оза лХую вею бек ТУ Кро Бук ТНК
А 5 «210» 78 -21155 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» ЕН1-65МН СОВІ1 «400» 78
Тв одех Жук ТЕ МЕ КІВ я «210» 79 -211510 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» ЕН1-656уН СОВ2 «400» 79
ТУт БГіж Ави БО їі еко обі ек ТБ ддтз -2105» 80 «2115 11 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» ЕН1-65МН СОВЗ «400» 80
ЗУ -іу діа Ту Чж дже бжт Мк Мем ом: ТУуж «210» 81 -211517 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» пИЕВ1-48 визначений за Кабатом НС СОН2 «400» 81 ві її тую БЕОо ще АДвв о ЗфУ Аве ех до бух бах ба буш Ре був і Я КУ їх «210» 82 -211517 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» ПИШЕН1-48 визначений за Кабатом НС СОН2 «400» 82 віз їі їз Бк Піфу дак Вер лек Ако Тек ТвЕ осів Був Ббе св ї | 5 | їо 15 -2105» 83 -211517 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» ПИШЕН1-49 визначений за Кабатом НС СОН2 «400» 83
Вів іє Тею бус бі ваг же дер Тахо тво ТУ Дей опію бує БЕНЮК ТІВ пре «210» 84 -211517 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» "ИЕВ1-57 визначений за Кабатом НС СОН2 «400» 84 тТУх Кі пек Бех зЗіУ щеюЄ дек оТце бТіє Зею о Тую дія АЮ ЛК У Бут ї. 5 ВЕ МЕ
У
-2105» 85 -211517 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» ПИШЕН1-57 визначений за Кабатом НС СОН2 «4005» 85
ТУЖЕ ТІ беж бек пі Век бек ТБ бів дес ТМе Кіз зве щех Мак був «-2105» 86 -211517 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність
«223» тИиЕН1-65 визначений за Кабатом НС СОВ2 «400» 86
ТУЮ Же Аж жо їі бек осі ТУЮ ТБ о ТУЮ дай бай уж вив Був
Х х Що і5
Ар -210» 87 «211517 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» ПШЕН1-65 визначений за Кабатом НС СОВ2 «400» 87
ТУкК Хі Ав» о вкЕО Тіб Бек см Тук ТвВх сани бек да іп о Му ККе пік п зх са «2105» 88 «2115 108 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» тив 1-48мІ «400» 88 дЕБ Їіфе па МеЄ ТБХ бій Шех Бхо дів Бех бец мех ува Бек ЖЕ су піш Так сеї ЖБК бі ТЕ бує дже ів бак біз без бів Єуж ех ад їжи Аза кро жк см сю ую сл а Бе ек вибо сімй їм фо Ві
У ЖЕ Зх
ТЖую дів Аіф жвх Аву; їнку Жів му бу Уві Бюро шеж бу Бе Бек обі У
Б З шО пек осів пек о БіУ ЖК бів тжЕ Бек Сем бух фі ей бек сема шк о бнВе 5 та У ЕН піч ввю біб се беж Тек ТУк Се бік Міш Ве Тер Вів Шек бюро Тук тве бнеЕ Піо пе піс твк їде їн) СЇлю їв був дкЙ 106 тоВ «210» 89 «2115 117 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність
Кун пе: ни Ач я ве Ач А на а и НН ж. Зо Жук я мій УВІ зи Б Сов оса век зам Ма пі фімА ів КК ЕК Бу лов ї 5 її Ах п ч о щу г МС С ке птежуМ Ка ес и ати чн, му Є Сет пе я вва чя У я Таз дю шавЕ о уща в»БуБ зм ек ев АК ЛІВ НИК ПУ СТУК ЖИХ Де уп ЯМИ ДУХ
Мхусух МО ЕК сах СКЛ у Ж ювию Х жіо0 Коже Ше Ж дк ЕМ о їла ба М хх ту Чех
ТЕжюЮ Ме папою ае мжВ осі одиб КО ау АЖ щу сем мл угор хе ог хх жк
КУ У не ек М Ж Фряеух Ж Я хо Мою яр Су ля Фе Моди Три ТЕ КТ жу С мусу ТІМ ші вав ТЗ бух Мк За дек БУ дар Бак дж ЩдУуХ ЗК силь Мт ' ее нтх ше ще
ХХ ХК А
Жов ки жк Му Ту. Уокут ЛИ хе А дощух бобу Жирах Ффуує шжюх Січ. КС о юку
МУ САУ муж вав жк бе ойХ лів о АЮ БЖ о ошЖ зшмК швиМ упо вл І ше Хуг -їЕ сх
ЕКО ТВ по
Ки А жі Кк сСтауує дик Ж оо Мчч лом КІ док Фін СО йо ую Му прі тв мет щі б же ем Там ЖИЛЕ сна КАМ дл Я рі да Км х Ї МЕ КУ
ВЕ ВЕЖУ па
ПК чним Ж ши М ТЛ ж ект ач ВТ Зо бю мує СТ те йктаю Ма хіх Ж У км и Ас аж б Ку ММ УЮ яд М Ж УЖ СІК КУ КАЖЕ АНА ОККО МАВ
З окуй зпач зів ж кчсне АС ха стр ЗР ж ла А ОК. ще ЖАКА
З
ЦО биту мк Фу Ван тюжує йо бах Тени М уяв Хо кузя бадузе ХУ ся зи сх їх х їх Як го ї ЕК у ут з ж Лаз: Сх ХВ паз їі ах
АК ТІ їж Ь Зв. ОБР КУдІ ХМ СКК ді Беж їі щЩаЕк Ві по и 4 ї іх т ех У Кь І
Ж а сте ує їв МУК що туз фату М яеру Усю дю БУ 145 чия Ж ді Убухує Мах М хуту
МАМО ЖК УщА КІЕ АЖ КІ СЛУЖ АХ же МК А ОВ ДАК АМЕАХ ТЕЖ ОЕМ пу я ме
КЕ Ка їй жов ТАМ м трі Пав СЕЛ у КУ доме же ФЛ юк жо Жак жи ВЖЕ жк там Тонкі Ху им АВ ЕК ї М У КОКО у ОО МОУ хи ше а АТМ АТ У В
В Б траихе ПАМ я СОЯ хо хх Кожух Ло кол Жолууч я ЖиЮ Муних Ше ли ю Кк би ут гл рек тп АЛ БЕК дат ба Діє Еф бу Ева СЕК ж мжчЧ БИйпєе ек су
Бо З о
АН и ї Кая СЛ. КУ гак Ту рих» я СХ ух, Ж оєнхх Зх Щоки кан Жожжтх МУ жк он хи х ою юю СТЬ Тл ух еко «ку Ти спещ що М лух дю ех ХХ тах век о сослУу сЗЕК щу СИЖ па КК век нед бУш де ши щех ви ОК мае шок сх ст 2-х оч КУ Т щи ел бла Ми ТАК БАК ха Ману хх тб Лу я тан СКМ тлу ку Лади неу СКУ хи меаЯ. яМА ТИЧ ХУ ОККО СУТ КУМ сл ІТ Би КЕНЕ ОТ в'яжщша и Ж Ух пе ХЕ ск жвЕО ВР ащ сут і іо Ствк Тина Бела «(3 Ті гум Дух
ЖБК ВЧ кт АОЮ АСУ АНУ АК МУ М А АХА А А мух АК рах че
А Не ви У ШИ Я Уошух т У я г Мих жк УЖ сти в сних М Х педеж Жим «ху х о нан З НЯ тіла тах фу МА хх Ж т її і сх зо дами хх. КІ д
ММ МЕ КМ ММ ІМК АТ мех шу КК ОА ти ліЗв АХ ТОЖ КК му ЕМ - гу я дк ї НЕ Її Їй с Я Ка Ьу Жорж ПЧ и. ї мк п Ж дух Мо реж у су Ен Ж ум У ец в м. Ту т: пом пів. Ми Кок Мід о свт мамо дм СА мо Ми ря ка бух ТІКНиНия. бОкре фбужтр й ху шко му МЖК мех СУ муш жа ЕК БАКУ КУМ БУМ КЕ ЛЖ ММ Ух ув Мо за я хжй м
ТЕ жук, М Фк ЖУК дих ж а ж ою Ж х- Тек Зевс и и НАШИ У НИ ННІ Уа Ох
ТжІ мес тех кр іє дя аа Во бро у соай су Зоо з їжа Ку «ут ще к 5 ке «В г жк АЛ жк са чию КУ ко Жогзрх кт ихує о фефшуу Мі Вирок Же У куба о Жоєхово Жувих
МАУ Ві се Ж ЕКС шу в БОЖКО ОСЕМЖ УмЕ бУЮ АНУ іх КВ СІМ шо -ї кт ши хе т-6
Тв пі Її Аїв Буш о цем ТБ лі Уві Живко пек дів дев Тк Маї Тек щУ НН р ав мех бін чаї дек ех фер; ТК о АкО Сів; вБвродек Вів уві Тек Тек Су
ТвВУ Був Вис Пів даю ТУК Зі дів Меб дво о тех Тер оБкУ бів осу НЕ
БК сві Тнж бі бек Бек 15 «2105» 92 2115109 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» пИЕН1-57МмІ. «4005» 92 мякі жк БАЧ Ум Жуля КМ Тк Ж кет МОЗ ле Уктая Коія семою ел ПЗ жеє їдкеу Є жу ав бі УВА іже бИЖх піар овех ко іа КВ їв важ Уа Лю мкс Ку
З В 18 15 аа леж ува с фей ще СУ Ах йіш ша бій дев бів Авий дай дам їжа Між ТЕО бек бів са Буш шех БВ осо бек Бко Бк о бем о бжеа Се
З а в
Уж чи усу стю КАЛ хм тю хжщ Філ сх фл Хілл длау у ожеею їЗМ и ша Ех
МУ ГУК УВІ Бек сФфатЬоеЖ Зв ОК МУ ЩА ШК ех Кр ета жнеЖ ща оте БЕ й
Фах Ста сх Ки ах Сміх що Тіз ху рю то я Ух ож Жах ЧУ і: їх т - чі шу КВК іУ ЖБЕ даш ВІ Тис іо бек із вай Бах ВЕ Ба ТВх іх У з КО іс аа бе Бі Мес тую Кіз бю обіг азу Бек дае беж тку Бе Нідй тім уж ХЕ сх пен нь у не НН І НН ву еВ Кк Лк Чи Ж Я дея
ЕмЖ ОМ ЖОВ А У ме шАУ МУ МеВ ЗХ їх 15 фі му щ оАКЧ
ОО І
-2105» 93 «2115 118 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» пТИЕН1-57УН «4005» 93
ТпомжУ Я В: г то балу І Її Гея СТ. ЕТ ду с т ху УЗ пух и хи ух
МАК СУ ї м ом У КЕ М В п І З НК ЕК А У ЕВ МІ А МКК У ша у з шк чо зд я о УА ії сФарвк Аеу бук Ко аю вк МО Ву щу и я бури ж Ярини «Ху жива Ж хм ЯКО му ше Ж Му ня ЖАВ вим У у БЖ АБ Кі ле НН КУМ карих «о Кн
ЗУ о М М
Ух жк шу о Ххежу хі Тури ХЛ рок на но а я НН І НН НН га ств й хау МАША ЖК КК ОБО ФАК ММ ОьМя. ЮЖЮ АК БЖ файлу. БЕ КОМ ЖК АХ
ЗМ «а 45
З А ряд Ж о лі х до їх її к діа Зкуюи ТИВ СК у и тм ул що МА ку у ві ЖУЮЄ ха щеЖж Ж сі ВЕЖ о шек ТОК бо ще ЖжЖ Мі АКО Жах шва -м мох че щ роже й
ЗО т ща оту. КК жк би ико ЩМУМЕУ Ук ую ТЛ ду стакан іх ку фак сих ож усу тушу ТКУ Ж осмля Ж хх
МмжЕ СА Ач еп КК дашок ЗМІ М а же МУ му ву МеВ ЗАВ
Жак ач ин нн нн нн в а Но и НО ск Фднх до Маму Мн Кам їжа с МеК сс Жчажк фнщі УК її ім С Зх ІЗ: ЕВ О ОЕМ МАУ СХ У Ох У шоку з Зрсрхатю СЕ з - Фу Ки б дж аж Хе ОТ «фс СТ м ее ем и о
ТТ лро Момую 7 зу пк Тож дО ОКУ хід. ТА пк у (31 КМ іх ринко я ЖК І вом уж ЕМ ВУ Мет ім бек Сх г СА ЗАТ ВАХ ОАЕ 100 ка що
Ком ЖК серии Фен нн аж Ма) ТИЖ бі бек Бех 115
Моск ен и и ВЕН НИ в Ко ке М Не Шен пУБк іш Тож січ Шев ХК УТ лХ ЩОКА чвЕ МЕж ж сх Беж сао Бу ев Ме, ех пи се о УЩЬ СКА із ч р та хо
Ка ЦП КО я.
Хокуух о Жежуха т охукх ЛА фе нан а НА ЕНН НН ШО
КУ Ю Ж УК БЕХ а І СУЖЕК УВК МІ ТУ Ск ТЬ АВ КІМ хи ЕХ з их, -ї гу де их Б:
пре ружа ния ее не но НН НЕ ЖЖ ша Ех Стою Жреє Ходи А тож ТИ жо Ж УЮ КАТЮ АК чу Ж шу лі ви КО КжО мВ бук еВ пуд Ки а щх ху я З я Ж Кк. ее а в НН в не НН НН НН НОЯ зи ен бфеоуеіо Ж Ію бю ж Ку
КЕ ОК а мк МК у УК АК мМ ММ. ЖЖ НЕ КК ІНЬ КЕ Уу а З 5 не нан не Ав и ни НН НК НО ОН тему СКЛІ, Сизуз ви Му Зп м: Хм ке взех ші век осіУу ЖДПУ аю ЕТ жМК їЯво ЖКкК щі пек нь Мек Фі ее ак то т що
РО ХУ поет КУ е я лечу пу по ши на в но НК Но бек лиж М вк АОС КУХ жЕН УЖ ою ща Ух Ух ж КЕ Ух КК КУ х по мех пк
МО КН ТЕ Ку сук ЖЕКу еМ гля Жак у пі щА ока То й Чт Жах Ву
МІЖ ЕІ ОКУ ФУ ШУ ЖИЕЖ Му БеО ша обАш БУМ ККЗ зе т
Ко ОБ ДІ плюс ч Жл и ж ЕЛ я Фк МЕ а А жк ник Не о а НК А ННЯ щ5ІБ он Зі б а аю еЖ бі Аза б ії вів вже БК су ХАІ
ЗХ 5 МО кВ нь ее чок Ки дах ке Ж жах Км Ше МАЛ кю ббююує ту. Жіех СЕ Му Кк
Бек Уві бе Мей дек СтУв обу бюз Бек (лу ТУ ЖИХ БІБ КБУ сзжеж ук «іх я з
КЕ ОВ З
. : ах Я й Я щ пр м - е чх и М Ту скх Уч ЗИМ Кум хх есежо Та Кт ж ЖЖ жа щи Тому МО пору Тк тки Ме Ма Те Уа МУ АТ КТК БМЕ У МИ ку АМІАК ях вола ря г се
Ян кА КО щ ч й я с плн ту о ож на Не и Мом уже КИ ШЕ ТБ а вн Мих Жуки бух вк о г Тк МЖК Х
У Те де деїх сш бе Бек ос У ЖУЖ Ж мах БК МУ Ам мук кище що щ Гу чу СЮТЯ по ї ще ; . й -х с -х щої п ож ку Зк ушу Тк ХУ сбУкрує точ УЖ В о бух В хуєю Шк юю Шьухю Шу ббври М вд чих
КУ Кз ОО ОЖМИХК МЕ що щ БЖ ім ОК ЯК КИ Мо у вишки щеЕЖ ЕЕ шо ВАВ У М ее «в хе пк
У Я г ям 4 ; є оч кеш мук жк дамам м жом о ан Не НН НН жи. (Ен У у и Пжмає пк
Ме (БЕ беж йиБІ: хек їмМма СКК ее ф3йАЗ еф Бех АВ ЖК ЖЖ МУК У
ЗИ 5 ки стуку чл я. Краю фон сеча жі хо дюмих Тік Жуки Ме блуву кає бачу БР і хі вАщ оч АК Ам КАК Ум шу дО вує ЖИ ВК ЛЕ. ЖК Кж ох ї ША й поши ож чех ток З
МІХ Кене о
Кк Мухи сич МУ Уа ХУ а З мом жах жк ва ВЕ А ще ОЕ
З хек
М Я р Не ах На а о иа я Фен Жора Педикюр Сіл ЖАЛО ДАХ
ШЕ АЖ Сех БМК о жк 3 ям БЖ ем Беж їж БЖ ві веж У У
А к я чек
Ка На М ях а х оди. сг3х ке ст, 3 « н Б У осики ж Кк СЕ. --- -х
ТЗ кт її су С уча гати Тому ев я В я хх я по Ха джує фаху вам АК ЕЕ кла о я МК о Ст ли ла сНЯВЖ їм аю А УК ОБ ш ЯМИТі до Ве 7 ему Кеш ее
Баш 3 що Ку ря иух ії з А ач їде ої жчм ТРУ те Єрко фени Божих Том Ж юмії ЛК а м и М ЖЕ МЕ в нн в М т а м о С п КЕ В М В о Вин а В КЕ НЕ КО В С В КО І Я в и ах тмххи Ва щі сю для бу: у Кохух Кк Хуй. Мур діди фути ТІМ ке хх мух ва АШ жк Й меш лав аю су А КК ЮК Б АКЖЖМЕ КшК хАМУ
БЕН 55 Жр
Фк чу бика тяж ср Кім стани ую тот фо Тех ща Шах Жар: Кк ую фр
ЖК Км ше ау ЖК ФММ УК жНшю БО ВИКО ДАХ 5 УТІК БЖ ща оКиЕо тов тру туї тпижкех
ТюТ ге хх ее п ж ох тк М де Ж ж ІМ йулумо ША ж СЕК Туз тр кох ше Ж Єрки шо дав кін У БЕХ ЖУуЮ БУХ Суш Б В КІМ БЖ Ав деж ви ДУ
З Я Я В; З ве Х шк З ГУ
Кк, хе ШТ ж, ит їх Ух мож аих Зою ух Зь в ви (х У пюзуч,
ДЕК КЕН М У ОМА ТК БА У УР О ЯЗ УО БАВМО їх ВО лу йООЖММЯ чових чи
А МЕ тіж іа жу У Бимії ХХ я ах їж М що їй ТА Ки ж ет у г лу М
МАЛА ща Ап АЖ ЩА АТ шфшХ МУ тАШ УА М ЖаВ аж МУ Ж КУ Лк
В х г ох 4. З щи ж тлдч У. лак їди ишщує тк т М дм. хо юю. чає МИМО срухх: межу ра хух сл Ух МАЛА оатК Слух ве ТКА юшК Му АЖ УКХ ЖЕО КАК КАТ У УЖЕ
БАЯН Те ен я. и -Х
Вуж Ми ЕЛ ж тІчах: УЛ о й ет - с: тече ач аю Е я
Ук их ПЛ. трутум ї її У Не о НК в во КН а А КН АН НВ н-шех їв МеК бів оте ос ау ЗАВ МЕЧ КК САУ АТ СУ щцфЕ ФІ у аз
М а я», ж ХА я тічк о Мід ості ях тро фбкжУ 1 ау бат г Шах ке ру баде ме фею га Бах ІМ
КК ль МОХ АЖ Ба БЕ Ма АЖ ДЕ БЕК ОК УК ВХ ІБ о Буш о штра щи до ЗЕ й
З 5 5
ОН Ук т. с Кк Гичня ц У ще сЕУх я За с Б - 7 н що
Пр гли че щу сив ах Тоащяя СВУ В б еум. Кох ФІдух бок ухе си МІ я ЗК о уко
МИХ шу КУ в КМ ме ча АВ ОВ її МУ БЕ БЕЖ Бек упК Дів о ТУХ с стю мк не и ТО 5 ЕЕ
Міри о їй ур. їжа бдеко мМак о Кавки фек Фбдую із. Мікму фазах У ХУ Мешую о Мах жк вих в сить Ущ дело шеж се ж бак о лі поле озех дьщ У. КК СУК КУ ща ща ги
Же аю том ому ее М ху ху Маєте ДЮ яю АТ лу чаю тру г я Уа Ура кА ж ши Му ВЕЛО ЗУЄ міш ЕВ о СУЖ ЖЖЮ ую АБ САМО КиКО Дю щи ТО 15
ХІМ ні по дян у
ЕК ЖК ЗАА дО З ж
ДО жо зитрох Ех пу нак в на а Ну сткм у ех Жорху жі дих її со Іа ЗИ У
За жі іє Ме ТЛ озаАлоОщяеЕ Бус ж Бех емо А се УЖЕ Оу н Ф чо т
КЗ С ак я
КУ Моди КМ рію ха КТ ми Жутюю ж ру АН Та Ля тез СЕ 1 шо У Кру Луки Ех
ММА ЗУ ОМА тв ТЕ тм У Дачі ій Бех са ЗИ жів у УЖ КК м еа мов с-ще щі о ке За
Уют ЖЕ Пед. Духу МУ ме А тк Жрусіо ГЛ столі жо КМУахую оди бах соді їец Вів ТЕ ОХ Ух ХАТА МА ЖЖ ду худ ши ЖЖ щук жКУМ М Ух щи З черв бу ло же бонті їні дій дек Ша б ча вже беж дк ща еко су кожух МАК ЖІ Ма. ЖХИУМк МУХА ба МУ лОу чо ж ех УК рот БК КАХ гли о ре
Фхечя ЖХЛ «жо дія ЖЖ а уж Жахат Сб м жди них тоже З Машу Ми Жокії ля Кк т шу Ж маш ах ВЕ ЖУК хшЖ мщАХ МУК КОМИ К Ж Без БІ Ко пря хчк «є ух 5 ТИ Тї що
Ж хв кути ТУ ж ка ую жк ку фо вач 10 и мо Убчьем г ех бла у СУМ
МАК Жив Крпзосбіу дв УЖ УК ев а ва г А ЖЕ ЗА ї ех ЕК ГУК де с ст
ХХ ЕМ ЛЮТ
УЖ ЗЕ ж км ЕТ ух УЖ да СКУ Лов ок о ие ше в НН Б
ТВО Бк сі, Я ХВ ЕМО ШУ ЖЕК КУТІ ЖАКА ЧИ ХМ їж ам са
І ЗЕ
КУКО. их ск І яю т ду я ММ ух но ж ж о що ЗЕ КечНи на Жоиммо Жкусач КТ, жк КТ лю шко мап оз АК дат ке Х у ФК Я Боуї АТ ЇрУш Би ши я ї ї зх КУ
Х ЕЕ ше «Зх га "ож МКМ лак жтавку бум Жир хаднує ФЛЬх в ми БЕ хх Ви Мои Тр ку ек чаю БУ Ме бек Су Буш Ді Беж пу ТУК ЖЕК ВЕБ ЖВЕ Ав СБух зе з зи сонну ну як жа лаему СОРТ шт те роя Жочуи у Зло тю МТ ую ток Ж Жонх ж
ЖОВ УК КО З шу а же же у. САТ У фа СМ Це Я
У ее пл М я пло Ха Мр МІ ху. у Сбиує Щошкину Ку Мф Му кцхо0ОТх кр ТЛ хЖокк ЖУК ех. му А АЖ УК ЖК АЗОЛУ ЖЕНЯ и АЕН МАМО СХ КО УЖЕ МЬБЕХЮ хгж В ЕЕ 53 я БО
Аж п ми ху пох ак Ше иа не и Ше НН у ІК А І Не ЖЕ тм мух ша У екв ва сл зи Ж ман мА ЖК ме ААУ КМУ Х
Х Як й; мм «м пуж ке ща Те їх ЕІ
Ки я і тт оч Ко кинь но ен НА НН НН НН Хе хе НЕ НВ
Ме осів Уві Бек обдес бе тк дек біфй дер одек аа Уа ФУ ТУЮ Су ср. ХУ ду Мом ХДУ ах Ужатую Ек паші. башт о ЗК ми ТК уинуя ЄМ дж Ж м аж ша
ЕКО Кб УК Ма ЯмеМ КУЖ Му вав ом о -жю УЮ КК о шаУМ Ба ух ВЕ яв тк хо
БУ ЯН БАХ с яка о ствіхя хх яз б
Хе А ре ХК ШО худі цех Уві ЖжЛу ВЕ ще нах зл
МИ їх жає йно Ж шутя бух М чу пух М ти ЖЖ ук ча ХХ Мою Зх Тл ле шлю жа Мед зна Ж сл ше ЖЕО Зі ЖЖ Бей век Ужща кжК вже КУ х щ жк р я З КУ 15
Ух он сш У кі Аж я НЯ Ж ОТ ху п НАННЯ мому СК кх Ту Мк іх
Кр ОощаЖе УЕ сах ем о -жеК СУ Же я ОК Її ОАЕ ас в ее А тк «М Б
ЖО ек 3 нн а ноя На НАВИ Но бок ни ПАЛ хх Хм ух ах Кітем Шут о Жодхіл. босі БУ і «М
На У КО КУ АВМ КОЛ Туя ТОЖ хау СТЬ ЖК КЕ ЖК ФЕОмАніх АХ НЕШНЕУ ак зо я
Жолтум ЇУчЧ ях ЕЛ а не и и я а а ян НН ни ва о Но НН а НВК ОН КОНИКИ мушку УМ ЖЖ лю ЗК Уа хек сша Уу ша ЖК АК же РІ ХХ Зеагу чо 55 «й бак іУ йевх сіУ ТБЖ АвровБе бе ба ББЕ жів Ше деж тую ба бує то зв во бі бю бі о ціУу МеВ ТУЮ Бре сбев ось зів Бе аа во ТжЮв Мис Ва тТуУК ТЕ Бве ШІ (бла щі так Мей бдем сім їй ту АС
КІ: ние «2105 101 «2115 118 «212» БІЛОК 5 213» Штучна послідовність «220» «223» ПИЕН1-57УН «4005 101 пАльЯ іх з вх я ху. "М МТ Фе и м щи Ятх. зх Глен А хо То І МЕ м т піч Уві Пік їм Уві о бек бе БЗіу Шіу їжм Чаї (ьа Бо ЗУ ЗКУ
