MX2012009754A - Anticuerpos de inmunoconjugados del receptor 1 de folato y usos de los mismos. - Google Patents

Anticuerpos de inmunoconjugados del receptor 1 de folato y usos de los mismos.

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Gillian Payne
Viktor S Goldmakher
Lingyun Rui
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Abstract

Se proporcionan nuevos agentes contra el cáncer, que incluyen, pero sin limitarse a, anticuerpos e inmunoconjugados, que se unen al receptor 1 de folato humano. Los métodos de usar los agentes, anticuerpos, o inmunoconjugados, tales como los métodos de inhibir el crecimiento se proporciona también.

Description

ANTICUERPOS E INMÜNOCONJUGADOS DEL RECEPTOR 1 DE FOLATO Y USOS DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCION El campo de esta invención se refiere, en general', a los anticuerpos e inmunoconj ugados que se unen al receptor 1 de folato humano, asi como a los métodos de uso de los anticuerpos e inmunoconj ugados para el tratamiento de enfermedades tales como el cáncer.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION El cáncer es una de las principales causas de muerte en el mundo desarrollado, con más de un millón de personas diagnosticadas con cáncer y 500,000 muertes por año sólo en los Estados Unidos. En general, se estima que más de. 1 de cada 3 personas desarrollarán algún tipo de cáncer durante su vida. Hay más de 200 tipos diferentes de cáncer, cuatro de los cuales—mama, pulmón, colorrectal y próstata— cuentan en más de la mitad de todos los casos nuevos (Jemal y otros, 2003, Cáncer J. Clin. 53:5-26).
El receptor 1 de folato (FOLR1) , también conocido como receptor-alfa de folato, o proteina de unión al folato, es una proteina N-glicosilada que se expresa en la membrana plasmática de las células. El FOLR1 tiene una alta afinidad por el ácido fólico y por varios derivados reducidos del KEF. : 233864 ácido fólico. El FOLRl media la entrega del folato fisiológico, el 5-metiltetrahidrofolato, al interior de las células .
El FOLRl se sobreexpresa en la gran mayoría de los cánceres de ovario, así como en muchos cánceres de útero, endometrio, páncreas, renal, pulmón y mama, mientras que la expresión de FOLRl sobre los tejidos normales se limita a la membrana apical de las células epiteliales en los túbulos proximales del riñon, los neumocitos alveolares del pulmón, la vejiga, los testículos, el plexo coroideo y la tiroide (Weitman SD, y otros, Cáncer Res 52: 3396-3401 (1992); Anthony AC, Annu Rev Nutr 16: 501-521 (1996); Kalli KR, y otros. Gynecol Oncol 108: 619-626 (2008)). Este patrón de expresión hace del FOLRl un objetivo conveniente para la terapia contra el cáncer dirigido al FOLRl.
Debido a que el cáncer de ovario es típicamente asintomático hasta la fase avanzada, este se diagnostica con frecuencia en una fase tardía y tiene mal pronóstico cuando se trata con los procedimientos disponibles en la actualidad, típicamente con los fármacos quimioterapéuticos que se aplican después de la cirugía citorreductora (von Gruenigen V y otros, Cáncer 112: 2221-2227 (2008); Ayhan A y otros, Am J Obstet Gynecol 196: 81 e81-86 (2007); Harry VN y otros, Obstet Gynecol Surv 64: 548-560 (2009)). De este modo, existe una clara necesidad médica insatisfecha de terapéuticas más eficaces de los cánceres de ovarios.
Tres anticuerpos anti-FOLRl se han analizado como potentes fármacos anticáncer. Los anticuerpos monoclonales murinos ovl8 y Movl9 se aislaron a finales dé 1980 (Miotti S y otros, Int J Cáncer 39: 297-303 (1987)); se confirmaron para el objetivo FOLR1 (Coney LR y otros, Cáncer Res 51: 6125-6132 (1991)); y se probaron en los estudios pre-clinicos por su capacidad para erradicar las células de cáncer que expresan el antigeno cuando se conjugan con la proteina citotóxica que inactiva el ribosoma (Conde FP y otros, Eur J Biochem 178: 795-802 (1989)).
El ovl9 se probó como un anticuerpo bi-especifico dirigido a las células T citotóxicas y células citoliticas naturales (Mezzanzanica D y otros, Int J Cáncer 41: 609-615 (1988); Ferrini S y otros, Int J Cáncer Suppl 4: 53-55 (1989); Ferrini S y otros, Int J Cáncer 48: 227-233 (1991)); y como una proteina de fusión de Fv de cadena simple (scFv) de Movl9 con la interleuquina-2 in vivo (Melani C y otros, Cáncer Res 58: 4146-4154 (1998)). Los anticuerpos anti-FOLRl quiméricos (cadena variable murina/cadena constante humana) de Movl8 y Movl9 se han examinado pre-clinicamente por su capacidad para mediar la muerte dependiente de la célula inmune citotóxica en las células tumorales que expresan FOLR1 in vitro (Coney LR y otros, Cáncer Res 54: 2448-2455 (1994)); y una ovl8-IgE quimérica se probó en los modelos inmunoterapéuticos preclinicos dependientes de IgE (Karagiannis SN y otros, J Immunol 179: 2832-2843 (2007); Gould HJ y otros, Eur J Immunol 29: 3527-3537 (1999)).
El Movl8 se estudió en forma de conjugados con distintos radionúclidos en estudios preclinicos y después, a inicios de los 1990, en ensayos clínicos (Zacchetti A y otros, Nucí Med Biol 36: 759-770 (2009) ) ; que finalizaron sin que se aprobara algún fármaco para uso clínico.
El MORAb003, una forma humanizada del anticuerpo monoclonal murino anti-FOLRl LK26 se evaluó pre-clínicamente como un anticuerpo sin modificación (Ebel y otros, Cáncer Immun 7:6 (2007)) y como un conjugado con el radionúclido In111 (Smith-Jones PM y otros, Nucí Med Biol 35: 343-351 (2008)); y se experimenta actualmente en los ensayos clínicos como un anticuerpo sin modificación (D. K. Armstrong y otros, J. Clin. Oncol . 26:, 20 de mayo de 2008, suppl; resumen 5500).
SUMARIO DE LA INVENCION La presente invención proporciona los nuevos anticuerpos que se unen al receptor 1 de folato humano, los inmunoconjugados que comprenden estos anticuerpos, y los métodos para su uso. La presente invención proporciona, además, nuevos polipéptidos , tales como los anticuerpos que se unen al receptor 1 de folato humano, fragmentos de tales anticuerpos, y otros polipéptidos relacionados con tales anticuerpos. Los polinucleótidos que comprenden las secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos se proporcionan también, como son los vectores que comprenden los polinucleótidos. Las células que comprenden los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención se proporcionan además. Las composiciones (por ejemplo, las composiciones, farmacéuticas); que comprenden los nuevos anticuerpos o inmunoconjugados para el receptor 1 de folato se proporcionan también. Además, los métodos de preparar y usar los nuevos anticuerpos o inmunoconjugados para el receptor 1 de folato se proporcionan también, tales como los métodos de usar los nuevos anticuerpos o inmunoconjugados para el receptor 1 de folato para inhibir el crecimiento tumoral y/o tratar el cáncer.
De este modo, en un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión al antigeno del mismo que se une de forma especifica a un receptor 1 de folato humano, donde el anticuerpo comprende (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GYFMN (sec. con núm. de ident.:l); una CDR2 de cadena pesada que comprende RIHPYDGDTFYNQXaaiFXaa2Xaa3 (sec. con núm. de ident.:56); y una CDR3 de cadena pesada que comprende YDGSRAMDY (sec. con núm. de ident.:3) y (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende KASQSVSFAGTSLMH (sec. con núm. de ident . : 7 ) ; una CDR2 de cadena ligera que comprende RASNLEA (sec. con núm. de ident.:8); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSREYPYT (sec. con núm. de ident.:9); donde Xaax se selecciona de K, Q, H y R; Xaa2 se selecciona de Q, H, N, y R, y Xaa3 se selecciona de G, E, T, S, A y V. En una cierta modalidad, el anticuerpo humanizado o el fragmento de unión al antigeno del mismo se unen a un receptor 1 de folato humano con la misma afinidad sustancial que el anticuerpo quimérico ovl9. En una cierta modalidad, el anticuerpo humanizado o el fragmento de unión al antigeno de este comprenden el CDR2 de secuencia RIHPYDGDTFYNQKFQG (sec. con núm. de ident.: 2) de una cadena pesada.
En una cierta modalidad, la afinidad de unión se mide por citometría de flujo, Biacore, o radioinmunoensayo .
En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión al antigeno del mismo que se une de forma especifica a un receptor 1 de folato humano, donde el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GYFMN (sec. con núm. de ident.: 1) ; o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, 6 4 sustituciones de aminoácidos conservados; una CDR2 de cadena pesada que comprende RIHPYDGDTFYNQKFQG (sec. con núm. de ident.: 2); o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones de aminoácidos conservados; y una CDR3 de cadena pesada que comprende YDGSRAMDY (sec. con núm. de ident.:3); o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; y/o (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende KASQSVSFAGTSLMH (sec. con núm. de ident.:7 ) ; o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; una CDR2 de cadena ligera que comprende RASNLEA (sec. con núm. de ident.:8); o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSREYPYT (sec. con núm. de ident.:9); o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos.
En' una cierta modalidad, la invención proporciona un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión al antigeno del mismo que se une de forma especifica al receptor 1 de folato humano que comprende una cadena pesada de sec. con núm. de ident.: 6. En otra modalidad, el anticuerpo humanizado o el fragmento de unión al antigeno del mismo se codifica por el ADN de plásmido depositado en la ATCC el 7 de abril de 2010 y que tiene los números de depósito e la ATCC PTA-10772 y PTA-10773 ó 10774.
En una cierta modalidad, la invención proporciona un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión al antigeno del mismo que compite por la unión a FOLR1 con un anticuerpo que comprende (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GYFMN (sec. con núm. de ident. :1); una CDR2 de cadena pesada que comprende RIHPYDGDTFYNQXaaiFXaa2Xaa3 (sec. con núm. de ident.:56); y un CDR3 de cadena pesada que comprende YDGSRA DY (sec. con núm. de ident.:3); y (b) una CDR1 de cadena ligera comprende KASQSVSFAGTSLMH (sec. con núm. de ident.:7); una CDR2 de cadena ligera que comprende RASNLEA ( sec. con núm. de ident.:8); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSREYPYT (sec. con núm. de ident.:9); donde Xaai se selecciona de K, Q, H y R; Xaa2 se selecciona de Q, H, N, y R, y Xaa3 se selecciona de G, E, T, S, A y V. En una cierta modalidad, el anticuerpo humanizado comprende el CDR2 de secuencia RIHPYDGDTFYNQKFQG (sec. con núm. de ident.:2) de una cadena pesada.
En una cierta modalidad, la invención proporciona un polipéptido, un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión al antigeno del mismo que comprenden un dominio variable de cadena pesada al menos aproximadamente 90% idéntico a la sec. con núm. de ident . : 4, y un dominio variable de cadena ligera al menos aproximadamente 90% idéntico a la sec. con núm. de ident.: 10 o sec. con núm. de ident.: 11. En otra modalidad, el anticuerpo humanizado o el fragmento de unión al antigeno comprende un dominio variable de cadena pesada al menos aproximadamente 95% idéntico a la sec. con núm. de ident.: 4, y un dominio variable de una cadena ligera al menos aproximadamente 95% idéntico a la sec. con núm. de ident.: 10 o sec. con núm. de ident.: 11. En una modalidad adicional, el anticuerpo humanizado comprende un dominio variable de cadena pesada al menos aproximadamente 99% idéntico a la sec. con núm. de ident.: 4, y un dominio variable de cadena ligera al menos aproximadamente 99% idéntico a la sec. con núm. de ident.: 10 o sec. con núm. de ident.:ll. En una cierta modalidad, el anticuerpo humanizado comprende el dominio variable de cadena pesada de la sec. con núm. de ident.: 4, y el dominio variable de cadena ligera de la sec. con núm. de ident.: 10 o sec. con núm. de ident.: 11. En ciertas modalidades, la invención proporciona un polipéptido, un anticuerpo, o un fragmento de unión al antígeno al menos aproximadamente 90% idéntico a las sec. con núm. de ident .: 88-119. En ciertas modalidades, la invención proporciona un polipéptido, un anticuerpo, o un fragmento de unión al antigeno al menos aproximadamente 95% idéntico a las sec. con núm. de ident.: 88-119. En ciertas modalidades, la invención proporciona un polipéptido, un anticuerpo, o un fragmento de unión al antigeno al menos aproximadamente 99% idéntico a las sec. con núm. de ident .: 88-119.
En una cierta modalidad, la invención proporciona un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión al antigeno del mismo que se expresa al menos diez veces más que el chMovl9 en las células eucariotas. En una cierta modalidad, las células eucariotas son células HEK-293T.
En ciertas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión al antigeno del mismo que se une de forma especifica a un receptor 1 de folato humano, donde el anticuerpo comprende: (a) una CDRl de cadena pesada que comprende SSYGMS (sec. con núm. de ident.:30) una CDR2 de cadena pesada que comprende TISSGGSYTY (sec. con núm. de ident.:31); y/o una CDR3 de cadena pesada que comprende DGEGGLYAMDY (sec. con núm. de ident.: 32); y/o (b) una CDRl de cadena ligera que comprende KASDHINNWLA (sec. con núm. de ident. :27); una CDR2 de cadena ligera que comprende GATSLET (sec. con núm. de ident. :28); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQY STPFT (sec. con núm. de ident.: 29). En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión al antigeno del mismo que se une de forma especifica a un receptor 1 de folato humano, donde el anticuerpo comprende: (a) una CDRl de cadena pesada que comprende TNYWMQ (sec. con núm. de ident.: 60); una CDR2 de cadena pesada que comprende AIYPGNGDSR (sec. con núm. de ident.: 61); y/o una CDR3 de cadena pesada que comprende RDGNYAAY (sec. con núm. de ident. :62); y/o (b) una CDRl de cadena ligera que comprende RASENIYSNLA (sec. con núm. de ident. :57); una CDR2 de cadena ligera que comprende AATNLAD (sec. con núm. de ident. :58); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QHFWASPYT (sec. con núm. de ident.: 59). En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión al antigeno del mismo que se une de forma especifica a un receptor 1 de folato humano, donde el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende TNYWMY (sec. con núm. de ident.:66); una CDR2 de cadena pesada que comprende AIYPGNSDTT (sec. con núm. de ident.:67); y/o una CDR3 de cadena pesada que comprende RHDYGAMDY (sec. con núm. de ident.:68); y/o (b) una CDRl de cadena ligera que comprende RASENIYTNLA (sec. con núm. de ident.:63); una CDR2 de cadena ligera que comprende TASNLAD (sec. con núm. de ident.:64); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QHFWVSPYT (sec. con núm. de ident.:65). En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une de forma especifica a un receptor 1 de folato humano, donde el anticuerpo comprende: (a) una CDRl de cadena pesada que comprende SSFGMH (sec. con núm. de ident.: 72); una CDR2 de cadena pesada que comprende YISSGSSTIS (sec. con núm. de ident. :73); y/o una CDR3 de cadena pesada que comprende EAYGSSMEY (sec. con núm. de iden't.:74); y/o (b) una CDRl de cadena ligera que comprende RASQNINNNLH (sec. con núm. de ident.: 69); una CDR2 de cadena ligera que comprende YVSQSVS (sec. con núm. de ident. :70); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSNS PHYT (sec. con núm. de ident. :71). En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión al antigeno del mismo que se une de forma especifica a un receptor 1 de folato humano, donde el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende TSYTMH (sec. con núm. de ident.:78); una CDR2 de cadena pesada que comprende YINPISGYTN (sec. con núm. de ident.:79); y/o una CDR3 de cadena pesada que comprende GGAYGRKPMDY (sec. con núm. de ident.:80); y/o (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende KASQNVGPNVA (sec. con núm. de ident.:75); una CDR2 de cadena ligera que comprende SASYRYS (sec. con núm. de ident.:76); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQYNSYPYT (sec. con núm. de ident.:77).
En ciertas modalidades, los polipéptidos de la invención son los anticuerpos de longitud completa o fragmentos de unión al antígeno. En ciertas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de unión al antigeno son un Fab, un Fab1, un F(ab')2, un Fd, un Fv o scFv de cadena simple, un Fv enlazado a disulfuro, un dominio V-NAR, un IgNar, un intracuerpo, una IgG-CH2, un minicuerpo, un F(ab')3, un tetracuerpo, un triacuerpo, un diacuerpo, un anticuerpo de dominio simple, DVD-Ig, Fcab, mAb2, un (scFv)2, o un scFv-Fc.
En ciertas modalidades, un anticuerpo o polipéptido de la invención se une a un receptor 1 de folato humano con una Kd de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 10 nM. En una modalidad, el anticuerpo o polipéptido se unen a un receptor 1 de folato humano con una Kd de aproximadamente 1.0 nM o mejor. En una cierta modalidad, la afinidad de unión se mide por citometría de flujo, Biacore o radioinmunoensayo .
La invención proporciona también un método de preparar un anticuerpo de la invención que comprende cultivar una célula que expresa el anticuerpo, y (b) aislar el anticuerpo de la célula en cultivo. En una cierta modalidad, la célula es una célula eucariota.
La invención proporciona también un inmunoconjugado que tiene la Fórmula (A) - (L) - (C) ; donde: (A) es un fragmento de anticuerpo o un fragmento de unión al antigeno o un polipéptido de la invención; (L) es un ligando; y (C) es un agente citotóxico, donde el ligando (L) enlaza (A) a (C) .
En una modalidad, el ligando se selecciona del grupo de un ligando escindible, un ligando no escindible, un ligando hidrofílico y un ligando basado en ácido dicarboxilico . En una modalidad adicional, el ligando se selecciona del grupo consistente de: N-succinimidil 4- (2-piridilditio) pentanoato (SPP) o N-succinimidil 4- (2-piridilditio) -2-sulfopentanoato (sulfo-SPP) ; N-succinimidil 4- (2-piridilditio) butanoato (SPDB) o W-succinimidil 4- (2-piridilditio) -2-sulfobutanoato (sulfo-SPDB) ; N-succinimidil 4- (maleimidametil ) ciclohexanocarboxilato (SMCC) ; N-sulfosuccinimidil 4- (maleimidametil) ciclohexanecarboxilato (sulfoSMCC); N-succinimidil-4- (iodoacetil) -aminobenzoato (SIAB) ; y el éster de N-succinimidil- [ (N-maleimidapropionamida) -tetraetilenglicol] (NHS-PEG4-maleimida) . En una cierta modalidad, el ligando¦ es el éster de N-succinimidil- [ (N- maleimidapropionamida) -tetraetilenglicol] (NHS-PEG4-maleimida) .
En una modalidad, los inmunoconjugados comprenden un agente citotóxico seleccionado del grupo de un maitansinoide, análogo de maitansinoide, benzodiazepina, taxoide, CC-1065, análogo de CC-1065, duocarmicina, análogo de duocarmicina, caliqueamicina, dolastatina, análogo de dolastatina, auristatina, derivado de tomaimicina y derivado de leptomicina o un profármaco del agente. En una modalidad adicional, el agente citotóxico es un maitansinoide. En otra modalidad, el agente citotóxico es (21 ) -deacetil-N (21 ) - (3-mercapto-l-oxopropil) -maitansina o N ('21 ) -deacetil-N2- ( 4-mercapto-4-metil-l-oxopentil) -maitansina .
En una modalidad la invención se proporciona un inmunoconjugado que comprende: (A) un anticuerpo humanizado que comprende el dominio variable de una cadena pesada de sec. con núm. de ident.:4, y el dominio variable de una cadena ligera de sec. con núm. de ident.:10 o sec. con núm. de ident.rll; (L) el éster de N-succinimidil- [ (N-maleimidapropionamida) -tetraetilenglicol] (SNS-PEG4-maleimida) y (C) el N (2 ' ) -deacetil-N2- (4-mercapto-4-metil-l-oxopentil) -maitansina; donde (L) enlaza (A) a (C) .