Е Ж ве ї5 ех Аж аю ви бек Суш Ал від бек ЗУ Біне вне ек ек БЕХ
СУ ж ЧК жо УЖ ек Оу я я ки уче лю М жу кож ху ж Жодшдя ЖЖЛдя Лі духу фе
Зі Мех Мі ТкюЮ Чай вса пів лів Бк ЗБУу Був су ен Січ Ткр о УВІ
Віа жу Кіш беж бех сі Бах шек Тис Лі дес Сук АЇЗ Авробех Узі 5 55 5 ув сі дя вве тн іє бек фу де дою НК лев дує БК фе вно
Ех та п ви
Я ил КК х реч ще вКх Я Ох М я г ур ще хі оч, Кфіж ух як ЄМ тит їм біп Ме ТБ Бек о ецз вч ліз са дар отв дія Вес жк бек се. ве З З г: з й і: М ик ко п о З Но о НН а А о ЇМ я СЕ же
Між вка сьо вів о тТеЮ СОУ беж бек МеБ би бух Тк ошіж а бу ТВ
ХО Тс їх5
Її УА ж Мак шеж се 115 «2105102 -2115108 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» ПИЕНІ1-65мі. «4005 102
Кз НА Ху Мч Су че ее ХО МУ ух кн нини СК
Зі діє Уві Жециї сбвж ск сек ЖЖжОо Аів Хв Мек беж ТЕЖ ех Вже су
З їх чо оц щя роз ж ОВ ро нн Таке хг ень о Не жор А и Мскуто ХЖх хр Жан р
МЕМ кож ХК У СаО МУ МВ Вів пек Зі дву ві У ВЕЖ дек
КІ «З КУ
ЮЛ АЖ В тазу сукня й жк их З пе тожукх Же тихо ві я аку чн хто шуля Сл за жа КЕ СУЮ с АК му Бк У щфАт еЖ БО АжОа ВАВ Бен є
І Беж Уа
Уж бек х Ма же бою ушю ори Ж уде доку рак т бути КЛ лі Жумаж о Жібувю Мч Кар ж
ТУуюк МевкК діа беж ТУ дЕч бек Бек обі Уві БО ді джо Бім. Тву су ї ке ме 4 У їх З во ХКІХ ще
Стодюю Є да бачила х свіча муха Ж А УЖИю о их чую Соду. Кк ум Ки ЕК Суд зе плуУу БЕХ піфУ ЖД Даю Бі бле Ммео тп 3і3е Бек екв Бек ска ех си нн в в Но но НН ач ОХ чо уми ум мул Жйіусмкю 0 буде тіж у
А ОБ У їх поміщ ста реж Вб ож В А СТЮ ЖЕ м ше а МК Ех
ЕЕ: зо я ре на НН в о на и НН Я Мои. КО З Жди Кути ик о БоФжосіу бів іУ ТЕ Муз Ен бій бі Буш ух че її кт
МАО не
Ук хм був уУх То жи ТЗ ехо «инах Шк МТВ в ая яю ше то жк фе се АН
Чу Уа с Зеюе жю с шех У Вів обі Уві і Бут Ес пі Від т СЯ Кк. т й 7 М ог т 5
М Х шою МИ. тла ж ток МОНО Ж: ех тує жо. Стах Ж ях см дж суб ж мл ши я
ОЗ З М З НИ ЖЕ ому АВ ОК ОО У ЖУХ СУП Сет Ще ї вя ср хк ух пе і м з
Чем Ки ЖК о Ман ух ХУ ложу у ому Тюуче ока АН НН В НН АН НН ЕН НН На
ТБ Мей тро СТЕ МОЯ ЛУ сф ар ою У А У Аа Я КК ОО ЯМ ту їх док ях о 45
АН НА ло Ж ія ла Се Бак ую МУкуує Ж. тах там КТ че пкх тую
У УЖ Каже дет МБжОа Ті ШЩеж 4 У КУ дк ші ух ав оса ПУ БИ шт ше с
Ма ТК шт 1 0 У С го пАЄ пт ку т км ож ху тиж «г Б Ж С дж ННЯ су че мух жа Ех т охУгх чо мі сур Во фаджу Фокса Шок шує БК Мк Мк
АЖ ШЕУ зму Ма БК шли лів ВЕК лам УВК жк Щек ЗМК лад ГУ
Та т ви дан З шо шк Ду хке си о Жожхах ку Мекку А у бом ун М лу в три сах жу
Ма біжу іно Баш ех їм; бах ех са йшю ж дів УВА Ух Жук С У вх за зв лот куда чн чу Ма тре кує Я 3. М жмут ДЯ Моз тр юж пуєух З юю Кк
ЕМ КЕ А м у АВ ОО КУМ ХА АК У БИК Ме Оле її Сак уж Боохналю АН шк до «їй
Іс ее лок тлу МЕМ «ие З муку Кі Тіт М
ОА ЗЕ Я Не а ЕХ ЗК НМ КО ММ З Я у З НК я зоткгх
М ку
Б змо У Ми і ке ох» сем. г. з хх жо пе Ух - ту, г ра хх КО тоже й є Ко нн но о НН НЯ вх. їжи шт жу кова Кал г Її Я кро є со ВМ ЖЕК о с снаю юЖжо ях ме ЯМА ям м хе жо А
СІ с чо ц
Н із НУ ТА х ве АК Кам ря бе її су Ки М В зе сф еми Те З ЖЖ М: ех СКУ М ух нує Щехх шо ля УМ. МАЕ А КК У АЖ які са і: і ке ЕК и на НК ЗЛ я и ЗМ Я я -к в
КОМ, ях Км т «дя Ох тоузчч сума Баку А кі чо км й уже до ряи Ж ух Ше їли ЖК жа ства Ж «і Лу ша АВ КК ОКУ МО і. ТОАЖАТІ МЕ їх т У Ам ше М сЬ шк ШКЮ мий па Ух ак яп ку
Уха хх Ки З ду аа Мдуку СМ шлю СМ лу ха КАЛ хх ху о ша НН Но НН НАНУ
УЖ ді ща аж пЕЮ оо МАВ мВ За у ща овес ск ЖІ КЕМБ ж шу дох тк шоу
Б щк Го Іі: лив меч ок ке а лет, м Ал Сич Кая ж ж ст «М Ж з пу с
Мас ТУ б КД хх тра ж Пк кКідУМУ ок ах у х. и нн ННЯ ТЛ сек лу
КК НА НІК ЖоХ Ж оз Ж ЯКО Ки А. АЛУТК ОХ ії ща де зм ЗАВ п сх ер мох
ТТ В Ку ред
Ме м ЕЕ шк я йому іх: ЖЖ хм ух Мк мує ТМужує фах ТИ У нка ше ня жумсяю ки Фет
Ам От ЕК уБоУ де УК ж Св АВ ОВНА ВІН ДКЮ ал НК ЕКО ЕЕ по в з тує тури щу и дк яхт Суди У ж ніх -х - мя г х ох кре при їх Оу Кі хх Сбпвуує то їм 144 Сх хек Дюету ЛЮ дз кри і т. жк ЖЖ зу жа ЛУ ще СКК УФК зма Ам ОМІЖ вує де Я УК АК А ів щі їх Ук Се я ду у ма Бе КАЄ жк хх ях їх меті тії 5 з су ка кч ЧЕН п жетя й чх джу Мово хх і их ЗшУ ем Ки зе Ан Я НА ННЯ ее тд ЕЕ хх
Еш СКМ Ж ж З Є ше КЖжс ЕЕ ХМ КН и М с КЛ шу У я ах сука прог ї г ОК Ох
КК М ас хлоп ма зе жа ТімУх о Зх кхих. Ск тіж Жжмі Жду ом. Ка му ям ж ща ША ЛУ ХХ Бе займ АКТІ виш КІОСК КК СУ АК 4 ше ль З ат кю ВХ ва
Мошажя йо Ж охж треки Ж чи СК Фелм ЕТ хою Те я дура а ко Міша б юю т Кхух ж З То тугі туї яко бно р ми тур МА хода
ХК ОМА ЗУ СКЖІ АРУЧИ ЗМ АЯЖО МЕК Хкалує ХИЖІ мим НУ АТ ЖМЕТЬ ХМ АЮ БККО
Ух ЕЙ ща ам
МАУ 5 ї55 їв боку Же Мн см ки Жим ж Фі ше ож бух. «іду Ма лучан дя Вк Ж
ЯКЕ КК ЖЕ а ЕМ АЯХ ЯМ МІК ем ЯК МАК У по У Ж ЗЕ МЕ ше з Ес шжеХ туту
Кая Хе (М КЯШЕНИМ штир Ж дя МУрує Ж р Жука ми за І оо Не А НИ
Уч ЖУК мем ол зма МБ о вув дер КУЖХ с КО г А ОККО Ух зда ве зав
АК ДО АЖ км флеш ХА Маю сту ТІ 2 Жов ММ демо мо дТкУує Ху Сл ко ху ТххУєм сс
АХЕРЖО Жук їх ЛЕ Ніл шк АЮ ЖК ЖРК МЕ КК А МА мух м дос рих суд г
Оу У хіх Му «Ж хі «ТІВ
Кк оз Моска фаху КУ плитку пе вва ока ви ом СЄув «у
Зк
Мох о не в и АН зо ж ну ж ам вк т Ум я фр з - Жчнтх Урхм Кхв ху Ко ра ле пут щи ім ЗТ. Ж іх лю 4 жид ж щ о ФКІ фКю АЮ СЕК І піп оУМВА ІМ фам Бім ау бек ау В м бита кіз 5 ОДУ му вкалм
Х сх МИ че
Ти ХТО такі Жах мн йбю у тим Ж ек кв рук стру ж ср дтку Мих хх
ШК ЖК м БК си ЛУ КК кА КМА КО Ах Її мя пк ожила Кг АЖ ОСУ ХА 85 ШЕ 35 теж оЖаЕМИ ОА Кк: тяжку СТ о т ук Ж но Жду Ти їй Й но хр жду МАТ них ж
Еко а св ОТЕ БОЖА гум (3 АЖ ЖЖ БУ АК ХК Яма ІА КОШИКУ
Ук ох Я
ЛДЕ Б СХ іл у ро пиши Жуки іму ЖК пе уч х моде М тил ух У схе го па ук їжк Му ко Код шу фу Мчч Мр чи ях у: Тіз зБиУ ів ле бує жо СУ вав Ба во Бех олияч беж Тв са Був Бр
Я м ек
БО Б -О ток ЖЕ ж меум я ен Не А НН НК а м На я НН НН На НН а муш шу амуш з щ Є ММ о Е сема МУ БУК ше мах Є УМЖ лк Ух шоу: ск «р гу
АХ КО я по
Б на З НШ оч НК смкун йб аю я Мі Мч У о ж сухим баку
Я Те ха хх Яни фару с куує Як СВ зу ще хо щі отИхх ра бе пі (ЗАКО Мами жна НИ Ди КГ же сля А СН жмОо Ущ УК МУ щіх - те що ЗЕ ре ко НН о хи ОН у нан о о ВК НОЯ що ТТ ею Ум Мом
ОКХ АКА ТИН С УЄ КОХ Гм ад МАЯ Ом ОК їж ЗІ САЖІ кт ле деко
З МО КО ха тку їж раку и АЮ ЗАТЕ м Жов Ве ти люк їди так й пк руч ток ча ж о Бек лів йів це ДК тк мБжОо КжоОо еко БУЄ БЖ ги їх ув зх їх ох кутя хів Бо 15 шШек ойіз дів ів о їн о дк Вех Мей Уві тк їні Я бо ків ЮЖО С си век ле вів ща КЕ Аа шеК Ме о УВІ. БЖ їм осуу УК як дих чок хх зак ді
КК я й КО й сю мо ик хе . ге ел зе ккд м «кох треш жу 2 січ ДО т куки сх СТР МО вен ха шли М Мифухи упро ія сін ну Мах дну
Те У МЖТ УА М СК ТВ ЖЕ; «ую БЖ АСК пкоедл шк ТЕ КО єКкМІх. КАЖЕ Х «оду од зу чо ша п 155 за ях Жуеах бабі ШЕ МЕУю: СК хух ві Міщв Сб ЩфЛЬих Ст дів зму биххі Т1зхї Ще и с А Са В М ЗВ хе а В НН А и п НИ КО В М Я М НЕ Ж М КИ В А ЕЕ КИ З о чо меч я «ЖК З ке
Жогієч о Жонугту СКчмує Мр Ж ошхії Ббухух о бзичи Ж куу її ран КА буті ВУфхщя бум ВЯкув Сех
ЕМО КА ТЕ ча ГК Ж Тази БНхю даю екю Укі ТвкК о Уці бує Кр дек Ме КЖ її чу то дк
М АЖ ке о но НАНУ В а пове НН ж з фо і С ИН ел Ж ду уд ХО лу сімю ху те жо сек со ба Ущі жкЖ СУБ ВИ Узі йо Ів БО дов век Бек жил
МУ а ах тодом ЖУТЬ жан Жак лю Ж що що Живи Між би Тир бхж дві Мох даних пк ще ОМ ЯМИМ лаУХ му їв 'Уучі ККЗ АХ Ша и В І в В Во М ЕМ ЗК тих туз сут их ш ші аа под жа уки ХЕ Фкечу Ж я ЩЕ чию ок км УВІ Ж ко 2М и но НИ
Ка Су ТПЖжЖ УМА Беж ж а ії Бек беж Уві Бе Тіш Біне БхеЄ Бр ї, У а тус ль Ух Ах кіт М УК км ученим Тех ще Кох ї Удукя Кум СК до Мч М му Мах Му Кожух що ур раку ХК
Ех МУ мер УА Ме КУ А АБУ вшУ АлЖ о ЮК МУ Ех пх У умо А
ОКУ З Ме во че «М хуй
Беж чт Ми фі «Жим Ж дя ху: юшку ючих 0153 а У хо их Чую КМ с ій щу Нм А КМ У ММ БУХ М МЕМ оіА мЕМА ЗАТ Бе ще жЖ уж КлЛле х ВУ КВ х х п -- КЕ «ЕК це УК ТУ? ши ХОМ ша ее НЄ оку тя й КО ЖК хо кін С Мая іа Хр я ям туя 4 дя ча ж НН У НО М БЕК ЮК ДАМ ММ ОС КІХХ АТ КУ ххх ОМА Ку їх тку лк п «Ж МІХ «ки хо ХХ
ТТ жу ОШХВішУ ЛУ хр, база ре ЖАХ Уже б З СЕУ МІ и їх деку їду МІ сх шоп е бБбщІЗ їЕМІЕ ЩІК БІВ де роки ВИ ІВ БАК ЗА А ВЖЕ ДЖ ВЕК ТА тей ух зиа
М ОКХ МУ и очах ок ша и а нн НН тремо ХУ ям баку Книу У аку шує М
ШК сам жа див МН ОКУ му КМ ю пе С ж СУ ш ВЕ щу ВКМ МО Ба за ее тю щ жде ї55 51 З ЗжМ
Ок ЖЕ Сукня УЗ ня же Мая Жодкчмо МУ ще жи чн НМ и о В АН ННЯ і ББшж ско дів БжоО бів бій Бу ЖИЖ бо Бек о БУВ ТВ Буш зу Же вач туту тульц ее Ка: чи ох Мі пу ке Сея Ел тіж ТИ М ду руч таж м Ж учт. фТоджу КАЛ юю Мн мих вЕОо цевоАів жо АВ У ЩеЮ СЛЕ бля ЕЖЖжО бе шхев Брук М і Ме «т дк секов
КЗ «КЛІ с хх т г Хеує Жокжмах ЖК са Жак. Же жк Ма ж де чу М ду Ук ее ще ліз БУЄ Зв бУуз Уві БШешх цем Теж Сув Меб біє ТВ одДею ВБе о Ббе Бе
ЗБЕ БО Зо ож и ше н тремо КУ у муку хрому ху ока Ше ее ее ше КН Тркзіх шо Аж ее КЕ еВ. А КК КМ КК Ю ЛАМХ і ж кат Бу ла Па БВИ ик ух зх бу тю Бе ХМ сркжує у хіх ше ую М як сич т ж Мч Хм ку о ах а хх діди Мих хах ЩвуМ с щ ї Ух ї ЕМ Ех ММ АЛІ Бусю та БК дк АВТ ж ши фу КЕ У зр ож а Кк. хх КНУ КОХ БО
ЖЖтжхає о Єви Тож У схля Ж ужух А. ЖАРУ токах рн нн ха Но и Но НН Ко
Гук овфеЖ ую фа АБИ УФ А ую сш ЕД їх бід дала фе Аля ТОХ
ВО КЕ ВЕУ суди Лук бух пд НУ тив Зх газ Я» тодУугі ТА ях ую ЗЛ хх МЛ вхо СЕ УМ БУВ ве Жах Се ох ЗВ дамо ОК жЮ ф шаУ ре БА ОН що Ах
Я шо Се
КНУ и що го ІЕМ ох тек. ТК их па НЕ НА
БУ в цЕакюк пев щшеюк МЕ ОЖНЕЖ СО А У МУ долю код
Ах мя бю КИ дО ТАТ я дев Мхя А УЮ Кк дю Ко ШИ сек нм би ті сл іп Кажу
Ями Ті ЗіБ мМек тних см Бех вКОе вів Бех Бем шах У ек УВО У ї 5 15 5
КУ ія рун ХА Ян СК Мам фсхкщ Дати в Кк ху буда шк Вих Мая 0 юрта
За бах мВ ЖИ бі сис СУБ Б іа ше Бай ват де стУЮ ТВ дев г тр зх хі? МОХ М
Жду Ми пря буму З Аа в нн кн «Тим Жраиуит Ж о ж т 1 мезо ЖЕюЮ УЖ ШТ А Б шаль ру пуд ЕНН БЖ ів 'їє їжа УВІ о нь НИ Ше Є ии Же хх я бос ЕТ кош ач с р ШЕ ХХ
ЖЕ УЖ а Ж Ж ЗА вМАжа АМІАКУ КУ Бах» ймею юка Бім Чек са ща ЩЕ де ма ХЕ и зді Жду дива фл ді прю КА ви пк бно похжа И біжу т Жака Тк ау
КН фам НЕК МКУ АК А Ж Кн муж каш мМ ха ж СУМ т Х ру мере я ек о КВУ ТІ а ту щу Мун Ж де гру Па ач пк сту хх З 1 ж ЩЕ жк Жувех Млуєм: 3 Жчучи Пюмиу фе
Ах в Же бі ТВ бук ТК ОЄ тв АЮ о Нів Бе тив Уві щежЖ БКо Ух п що У сек Ек Гоа не а у нн ак У и ОК М ЧК Кая Су дві Хаеест Од реко Ше Шо НИНІ
МІК ХМ Ом КАМ Ох КУ АЖ МУК НИК дО мам аж ОХ КУ ЯКЕ кю вк
МО ва5 КО
Біатая сб ла Кия СТ шк ЯМчку їічет фази. Маму Щеху аз ія шу ярах ші ЇОу хз Ще УЗ) шк бі Бе БО бує Бек Беж жа ша Бей шик Бех су чо чех ястУ
МОЮ ау МО тре Ка баню КА ща бе БК рама фот ща бід: стае фут Бл км. Кл шу ба кжж КЕ Уа жа Су пе бе йай НЯ СБ т УК ОЖ КК лук АКА ЗОМ ХЕ
В М аг
Ки х ж У Уху в УЖ дуєюжх у: що ЗК шо У ою. СЕ их мо КЗ Мк Ж жа КА їх дю ой Жокалї богу ? НЕСУж тую хакі ок хі Із УТ ж у су хо згду Кок
ЗвповВвае НН Її: Ук АЖ ИН у хна ю ЯМИ ов Де ЛУ МЕ. КА зл чех а зе
МЕ 5 МЛ жо бажу Ск М жеутю У їх ехо Жду Ж не щу ше Ж Ді Ми УМ М ух їлдиде биду ко Фу
Авт Щек ТЕ оОБЦЕ Аа ав ВЕ Бех Був що ев де УЮ ек ВВЕ вБеу дяк 4 трах чор ке їх 5 А
Техн МЕ Ж ор Учня Тх ту. У ку бохо о Уа Ж бачу З їх Мт хе Ме щ-еШ ЩИаЖ їм; Таж ід Жах БУ ЛЕ Бо МУЖА Кс рев км х ек С юшх їх чек з тук ще ЕЕ їІ8О
Мфічео буку хх У і в упак Я ах о Ж Ух Жду рек ба Ме Яра лю. Жду сх
Те Су За віз Тве нів Був ЖХБУ бек ЖБК ес Бо їі Уа о бушо де ї155 Ка; Ух м их, Том Хоча рН ОК ст им
Ірішу дюхіру Ху кт я Ж шКВІ мишу М ХХ МК Ох
МА мок: в хр ут пох ях шк дк м Фтдут жи фу там жому КО лю буки Шемчх Я жа Кз піц Уеш ат без Сл Са бек осі Тв Уа їм вів ВвжО Бу зо АЛ -х «ех я ох,
Хе А боками. Кл ин о На НН Фа рю нм СК Ух Му ажщро я ще О УЗ му БИ ном сечЕ шу МВА ЕМЕХМ ОС у ї УЖ о мУшо шЕВВ ХЕ МУ туїх ск ог
У МО АХ ХжОКХ
Уїсдчух Міда бі хає базах СКМ Ж дк КУТ у дет лучних З «ее РЕ Фе Жахі: КОТ аз бух хх
ЖЕ Ме ВУЖ ОО ів 5 У АК АЮ КК КУ АВ ОА У Ж ТАМ ОМ ХК
ЗО І с
У ди В ї ях теж Мун у СУ бужема сЖмочи ДК ку ен на НН НН НА ту Х
МУ їв Ліве Е Бут рі Яштрсввик дО бі ТЕ о бУЮХ ДЕ Їжа Був Бе
ЗЕ МО ви
Жди Ух фл ЛЮ що То. Туя ух М у ау яю Беха ЗУ Мат УК ХА сти зу ли ХАТУ ЛНУ ДдЬосхаох їх м КАК МАМИ Оз ми МІК и З АХМА МАМ ОМ ХХ хх
СУК Б З ще мех міх хх Федак Жошху УЮ ахач (Му ух. Жцмах Молю ЗІ сбадує баки г кщ мес шЖМм мА МИЖ ОжшЖК ше лю ММ а ви хе ка УЮ УЖ УЖ УЮ вк чо ЗЕ ями я хх дру. КЕ 2 Жук чу Ж ж Ж М Тут спеку брюк Ж жк Сх у ЕЛ ку. ух
АХККК Му ж маше ЖК оку А ЖНаУ До ОСИКОЮ ТО У Кх з ха ГХ
З що Аг ех ог її 1.33 ж ю не» А
Сива та вх В су ще АС ОО бак ть нях В ї ху лечо для ЗЖщЮ бЧіххує трюк ку ме ОН я ж КК ЖАКА ЛЯ ОАЕ Кз СМАК юку М Б ЖК чи прю доіу 145 їх їх
Жозе кУШе знак вич ЖЖ хх я 1 є пови осн ТО тих. Жах жи Беха Жора ТТ юх
Ток. Мод уч ж: ТХб ях ух тех ТУКу еф Ж ща Кум Кота хх пев ол дА Вис Ви ЦП ри ми З в с п о а Кп М о я В В ЕЕ ММ В ВН І З М Я
Зк ху зах 3 15 Ка пуд туя КУ жуки дю жу Бура хктим ЕМО Же СЕК М Кк фа Юа М ох шт дм Е ї щих Я хх ня з сх т ТТ ит У Н у сх зе сх
Св ев; Уа У с щу о вВпш. Бжо си Бжо УЗ ЖаЄ фа отв ТЕ Дав та за тек кг не ї59 ДОЛЕ жвшУ ше Мк кад то Ждтяо фідж вм вдя за. ЖІ до МУ ФУ Мене у М ха тах ж ах ху мих мм ме ФК Я Хе БО БЕ ве БО вів Уа демо сш з асеке дек 1 за т зоба ь ум Ж оміх бпйжум жу кое ке фу фл хи стіл р поч сшшекч ок У о а ОО В й З М У ВА Зах З СХ З ЗНМ КУ ЯВНИМ ЕМ С З ЗК НЯ ТО ЕЧМЮ БНО СТЕК
Ал чек чо щи а п ж бек Мем Жду Ех дих СМ М ку т хх ща З де о Жркче Алоао Мука хх кжшЕ шЖжЕ ем сах Бек А п Сук ям ща ВАВ ОБО БСК АК КО Ж фол сухе лю, т тк: КК їз щи ЯК тУкрж Тохуєх хуя гаю Жду Тл СУ и М буряк Хуан їм де Клаєуч УВА че СКОБ дО бак Кудчх
ЖК шум УА в ММ мушок Ам КО АЖ ау ЖЖ МВХ фа ший КО чо «о хв з ; ах у
М кА ММ тлу Шен Жуля сббяугх Жду Мем Тих СТ о зує Мсуєх бокзяя фам Фах КУ ах біжних пудру сумо жКжАХ КЕ СУ МУш СУБ КК Зі Ко вшиа мем Ме сАю шу КС ме Е пр лі уд зт а ие УМІЙ ЛУ УК да ту чи сть Жду прути Ж ож шнт ге Уха шт захи Вид СТ Бач чт тк з Тех Тем кути хе джхй шко Жук ду тах ев ВДЕ СТА ую ох
УА БВНе бе Би: Бу БК їх У Те Мум шк хА бец о Меїбї ді ща БМ тк гущі сто мое ЗІ хх
КЕ М «ТЕТ се мим Бо та ЗЕ т же Хі З. Які дез а бе Та: Діву ому Фекоу ох АН я ОА ЕН С и о УЗ СЕ ЗЕ ЯМИ ЧА ВНУ МОожхВа АТ КАДМІЮ ВИНО КСО р: З 5 їх
Кая вч КК
УК Би ся І «БУ А «ко
Фах Южне ртяхух КМИН са ак НИ кі я кю пріо
ЕВ ке ЯН С КИ МИ Я СН К МО жЖУВВ УА ММ ЯМ ЖК МО УА МОЮ ММК РА дит Ми п хх Кс «ВЕ «УКХ
Уж Мф КУ жу мах Ж Ми. я Ж 0 Миші аю ЧМТ яю Коля Ман Мох
Ат САТ А ЗРК БО АД МАЛА а УК АЖ я АЖУЮ УЖ р У а сррих дух че
ВН ВІ по тка А о жа Кун Ж ку їх фік ЖУРІ іх Мун М бін Те У ху Кая ЖУКох пек вів їжа ко Хі аб нів б аею ою Ме ск Пп.У БУ ба БЕ ее ха ТВ ЗО
Чоюхаю сбХухум Жохккм хХткИї Молуєу МуюУ Бог дак У хі лит МОБ ше ву ї7 5 дами ЗЗБую ше У Му БА МАМО УЖЕ Бе - в цем Куб ЕВ жі ша ОКО ТпЕ
Уйх ах 335 ще гул ох Де че пон ско ; су о и чи шк доку. ТВ уче Ж ХК о ша КР може М, жо Тож лу їщхле хіщ У жі
КАЖУ М її: УОАЕУ За щі зи пів вища шу ки и НКИ тку чн адм
ХА КН ЗБ.
Жручню буче ичині КЗ о ско тб Ту Та Хв хх ах то С бек ах я тир те гі -х 1 я ІК ЖЕ ІК А СН ННЯ химії гх КУ
Бко Бас БЕЄ ім сам ос Ме Бах У шу АТ У УЖ ММ КМ СУ доню зу рих зи БІ КІ
Машню БЮ ж чн Мой З «Ж Жажекм Лот Ану СТ до бююкух їйщо я тр ТУ их ок ух
Ве їж Ії Іа пжЖ оце М ГУ ОО ши КО ЖК Ук МАМ АД я Ох пі їх 1 МадА ЖК: кі уче бог 7 ЗУ що йо й хо М ожхєю фа ЕЛ т жЖосзяч сБадуя Жов Доу ТИЖ ах ІТ о фідевм т нхзі опу
АК (М я УК Тпжоа фе; зва ТУухХ М твОоАЕИ КПЖ М тех Во мем ме 3 зх уст я 8 за Ежен Зх жо поет гу сан иа нь Не Ки Мдехміє беж лем біжу оп але Хілл АХ ют т омаху ЗУ цеж дею Сі У Ж Ам ЖК пе оМеж бух щей БУ фа ахщЩ мВ. сам о мую БУВ
КО і АН
З утуУю ее їм 88335 ща ща Ме ах Ж сті дор ХЕ: ХК жах ж гу БЛЬхУ ажшхв ж мя А ЯККНЯ ям ЗК ААУ ск СУ ве Ук жд дав о ау ат спот су
М БЕЖ 5
Же мя З хеяк Що очне сть. Міда у «кг сх Ух ех ще зу ще м. щ іа КкрхІ ЯМ: ВОЗ В гр Ме АЖ 0 Був згід іде ФК СКУ Мем Па бле мец паж зви о ВОУВ бів Ж тк муж Епш -ежЖ бич ЖжвХ Бжо сі КУ
ЗО Ж НКУ шо ж дл хи с
КОЛИ КК ча
Фото КО ям КАТ Ж т кі їх роя яр смт - Ко ке чи А у чо
ЕК гоже М щОЇ пове но и В о Но зу: ТО: Чу са Фк ЗМ ті 00 Гуде пед тек АЖ М Я МУТЖ ЗАТ с Ж 0 КЖЕх Фо ЖЕКи бутах ше ІМ жВЕ Бе КУ
АХ Хе хо їх
Ффтжмі уче ХК Кі ухчи СРоух хну вжи шкода ще шою чи Уч Ж че дясежокю їх МЕ б сів ому Му тк ща хі 2 Кі Лк Мотеку тб бухшоку бухт буку
УК ККУ а ше ММ ОО КЕ УА Ж ЖК КМАЖА йМаТ АОЖР я ЕМ КО «им їх спору хо а КН
Жоамц умо паю Тра БА ик проку. Ставки ух кора п. удо п уза ТК Х то Та бу схе М жу ря току ско я ах їм ен НН ді гл емщ назв дих КТуюх зай БІВ КУ шБеЕ МІВ ії бек ре печу їм їжа тів р х ре
ЕчКЯ а см па ЗИ а ту
Жов ак бач ху Жде Фо діл шУхУує ї хю СК Туди Камю учи ТИМ гасу МА Ку шу Ку Ві їдаежЖ Сов ек о УЗ ех оСіУ бі БЕоО Беж вщЯ Же дек сет хх цк: пот
ХМ ТО їли аж АН Я НН и В НК Ноя УК Ху Коєхії др Ж Фумух бищнух І Тл ат пе фіч
ВХ ОКУ БЕК У М АВЕУ К Ве Тв бен бек Кіш дев бах ді бі жнЕ
ЩЕ Та 5 по спо дар: Ши жі Мак беж Юта ш Вк ов о їчаж ще ями Трек ж» ЩЕ
СА З КІ АКА ОТ КВУ АЖ ЖК шо КТК г шою АВМ Од Ж МЖК ТК я МОХ
Кутя юн тю бужудю в за тв кю ж кю три Кок ом с З їси Мч що я щі д
УЖ ТИЖ БІВ ОА у Ам У їни БУ ід ба бі Уж МЕ що ВИК луку Зо 3
ДАМИ КАК КК ох. тушисах стру т жхА ож а нн а НН Уч Фр аж КАТ Ж юр ее ня
Адю ЕЕ ТЕ пе ма ча фл БЕН КБжЖОо Кф жна ЖК М цю з Я Ех чт сл Зк
КО дощ М доли трюк Кі чу що ок ние Ну фея дан ОУН Жак Мох Ух иИ Мочлних чених СКМоуу 0 Маму ша У Аа ши На УА СУуФшовне лечо М ща Клео сюжх Кому СЮ я чх зж чи
ММ «КОХ ЯН
МУК ЗУ жк ни на Тези Ж ож Ех буму юю ми поча у нн ау оо НН
Тіт вна що Це Тже СБУ Же Ащю У аж ла Ух Аг. дат у Ух
МУ Ми 155 Бо
КУ чо «хи сткжеаху ОТІУВю же Дік АЛ ОД км Си ає о Кох Мекку Мом Сбфеже Убухаує «Ши кі:
Ма АЕН ше СКК УМО УЮ АТ АВМ жк МУ Мо Ж ЗПЖ УК МИХ МЖК
З Ки КОДУ
Жди «Ж«Здграз ббкюує Жосзх ЧТ У жух сі ух Жде іш «у муки Жук І У сх Сешу ек ек бах ба ТВ З ТВ Ук ЕМ м УЖ с дк мив 'МмлУ БЕ че довге ру
ЕМО КЕ їз
Тфжуч СТЬ біжу їх М зх чт Вк Ж жах ТИ, БК «у -х тк вч ма я еЖ АК ОКУ ХК Я їх НІВ Деу МАЮ Ем їКжЖ о дет БкОо їі Удфі ГУ Е5У тах т тут
КЛ ВУ ші
Ки ЗУ их Тхчииж с дк Пл Ук КЕ м Кт Є АК ВЕЖ іш ГУ хи М МУ божих му ТО шу їду ли Се Фк й А ка жк уж ХЖ ОХ я Утатам Ма м ж ке маше ШКО Ж ОА Уа ЗМ УК А У Сх. ОН З о І НЄ жроКжЖМ А У АМУ
ХМ ї 15 5 пхюхе Жук о їм хр ее Соч Шіскюух МАЛЯ яю Сами М ВУД «Хек СМ си ХВ век Я муш ши шию БУМ хх АВ ОМ су ле КМЖжо М жна ех Де хх З і: зов че сх я «З пу
А С ШК Фрукт ОЛонИМ ким С. Фати СХ т ско Ми Ж ошух Є зя Мулу хлкію ї ї ко М ЕЯроєхо сте іти Томи Ст Кз же ЕВ ті. Тахо ЗЕНИК Пп тему Хо Її
Ух іже аж пла же ОА ЯК КАХ ЕКАЧИ БТ ща КуУуюЮ ке ДЯ АЯ ККЮ ОМ ха о ре
Жено бжжає СКЛ ях іде Минув дика Зк Мун КО ие су КЛ ох Му ХК якідв ЖЖ дО. ЕК ФАК У СРУЖМК ХУ СКК ЗА ІЗ КО КК а БосКпЕ о ха п - оС вУнАннЯ Жука Мк с КТК хх, Ха чх Точних Ток боже Фо мя босих. жим вия Ток Кох
Укї г шт ЗК ях Кобух фун Сюєть сухі жі Ех БОКУ які В Код У
БУВ бу КО Бім ТЕ бо беж Вдоеч емНо ЕМ ек ОФфрУл бУКЬ ЖК ЗУ. Бе
Гм Я ЧЕ па
Ак хм ТЕ мш боти Ла Ма У, йХити к - Е ке ХХ ож МЛ ЗАооджт тучу М и ни ни ня гуї зач ду УЧ буди по Хе е ді Її л55 сах еВ ю хх зе я
Бей Зінз мес ТБ дех їец дез ек пів Авр ТБ АфЯ Меб тк трек ув по сю хе її сг З хх ве «Ж жо пк ї КЗАЯ я. м 1ух. коня я их м а м пи сь ШК ух, є куч АК меч ри НИКИ т що тет Єїи дів ре сі де бак омМеф піц рек бр ші п пі тьу ів Аж Си ва КУЄ ЗУ Зежш щшежЖ МеБб Ба тТею СУую Бе см У БИ
Ви ша леж
ЕЕ їх МК ду ох т Ту же хх МТ ХЕ св А Тед З хе тигра кока В Ж т то дн Ху У сх хах о Щі я
УЙ МИ АХ шою ОМА вн а м ЕЕ, МЕ о в кА и В, МЕ ЕН М о М М І МНН НН ОК «че доку 4 ге чо з г І
ОМ ж о Куй оку М ЖУюч ХУул їихе ЄМ хо Зухику Ме тку уз У я их де ху рах ТУ шу КОЛ ху їж МІ ВОККО УДО ЄЮ жк АВК М ЯМ КК ХК ЗАМ КН Х ВЖИ А ЖКККО КМ ЗА У аохр ях хх ЕК
МО їх їж
Кави Жах ХХ жах Ж м ун А Же ен км ст - - хх ухх сх жом - ех ях х; ди мех іх псуту др ббкрух Том: не ума маку -ш КА МК МУ СУ УЖ ЕІ юс БА МО ЕХ МЕ СЮ да А Кр МТ
З ре чи щрогохх чоаж й ож ке що и» ху
Ло ЗО алУХУ ії15о
Сб 8 Її: КУ ткож, тю ей ве а У НИ сх ож пох. ох НУ н ЩЕ
Ж Сі ЖЕ ті лю у Тк АЖЯ кх стек Тл с нь а Не ие ИН В ЧА НН ма кв км о Кк м у о м М М ОА М ДЕ и НУ ВИНИ КИНЕ ЕН я ус КО М Та СЕУ в у до ох 7 пу мо КУ ОР
Фо ям АТМ М дя Туя А тез - щи ук: хх КОЛУ мух АХ с ну т Я
Ху щу Ж овії ее ся Ж Ж чи им Ми ту у їх ЛЬ дідуха ух Ух мих о щЕ ми МУЖ ТК вм Ж УК ж Ми їли УВУ ТО»Х Бех пек сн пух сх хх г хх хи З ект
Я З іо
Є Дух и нка НН Не В ОН КК и НН ЕК ОЯ в ШК КВ шаную АЛ ми М я жЖжЕС КК ОК АТ ще КК ОМ А М М МОЖ КІ Азію ЧУЮ НК ту ср кру
АХ ки ЕОМ сте т хх Кам Жояюи ов М шок хи Що Ти мае Тіма СК - ж
Е Уч УАЗ Ху ї якщо ТІМ б шу МЛ 131 Ух? п ях зт их ПЗ де па ух
ЖККЕ МУ ща г ому му АК ЗАМ ЕМО АЕ що У ЖЖ ХХ ж А КАК тах блок талу
КЗ кА «ие
Кок: т Зк си и - ЛК ххх. У теку Ту с піл ук вчи М г У яти їх Ся - хвж ее Ше ск о бе ЛКК і Шут Ах тд їоваї (11 Бур др
МАЕ шк Ж МУК мВ У БЖ УСЕ Бук М Її мА у У шу ЖК гу з - ВЗ З тру: яко ву куту з кж
Не еьжУ «ЛУ «и ж жи Ки Ум Мушу фчечемчо Ж одтах СК АХ дей іш ХМ их щи ТК шу Ж
Уа РІ баж бів СО ВО БУВ жає Уж АВ ОВ Бес ке же век ей судо кох реч
У киш я ЩЕ
Фішки ТТ ох, жил Ужчьучху уМх сх г лу ее їх | Федак ЖК ЖХигю СЕЛ ооо сажа ки
ХМ кА МА У АЖ Був Уа УА Я ЕЕ Ха хна КАМ Маю ЛВ вус зей зх тв
ЕМ «М «ОК
Ффауй МУЛ МУ жу тор мих с руєум Івах їз й учух ой ЗО Зар ух ом інни су вро Узі са Ті бек тр Бе З два Ази УЩі са УВУ Ма жвЕ Віа «ту суті хто В «І «М «М
СТЕ я НОВНИХ стуку Ві бю Ж зі М дну ут ду куух ді мюхе Уж т вуз А учч ха чт
А ї АК МИ З ЯНВ З ВЕ З я КАК я НЕ Я У ЯМ ОК М Я МК ЧУ М С НН З я Я а Я МН о я п Я В ЗЕ ЕЕ В З ЧЕ М УЮ туї бука Мам м хи ЖК
Фе жи То У нн ЕТ. ач же осо шу Уж Ма Фо Ж аю Ж ож МАТ УЖ шШеЕжш жо щ їди й Тієс іа нів ів аю СКМ Мен Бек ее БУВ о ОСІ еще ки сочив яр т пек виш ру У Ж их Зо ЗУ хо
Жов жим Жов хх зу Мох нн нан о ІК и НН о Но НЕ В НАННЯ Тхузат Ж ух му СЕ Її; ЕОМ ЯМИ АЖМЮ БОС ол мМ Ум вою кю ЖАХ 85 Ва ак
ЗХ екх же ІХ
Кл я ШУ инух божих шу тожжию ХХ в ФІ ДЗК Момичм. 1 Шюрх бу ДЮ Тих хи Н Та іх ек му жус МУ ошуЄ век УЗ) КЗ Мпа ЕКО ша ща. ЮК АБ ОошЮ сфодя ах жк
УшО Я БАС дя Іжа фути ту еліта Ж ник У ких о че І Ура ЗК оащау р важуМ,
Мах усе БЕЖ із скеля ВЕК СТЕ ШУ Ме ЕК А УК Ж лави СИ СЕ 355 5 ЗБЕ що ж ев Жах ЖЖ М 0 фея Хо вонух Ж Еку брат Яка КАЛ у Мруех СЧтьуає Мкке
Мек УЕ ТО БЕН Бім Мей бюко сім АЮ ліз тбУК Уві ЗАМ їх оТвкх БВ
СЯ ЗУБ ЗО
Момту ЕМ ях бух ах Ж яю Мод Хек ЗЮеууз о Є шим аку Зм Кі чхучию хг їх духо
МОЖ АК МУ ю ї УКОЛ М КУМ ХХюИЕ КАК Ап ЯК ко аа на Ку ви сх тт з моди
ЯМ ЗБК ЗЛУ БУ рожа Томи жна ня НЕ пк а СА А ни НЯ г хи чт а вич слові
Зк ашрує дек Кт і мес бук Бех Бук ем ЛКчЯ У Лю ХУ Тут я Олущ док оих хом
КОХ АЛ УКХ брату т Жди Жосяв т иує ВМ и м их. щи пн нн НН чн НУ кк ж 3 З ж Коти хе сту тмоихх тд те ем яе ЗЕ Ох хл ско ЧИ ОН
УЖ Ту МожщА СМ ол М КК юю мМ Суто Ех Мею УдЬХМ БКБЕ бтвіх САУ до як 35 у КИ СНО та ЖІ дужі і т ся рух Жим Мвуде Тих ил МЖиеку Чую шому ОЛЯ тд и ВЕК МІ МКБіВж мазі оч Тих Її ЩОБ КІН ж МО ми го КІСОК СКУ ЦЕ
Кт долу дк
ЗВ БЕ ве саму СК лу ху им б КЗ ж ану ЇМ у б ум Хр Камю бує Чом бинт Я хх
Вр осів Ущі Мебб ж бат Юшко скит фо тн Ме ск бак овБех УВІ бю
Ї Ки тот Я
Ге ах их и суху свою ЖУК ан ен НН НН НО ТЕХ Ж жу Жойжх Зо 1 хи жу Мох ух
ТБ УК У Її бет Уві ту пев їв Мі ех полі вва Мщі бус бу ойа
Зв У За
М З М жк оон чу ее но ни ж НН нак на НН жк З НН и НН НН А НН НИК
КУН я т ро ї ХВО БКАХУ УЖ КК СУХУ ПЕ я МЕ ЗК ОК я ЯК мим ДОК
Ж Б Зх -. а с -- - у м «ех. ех, г - м - --ї «є Кона г че о Мох Мат «Жду Чо уує щЩомеж тя мує У хжщ Тгіеку. Жак щт бю Св ВР шУш шЕЖ віщш ШЕ УК АК КУМ УК Ам ОАА ЮТЬ М ЖАММО Ох Ж
Б ЗЕ Се а А Не НК І Ха НОЯ зі М сою Ку КТ сих Хлику Ма Те сту
ХЕ ОК У СЕЗ АХ ОСА ЖЬ ОА її Ре ви сам БЖ іє БЕЖ ДВ МЕ ша СХ мож кут Ух ке
Бо ТК с М
Кене Жди Сходи КО у У я ум рих й ухмо мл чи ни сим. тку Ж Тр ку ків вже Бе» дів зЗіб ТУЮ БЕ був сів са бух л5Оо мех осбую Кз ГуУх
Фр Фіг Кк ге - М ох тру шнрих о фіала арх МЕ хх п Жоожу Базу Фа Ж лох Мету Зі до дів ді
М ХУ г | МЕЖ щУуМ ке у У КУ ХА Ж ОК ж ах МВА А ВОЮ ук АЛЛА М ОБЖАЗІ МАЧО ЖМ ТА
ЗІ гу КИ ке ХОМ Хе МОМ
Фк УЖ хи ИН НЕК ХУ уми, пи лм кю ри ро Жак у Мих ід ЇХ дх же ди що НМ ЦЕ У Те Юре ФК ши ни а щу ІМ жа Ж сна у У тк чотиту зтац ух ІТх ж
СЯ ІВ Яку дежЕ
КЕ жк ДЮ ги ХУ ху ЇХх ух уУМічншу Тоня Ж Віт ШУКуУ Мухи ун ую Кок жи М ик З пу Вів век ве Уві був Ббе бек Ав датпоБІне Туж ВК Буд МЕМ ОМ 4 ср «А ї35 15 я
Жоїху ож З оди Ву дехжх Жов жк ЗМ Зоя УЧ Фе ку Селчя о Ь Ак пз у чл я ун пу р які в тд ур жо ж кУ бак Їх шу паї уче З о Жнту ТІ» ЗВ Тл
У З си Кз М Ка У АЮ ЯКЖ ЖУК АСУ м КУА АК КАТ ЯМ ск МО УТА ОКА ча зді шк З
Іа х ше і ня Але МЕ ше бом а ж Тух уки: тупо ТО хе Ж ще си Ж жи Фі ж ТЕ чих УУЄ І УЖЕ хх «имя ках хи ех шк Щек УК ОЖлУ Аеб са вве Бех Буш Ааю щеє ЖЕ ЖУЖ Беж Ме сех кох дону «сур о ЕК ше а на в нн и но Я тсУучи Ж дк сачих У Убх хи сх ен Кн НА Но
Ж КВЖж ве жМмжЖ Мей лк ому ев ОА УЖ Ам ЖУК мав Мі Зею Ух
З чи так іве М есКу яру тт жу Му ан За Жоден річн Жид криє. фону сума тах УК фугу киця
КЖ ув ів ЕЕ АЛЕ ОпУщ му МК о -шЕ АЛЕ шк КЖК АЖ УА мем мих --аЕ ХКТіг КК
ОМ КИ «МТ
Е що Дол Що тк ще гр жк
КЕ ОХ ЕЕ ОБМЕИ АТЕ У ток ве
Івах ка Уж ач Ж є я ХУ же Не На ан Ач и нан кН: чи НН НВ НИЗИН Чи пів Уві 0іб їн За біб БВехоїуУу вів ЗР: їеб дія Акз БЕ ФУ Аме
ХМ ХУ 3 МЕ пок на. Жодахмо Мао Кк миш о їх ку стоку МОХ тиж Ж жк сфе ту її Сі яе. се УйжудУ а ва У БК си КУ УЮ МАХ УМХ Ми КУ КК Тк Біне МЕ о шШЕш У
У Я 4 ВУ : - ххх є Ж МКК ко Кк А беж мене Міш сек Сі точ біг Ду Шо У; блю бах Тв дів бр те тва Ве Бі ТЕ МОН Ту Її ос Кк Ки САУ ма У Її АІВ ТЕ Кеш БЖ мя я ЗЕ
В же С : : . щ 2 й - : й м й уж зх шт ях пряую СТО уві їехих Ж У іде їде тра Мо шную хну Ма ФУР жу ММ щі У КУ о ще АТ ЖК СК ІМ АСУ із чек Ен ак ром АВ ОА му ие
У у; Х В; ї З ви ТУ Б
Фокс фо М 1 ож ШЕ НИ чУюрух Ж ду даху Боєхкх китах ЩШіднє Шк СИ А ду Ух ку
Мущш яма му ка алЖ ей лю АЖ лАеЮ у Б'юшЕ ОК БеЕ ПК Ак ІУК шок зу «Е ту
Су З ще
Хна ЛВ ря. Тому Щужітчо «бик Ж: М щи їж дух Оу ХУ мух ккд
Мет щі їн ВЕУ ме з СшВЖ с да Ле Бек і УВА КУЄ Її ОС - З сх м на Не вн Не о нин ні НН Не На дм Хом сажу тр міц Ж ТЕ ух,
Кок я с Ме М ше МАВ КУМ Му МИМО ДУКк МЕ ми де ВЖК ОСКЕК ох уУ хг че по доня му М НЯ
ТУ рани - оч оку чих гоже хх що МК я км і тожж. Гачнк їх сту. уз и У ся С. ж
Зах Указ Ех Та Мчч ЗМ Кох бич АК о фокусу «рух Женя фути єм лк ше КО ше УК ЛЮ У ЗшЖ МЖК ЖК му КК лах ЕХО ЕМ ше М г ясерех Олю
ТЕ Кех «Мк Й
Чек о Шюсю нні лою біз У йеву дія іа ій твк дай дек Ме осві ук
ЖЕ о БЕсО сн Біо Бк бу смаЕ ді ев ай ТжТпХ баб Бех Ме У тиж
НК зак тай
КК ММ Я
Кк х. вч пдодуми Х хх ж як хи У Б як хх ек че На - Іде гоакто сії ХК то ХР юку КЕ деку ШКЛО; гуми Ху рин їж Хек хе ли су ше щ БУ а ш сКУЖ КІНО БжХУ бо виш Маю дж Уа вх
УК оду Зм я їх Тхуй ЩО щі мож кош АХ ее ве три дв Ек о сРе бек їм; ех бами сфе б ів ошжиюЕк Шу бр Клта увщі
АЖ ЖЕК мех бу Бех ди ех шви С що Ка сл ов о БЕК Аа УА зах ороєюух чрхук
Кк ки тк
М зт МВ оашух їх Фу йлюю; їбоеМі сажу СИ Бр жо я вх Стік маю ев ШИ лю ех Кт т а Не хМи СЯ ТЗІ АХ ї ЗЕ» ЗЕ Мох хм ту СХ КК Куй мем шу щеК ВЕ щем ТУЮ ЖИЛУ Ме о сеж се век бува ЛК УВО жх ББЖ
ЕН 185 1
Фета Ваші аск баси. ех Ра ря Ед Має їсск о хх ВО до Я о тн у М х ша ЯК мкс се ЗАВ МКК УА ЛК КУ УВА маіщ и КО ВА ек зп «груш
ЕХ ІНО щи бач МУ х тую ТТ хх Збщі Мк во на ни и Шу Ти Щоехнимо Мф брас СХ КІ Кк с б'кхки м а КК МН о у З З НК и і Я С МО НИ АК НИ и З ОК Я В КЗ З В КМ А НЕ ВЕ а зак пре хх «КОХ «и тож Ж мн їх Ж пк кгю МУК М лютні М ху и но НУ хЖвоичх шо У ХУ бушо Бус їую же ев жи ва шШко Зі Зі йеж8 Бек У пе дае БІ ти з Ужд му тай
СХ ЕМ ве УЗ хіх «А «ОЙ Ку
Яку Жуучу и НА У хкіх дах їй Ж авт Мі Х Я ду ТК Тошутя іх ТМ юти іххк Хтд
БЕ Кк МУ КЕ мВ ТМ У ще ТТН ліком бе кмвж еко НЕ мою укл т ід гуде я ямМ ее:
Річ ЖЗюену бу зд а а що «що Жоюку лк шнух Мк нич КУТ ую охжа ри ХУ
МЕ С ЕЕ о ща мк АК Хі ще ОО УМ ОЖАЛЦЮ чУІю юж ЗАХО ЩА Ек Бруе
ВА тк ц ту щи хх КЕ еНЕНЯ сет рек фаз ща даю фот кі 3 ж ні щ нм дів і тв ве ЖуУУ --ек їж о Бівф УВІ Звр ор Оу Ка У мів ВЕ а фо спи ОЖКЕ гю
ТУ ча вх я Ти «ОХ а їж 4-4 Ж у ЖІ ам о божу там ую БУукуєу: бле ж о ШЕкуЄ Ж Же ЖЖ Ту. оди ЖЕучч дже ша ша баг ел дв щеж КЕ Бе доз Бек В жк балу зма КУ
МО У пс ке нн и НН Чан кож дю коді Могили тмтрах жо т ту фдржаю жим ун ж жав ТИ ВИЩ СИ дао ЕМ ом ва КУ шУуш с тво ХуДЯМ Кум КК Ух зх чок оз сух зтутх
МАМ ЗА Кн З ее жі ду ВТ: ьо Жах м Ух о ни а о НА я Не НН о НИ Фідухе ст же Піх
То аку ох с. іже Му 3 ке ї дк ОК У НЕ з ХДУ ту, ПЕ
ФУХМА ЗшК КА ЯМА БЕ ЖЮЄХ СТЬ ЖЖ ом УМ АЖ АЯЖ ЖОМУ МТК ї хх (З Жах юних ГУ Уч Жлдиху ТО Ше ух к В. як КР граду М жд фев фах йти ок ав еи нш О ни зач КО КН о м и м а и КК Я М не Ух КА кед ма а В ЗИ о п зм У ух чи зро зи
ОЖЬІЇ ве пз аа НАННЯ шию ложу Моклуя тяж ЩЕ жан Томи Ту луг Фі шо Жид са зів Меб та му МК Ум Ж БНеЖ сзБИЯ СК У Щек ів КЕ ЗЕЮ
Фін. ТУЮ му у З ока ЗК Мт АТО круки УМ сфе ро ШИ юю де шуля кІНЕ щу КК ЄМ дшЕ ДІ КВК Ух ем о БХЮ Бах Кер АВ п Су А КО урехтх ня тд
А ОК Бу
З й Мч стзюжже Жокук МФ ю М іщеО КТ ух, пух и, КО аск їх чех бу ук дю уж он Сіла жи СК Ту ЗМЕИ СЕРТЄ С бшсУ Ка Мет Кг ТП да ша У МЕ зх БЕ а УНН тр мех. ІОВ зму ух Чак фннії Кіш аю фл; Жде ую Мотух сббехуя 2 тя А я
УКХ Кп о УщвІ БУМ БЕК ев фе АВМ УК УМ ру Не ЕТ СЖО ЗУцОгьа зт ач ап
КТ ЗИМА КМ а Феджаж фе Журую шо й хих описи Ен Жоекля ЛД ую рух ЕК жк Тому ТЯ ско сх у му АвЕ ТВ рве тв Сую шж Ми їжа Най сла се бо МівБ ом аж ож ях, о І ФО
АТМ ча х А дою Мн АТ А на и НЯ сви Ех ах дня уч ХК го
Ма шпх сб БЕ леж ев ше Му о щех ЕК КУ му
КЕ ка
БОНН Б
Теж ЖК ді. стю ЖЖ тка Яра лок Там Же ух Фоми из СЗиха т Хе Ко хх де йишже бле Серж М СМ ту тТЮ БЕК БЕКЬ Ми М хи МІК ВО ся Оу ЩО БУ х м хо е х я т КЕ х в не ї5 хх зу чиї ка ее ФуУУку мя б'ю Мох ло Же яхт оо чекаю Жідимо Що ми аж ЩА ЛЕ А КП СУ лпющч ов шик Ти одяв ле шок гОЗАХ
МУ Б 55
У «вд Жлолую брам. Пе Ма КУ ум фе пу де с хх Мівху ЖХкии їаккх БощУ толку І
Те іш ЖЕ БУК БІБ ОСТ був ВЕ лу БУВ о шщех БЕ Був БЖ ма УВЕ
Я Я треку МОХ оз Ух Жамух жо Тх Жотуєо ШМК я хучК Км ре су МИ Стаж КАТ ж хжх їх У ї їх Машу таці Зх КУ ж Ь ту жен у бючтух КМ Удх у ТЕЖ
МУХА ЖАВ ХР МИТЬ жи Я ЕМ Му ВХ шк Ж ЖАХ ЩО КМ КМ КУ Илу 0 па Б аж НАВИ Фе СХ хх ре ує Мшхах ск жу бух том Явка С ку уко ШХідм ую Тодуга й у кун сх ї3у дна хх пк ЩЗЕх паху ха тим пек 5 ДЕ ШамуЗ Та кро бух век сам шах су Тих Ажщо Тех Бек Ге Мую (бів дю Щек о їжма дл вх)
Тіз Мем ЖІх БУ хх ач хи ба ух о біжуєю ЛЕ. Кф лм Пюре бтхекя ВО з «діам Щі Пре спів вав бие біУ Ше Тує ТуЖ СУ бів Ніш Бе ТкКр о АВз Бех БЕ ТтТУХ ца зе КЕ
Фуку щі кл на АН ТАН о У, ух и й а І НН хо оч і гг Пе У хІ фр усу йхе СНИ о: Толжхм Дю хх 12 що чеше
КЕ тт ХА У АТ САУ Те Був Ме лим бл муш вич Те бі хі: віз чор жк ж п хг ї
АК АЛЕЛІ 1115 жо Бак о Ві ре фія Бе Буре; БЕо»м їнза шмЕ 12 Фет їди зу жи КОЛ же ек че Кле МА я ВЕК Еш Уж ВЕ ІК шк еа му шим малу ех вул п-ху у ий Ти ер 3 ях жду ХМ ро Її ви ее НН а ОО Хокзехо щих Ху амо Пежо Же се ЕТ І ї -
УКЖ ог ж Зк ВАК СУК ве БМ АК МЕШХ КМ ТУЮ БЕ дХ од 2 оч че Зх 159 ха Ки хе чл ул трата Ж ле ХК Мод З кое АН Тоді С ов НН АНН Не Єтеває КЕ.