En una modalidad la invención proporciona un inmunoconj ugado que comprende: (A) un anticuerpo humanizado que comprende el dominio variable de una cadena pesada de sec. con núm. de ident . : , y el dominio variable de una cadena ligera de sec. con núm. de ident.: 10 o sec. con núm. de ident.: 11; (L) el N-succinimidil 4- (2-piridilditio) butanoato (SPDB) y (C) el N ( 2 ' ) -deacetil-N2- ( 4-mercapto-4-metil-l-oxopentil) -maitansina; donde (L) enlaza (A) a (C) .
En una modalidad, la invención proporciona un inmunoconjugado que comprende: (A) un anticuerpo humanizado que comprende el dominio variable de una cadena pesada de sec. con núm. de ident.: 4, y el dominio variable de una cadena ligera de sec. con núm. de ident.: 10 o sec. con núm. de ident.: 11; (L) el W-succinimidil 4- (2-piridilditio) 2-sulfobutanoato (sulfo-SPDB) y (C) el (2 ' ) -deacetil-N2- (4-mercapto-4-metil-l-oxopentil) -maitansina; donde (L) enlaza (A) a (C) .
En una modalidad, la invención proporciona un inmunoconjugado que comprende: (A) un anticuerpo humanizado que comprende el dominio variable de una cadena pesada de sec. con núm. de ident.: 4, y el dominio variable de una cadena ligera de sec. con núm. de ident. :10 o sec. con núm. de ident.: 11; (L) el N-succinimidil 4- (2-piridilditio) -2-sulfopentanoato (sulfo-SPP) ; y (C) el N (2 ' ) -deacetil- (21 ) -(3-mercapto-l-oxopropil) -maitansina; donde (L) enlaza (A) a (C) .
En una modalidad, la invención proporciona un inmunoconjugado que comprende: (A) un anticuerpo humanizado que comprende el dominio variable de una cadena pesada de sec. con núm. de ident.: 4, y el dominio variable de una cadena ligera de sec. con núm. de ident.: 10 o sec. con núm. de ident.: 11; (L) el .V-succinimidil 4- (2-piridilditio) pentanoato (SPP) ; y (C) el (2 ' ) -deacetil-N (2 ' ) - (3-mercapto- 1-oxopropil) -maitansina; donde (L) enlaza (A) a (C) .
La invención proporciona también una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo, un fragmento de unión al antigeno, un polipéptido, o un inmunoconjugado de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una cierta modalidad, la composición farmacéutica comprende, además, un segundo agente contra el cáncer.
La invención proporciona también un reactivo de diagnóstico que comprende un anticuerpo, un fragmento de unión al antígeno, un polipéptido, o un inmunoconjugado de la invención que se marca. En una modalidad, el mareaje se selecciona del grupo de un radiomarcador, un fluoróforo, un cromóforo, un agente de imagen y un ion metálico.
La invención proporciona también un kit que comprende el anticuerpo, el fragmento de unión al antígeno, el polipéptido, o el inmunoconjugado de la invención.
La invención proporciona también un método para inhibir el crecimiento tumoral en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo, el fragmento de unión al antígeno, el polipéptido, el inmunoconjugado, o la composición farmacéutica de la invención. En una cierta modalidad, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento tumoral en un sujeto que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un inmunoconjugado que tiene la Fórmula (A) - (L) - (C) ; donde: (A) es un anticuerpo o fragmento de unión al antigeno del mismo que se une de forma especifica a un receptor 1 de folato humano; (L) es un ligando, y (C) es una citotoxina seleccionada del grupo consistente de un maitansinoide y un análogo de maitansinoide; donde (L) enlaza (A) a ( C) y donde el inmunoconjugado reduce la media del volumen tumoral al menos dos veces en un modelo de xenoinjerto en KB. En una cierta modalidad, el método comprende administrar un anticuerpo o un fragmento de unión al antigeno del mismo que comprende (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GYFMN (sec. con núm. de ident.rl); una CDR2 de cadena pesada que comprende RIHPYDGDTFYNQXaalFXaa2Xaa3 (sec. con núm. de ident.:56); y una CDR3 de cadena pesada que comprende YDGSRAMDY (sec. con núm. de ident.:3) y (b) una CDR1 de cadena ligera comprende KASQSVSFAGTSLMH (sec. con núm. de ident.:7); una CDR2 de cadena ligera que comprende RASNLEA (sec. con núm. de ident.:8); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSREYPYT (sec. con núm. de ident.:9); donde Xaai se selecciona de K, Q, H y R; Xaa2 se selecciona de Q, H, N, y R, y Xaa3 se selecciona de G, E, T, S, A y V. En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende una CDR2 que comprende RIHPYDGDTFYNQKFQG (sec. con núm. de ident.:2) de cadena pesada.
En una cierta modalidad, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento tumoral que comprende administrar un anticuerpo o un fragmento de unión al antigeno del mismo codificado por los ADN de plásmido depositados en la ATCC el 7 de abril de 2010 y que tienen los números de depósito de la ATCC, PTA-10772 y PTA-10773 ó PTA-10774.
En otra modalidad, el método proporciona administrar un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo humanizado que comprende el dominio variable de una cadena pesada de sec. con núm. de ident.:4, y el dominio variable de una cadena ligera de sec. con núm. de ident.:10 o sec. con núm. de ident.:ll; (L) el éster de N-succinimidil- [ (N-maleimidapropionamida) -tetraetilenglicol] (SNS-PEG4-maleimida) y (C) el N (2 ' ) -deacetil-N2- ( 4-mercapto-4-metil-l-oxopentil) -maitansina.
En otra modalidad, el método proporciona administrar un inmunoconj ugado que comprende un anticuerpo humanizado que comprende el dominio variable de una cadena pesada de sec. con núm. de ident.:4, y el dominio variable de una cadena ligera de sec. con núm. de ident.:10 o sec. con núm. de ident.rll; (L) el W-succinimidil 4- (2-piridilditio) butanoato (SPDB); y (C) el N (2 ' ) -deacetil-N2- (4-mercapto-4-metil-l-oxopentil ) -maitansina; donde (L) enlaza (A) a (C) .
En otra modalidad, el método comprende administrar un inmunoconjugado que comprende (A) un anticuerpo humanizado que comprende el dominio variable de una cadena pesada de sec. con núm. de ident.:4, y el dominio variable de una cadena ligera de sec. con núm. de ident.:10 o sec. con núm. de ident.rll; (L) el N-succinimidil 4- (2-piridilditio) 2-sulfobutanoato (sulfo-SPDB) y (C) el N (2 ' ) -deacetil-N2- ( 4-mercapto-4-metil-l- oxopentil) -maitansina, donde (L) enlaza (A) a (C) .
En otra modalidad, el método comprende administrar un inmunoconjugado que comprende (A) un anticuerpo humanizado que comprende el dominio variable de una cadena pesada de sec. con núm. de ident.:4, y el dominio variable de una cadena ligera de sec. con núm. de ident.:10 o sec. con núm. de ident.rll; (L) el -succinimidil 4- (2-piridilditio) -2-sulfopentanoato (sulfo-SPP) ; y (C) el N (2 ' ) -deacetil-N (21 ) -( 3-mercapto-l -oxopropil) -maitansina; donde (L) enlaza (A) a (C) .
En otra modalidad, el método comprende administrar un inmunoconjugado que comprende (A) un anticuerpo humanizado que comprende el dominio variable de una cadena pesada de sec. con núm. de ident.:4, y el dominio variable de una cadena ligera de sec. con núm. de ident.rlO o sec. con núm. de ident.rll; (L) el N-succinimidil 4- (2-piridilditio) pentanoato (SPP) ; y (C) el N (21 ) -deacetil-N (21 ) - (3-mercapto- 1-oxopropil) -maitansina; donde (L) enlaza (A) a (C) .
En otra modalidad, el método comprende administrar un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo FR-l-21hu depositado en la ATCC el 7 de abril de 2010 y que tiene los números de depósito de la ATCC, PTA-10775 y PTA-10776. En una cierta modalidad, el anticuerpo FRl-21hu comprende (a) una CDRl de cadena pesada que comprende SSYGMS (sec. con núm. de ident.:30); una CDR2 de cadena pesada que comprende TISSGGSYTY (sec. con núm. de ident.:31); y una CDR3 de cadena pesada que comprende DGEGGLYAMDY (sec. con núm. de ident.:32); y (b) una CDRl de cadena ligera comprende KASDHINNWLA (sec. con núm. de ident.:27); una CDR2 de cadena ligera que comprende GATSLET (sec. con núm. de ident.:28); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQYWSTPFT (sec. con núm. de ident.:29). En ciertas modalidades, el método comprende administrar un inmunoconj ugado que comprende el anticuerpo que es el anticuerpo FRl-48hu que comprende: (a) una CDRl de cadena pesada que comprende TNYWMQ (sec. con núm. de ident.:60); una CDR2 de cadena pesada que comprende AIYPGNGDSR (sec. con núm. de ident.:61); y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDGNYAAY (sec. con núm. de ident.:62); y (b) una CDRl de cadena ligera comprende RASENIYSNLA (sec. con núm. de ident.:57); una CDR2 de cadena ligera que comprende AATNLAD (sec. con núm. de ident . : 58 ) ; y una CDR3 de cadena ligera comprende QHFWASPYT (sec. con núm. de ident.: 59). En ciertas modalidades, el método comprende administrar un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo que es el anticuerpo FRl-49hu que comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende TNYWMY (sec. con núm. de ident.: 66); una CDR2 de cadena pesada que comprende AIYPGNSDTT (sec. con núm. de ident.: 67); y una CDR3 de cadena pesada que comprende RHDYGA DY (sec. con núm. de ident.: 68); y (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende RASENIYTNLA (sec. con núm. de ident.: 63); una CDR2 de cadena ligera que comprende TASNLAD (sec. con núm. de ident.: 64); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QHFWVSPYT (sec. con núm. de ident. :65). En ciertas modalidades, el método comprende administrar un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo que es el anticuerpo FRl-57hu que comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende SSFGMH (sec. con núm. de ident. :72); una CDR2 de cadena pesada que comprende YISSGSSTIS (sec. con núm. de ident. :73); y una CDR3 de cadena pesada que comprende EAYGSSMEY (sec. con núm. de ident. :74); y (b) una CDR1 de cadena ligera comprende RASQNINNNLH (sec. con núm. de ident.: 69); una CDR2 de cadena ligera que comprende YVSQSVS (sec. con núm. de ident. :70); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSNSWPHYT (sec. con núm. de ident. :71). En ciertas modalidades, el método comprende administrar un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo que es el anticuerpo FRl-65hu, que comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende TSYTMH (sec. con núm. de ident.:78); una CDR2 de cadena pesada que comprende YINPISGYTN (sec. con núm. de ident.:79); y una CDR3 de cadena pesada que comprende GGAYGRKPMDY (sec. con núm. de ident.:80); y (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende KASQNVGPNVA (sec. con núm. de ident.:75); una CDR2 de cadena ligera que comprende SASYRYS (sec. con núm. de ident.:76); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQYNSYPYT (sec. con núm. de ident.:77).
En una modalidad, el método inhibe el crecimiento del tumor de ovario, tumor de cerebro, tumor de mama, tumor de útero, tumor de endometrio, tumor pancreático, tumor renal, o tumor de pulmón. En una cierta modalidad, el método inhibe el crecimiento del tumor de ovario. En otra modalidad, la invención inhibe el crecimiento del tumor de pulmón. En una cierta modalidad, la inhibición del crecimiento tumoral se usa para tratar el cáncer. En una modalidad adicional, el método comprende administrar al sujeto un segundo agente contra el cáncer. En una cierta modalidad, el segundo agente contra el cáncer es un agente quimioterapéutico .
La invención proporciona también una célula aislada que produce el anticuerpo, el fragmento de unión al antígeno, o el polipéptido de la invención.
La invención proporciona también un polinucleótido aislado que comprende una secuencia al menos 90% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo consistente de las sec. con núm. de ident.: 5, 14, 15, 37, 38, 43, 44, 47, 48 y 120- 127. En una cierta modalidad, el polinucleótido aislado es al menos 95% idéntico a una secuencia seleccionada del grupo consistente de las sec. con núm. de ident.: 5, 14, 15, 37, 38, 43, 44, 47, 48 y 120-127. En otra modalidad, el polinucleótido aislado es al menos 99% idéntico a una secuencia seleccionada del grupo consistente de las sec. con núm. de ident.: 5, 14, 15, 37, 38, 43, 44, 47, 48 y 120-127. La invención proporciona también un vector que comprende cualquiera de los polinucleótidos de las sec. con núm. de ident.: 5, 14, 15, 37, 38, 43, 44, 47, 48 y 120-127. En otra modalidad, la invención proporciona una célula huésped que comprende un vector que contiene un polinucleótido de sec. con núm. de ident.: 5, 14, 15, 37, 38, 43, 44, 47, 48 y 120-127.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A-1D. Residuos superficiales de Movl9 murino (Movl9mu) y humanizado ( ovl9hu) . (Fig. 1A) Residuos superficiales de una cadena ligera de Movl9 murino y humanizado. Se dan los residuos superficiales del marco de la región variable de una cadena ligera de Movl9 murino y humanizado y el número de posición (sistema Kabat) . Los residuos humanos que son diferentes de las secuencias murinas originales se subrayan. *La posición 74 no es una posición de superficie, pero para eliminar un sitio de glicosilación ligado a N-consenso en la versión 1.00, esta posición se cambió por una Treonina (el residuo humano más común en esta posición); lo que resulta en la versión 1.60. (Fig. IB) Residuos superficiales de una cadena pesada de Movl9 murino y humanizado. Se dan los residuos superficiales del marco de la región variable de una cadena pesada de Movl9 murino y humanizado y el número de posición (sistema Kabat) . Los residuos humanos que son diferentes de las secuencias murinas originales se subrayan. Residuos de superficie similares se proveen para FR1-21 (Fig. 1C) y (Fig. ID) .
Las Figuras 2A-2D. Alineaciones de los dominios variables de una cadena ligera y pesada de ovl9 quimérico y Movl9hu y los dominios variables de una cadena pesada y ligera de FRl-21mu y FRl-21hu. Alineamiento de secuencias revestidas de las regiones variables de Movl9 y Frl-21 con sus homólogos murinos. Fig. 2A) y Fig. 2C) dominios variables de una cadena ligera; Fig. 2B) y Fig. 2D) dominio variable de una cadena pesada. Los guiones "-" indican la identidad con la secuencia murina. Las CDR (definición Kabat) se subrayan.
La Figura 3. Expresión de Movl9 quimérico y Movl9hu en las células HEK. Los plásmidos de expresión de ovl9 quimérico y humano se transíectaron transientemente en las células de suspensión T HEK293, se cosecharon 7 días después, y el anticuerpo expresado se determinó por ELISA cuantitativo. Los plásmidos de cadena ligera y cadena pesada se transíectaron a las proporciones molares respectivas ya sea de 3:1 o 6:1.
La Figura 4. Especificidad de unión de anticuerpos anti-F0LR1, según se detectó por su unión a las células 300-19 que expresan F0LR1. La unión de Movl9hu a las células 300-19-FOLR1 mediante citometría de flujo. Las células parentales 300-19 que expresan FOLR-1. El sombreado gris sólido representa la autofluorescencia celular, las líneas de puntos negros representan las células incubadas con el anticuerpo secundario antihumano conjugado con FITC, las líneas negras sólidas representan las células incubadas con el anticuerpo Mov-19hu y el anticuerpo secundario antihumano conjugado con FITC.
La Figura 5. Afinidades de unión y la actividad citotóxica, in vitro, de los anticuerpos anti-FOLRl e inmunoconj ugados . La afinidad de unión de Movl9hu y de distintos anticuerpos FR-1 murinos y humanizados se midió en las células SKOV3. La actividad citotóxica, in vitro, de los conjugados PEG4-Mal-DM4 con los anticuerpos mencionados se ensayó también.
La Figura 6. Citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo de los inmunocon ugados . La actividad ADCC de Movl9hu, FRl-21hu, y Mor003 se ensayó frente a las células Igrovl . Las Igrov 1 se incubaron a 15000 células/pocilio de objetivo : NK en la proporción celular de 1:4.
La Figura 7. Actividad citotóxica por la exposición continua de FRl-21hu-PEG4-mal-D 4 y Moví9hu-PEG4-mal-DM4 en las células KB. Un exceso de anticuerpos sin conjugar suprimió la actividad de los inmunoconjugados cuando se coincubaron en la presencia de células KB, lo cual indica que la actividad citotóxica es dependiente de antigeno.
La Figura 8. Eficacia, in vivo, de los conjugados dirigidos por el Movl9hu en un modelo de xenoinjerto con KB. El conjugado escindible Movl9hu-SPDB-DM4 dirigido al FOLRl (B) en comparación con el C242hu-SPDB-DM4 no dirigido a FOLRl (D) ; y el conjugado Movl9hu-PEG4-Mal-DM4 no escindible (C) en comparación con el C242hu-PEG4-Mal-DM4 no dirigido (E) se probaron mediante un modelo de xenoinjerto establecido para las células KB que se implantan por vía subcutánea en ratones SCID. Dirigir el Movl9hu al FOLRl resultó en una disminución significativa de la media del volumen tumoral.
Las Figuras 9A-9D. Eficacia, in vivo, de Movl9hu-PEG4- Mal-DM4 en comparación con los anticuerpos FR-1 murinos anti-FOLR1 en un modelo de xenoinjerto con KB. Los anticuerpos de serie FR-1, ya sea sin conjugar, o conjugados con PEG4-Mal-DM4 se probaron por su capacidad para reducir la media del volumen tumoral en comparación con Movl9hu-PEG4-Mal-DM4 en un modelo tumoral de xenoinjerto en células KB. (Fig. 9A) FR-1-9, (Fig. 9B) FR-1-13, (Fig. 9C) FR-1-22, y (Fig. 9D) FR-1-23.
La Figura 10. Eficacia, in vivo, de Movl9hu-PEG4-Mal-DM4 y FRl-21hu-PEG4-Mal-DM4 en un modelo de xenoinjerto con células KB. Las inyecciones únicas con 10 mg/kg de Movl9hu-PEG4-Mal-DM4 y FRl-2 lhu-PEG4-Mal-DM4 se realizaron el día 6 posterior a la inoculación. Ambos Movl9hu-PEG4-Mal-DM4 y FR1-21hu -PEG4-Mal-DM4 mostraron una reducción significativa de la media del volumen tumoral. La "Media TV" se refiere a la media del volumen tumoral.
La Figura 11. El ovl9hu-PEG4-Mal-DM4 muestra una actividad dependiente de la dosis en el modelo de xenoinjerto con células KB. La actividad dependiente de la dosis del inmunoconj ugado se ensayó en todo el intervalo de dosis probadas. La dosificación semanal resultó en la mejoría de la actividad antitumoral. Las altas cargas de fármacos mejoraron sólo marginalmente la actividad en los grupos con dosis de 10 mg/kg, con una actividad reducida en los grupos de dosis menores. El DAR 3.7 se refiere a 3.7 moléculas del fármaco por anticuerpo.
La Figura 12. Eficacia, in vivo, de Movl9hu conjugado con DM1 y DM4 con distintos ligandos. El Movl9hu se conjugó con el SMCC-DM1 a 3.9 moléculas del fármaco por anticuerpo; el sulfo-Mal-DM4 a 3.7 moléculas del fármaco por anticuerpo (B) ; y el sulfo-Mal-DM4 a 8.23 moléculas del fármaco por anticuerpo (C) y se ensayaron por su capacidad para reducir la media del volumen tumoral a diferentes concentraciones en comparación con el Movl9hu-PEG4-Mal-DM4.
La Figura 13. Eficacia, in vivo, de Movl9hu conjugado con DM1 y DM4 con distintos ligandos. El Movl9hu se conjugó con SPP-DM1 a 4.3 moléculas del fármaco por anticuerpo; el sulfo-SPDB-DM4 a 3.8 moléculas del fármaco por anticuerpo, el SPDB-DM4 a 3.8 moléculas del fármaco por anticuerpo, y el sulfo-SPDB DM4 a 6.8 moléculas del fármaco por anticuerpo y se analizaron por su capacidad para reducir la media del volumen tumoral. Los ratones se trataron con 5 mg/kg (A) y 2.5 mg/kg (B) de uno de los conjugados mencionados anteriormente o sólo con PBS .