Тих Ел ДЯя Н това сх ї ТЇеєеюу ЛЮ ТУ 1 дх піт пра ЕЛЕ га хх Фу уюхо іду я муху хг ї КК КОМУ УЩщ А лК ЯАЖЮ ЛЬШЕ ААЖКВ СТЕ кю кВА деїюЬ ек іп ще пово чук дя чих 15 МО не БЕ 2хл у хат рум ес З Кк Мини т о Ду Еш 0 юн Киця Кдху жду шів ше Уві СБК і ось а ШО ук АМКУ МЖК ОКХ ОХ Уо ме мм КЕ
ЗЕ лк 1 з то ї75
Уха Же Му ен ШШь Сен Жах М Модух ро Не МНН КМ Можмки дит рен -ежх ТБЖ ії Так о бе Бех був Аа дю бек осн СУ Наовобув уа3 жТУХ тт я лет
Мко Ка мм
Ж ощо бха жк КА ящик б ху жЖамуу дію (Жїднує блю хмУу Мері б окжю ху
Важ Су шім ЗЩВІі Та Бі Бо су їм ЗаЖ о йех хо УЗ КН му щаж з сте ту 5 ке ЕВ
Зв дат; дує йо біз) зу
ЖІ: ЕТ Кт у оо зам іо ки Ши МУ ку Од хи То с нос я нн и Я НЯ КМ ре т тож. Бут С хи ЗК щі чів УВА ЗіЗ їв Уукі ЗіБ бех Оу Ав ші Ущі Дів Бе Бк у я
З е за Ек с ж р Б сй Ул - є ши пи. - ЄМ ТЕ сих ци Пл их фея чия ря чи ден худ гохужх ТТ одурї сік ує сві Хорив ЛЮ до КЕ де Мих ее ен СУ ї орух а на
Ж А мух Ма мшх сушу У ЖК а КУ ММ КОХ Бковвиа р ху ук Ех шк я 6 пееку Кв о КуБуЮ ск. Ех Бу Фе Мом Женя ра ЛУ Ав я о я АН На в УшН бхюр ОВК сю жКю бе СУБ пів Ме БкОо Оу бів ббрУ Бем осо бою 118 ке ж Зх
З жа че муру ді кк льшую ту дулує Фу Моє пИч екю ІУБущА МА м фохкх ММа,
ЗКУ вла БІБ ОО МУЮ Бу а ТУ ії уУ же Бек ОЕ БУХ БАК Кг Був БРВ
З се БІ ба ах вки. Ж СА У Мч фо Меч тот тож її хуУєх дому арх фіохує Піх Учня Уже ут сів збу Був ліз ТЕ їв ТЕ Абе в ДУ бек БЕХ шШек ТЕ дів ї КЕ
У т т що вах я Зх ух, Фет Я т. УЖ Ж хх ХХ ож ДЯ Я ча ши хАТЕ чн кух. с. ях. --
Ех мах Ка су сх ха бе Кока Ех М тку Ж іМ 5РдУ бич суаця хх ук мек сій Уч Бех бек їм ВЕ СК КЛ: за» ог оса ча Ух ТУХ а:
Бе ЗУ ХУ
ХО и не па ав Я НН НН а о НН Ж ж ЖЖ аж хо уж Ж вів о БвЖжОа вЕЧ ЗНО фу Мвт оОКУЮ ЗІ в ДУХ ЩЕ У аль ЗКУ ЗХ Св хх т тай
МЕ ОМ ДО
КУМ се ЖЕК Фк СУ пу КУ Сех тиф том КА ху пуд «лі тлу ХУавуам їди Ж тщк мжЖ Уж век г вка вшХ МЛХ му ша шо с В КО кБКсК дико чех чм вУНя
АВ Я Кв
ОХ я ЖЕ Ж ню Ли там Жаєк Ж: Жди тях да рн АВ АТ Ту й че щіІЩ ОКЖШ ве ВХ Їгу ш Щеж Ти ЩЕ щі У КУ СЮ ПКОЯ жі ема СУ ОКУ їЗо їх Нео тож дл ткке баки ТК ин Жіум Жбучлих ОКХ Пк їі кан ху Хацти Ст у жі «Таку м І УК А із ї їка ЖОВ КК що Кж УміІ СЮ з Ко чВва НЕ їх ОВАМЕ ше чия мен чо хе
Ка МО ах 158 тт чи боякі у Мам Фах М кю Ж о Ша Нв КН и НН ИН ШК В Ж їла па їв У Вів їні КМ бе Бі а МавотТлк БОеБ Бмкст дій Мща іі лат Бех ши жк чук її. ТО В яєш дв ши трах с Фтауяи Ж шу лук Жехчх ке ЯН гріє ха Трутех духа Минко Фу уУ зак су МЕ Ук ОК мш оБшюЕ кВ що УщшА ОО ВУ УЗ хз ше сек Бех рух зе аа їв 185 за ож хх їх У я Ту Уч дж у сх Ж ет жу-х Туз Ге Ке У іх тю жи с хом дм пе НИ я гум Ух ке Я кІх су п Тедут їх хх Кен сх охУк сш КУ Х п А АЖ АК А КУ МА я ЗВО КВ ОО у ке Бшх ЕВ зл ТРК УК
МУ ЖИ п тку тки же бсажух Ж лади Тс їуті УК т. ЖЕКу Ж Же бук М ктя У віх ПМ чи КД є
М БА УВА КК ду му ещМ КК юЮЖ Буш УА ую Я МЖК х пк з су дутух
А «М «ке М
ТІК до уж. пруєєм о Ж утих Жах хи іх Ж ше пт я Ж бамхут ТЗ хе тхір аж Хіти бод ХЛ твкощшетш БЕ Бе уш БЕЖ их Же Б ДН дм Аз і КО БЕК ОА схуд слу сі «и
Ах км хи шяй
Фудз хх чик Ти. ХА ях т хуУєХУ Круче Болжум сом ту фолухс Жли КО рої ям Шехмо буку Ку хх
Вт джем бін БК ЕКО МУ КЕ Ту Ху КО ЖК дн ВМО а хВЖ вКФЧ ЄМ че сук те хІТК ННІ МІЙ
Фени Мт Уух ху сттьиею ги цтлк ха ху Жажих Ем | Фк Можно іму учи ЖИТ ра еВ ЗМ ОКХ ИН АННИ С іх ща ші Ма Ю МІН Мі оса; дак ше АВ
ВЕ тк тутрх «ЕМ еВ шт о и АНА ЧИ ме дана и а ШХ щ- дшяоух суця хуй г. й лу дек ЇЗвБиу йому чле Мк ба Жош ТМ о Ме их я хи сне не ре тоже ча омуш БІВ дЕТ СКО їУК УВІ бер пі УБі ЗАЙ о Ущі Мо дат Зіл туев
Бя хек суржик хі Я ки кі дно Жим Жуулумо ду кт перу кА Ж х 53 м що : А НН х , дим Тутемо Дж КК Ан х ня ж Му Ху Ук се шує одеомо Ж ху С дими
МК О щу ЕжЖС МКФ АЮ аю ей ах ше За БУ АЖ У МІ Нею
І; х У і; КО МОМ
БОС па г ее: ІЙ МА се ИН З У ННЯ «ка ж х ект. -у хо пт - - щ-
Си ба кю ку не То Хр туту х спеку, п ик Лоза ж хек КА уд ючи хх
У ЖЕ ЛЮК Я АЖаМ ЖК зав ню ХЮОо вео Єедиь бах БУВ АВ ОдуУЄ ую г тв У тросу
ДеМА Ха ККУ Своя хх ЕВ їбяж їх Хі Ек Вік ток ОА Куц Му Зх жу М юю у Жду Ж КТ ств о був о УчЕ век лам Був да за БЕО Дав Бо бі Зав їде СН Тіє ух ур щи
ЕФ ДОК 335
Я ток ТЗ хе Фа Ат кана Фу тку Луч хя Те вн ер Ка и че ї ум
КИ Му ж БУ Її ЗКУ АТ Б ВК КАМ ЕК сел Ух УМО УЛ а ОКУ под дк зр а 345 а тику Жук ех Що С котам Кр фо Мт ЕЛ дя ен о сиве ше ко З НЯ жи а К ЕК м ЗАМ ос жом УЖ АМмиТЬ з Ма ем дяма уд Ух пуп рр чи су
Зх Еш ха
ТКХУ Ко У хЖИ сю ХЛ дк Ми бМужмх Жреш и ум СК р кн ут см ов НН ча МмУю іа БЕФ УЮ вл ек ММ а а ЖЕ вл Сер ки СК ЯМ суку тре пор
ГЖЗ: А м
ІК ОКХ ЖАХ:
Уся ж пи з пкожжу ом стек ач іч с ЖІ їх ух. я Ж ук, СИТх и хі оч. руш си чи тя її сі х ому зача оюхку. ЯТЬ. ех Зам их Хв ще ЩЕ с ім КЕ КК КУА АТ А Ук м А г по Ко уко м Би Б БОМ т гі сект «ар КК «ХХ ж ен ХНУ олія ва ЧИЯ ся фен і ка Нь Стоожм срежючтю Ту я хи ох дою п на ваш ошку а В пек Сем оїую СЕК о БУБ ПевотТвЕ Ві обфяю був БК ОКУ а пи 15 ул Же Ж хе ее ли біо чук їзкіує ЗТ Мехі у к. ККТ33 В т ем
АЖ СХ АЮ са У НІ ж Тих Бе СУ ша Ул БЖ КБ с іш Ка дуг одремн іх Іра ху У аа тії щоку кві у тру пУМ юю ж Ух Том пуд Код Сива о Ж ж бехще Спуючя УЖ Кк мів мав ЕК Коса шу жнив КМ СИ мА тло ВУ
Же т хну М кю я Ок Хр ду у Бах Ждіко її Сішкже ЛУ Кк хх дав їі сій Меб їБЕ іт цех Бкб Бех Бехс фе век зві век о УшВаЕ Фу
Ко ЩЕ КА У
ОВ АНЯ оч ту я о між, ших. я х СКУ дк і Б чо ух, гм тіж Тех М тфже гора пух по Кучу о и хонк У тролі гумі С ку
ЕМО ТУЕ Ол Тв дів Жах м А хів ше шлю ВАНІ ба рем ру де кру сх жа
КУ ТЕ КВ ну УА Френч Вуаля Є уко М міх ще їх их Кок їх Ук У ж. КУ се А; сво КЕ КУЖК УХКЮ Є Ж м БЕ У МЕ жи КІхЗ Мет свц і М щі
С ве бтюєио у ах М селі Жду по акд ОК моді СЮ юу Ум. Мушу дае сТукхує Тк гад чук
ЖЖ ВЕ лов О5ежк ЕВ бен лів АврозаУ Увь вк ниж вжУ БІВ пек Фу
ГУ ЩЕ ша щи х БИ
Слемо ру «дим ХХ ки брюк беж у у Ж хм Ж я дет Хот жо Ж диня
ЕК АНУ ШЕ ЗКУ у Ме МОУ БК де УВК да ЯМИХю МК ща АЛ ОК шк Бан тк г щ-5 Їх Тш ще т ххх Кутики Чтв жк трати ки КАЛУ ХК Ул дя яв, Я Жімлию Му, в
Шамо ям Вінн су ТИХ жУК Тух СУує БРВ о Вівш Не ТЕЖ УВО (Ек Би стух сх що со хх хг г
ХХ о 5
Ук рих Ж жк т я ха ЧИ рух Ж до ХХ кул КУТ Ж хх кожи Мати ум УЮ Ану В х
ЕТО КТ і У СКК му ТЕБЕ ге Божі ОН КА іл г ТВх УЖ ВКА ЛІВ 128 зп їко
Тех Ті хТїЖ ПУ: ие ут Уїаєиют ОХ уюим До Он ТІ ух. Кл оч Жов го КІ ху вЕо шежЖ ВА жів бле Бре Бо шВжхе Век лек сьо (33 їз: Пе бек осду ток Фокруї чол
ОКХ У й іже Ох ра нь ОН ж хек т х СИЧ Моїх Мк ух ух у ЛЬ З їде Ал шех бах Мі Су бей фі АеБ олег ве Ту БЕО Аа ЗІ Аа
Жора ПТ же ня Жах хи ож ода ние Кк у же Фен яю жо сла же муш Узі БА їКв'іїВв БІ ЗБЕ АВОа Ав юМ сю шнек У ЗУЕМА КН КО Хо КЕ ве 155 ї55 150
Ух Сен їй суєта дя дк; о Мік Жах Жук хат сажу Ту прараню ж Кт СЕМ шо ще Уже Твх Зі а дн ошех цув ДЕр оБек Те ТуЄ БЕЖ Бр БЕХ ха 7 їт5
Ж аюомис СКМ и лик ах Фо ан Жде я кожух пф юн У кт ТЕХ о Їж ТАЗ КЕ ж. кН ЗІ ми АЮ І Зв ЮК м ма м ГУ сії г За «хащах 4 Ж Х 155 в я;
ІН тк ЖАХ о ее и Не и НН а фе Фідеже Шлуу ю Жджиє НУ ТУ ож че ай тую ШО Ме ЖК НО сам БУ їй Бек шек Ба УВА КВК вив Ех коми пок у КЕ їя5 ай вл
У х я паж - їх СУ ух
Не дак вже се щі СУЄ очах хи М «2105115 «2115 447 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» ПИЕН149НСО «4005 115 п нь сь НЯ Ех вк дим КЗ хі їкАЙ жкАЛ о хї - 4 ск щу
Те йде бух бив со х у 3 їй гах З - Ул МО т оюгхх Ук ря
Ша ЖЕК к лиц Ми а ЯЗ Ве м АВ УА У ВА МВ КЕ си ів т род ОКУ ЛЯХ х щ ке З
Тис М бл Ви Жмемо жк тож а пт ли їм ги МК, ех Ук сх
ГІЯ щі ЕІ МхНцхї ас ЖЕО Ід СХ 14 чу юю Кук. кр Туююжу б жх У зви ам муж ВНС меж СУ БУ Вів Бек обзЛУ фУЮ ЖБК Бе ТЕЖ де т сут сУї - тк
КІ І 3
І ВІЙ же
Урбомтює Ада Му бууту Тк Ж юю ях і ї нами ей ху. ух за н-ї ре дк: татко Мих Те ук їде Рух ж хр Мк ЛОТ ках дя Й оди ую Ко КТ
КО оз а Кк АХ М мем: ау МЕЖ СО ОКХ МОХ МО ях КАМ АЖ И 4 С
З КІ Кк
С ді т ню тки Кі хх Вау бах Ве ЛИ ах спфууї сраву й ську тек КУ сожу ві І УЖ МО ба ау беж ваше жк тах Ух ЕВ ОБ Був КВе ча КА що мА УР сх ат Ж я Жодним ПАТ Уч ток є Ме руч Ан о ен НН СТегмух Се хх ЖЖ ук
АК шу му дж МпХ дм Ікс вав Вк АЛЖ шах Аа ЕН АВК УА УЖ ще че хх Кк ти 15 ща ме опіц: ді че екю Тама ЖЖ бе пібд ЗщЩаб йЕеу дів Ущі сббужо Ор пов
Ка нини а і Кс и А в А ВН ЕК п і ВОМ и В В У Зиму Фа КК А КОЖ АЖ Ах Ж ХУ пе за ах
ТЕПіче соузе К сх ня ї е Мат мух АН У ї д що; о Ддашжу бихуу брасре 03» ТУ хх тв пе
ЖЖ Ам КОКК З ма го МОЖ жу жк вишже ЯМшжю УК БЕ рБомку АЛІ жу ЖВЕх че ов пк
МО Кен МАВ хи Жук ХА «жили аю Кеди При зач Сак Ж СУ У
Та ХУ Не Ка шк Сб Зх рик Пе ризи у Жим СКУ шен у
Шех ВІ ТВ бі Беж Бех йів пек ТЕБЕ Є В ОА мже ях жа БІБ Ес тт з чл
ККУ АХ ік Уй чок АС чо бах Філін «Зав б охжмо Шоу трі Юре Кр т чи тку А Кр тому Ух 3 пк іш йо Ко Бек Бек би СМ СЕК Бен (У ОКА МЕ она М дк лю
ЯЗ м В: 4 тав тав ща
ЗО ПО в я : Я -ї - в наче : й
Хм с дж ху Тохукі усу тяхує ЖІ: Же Ку Ту За ку у Ху ах с сббакх Зх
Му АЮ У щу У о вв Ух Мке Бисть ім во Уі тім У чех ТЕ Е ЖУК з де м У Я
ЗК щі іо зЖ5 ща ІВ 150 р а ев и и НН УДО жу ки Ух ач: тд ож теме ОШЖХьшю Же КТ ху баку Сх
ЖК Ж ве ВИ. ФК ЕК КУ ХО КСВ Те оБіне Буш аа Ма їм БА жк рт З
Ох КУ ке
Хм ЕМ ТІЛ Кх Тї кю бух ТЕМ Ха дя Мік чи щ ях вах тд ї ее «ах МЕ шаЕЖО ЕМ ОХ КЕ УТ МОМ рекекЯ ДИ А Ом ВЖИ АК Ме ее ПЕ ке Ко Є КАЮ Є хе ож лок
В КІЗ КОМ
Стдюує бок год МА жи вам КЕ Ж Жряю йахуєю Ма ЛЬ Кіа Я ЩО ї ххх Хр пак
ЗекЕЖ Мез Оу тТвх бів ЖНУ ЖУю їіє був т Уа ага беж БК ЕМУХ се З Я У ох ср т сих
Ка ОО ЯЗ ск К; - ча 25, бр; їла Ша бою о бує Блкщ лИВуе ав овУ тТдуж бі дош Тих Би ли 11 ї меш ЕХ СУ ща Був Сх ав Тахо був Ві Ашр о бую Був Чі 3 фо СУБ Важ бук Де х МЕ й чт г т хг
В С ОК я; кам КК чу кожх, тк пу с Бузз хе бо Бк Бі ше її їі їм рік о В т мех км о щло»Е СУ БІ Ко Су КЕОо віз вже па б бе У щу Же КЕ й х ко, як кухку йх тлу ех пек КБУ а ХВ ху шко 5 Ку п з пк т ох Жовч Між бдмм. Мова» т ву. дико Мою
Уві іже бецо важ буре БЕ умо ЖК ме ФМ Мих о А РЕК дае НК УК че Бе фея Бе пюре Му Бу мо мк мЖЕ ФО ЖК АЮ с зо хуіх у «уд