La Figura 14. Eficacia, in vivo, de Movl9hu-sulfo-SPDB-DM4 en el modelo tumoral de xenoinjerto con OVCAR-3. Los ratones se trataron con 25, 50, ó 100 pg/kg de Movl9hu-sulfo-SPDB-DM4 o sólo con PBS.
La Figura 15. Eficacia, in vivo, de Movl9hu-sulfo-SPDB-DM4 en el modelo tumoral de xenoinjerto con IGROV-1. Los ratones se trataron con 25, 50, ó 100 pg/kg de Movl9hu-sulfo-SPDB-DM4 o sólo con PBS.
La Figura 16. Eficacia, in vivo, de Movl9hu-sulfo-SPDB-DM4 en el modelo tumoral de xenoinjerto con OV-90. Los ratones se trataron con 25, 50, ó 100 g/kg de Movl9hu-sulfo-SPDB-DM4 o sólo con PBS.
La Figura 17. Efecto de los ligandos escindible y los ligandos no escindibles en la eficacia de los inmunoconjugados en los modelos de xenoinjertos en células KB.
Las Figuras 18A-18B. Efecto de los ligandos escisindibles en la eficacia de los inmunoconjugados en (Fig. 18A) el modelo de xenoinjerto con KB, (Fig. 18B) el modelo de xenoinjerto con OVCAR-3.
La Figura 19. Eficacia in vitro e in vivo de FRl-48hu, FRl-49hu, FRl-57hu, y FRl-65hu-SMCC-DMl en KB y los modelos tumorales de xenoinjertos. Los ratones se trataron con 200 yg/kg de dosis únicas.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención proporciona agentes nuevos, que incluyen pero no se limitan a polipéptidos, tales como los anticuerpos, e inmunoconjugados que se unen al receptor 1 de folato humano (FOLRl) . Se proporcionan los polipéptidos y polinucleótidos relacionados, las composiciones que comprenden los agentes de unión a FOLRl, y los métodos para preparar los agentes de unión a FOLRl. Además se proporcionan los métodos de usar los agentes nuevos de unión a FOLRl, tales como los métodos de inhibir el crecimiento tumoral y/o tratar el cáncer.
I. Definiciones Para facilitar una comprensión de la presente invención, un número de términos y frases se definen a continuación.
Los términos "receptor 1 de folato humano" o "FOLR1", que se usan en este documento, se refieren a cualquier F0LR1 humano nativo, a menos que se indique de otra manera. El término "F0LR1" incluye el FOLR1 sin procesar, de "longitud completa" asi como cualquier forma de FOLR1 que resulte del procesamiento dentro de la célula. El término incluye también las variantes de FOLRl de origen natural, por ejemplo, las variantes de empalme, las variantes alélicas e isoformas. Los polipéptidos FOLRl que se describen en este documento se pueden aislar de diferentes fuentes, tales como de tipos de tejido humano u otra fuente, o preparado mediante los métodos recombinantes o sintéticos. Los ejemplos de las secuencias FOLRl incluyen, pero no se limitan a los números de referencia de NCBI P15328, NP_001092242.1 , AAX29268.1, AAX37119.1, NP_057937.1, y NP_057936.1.
El término "anticuerpo" significa una molécula de inmunoglobulina que reconoce y se une de forma especifica a un objetivo, tal como una proteina, polipéptido, péptido, carbohidrato, polinucleótido, lipido, o combinaciones de los anteriores, al menos a través de un sitio de reconocimiento del antigeno dentro de la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se usa en este documento, el término "anticuerpo" incluye los anticuerpos policlonales intactos, los anticuerpos monoclonales intactos, los fragmentos de anticuerpos (tales como Fab, Fab', F(ab')2, y fragmentos Fv) ; mutantes Fv de cadena simple (scFv) , anticuerpos multiespecificos tales como los anticuerpos biespecificos generados al menos de dos anticuerpos intactos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, proteínas de fusión que comprenden una parte para la determinación del antígeno de un anticuerpo, y cualquier otra molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento del antígeno tan extenso que los anticuerpos presenten la actividad biológica conveniente. Un anticuerpo puede ser de alguna de las cinco mayores clases de inmunoglobulinas : IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, o subclases (isotipos) de éstas (por ejemplo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) ; basado en la identidad de sus dominios constantes de las cadenas pesadas que se refieren como alfa, delta, épsilon, gamma, y mu, respectivamente. Las clases diferentes de inmunoglobulinas tienen estructuras de subunidades y configuraciones tri-dimensionales diferentes y bien conocidas. Los anticuerpos se pueden desnudar o conjugar a otras moléculas tales como toxinas, radioisótopos, etc.
Un anticuerpo de "bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno que se une, tal como F0LR1. En una cierta modalidad los anticuerpos de bloqueo o los anticuerpos antagonistas inhiben de manera sustancial o completamente la actividad biológica del antigeno. Es conveniente que, la actividad biológica se reduzca en un 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, o incluso en un 100%.
El término "anticuerpo anti-FOLRl" o "un anticuerpo que se une a F0LR1" se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse a FOLR1 con afinidad suficiente de manera tal que el anticuerpo sea útil como un agente para el diagnóstico y/o agente terapéutico dirigido a FOLR1. La magnitud de la unión de un anticuerpo anti-FOLRl a una proteina sin relación, una proteina sin FOLR1 es aproximadamente menor que 10% de la unión del anticuerpo a F0LR1 cuando se mide, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA) . En ciertas modalidades, un anticuerpo que se une a FOLR1 tiene una constante de disociación (Kd) de =1µ?, =100 n , <¦ 10 n , = 1 nM, o = 0.1 nM.
El término "fragmento de anticuerpo" se refiere a una parte de un anticuerpo intacto y se refiere a las regiones variables de determinantes antigénicos de un anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a los fragmentos Fab, Fab1, F(ab')2, y Fv, los anticuerpos lineales, los anticuerpos de cadena simple, y los anticuerpos multiespecificos formados de los fragmentos de anticuerpos.
Un "anticuerpo monoclonal" se refiere a una población homogénea de anticuerpo involucrada en el reconocimiento altamente especifico y la unión de un determinante antigénico simple, o epitopo. Esto está en contraste con los anticuerpos policlonales que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes antigénicos. El término "anticuerpo monoclonal" incluye tanto los anticuerpos monoclonales intactos como los anticuerpos monoclonales de longitud completa, así como los fragmentos de anticuerpos (tales como Fab, Fab, F (ab')2, Fv) ; mutantes (scFv) de cadena simple, proteínas de fusión que comprende una parte de anticuerpo, y cualquier otra molécula modificada de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento del antígeno. Además, el "anticuerpo monoclonal" se refiere a aquellos anticuerpos preparados de muchas maneras que incluyen pero no se limitan a las de hibridoma, selección de fagos, expresión recombinante, y animales transgénicos .
El término "anticuerpo humanizado" se refiere a las formas de anticuerpos no-humanos (por ejemplo, murinos) que son las cadenas específicas de inmunoglobulinas , las inmunoglobulinas quiméricas, o los fragmentos de éstos que contienen el mínimo de secuencias no-humanas (por ejemplo, murinas) . Típicamente, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas en las que los residuos de la región determinante de la complementariedad (CDR) se sustituyen por los residuos de la CDR de una de las especies no humanas (por ejemplo, ratón, rata, conejo, hámster) que tienen la especificidad, afinidad, y capacidad convenientes (Jones y otros, 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann y otros, 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen y otros, 1988, Science, 239:1534-1536). En algunos ejemplos, los residuos de la región marco (FR) de Fv de una inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos correspondientes de un anticuerpo de una de las especies no humanas que tienen la especificidad, afinidad y capacidad convenientes. El anticuerpo humanizado se puede modificar, además, por la sustitución de residuos adicionales ya sean en la región marco de Fv y/o dentro de los residuos no humanos reemplazados para perfeccionar y optimizar la especificidad, la afinidad y/o capacidad del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos un dominio variable, y típicamente dos o tres dominios variables que contienen todas o sustancialmente todas las regiones CDR que corresponden a la inmunoglobulina no humana, mientras que en todas o sustancialmente todas las regiones de FR están aquellas de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede comprender también al menos una parte de una región o dominio constante de la inmunoglobulina (Fe) ; típicamente de una inmunoglobulina humana. Los ejemplos de los métodos que se usan para generar anticuerpos humanizados se describen en las patentes de EE.UU. 5,225,539 ó 5,639,641.
Una "región variable" de un anticuerpo se refiere a la región variable de una cadena ligera del anticuerpo o a la región variable de una cadena pesada del anticuerpo, ya sea sola o en combinación. Las regiones variables de una cadena pesada y ligera cada una consistentes de cuatro regiones marco (FR) se conectan por tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) ; también conocidas como regiones hipervariables . Las CDR en cada cadena se mantienen unidas a corta distancia por las FR y con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión de los anticuerpos al antigeno. Existen dos técnicas al menos para determinar las CDR: (1) un enfoque basado en la variabilidad de secuencia de especies cruzadas (es decir, Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5ta ed. , 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)) y (2) un enfoque basado en los estudios cristalográficos de los complejos antigeno-anticuerpo (Al-lazikani y otros (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). Además, a veces se usan en la técnica las combinaciones de estos dos enfoques para determinar las CDR.
El sistema de numeración Kabat se usa, en general, para referirse a un residuo en el dominio variable (aproximadamente de 1-107 residuos de una cadena ligera y de 1-113 residuos de una cadena pesada) (por ejemplo, Kabat y otros, Sequences of Immunological Interest. 5ta Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) ) .
La numeración de la posición de los aminoácidos según Kabat, se refiere al sistema de numeración que se usa para los dominios variables de una cadena pesada o los dominios variables de una cadena ligera en el compendio de anticuerpos de Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) . Mediante este sistema de numeración, la secuencia lineal de aminoácidos presente puede contener menos o más aminoácidos que corresponden a una reducción de, o una inserción a, una FR o una CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir un único inserto de aminoácido (residuo 52a de acuerdo con Kabat) después del residuo 52 de H2 y los residuos insertados (por ejemplo, residuos de 82a, 82b, y 82c, etc. según Kabat) después del residuo 82 de la FR de una cadena pesada. La numeración Kabat de los residuos se puede determinar para un anticuerpo dado por el alineamiento de las regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia "estándar" numerada por Kabat. Chothia en cambio se refiere a la ubicación de los lazos estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). El terminal del lazo CDR-Hl de Chothia cuando se numera usando la convención de numeración de Kabat varia entre H32 y H34 en dependencia de la longitud del lazo (esto se debe a que el esquema de numeración de Kabat sitúa las inserciones en H35A y H35B, si ni 35A ni 35B está presente, el lazo termina en 32, si sólo 35A está presente, el lazo termina en 33, si ambos 35A y 35B están presentes, el lazo termina en 34) . Las regiones hipervariables AbM representan un compromiso entre las CDR de Kabat y los lazos estructurales de Chothia, y se usan por el programa para el modelaje de anticuerpo AbM de Oxford Molecular .
Lazo Kabat AbM Chothia Ll L24-L34 L24-L34 L24-L34 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L56 L3 L89-L97 L89-L97 L89-L97 H26- Hl H31-H35B H26-H35B H32..34 (Numeración Kabat) Hl H31-H35 H26-H35 H26-H32 (Numeración Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H52-H56 H3 H95-H102 H95-H102 H9¾-H102 término "anticuerpo humano", denota un anticuerpo producido por un humano o un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos que se corresponde a un anticuerpo producido por un humano que se prepara mediante cualquier método conocido en la técnica. Esta definición de un anticuerpo humano incluye los anticuerpos intactos o de longitud completa, los fragmentos de éstos, y/o los anticuerpos que comprenden al menos un polipéptido de cadena pesada y/o cadena ligera humano, tal como, por ejemplo, un anticuerpo que comprende los polipéptidos de cadena ligera murina y de cadena pesada humana.
El término "anticuerpos quiméricos" se refiere a los anticuerpos donde la secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina se deriva de dos o más especies. Típicamente, la región variable tanto de las cadenas ligeras como de las pesadas se corresponde a la región variable de anticuerpos derivados de una de las especies de mamíferos (por ejemplo, ratón, rata, conejo, etc) con la especificidad, afinidad y capacidad conveniente, mientras que las regiones constantes son homologas a las secuencias de los anticuerpos derivados de otra especie (usualmente humana) para evitar la inducción de una respuesta inmune en estas especies.
Los términos "epítopo" o "determinante antigénico" se usan indistintamente en este documento y se refieren a la parte de un antígeno capaz de ser reconocido y enlazado de forma específica por un anticuerpo particular. Cuando el antígeno es un polipéptido, los epitopos se pueden formar tanto de aminoácidos contiguos como aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por el plegamiento terciario de una proteina. Los epitopos formados de los aminoácidos contiguos normalmente se retienen con la desnaturalización de la proteína, mientras que los epítopes formados por el plegamiento terciario normalmente se pierden con la desnaturalización de la proteína. Un epítopo normalmente incluye al menos 3, y usualmente más, al menos 5 u 8 a 10 aminoácidos en una conformación espacial única.
La "afinidad de unión" se refiere en general a la fortaleza de la suma total de las interacciones no covalentes entre un sitio de unión único de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su pareja de unión (por ejemplo, un antígeno) . A menos que se indique lo contrario, como se usa en este documento, la "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción de 1:1 entre los miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno) . La afinidad de una molécula de X por su pareja Y se puede representar en general, por la constante de disociación (Kd) . La afinidad se puede medir por métodos comunes conocidos en la técnica, que incluyen aquellos descritos en este documento. Los anticuerpos de baja afinidad, en general, se unen lentamente al antígeno y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad en general se unen rápidamente al antigeno y tienden a permanecer unidos por más tiempo. Una variedad de métodos para medir la afinidad de unión se conocen en la técnica, algunos de los cuales se pueden usar para los propósitos de la presente invención. Las modalidades especificas ilustrativas se describen a continuación.
Cuando se usa en este documento "o mejor" para referir la afinidad de unión se refiere a una unión más fuerte entre una molécula y su pareja de unión. Cuando se usa en este documento "o mejor" se refiere a una unión más fuerte, que se representa por un valor numérico Kd más pequeño. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene una afinidad por un antigeno de "0.6 nM o mejor", la afinidad del anticuerpo para el antigeno es <0.6 nM, es decir, 0.59 nM, 0.58 nM, 0.57 nM etc. o cualquier valor inferior a 0.6 nM.
La frase "sustancialmente similar", o "sustancialmente la misma", como se usa en este documento, denota un grado de similitud suficientemente alto entre dos valores numéricos (por lo general uno se asocia con un anticuerpo de la invención y el otro se asocia con una referencia/anticuerpo de comparación) de manera que una persona con conocimiento en la técnica podría considerar que la diferencia entre los dos valores sería de poca o ninguna significación biológica y/o estadística en el contexto de las características biológicas medidas por los valores (por ejemplo, los valores de Kd) . La diferencia entre los dos valores es menor que aproximadamente 50%, menor que aproximadamente 40%, menor que aproximadamente 30%, menor que aproximadamente 20%, o menor que aproximadamente 10% en función del valor para la referencia/anticuerpo de comparación.
Un polipéptido, un anticuerpo, un polinucleótido, un vector, una célula, o una composición que se aisla es un polipéptido, un anticuerpo, un polinucleótido, un vector, una célula, o una composición que está en una forma no encontrada en la naturaleza. Los polipéptidos, anticuerpos, polinucleótidos , vectores, células o composiciones aislados incluyen aquellos que se han purificado hasta un grado que ya no están de una forma en la que se encuentran en la naturaleza. En algunas modalidades, un anticuerpo, un polinucleótido, un vector, una célula, o una composición que se aisla es sustancialmente pura.
Según se usa en este documento, "sustancialmente pura" se refiere a un material que es al menos 50% puro (es decir, libre de contaminantes) ; al menos 90% puro, al menos 95% puro, al menos 98% puro, o al menos 99% puro.
El término "inmunoconjugado" o "conjugado" como se usa en este documento, se refiere a un compuesto o un derivado de éste que se enlaza a un agente de unión celular (es decir, un anticuerpo anti-FOLRl o un fragmento de éste) y se define por una fórmula genérica: C-L-A, donde C=citotoxina, L = ligando, y A=agente de unión celular o anticuerpo anti-FOLRl o fragmento de anticuerpo. Los inmunoconjugados se pueden definir también por la fórmula genérica en el orden inverso: A-L-C.
Un "ligando" es cualquier mitad quimica que es capaz de enlazar un compuesto, usualmente un fármaco, tal como un maitansinoide, con un agente de unión celular tal como un anticuerpo anti F0LR1 o un fragmento de éste. Los ligandos pueden ser susceptibles o ser sustancialmente resistentes a la escisión inducida por ácido, escisión inducida por la luz, escisión inducida por peptidasa, escisión inducida por esterasa y escisión del enlace disulfuro, en condiciones en las que el compuesto o el anticuerpo se mantiene activo. Los ligando adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, los grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles al ácido, grupos fotolábiles, grupos lábiles a la peptidasa y grupos lábiles a la esterasa. Los ligandos incluyen también ligando cargados, y las formas hidrofilicas de éstos como se describe en este documento y se conocen en la técnica.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la enfermedad fisiológica en los mamíferos en los que una población de células se caracteriza por el crecimiento celular descontrolado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Los ejemplos más particulares de estos cánceres incluyen el cáncer de células escamosas, el cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña, adenocarcinoma de pulmón, el carcinoma escamoso de pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, el glioblastoma , el cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, el cáncer vulvar, cáncer de tiroide, carcinoma hepático y distintos tipos de cánceres de cabeza y cuello.
El "tumor" y el "neoplasma" se refieren a cualquier masa de tejido que resulta del crecimiento o la proliferación celular en exceso, ya sea benigno (no canceroso) o maligno (canceroso) que incluyen las lesiones pre-cancerosas.
Los términos "célula de cáncer", "célula tumoral," y los equivalentes gramaticales se refieren a la población total de células derivadas de un tumor o una lesión pre-cancerosa, que incluyen tanto las células no tumorales, que comprenden la extirpación de la población de célula tumoral como las células tumorigénicas madre (células madre de cáncer) . Como se usa en este documento, el término "célula tumoral" será modificado por el término "no-tumorigénica" cuando se refiere exclusivamente a aquellas células tumorales que carecen de la capacidad de renovarse y diferenciarse para distinguir aquellas células tumorales de las células madre de cáncer.
El término "sujeto" se refiere a cualquier animal (por ejemplo, un mamífero) ; que incluye pero no se limita a humanos, primates no humanos, roedores, y similares, que debe ser el receptor de un tratamiento en particular. Típicamente, los términos "sujeto", y "paciente" se usan indistintamente en este documento con respecto a un sujeto humano.
La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concomitante) y consecutiva en cualquier orden.
El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que es de cierta forma para permitir que la actividad biológica del principio activo sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean tóxicos inaceptables a un sujeto para el cual la formulación se podría administrar. Esta formulación puede ser estéril.
Una "cantidad efectiva" de un anticuerpo como se describe en este documento es una cantidad suficiente para llevar a cabo un propósito específicamente establecido. Una "cantidad efectiva" se puede determinar empíricamente y de una manera rutinaria, en relación con los propósitos establecidos .
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un anticuerpo u otro fármaco eficaz para "tratar" una enfermedad o trastorno en un sujeto o mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede reducir el número de células de cáncer, reducir el tamaño del tumor, inhibir (es decir, ralentizar en alguna medida y en una cierta modalidad, detener) la infiltración de células cancerígenas en órganos periféricos, inhibir (es decir, ralentizar en alguna medida y en una cierta modalidad, detener) la metástasis del tumor, inhibir, en alguna medida, el crecimiento del tumor, y/o aliviar en alguna medida uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. Véase la definición de "tratar" en este documento. En la medida que el fármaco pueda prevenir el crecimiento y/o matar a las células de cáncer que existen, puede ser citostático o citotóxico. Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, en dosis y durante períodos de tiempo necesario, para lograr el resultado profiláctico conveniente. Típicamente, pero no necesariamente, ya que una dosis profiláctica se usa en los sujetos antes o en una fase temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.
La palabra "marca" cuando se usa en este documento, se refiere a un compuesto detectable o a la composición que se conjuga directa o indirectamente con el anticuerpo con el fin de generar un anticuerpo "marcado". La marca se puede detectar por sí misma (por ejemplo, los marcadores de radioisótopos o marcadores de fluorescencia) o, en el caso de un marcador enzimático, que puede catalizar la modificación química de un compuesto o una composición de sustrato que se detecta .
Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer, independientemente del mecanismo de acción. Las clases de agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a: agentes alquilantes, antimetabolitos, alcaloides de la planta de veneno del husillo, antibióticos citotóxicos/antitumorales, inhibidores de la topoisomerasa, anticuerpos, fotosensibilizadores, e inhibidores de quinasa. Los agentes quimioterapéuticos incluyen los compuestos usados en la "terapia dirigida" y la quimioterapia convencional.
Los términos tales como "trato" o "tratamiento" o "tratar" o "alivio" o "aliviar" se refieren tanto a 1) medidas terapéuticas que curen, desaceleren, disminuyan los síntomas, y/o el cese de la progresión de una afección o trastorno patológico identificado y 2) medidas profilácticas o preventivas que prevengan o disminuyan el desarrollo de una enfermedad o trastorno patológico objetivo. De este modo, aquellos que necesitan el tratamiento incluyen aquellos que ya están con el trastorno; aquellos propensos a tener el trastorno, y aquellos en los que el trastorno se debe evitar. En ciertas modalidades, de acuerdo con los métodos de la presente invención un sujeto se "trata" con éxito para el cáncer, si el paciente presenta uno o más de los siguientes efectos: una reducción en el número o ausencia completa de las células de cáncer, una reducción en el tamaño del tumor, la inhibición o una ausencia de la infiltración de células de cáncer en órganos periféricos que incluyen, por ejemplo, la propagación del cáncer en tejidos blandos y huesos; la inhibición o una ausencia de metástasis tumoral, la inhibición o una ausencia de crecimiento tumoral, la atenuación de uno o más de los síntomas asociados con el cáncer específico; la reducción de la morbilidad y la mortalidad, la mejoría en la calidad de vida, la reducción en la tumorigenicidad, la frecuencia tumorigénica, o la capacidad tumorigénica, de un tumor, la reducción en el número o la frecuencia de las células madre de cáncer en un tumor, la diferenciación de células tumorigénicas a un estado no-tumorigénico, o alguna combinación de efectos.
Según se usan indistintamente en este documento "polinucleótido, " o "ácido nucleico, " se refieren a los polímeros de nucleotidos de cualquier longitud, e incluyen el ADN y el ARN. Los nucleotidos pueden ser desoxirribonucleótidos , ribonucleótidos, nucleotidos o bases modificadas y/o sus análogos, o cualquier sustrato que se pueda incorporar en un polímero mediante la polimerasa de ADN o ARN. Un polinucleótido puede comprender nucleotidos modificados, tales como nucleotidos metilados y sus análogos. Si se presenta, la modificación en la estructura de nucleotidos se puede dar antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleotidos se puede interrumpir por componentes que no son nucleotidos. Un polinucleótido se puede modificar además después de la polimerización, tal como mediante la conjugación con un componente que marca. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, las "capas", la sustitución de uno o más de los nucleotidos de origen natural con un análogo, las modificaciones internucleótido tales como, por ejemplo, aquellas con los ligandos sin carga (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres , fosfoamidatos , carbamatos, etc.) y con los ligandos cargados (por ejemplo, fosforotioatos , fosforoditioatos, etc.); aquellos que contienen porciones colgantes, tales como, por ejemplo, las proteínas (por ejemplo, las nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, capa-L-lisina, etc. ) aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, soraleno, etc.); aquellos que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidantes, etc.); aquellos que contienen los alquilantes, aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc) ; así como las formas sin modificar de polinucleótido ( s ) .
Además, cualquiera de los grupos hidroxilo presentes normalmente en los azúcares se pueden reemplazar, por ejemplo, por grupos fosfonatos, grupos fosfatos, se pueden proteger por los grupos de protección estándar, o se pueden activar para preparar los enlaces adicionales a los nucleótidos adicionales, o se pueden conjugar con soportes sólidos. El terminal OH 5 ' y 3' se puede fosforilar o sustituir con aminas o porciones con grupos de capa orgánica de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos se pueden derivar también a los grupos protectores estándares. Los polinucleótidos pueden contener también las formas análogas de azúcares ribosa o desoxirribosa que se conocen en general en la técnica, que incluyen, por ejemplo, 2 ' -0-metilo-, 2 ' -0-alilo, 2'-fluoro- o 21 -azido-ribosa, análogos carbociclicos del azúcar, azúcares alfa-anoméricos, azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares piranosas, azúcares furanosas, sedoheptulosas, análogos aciclicos y los análogos abásicos de nucleosidos, como el metil ribósido. Uno o más enlaces fosfodiéster se pueden reemplazar por grupos de enlace alternativo. Estos grupos de enlace alternativo incluyen, pero no se limitan a, las modalidades donde el fosfato se reemplaza por P(0)S ("tioato"); P(S)S ("ditioato") ; "(0)NR2 ("Amidato"), P(0)R, P(0)0R, C0 o CH2 ("formacetal" ) ; en donde cada R o R' es el alquilo (1-20 C) sustituido o no sustituido independientemente de H que contiene opcionalmente un enlace éter (—O--), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, o araldilo. No todos los enlaces en un polinucleótido necesitan ser idénticos. La descripción anterior se aplica a todos los polinucleótidos referidos en este documento, que incluyen el ARN y el ADN.
El término "vector" significa un constructo, que es capaz de entregar, y expresar, uno o más genes (s) o secuencia (s) de interés en una célula huésped. Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, los vectores virales, vectores de expresión de ADN o ARN desnudo, plásmido, vectores cósmido o fago, vectores de expresión de ADN o ARN asociados con agentes de condensación catiónica, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas, y determinadas células eucariotas, tales como las células productoras .
Los términos "polipéptido" , "péptido", y "proteína" se usan indistintamente en este documento para referirse a los polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados, y se puede interrumpir por no- aminoácidos. Los términos incluyen también un polímero de aminoácidos que se ha modificado de forma natural o por intervención, por ejemplo, la formación de enlace disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tales como la conjugación con un componente marcado. En la definición se incluyen también, por ejemplo, los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (que incluyen, por ejemplo, aminoácidos artificiales, etc) ; asi como otras modificaciones conocidas en la técnica. Se entiende que, debido a que los polipéptidos de esta invención se basan en anticuerpos, en ciertas modalidades, los polipéptidos pueden aparecer como cadenas simples o cadenas asociadas .
Los términos "idéntico" o por ciento de "identidad" en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especifico de nucleótidos o residuos de aminoácidos que son iguales, cuando se comparan y se alinean (que introducen brechas, si es necesario) para la correspondencia máxima, sin considerar ninguna de las sustituciones conservativas de aminoácidos como parte de la identidad de secuencia. El por ciento de identidad se puede medir mediante el programa de comparación de secuencias o algoritmos o mediante inspección visual. Distintos algoritmos y programas que se pueden usar para obtener los alineamientos de las secuencias de aminoácidos o nucleótidos son conocidos en la técnica. Un ejemplo tal no limitativo de un algoritmo para alineamiento de secuencia es el algoritmo descrito en Karlin y otros, 1990, Proc. Nati. Acad. Sci., 87:2264-2268, según modificado en Karlin y otros, 1993, Proc. Nati. Acad.
Sci., 90:5873-5877, e incorporado en los programas NBLAST y XBLAST (Altschul y otros, 1991, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402) . En ciertas modalidades, el Gapped BLAST se puede usar como se describe en Altschul y otros, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. El BLAST-2 , WU-BLAST-2 (Altschul y otros, 1996, Methods in Enzymology, 266:460-480); ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California) o Megalign (DNASTAR) son programas de software adicionales disponibles públicamente gue se pueden usar para alinear secuencias. En ciertas modalidades, el por ciento de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina mediante el programa GAP en el software GCG (por ejemplo, usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso del intervalo de 40, 50, 60, 70, ó 90 y un peso del tramo de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6) . En modalidades alternativas determinadas, el programa GAP en el paquete de programas GCG, que incorpora el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)) se puede usar para determinar el por ciento de identidad entre dos secuencias de aminoácidos (por ejemplo, usando ya sea una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso del intervalo de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ó 4 y un peso del tramo de 1, 2, 3, 4, 5) . Por otra parte, en ciertas modalidades, el por ciento de identidad entre secuencias de nucleótidos o aminoácidos se determina mediante el algoritmo de Myers y Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)). Por ejemplo, el por ciento de identidad se puede determinar mediante el programa ALIGN (versión 2.0) y mediante un PAM120 con tabla de residuo, una penalidad en la longitud del intervalo de 12 y una penalidad del intervalo de 4. Los parámetros adecuados para el alineamiento máximo por un programa de alineamiento en particular se pueden determinar por una persona con conocimiento en la técnica. En ciertas modalidades, se usan los parámetros predeterminados del programa de alineamiento. En ciertas modalidades, el porcentaje de identidad "X" de una primera secuencia de aminoácidos en una segunda secuencia de aminoácidos se calcula como 100 x (Y/Z) ; donde Y es el número de residuos de aminoácidos anotados como contrapartes idénticas en el alineamiento de las secuencias primera y segunda (según alineadas mediante inspección visual o un programa de alineamiento de la secuencia en particular) y Z es el número total de los residuos en la segunda secuencia. Si la longitud de una primera secuencia es mayor que la segunda secuencia, el por ciento de identidad de la primera secuencia con la segunda secuencia será mayor que el por ciento de identidad de la segunda secuencia con la primera secuencia.
Como un ejemplo no limitativo, si algún polinucleótido en particular tiene un porcentaje determinado de identidad de secuencia (por ejemplo, siendo al menos 80% idéntico, al menos 85% idéntico, al menos 90% idéntico y, en algunas modalidades, al menos 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idénticos) con una secuencia de referencia se puede, en ciertas modalidades, determinar mediante el programa Bestfit (paquete de análisis de secuencia isconsin, versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park 575 Science Drive, adison, I 53711) . El Bestfit usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482 489 (1981); para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se usa el Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia en particular es, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente invención, los parámetros se ajustan tal que el porcentaje de identidad se calcula sobre la secuencia completa de nucleótidos de referencia completa y que se permitan las brechas en la homología de hasta 5% del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia.
En algunas modalidades, dos ácidos nucleicos o polipéptidos de la invención son sustancialmente idénticos, lo que significa que ellos tienen al menos un 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, y en algunas modalidades al menos el 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de residuos de nucleótidos o de aminoácidos, cuando se compara y se alinea para la correspondencia máxima, cuando se mida mediante un algoritmo de comparación de secuencias o por inspección visual. En ciertas modalidades, la identidad existe sobre una región de las secuencias que es al menos aproximadamente 10, 20, 40-60 residuos de longitud o cualquier valor integral entre estos, o sobre una región más larga que 60 a 80 residuos, al menos aproximadamente 90 -100 residuos, o las secuencias son sustancialmente idénticas sobre las secuencias completas que se comparan, tales como, por ejemplo, la región que codifica para una secuencia de nucleótidos .
Una "sustitución conservativa de aminoácidos " es una en la que un residuo de aminoácido se reemplaza con otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de los residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica, que incluyen las cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) ; las cadenas laterales de ácidos (por ejemplo, el ácido aspártico, ácido glutámico) ; las cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina) ; las cadenas laterales no polares (por ejemplo, la glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) ; las cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y las cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, la tirosina, fenilalanina, triptófano, la histidina) . Por ejemplo, la sustitución de una fenilalanina por una tirosina es una sustitución conservativa. En ciertas modalidades, las sustituciones conservativas en las secuencias de los polipéptidos y anticuerpos de la invención no anulan la unión del polipéptido o anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos, al antigeno (s); es decir, el F0LR1 al que el polipéptido o anticuerpo se une. Los métodos de identificación de las sustituciones conservativas de nucleótidos y de aminoácidos que no eliminan la unión al antigeno son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Brummell y otros, Biochem. 32: 1180-1 187 (1993); Kobayashi y otros Protein Eng. 12 (10) : 879-884 (1999); y Burks y otros Proc. Nati. Acad. Sci . Estados Unidos 94:. 12-417 (1997) ) .
Como se usa en la presente descripción y en las reivindicaciones, la formas singulares "un", "uno", "y", "la" incluyen las formas plurales a menos que el contexto se indique claramente lo contrario.
Se entiende que dondequiera se describan en este documento las modalidades con el lenguaje "que comprende", se proporcionan también las modalidades análogas contrarias descritas en los términos de "consistente de" y/o "que consisten esencialmente de".
El término "y/o" como usa este documento en una frase tal como "A y/o B" pretende incluir ambos "A y B", "A o B", "A" y "B". Del mismo modo, el término "y/o" como se usa en una frase como "A, B, y/o C" pretende incluir cada una de las siguientes modalidades: A, B, y C; A, B, o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).
II. Agentes de unión-FOLRl La presente invención proporciona a los agentes que se unen específicamente a FOLRl humano. Estos agentes se refieren en este documento como "agentes de unión a FOLRl". Las secuencias de aminoácidos (aa) y nucleótidos (nt) de longitud completa de FOLRl son conocidas en la técnica y se proporcionan en este documento como se representa por las sec. con núm. de ident.: 25 y 26, respectivamente.
En ciertas modalidades, los agentes de unión a FOLRl son anticuerpos, inmunoconjugados o polipéptidos . En algunas modalidades, los agentes de unión a FOLRl son anticuerpos humanizados. En ciertas modalidades, los agentes de unión a FOLR-1 son versiones humanizadas del anticuerpo murino Movl9 (variable de una cadena pesada y ligera se muestran como las sec. con núm. de ident. : 17 y 18, respectivamente) .
En ciertas modalidades, los agentes de unión al FOLRl tienen uno o más de los siguientes efectos: inhibe la proliferación de las células tumorales, reduce la tumorigenicidad de un tumor por la reducción de la frecuencia de las células madre de cáncer en el tumor, inhibe el crecimiento tumoral, aumenta la supervivencia, desencadena la muerte celular de las células tumorales, diferencia las células tumorigénicas a un estado no-tumorigénico, o previene la metástasis de las células tumorales.
En ciertas modalidades, los inmunoconjugados u otros agentes que de forma especifica se unen al F0LR1 humano desencadenan la muerte celular a través de un agente citotóxico. Por ejemplo, en ciertas modalidades, un anticuerpo de un anticuerpo F0LR1 humano se conjuga con un maitansinoide que se activa en las células tumorales que expresan el F0LR1 por la internalización de la proteina. En ciertas modalidades alternativas, el agente o el anticuerpo no se conjuga.
En ciertas modalidades, los agentes de unión al F0LR1 son capaces de inhibir el crecimiento tumoral. En ciertas modalidades, los agentes de unión al F0LR1 son capaces de inhibir el crecimiento tumoral in vivo (por ejemplo, en un modelo de xenoinjerto en ratón y/o en un humano que tiene cáncer) . En ciertas modalidades, los agentes de unión al F0LR1 son capaces de inhibir el crecimiento tumoral en un humano .
De este modo, la invención proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento de unión al antigeno del mismo que se une de forma especifica a un receptor 1 de folato humano, donde el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GYFMN (sec. con núm. de ident. : 1) una CDR2 de cadena pesada que comprende RIHPYDGDTFYNQXaa!FXaa2Xaa3 (sec. con núm. de ident.: 56); y una CDR3 de cadena pesada que comprende YDGSRA DY (sec. con núm. de ident.: 3); y (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende ASQSVSFAGTSLMH (sec. con núm. de ident.: 7); una CDR2 de cadena ligera que comprende RASNLEA (sec. con núm. de ident.: 8); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSREYPYT (sec. con núm. de ident.: 9) ; donde Xaai se selecciona de K, Q, H y R; Xaa2 se selecciona de Q, H, N, y R, y Xaa3 se selecciona de G, E, T, S, A y V. En ciertas modalidades, el anticuerpo es el anticuerpo Movl9hu, que es el anticuerpo descrito anteriormente que comprende el CDR2 RIHPYDGDTFYNQKFQG (sec. con núm. de ident.: 2) de cadena pesada .
En ciertas modalidades, la invención proporciona anticuerpos humanizados o fragmentos de unión al antigeno que de forma especifica se unen al FOLRl que comprende las CDR de Movl9hu con hasta cuatro (es decir, 0, 1, 2, 3, ó 4) sustituciones conservativas de aminoácidos por CDR. De este modo, en ciertas modalidades la invención proporciona anticuerpos humanizados o fragmentos de unión al antigeno que se unen de forma especifica a un receptor 1 de folato humano, donde el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GYFMN sec. con núm. de ident. :1), o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; una CDR2 de cadena pesada que comprende RIHPYDGDTFYNQKFQG (sec. con núm. de ident . : 2), o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; y una CDR3 de cadena pesada que comprende YDGSRAMDY (sec. con núm. de ident.: 3), o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos y/o (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende KASQSVSFAGTSLMH (sec. con núm. de ident.: 7), o un variante de éste que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; una CDR2 de cadena ligera que comprende RASNLEA (sec. con núm. de ident.: 8) , o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSREYPYT (sec. con núm. de ident.: 9), o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos.
La invención proporciona también un anticuerpo humanizado (FRl-21hu) o un fragmento de unión al antigeno del mismo que se une de forma especifica a un receptor 1 de folato humano, donde el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende SSYGMS (sec. con núm. de ident.: 30); una CDR2 de cadena pesada que comprende TISSGGSYTY (sec. con núm. de ident. :31); y una CDR3 de cadena pesada que comprende DGEGGLYAMDY (sec. con núm. de ident.: 32); y/o (b) una CDRl de cadena ligera que comprende KASDHINNWLA (sec. con núm. de ident. :27); una CDR2 de cadena ligera que comprende GATSLET (sec. con núm. de ident.: 28); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQYWSTPFT (sec. con núm. de ident . : 29) .
En ciertas modalidades, la invención proporciona anticuerpos humanizados o fragmentos de unión al antigeno que se unen de forma especifica al FOLRl que comprende las CDR de FRl-21hu con hasta cuatro (es decir, 0, 1, 2, 3, ó 4) sustituciones conservativas de aminoácidos por CDR. De este modo, en ciertas modalidades, la invención proporciona anticuerpos humanizados o fragmentos de unión al antigeno que se unen de forma especifica un receptor lde folato humano, donde el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende SSYGMS (sec. con núm. de ident: 30) o una variante de ésta que comprende 1 , 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; y/o una CDR2 de cadena pesada que comprende TISSGGSYTY (sec. con núm. de ident: 31) o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; y/o una CDR3 de la cadena pesada que comprende DGEGGLYAMDY (sec. con núm. de ident: 32) o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; y/o (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende KASDHINNWLA (sec. con núm. de ident: 27) o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; y/o una CDR2 de cadena ligera que comprende GATSLET (sec. con núm. de ident: 28) o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; y/o una CDR3 de cadena ligera que comprende QQY STPFT (sec. con núm. de ident: 29) o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos.
En ciertas modalidades, la invención proporciona anticuerpos humanizados o fragmentos de unión al antigeno que se unen de forma especifica al FOLRl que comprende las CDR de FRl-48hu con hasta cuatro (es decir, 0, 1, 2, 3, ó 4) sustituciones conservativas de aminoácidos por CDR. De este modo, en ciertas modalidades, la invención proporciona anticuerpos humanizados o fragmentos de unión al antigeno que se unen de forma especifica un receptor 1 de folato humano, donde el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende TNYW Q (sec. con núm. de ident: 60) o una variante de ésta que comprende 1 , 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; y/o una CDR2 de cadena pesada que comprende IYPGNGDSR (sec. con núm. de ident: 61) o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; y/o una CDR3 de cadena pesada que comprende RDGNYAAY (sec. con núm. de ident: 62) o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; y/o (b) una CDRl de cadena ligera que comprende RASENIYSNLA (sec. con núm. de ident: 57) o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; y/o una CDR2 de cadena ligera que comprende AATNLAD (sec. con núm. de ident: 58) o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; y/o una CDR3 de cadena ligera que comprende QHFWASPYT (sec. con núm. de ident: 59) o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos.