ХІІ АХ ЩІТЛОЗ й я с : щк дев жд ж ОХ би міх жу Кс дар тГви шк ла В сЖжЖвиМ боку Зяф і яви а бек С ех Міллі бан у як Бк сам ВА ЖИ буд ЩЕ Зах УВК Бек У бчаж Між М ех пече суеірх - «ре 17 суку зал тв кх ХМ. «АЛ - гі -к Бх дещо Же гіди Мало з: а Зі ват Віа ана Жочси о Їх банку Сули, т ко щі щі у У ж ЗОВ АТ
БУК ЕХ ї Аулх Е ІН МІ у Може ща ЛЮ мА ген хх КА. х й ух єх сі
Ка: СЕ да «КІ Х ож - сх па ну г я ях А коек Дт Уа З худ Б оди Мун Та дк Ууи Ту їізз (іт ху дить МІЖ ОККО А КІХ Ся Я пу ЗЛЕ муш кис меч шив А Бій овфУуХ БО Х З х С за а ЗУ ки ге,
ЗчИ суя об т - ї3 ЗсЄ Фоскуло лачух стем лу я Тих, її 31 Че ск ма Те ТБ Мі їм Ні сл Аца СТЮ би дама Си фу ЕМ СТЕ ша МІ зб СК ші їх Бі ост МИ Кк іх НЕАЯ У і 5 х с. щК чеки мч лухром Я її
ЗИ ЖЕ С їх
М з о З х що Фудчитчо СБ шо Ж ри рю пух й 4 ча и Ач тк Дів Там; бух Від фе Ті тім Та тва шу см У о Жщ БК в МВ їв КК Ол же АЖ КМ У МЕ муш суш Буш ща сш вшБОЇ шу а ме Кс ях і 7 т 7 яку тю ях 3 аа яки ОМ : х хх ше У ау ху. усу чає Ток
КОТ їх о КУ Кок тоді їла зх малу ЯН Хегу тА їх зи Вт У аа в ЗВ
Ббіже дае ж мВ Вів Був БУ Зі ОБжсЄ дЕКЧч о шаю БЖ ЗІ УА КУЄ
У но ано КУ в В вок туту ха Зак 3 ле шок -4 4 ке не ке па с теїхха З хх їх що бу Тіз Са му сажа. пох ух «Фа ее Мам 135 Хом сх па Дт Піт до сну їі Сук Пл мера сек Ки МЕ з «ЕМО А ЦЄІ СУ ТАЮ їх УОЯ МшЕК БА ЖЮ ЕВ СЕ А і; су их суши кох
ЗІ Б КК ч - - я мл т ДУ Уу. ббхух я ув « пу де Рея Ме яю баки ЩЕ о тд ло ді Се о тко і вах ет я а км хх ЗУ БАКУ ет У й МОМ АЮ ОМ АКА ж АЮ М вини
АКИЕ м Ян Жх аю М УЮ КК М МК 3 І: зритх
ПК щі зчаи в зди жи ОКУ х х гу нн х ОК У Орке рУув'стце ТЕ Бра Бо Уа фнмі да Ю ет би (в кут 41 Дауї Кт Кк ТОК і и и и а яеАМ я. КАТІ КУ ЩА АМИХЬ ЛУНЬ КУЖ ОКУ УХ ХЕ Х Кк 7 ї дових як те як ск мет гі айва
Її ЗО З у х т піку В хХ дик З аж Мх луку То Км ж
С ух поки в лю Мих б;ху БТахую ху іх її І Кр Щі ЗК о Б КЕ кщк ДЕ ЗЛУ БЕХ БЕ Ба іжаба ТУЮ йЕХ МБУБш ва СлВЕш УА вве ої
ЗЕ ОАКЕ Х Ї й ща до зх зад 1 М т я Сх їх - нин ак АЖ КН АННИ ВІКА дир Тиюв а БЕК У Ав щі жа Ем Щую фев щі Ве Но Б ОВ
ХЕ Фо А кр лю АВМ МАО КІМ КМУ ХУ УК сни У ши Шк й Б хотх о; Б 3
Б хе я с . я ня ще ще. птахи йду дам МУ ху ця с нед. п т С рожі за ки Міді год УКХ Ба МУ ії а Ні Ба МНів СБУ ТВХ Б цу щЕЖ фена (ЕК їн БЕХ ВХ З МЕ айв Ями НЕ МОВ МЖК Ж А УК хе ю Мк УА Ом і: ай а ЕЕЗН яті ЕТ кю вче Ток ЖЕІсує ас ди я рн ОО У - с, Фо» Ь сх, с, шо ; хх : У ї с ра ие ке ук СХ р ен не НН НН ву о е . х пом їде УЩаЕ іно їж біб оїакК о Бр біз бвж їні бат ві Тако Бу о щу і х КН Ех
Х що КК ї хх дж З ту КО Же Тидопзі Жів ж їЗю Щучх щу тм сфе; булуюу бу Ме іх Мр
УМ ЯКЕ жк а КнТАХ ОКМИ Кк СУ що І КІ ЕК БРОНІ МЕНЕ ХМ
Б й За боже Я шу балу ткач МАТ юю ШК жк тож ушх Ж усеч. їв ФІЛ Те ую Мои Мовютя Ж уз МТ ше Яра ЩбЕюЮотТУує 5 см БУВ Бе бі біб ще БО Абе бец Бей ті «кЕ Лх 5
І вк: ІЗ
Зожужу Зк, ку ЖК Же КХ жу шкур лає їз а Сн ючих кує Фочюесюо МК шок Кі ку
ЖЕ Км Ж о Ми см МЕ шк ж Бек Ам іш во ВО СО їма ла Є жк доц шле
З МА Не
Тих. ту жк Уч їл по Кф важя Же У ех ОХ ж ТО ку протя «Фи спілку ХА сук Ка
ЖШекає З хто бух т хх Та М ку ухва т яхт боку Те Ж Жду ЗД Та мак Баш м шу КК Ом шоОКле що ХиМма сх біля: Ще БЕК УЮ мМ жю шк тк се що
ХХ г їх а чі. аж Кіш КА хх шо Жуан КАК оку УК ж и нн Не Ше шкомн. ФфУжеаму Жрузе ЛИ ках сам ММ КІМ Масу КН СУ БІ ХЛ КУА Аа ХНаЖж ЗАМ ме о скКр юю Хо че п щи
З Зо ак
УЖ. юю УЖіахо ра СХ дж ВМ ТЛ х суху тоди ту ж ТИ Жди сфе чт РАК
Тух ТВЖж Вне йіФс а му ТИХ СуУуш іже іс бів БУВ дк ЧЕ Уі ВІВ ех ЗОН У Ук
КИ КІТУ НО
М Фу ХХ ЩЕ УшЖУ ПО ЖУК пи Ти Сл ща Кулі: КИ мх Тищшу бік «дух дів ско Шеж ЗаЗ3 ББе їі Бе Бкб бус беж Аве ос бю фа Кур 5еХх
Зах з ех чл
Ж ДОК гУрхк ма: му ідею аЯаЮт ХЕ щС жзюю бак; тиху фужхж безе Же о сжжчи ух ех сатту 1 шУ таж Віз ек За В Су ам Бо щоб; Авиа ЄЛЕ УЖ КЕ Кер М
Уж мол, зло гу в Ше вен ее тк ЕН тах Ту Жожяк Х ж зу шт Хе КТ я и АН НН НС Мая тик вів тбуяевн оні сІв Тк Ммушо ме вих ОЕМ дів їні ФС Швж СУ ОО ВАМ. НЕЮ дол м омлх дог чит 155 і 1-5 ТВО тех ках дідух пу 21 тб бреуєх жує болем Моахух скік Сбізає сраху с Жим моз ек А КТ ЗАМ оса ми ех Їх У ЯМ НН КО ХУ ї ле ЗА МИН
ТЕО КМ МЕ ра даю Ж шк ау у жи соежт до лм Ж хх Може тою ЛК хом УА ж ух ху ех хе тре Мк У зії іх ТЕ пі у а Не ГАК Я» У др аж ек ТЕ Мао Тих ре; пек обу ваш дю жук п му а уже Ух чт а яткру ме іа КЛ
Фуко "М ї ж, рез не с оса я ке я т хх ках ся ОДН
Кажу що їжу йгРї, ЩО ча ах Ж сю яю ЖЖ т су ект бух ТХжтих ХК йно яру
Ук АВ Куй см В ЖК СБККЕК БУХ ба дома Бех С ж УщА ЛЕК лу
ЗІ тут ху жЯ5 о АВ
Ск ух Жим Вахта ЕХ хе ех тю кох ех кла Б яиФфоаКУ АВ КВ
КМ ША ТЙ
3 яти ТУ Хож Жосв ххх шу м У яких і кк У с Є жк Жах нич АК пл ум ож НИ лізі зт де Лв її? ло Жук іх хе : ЩЕ щі т; кг» ху НЕ піч щі іп Її Уві ім ше ше СІ А ЕЕ З и З о а А На НА НУ у 5 же хв
Ка що. 1 К-Х сш бли рути Жодві Еко ЖХюидт Жак МЛ ие А ди Жак пу Жук дме фуБунх чшЕ вжЖО ж ІМ БЕК Со ад я ши іш Ши тв кни Бак ЖЕ Бл зд "з зи
ХК «ІВ в ж Вк Б о сук МУЛ уча їй ує В о Жекухє Ура Жду уки тих гл трати т шу м МК ЕХ їх БО АК же аов Же ААУ АЖ Жидоу м М ЯКО зва зт я їх ящ
Ж до ВЕ -з тою тів В сш Є ду ку Фея ружА дає бот Кіа Ба пек Уві ї прото но ще МЕНЮ бе ї4 ху Шум хх тую Іде фею С Хід) дк дуюу ІДЕ Х БА
З ЖК КЕ ех ше ам Ж жк ДК Ох їш дек ї ЖЕО ЖЕК ММ БК Ме ца Ба 5
ХК а я но ау Но я АН НН НН Не а не ни З Но и и НМ гокх їв фшуУ АЖ гІМе ХУ ха ЖЕ ве яром Бех муж Бум т м ТІ ря т жар нь и в НН не НН Моск ен КО Ки Жук їн; щі мес Так Бек ей дез Ді а МВ щпожпх ла В УК шк КУ що пог мат пе ща 5
ТО 23 южлиж ОХ ОХ. с Трах З ко бух Ж м о ВМ я сажу ун ТА ху ХУ фл ях тк «ЖИ ЯМ ж їх ЖУК КУМ Ам АВМ и ЖК ме сли МУХ ХХ мому АХ кА МІ їх ке я ч їпо її КО г шутт да ху ск Жук ин Мр ду ТК Камо Ж деме КР УЮ дату Шшуує ХТЗ ох фея їжі а м с БА СН мід Бе ОМ Її, І км ж МЕМ, кре мух ї з г НИЖ «МУ в а шефи шва ша не НК А о в ви о НН На в Не Не п ж ух ху вт ка Ек УНаЖ сек МмУю еК Мх Сех Ам У ГЛ ФК ЗК МКМ ОКУ алух ЕК ча
УМ КА ж бххкжу Жонах ЯКЩО. суху Зуєв; Зб Ж3бех їн БУТ, фриуу 424 Фр Ку буде нку Мод
Буш ющши щу Мую ваше У ре мислю ши ше щі БМ ща ж УшО ВА до сих пе дош
Мах ї5о МЕ в дю жо фощмух туя Фбду сбержу ти уд оо МА СТУОщЩО обимнки Яр хкдово у я паю пн я їж Ве Щек о яліху тд Ер ОбиКою Бі тк ДЯ: Не їі ххх хм: АКАСЮ ЯМА а ДЖ КЕ ку в МОВ ОДюю Бім Бу мів УВО бика бу зи жк зок її з Тл т пуд ся де а ОУН НН ХК щу укл ших КО УЧНЯ о ре в Фе НА а хаче о Жим пет Жбдн драм їі ТО ує му бух ех ханех кюваи Ех сему аа ЖЖ си мо ше О-ЗеК шві щі Лю УХМИ. КУ ВК НЕК чошщх нор ку. ххх
Ми ДЕ КА
Б жо хх УУхд у ро: нн і КОН ак из ше яки Бе чи - руш їх ие діжку їж й КМ. У х Те ххх т их ху ух сх ст ЖІ ду бак меру оби м ше Бек сі хх п оса ТК ач ня в а М з м а В З В ВИ М З В В ЗК т ке тех
АІ шо «ТУ
Фу Іі Там її Можу жк хіх аж і я ЖЕКи Жора Ед батік хх ках
БО ЛЕ їх Ух ЩО ГУ МЖК му мив шніх ЖЖ МУ КАК чи ою мух пе єр мч «кри
В ШО І
Ух о ги фавиМ С Жуихя пуд ух їх ки Лю нини КК Жоєкіх о Жоехія ОСА ук МУ хо Жучея Сак ує
МБ АК УЖ Кк Кг УК ОюЖКЮ ЯКняК ОМ сала М ла хе А КО ше
За зв Ук зай
Мох У т «А АЯ «М х щ- - -е. - сп Ж. зд, як. -х ху ль. Ті АК Бе труси Тожех лах Жде о Дощ СИ Я лу ВМ: ЕМ Сг кУ Шах А уч
ТВі Вцешо ем Не Без БЕ МмжЖВ Кіш МмУшШ Афвро ЖЖ фо МС бле Зех и шах НН ЗЕ «ЕХ «ЛюМХ ЯАЛИЧ : й - я ще я оку щоя гуд ; г: пт ри уд мк Н чик хр КУМ СУ ї- ту см ХК жи хх Мо І щ Її Сід Зх сш БАЛ ж 0 Туя Ше їж Бека В. неза ас В КН З 1 У АВК У ФМ БЕ САМ ОЖМ КК
Фтит пишу ев
ЖАХ ХК шко 4 сис . х г я сх ех нн ни я НН АН НИ хх «АЛ ток ЖдА Ж Фр Фк ХК Можу слі хУу А 11 Ох КИ ФІМ 8 3
СА СЕК мук киш сМмЕ СК СУМ У ж у чек МКМ Ж О тО Ух вх пут сут «ук я хм окон ня ч пюч кт 2: с 2 хе кУхо х 4 КАТ
Чожукю МхХкрах о г охук о Ще ВОЖУТал КІ і кро стю ук у шу Сх мг нив що ЯН ую ТНЖ СУБ БІО вх зів бів сіб ЖУК АБИ Бек ТВБЕ о беУк Акз У мах зав зав зи хі кошеня Ве шШаее їЖа Бадру КО св тазі іч ав аж дю стру Тема: ат ін бле БИ пред
НЕ УЮ Ме БИК же ЕМО Хе зни ЖНю І ЖЕ ЧА ВМ КЕ хУулоу му о ВАМ СКУ пош хе хр че че екв
НН Мб Ах В
Е но їх хх тхує птлюї СЕх біжу Тл і що Бош ЖЕ жо нету б БЕМ Ж у Кк ПУ тео Сев Ге щі КО МИ ЗЕ слов МЯПТЮ кЖжеЮ ло жа ДАВ їз ХУ КК
ША мл З І ра ж ж хАКАЖОКИ ох че Фриз Тих АЛ що ти Ся ку ве т ок ФУТ34 фа ті т яд бу ЕК я т йї3
МАВ ІК У ка лиж Мпа їджак ж ие о я рос СІК щі ЖК аа ВГ дод зу
Чо за т
У А а
Хрржх Терееч о Фах Жученко ЧУВ їн ВЕ пал жу жа сину Їм УК яко кА ж шк я АК ких мон ІК я МТ МеОТЬ УшА А КО АТМ АЛЕКС суто оту дах
ЗК ЗК 55 а Ані Ж кас А У ше таку чну ідеєю Дошку лк що ю 3 УР сек У КЕ цем мі Був о сіє Ве УЮ БК ще вшю ба БіЗ УВО Само тео см вех
ЕК у тре сх керу
КНУ Де: А
Ху 1 ли Ло КІ усич. у ії я. Жашу ето не Жак бМьву сиру руч. Жеусем (фл Ж олія імя мі са ЗІБ рт Ка о дав оба о гух муш КО АТ ЄС КО УВА ем АВ
Зах аа ВЕ зпп
Споу Да Гід их ЩІК ЖІ б вузу бух слину фон о не Фо Жожеумо пла ша її шем жна к Бра Кляо їм МК ОККО Ж ОТО СКЛО ку ї УБК МвУВ о ких ЖЕ ме коро ЧК
З КН сх жо сах оС ен пу жк у Ж УУМОСТУМ п пчж У шедн А ОдуАя ни пт пКря бетк є го ФІ джу Док Пік ди їх Мід що дк Їх КМТ п ча же з зай су МВ Уа кг лет Св ек Уві Мейо Вій с дід поту дО ІХ дог
ЯН он ет фол ре бах тах тре у би куєє ач їжи чи Б А НКИ Фидщух Ек АЛ їжа» Мав фа Мі тек ТВ бій бує Беб Бер бек рей ек Бко су г ЧК з ду
АВ Б Ух трах СК ах Ми Маю Мк хо Мих Мкенух МО пром и дю Мах еко Юних Ки пін жав Уві Ме Те бір беж БЕОо йЛіз тах Мей Сех тб Беж БЕХ і БУ - Кк я а Зк
ЩІ іх НЯ ІЗ ня ФУ ке ке
Жах Жашиж у их ую Ху МО бат Мт ЗМ кіш Та Мох хи кур хо фе вх Мох аз аж ощБА ееК УщВИ УВК СУХ му б ме Аа ТК ж СКУ ОБСХУ ФМ
Зк т пет
Ж ЕХ с дн хі - тТтеуч фут М кр ЕХ фізику Мі ЇХ я зх шує їУреУу Магу п лах а ів же ТеУю Зак мук шже і мій ще во дез АївВ бе туї аг я
ХХ М лий страху ку Щі що теє че вес лк вк стае Вл йду Мі ху БЕ Ж гія ех Бек аа мех УЖ йвЖЕЧ УЖ ок ду м ЕК ма МО КЕКВМ ОБЛ юку т рве шт
БО А БО сих сли ку СУТ чия жу Ма тик ТЯ тво Ті бек ща МеО щі ши ек су век Ам ЕКО АВМ шва БЮ Ом Ки АЮ ОВТ КАК ху що тк ке хг ко її В рем що Ех - чу не. - що с се їх х Я дум ці МУ ж а Жах окт ХА. зх юю Туючав їм Ух Її хх ЗЕ стан Му ЖХхву СИхКк у ТОЖ х піс двро іі Віа ОО Ту сбв СУув о пів а Жуює АБО Бех ТК Бл ТУЄ ке док Фк з гу .
М Ми ОХ зежужє жукуих 3 а фа я АТ аг жррах Ж хв б дет я я Ов ях Я хкко буку М їх хі Ві
ЖЕО КІМ у бю ом С ЖжЖ о му ем мА А мущш жк ДК Ева якАХА. БА лови яки яв
Б ща що ка не Не а и НА о в ШК Жду шу долею ТЯ. ЖЕ ух. Ж дузі боже Мухи МКК миле че У, ше вод є Бе Еко КБ КТУ МК АМС КІ ду ж НИК М Ба мг домкіх чо
ЕН КА
ТВ оАлв ех бві б бою гар бе Же Дам Шах СР їх з Я и а Ми ми КАМ М З Ми ЩХ зви БИйпе Бек кт Щукін о діщ х З що о шшжМе аа аа КИЛЕ БУМ ЕКО Кр Ам ЯМИ че чЯ КК їх 150 як 158 сок КІ
Пощ о баі сл бкть Їде СВІ дит аг Вл їн пт ке п дек Ве гі мим тк ШЖМХЮ ЖЕ ме з Мак МЕМ У МАХ САТ НК шу ВгЮК ох Ще
З ат яке пох й
І КО тех чи
М ОЙ АЖ жк 2 и Не я ух
Сі Жах ж З твої З жа КУТУ а НИ А Уроку Пух Су Три М т х ем век ДІ Тих баб ст беро Бек дух Ажю Щек бю бю ехо жна де -шЕ зриви І
Ех їх Кк ж ТК КМ - си т о - - : 4 :
Хек сп Тр пк вз31 ШЕ їдою Маша ЕЛ Х «ку ЖК зо ху КСВ ст веж жк Се Кв»х би Бек У ва мив УЖ ли МеВ Ма ост УВО ТУЖ іє г хж шк й й м та дик «ще
ІБ НИеЖІЯ З:
БЕ Де БІ
Се чи ИН ЧА -о ту ще 4 :
Мі бок біз а бе Щі ох іа ЖУТяхх їодиз дує Ха Жанеу я бл впав стжв вів ті Жах нів обі слу давл меж ек Вжо Уві ТВБК бух аж ех горя т й Ш і щ за туку
КАХ «НИ КУ -і - с вт ня
Міїшм о Хухх» омоих ЛЕ. М фт йхіху
КУМ Вже А У КУА АК ше по и и Нм скл ж ач дО « : 3 -
А ТУ жк ол Ки ТУ о Ми їж Ко ит тд Не ток Уч піч за УВА Сеат їмо Уві ст бек де Мі сах Уві іа му ки КУ іш
Кч к: -х и
А 5 13 ї5 скор З Кор Яка во бю го фл М: Фуннмі ЧЗ ди о лиж ПЗіча Зих СИ крує соккух МХротих меж чаї МУБ ВК БеК Суш КУБ да ЕК У ЖК О КЛЕоО Кк це тик о Бек Тух ту ЗЕ ще ща Мем ЗО ет Щашов 123 у бах ХЕ сток Др рих Крусю бля ші у: жк СК гя Я треку ТК дз тик Мас нів ТЕ ія; МЕ АК СХ 15 ВК БЖ КУМ І Сн Кк АВ Ух ке ДАЕ
З З В; Я
ЕЕ стук ще
Зх са ух ю в я млю КУ кох ву Я сх Ух, т зр Фо Ж . сх Ку ях
Мах їх КЛех суч їжи їх Хан Ми Ту кеш но р НА У ке че
Не у М Км - од мес Бе яв У Лек ВК ще я ЖАХ пів 5 У гр: шоу оц п
У що щи тд дао жи КО о раю сода З А «кожи я сх З се гук зл 3. шк тк хе пк І тре щі ФУ сне Моск Жоювих Ящик поко и Тс ТУ що Ля Ж мух
МАТ МАУ ТУ и вв жКжК Ми лак ав Вр о муш се ек ех ЗУ міш ДУХ ши тку у гр; «УХЕ ТО Ту РЕЖ
Міша ові Бі фо бе ан мч ТХТ хну Ши щі АК чию рук Же
Ме фа Бе аж Бек ча Кп снВЖ лам ещро ак АВ о МЕ КУ КУ В 4 ї Ї В: пах Фе що
КЕ хі ж су сах ги хх Ен гук вт х « 4 ун г «Ух ах лют
Що сш ТІ хе о лю баню Ух кн Тек Деу ав Ще пвх Ману сну о ва ше ку су як УК Ку АККЩ ду КК Же Аве СЕ КОЖ У СЕ тк тр, чок що «КЕТУ МОКАЕ ше СТУ юх кує ул тт кока Км т - ее с «ех ж я - ля не хх Га КІ У ту з ТЕ шу А ех ТПвух ото хуєх ФІ ЛЬЯ 5 Жлідеуку дід хх хе
Макя У ПЕОМ ща САУ жа Бе Бек да ше СЕ УЧ 3 У ОБЖ ЮО У3, І; ча зосур:х Фотук
Как 5 НЯ таж Хфим Ж му ОВУ куту Ки т ку ж Уесрдсюю ЩЕ ох У чх кї ча
ЗУ Ще ї «5 121 буучкчяо Шев Ше бр др Уміє сиру Уж УТ ях Кр АТР кл: КІ ме Ал Бр Бех Бу шок АК МеК Х ен І НН КО Ав
Ок яолю З шига
КМ 2 ск
Толя З мує їшУМ. 3ГгУ бух Щеня Ліза Тр: ПЕ г. пу ТА ря ХК а ке У Су ЯМ Уві МУущ ВВЕ ТУЮ рів БЮ й ке УМ Кох УВК ше чом ЗТ з чаш
ЖАХ АХ АТХ КК пухку ех фбнюух ГА я ж УКІіцн о Же г ТЯ о Мр Журі: ун Вт о Я ї т до пе Ку и Кох а ЛК Ха рН Бк І 2 В й ЖК ми ут Тх ХЕ
ЖІ А ех су аж мМ АБИ же ії жі ВЖЕ ОТ МЕНЕ БЕЖ щі Ущі
Зх тм ве
НУ ке 175
Ж дух ОБЛ ск ЩЕ КА ех. дути Махно ЖИ Кая Жид Ком ХК СХ МАТ рі ж М
МАЩ ЛЮ ВЕК БЕХ У жа Т Ко шк о машжи мшик ЕК жеО ш щрИКОК чо я тут я вх
А АСяМ м КН А ИН з кі зер НН А НН я НН Ну НЕ
У. чеком о в ал я А МИЛЬ а З км кі кре З яю лю Тож Кт о Туші ЕЛ ох Зо
ВК АЖ Ка ДН ско у ТЕ Би Таж щи ЧИ НІ Жде лав Мово ЗУУ В їв що В
Тана х Жди Хіт СКУ: оазис о бік оо фтюю В Фа бен фрккм иа тки ах
КЖжех смж Еш АК мВ ча ие смМУК му ж й ЕК щук зе ую си ск жу ект теру щи КУШКс хх "хіх ТИ З ще сві го Ж Шу гуд хата ЖОВ Лани ЖІ Бод Па и СУ ех: Во ДЕ МАВ САЛЮЮ О Є ж КА. Ех км НУ ОО ЕКС ех Ки ЛЮ МАХ КАХ ККУ дО У У
СО тат Де ВЕ: ку ху И МІЛЬ ІЙ ЛЕ
Укет. Жак Агщ их Тихі Ки: Бех БВжу їуочЕ Шуть бок А Жвк Блдеазі Мей рід
КК ее жа ЇМ ме киш БК КжЖе ку КО мух р як ОшХх Вих ЖАК пе уж утіх те хм за че Кон КОЛО чн а ач Ух ЖЖ скул иумо ХТО Ж чу пох ХУ іх ДЯ гм ія ви одлищ СбпУ кКжб а УА жа АЖ УВО акме ЗМУ Ма ж ЛАВ АК «уд ча сита ка ЗВУ хї ІЗ но цо ккд зов -е пох - х ек сту х з ж кл и ШЕ и босих учи ух хе са Бе дапоуте беж Ма дви Обі Уві «Мар осві Вів жМмаМ КМ А мя Му в ожве АВ Ж. їй Уж ОМ АСУ ЖАВ АХА ДК ККАКХ ре жк пи трІв ц хе БЕ «ОО ке хе тітку Ж жкую Жуусую стадо мяз КА ач зрхжуї йапут Ж юо юемо рю Мом я Же УЖ СКЛУ ЗУ КО КА ВИ МИМО ККУ КО ях укожник СЕК ОЕ МЖК кро ох пеня ях ср
ТУ ХХтК Кам «А Оу пи зЕщ а Сину ові іч ен хх лому БЖ шу бі рач о Сб тяж тар Мав БІК фол ча мер ех зей дей є ща ни Ва маю Юди ана лем Ку Ту п я дав дк порту
Згих 310 1 ЕК
Є. ся чи Тл аму бю тх Ток чтщ «Фихмус Хіт Хом ТО що Би Бу Д ІН дж СК ду Н ж
МАМО КУЮ ж УЮ БУ жк ж БМ АЖ ЖАЛА. ЖДБИМО шЖЖжА ЖАКА Ж БМ ДК тоху ж срех су ух за КЕ і
КашЕУ ЖжвиЕ Хі св бе Вів їв я Фах уч уч ГУТІ беею тре г На мив ожаж їж Єоке зуБ вив мук ау са юЖж м шаМм ЕКО СА Уві Ух кох ер су ех ля Ко ЗБ т Я ххх Я у
УєЄбру чую ЛО шх пики Ван ММ ямки С Мочиили ух ТЛ Код Ов ю ух Ж паху БУЛ кі ххкрї Фах Бал хм МЕМ ис БЕ шк аАКо Ве пам б ТИаХ Буш Авт сію УВА бек Кам
ЗБ БЕЗ пе ; я - Н де ще чи А
У бай ую ЗАТ ту пеРяу ХУкуюх СбИхуах Міахех вк ах т Н пох 1 ж ках о СУуж цем зво дув ші Бое ЖУК вЕО бек вв ода Авво Уві сао ТЕ хг піку вух
І Зі з й о - з «Ж х Я тек. сода си МКУ Му ери ях КАН
ХУ ж дух ліміт кА Ша баз Мат Суд кає ТТ РХ І і Пи пе алу би
САМОК ММЗ фу сить Кжк їм Зах ХО УКОМУ ВАЖКО КЕ Ву Мжем у ух це за яти
АВ З й ОшТІ КА
Уже Е 5. тр. х з ня ни а гамі сх им емо М ж сю Ди Ку Та хи МЕ Тему Тека МЗБрю ях ї Лют» па Ав бек де юс НЕ Ві Бі: інші ЯК мМ Ж АЖ АБО СУА, ТЕО
Її ї Я й : -
ЮК КХ КУН
Щі що ох сх ще -х т коми біде У ан ВХ жде Сую о фомже спро а жа жі КМ ху бо хг ЗізжУ ІЕМ дач. ОТО лою Мат. чів був бек АкОа ТЕ Січ з щіУ Авп о УА Ве бек СуУув щех бві Ме: НІВ й "У й К й ши пок пол у
СУ Са Ус : 4 : З хи - ФІ г Швже бочаї Житає Жрутих я - Зо зії сх о йезуї УЧ хх сб маю тА тях тохужу Фтиху т хи ЕВ» бу Ми шу пів Мід їв; о Нів Дюм МОВ її УЖ КМ Оса Ме зЗшжК меш Нє Бе ЗК КАК; ку дах дак 35 щи ве
ТЛ
У
: че М сих шар Мох вт чемеврих опер еуевих ж и в ит ме и честі до суди Б Вуу ух деечкерЕ мх Гн: «Песни косо зЗавьрсчосв ссасчачаоя зач вго абоссчее Кот кя ЕЕ, ЗЕ ви ше шу пн НК АТАК чо спо вве стешиі. сила ші но бек Боня щмочсшсси всю с Чо шою у МЕ А ее шк
Кв товсосінсоц босабсвовя нм ша спа є о щеешЕнь швсчщчсЕос пох и соч МОСТОМ ВС І з
НУ фесту х як я яу о о о ня еВ ух Ум тру у ух и. хижих, ТЕ Ти "дев иащск сдцреосннє БащенМлтив мої Кз щетих птЕзсаВвас сенс з:
ІК Щ мно ен м и м м м и м кн и и о ЕВ УК ве ї І м У; З З
КЕН
5 чен р НН
КЕ имя В фе се ее оц уж кут є пров в и. ЧТ их оо вЕтЕшВсеКчлва пиКшаВшеве занесено ЗЕ чОо зраз спосо висо ще х
ЗО хх К ч їх с, У чи А ЧИ ЧИН а в КН НО пок очеУю і М ща Каже де щд ие миро ПЕВ РК ІН
ФЕМ ОАЕ НИ сія сист о нари Кл КЗ У а Б Кл В КІН
Б
ЕК ее гурт р Ер уже прп ово М уд. тує кмссмтсския песик Бочка ие
«212» ДНК 213» Штучна послідовність «223» ПШЕН1-48 УНН «4005» 121 ававщоссвсоа «коза чоя сад ощовоо сок оКе го сзюсмх Сокме чІчовосекс виру сеанн Єексочовеаоє озцаЧчесоеане безос се їй поса взЗИиКшс сабо зоссзчсесво восссЕвесЗ азс чевУМкащао ї5о шввоусввосно сФачобвача сосозчнасча есрачоога сркасоссоЗзо вас,
КЕ: ніж ек фе лих АК ум ж м я Мох шу у шити ос и ужив фін Мои
ОС КиомМ Є пава ВК ти рН КОНКУ СН Ми уює
ЖІН зсачевксвка песто сус чаио озон в чепцесексоа бе сІое
ЗЕ нач ки ки зако иа же т и у чи «окис їх їх оку сувеЖ ую щи уки ж УМ ву гоже ще ро ї Уж жиМ
З с Б У ЗК ра АБІС З ОК г Б М Б. М М Я всех З їх ще АН Не НАСЗе ме с ко
ООН ОН ВЕЧОИ КУ вання «2105 122 «2115 396 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» ПШЕН1-49 МІ. «4005 122 зчзавесочесв ссасзичЕв чссвзосв воски Соеассопсваас вЗоаВвсвоце 5 зЗкчсвсвакч всасшсвчає чвоссзсазаче сесосшацчео сем се це в
ВУАН ве са свока безоВвсчоВа зоосссчаз засво саєв еаасювец «есе що шпензівачссст сазан евавоесико зов о зов оса суд м
КН чЕчессВвчсс чакЕсацоеча Ессе ссв зо осячеЕ все сиза забив ренх а сочозцостя вче свсссасеах бдосвесви БЕсчоВсВвю зеовсжвовВах зво
КУ жтміді щі судово свт ефе вет
ММА І СК ИНА чек сві Ко СС
МЕ
«2105 123 «2115» 440 «212» ДНК 213» Штучна послідовність
«223» ПШЕНІ1-49. УН «4005» 123 зазсксочсха стуки све зосЕзЗВс вис сезон. вс вороха ен ще чисспакково вчокасавашь сова зчопоВескя позсозачос соч гУБезрдткдр зе. З Кксслльен стенд висить ВЕКа ба азот крехря р ОА Ко МУК ти МО УК КІК М АК в АЮ рек ККУ троп
МОЮ, зачовасзес ссзчессася сосок аЄозлеалсеся сСссзесеу се соУве до УК ям й їх у УЖ фо о км и МО рис ужив пух пу пю ліроя и фжо ен не НН НН ни возвсаевов Все Козова засо в екс шипа іга
ОМ
ЩА -ц- вся ча кни НИ ЗО гай о китах її со ва а се МОТО зво ввсасоссавя зееасачсно свсчовстАє ЄСесочосваЗ зевсоваеН зас чи фур ов ру туї
МЖК СТ СІНА ав «2105 124 «2115» 399 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» ПШЕНІ1-57 М «4005» 124 чазиесчесВ совізочнеКа чис ВОВК осо поп осисс спосо і ія ша і З лення У Я
ЕН
ФВ т вач у пд жави ач їх М дру седеульсту сту т ие кру е жі рег притчу ки ужити їх ока и но как ок и по о Ка вежі дух ле ке їх СЕМ ЕЖМУ Кох. ви Б міх АЛ, БУ Гей
У спсзоеєсво сзвчеєЗовВе зе весовВи завінениаса ЗеааоКос соочавева чим Е ще сацаваоскУ зисЗауоишо бозчоБеЗзско зоб звчові бесевсВвящо озон чо психо гі Ук Кф ку музу о ФК хів ек а А о рони АН ин но НН А
ВвІссскцвос чо озЗУ зЗесвазососв ззеовессавВсо сага чес сво чЕзевВчссое вада сзс вве Сбоссешшляиов щошеасвося цен сок дих : во
Фе екех сецчешносма ссеоасас зво зиа «2105» 125 «2115 440 «212» ДНК 213» Штучна послідовність
«223» ПШЕНІ1-57. УН «4005» 125 зер свеся созвсочччскЯя чачосесаво всесктцактеєс. соч щоєво вчасевитсо «0 чечевосвок во ЕчеВеЕ «зобов ес «рочовчоЄює гещесюю Є чс як дяк щих дув ай тхтеМ етрх рю и ум ЕВ сх вк ще веезкітад гос сш ке ує я кл СК УБи Бу Ка КІ ух» Мщум о Ию ех у і Мн ЖК Кокс м ко и М Му А і ху МН ТИ що пчусовчдекос сскдупузавеча ссбочзасач чеоЕчоссквов свое осСою сао юмоо ха
ВвЕБЕССЕВсСЯ сон лоЗ Сваззощоце біси сао зерня шк
Бе всоссЕЕстЯє боисадвецво Єсшокевоссео посовацасяа сода каст
Ти
ХМ з«чаопвччссє поцщесенІС ЄвзБечесвеє бос санках ос є песчевисов осо
МожЯ г «2105 126 «2115 396 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» ПШЕНІ-65 МІ «4005» 126 чазвсскчоса сао со ссср аск оос ЗУ свао вчЄса сце
БИ часов соз зазксчечає засос ссощчосвосВ плесо сопе ох,
Каже полимукІф ух є схоче у суху М мМ ель ІЗ І ЖЕ ттуюжития годі щи тел в МмІ га
ХОМ х» І кла ші ЗО ЩшЕеМА хату А КМКТ ОКХ ее рн нн и в В НН В В В: саспзазосвч сочевлєсвеє сачазосоко асесваессс скоса вовка чЕсессосомоо закл зло є засво совоскуЗає св КЕосао
ПОТУ ям звсчезасосу аозасосече совка о КотгсазчоваЄ возвусовса сосок Вов село дово саазеє зоавасавВас чи «2105 127 «2115 446 «212» ДНК 213» Штучна послідовність «220» «223» ПШЕНІ1-65. УН
«400» 127 поженєюуюни шенлхира я овеча ва бом екиємх бороюеех «рус чевсовокесє вопобосавске зососовевою Фаспоссоваю кечосаако коеф заз ти ссбчсваає бвзчзсоФеуевс возі линитеє сееасаскає зов жк й ії заасвацсевис сасповсазча воссозессз асвззчесака сбравоссав вгадав мя З всащаствосяь сво Єовоненну дес ововВ сещсоонома зессшоБкЕ звштсздсвсата посбазчесова сброоссовио вчролаовгса дедпевасчов спасісдосх синочка сс счасоЗ зе сся зЗВесВесооч своп чеВе соєве чЕшачеащюю сокбсвиова чо «210» 128 -211517 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Визначений за Кабатом Мом19 НС СОВ2 мишачий «400» 128 дич ще МІВ со ТУХ Ав оЗіУ ДЕ ОВ вне стек ва бів дай Кі був
Ка НКУ Кк 3:
ДЕ
«2105» 129 -211517 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Визначений за Кабатом Мом19 НС СОНВ2 людський «400» 129 дуб хів Мі Бо Жек бро бі Вер ВЕ Ве о ТУх Бе) пір бе Бе ОД «2105130 -211517 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» ТИЕВ1-49 визначений за Кабатом НС СОН2 «400» 130
Вів тів ТуУук ЕКО біУ дДвгб бек Ве о жнЕ ЖнНЕ Тек Авт бува душ ква Му 1 ї їз ї5
Сгх

Claims (1)

  1. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
    1. Виділений полінуклеотид, що містить (ї) нуклеїнову кислоту, яка містить послідовність, що кодує варіабельний домен важкого ланцюга (МН) антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, і (її) нуклеїнову кислоту, яка містить послідовність, що кодує варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, причому антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент специфічно зв'язується з рецептором 1 фолату людини, при цьому МН містить НС СОКТ, що містить амінокислотну послідовність ЗУЕММ (ЗЕО ІО МО: 1); (Б) Не СОК2, що містить амінокислотну послідовність КІНРУОСОТЕУМОКРОС (5ЕО ІЮО МО: 2); і (с) Не СОКУ, що містить амінокислотну послідовність /УОС5КАМОМ (ЗЕО І МО: 3), і при цьому МІ. містить (а) ЇС СОМ, що містить амінокислотну послідовність КАБОБМЗЕАСТЗІ МН (5ЗЕО І МО: 7); () С СОК2, що містить амінокислотну послідовність КАЗМІЕА (5ЕО ІО МО: 8); і (0) 1 С СОКЗ, що містить амінокислотну послідовність ФОБКЕМРУТ (5ЕО ІЮ МО: 9).
    2. Виділений полінуклеотид за п. 1, в якому УН містить амінокислотну послідовність ЗО | МО:
    4.
    3. Виділений полінуклеотид за п. 2, в якому нуклеїнова кислота, яка містить послідовність, що кодує МН, кодує важкий ланцюг (НС) що містить таку ж амінокислотну послідовність, що і амінокислотна послідовність важкого ланцюга, кодованого плазмідою, депонованою в АТОЄ за номером РТА-10779.
    4. Виділений полінуклеотид за п. 1, в якому Мі. містить амінокислотну послідовність ЗБОЮ МО:
    10.
    5. Виділений полінуклеотид за п. 4, в якому нуклеїнова кислота, яка містить послідовність, що кодує МІ, кодує легкий ланцюг (С), що містить таку ж амінокислотну послідовність, що і амінокислотна послідовність легкого ланцюга, кодованого плазмідою, депонованою в АТСС за номером РТА-10773.
    6. Виділений полінуклеотид за п. 1, в якому Мі. містить амінокислотну послідовність ЗЕО | МО:
    11.
    7. Виділений полінуклеотид за п. 6, в якому нуклеїнова кислота, яка містить послідовність, що кодує Мі, кодує легкий ланцюг (С), що містить таку ж амінокислотну послідовність, що і амінокиспотна послідовність легкого ланцюга, кодованого плазмідою, депонованою в АТОСО за номером РТА-10774.
    8. Виділений полінуклеотид за п. 1, в якому УН містить амінокислотну послідовність ЗЕО ОО МО: 4, та в якому Мі. містить амінокислотну послідовність ЗКО ОО МО 10.
    9. Виділений полінуклеотид за п. 8, в якому нуклеїнова кислота, яка містить послідовність, що кодує МН, кодує НС, що містить таку ж амінокислотну послідовність, що | амінокислотна послідовність важкого ланцюга, кодованого плазмідою, депонованою в АТСС за номером РТА- 10772, та в якому нуклеїнова кислота, яка містить послідовність, що кодує Мі, кодує ГО, що містить таку ж амінокислотну послідовність, що ї амінокислотна послідовність легкого ланцюга, кодованого плазмідою, депонованою в АТО за номером РТА-10773.
    10. Виділений полінуклеотид за п. ії, в якому УН містить амінокислотну послідовність ЗКО ІЮ МО: 4, та в якому М. містить амінокиспотну послідовність ЗЕО І МО: 11.
    11. Виділений попінуклеотид за п. 10, в якому нуклеїнова кислота, яка містить послідовність, що кодує МН, кодує НС, що містить таку ж амінокислотну послідовність, що | амінокислотна послідовність важкого ланцюга, кодованого плазмідою, депонованою в АТОСС за номером РТА- 10779, 1 в якому нуклеїнова кислота, яка містить послідовність, що кодує Мі, кодує СС, що містить таку ж амінокислотну послідовність, що ії амінокислотна послідовність легкого ланцюга, кодованого плазмідою, депонованою в АТОС за номером РТА-10774,
    12. Виділений полінуклеотид за п. 1, в якому послідовність, що кодує УН, містить послідовність ЗБОЮ МО: 5 і в якому послідовність, що кодує Мі,, містить послідовність ЗЕО Ю МО: 14.
    13. Виділений полінуклеотид за п. 1, в якому послідовність, що кодує МН, містить послідовність ЗЕОЮ МО: 5 і в якому послідовність, що кодує МІ., містить послідовність ЗЕО І МО: 15.
    14. Вектор, що містить полінуклеотид за будь-яким з пп. 1-13.
    15. Виділена клітина-хазяїн, яка містить полінуклеотид за будь-яким з пп. 1-13.
    16. Виділена клітина-хазяїн, яка містить (ії) полінуклеотид, шо містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельний домен важкого ланцюга (МН) антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, що зв'язує ЕОЇ КТ, і (ії) полінуклеотид, шо містить послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує варіабельний домен легкого ланцюга (МІ) антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, при цьому варіабельний домен важкого ланцюга містить (а) НС СОКТ, що містить амінокислотну послідовність ЗМЕММ (5ЕО ІО МО: 1); (в) НС СОК2, що містить амінокислотну послідовність КІНРУМОСОТЕУМОКРОС (5ЕО ІО МО: 2); і (с) НС СОКЗ, що містить амінокислотну послідовність ХОСЗКАМОМ (ЗЕО ІЮО МО: 3), і при цьому варіабельний домен легкого ланцюга містить (а) С СОКт!, що містить амінокислотну послідовність КАБОБМБЕАСТОІ МН (ЗЕО І МО: 7); (Б) ГО СОК2, що містить амінокислотну послідовність КАБМІ ЕА (5ЕО ІО МО: 8); і (с) ГО СОКЗ, що містить амінокислотну послідовність ООБКЕХУРУТ (ЗЕО ІО МО: 9).
    17. Виділена клітина-хазяїн за п. 16, в якій МН містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 4 і МІ. містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 10.
    18. Виділена клітина-хазяїн за п. 16, в якій МН містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 4 і МІ. містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 11.
    19. Виділена клітина-хазяїн за п. 16, в якій послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує УН, кодує важкий ланцюг, що містить таку ж амінокислотну послідовність, що і амінокислотна послідовність важкого ланцюга, кодованого плазмідою, депонованою в Американській колекції типових культур (АТСС) за номером РТА-10772, та в якій послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує МІ, кодує легкий ланцюг, що містить таку ж амінокислотну послідовність, що і амінокислотна послідовність легкого ланцюга, кодованого плазмідою, депонованою в АТСС за номером РТА-10773.
    20. Виділена клітина-хазяїн за п. 16, в якій послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує МН, кодує важкий ланцюг, що містить таку ж амінокислотну послідовність, що і амінокислотна послідовність важкого ланцюга, кодованого плазмідою, депонованою в Американській колекції типових культур (АТСС) за номером РТА-10772, та в якій послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує МІ, кодує легкий ланцюг, що містить таку ж амінокислотну послідовність, що і амінокислотна послідовність легкого ланцюга, кодованого плазмідою, депонованою в АТСС за Зо номером РТА-10774.
    21. Виділена клітина-хазяїн за п. 16, в якій послідовність, що кодує МН, містить ЗЕО ІЮО МО: 5.
    22. Виділена клітина-хазяїн за п. 16, в якій послідовність, що кодує МІ, містить послідовність ЗЕО ІО МО: 14.
    23. Виділена клітина-хазяїн за п. 16, в якій послідовність, що кодує МН, містить ЗЕО ІЮ МО: 5, і в якій послідовність, що кодує МІ, містить послідовність ЗЕО ІО МО: 14.
    24. Виділена клітина-хазяїн за п. 16, в якій послідовність, що кодує МІ, містить послідовність ЗЕО ІО МО: 15.
    25. Виділена клітина-хазяїн за п. 16, в якій послідовність, що кодує МН, містить ЗЕО ІЮ МО: 5, і в якій послідовність, що кодує МІ, містить послідовність ЗЕО ІЮО МО: 15.
    ДЕК АКА УУУУУМУУУУУУУУУУ УУУУУУУУУУУУУУУУУУ КК к АКК КК АкКАкКмьму І Яку дам Ї ех зо я сек юю КК ЖК АЖ КК Ж ЖАКА деллнкх х с рез км, мВ Ж куме щи Ми Е свя у их КОЖ ЯК Хр Ж ОБ БК оіе Ос вмінні З . се АНА КТ ііечм. вх у т а із Е: ї ; і Ю ІЗ Ко І На Е ГКЗ і нин нин нн нн нн нн нн нн мен о ї ж Кк ТЗ Е «тк тиж кю скжифккююкя ск х АКТ Ж КК нн кіль о п ЇХ р т т т Ку : м і Е ї фуру А о оон Мн ор нрвновннноя п а Ще й. Е Як Ж Ей в ТЕН ї КО у; З з З З КЗ Її Й Я. 3 їх Її: Е В з і і А - їх пиво х с лення со оон МУК сткккссвкек 15 З Кк ща Ж. ж ке КН о с кн з я У» Зх Ко: З в у т х гл х зни со зання її хх ее У х Б ЩЕ СЯ йо Ко Дедекюкіютююси с ків ї у Доєстесесестогегоооесте се У т То (я З КК Ж Ж КК М кА Кк Кк ки Кен окре Кок Кок в ЕК Коко век Я Е я ІЗ с 53 В К КЗЗ Ж КЯ Кк ккал КК КК кА кАКК КАК КК аз заз я КОМ и : а: ту сх в т ОМ У ІЗ їЗ Б пен м в о КК с Я М й я нн и 3 сн нн Ї і ЕІ їх її :
    БР. й КЗ КЗ Ки Н Енн ен змін стран нн в ноя сан й нон нн ВО КІ ЩЕ їх їз З у 5 м о в хи. Ж сї У ща з Я і ях Я ВУ Кк ЕК Її Е: Ж Я ЕТ н ях хх у: Я ї З х Е: з ЩЕ ЕВ. З | ! ї Хжккскдкнкккккні Ум дих ик нан НЯ А зно ск саке Кк КАХ Ж ІЗ й ДЕ Е й й є. і ПИлУМУюх ДАТА КО КК КК КМУ КУМ мкм ЕХ з їх Я їх п ї з ї 8) КЕ. ве Е В і Кан тех с не Е. ни лк нн нн нення нн они ї с т ї ех З у Я С З ОО НК. Ку Її МУ 3 і МЕ : В в о п сх зання ех се У Од Е х те х ше Ж МИ Кк. Ме ТУ : Кк М Ко 5 сежккфкжжкаж как ехо юєя ооо еео ооо екс х ок Е х де у су Я ї НО Б. З КЕ і В й Я деераит се з У з ря кю зминання ї Є із з ї У з ї ОЦ Кк Ко. чи А НН ї фол сф нини: ие пн інн се я із с В с х ТКУ ї х НЕ Ж В с ї
    Фіг. А они нн о В ння І ІВІВЕНИ лиц З нечЯ н » д - с мова КОХ В оце тия ВЕНИ Вила Ї нн нн ОО Е ші (З я Си. МУК ХУ МУКи пеню рн» сич три рач чч їх й ї вх сх рови о КК КК КК М ОЦ КК ї ку и р» не їх Ї лк по ї КЕ мнения ; Хукамя ня їх х З Х я ХУ КК ї КЕ С І ЕЗ Н Кессосовсюсукю сн нн а ККУ екюююююьюєкюкьккихю сю ж жують срок «Хек жк ї х Ь -к3 Ж ї 1 т г ВЕ ї Док юю тк кн КК МКК Кк Кк КК КК ДАК АЖ Кік кн т. їй Кк. К і КЕ ї фік о в В КУ І сх В де в ї Кох ва 5 ї ї фа ля і АТ Кілія сімя, ї хе х ве З ї ХК ї Е Х ї. Ка 2 ее я скх : ях з З Е 3 Я В Сай З Нд х Го ач а он нн номен ІЗ ку ТУ КО ІЗ У Ко їх Мі В ЕФ ї ока нн : ення З Я Кк Хей ща нн В нн ик и п х ї г ї ГУ ї г ї З ії х СУ ЕІ ТК І щ 5 Фанати Жим» жи жк ЕЕкркю Ек ЕЕЕкес Мов рою ххх» «ЖЖ юю її ай г хх Е Ж Я : нн ун ман мнения прекккннк Кок х сосякннннку СКУ Кк її о Кей : о о о о о ау Хм х х Ек х а Е ч х БУ М Мх ся хх з ск Я се ско пен о он нн се Я сх : ще, Е ще ях Ж ї Бе . Б г. с» нави і и аа ха їх - Ко
    В. В Е.О Що щ Ще АК ОВ с я кДж ск З хх і Кк с ІЩЕ в Е а Х В ож г обі теїно око МИХ в ши ни ЩО (В Її ї ЕХ Е ще ї З ІЗ Кох БУ їх З І У ХХ Е БУ ж о оон кс мин ння нн ни ОЗ З ЗК КЗ дулю ск екки юн х хх х ОО км
    Фіг. їв ї.