En ciertas modalidades, la invención proporciona anticuerpos humanizados o fragmentos de unión al antigeno que se unen de forma especifica al FOLRl que comprende las CDR de FRl-49hu con hasta cuatro (es decir, 0, 1, 2, 3, ó 4) sustituciones conservativas de aminoácidos por CDR. De este modo, en ciertas modalidades, la invención proporciona anticuerpos humanizados o fragmentos de unión al antigeno que se unen de forma especifica a un receptor 1 de folato humano, donde el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende CDR1 TNYWMY (sec. con núm. de ident: 66) o una variante de ésta que comprende 1 , 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos, y/o una CDR2 de cadena pesada que comprende AIYPGNSDTT (sec. con núm. de ident: 67) o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos y/o una CDR3 de cadena pesada que comprende RHDYGAMDY (sec. con núm. de ident: 68) o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos, y/o (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende RASENIYTNLA (sec. con núm. de ident : 63) o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos, y/o una CDR2 de cadena ligera que comprende TASNLAD (sec. con núm. de ident: 64) o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos y/o una CDR3 de cadena ligera que comprende QHF VSPYT (sec. con núm. de ident: 65) o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos.
En ciertas modalidades, la invención proporciona anticuerpos humanizados o fragmentos de unión aL antigeno que se unen de forma especifica al FOLRl que comprende las CDR de FRl-57hu con hasta cuatro (es decir, 0, 1, 2, 3, ó 4) sustituciones conservativas de aminoácidos por CDR. De este modo, en ciertas modalidades, la invención proporciona anticuerpos humanizados o fragmentos de unión al antigeno que se unen de forma especifica a un receptor 1 de folato humano, donde el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende SSFGMH (sec. con núm. de ident: 72) o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; y/o una CDR2 de cadena pesada que comprende YISSGSSTIS (sec. con núm. de ident: 73) o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; y/o una CDR3 de cadena pesada que comprende EAYGSSMEY (sec. con núm. de ident: 74) o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; y/o (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende RASQNINNNLH (sec. con núm. de ident: 69) o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; y/o una CDR2 de cadena ligera que comprende YVSQSVS (sec. con núm. de ident: 70) o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; y/o una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSNS PHYT (sec. con núm. de ident: 71) o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos.
En ciertas modalidades, la invención proporciona anticuerpos humanizados o fragmentos de unión al antigeno que se unen de forma especifica al FOLRl que comprende las CDR de FRl-65hu con hasta cuatro (es decir, 0, 1, 2, 3, ó 4) sustituciones conservativas de aminoácidos por CDR. De este modo, en ciertas modalidades, la invención proporciona anticuerpos humanizados o fragmentos de unión al antigeno que se unen de forma especifica a un receptor 1 de folato humano, donde el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende TSYTMH (sec. con núm. de ident: 78) o una variante de ésta que comprende 1 , 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; y/o una CDR2 de cadena pesada que comprende YINPISGYTN (sec. con núm. de ident: 79) o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; y/o una CDR3 de cadena pesada que comprende GGAYGRKPMDY (sec. con núm. de ident: 80) o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; y/o (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende KASQNVGPNVA (sec. con núm. de ident: 75) o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, o 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; y/o una CDR2 de cadena ligera que comprende SASYRYS (sec. con núm. de ident: 76) o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; y/o una CDR3 de cadena ligera que comprende QQYNSYPYT (sec. con núm. de ident: 77) o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos.
Los polipéptidos que comprenden una de las cadenas ligeras o cadenas pesadas individuales descritas en este documento, asi como los polipéptidos (por ejemplo, anticuerpos) que comprenden tanto una cadena ligera como una cadena pesada se proporcionan también. Los polipéptidos de las sec. con núm. de ident: 4 y 6 comprenden el dominio variable de una cadena pesada de Movl9hu, y una cadena pesada de Movl9hu, respectivamente. Los polipéptidos de sec. con núm. de ident: 10-13 comprenden la versión 1.00 del dominio variable de cadena ligera, la versión 1.60 del dominio variable de cadena ligera, la versión 1.00 de cadena ligera y la versión 1.60 de cadena ligera de Movl9hu, respectivamente.
Los polipéptidos de las sec. con núm. de ident : 42 y 46 comprenden el dominio variable de una cadena pesada de FR1-21hu, y una cadena pesada de FRl-21hu, respectivamente. Los polipéptidos de las sec. con núm. de ident: 41 y 45 comprenden el dominio variable de cadena ligera y una cadena ligera de FRl-21hur respectivamente. Los polipéptidos de las sec. con núm. de ident: 97 y 113 comprenden el dominio variable de una cadena pesada de FRl-48hu, y una cadena pesada de FRl-48hu, respectivamente. Los polipéptidos de las sec. con núm. de ident: 96 y 112 comprenden el dominio variable de una cadena ligera y una cadena ligera de FR1-48hu, respectivamente. Los polipéptidos de las sec. con núm. de ident: 99 y 115 comprenden el dominio variable de una cadena pesada de FRl-49hu, y una cadena pesada de FRl-49hu, respectivamente. Los polipéptidos de las sec. con núm. de ident: 98 y 114 comprenden el dominio variable de una cadena ligera y una cadena ligera de FRl-49hu, respectivamente. Los polipéptidos de las sec. con núm. de ident: 101 y 117 comprenden el dominio variable de una cadena pesada de FR1-57hu, y una cadena pesada de FRl-57hu, respectivamente. Los polipéptidos de las sec. con núm. de ident: 100 y 116 comprenden el dominio variable de una cadena ligera y una cadena ligera de FRl-57hu, respectivamente. Los polipéptidos de las sec. con núm. de ident: 103 y 119 comprenden el dominio variable de una cadena pesada de FRl-65hu, y una cadena pesada de FRl-65hu, respectivamente. Los polipéptidos de las sec. con núm. de ident: 102 y 118 comprenden el dominio variable de una cadena ligera y una cadena ligera de FRl-65hu, respectivamente.
Se proporcionan también los polipéptidos que comprenden: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia con las sec. con núm. de ident: 4 ó 6; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia con las sec. con núm. de ident: 10-13. Se proporcionan también los polipéptidos que comprenden: (a) un polipéptido que tiene aproximadamente 90% de identidad de la secuencia con las sec. con núm. de ident: 42 ó 46; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia con las sec. con núm. de ident: 41 y 45. Se proporcionan también los polipéptidos que comprenden: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia con las sec. con núm. de ident: 97 ó 113; y o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia con las sec. con núm. de ident: 96 ó 112. Se proporcionan también los polipéptidos que comprenden: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia con las sec. con núm. de ident: 99 ó 115; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia con las sec. con núm. de ident: 98 ó 114. Se proporcionan también los polipéptidos que comprenden: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia con las sec. con núm. de ident: 101 ó 117; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de la identidad de secuencia con las sec. con núm. de ident: 100 ó 116. Se proporcionan también los polipéptidos que comprenden: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia con las sec. con núm. de ident: 103 ó 119 y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia con las sec. con núm. de ident: 102 ó 118. En ciertas modalidades, el polipéptido comprende un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% de la identidad de la secuencia con las sec. con núm. de ident: 6, 4, 10-13, 41, 42, 45 ó 46. De este modo, en ciertas modalidades, el polipéptido comprende (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia con las sec. con núm. de ident: 4 ó 6, y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia con las sec. con núm. de ident: 10-13. En ciertas modalidades, el polipéptido comprende (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia con las sec. con núm. de ident: 42 ó 46, y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia con las sec. con núm. de ident : 41 ó 45. Se proporcionan también los polipéptidos que comprenden: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia con las sec. con núm. de ident: 97 ó 113 y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia con las sec. con núm. de ident: 96 ó 112. Se proporcionan también los polipéptidos que comprenden: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia con las sec. con núm. de ident: 99 ó 115; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia con las sec. con núm. de ident: 98 ó 114. Se proporcionan también los polipéptidos que comprenden: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia con las sec. con núm. de ident: 101 ó 117; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95 % de la identidad de la secuencia con las sec. con núm. de ident: 100 ó 116. Se proporcionan también los polipéptidos que comprenden: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia con las sec. con núm. de ident: 103 ó 119; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia con las sec. con núm. de ident: 102 ó 118. En ciertas modalidades, el polipéptido comprende (a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident: 4; y/o (b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident: 10 o sec. con núm. de ident: 11. En ciertas modalidades, el polipéptido comprende (a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de la sec. con núm. de ident: 45; y/o (b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de la sec. con núm. de ident: 46. En ciertas modalidades, el polipéptido comprende (a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident: 6; y/ o (b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident: 12 o sec. con núm. de ident: 13. En ciertas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo y/o el polipéptido se une de forma especifica al receptor 1 de folato humano. En ciertas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo humanizado que se une de forma especifica al receptor 1 de folato humano. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo o anticuerpo humanizado que se une de forma especifica a un FOLR1 humano que comprende (a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácido de la sec. con núm. de ident: 4; y (b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident: 10 o sec. con núm. de ident: 11. En ciertas modalidades del polipéptido que comprende la sec. con núm. de ident: 4 es una región variable de cadena pesada.
En ciertas modalidades, el polipéptido que comprende las sec. con núm. de ident: 10 ó 11 es una región variable de cadena ligera. La invención también proporciona un anticuerpo o anticuerpo humanizado que se une de forma especifica a un FOLRl humano que comprende (a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident: 6; y (b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de las sec. con núm. de ident: 12 ó sec. con núm. de ident: 13. La invención también proporciona un anticuerpo o anticuerpo humanizado que se une de forma especifica a un FOLRl humano que comprende (a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident: 45, y (b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident: 46. La invención proporciona también un anticuerpo o anticuerpo humanizado que se une de forma específica a un FOLRl humano que comprende (a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident: 112; y (b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident: 113. La invención proporciona también un anticuerpo o anticuerpo humanizado que se une de forma específica a un FOLRl humano que comprende (a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident: 114; y (b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident: 115. La invención proporciona también un anticuerpo o anticuerpo humanizado que se une de forma especifica a un F0LR1 humano que comprende (a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident: 116; y (b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident: 117. La invención proporciona también un anticuerpo o anticuerpo humanizado que se une de forma especifica a un F0LR1 humano que comprende (a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident: 118; y (b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident: 119. En ciertas modalidades, el polipéptido que tiene un cierto porcentaje de la identidad de la secuencia con las sec. con núm. de ident: 4, 6, 10-13, 41, 42, 45, 46, 96-103 y 112-119 difiere de las sec. con núm. de ident: 4, 6 , 10-13, 41, 42, 45, 46, 96-103 y 112-119 por sólo sustituciones conservativas de aminoácidos .
En ciertas modalidades, el agente de unión al FOLR1 comprende, consiste en esencia de, o consiste de un anticuerpo anti-FOLRl seleccionado del grupo consistente de los anticuerpos Movl9hu, FR-1-21, FR1-48, FR1-49, FR1-57, y FR1-65.
En ciertas modalidades, el anticuerpo Movl9hu se codifica por los plásmidos depositados en la Colección Americana de Cultivos Tipos (ATCC) el 7 de abril de 2010 y que tienen los números de depósito de la ATCC PTA-10772 y PTA-10773 ó 10774.
En ciertas modalidades, el anticuerpo FR-1-21 se codifica por los plásmidos de la ATCC depositados el 7 de abril de 2010, y se asignan los números de denominación del depósito PTA-10775 y 10776.
En ciertas modalidades, los anticuerpos humanizados se unen a FOLR1 sustancialmente con la misma afinidad como el anticuerpo quimérico Movl9. La afinidad o avidez de un anticuerpo por un antigeno se puede determinar de forma experimental mediante cualquier método adecuado bien conocido en la técnica, por ejemplo, la citometria de flujo, ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzimas (ELISA) , o radioinmunoensayo (RIA) , o cinéticas (por ejemplo, el análisis BIACORE ™) . Los ensayos de unión directa, asi como los formatos de ensayo de unión competitiva se pueden emplear fácilmente. (Véase, por ejemplo, Berzofsky, y otros, "Antibody-Antigen Interactions" , en Fundamental Immunology, Paul, W. E . , Ed., Raven Press: Nueva York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: Nueva York, N.Y. (1992); y los métodos descritos en este documento. La afinidad medida de una interacción particular antigeno-anticuerpo puede variar si se mide bajo condiciones diferentes (por ejemplo, concentración de sal, pH, temperatura) . De este modo, las mediciones de la afinidad y otros parámetros de unión al antigeno (por ejemplo, KD o Kd, Kon 0ff) se preparan con las soluciones estandarizadas de anticuerpo y antigeno, y un amortiguador estandarizado, como se conoce en la técnica y tal como el amortiguador se describe en este documento.
En un aspecto, los ensayos de unión se pueden realizar mediante la citometria de flujo en las células que expresan el antigeno F0LR1 en la superficie. Por ejemplo, las células positivas para F0LR1 tal como SK0V3 se incubaron con concentraciones distintas de anticuerpos anti-FOLRl usando 1 xl05 células por muestra en ???µ? de amortiguador FACS (medio RPMI-1640 suplementado con 2% de suero normal de carnero) . Después, las células se sedimentaron, se lavaron, y se incubaron durante 1 h con 100 µ? de anti ratón en carnero conjugado con FITC o el anticuerpo anti-IgG humana en carnero (tal como se obtiene de, por ejemplo, el Laboratorio Jackson, 6 µq/ml en amortiguador FACS) . Las células se sedimentaron nuevamente, se lavaron con amortiguador FACS y resuspendieron en 200 µ? de PBS con formaldehido al 1%. Las muestras se adquirieron, por ejemplo, mediante un citómetro de flujo FACSCalibur con el dispensador multipocillo HTS y se analizaron mediante CellQuest Pro (todos de BD Biosciences, San Diego, EE.UU.). Para cada muestra, la intensidad media de fluorescencia para FL1 ( FI) se exportó y representó contra la concentración de anticuerpo en una representación semi-log para generar una curva de unión. Una curva sigmoidal dosis- respuesta se ajustó para las curvas de unión y los valores EC50 se calculan usando los programas tales como GraphPad Prism v4 con los parámetros predeterminados (software GraphPad, San Diego, CA) . Los valores de EC50 se pueden usar como una medida para la constante de disociación aparente "Kd" o "KD" para cada anticuerpo.
Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante métodos del hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495. Mediante el método del hibridoma, un ratón, hámster, u otro animal huésped apropiado, se inmuniza como se describió anteriormente para inducir la producción de anticuerpos por los linfocitos que se podrán unir de forma especifica a un antigeno inmunizante. Los linfocitos también se pueden inmunizar in vitro. A continuación de la inmunización, los linfocitos se aislan y se funden con una linea celular de mieloma adecuada usando, por ejemplo, del polietilenglicol, para formar células de hibridoma que se pueden seleccionar después de los linfocitos y las células de mieloma no fusionadas. Los hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales dirigidos de forma especifica contra un antigeno seleccionado según se determina por inmunoprecipitación, inmunotransferencia, o por un ensayo de unión in vitro (por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA) ; ensayo de inmunoabsorción enlazado a enzimas (ELISA) ) , se pueden propagar después ya sea en cultivo in vitro mediante métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, 1986) o en vivo como tumores de ascitis en un animal. Los anticuerpos monoclonales se pueden purificar después del medio de cultivo o del liquido ascitico como se describe anteriormente para los anticuerpos policlonales .
Por otra parte los anticuerpos monoclonales también se pueden preparar mediante los métodos de ADN recombinante como se describe en la patente de EE.UU. 4, 81,6,567. Los polinucleótidos que codifican un anticuerpo monoclonal se aislan de las células B maduras o de células de hibridoma, tal como por RT-PCR usando de forma especifica los cebadores de oligonucleótidos que amplifican de forma especifica los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo, y su secuencia se determina mediante los procedimientos convencionales. Los polinucleótidos aislados que codifican las cadenas pesadas y ligeras se clonan después en vectores de expresión adecuados, los cuales, cuando se transfectan en las células huésped, tales como células de E. coli, células COS de simios, células de ovario de hámster chino (CHO) , o células de mieloma que de otra manera no producen proteina inmunoglobulina los anticuerpos monoclonales se generan por las células huésped. También, los anticuerpos monoclonales recombinantes o fragmentos de éstos de las especies convenientes se pueden aislar de las genotecas de exposición en fagos que expresan las CDR de la especies convenientes como se describe (McCafferty y otros, 1990, Nature, 348:552-554; Clackson y otros, 1991, Nature, 352:624-628;. y Marks y otros, 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597) .
El polinucleótido (s) que codifica un anticuerpo monoclonal se puede modificar, además, en un número de diferentes maneras mediante la tecnología del ADN recombinante para generar anticuerpos alternativos. En algunas modalidades, los dominios constantes de las cadenas ligera y pesada de, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de ratón se puede sustituir 1) por aquellas regiones de, por ejemplo, un anticuerpo humano para generar un anticuerpo quimérico o 2) por un polipéptido no-inmunoglobulina para generar un anticuerpo de fusión. En algunas modalidades, las regiones constantes se truncan o se eliminan para generar el fragmento de anticuerpo conveniente de un anticuerpo monoclonal. La mutagénesis de sitio dirigida o de alta densidad de la región variable se puede usar para optimizar la especificidad, la afinidad, etc. de un anticuerpo monoclonal .
En algunas modalidades, el anticuerpo monoclonal contra el FOLR1 humano es un anticuerpo humanizado. En ciertas modalidades, tales anticuerpos se usan de forma terapéutica para reducir la antigenicidad y las respuestas HAMA (anticuerpo humano antiratón) cuando se administra a un sujeto humano.
Los métodos para modificar, humanizar o revestir los anticuerpos no humanos o humanos se pueden usar también y son bien conocidos en la técnica. Un anticuerpo humanizado, revestido o de manera similar modificado puede tener uno o más residuos de aminoácido de una fuente que no es humana, por ejemplo, pero no se limita a ratón, rata, conejo, primate no humano u otro mamífero. Estos residuos de aminoácidos no-humano se reemplazan por los residuos que se refieren a menudo como residuos de "importación", que se toman normalmente de un dominio variable "importación", constante u otro de una secuencia humana conocida.
Tales secuencias importadas se pueden usar para reducir la inmunogenicidad o reducir, mejorar o modificar la unión, afinidad, en la tasa, fuera de la tasa, la avidez, la especificidad, la vida media, o cualquier otra característica adecuada, como se conoce en la técnica. En general, los residuos de CDR están directamente y más sustancialmente involucrados en influenciar la unión al F0LR1. Por consiguiente, parte o la totalidad de las secuencias de CDR no humanas o humanas se mantienen mientras que las secuencias no-humanas de las regiones variable y constante se pueden reemplazar con aminoácidos humanos u otros.
Los anticuerpos opcionalmente se pueden humanizar, revestir, modificar o también los anticuerpos humanos se modifican con la retención de alta afinidad para el antigeno F0LR1 y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, se pueden preparar anticuerpos anti-FOLRl humanizados (o humano) o modificados y anticuerpos revestidos por un proceso opcional de análisis de las secuencias parentales y varios productos conceptuales, humanizados y modificados usando modelos tridimensionales de las secuencias parentales, modificadas, y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina están comúnmente disponibles y son familiares para aquellas personas con conocimiento en la técnica. Los programas de computación que ilustran y muestran las probables estructuras de conformación tridimensional de las secuencias seleccionadas de la inmunoglobulina candidato están disponibles. La inspección de estas muestras permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de la inmunoglobulina candidato, es decir, el análisis de los residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidato para unir su antigeno, tal como FOLRl . De esta manera, los residuos del marco (FR) se pueden seleccionar y combinar de las secuencias importadas y de consenso de modo que se logre la característica conveniente del anticuerpo, tal como la afinidad aumentada para el antígeno(s) objetivo.
La humanización, el revestimiento o la modificación de los anticuerpos de la presente invención se pueden realizar usando cualquier método conocido, tales como pero sin limitarse a aquellos descritos en, Winter (Jones y. otros, Nature 321:522 (1986); Riechmann y otros, Nature 332:323 (1988); Verhoeyen y otros, Science 239:1534 (1988)), Sims y otros, J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Cárter y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos. 89:4285 (1992); Presta y otros, J. Immunol. 151:2623 (1993), Patente de EE.UU. con núms . 5, 639, 641; 5,723,323; 5,976,862; 5,824,514; 5,817,483; 5,814,476; 5,763,192; 5,723,323; 5,766,886; 5,714,352; 6,204,023; 6,180,370; 5,693,762; 5,530,101; 5,585,089; 5,225,539; 4,816,567; PCT/: US98/16280; US96/18978; US91/09630; US91/05939; US94/01234; GB89/01334; GB91/01134; GB92/01755; WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; EP 229246; 7,557,189; 7,538,195; y 7,342,110, cada uno de los cuales se incorpora a este documento en su totalidad como referencia, que incluyen las referencias aquí citadas.