    : появи огіосеотототетстся Їнпкинйткоіжчюсо А я ї : | зм пон Деко кн вюснічунакннес тест ї В ЯК МВ Н перлененені о чех о ВО Н : в Канени Мілвачнй Ето ьеМ ППівлінном МЕ пер деття вка хулнї Код ж й ТЕН УК щмчкі Вуді рентний ЗВляиВНаМ Її ЯМ ів КаЮЗЕ ртвішаннк ВОдеВНИК А КН т : ї і і З | БО Е х ; і» ши шк ія ! : ЕК Я Е ! хх ! щі Я й і В СУУУУУУУ УК КУ ХУ УК У 5 о Ї Е З ! У : м ї Я Я фу У ненні ій : у гу З Кк ; Ї ; : нн нн Мои З З ге ; че ше ин нен кін ; ши ши ша ша ешш. у ї й п пи Н й : Ї тр Е У ! пон ше ше не ше ен нина кН я КЕ Е ; не ї 3. «АААААААТ ТТ, Коддннняннх у їх і Кк і З к Е г ї Ух з Р А стен ! нй ення кпожкнфкетеесниніксеннк НЕ АНА НН В Н Я : В : не ї : я роезвннннноннии и ялин, Поч х. ї. Сай З ї у З і Е ! кн в НИ; і Бе Е Б : о в : щі і рекннтнинях по п Длххячккккккк яння: ї й і | та | | КО : : нен нн нн нн і сх Кк і що Е ї до ї у Е ; ЗУ досоєюоююююю юю юютях 3 3 р! . я ї х Е хх фе куму зно у мшнни ДМК КАК днк нинт - 3 Я Н ІЗ ї З. : Я ; М ї пт на ке: і Її а | ; | ї | ше Е ши иа їн и и М. ШЕ ї3 Ї зе : ! ї : нин пня их ко щк вк як нь З НА ЧИ Кк . р щу х скний Золота у : їх Е тв, ; 5 їх | Е я нн, зн ши сне и ни и м ЖЕ м ши НИ ИН: ИН. і в зн и ви Ї нн см ння нн х 3 5 Н ЕЙ В 5 : Коко з Ї укчкекя Досюююсюссюсюстсов В З ї : гу Е в : в ! і офорт фе тн инн ї ре еу а Н ; і Х : ЩІ нин и и В МАННА й : ! ше ї с х й щ- Дкетннтютжкнююфилтть А АК І в | й я : - і ки З скл ен нини нина ї я Н М ї гій : : ща ї : ї в екон шини шин ннннннкрючнюнсня Вудння шлю ВЖЕ | КЕ г ї ! че ї : Доленмитттнннях на но Мак : Я Е ; | : Е ; вх ! рани нн З ще в п 1 КЕ Ї ЕК Її х ЗО: й ї я : і ка мн се К : то вн нн: нини 3 сен нююсной цу : Е : і : ке | З ! ре ї пенчт пенні ол вен Дует нукн ск фік кккхвКу о ї В: й : Б ї ще нн в ї ї й Н Ук Е ІЗ ж Я пе ї Беку Хужуюух ючих 5 5 ї ІЗ ТЕ Я 5 Я ще ї ї ен ї г у 1 і Я Н Ек НІ З : ее ен ко ї ї їв 4 Кк Е х ! ї т т ; - МААКАХХКААМНЯЙ В Де щі 3 Кк ц Ш ех . їх ' в ї ! т ее пакетом тетестох дж, не лина Кінаию СХ ВНЕ М Е К Е ве они нин нн Те ва Її 8 Н Я ї ен по нн нн - і й ї їх ї 1 о: КЕ ї КЕ і нн ЗО і Ї ГО і Дункан окр пнннн нн чо В ше ші й Др мн 1 З ї : ї У Е нн Можяй нн ї З і пл АЛ АААААТ А ТКА хг, С и нн.
UAA201507804A 2010-02-24 2011-02-24 Виділений поліпептид, що кодує антитіло до рецептора фолієвої кислоти 1 UA123257C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US30779710P 2010-02-24 2010-02-24
US34659510P 2010-05-20 2010-05-20
US41317210P 2010-11-12 2010-11-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA123257C2 true UA123257C2 (uk) 2021-03-10

Family

ID=44507210

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201507804A UA123257C2 (uk) 2010-02-24 2011-02-24 Виділений поліпептид, що кодує антитіло до рецептора фолієвої кислоти 1

Country Status (29)

Country Link
US (11) US8557966B2 (uk)
EP (3) EP2538976B8 (uk)
JP (7) JP5778700B2 (uk)
KR (11) KR101580713B1 (uk)
CN (2) CN103037900B (uk)
AR (1) AR080301A1 (uk)
AU (1) AU2011220728B2 (uk)
BR (1) BR112012021296B1 (uk)
CA (3) CA3206109A1 (uk)
CY (1) CY1118668T1 (uk)
DK (1) DK2538976T3 (uk)
ES (2) ES2617283T3 (uk)
HR (1) HRP20170281T1 (uk)
HU (1) HUE030854T2 (uk)
IL (7) IL303569A (uk)
LT (1) LT2538976T (uk)
MX (4) MX340437B (uk)
MY (3) MY197016A (uk)
NZ (4) NZ621938A (uk)
PL (1) PL2538976T3 (uk)
PT (1) PT2538976T (uk)
RS (1) RS55738B1 (uk)
RU (2) RU2740479C2 (uk)
SG (4) SG10201606573SA (uk)
SI (1) SI2538976T1 (uk)
TW (6) TWI504408B (uk)
UA (1) UA123257C2 (uk)
WO (1) WO2011106528A1 (uk)
ZA (1) ZA201508660B (uk)

Families Citing this family (131)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110166319A1 (en) * 2005-02-11 2011-07-07 Immunogen, Inc. Process for preparing purified drug conjugates
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
IL305084A (en) 2005-08-24 2023-10-01 Immunogen Inc A process for preparing purified drug compounds
KR20210100223A (ko) 2008-04-30 2021-08-13 이뮤노젠 아이엔씨 가교제 및 그 용도
BRPI1008749B8 (pt) 2009-02-05 2021-05-25 Immunogen Inc compostos derivados de benzodiazepina, seus conjugados, composição farmacêutica, seu uso e seus processos de preparação
LT2437790T (lt) 2009-06-03 2019-06-10 Immunogen, Inc. Konjugavimo būdai
KR101580713B1 (ko) 2010-02-24 2015-12-29 이뮤노젠 아이엔씨 엽산염 수용체 1 항체와 면역접합체 및 이들의 용도
US10273294B2 (en) 2010-10-11 2019-04-30 University Of Southern California Compositions and methods for treating HIF-1α over-expressing cancers
EP3666289A1 (en) 2011-02-15 2020-06-17 ImmunoGen, Inc. Cytotoxic benzodiazepine derivatives
WO2012135517A2 (en) 2011-03-29 2012-10-04 Immunogen, Inc. Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
KR20220009505A (ko) 2011-03-29 2022-01-24 이뮤노젠 아이엔씨 일-단계 방법에 의한 메이탄시노이드 항체 접합체의 제조
UA125636C2 (uk) 2011-04-01 2022-05-11 Іммуноджен, Інк. Способи ідентифікації раку, який може реагувати на анти-folr1 антитіло або анти-folr1 імунокон'югат
JP6209159B2 (ja) 2011-06-21 2017-10-04 イミュノジェン・インコーポレーテッド ペプチドリンカーを有する新規メイタンシノイド誘導体およびその結合体
US8790651B2 (en) 2011-07-21 2014-07-29 Zoetis Llc Interleukin-31 monoclonal antibody
EP2887965A1 (en) 2012-08-22 2015-07-01 ImmunoGen, Inc. Cytotoxic benzodiazepine derivatives
KR20200079565A (ko) * 2012-08-31 2020-07-03 이뮤노젠 아이엔씨 엽산 수용체 1의 검출을 위한 진단성 검정 및 키트
SG11201502429YA (en) 2012-10-04 2015-04-29 Immunogen Inc Use of a pvdf membrane to purify cell-binding agent cytotoxic agent conjugates
WO2014055771A1 (en) 2012-10-05 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Human alpha-folate receptor chimeric antigen receptor
WO2014089177A2 (en) 2012-12-04 2014-06-12 Massachusetts Institute Of Technology Compounds, conjugates and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines
EP2930240B1 (en) * 2012-12-07 2018-08-01 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-folr1 antibody
RU2019105549A (ru) 2012-12-21 2019-03-28 Биоэллаенс К. В. Гидрофильные саморазрушающиеся линкеры и их конъюгаты
WO2014134483A2 (en) 2013-02-28 2014-09-04 Immunogen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents
US9901647B2 (en) 2013-02-28 2018-02-27 Immunogen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents
US20140302037A1 (en) 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
MX2015015735A (es) * 2013-05-14 2016-03-31 Immunogen Inc Regimenes de dosificacion de inmunoconjugado anti-receptor en folato 1 (folr1).
WO2014194030A2 (en) 2013-05-31 2014-12-04 Immunogen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents
WO2015031815A2 (en) 2013-08-30 2015-03-05 Immunogen, Inc. Antibodies and assays for detection of folate receptor 1
US20150132323A1 (en) * 2013-10-08 2015-05-14 Immunogen, Inc. Anti-FOLR1 Immunoconjugate Dosing Regimens
TWI787590B (zh) * 2013-12-27 2022-12-21 日商中外製藥股份有限公司 等電點低之抗體的精製方法
EP3593812A3 (en) 2014-03-15 2020-05-27 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
WO2015149018A1 (en) * 2014-03-28 2015-10-01 Immunogen, Inc. Anti-folr1 immunoconjugate dosing regimens
AU2015276821A1 (en) * 2014-06-20 2017-01-12 Abgenomics International Inc. Anti-folate receptor aplha (FRA) antibody-drug conjugates and methods of using thereof
JP2017528433A (ja) 2014-07-21 2017-09-28 ノバルティス アーゲー 低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤とＣＡＲの組み合わせ
JP2017526682A (ja) * 2014-09-02 2017-09-14 イミュノジェン， インコーポレイテッド 抗体薬物複合体組成物の製剤化方法
WO2016036794A1 (en) * 2014-09-03 2016-03-10 Immunogen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents
CR20170111A (es) 2014-09-03 2017-05-23 Immunogen Inc Derivados de benzodiazepina citotóxicos
EP3189057A1 (en) 2014-09-03 2017-07-12 ImmunoGen, Inc. Cytotoxic benzodiazepine derivatives
KR20170088905A (ko) 2014-11-19 2017-08-02 이뮤노젠 아이엔씨 세포 결합 작용제-세포독성 작용제 접합체를 제조하기 위한 공정
SI3789402T1 (sl) * 2014-11-20 2022-10-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Kombinirano zdravljenje z bispecifičnimi molekulami, ki vežejo antigen in aktivirajo celice T, ter antagonisti za vezavo osi PD-1
US20180334490A1 (en) 2014-12-03 2018-11-22 Qilong H. Wu Methods for b cell preconditioning in car therapy
WO2016123143A1 (en) * 2015-01-26 2016-08-04 The University Of Chicago CAR T-CELLS RECOGNIZING CANCER-SPECIFIC IL 13Rα2
CN107683289B (zh) 2015-01-26 2021-08-06 芝加哥大学 IL13Rα2结合剂和其在癌症治疗中的用途
WO2016126608A1 (en) 2015-02-02 2016-08-11 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
EP3286211A1 (en) 2015-04-23 2018-02-28 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
CN106267225B (zh) * 2015-05-29 2020-03-06 上海新理念生物医药科技有限公司 三马来酰亚胺型连接子及其应用
PT3313884T (pt) 2015-06-29 2021-02-25 Immunogen Inc Anticorpos anti-cd123 e conjugados e derivados dos mesmos
RU2733740C2 (ru) * 2015-06-29 2020-10-06 Иммуноджен, Инк. Конъюгаты сконструированных антител с цистеиновыми заменами
LT3325482T (lt) 2015-07-21 2020-11-25 Immunogen, Inc. Citotoksinių benzodiazepino darinių paruošimo būdai
US11667691B2 (en) 2015-08-07 2023-06-06 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric CD3 receptor proteins
IL257531B2 (en) * 2015-09-17 2023-04-01 Immunogen Inc Medicinal compositions containing anti-folr1 immunoconjugates
EP3380620A1 (en) 2015-11-23 2018-10-03 Novartis AG Optimized lentiviral transfer vectors and uses thereof
EP4335851A3 (en) 2015-11-25 2024-06-05 ImmunoGen, Inc. Pharmaceutical formulations and methods of use thereof
ES2944597T3 (es) 2015-12-30 2023-06-22 Novartis Ag Terapias con células efectoras inmunitarias de eficacia mejorada
RU2766000C2 (ru) 2016-01-08 2022-02-07 АльтруБио Инк. Четырехвалентные антитела к psgl-1 и их применения
CN105542004B (zh) * 2016-01-12 2019-02-19 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种抗破伤风毒素的中和性单克隆抗体及其应用
SG11201806478PA (en) 2016-02-05 2018-08-30 Immunogen Inc Efficient process for preparing cell-binding agent-cytotoxic agent conjugates
WO2017149515A1 (en) 2016-03-04 2017-09-08 Novartis Ag Cells expressing multiple chimeric antigen receptor (car) molecules and uses therefore
US11549099B2 (en) 2016-03-23 2023-01-10 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
SG11201809041TA (en) 2016-04-15 2018-11-29 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein expression
WO2017197045A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 Movassaghi Mohammad Convergent and enantioselective total synthesis of communesin analogs
EP3490590A2 (en) 2016-08-01 2019-06-05 Novartis AG Treatment of cancer using a chimeric antigen receptor in combination with an inhibitor of a pro-m2 macrophage molecule
CN109689104A (zh) 2016-08-12 2019-04-26 L.E.A.F.控股集团公司 α和γ-D聚谷氨酸化抗叶酸剂及其用途
WO2018031980A1 (en) 2016-08-12 2018-02-15 L.E.A.F. Holdings Group Llc Polyglutamated antifolates and uses thereof
WO2018031968A1 (en) * 2016-08-12 2018-02-15 L.E.A.F. Holdings Group Llc Alpha and gamma-d polyglutamated antifolates and uses thereof
CN116813690A (zh) 2016-11-23 2023-09-29 伊缪诺金公司 苯并二氮䓬衍生物的选择性磺化
WO2018111340A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Novartis Ag Methods for determining potency and proliferative function of chimeric antigen receptor (car)-t cells
WO2018119425A2 (en) * 2016-12-22 2018-06-28 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Anti-lilrb3 antibodies and methods of use thereof
US11535662B2 (en) 2017-01-26 2022-12-27 Novartis Ag CD28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy
US20190375815A1 (en) 2017-01-31 2019-12-12 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric t cell receptor proteins having multiple specificities
WO2018156180A1 (en) 2017-02-24 2018-08-30 Kindred Biosciences, Inc. Anti-il31 antibodies for veterinary use
RU2765098C2 (ru) 2017-02-28 2022-01-25 Иммуноджен, Инк. Производные майтанзиноида с саморасщепляющимися пептидными линкерами и их конъюгаты
EP3589647A1 (en) 2017-02-28 2020-01-08 Novartis AG Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
JP2020517256A (ja) * 2017-04-19 2020-06-18 エルスター セラピューティクス， インコーポレイテッド 多重特異性分子およびその使用
US20180346488A1 (en) 2017-04-20 2018-12-06 Immunogen, Inc. Cytotoxic benzodiazepine derivatives and conjugates thereof
US11932650B2 (en) 2017-05-11 2024-03-19 Massachusetts Institute Of Technology Potent agelastatin derivatives as modulators for cancer invasion and metastasis
WO2018213260A1 (en) * 2017-05-16 2018-11-22 Immunogen, Inc. Anti-folr1 immunoconjugates and anti-pd-1 antibody combinations
WO2018229715A1 (en) 2017-06-16 2018-12-20 Novartis Ag Compositions comprising anti-cd32b antibodies and methods of use thereof
US10688247B2 (en) 2017-07-13 2020-06-23 Haselmeier Ag Injection device with flexible dose selection
SG11202001348WA (en) * 2017-09-05 2020-03-30 Immunogen Inc Methods for detection of folate receptor 1 in a patient sample
US10640508B2 (en) 2017-10-13 2020-05-05 Massachusetts Institute Of Technology Diazene directed modular synthesis of compounds with quaternary carbon centers
CN111629749A (zh) 2017-10-18 2020-09-04 诺华股份有限公司 用于选择性蛋白质降解的组合物和方法
KR20200069358A (ko) 2017-10-25 2020-06-16 노파르티스 아게 키메라 항원 수용체 발현 세포의 제조 방법
EP3700933A1 (en) 2017-10-25 2020-09-02 Novartis AG Antibodies targeting cd32b and methods of use thereof
US20210179709A1 (en) 2017-10-31 2021-06-17 Novartis Ag Anti-car compositions and methods
CA3083345A1 (en) 2017-11-27 2019-05-31 Purdue Pharma L.P. Humanized antibodies targeting human tissue factor
JP2021508714A (ja) 2017-12-28 2021-03-11 イミュノジェン・インコーポレーテッド ベンゾジアゼピン誘導体
WO2019140141A1 (en) 2018-01-12 2019-07-18 Immunogen, Inc. Methods for antibody drug conjugation, purification, and formulation
WO2019157138A1 (en) 2018-02-07 2019-08-15 L.E.A.F. Holdings Group Llc Alpha polyglutamated pemetrexed and uses thereof
WO2019157129A1 (en) 2018-02-07 2019-08-15 L.E.A.F. Holdings Group Llc Alpha polyglutamated pralatrexate and uses thereof
US11771700B2 (en) 2018-02-14 2023-10-03 L.E.A.F. Holdings Group Llc Gamma polyglutamated lometrexol and uses thereof
US11629184B2 (en) * 2018-02-23 2023-04-18 Remd Biotherapeutics, Inc. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) antagonist antibodies
MX2020009522A (es) * 2018-03-13 2020-10-22 Phanes Therapeutics Inc Anticuerpos anti-folato del receptor 1 y usos de los mismos.
KR102275930B1 (ko) 2018-03-14 2021-07-12 (주)알테오젠 Folr1에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
EP3765069A1 (en) 2018-03-16 2021-01-20 Zoetis Services LLC Peptide vaccines against interleukin-31
CN112020511A (zh) 2018-03-16 2020-12-01 硕腾服务有限责任公司 用于兽医用途的白介素-31单克隆抗体
US20210047405A1 (en) 2018-04-27 2021-02-18 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
WO2019213282A1 (en) 2018-05-01 2019-11-07 Novartis Ag Biomarkers for evaluating car-t cells to predict clinical outcome
EP3801769A1 (en) 2018-05-25 2021-04-14 Novartis AG Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
EP3802825A1 (en) 2018-06-08 2021-04-14 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immunooncology
JP2021531825A (ja) * 2018-07-09 2021-11-25 マルチチュード インコーポレーテッドMultitude Inc. 葉酸受容体アルファに特異的な抗体
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
AU2019402189B2 (en) 2018-12-20 2023-04-13 Novartis Ag Dosing regimen and pharmaceutical combination comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
BR112021015672A2 (pt) 2019-02-15 2021-10-05 Novartis Ag Derivados de 3-(1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona substituída e usos dos mesmos
BR112021015783A2 (pt) 2019-02-15 2021-10-05 Novartis Ag Derivados de 3-(1-oxo-5-(piperidin-4-il)isoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona e usos dos mesmos
KR20220022112A (ko) 2019-03-21 2022-02-24 이뮤노젠 아이엔씨 세포-결합 제제-약물 콘쥬게이트를 준비하는 방법
TW202102506A (zh) 2019-03-29 2021-01-16 美商伊繆諾金公司 苯二氮平衍生物
WO2020219742A1 (en) 2019-04-24 2020-10-29 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
PT3958977T (pt) 2019-04-26 2023-12-15 Immunogen Inc Derivados de camptotecina
JP2022530524A (ja) * 2019-04-29 2022-06-29 イミュノジェン， インコーポレイテッド バイパラトピックＦＲ－α抗体及びイムノコンジュゲート
US11535634B2 (en) 2019-06-05 2022-12-27 Massachusetts Institute Of Technology Compounds, conjugates, and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines and uses thereof
US20230000997A1 (en) 2019-08-06 2023-01-05 L.E.A.F. Holdings Group Llc Processes of preparing polyglutamated antifolates and uses of their compositions
KR20220116257A (ko) 2019-12-20 2022-08-22 노파르티스 아게 골수섬유증 및 골수이형성 증후군을 치료하기 위한, 데시타빈 또는 항 pd-1 항체 스파르탈리주맙을 포함하거나 또는 포함하지 않는, 항 tim-3 항체 mbg453 및 항 tgf-베타 항체 nis793의 조합물
US11890828B2 (en) 2019-12-30 2024-02-06 Idaho Forest Group, LLC Moisture extraction press and moisture removal from wood materials
CA3185455A1 (en) 2020-06-11 2021-12-16 Novartis Ag Zbtb32 inhibitors and uses thereof
CN115916199A (zh) 2020-06-23 2023-04-04 诺华股份有限公司 包含3-(1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮衍生物的给药方案
CN111690061B (zh) * 2020-06-28 2022-08-23 中国人民解放军东部战区疾病预防控制中心 人源化抗鼠疫耶尔森菌抗原f1的抗体及应用
JP2023536164A (ja) 2020-08-03 2023-08-23 ノバルティス アーゲー ヘテロアリール置換３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体及びその使用
US20240165250A1 (en) * 2021-01-08 2024-05-23 Lycia Therapeutics, Inc. Bifunctional Folate Receptor Binding Compounds
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
EP4319820A1 (en) 2021-04-10 2024-02-14 Profoundbio Us Co. Folr1 binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
CN112794911B (zh) * 2021-04-14 2021-08-03 上海偌妥生物科技有限公司 人源化抗叶酸受体1抗体及其应用
BR112023021873A2 (pt) 2021-04-23 2023-12-19 King S College London Composição compreendendo um anticorpo ige
TW202309294A (zh) 2021-04-27 2023-03-01 瑞士商諾華公司 病毒載體生產系統
CA3217726A1 (en) * 2021-05-04 2022-11-10 Oren Bogin Anti-nkg2d antibodies and uses thereof
TW202320857A (zh) * 2021-07-06 2023-06-01 美商普方生物製藥美國公司 連接子、藥物連接子及其結合物及其使用方法
WO2023170247A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 Mablink Bioscience Antibody-drug conjugates and their uses
WO2023214325A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Novartis Ag Pyrazolopyrimidine derivatives and uses thereof as tet2 inhibitors
WO2024008755A1 (en) * 2022-07-04 2024-01-11 Vib Vzw Blood-cerebrospinal fluid barrier crossing antibodies
KR20240030075A (ko) 2022-08-29 2024-03-07 전남대학교산학협력단 Dlc 적층에 의한 금속 박막의 강화방법
EP4342488A1 (en) 2022-09-26 2024-03-27 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG Chimeric antigen receptor specific for folate receptor 1
WO2024089639A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 Novartis Ag Lentiviral formulations

Family Cites Families (181)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3720760A (en) 1968-09-06 1973-03-13 Pharmacia Ab Method for determining the presence of reagin-immunoglobulins(reagin-ig)directed against certain allergens,in aqueous samples
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4563304A (en) 1981-02-27 1986-01-07 Pharmacia Fine Chemicals Ab Pyridine compounds modifying proteins, polypeptides or polysaccharides
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4588585A (en) 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US6492107B1 (en) 1986-11-20 2002-12-10 Stuart Kauffman Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
GB2183661B (en) 1985-03-30 1989-06-28 Marc Ballivet Method for obtaining dna, rna, peptides, polypeptides or proteins by means of a dna recombinant technique
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
DE3600905A1 (de) 1986-01-15 1987-07-16 Ant Nachrichtentech Verfahren zum dekodieren von binaersignalen sowie viterbi-dekoder und anwendungen
US5681718A (en) 1986-03-14 1997-10-28 Celltech Limited Methods for enhanced production of tissue plasminogen activator in cell culture using alkanoic acids or salts thereof
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
JP3040121B2 (ja) * 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
GB8826530D0 (en) 1988-11-12 1988-12-14 Ped Capacitors Ltd Electrical capacitors
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US20040049014A1 (en) * 1988-12-28 2004-03-11 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
WO1990014443A1 (en) 1989-05-16 1990-11-29 Huse William D Co-expression of heteromeric receptors
CA2016841C (en) 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5705337A (en) 1990-06-11 1998-01-06 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chemi-SELEX
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
US6344321B1 (en) 1990-06-11 2002-02-05 Gilead Sciences, Inc. Nucleic acid ligands which bind to hepatocyte growth factor/scatter factor (HGF/SF) or its receptor c-met
US5496938A (en) 1990-06-11 1996-03-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands to HIV-RT and HIV-1 rev
US5683867A (en) 1990-06-11 1997-11-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: blended SELEX
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6916605B1 (en) * 1990-07-10 2005-07-12 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
EP0546073B1 (en) 1990-08-29 1997-09-10 GenPharm International, Inc. production and use of transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
EP0564531B1 (en) 1990-12-03 1998-03-25 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5840867A (en) 1991-02-21 1998-11-24 Gilead Sciences, Inc. Aptamer analogs specific for biomolecules
US5582981A (en) 1991-08-14 1996-12-10 Gilead Sciences, Inc. Method for identifying an oligonucleotide aptamer specific for a target
EP0605522B1 (en) 1991-09-23 1999-06-23 Medical Research Council Methods for the production of humanized antibodies
DE69233782D1 (de) 1991-12-02 2010-05-20 Medical Res Council Herstellung von Autoantikörpern auf Phagenoberflächen ausgehend von Antikörpersegmentbibliotheken
CA2507749C (en) 1991-12-13 2010-08-24 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
PT627940E (pt) 1992-03-05 2003-07-31 Univ Texas Utilizacao de imunoconjugados para o diagnostico e/ou terapia de tumores vascularizados
US5965132A (en) 1992-03-05 1999-10-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
US20030148406A1 (en) 1992-03-17 2003-08-07 David John King Multivalent antigen-binding proteins
ES2149768T3 (es) 1992-03-25 2000-11-16 Immunogen Inc Conjugados de agentes enlazantes de celulas derivados de cc-1065.
US5756291A (en) 1992-08-21 1998-05-26 Gilead Sciences, Inc. Aptamers specific for biomolecules and methods of making
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US6706484B1 (en) 1995-08-18 2004-03-16 Morphosys Ag Protein/(poly)peptide libraries
ES2176484T3 (es) 1995-08-18 2002-12-01 Morphosys Ag Bancos de proteinas/(poli)peptidos.
WO1997011971A1 (en) 1995-09-28 1997-04-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Porcine cell interaction proteins
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US6596850B1 (en) 1998-01-30 2003-07-22 Ixsys, Incorporated Anti-αv3β3 recombinant human antibodies, nucleic acids encoding same
WO2000023082A1 (en) 1998-10-19 2000-04-27 Yeda Research And Development Co. Ltd. Treatment of systemic lupus erythematosus by down-regulating the autoimmune response to autoantigens
US20030054360A1 (en) 1999-01-19 2003-03-20 Larry Gold Method and apparatus for the automated generation of nucleic acid ligands
US20040031072A1 (en) * 1999-05-06 2004-02-12 La Rosa Thomas J. Soy nucleic acid molecules and other molecules associated with transcription plants and uses thereof for plant improvement
DE60044997D1 (de) 1999-07-02 2010-11-04 Morphosys Ag Erzeugung spezifischer bindungspartner die an von genomischen dns-fragmenten oder ests kodierten (poly)peptiden binden
US20020068066A1 (en) 1999-08-20 2002-06-06 Wenyuan Shi Method for the treatment and prevention of dental caries
IT1307309B1 (it) * 1999-12-30 2001-10-30 Enea Ente Nuove Tec Peptidi stabilizzanti, polipeptidi ed anticorpi che li comprendono.
AU5697001A (en) 2000-03-31 2001-10-15 Purdue Research Foundation Method of treatment using ligand-immunogen conjugates
RU2280650C2 (ru) * 2000-04-17 2006-07-27 Шанхай Фармко Рисерч, Инк. Комплекс фолиевой кислоты или производного фолиевой кислоты, фармацевтическая композиция и применение комплекса
DE10037759A1 (de) 2000-08-03 2002-07-04 Gruenenthal Gmbh Screeningverfahren
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
EP2325337A1 (en) 2000-09-26 2011-05-25 Duke University RNA aptamers and methods for identifying the same
EP1998266A3 (en) * 2001-02-19 2009-02-11 Merck Patent GmbH Method for identification of T-cell epitopes and use for preparing molecules with reduced immunogenicity
AU2002258518A1 (en) 2001-03-14 2002-09-24 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules and proteins for the identification, assessment, prevention, and therapy of ovarian cancer
PL367102A1 (en) 2001-05-02 2005-02-21 Purdue Research Foundation Treatment and diagnosis of macrophage mediated disease
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
US6716821B2 (en) 2001-12-21 2004-04-06 Immunogen Inc. Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same
GB0202319D0 (en) 2002-02-01 2002-03-20 Calex Electronics Ltd Apparatus
AU2003217379A1 (en) 2002-02-15 2003-09-09 Somalogic, Inc. Methods and reagents for detecting target binding by nucleic acid ligands
US7314974B2 (en) * 2002-02-21 2008-01-01 Monsanto Technology, Llc Expression of microbial proteins in plants for production of plants with improved properties
AU2003211337A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Japan Envirochemicals, Ltd. Proteins capable of binding to female sex hormones and process for producing the same
US7531522B2 (en) 2002-04-22 2009-05-12 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Forderung Der Angewandten Forschung E.V. Antibodies, recombinant antibodies, recombinant antibody fragments and fusions mediated plant disease resistance against fungi
KR100480244B1 (ko) 2002-06-03 2005-04-06 삼성전자주식회사 레이저 모듈
US7538195B2 (en) 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
GB0216648D0 (en) 2002-07-18 2002-08-28 Lonza Biologics Plc Method of expressing recombinant protein in CHO cells
HUE026914T2 (en) 2002-11-07 2016-08-29 Immunogen Inc Anti-CD33 antibodies and a method of treating acute myeloid leukemia
AU2003295411A1 (en) 2002-11-07 2004-06-03 Celltech R & D Human monoclonal antibodies to heparanase
US20050124565A1 (en) 2002-11-21 2005-06-09 Diener John L. Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics
EP1481993A1 (en) 2003-05-28 2004-12-01 Xerion Pharmaceuticals AG Modulation of the poliovirus receptor function
US20050255114A1 (en) 2003-04-07 2005-11-17 Nuvelo, Inc. Methods and diagnosis for the treatment of preeclampsia
US20050025763A1 (en) * 2003-05-08 2005-02-03 Protein Design Laboratories, Inc. Therapeutic use of anti-CS1 antibodies
WO2005000901A2 (en) 2003-05-09 2005-01-06 Duke University Cd20-specific antibodies and methods of employing same
BRPI0410260A (pt) 2003-05-14 2006-05-16 Immunogen Inc composição conjugada para medicamento
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
ZA200510282B (en) 2003-07-02 2007-03-28 Genentech Inc Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US7329742B2 (en) 2003-09-04 2008-02-12 The Regents Of The University Of California Aptamers and methods for their in vitro selection and uses thereof
US7622112B2 (en) 2003-12-05 2009-11-24 Jody Berry Anti-SARS monoclonal antibodies
AU2005214331B2 (en) 2004-02-12 2011-09-15 Eisai, Inc. Monoclonal antibodies that specifically bind to folate receptor alpha
WO2005075514A2 (en) 2004-03-10 2005-08-18 Lonza Ltd. Method for producing antibodies
FR2867784B1 (fr) 2004-03-17 2006-06-09 Commissariat Energie Atomique Aptameres selectionnes a partir de cellules vivantes tumorales et leurs applications
US20050239134A1 (en) 2004-04-21 2005-10-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Combinatorial selection of phosphorothioate single-stranded DNA aptamers for TGF-beta-1 protein
CA2562833A1 (en) 2004-04-27 2005-11-03 Galapagos N.V. Methods, agents, and compound screening assays for inducing differentiation of undifferentiated mammalian cells into osteoblasts
KR20070072510A (ko) 2004-08-30 2007-07-04 론자 바이올로직스 피엘씨 항체 정제를 위한 친화도- 및 이온 교환- 크로마토그래피
RU2007119382A (ru) * 2004-10-25 2008-11-27 Мерк энд Ко., Инк. (US) Антитела против addl и их применение
AU2005337132B2 (en) 2004-12-21 2011-01-20 Monsanto Technology, Llc Transgenic plants with enhanced agronomic traits
JP2008526205A (ja) 2004-12-31 2008-07-24 ジェネンテック・インコーポレーテッド Ｂｒ３に結合するポリペプチド及びその使用
EP1850866A4 (en) 2005-01-27 2009-07-08 Univ California MONOCLONAL THERAPEUTIC ANTIBODIES FOR THE NEUTRALIZATION OF BOTULIN NEUROTOXINES
US7608413B1 (en) 2005-03-25 2009-10-27 Celera Corporation Kidney disease targets and uses thereof
EP2343320B1 (en) 2005-03-25 2017-10-25 GITR, Inc. Anti-gitr antibodies and uses thereof
CN101203759A (zh) 2005-03-30 2008-06-18 普渡研究基金会 使用细胞叶酸维生素受体定量法而用于癌症预后的方法
JP2008537180A (ja) 2005-04-18 2008-09-11 エルジー エレクトロニクス インコーポレーテッド 音楽作曲装置の運用方法
AU2006241099B2 (en) * 2005-04-22 2012-04-19 Eisai, Inc. Antibodies with immune effector activity and that internalize in folate receptor alpha-positive cells
WO2006121207A1 (en) 2005-05-12 2006-11-16 Oncotherapy Science, Inc. Methods for damaging cells using effector function of anti-dsc2 antibody
WO2006122822A2 (en) * 2005-05-20 2006-11-23 Lonza Biologics Plc. High-level expression of recombinant antibody in a mammalian host cell
AP2007004252A0 (en) * 2005-05-24 2007-12-31 Avestha Gengraine Tech Pvt Ltd A method for the production of a monoclonal antibody to cd20 for the treatment of B-cell lymphoma
WO2007006041A2 (en) 2005-07-05 2007-01-11 Purdue Research Foundation Imaging and therapeutic method using monocytes
US7521195B1 (en) 2005-07-21 2009-04-21 Celera Corporation Lung disease targets and uses thereof
WO2007022416A2 (en) 2005-08-18 2007-02-22 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Single chain antibodies against beta-amyloid peptide
US7906116B2 (en) 2005-09-01 2011-03-15 Parkash Gill Methods for using and identifying modulators of Delta-like 4
JP5376948B2 (ja) 2005-09-13 2013-12-25 ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ 腫瘍細胞活性を調節する方法及び組成物
WO2007047796A2 (en) 2005-10-17 2007-04-26 Institute For Systems Biology Tissue-and serum-derived glycoproteins and methods of their use
EP1790664A1 (en) 2005-11-24 2007-05-30 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
PT2913343T (pt) * 2005-12-20 2018-11-21 Sbi Biotech Co Ltd Anticorpo anti-ilt7
US8486412B2 (en) 2006-06-01 2013-07-16 Mayo Foundation For Medical Education And Research Immunity to folate receptors
EP2032701B1 (en) 2006-06-23 2013-11-27 Alethia Biotherapeutics Inc. Polynucleotides and polypeptides involved in cancer
US7910702B2 (en) * 2006-07-28 2011-03-22 The Governors Of The University Of Alberta Recombinant antibodies to sclerotinia antigens
AU2007284651B2 (en) 2006-08-09 2014-03-20 Institute For Systems Biology Organ-specific proteins and methods of their use
JP4711910B2 (ja) * 2006-08-24 2011-06-29 パナソニック株式会社 紙製包装箱
EP1900752A1 (en) 2006-09-15 2008-03-19 DOMPE' pha.r.ma s.p.a. Human anti-folate receptor alpha antibodies and antibody fragments for the radioimmunotherapy of ovarian carcinoma
CA2665528C (en) 2006-10-12 2018-01-23 The University Of Tokyo Diagnosis and treatment of cancer using anti-ereg antibody
WO2008072723A1 (ja) 2006-12-14 2008-06-19 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. 抗Claudin3モノクローナル抗体およびそれを用いる癌の治療および診断
CA2673725C (en) 2006-12-20 2016-01-12 Mmr Information Systems, Inc. Antibodies and methods for making and using them
US20080227704A1 (en) 2006-12-21 2008-09-18 Kamens Joanne S CXCL13 binding proteins
US7691980B2 (en) 2007-01-09 2010-04-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enhanced capacity and purification of antibodies by mixed mode chromatography in the presence of aqueous-soluble nonionic organic polymers
EP2606911A1 (en) 2007-02-16 2013-06-26 KTB Tumorforschungsgesellschaft mbH Receptor And Antigen Targeted Prodrug
WO2008101231A2 (en) * 2007-02-16 2008-08-21 Endocyte, Inc. Methods and compositions for treating and diagnosing kidney disease
CN101678124A (zh) * 2007-03-14 2010-03-24 恩多塞特公司 结合配体连接的微管溶素递药缀合物
WO2008145136A1 (en) 2007-05-30 2008-12-04 Aarhus Universitet Stat3 inactivation by inhibition of the folate receptor pathway
EP3569251A1 (en) 2007-06-25 2019-11-20 Endocyte, Inc. Conjugates containing hydrophilic spacer linkers
CN101139613B (zh) 2007-08-01 2011-06-08 姜荣锡 抗肿瘤二元多肽及其应用与制备方法
PL2227549T3 (pl) 2007-12-21 2015-12-31 Novartis Ag System selekcji do hodowli komórek eukariotycznych oparty na genie związanego z błoną receptora folianowego
DE202008000527U1 (de) 2008-01-11 2009-03-05 Bucyrus Dbt Europe Gmbh Firstmeißelträgerverstellung und Sicherungselement hierfür
EP4282428A3 (en) 2008-01-11 2024-03-20 The University of Tokyo Anti-cldn6 antibody
JP5624476B2 (ja) 2008-01-18 2014-11-12 バイオ−ラッド ラボラトリーズ インコーポレーティッド アパタイトクロマトグラフィーによるリン酸化生体分子および非リン酸化生体分子の向上した精製法
JP5470817B2 (ja) 2008-03-10 2014-04-16 日産自動車株式会社 電池用電極およびこれを用いた電池、並びにその製造方法
WO2009132081A2 (en) 2008-04-24 2009-10-29 The Research Foundation Of State University Of New York Monoclonal antibody-based targeting of folate receptors
BRPI0911442A2 (pt) 2008-04-30 2019-03-12 Immunogen, Inc. conjugados potentes e ligantes hidrofílicos
KR20210100223A (ko) 2008-04-30 2021-08-13 이뮤노젠 아이엔씨 가교제 및 그 용도
US8383351B2 (en) * 2008-06-11 2013-02-26 Oxford Brookes University Antibody to inhibin/ activin β-B subunit
EP2349274A4 (en) 2008-09-17 2014-12-17 Endocyte Inc CONJUGATES OF ANTIFOLATES BINDING THE FOLATE RECEPTOR
WO2010033913A1 (en) 2008-09-22 2010-03-25 Icb International, Inc. Antibodies, analogs and uses thereof
CN101440130B (zh) 2008-11-21 2011-07-27 中国人民解放军第四军医大学 一种抗人IL-13Rα2单克隆抗体的重链和轻链的可变区
BRPI1008749B8 (pt) 2009-02-05 2021-05-25 Immunogen Inc compostos derivados de benzodiazepina, seus conjugados, composição farmacêutica, seu uso e seus processos de preparação
JP5923035B2 (ja) 2009-03-24 2016-05-24 バイオセプト インコーポレイティッド 細胞の捕捉および解析のデバイスおよび方法
JP5769316B2 (ja) 2009-08-06 2015-08-26 イムナス・ファーマ株式会社 Ａβオリゴマーに特異的に結合する抗体およびその利用
AR080155A1 (es) 2010-02-10 2012-03-14 Immunogen Inc Anticuerpos anti-cd20 y su utilizacion
KR101580713B1 (ko) 2010-02-24 2015-12-29 이뮤노젠 아이엔씨 엽산염 수용체 1 항체와 면역접합체 및 이들의 용도
MX368394B (es) 2010-11-05 2019-10-01 Eisai Inc Receptor alfa de folato como marcador de diagnostico y pronostico para canceres que expresan receptor alfa de folato.
KR20220009505A (ko) 2011-03-29 2022-01-24 이뮤노젠 아이엔씨 일-단계 방법에 의한 메이탄시노이드 항체 접합체의 제조
BR112013025228A2 (pt) 2011-03-29 2018-09-25 Immunogen Inc processo para fabricar conjugados de homogeneidade aperfeçoada
UA125636C2 (uk) 2011-04-01 2022-05-11 Іммуноджен, Інк. Способи ідентифікації раку, який може реагувати на анти-folr1 антитіло або анти-folr1 імунокон'югат
WO2012138749A1 (en) 2011-04-04 2012-10-11 Immunogen, Inc. Methods for decreasing ocular toxicity of antibody drug conjugates
LT2731972T (lt) 2011-07-15 2018-03-26 Eisai R&D Management Co., Ltd. Antikūnai prieš foliato receptorius alfa ir jų panaudojimas
KR20200079565A (ko) 2012-08-31 2020-07-03 이뮤노젠 아이엔씨 엽산 수용체 1의 검출을 위한 진단성 검정 및 키트
WO2014055842A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Immunogen, Inc. Process for preparing stable antibody maytansinoid conjugates
JP6136279B2 (ja) 2013-01-15 2017-05-31 株式会社ジェイテクト 転がり軸受装置
TWI503850B (zh) 2013-03-22 2015-10-11 Polytronics Technology Corp 過電流保護元件
MX2015015735A (es) 2013-05-14 2016-03-31 Immunogen Inc Regimenes de dosificacion de inmunoconjugado anti-receptor en folato 1 (folr1).
WO2015031815A2 (en) 2013-08-30 2015-03-05 Immunogen, Inc. Antibodies and assays for detection of folate receptor 1
TWI510996B (zh) 2013-10-03 2015-12-01 Acer Inc 控制觸控面板的方法以及使用該方法的可攜式電腦
US20150132323A1 (en) 2013-10-08 2015-05-14 Immunogen, Inc. Anti-FOLR1 Immunoconjugate Dosing Regimens
WO2015149018A1 (en) 2014-03-28 2015-10-01 Immunogen, Inc. Anti-folr1 immunoconjugate dosing regimens
IL257531B2 (en) 2015-09-17 2023-04-01 Immunogen Inc Medicinal compositions containing anti-folr1 immunoconjugates
US9816280B1 (en) 2016-11-02 2017-11-14 Matthew Reitnauer Portable floor

Also Published As

Publication number Publication date
IL247615B (en) 2018-04-30
HUE030854T2 (en) 2017-06-28
US9670279B2 (en) 2017-06-06
CN105777907B (zh) 2020-03-17
TW202348631A (zh) 2023-12-16
EP2538976B8 (en) 2017-05-24
IL255013B (en) 2019-10-31
US9657100B2 (en) 2017-05-23
US10752683B2 (en) 2020-08-25
MX2012009754A (es) 2012-11-21
JP5778700B2 (ja) 2015-09-16
US20160083471A1 (en) 2016-03-24
US9670278B2 (en) 2017-06-06
US20120009181A1 (en) 2012-01-12
KR20200106987A (ko) 2020-09-15
US20160096888A1 (en) 2016-04-07
US9598490B2 (en) 2017-03-21
CN103037900A (zh) 2013-04-10
CN105777907A (zh) 2016-07-20
MX2022001086A (es) 2022-02-14
TW201138816A (en) 2011-11-16
KR20220017432A (ko) 2022-02-11
AR080301A1 (es) 2012-03-28
SG10201801636QA (en) 2018-03-28
JP2013524773A (ja) 2013-06-20
EP3196212B1 (en) 2020-06-03
IL290617B1 (en) 2023-07-01
TWI504408B (zh) 2015-10-21
CA3014767C (en) 2023-08-29
RU2610663C2 (ru) 2017-02-14
TWI781327B (zh) 2022-10-21
KR20240052894A (ko) 2024-04-23
JP2016000729A (ja) 2016-01-07
EP2538976B1 (en) 2016-11-30
MY171234A (en) 2019-10-04
EP2538976A1 (en) 2013-01-02
IL255013A0 (en) 2017-12-31
MX2019009654A (es) 2019-10-07
NZ709390A (en) 2016-11-25
HRP20170281T1 (hr) 2017-04-21
PT2538976T (pt) 2017-03-08
JP2021100430A (ja) 2021-07-08
US9670280B2 (en) 2017-06-06
IL269530A (en) 2019-11-28
EP3196212A1 (en) 2017-07-26
TWI622402B (zh) 2018-05-01
JP2019213522A (ja) 2019-12-19
KR102346223B1 (ko) 2022-01-03
US20160075781A1 (en) 2016-03-17
US20240132585A1 (en) 2024-04-25
JP2022191500A (ja) 2022-12-27
KR20180093131A (ko) 2018-08-20
TWI672318B (zh) 2019-09-21
US8557966B2 (en) 2013-10-15
TW202237659A (zh) 2022-10-01
RU2012135395A (ru) 2014-03-27
IL269530B (en) 2020-11-30
KR20170085143A (ko) 2017-07-21
SI2538976T1 (sl) 2017-05-31
US20190345248A1 (en) 2019-11-14
PL2538976T3 (pl) 2017-08-31
CA2790412C (en) 2018-10-02
SG183144A1 (en) 2012-09-27
TW201817746A (zh) 2018-05-16
JP2018021069A (ja) 2018-02-08
JP7167228B2 (ja) 2022-11-08
KR101580713B1 (ko) 2015-12-29
TW201607555A (zh) 2016-03-01
KR102287474B1 (ko) 2021-08-06
JP2016153412A (ja) 2016-08-25
DK2538976T3 (en) 2017-02-27
RU2017102988A (ru) 2019-01-17
ES2813549T3 (es) 2021-03-24
KR20150031488A (ko) 2015-03-24
KR20190114019A (ko) 2019-10-08
IL278658B (en) 2022-03-01
KR20210098560A (ko) 2021-08-10
IL221241A (en) 2017-05-29
US20130295119A1 (en) 2013-11-07
US9133275B2 (en) 2015-09-15
AU2011220728B2 (en) 2014-07-31
CA2790412A1 (en) 2011-09-01
NZ601617A (en) 2014-03-28
CN103037900B (zh) 2016-04-06
SG10201606573SA (en) 2016-10-28
TWI796132B (zh) 2023-03-11
IL290617B2 (en) 2023-11-01
RS55738B1 (sr) 2017-07-31
WO2011106528A1 (en) 2011-09-01
IL303569A (en) 2023-08-01
IL290617A (en) 2022-04-01
EP3760643A1 (en) 2021-01-06
KR102028531B1 (ko) 2019-10-04
MY197016A (en) 2023-05-20
KR20160083962A (ko) 2016-07-12
ZA201508660B (en) 2017-11-29
US20160096887A1 (en) 2016-04-07
RU2017102988A3 (uk) 2020-05-18
KR20230044026A (ko) 2023-03-31
CA3014767A1 (en) 2011-09-01
BR112012021296A2 (pt) 2017-09-19
NZ724971A (en) 2019-06-28
MX367345B (es) 2019-08-15
JP6860614B2 (ja) 2021-04-14
KR101637138B1 (ko) 2016-07-06
NZ621938A (en) 2015-07-31
JP6039751B2 (ja) 2016-12-07
LT2538976T (lt) 2017-03-27
US20160060339A1 (en) 2016-03-03
CA3206109A1 (en) 2011-09-01
AU2011220728A1 (en) 2012-08-30
RU2740479C2 (ru) 2021-01-14
IL221241A0 (en) 2012-10-31
US10301385B2 (en) 2019-05-28
CY1118668T1 (el) 2017-07-12
MX340437B (es) 2016-07-08
US20170327575A1 (en) 2017-11-16
EP2538976A4 (en) 2013-07-24
TW202012446A (zh) 2020-04-01
KR20130012117A (ko) 2013-02-01
BR112012021296B1 (pt) 2021-06-15
ES2617283T3 (es) 2017-06-16
MY165151A (en) 2018-02-28
KR101759057B1 (ko) 2017-07-18
SG10201501342UA (en) 2015-04-29
US20210032327A1 (en) 2021-02-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA123257C2 (uk) Виділений поліпептид, що кодує антитіло до рецептора фолієвої кислоти 1
US11214628B2 (en) Bispecific antibodies for use in stem cell transplantation
JP7222024B2 (ja) 上皮増殖因子受容体変異体ｉｉｉおよびｃｄ３の単一および二重特異性抗体およびそれらの使用
US20220249657A1 (en) Anti-pd-1 antibodies and methods of use thereof
US20220049001A1 (en) Anti-met antibodies, bispecific antigen binding molecules that bind met, and methods of use thereof
US20210163620A1 (en) Trispecific binding molecules against cancers and uses thereof
CN110461876B (zh) 用于耗尽cd137+细胞的组合物和方法
UA125718C2 (uk) Композиції антитіл до ror1 і пов'язані з ними способи
US20230042913A1 (en) A combination of, or a bispecific binding molecule to, an immune checkpoint molecule antagonist and a rank-l (nf-kb ligand) antagonist for cancer therapy or prophylaxis and uses thereof
TW201706311A (zh) 治療性抗體及其用途
BR112020005212A2 (pt) conjugado de anticorpo, kit, composição farmacêutica, e, métodos de tratamento ou prevenção e de diagnóstico de uma doença ou condição.
US20220175951A1 (en) Anti-CD45 Antibody Drug Conjugates and Uses Thereof
US11066471B2 (en) Antibodies to MICA and MICB proteins
TW202015739A (zh) 剪接調節抗體-藥物結合物及其使用方法
UA127450C2 (uk) Рекомбінантний поліпептид, що зв'язується з cd123
KR20220003572A (ko) 아마톡신 항체-약물 결합체 및 이의 용도
KR20210086683A (ko) 동종이형 조혈 줄기 세포 이식 방법
JP5868176B2 (ja) 抗癌活性を有する抗体
CN110382532A (zh) 抗g-csf抗体及其用途
KR20200090801A (ko) Cd2+ 세포의 고갈을 위한 조성물 및 방법
US20210163604A1 (en) DRUG CONJUGATES OF cMET MONOCLONAL BINDING AGENTS, AND USES THEREOF
TWI793714B (zh) 結合人cd38的抗體、其製備方法和用途
CN111867621A (zh) 用于耗尽cd134+细胞的组合物和方法
US20240058467A1 (en) Anti-ror1 antibody conjugates, compositions comprising anti ror1 antibody conjugates, and methods of making and using anti-ror1 antibody conjugates
US20220296727A1 (en) Immunoconjugate