En ciertas modalidades alternativas, el anticuerpo para FOLR1 es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos se pueden preparar de forma directa mediante distintas técnicas conocidas en la técnica. Los linfocitos B humanos inmortalizados que se inmunizan in vitro o se aislan de un individuo inmunizado que produce un anticuerpo dirigido contra un antigeno objetivo se pueden generar (Véase, por ejemplo, Colé y otros, Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer y otros, 1991, J. Immunol, 147 (1) : 86-95; y la patente de EE.UU. 5,750,373). También, el anticuerpo humano se puede seleccionar de una genoteca de fagos, donde esa genoteca de fagos expresa anticuerpos humanos, tal como se describe, por ejemplo, en Vaughan y otros, 1996, Nat . Biotech., 14:309-314, Sheets y otros, 1998, Proc. Nati. Acad. Sci . , 95:6157-6162, Hoogenboom y Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381, y Marks y otros, 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Las técnicas para la generación y uso de las genotecas de anticuerpos en fagos se describen también en las patentes de EE.UU. núms . 5,969,108; 6,172,197; 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915; 6,593,081; 6,300,064; 6,653,068; 6,706,484; y 7,264, 963; y Rothe y otros, 2007, J. Mol. Bio., doi : 10.1016/j . jmb .2007.12.018 (los que se incorporan en su totalidad como referencia) . Las estrategias para la maduración de la afinidad y las estrategias de intercambio de cadena (Marks y otros, 1992, Bio/Technology 10:779-783, incorporado en su totalidad como referencia) son conocidas en la técnica y se pueden emplear para generar anticuerpos humanos de alta afinidad.
Los anticuerpos humanizados se pueden también preparar en ratones transgénicos que contienen los loci de inmunoglobulina humana que son capaces de producir en la inmunización todo el repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de la producción de inmunoglobulina endógena. Este enfoque se describe en las patentes de EE.UU. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; y 5,661,016.
Esta invención también incluye a los anticuerpos biespecificos que reconocen de forma especifica un receptor 1 de folato humano. Los anticuerpos biespecificos son anticuerpos que son capaces de reconocer de forma especifica y unir al menos dos epitopos diferentes. Los epitopos diferentes pueden estar ya sea dentro de la misma molécula (por ejemplo, el mismo receptor 1 de folato humano) o en moléculas diferentes tal que, por ejemplo, ambos anticuerpos puedan específicamente reconocer y unir un receptor 1 de folato humano, asi como, por ejemplo, 1) una molécula efectora de un leucocito, tal como un receptor de células T (por ejemplo CD3) o el receptor Fe (por ejemplo, CD64, CD32, o CD16) o 2) un agente citotóxico como se describe en detalle a continuación.
Los anticuerpos biespecificos ilustrativos se pueden unir a dos epitopos diferentes, al menos uno de estos se origina en un polipéptido de la invención. Por otra parte, un brazo antiantigénico de una molécula de inmunoglobulina se puede combinar con un brazo que se una a una molécula de activación de un leucocito tal como una molécula del receptor de células T (por ejemplo, CD2, CD3, CD28, o B7 ) , o los receptores Fe para la IgG de manera de concentrar los mecanismos celulares de defensa a la célula que expresa el antígeno particular. Los anticuerpos bispecificos también se pueden usar para dirigir los agentes citotóxicos a las células que expresan un antigeno en particular. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión al antigeno y un brazo que se une un agente citotóxico o un radionúclido quelante, tal como EOTUBE, DTPA, DOTA, o TETA. Las técnicas para preparar los anticuerpos biespecificos son comunes en la técnica (Millstein y otros, 1983, Nature 305:537-539; Brennan y otros, 1985, Science 229:81; Suresh y otros, 1986, Methods in Enzymol. 121:120; Traunecker y otros, 1991, EMBO J. 10:3655-3659; Shalaby y otros, 1992, J. Exp. Med. 175:217-225; Kostelny y otros, 1992, J. Immunol . 148:1547-1553; Gruber y otros, 1994, J. Immunol. 152:5368; y la patente de EE.UU. 5,731,168). Los anticuerpos con más de dos valencias también se contemplan. Por ejemplo, se pueden preparar los anticuerpos triespecificos (Tutt y otros, J. Immunol. 147:60 (1991)). De este modo, En ciertas modalidades los anticuerpos para FOLR1 son multiespecificos .
En ciertas modalidades se proporcionan un fragmento de anticuerpo para, por ejemplo, aumentar la penetración al tumor. Distintas técnicas son conocidas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se obtienen a través de la digestión proteolitica de los anticuerpos intactos (por ejemplo, Morimoto y otros, 1993, Journal of Biochemical y Biophysical Methods 24:107-117; Brennan y otros, 1985, Science, 229:81). En ciertas modalidades, los fragmentos de anticuerpos se producen por recombinación. Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv, y scFv se pueden expresar y secretar a partir de células de E. coli o de otras células huésped, de este modo se permite la producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Tales fragmentos de anticuerpos se pueden también aislar de las genotecas de anticuerpos en fagos discutidas anteriormente. El fragmento de anticuerpo puede ser también de los anticuerpos lineales como se describe en la patente de EE.UU. 5,641,870, por ejemplo, y puede ser monoespecifico o biespecifico . Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para el profesional con experiencia .
De acuerdo con la presente invención, las técnicas se pueden adaptar para la producción de anticuerpos de simple cadena específicos para el receptor 1 de folato humano (véase la patente de EE.UU. núm. 4,946,778). Además, los métodos se pueden adaptar para la construcción de genotecas de expresión de Fab (Huse, y otros, Science 246:1275-1281 (1989)) para permitir la identificación rápida y eficaz de los fragmentos Fab del monoclonal con la especificidad conveniente para un receptor 1 de folato, o derivados, fragmentos, análogos u homólogos de éstos. Los fragmentos de los anticuerpos se pueden producir por los métodos en la técnica que incluyen pero no se limitan a: (a) un fragmento F(ab')2 producido por la digestión de la pepsina de una molécula de anticuerpo; (b) un fragmento Fab generado por la reducción de los puentes disulfuro de un fragmento F(ab') 2, (c) un fragmento Fab generado por el tratamiento de la molécula de anticuerpo con papaina y un agente reductor, y (d) fragmentos Fv.
Esto puede ser conveniente, además, especialmente en el caso de los fragmentos de anticuerpos, para modificar un anticuerpo a fin de aumentar su vida media en el suero. Esto se puede lograr, por ejemplo, por la incorporación de un epítopo de unión del receptor de salvamento en el fragmento de anticuerpo por la mutación de la región apropiada en el fragmento de anticuerpo o por la incorporación del epitopo en una etiqueta del péptido que se fusiona después con el fragmento de anticuerpo en cada extremo o en el medio (por ejemplo, por síntesis de ADN o péptidos) .
Los anticuerpos heteroconjugados están también dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados se componen de dos anticuerpos unidos de manera covalente. Tales anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir las células inmunes a las células no deseadas (patente de EE.UU. núm 4,676,980). Se contempla que los anticuerpos se pueden preparar in vitro mediante métodos conocidos en la química de proteínas sintéticas, que incluyen aquellos que involucran los agentes de reticulación. Por ejemplo, las inmunotoxinas se pueden construir mediante una reacción de intercambio de disulfuro o por la formación de un enlace tioéter. Los ejemplos de los reactivos adecuados para este propósito incluyen el iminotiolato y el metil-4-mercaptobutirimidato .
Para los propósitos de la presente invención, se apreciará que los anticuerpos modificados pueden comprender cualquier tipo de región variable que se proporcione para la asociación del anticuerpo con los polipéptidos de un F0LR1 humano. En este sentido, la región variable puede comprender o se puede derivar de cualquier tipo de mamífero que se pueda inducir para acumular una respuesta humoral y generar las inmunoglobulinas contra el antígeno conveniente asociado al tumor. Como tal, la región variable de los anticuerpos modificados puede ser, por ejemplo, de origen humano, murino, primates no humanos (por ejemplo, monos cynomolgus, macacos, etc) o lupino. En algunas modalidades, tanto las regiones variables como las constantes de las inmunoglobulinas modificadas son humanas. En otras modalidades las regiones variables de los anticuerpos compatibles (por lo general derivado de una fuente no humana) se pueden modificar o adaptar de forma específica para mejorar las propiedades de unión o reducir la inmunogenicidad de la molécula. Con respecto a esto, las regiones variables útiles en la presente invención se pueden humanizar o de lo contrario alterar a través de la inclusión de secuencias importadas de aminoácidos .
En ciertas modalidades, los dominios variables, tanto en las cadenas pesadas como ligeras se alteran al menos por la sustitución parcial de una o más de las CDR y, si es necesario, por la sustitución parcial de la región marco y cambio de la secuencia. Aunque las CDR se pueden derivar de un anticuerpo de la misma clase o incluso subclase del anticuerpo de la cual las regiones marco se derivan, se prevé que las CDR se podrán derivar de un anticuerpo de clase diferente y, en ciertas modalidades de un anticuerpo de una especie diferente. Puede que no sea necesario sustituir todas las CDR con las CDR completas de la región variable del donante para transferir la capacidad de unión al antigeno de un dominio variable a otro. Más bien, sólo sería necesario transferir aquellos residuos que son necesarios para mantener la actividad del sitio de unión al antígeno. Teniendo en cuenta las explicaciones establecidas en las patentes de EE.UU. núms. 5,585,089, 5,693,761 y 5,693,762, estará bien dentro de la competencia de las personas con conocimiento en la técnica, ya sea realizar la experimentación de rutina como obtener por ensayo y error de las pruebas un anticuerpo funcional con la inmunogenicidad reducida.
A pesar de las alteraciones de la región variable, las personas con conocimientos en la técnica apreciarán que los anticuerpos modificados de esta invención podrán comprender los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos de longitud completa o los fragmentos inmunorreactivos de éstos) en el que al menos una fracción de uno o más de los dominios de la región constante se ha eliminado o por el contrario alterado para proporcionar las características bioquímicas convenientes tal como la localización aumentada del tumor o para reducir la vida media en el suero cuando se compara con un anticuerpo de aproximadamente la misma inmunogenicidad que comprende una región constante nativa o sin alteración. En algunas modalidades, la región constante de los anticuerpos modificados podrá comprender una región constante humana. Las modificaciones de la región constante compatible con esta invención comprenden las adiciones, eliminaciones o sustituciones de uno o más aminoácidos en uno o más dominios. Es decir, los anticuerpos modificados descritos en este documento pueden comprender las alteraciones o modificaciones en uno o más de los tres dominios constantes de cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) y/o en el dominio constante de cadena ligera (CL) . En algunas modalidades, se contemplan las regiones constantes modificadas donde uno o más dominios son parcial o totalmente eliminados. En algunas modalidades, los anticuerpos modificados podrán comprender las construcciones de dominio eliminados o variantes donde el dominio CH2 completo se ha eliminado (construcciones ACH2) . En algunas modalidades, el dominio omitido de la región constante se reemplazará por un espaciador corto de aminoácido (por ejemplo, 10 residuos) que proporciona algo de la flexibilidad molecular que se da normalmente por la región constante ausente .
Además de su configuración, se conoce en la técnica que la región constante media varias funciones efectoras. Por ejemplo, la unión del componente Cl del complemento a los anticuerpos activa el sistema del complemento. La activación del complemento es importante en la opsonización y la lisis de los patógenos celulares. La activación del complemento también estimula la respuesta inflamatoria y se puede involucrar también en la hipersensibilidad autoinmune. Además, los anticuerpos se unen a las células a través de la región Fe, con un sitio receptor Fe en la región Fe de anticuerpo que se une a un receptor Fe (FcR) en una célula. Existe un número de receptores Fe que son específicos para las diferentes clases de anticuerpos, que incluyen IgG (receptores gamma) , IgE (receptores eta) , IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu) . La unión de los anticuerpos a los receptores Fe en la superficie celular desencadena un número de importantes y diversas respuestas biológicas que incluyen el englobamiento y la destrucción de las partículas recubiertas con anticuerpos, la eliminación de los complejos inmunes, la lisis de las células objetivos recubiertas con anticuerpos por las células citoliticas (denominada citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos, o ADCC) , la liberación de mediadores inflamatorios, la transferencia a la placenta y el control de la producción de inmunoglobulinas .
En ciertas modalidades, los anticuerpos de unión al F0LR1 proporcionan funciones efectoras alteradas que, a su vez, afectan el perfil biológico del anticuerpo administrado. Por ejemplo, la eliminación o inactivación (a través de mutaciones puntuales u otro método) de un dominio de la región constante puede reducir la unión del receptor Fe de los anticuerpos modificados circulantes aumentando de este modo la localización del tumor. En otros casos, podría ser que las modificaciones de la región constante, consistentes con esta invención, moderen la unión del complemento y de este modo reduzcan la vida, sin embargo, otras modificaciones de la región constante se pueden usar para eliminar los enlaces disulfuro o las porciones de oligosacáridos que permiten se mejore la localización debido al aumento de la especificidad del antígeno o la flexibilidad del anticuerpo. Del mismo modo, las modificaciones de la región constante de acuerdo con esta invención se pueden preparar fácilmente mediante técnicas de ingeniería molecular o bioquímicas bien conocidas dentro del ámbito de la persona con conocimiento en la técnica.
En ciertas modalidades, un agente de unión al F0LR1 que es un anticuerpo no tiene una o más funciones efectoras. Por ejemplo, en algunas modalidades, el anticuerpo no tiene actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o no tiene actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) . En ciertas modalidades, el anticuerpo no se une a un receptor Fe y/o a factores del complemento. En ciertas modalidades, el anticuerpo no tiene función efectora.
Se podrá notar que, en ciertas modalidades, los anticuerpos modificados se pueden modificar para fusionar el dominio CH3 directamente a la región bisagra de los respectivos anticuerpos modificados. En otros constructos seria conveniente proporcionar un péptido espaciador entre la región bisagra y el CH2 modificado y/o los dominios CH3. Por ejemplo, los constructos compatibles se podrían expresar donde el dominio CH2 se elimina y el dominio CH3 restante (modificado o no modificado) se une a la región bisagra con un espaciador de 5-20 aminoácidos. Tal separador se puede adicionar, por ejemplo, para garantizar que los elementos reguladores del dominio constante permanezcan libres y accesibles o que la región bisagra permanezca flexible. Sin embargo, se deberá notar que los espaciadores de los aminoácidos pueden, en algunos casos, demostrar ser inmunogénico e inducir una respuesta inmune no deseada en contra del constructo. En consecuencia, en ciertas modalidades, cualquier espaciador adicionado al constructo será relativamente no inmunogénico, o incluso omitirse por completo, para mantener las cualidades bioquímicas convenientes de los anticuerpos modificados.
Además de la eliminación de los dominios completos de la región constante, se podrá apreciar que los anticuerpos de la presente invención se pueden proporcionar por la eliminación parcial o la sustitución de unos pocos o incluso un único aminoácido. Por ejemplo, la mutación de un único aminoácido en áreas determinadas del dominio CH2 podría ser suficiente para reducir sustancialmente la unión de Fe y de este modo aumentar la localización del tumor. Del mismo modo, podría ser conveniente eliminar simplemente esa parte de uno o más dominios de la región constante que controlan la función efectora (por ejemplo, la unión a C1Q del complemento) a ser modulada. Tales eliminaciones parciales de las regiones constantes pueden mejorar las características seleccionadas del anticuerpo (vida media en el suero) , mientras que dejan intactas otras funciones convenientes asociadas' con el dominio de la región constante del individuo. Además, según se refirió anteriormente, las regiones constantes de los anticuerpos descritos se pueden modificar a través de la mutación o la sustitución de uno o más aminoácidos que mejoran el perfil del constructo resultante. En este sentido seria posible interrumpir la actividad que se proporciona por un sitio de unión conservado (por ejemplo, unión al Fe), mientras que se mantiene sustancialmente la configuración y el perfil inmunogénico del anticuerpo modificado. Las modalidades determinadas pueden comprender la adición de uno o más aminoácidos de la región constante para mejorar las características convenientes, tales como disminuir o aumentar la función efectora o proporcionar el enlace para más citotoxina o carbohidrato. En tales modalidades puede ser conveniente insertar o reproducir secuencias especificas derivadas de los dominios seleccionados de la región constante .
La presente invención además abarca las variantes y los equivalentes que son sustancialmente homólogos a los anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos, o los fragmentos de anticuerpos de éstos, expuestos en este documento. Estos pueden contener, por ejemplo, las mutaciones con sustitución conservativa, es decir, la sustitución de uno o más aminoácidos por aminoácidos similares. Por ejemplo, la sustitución conservativa se refiere a la sustitución de un aminoácido con otro dentro de la misma clase general tal como, por ejemplo, un aminoácido ácido con otro aminoácido ácido, un aminoácido básico con otro aminoácido básico o un aminoácido neutro por otro aminoácido neutro. Lo que se pretende por una sustitución conservativa de aminoácido se conoce bien en la técnica.
Los polipéptidos de la presente invención pueden ser polipéptidos recombinantes, polipéptidos naturales, o polipéptidos sintéticos que comprenden un anticuerpo, o fragmento de éste, contra un F0LR1 humano. Se podrá reconocer en la técnica que algunas secuencias de aminoácido de la invención se pueden variar sin efecto significativo en la estructura o función de la proteína. De este modo, la invención además incluye las variaciones de los polipéptidos que muestran actividad sustancial o que incluyen las regiones de un anticuerpo o fragmento de éste, en contra de una proteína del receptor de folato humano. Tales mutantes incluyen las eliminaciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones tipos.
Los polipéptidos y los análogos se pueden además modificar para contener porciones químicas adicionales que normalmente no forman parte de la proteína. Aquellas porciones derivativas pueden mejorar la solubilidad, la vida media biológica o la absorción de la proteína. Las porciones pueden también reducir o eliminar cualquier efecto secundario conveniente de las proteínas y los similares. Una visión general de esas porciones se puede encontrar en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 20ma ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000) .
Los polipéptidos aislados que se describen en este documento se pueden producir por cualquier método adecuado conocido en la técnica. Tales métodos se extienden desde los métodos directos sintéticos para la proteina hasta la construcción de la secuencia de ADN que codifica las secuencias aisladas de polipéptido y la expresión de esas secuencias en un huésped adecuado transformado. En algunas modalidades, una secuencia de ADN se construye mediante la tecnología recombinante por el aislamiento o la síntesis de una secuencia de ADN que codifica una proteína tipo salvaje de interés. De forma opcional, la secuencia se puede mutar por mutagénesis sitio-específica para proporcionar análogos funcionales de éstos. Véase, por ejemplo, Zoeller y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 81:5662-5066 (1984) y la patente de EE.UU. núm. 4,588,585.
En algunas modalidades una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés se podrá construir por síntesis química mediante un sintetizador de oligonucleótidos . Tales oligonucleótidos se pueden diseñar en base a la secuencia de aminoácido del polipéptido conveniente y seleccionar aquellos codones que se favorecen en la célula huésped en el que el polipéptido recombinante de interés se podrá producir. Los métodos estándares se pueden aplicar para sintetizar una secuencia aislada del polinucleótido que codifica un polipéptido aislado de interés. Por ejemplo, una secuencia completa de aminoácido se puede usar para construir un gen post-traducido . Además, se puede sintetizar un oligómero de ADN que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido aislado en particular. Por ejemplo, varios oligonucleotidos pequeños que codifican para porciones del polipéptido conveniente se pueden sintetizar y ligar después. Los oligonucleotidos individuales normalmente contienen extremos salientes 5 'o 3' para el ensamblaje complementario .
Una vez ensambladas (por síntesis, mutagénesis sitio dirigida u otro método) , las secuencias de polinucleótidos que codifican un polipéptido de interés aislado en particular se podrán insertar en un vector de expresión y operativamente unir a una secuencia de control de la expresión apropiada para la expresión de la proteína en un huésped conveniente. El ensamblaje correcto se puede confirmar por la secuenciación de nucleótidos, el mapeo de restricción, y la expresión de un polipéptido biológicamente activo en un huésped adecuado. Como se conoce bien en la técnica, para obtener altos niveles de expresión de un gen transfectado en un huésped, el gen debe estar operativamente unido a las secuencias de control de la transcripción y de la expresión de la traducción que son funcionales en el huésped elegido de expresión .
En ciertas modalidades, los vectores de expresión recombinante se usan para amplificar y expresar los anticuerpos que codifican el ADN, o los fragmentos de éstos, contra F0LR1 humano. Los vectores de expresión recombinante son constructos de ADN replicables que tienen fragmentos de ADN sintético o derivados de ADNc que codifican una cadena polipeptidica de un anticuerpo anti-FOLRl, o fragmento de éste, operativamente unido a elementos reguladores adecuados de la transcripción o traducción derivados de genes de mamíferos, microbios, virus o insectos. Una unidad transcripcional en general comprende un ensamblaje de (1) un elemento genético o elementos que tienen un papel regulatorio en la expresión génica, por ejemplo, los promotores transcripcionales o potenciadores, (2) una secuencia estructural o de codificación, que se transcribe a ARNm y se traduce en proteína, y (3) la transcripción apropiada y la iniciación de la traducción y las secuencias de la terminación, como se describe en detalle a continuación. Tales elementos reguladores pueden incluir una secuencia del operador para controlar la transcripción. La capacidad de replicarse en un huésped, por lo general se confiere por un origen de replicacion, y se puede incorporar además un gen de selección para facilitar el reconocimiento de los transformantes. Las regiones de ADN se unen operativamente cuando ellas están relacionadas entre sí de forma funcional. Por ejemplo, el ADN de un péptido señal (líder de secreción) se enlaza operativamente al ADN para un polipéptido si este se expresa como un precursor que participa en la secreción del polipéptido; un promotor se une operativamente a una secuencia de codificación si este controla la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma se une operativamente a una secuencia de codificación si esta se coloca para permitir la traducción. Los elementos estructurales destinados para el uso en los sistemas de expresión de levadura incluyen una secuencia líder que permite la secreción extracelular de la proteína traducida por una célula huésped. Por otra parte, donde la proteína recombinante se expresa sin una secuencia líder o de transporte, esta puede incluir un residuo de metionina N-terminal. Este residuo de forma opcional puede ser posteriormente escindido a partir de la proteína recombinante expresada para proporcionar un producto final.
La elección de la secuencia de control de la expresión y el vector de expresión podrán depender de la elección de huésped. Se pueden emplear una amplia variedad de combinaciones de huésped/vector de expresión. Los vectores de expresión útiles para los huéspedes eucariotas, incluyen, por ejemplo, los vectores que comprenden las secuencias de control de la expresión de SV40, virus del papiloma bovino, adenovirus y citomegalovirus . Los vectores de expresión útiles para los huésped bacterianos incluyen los conocidos plásmidos bacterianos, tales como plásmidos de Escherichia coli, incluyendo pCR 1, pBR322, pMB9 y sus derivados, plásmidos del más amplio intervalo de huéspedes, tales como M13 y fagos filamentosos con ADN de cadena sencilla.
Las células del huésped adecuadas para la expresión de un polipéptido de unión al FOLRl o anticuerpo (o una proteina FOLRl para usar como un antigeno) incluyen las procariotas, levaduras, insectos o células superiores eucariotas bajo el control de los promotores apropiados. Las procariotas incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, E. coli o bacilos. Las células superiores eucariotas incluyen lineas celulares establecidas de origen de mamíferos, como se describe a continuación. Se podrían también emplear los sistemas de traducción libres de célula. La clonación apropiada y los vectores de expresión para usar con huéspedes celulares bacterias, hongos, levaduras y mamíferos son descritos por Pouwels y otros (Cloning Vectors : A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, 1985), la descripción relevante se incorpora en la presente como referencia. La información adicional sobre los métodos de producción de proteínas, que incluye la producción de anticuerpo, se puede encontrar, por ejemplo, en la publicación de la patente de EE.UU. núm 2008/0187954, la patente de EE.UU. núm. 6,413,746 y 6,660,501, y la publicación de patente internacional WO núm 04009823, los que se incorporan en la presente en su totalidad como referencia.
Distintos sistemas de cultivo de células de mamíferos o de insectos también se emplean de forma ventajosa para expresar la proteína recombinante . La expresión de las proteínas recombinantes en las células de mamíferos se puede realizar porque tales proteínas son en general correctamente plegadas, apropiadamente modificadas y completamente funcionales. Los ejemplos de líneas celulares adecuadas de huésped de mamíferos incluyen HEK-293 y HEK-293T, las líneas COS-7 de las células de riñon de mono, descrita por Gluzman (célula 23:175, 1981), y otras líneas celulares que incluyen, por ejemplo, las células L, C127, 3T3, ovario de hámster chino (CHO) , HeLa y líneas celulares BHK. Los vectores de expresión de mamíferos pueden comprender elementos no transcritos tales como un origen de replicación, un promotor adecuado y potenciador unido al gen para que se exprese, y otras secuencias no transcritas que flanquean 5 ' o 3', y secuencias no traducidas 5 ? 3', sitios de unión al ribosoma, tal como sean necesarios, un sitio de poliadenilación, sitio donador y sitios aceptores, y las secuencias transcripcional de terminación. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en las células de insecto son revisados por Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988).
Las proteínas producidas por un huésped transformado se pueden purificar de acuerdo con cualquier método adecuado. Tales métodos estándares incluyen la cromatografía (por ejemplo, cromatografía en columna de intercambio iónico, afinidad y por tamaño) , la centrifugación, la solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Las etiquetas de afinidad como hexahistidina, dominio de unión a maltosa, la secuencia de recubrimiento de la influenza y la glutatión-S-transferasa se pueden fijar a la proteína para permitir la fácil purificación por el paso a través de una columna de afinidad adecuada. Las proteínas aisladas también se pueden caracterizar físicamente mediante técnicas tales como la proteolisis, la resonancia magnética nuclear y la cristalografía de rayos X.
Por ejemplo, los sobrenadantes de los sistemas que secretan la proteína recombinante en los medios de cultivo se pueden concentrar primero usando un filtro de concentración de proteína disponible en el mercado, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. A continuación de la etapa de concentración, el concentrado se puede aplicar a una adecuada matriz de purificación. Por otra parte, una resina de intercambio aniónico se puede emplear, por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos colgantes de dietilaminoetil (DEAE) . Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrana, celulosa u otros tipos comúnmente empleadas en la purificación de proteínas. Por otra parte, se puede emplear una etapa de intercambio catiónico. Los adecuados intercambiadores de cationes incluyen diversas matrices insolubles que comprenden los grupos sulfopropil o carboximetilcelulosa . Por último, una o más etapas de la cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC) que emplean medios hidrofóbicos RP-HPLC, por ejemplo, gel de sílice que tiene colgando grupos metilo u otros alifáticos, se pueden emplear para purificar además un agente de unión al FOLR1. Algunas o todas las etapas de purificación precedentes, en diversas combinaciones, se pueden también emplear para proporcionar una proteína recombinante homogénea.
La proteína recombinante producida en el cultivo bacteriano se puede aislar, por ejemplo, por la extracción inicial a partir de los sedimentos celulares, seguido de una o más etapas de concentración, precipitación por sales, cromatografía de intercambio de iones acuosos o de exclusión por tamaño. La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se puede emplear para las etapas finales de purificación. Las células microbianas empleadas en la expresión de una proteína recombinante se puede romper por cualquier método conveniente, que incluyen ciclo de congelación-descongelación, sonicación, rotura mecánica, o el uso de agentes que lisan células.
Los métodos conocidos en la técnica para purificar anticuerpos y otras proteínas también incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en la publicación de la patente de EE.UU. núm. 2008/0312425, 2008/0177048 y 2009/0187005, los que se incorporan en la presente en su totalidad como referencia.
En ciertas modalidades, el agente de unión al FOLR1 es un polipéptido que no es un anticuerpo. Una variedad de métodos para identificar y producir polipéptidos que no son anticuerpos que se unen con alta afinidad a un objetivo proteico se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Skerra, Curr. Opin. Biotechnol., 18:295-304 (2007), Hosse y otros, Protein Science, 15:14-27 (2006), Gilí y otros, Curr. Opin. Biotechnol., 17:653-658 (2006), Nygren, FEBS J. , 275:2668-76 (2008), y Skerra, FEBS J. , 275:2677-83 (2008), los que se incorporan a este documento en su totalidad como referencia. En ciertas modalidades, la tecnología de exposición de fagos se ha usado para identificar/producir el polipéptido de unión al FOLRl . En ciertas modalidades, el polipéptido comprende un andamio proteico de un tipo seleccionado del grupo consistente de proteína A, una lipocalina, un dominio de fribronectina, un dominio repetitivo consenso de ankirina, y tiorredoxina .
En algunas modalidades, el agente es una molécula no proteica. En ciertas modalidades, el agente es una molécula pequeña. Las genotecas combinatoria de química y las técnicas útiles en la identificación de los agentes no proteicos de unión al F0LR1 se conocen por aquellas personas con conocimiento en la técnica. Véase, por ejemplo, Kennedy y otros, J. Comb. Chem, 10:345-354 (2008), Dolle y otros, J. Comb. Chem., 9:855-902 (2007), y Bhattacharyya, Curr. Med. Chem., 8:1383-404 (2001), los que se incorporan a este documento en su totalidad como referencia. En ciertas modalidades, además, el agente es un hidrato de carbono, un glicosaminoglicano, una glicoproteina, o un proteoglicano .
En ciertas modalidades, el agente es un ácido nucleico aptámero. Los aptámeros son moléculas de polinucleótidos que se han seleccionado (por ejemplo, a partir de las mezclas al azar o mutagenizadas) sobre la base de su capacidad para unir a otra molécula. En algunas modalidades, el aptámero comprende un polinucleotido de AD . En ciertas modalidades alternativas, el aptámero comprende un polinucleotido de ARN. En ciertas modalidades, el aptámero comprende uno o más residuos modificados de ácido nucleico. Los métodos de generación y detección de ácidos nucleicos aptámeros para unir a las proteínas se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. núm. 5,270,163, la patente de EE.UU. núm. 5,683,867, la patente de EE.UU. núm. 5,763,595, la patente de EE.UU. núm. 6,344,321, la patente de EE.UU. núm. 7,368,236, patente de EE.UU. núm. 5,582,981, la patente de EE.UU. núm. 5,756,291, la patente de EE.UU. núm. 5, 840, 867, la patente de EE.UU. núm.7 , 312 , 325 , la patente de EE.UU. núm. 7,329,742, publicación internacional de la patente núm. WO 02/077262, publicación internacional de patente núm. WO 03/070984, publicación de la solicitud de patente de EE.UU núm. 2005/0239134, publicación de la solicitud de patente de EE.UU núm. 2005/0124565, y publicación de la solicitud de patente de EE.UU núm. 2008/0227735, los que se incorporan en este documento como referencia en su totalidad.
III. Inmunoconjugados La presente invención se dirige también a los conjugados (también referido en este documento como inmunoconjugados) , que comprende los anticuerpos anti-FOLRl, los fragmentos de anticuerpos, equivalentes funcionales, los anticuerpos mejorados y sus aspectos como se describe en este documento, unido o conjugado con una citotoxina (de fármaco) o profármaco. De este modo, en una cierta modalidad, la invención proporciona un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión al antigeno del mismo que se une de forma específica a un receptor 1 de folato humano, donde el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GYFMN (sec. con núm. de ident : 1) ; una CDR2 de cadena pesada que comprende RIHPYDGDTFYNQXaaiFXaa2Xaa3 (sec. con núm. de ident: 56); y una CDR3 de cadena pesada que comprende YDGSRAMDY (sec. con núm. de ident: 3); y (b) una CDRl de cadena ligera que comprende KASQSVSFAGTSLMH (sec. con núm. de ident: 7); una CDR2 de cadena ligera que comprende RASNLEA (sec. con núm. de ident: 8) ; y una CDR3 de cadena ligera comprende QQSREYPYT (sec. con núm. de ident: 9); donde Xaai se selecciona de K, Q, H y R; Xaa2 se selecciona de Q, H, N, y R, y Xaa3 se selecciona de G, E, T, S, A y V. En ciertas modalidades, el anticuerpo es el anticuerpo Movl9hu, que es el anticuerpo descrito anteriormente que comprende el CDR2 RIHPYDGDTFYNQKFQG (sec. con núm. de ident.: 2) de cadena pesada. En otras modalidades, el anticuerpo es FRl-21 y comprende (a) una CDRl de cadena pesada que comprende SSYGMS (sec. con núm. de ident: 30); una CDR2 de cadena pesada que comprende TISSGGSYTY (sec. con núm. de ident: 31); y/o una CDR3 de cadena pesada que comprende DGEGGLYA DY (sec. con núm. de ident: 32); y (b) una CDRl de cadena ligera que comprende KASDHINNWLA (sec. con núm. de ident: 27); una CDR2 de cadena ligera que comprende GATSLET (sec. con núm. de ident: 28); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQY STPFT (sec. con núm. de ident: 29) . En otras modalidades, el anticuerpo es FR1-48 y comprende: (a) una CDRl de cadena pesada que comprende TNYWMQ (sec. con núm. de ident: 60); una CDR2 de cadena pesada que comprende AIYPGNGDSR (sec. con núm. de ident: 61); y/o una CDR3 de cadena pesada comprende RDGNYAAY (sec. con núm. de ident: 62), y/o (b) una CDRl de cadena ligera comprende RASENIYSNLA (sec. con núm. de ident: 57); una CDR2 de cadena ligera que comprende AATNLAD (sec. con núm. de ident: 58); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QHFWASPYT (sec. con núm. de ident: 59). En otras modalidades, el anticuerpo es FR1-49 y comprende: (a) una CDRl de cadena pesada que comprende TNYWMY (sec. con núm. de ident: 66); una CDR2 de cadena pesada que comprende AIYPGNSDTT (sec. con núm. de ident: 67); y/o una CDR3 de cadena pesada que comprende RHDYGAMDY (sec. con núm. de ident: 68); y/o (b) una CDRl de cadena ligera que comprende RASENIYTNLA (sec. con núm. de ident: 63); una CDR2 de cadena ligera que comprende TASNLAD (sec. con núm. de ident: 64); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QHFWVSPYT (sec. con núm. de ident: 65) . En otras modalidades, el anticuerpo es FR1-57 y comprende: (a) una CDRl de cadena pesada que comprende SSFGMH (sec. con núm. de ident: 72); una CDR2 de cadena pesada que comprende YISSGSSTIS (sec. con núm. de ident: 73); y/o una CDR3 de cadena pesada comprende EAYGSSMEY (sec. con núm. de ident: 74); y/o (b) una CDRl de cadena ligera que comprende RASQNINNNLH (sec. con núm. de ident: 69); una CDR2 de cadena ligera que comprende YVSQSVS (sec. con núm. de ident: 70); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSNS PHYT (sec. con núm. de ident: 71). Todavía en otra modalidad, el anticuerpo es FR1-65 y comprende: (a) una CDRl de cadena pesada que comprende TSYTMH (sec. con núm. de ident: 78); una CDR2 de cadena pesada que comprende YINPISGYTN (sec. con núm. de ident: 79); y/o una CDR3 de cadena pesada que comprende GGAYGRKPMDY (sec. con núm. de ident: 80); y/o (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende KASQNVGPNVA (sec. con núm. de ident: 75); una CDR2 de cadena ligera que comprende SASYRYS (sec. con núm. de ident: 76); y una CDR3 de cadena ligera comprende QQYNSYPYT (sec. con núm. de ident : 77 ) .
Los fármacos adecuados o profármacos se conocen en la técnica. En ciertas modalidades, los fármacos o profármacos son agentes citotóxicos. El agente citotóxico usado en el conjugado citotóxico de la presente invención puede ser cualquier compuesto que resulta en la muerte de una célula, o induce la muerte celular, o de alguna manera disminuye la viabilidad celular, e incluye, por ejemplo, maitansinoides y análogos de maitansinoides, las benzodiazepinas , taxoides, CC-1065 y análogos de CC-1065, duocarmicinas y análogos de duocarmicina, enediinas, tales como análogos calicheamicinas , dolastatina y análogos de dolastatina que incluyen auristatinas, derivados de tomaymicina, derivados de leptomicina, metotrexato, cisplatino, carboplatino, daunorrubicina, doxorrubicina, vincristina, vinblastina, melfalán, mitomicina C, clorambucil y doxorrubicina morfolino. En ciertas modalidades, los agentes citotóxicos son maitansinoides y análogos maitansinoides.
Tales conjugados se pueden preparar por el uso de un grupo ligando para enlazar un fármaco o profármaco al anticuerpo o su equivalente funcional. Los grupos ligandos adecuados se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos de ácido lábil, grupos fotolábiles, grupos de peptidasa lábiles y grupos de esterasa lábiles.
El fármaco o profármaco se puede, por ejemplo, enlazar al anticuerpo anti-FOLRl o fragmento de éste a través de un enlace disulfuro. La molécula ligando o agente de reticulación comprende un grupo reactivo químico que puede reaccionar con el anticuerpo anti-FOLRl o fragmento de éste. En ciertas modalidades, los grupos reactivos químicos para la reacción con el agente de unión a la célula son los ésteres W-succinimidilo y ésteres de N-sulfosuccinimidilo . Además, la molécula ligando comprende un grupo químico reactivo, en ciertas modalidades un grupo ditiopiridilo que puede reaccionar con el fármaco para formar un enlace disulfuro. En ciertas modalidades, las moléculas ligando incluyen, por ejemplo, N-succinimidilo 3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) (véase, por ejemplo, Carlsson y otros, Biochem J. , 173: 723-737 (1978)), -succinimidilo 4- (2-piridilditio) butanoato (SPDB) (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. núm. 4,563,304), N-succinimidilo 4- (2-piridilditio) 2-sulfobutanoato (sulfo-SPDB) (véase la publicación de EE.UU. núm. 20090274713), N-succinimidilo 4- (2-piridilditio) pentanoato (SPP) (véase, por ejemplo, el registro CAS número 341498-08-6), 2-iminotiolano, o anhídrido acetilsuccínico . Por ejemplo, el anticuerpo o el agente de unión celular se puede modificar con los reactivos de reticulación y el anticuerpo o el agente de unión celular que contienen grupos tiol libre o protegidos de este modo derivados se reacciona después con maitansinoide que contiene tiol o disulfuro para producir los conjugados. Los conjugados se pueden purificar por cromatografía, que incluyen pero no se limitan a, HPLC, exclusión por tamaño, adsorción, intercambio iónico y la captura por afinidad, la diálisis o la filtración de flujo tangencial. En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-FOLRl se enlaza a la citoxina a través de un ligando SPDB o sulfo-SPDB. En una cierta modalidad, el anticuerpo Movl9hu se enlaza a una citotoxina a través de un ligando SPDB o sulfo-SPDB.
En otro aspecto de la invención, el anticuerpo anti-FOLRl se enlaza a los fármacos citotóxicos a través de enlaces disulfuro y un espaciador de polietilenglicol para aumentar la potencia, la solubilidad o la eficacia del inmunoconjugado . Tales ligandos de escisión hidrofílicos se describen en WO2009/0134976. El beneficio adicional de este diseño de ligando es la proporción conveniente de monómero alto y el mínimo de agregación del conjugado fármaco- anticuerpo. De forma especifica están contemplados en este aspecto los conjugados de los agentes de unión a las células y los fármacos enlazados a través de los grupos disulfuro (-SS-) que llevan los espaciadores de polietilenglicol ((??2??2?)? = 1-14) con un margen estrecho de la carga del fármaco de 2-8 se describen que muestran la actividad biológica potente relativamente alta hacia las células cancerosas y tienen las propiedades bioquímicas convenientes de alto rendimiento de conjugación y alta proporción de monómero con mínima agregación de proteína.
De forma especifica está contemplado en este aspecto un conjugado del fármaco anticuerpo anti-FOLRl de Fórmula (I) o un conjugado de Fórmula (Ir): A-[Xi-(-CH2-CH20-)n-Y-C]m (I) A-[Xl-(-CH2-CH20-)n-Y-C]m (I) [C-Y-(-CH2-CH20-)n-Xi]m-A (?') donde : A representa un anticuerpo anti-FOLRl o fragmento; C representa una citotoxina o fármaco; X representa una unidad alifática, aromática o heterocíclica enlazada al agente de unión a la célula a través de un enlace tioéter, un enlace amida, un enlace carbamato, o un enlace éter; Y representa una unidad alifática, aromática o heterocíclica enlazada al fármaco a través de un enlace disulfuro; 1 es 0 ó 1; m es un número entero de 2 a 8, y n es un número entero del 1 al 24.
En ciertas modalidades, m es un número entero de 2 a 6.
En ciertas modalidades, m es un número entero de 3 a 5.
También, en ciertas modalidades, n es un número entero de 2 a 8. Por otra parte, como se describe en, por ejemplo, la patente de EE.UU. núm 6,441,163 y 7,368,565, el fármaco primero se puede modificar para introducir un éster reactivo adecuado para reaccionar con un agente de unión de la célula. La reacción de estos fármacos que contienen una región de ligando activado con un agente de unión a la célula proporciona otro método para producir un conjugado del fármaco con el agente de unión a la célula. Los maitansinoides también puede enlazar con el anticuerpo anti F0LR1 o el fragmento mediante grupos ligando PEG, según lo expuesto por ejemplo en la patente de EE.UU. 6,716,821. Estos grupos no escindibles que enlazan a PEG son solubles tanto agua como en solventes no acuosos, y se pueden usar para unir uno o más agentes citotóxicos a un agente de unión celular. Los grupos ilustrativos que enlazan a PEG incluyen los ligandos de PEG heterobifuncionales que reaccionan con los agentes citotóxicos y los agentes de unión a la célula en los extremos opuestos de los ligandos a través de un grupo funcional sulfhidrilo o disulfuro en un extremo, y un éster activo en el otro extremo. Como un ejemplo general de la síntesis de un conjugado citotóxico mediante un grupo que enlaza a PEG, se prepara otra vez la referencia para la patente de EE.UU. 6,716,821 que se incorpora a este documento en su totalidad como referencia. La síntesis se inicia con la reacción de uno o más agentes citotóxicos que llevan una región de PEG reactiva con un agente de unión a la célula, lo que resulta en el desplazamiento del éster activo terminal de cada región PEG reactiva por un residuo de aminoácido del agente de unión celular, para rendir un conjugado citotóxico que comprende uno o más agentes citotóxicos enlazado de forma covalente a un agente de unión celular a través de un grupo que enlaza a PEG. Por otra parte, la unión a la célula se puede modificar con el reticulante PEG bifuncional para introducir una región reactiva de disulfuro (tal como un piridildisulfuro) , que se puede tratar después con un maitansinoide que contiene tiol para proporcionar un conjugado. En otro método, la célula de unión se puede modificar con el reticulante PEG bifuncional para introducir una región de tiol que se puede tratar después con un reactivo maitansinoide que contiene disulfuro (tal como un piridildisulfuro) , para proporcionar un conjugado.
Los conjugados anticuerpo-maitansinoide con los ligandos no escindibles se pueden preparar también. Tales reticulantes se describen en la técnica (véase ThermoScientific Pierce Crosslinking Technical Handbook y la publicación de la solicitud de patente de EE.UU. núm. 2005/0169933) e incluyen, pero no se limitan a, N-succinimidil 4- (maleimidoraetil) ciclohexanocarboxilato (SMCC), W-succinimidil-4- (N-maleimidometil) -ciclohexano-1-carboxi- (6-amidocaproato) , que es análogo de "cadena larga" del SMCC (LC-SMCC) , éster de N-succinimidil del ácido ?-maleimidoundecanoico (KMUA) , éster de W-succinimidil del ácido ß-maleimidopropanoico (BMPS) , éster de i\7-succinimidil del ácido ?-maleimidobutirico (GMBS) , éster de N-hidroxisuccinimida del ácido e-maleimidocaproico (EMCS) , éster de N-hidroxisuccinimida-m-maleimidobenzoil (MBS), éster de N- (a-maleimidoacetoxi) succinimida (AMAS), succinimidil-6- (ß-maleimidopropionaraido) hexanoato (SMPH) , N-succinimidil 4- (p-maleimidofenil) -butirato (SMPB) , y N- (p-maleimidofenil ) isocianato (PMPI), W-succinimidil-4- (iodoacetil) -aminobenzoato (SIAB) , i\7-succinimidil iodoacetato (SIA) , -succinimidil bromoacetato (SBA) , y N-succinimidil 3- (bromoacetamido) propionato (SBAP) . En ciertas modalidades, el anticuerpo se modifica con los reactivos de reticulación, tales como succinimidil 4- (N-maleimidometil ) -ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) , sulfo-SMCC, éster de maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS) , sulfo-MBS o succinimidil-iodoacetato, como se describe en la literatura, para introducir 1-10 grupos reactivos (Yoshitake y otros, Eur. J. Biochem, 101:395-399 (1979); Hashida y otros, J. Applied Biochem. , 56-63 (1984); y Liu y otros, Biochem., 18:690-697 (1979) ) . El anticuerpo modificado se reacciona después con el derivado de raaitansinoide que contiene tiol para producir un conjugado. El conjugado se puede purificar por filtración . en gel a través de una columna de Sephadex G25 o por diálisis o filtración de flujo tangencial. Los anticuerpos modificados se tratan con el maitansinoide que contiene tiol (1 a 2 equivalente molar/grupo maleimida) y los conjugados maitansinoide/anticuerpo se purifican por filtración en gel a través de una columna Sephadex G-25, cromatografía en una columna de cerámica de hidroxiapatita, la diálisis o filtración de flujo tangencial o una combinación de éstos métodos. Normalmente, se enlazan un promedio de 1-10 maitansinoides por anticuerpos. Un método es para modificar los anticuerpos con succinimidil 4- (N-maleimidometil ) -ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) para introducir los grupos maleimida seguido por la reacción del anticuerpo modificado con un maitansinoide que contiene tiol para dar un conjugado enlazado a tioéter. Otra vez resultan los conjugados con 1 a 10 moléculas del fármaco por molécula de anticuerpo. Los conjugados maitansinoide de anticuerpos, los fragmentos de anticuerpos, las hormonas proteicas, los factores de crecimiento proteicos y otras proteínas se preparan de la misma manera.
En otro aspecto de la invención, el anticuerpo FOLR1 (por ejemplo, Movl9hu, FR1-21, FR1-48, FR1-49, FR1-57, o FR1- 65) se enlaza al fármaco por un enlace no escindible a través del intermediario de un espaciador PEG. Los reactivos de reticulación adecuados que comprenden las cadenas hidrofílicas de PEG que forman ligandos entre un fármaco y el anticuerpo anti F0LR1 o fragmento son también bien conocidos en la técnica, o están disponibles en el mercado (por ejemplo, de Quanta Biodesign, Powell, Ohio) . Los reticulantes adecuados que contienen PEG se pueden también sintetizar a partir de los mismos PEG disponibles en el mercado mediante las técnicas estándar de la química sintética conocida por las personas con conocimiento en la técnica. Los fármacos se pueden reaccionar con ligandos bifuncionales cruzados que contiene PEG para dar compuestos de la siguiente Fórmula, Z-?- (-CH2-CH2-O-) n-Yp-D, por los métodos descritos en detalle en la publicación de la patente de EE.UU. 20090274713 y en WO2009/0134976, que pueden reaccionar con el agente de unión celular para proporcionar un conjugado. Por otra parte, la unión a la célula se puede modificar con el ligando de cruzamiento bifuncional de PEG para introducir un grupo reactivo tiol (tal como una maleimida o una haloacetamida) los que se pueden tratar después con un maitansinoide que contiene tiol para proporcionar un conjugado. En otro método, la unión a la célula se puede modificar con el reticulante bifuncional de PEG para introducir una región tiol que se puede tratar después con un maitansinoide con un tiol reactivo (tal como un maitansinoide que porta una maleimida o una haloacetamida) para proporcionar un conjugado.
En consecuencia, otro aspecto de la presente invención es un conjugado fármaco del anticuerpo anti-FOLRl del de Fórmula (II) o de Fórmula (II' ): A- [Xi- (-CH2-CH2-O-) n-Yp-C] m (II) [C-Yp-(-CH2-CH2-0-)n-Xi]m-A di' ) donde, A representa un anticuerpo o un fragmento anti-FOLRl; C representa una citotoxina o fármaco; X representa una unidad alifática, aromática o heterociclica unida al agente unión a la célula a través de un enlace tioéter, un enlace amida, un enlace carbamato o un enlace éter .
Y representa una unidad alifática, aromática o heterociclica unida al fármaco a través de un enlace covalente seleccionado del grupo consistente de un enlace tioéter, un enlace amida, un enlace carbamato, un enlace éter, un enlace amida, un enlace carbono-carbono y un enlace hidrazona; 1 es 0 ó 1; p es 0 ó 1; m es un número entero de 2 a 15; y n es un número entero de 1 a 2000.
En una cierta modalidad, m es un número entero de a 8 ; y n es un número entero del 1 al 24.
En una cierta modalidad, m es un número entero de 2 a 6. En una cierta modalidad, n es un número entero de 2 a 8. En una cierta modalidad, m es un número entero de 3 a 5. En una cierta modalidad, el anticuerpo es Movl9hu. En otra modalidad, el anticuerpo es FR-1-21. En otra modalidad, el anticuerpo es FR-1-48. En otra modalidad el anticuerpo es FR-1-49. En otra modalidad, el anticuerpo es FR-1-57. En otra modalidad, el anticuerpo es FR-1-65.
Los ejemplos de ligandos que contienen PEG adecuados incluyen los ligandos que tienen una región éster N-succinimidil o éster N-sulfosucinimidil para reaccionar con el anticuerpo anti-FOLRl o el fragmento de éste, asi como una región basada en maleimida o haloacetil, para la reacción con el compuesto. Un espaciador PEG se puede incorporar dentro de cualquier reticulante conocido en la técnica por los métodos descritos en este documento.
Muchos de los ligandos descritos en este documento están descritos en detalles en las publicaciones de las patentes de los EE.UU. núms. 20050169933 y 20090274713 y en WO02009/0134976, cuyos contenidos se incorporan a este documento en su totalidad como referencia.
La presente invención que incluye aspectos donde aproximadamente de 2 a 8 moléculas de fármaco ("carga del fármaco"), por ejemplo, el maitansinoide, se enlazan a un anticuerpo anti - FOLR1 o un fragmento de éste, el efecto antituraoral del conjugado es mucho más eficaz cuando se compara con una carga de fármaco de un número menor o mayor de fármacos enlazados al mismo agente de unión a la célula. La "carga del fármaco" como se usa en este documento se refiere al número de moléculas de fármaco (por ejemplo un maitansinoide ) , que se puede unir a un agente de unión a la célula (por ejemplo un anticuerpo anti-FOLRl o un fragmento de éste) . En un aspecto el número de moléculas de fármaco que se pueden unir al agente de unión a la célula pueden promediar aproximadamente de 2 a aproximadamente 8 (por ejemplo 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1). En ciertas modalidades, el fármaco es N2' -deacetil-N2' - (3-mercapto-l-oxopropil) -maitansina (DM1) o W^'-deacetil-N2' - (4-mercapto-4-metil-l-oxopentil) maitansina (DM4). De este modo, en una cierta modalidad, el anticuerpo Movl9hu se conjuga a DM1 o DM4. En otra modalidad, el anticuerpo FR-1-21 se conjuga a DM1 o DM4. En otra modalidad, el anticuerpo FR-1-48 se conjuga a DM1 o DM4. En otra modalidad el anticuerpo FR-1-49 se conjuga a DM1 o DM4. En otra modalidad el anticuerpo FR-1-57 se conjuga a DM1 o DM4. En otra modalidad el anticuerpo FR-1-65 se conjuga a DM1 o DM4.
De este modo, en un aspecto, un inmunoconjugado comprende a 1 maitansinoide por anticuerpo. En otro aspecto, un inmunoconjugado comprende a 2 maitansinoides por anticuerpo. En otro aspecto un inmunoconjugado comprende a 3 maitansinoides por anticuerpo. En otro aspecto, un inmunoconjugado comprende a 4 maitansinoides por anticuerpo. En otro aspecto, un inmunoconjugado comprende a 5 maitansinoides por anticuerpo. En otro aspecto, un inmunoconj ugado comprende a 6 maitansinoides por anticuerpo.
En otro aspecto, un inmunoconjugado comprende a 7 maitansinoides por anticuerpo. En otro aspecto, un inmunoconj ugado comprende a 8 maitansinoides por anticuerpo.
En un aspecto un inmunocon ugado comprende aproximadamente de 1 a aproximadamente 8 maitansinoides por anticuerpo . En otro aspecto un inmunoconjugado comprende aproximadamente de 2 a aproximadamente 7 maitansinoides por anticuerpo. En otro aspecto un inmunoconjugado comprende aproximadamente de 2 a aproximadamente 6 maitansinoides por anticuerpo. En otro aspecto un inmunoconjugado comprende aproximadamente de 2 a aproximadamente 5 maitansinoides por anticuerpo. En otro aspecto un inmunoconjugado comprende aproximadamente de 3 a aproximadamente 5 maitansinoides por anticuerpo. En otro aspecto un inmunoconjugado comprende aproximadamente de 3 a aproximadamente 4 maitansinoides por anticuerpo .
En un aspecto, una composición que comprende inmunoconjugados tiene un promedio de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 ( por ej emplo, 1.9, 2.0, 2.1, 2 · 2 2 * 3 ^ 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1) moléculas de fármacos (por ejemplo. maitansinoides) unidas por anticuerpo . En un aspecto, una composición que comprende inmunoconjugados, tiene un promedio de aproximadamente 1 a aproximadamente 8 moléculas de fármaco (por ejemplo, maitansinoides) por anticuerpo. En un aspecto, una composición que comprende inmunoconjugados tiene un promedio de aproximadamente 2 a aproximadamente 7 moléculas (por ejemplo maitansinoides) por anticuerpo. En un aspecto una composición que comprende inmunoconjugados tiene un promedio de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 moléculas de fármaco (por ejemplo maitansinoides) por anticuerpo. En un aspecto una composición que comprende inmunoconjugados tiene un promedio de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 moléculas de fármaco (por ejemplo maitansinoides) por anticuerpo. En un aspecto una composición que comprende inmunoconjugados tiene un promedio de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 moléculas de fármaco (por ejemplo maitansinoides ) por anticuerpo. En un aspecto una composición que comprende inmunoconjugados tiene un promedio de aproximadamente 3 a aproximadamente 4 moléculas de fármaco (por ejemplo maitansinoides) por anticuerpo. En un aspecto una composición que comprende inmunoconjugados tiene un promedio de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 4 moléculas de fármaco (por ejemplo maitansinoides) por anticuerpo.
En un aspecto, una composición que comprende inmunoconjugados tiene un promedio de aproximadamente 2 ± 0.5, aproximadamente 2.5 ± 0.5, aproximadamente 3 ± 0.5, aproximadamente 3.5 ± 0.5 aproximadamente de 4 ± 0.5, aproximadamente 4.5 ± 0.5, aproximadamente 5 ± 0.5 aproximadamente 5.5 ± 0.5, aproximadamente 6 ± 0.5, aproximadamente 6.5 ± 0.5, aproximadamente 7 ± 0.5, aproximadamente de 7.5 ± 0.5, aproximadamente 8 ± 0.5 moléculas de fármacos (por ejemplo, maitansinoides) unidas por anticuerpo. En un aspecto una composición que comprende inmunoconjugados, tiene un promedio de aproximadamente 3.5 ± 0.5, moléculas de fármaco (por ejemplo maitansinoides) por anticuerpo .
El anticuerpo anti-FOLRl o fragmento de éste se puede modificar reaccionando un reactivo bifuncional de entrecruzamiento con el anticuerpo anti-FOLRl o fragmento de éste, resultando de ese modo en el enlace covalente de una molécula ligando al anticuerpo anti-FOLRl o fragmento de éste. Como se usa en este documento, "un reactivo bifuncional de entrecruzamiento" es cualquier región química que enlaza covalentemente un agente de unión a la célula con un fármaco, tal como los fármacos descritos en este documento. En otro método una parte de la región de enlace se proporciona por el fármaco. Con respecto a esto, el fármaco comprende una región de enlace que es parte de una molécula ligando mayor que se usa para unir el agente de unión a la célula con el fármaco. Por ejemplo, para formar el maitansinoide DM1, la cadena lateral del grupo hidroxilo C-3 de maitansina se modifica para tener un grupo sulfhidrilo libre (SH) . Esta forma tiol de maitansina puede reaccionar con un agente modificado de unión a la célula para formar un conjugado. Por lo tanto, el ligando final se ensambla a partir de dos componentes, uno de los cuales se proporciona por el reactivo de entrecruzamiento, mientras que el otro se proporciona por una cadena lateral del DM1.
Las moléculas del fármaco se pueden enlazar también a las moléculas del anticuerpo a través de una molécula intermediaria transportadora tal como es la albúmina sérica.
Como se usa en este documento, la expresión "enlace a un agente de unión a la célula" o "enlace a un anticuerpo o fragmento anti-FOLRl" se refiere a la molécula conjugada que comprende al menos un derivado del fármaco unido a un agente de unión a la célula, el anticuerpo o fragmento anti-FOLRl, a través de un grupo de enlace adecuado, o un precursor de éste. En ciertas modalidades, el grupo de enlace es SMCC.
En ciertas modalidades, los agentes citotóxicos útiles en la presente invención son maitansinoides y análogos de los maitansinoides. Los ejemplos de maitansinoides adecuados incluye a los ésteres de maitansinol y análogos del maitansinol. Se incluyen algunos fármacos que inhiben la formación del microtúbulo y que son altamente tóxicos para las células de mamíferos, como son el maitanasinol y los análogos del maitanasinol .
Los ejemplos de ésteres de maitansinol funcionales incluyen aquellos que tienen un anillo aromático modificado y aquellos que tienen modificaciones en otras posiciones. Tales maitansinoides adecuados están descritos en las patentes de los EE.UU. núms . 4,424,219; 4,256,746; 4,294,757; 4,307,016; 4,313,946; 4,315,929; 4,331,598; 4,361,650; 4,362,663; 4,364,866; 4,450,254; 4,322,348; 4,371,533; 5,208,020; 5,416,064; 5,475,092; 5,585,499; 5,846,545; 6,333,410; 7,276,497 y 7,473,796.
En una cierta modalidad, los inmunoconj ugados de la invención utilizan el maitansinoide que contiene el tiol (DM1) formalmente denominado N2' ' -deacetil-N2' - ( 3-mercapto-l-oxopropil ) -maitansina, como el agente citotóxico. El DM1 se representa por la siguiente Fórmula estructural (III) : En otra modalidad, los conjugados de la presente invención utilizan el maitansinoide que contiene tiol en N2' -deacetil-2\72' ( 4 -me t i 1 - -mer capt o- 1 - oxopentil)- maitansina (por ejemplo, DM4) como el agente citotóxico. DM4 se representa por la siguiente Fórmula estructural (IV) : Otro maitansinoide que comprende una cadena lateral que contiene un enlace tiol estéricamente impedido es el N2' -deacet il-N-2' ( 4 -me re apto- 1- oxopentil ) -maitansina (denominado DM3) representado por la siguiente Fórmula estructural (V) .
Cada uno de los maitansinoides enseñados en las patentes de los EE.UU. núms . 5,208,020 y 7,276,497 se pueden usar también en el conjugado de la presente invención. Con respecto a esto, la descripción completa de 5,208,020 y 7,276,697 se incorpora a este documento como referencia.
Muchas posiciones en los maitansinoides pueden servir como la posición para enlazar químicamente a la región de enlace. Por ejemplo, la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximet ilo , la posición C-15 modificada con hidroxi y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxi, que se esperan todas sean útiles. En ciertas modalidades, la posición C-3 se utiliza. En ciertas modalidades, se utiliza la posición C-3 del maitansinol .
Las representaciones estructurales de ciertos conjugados se muestran a continuación: ) 25 (XII) Ab-sulfo-SPDB-DM4 (XIII) En una cierta modalidad, el anticuerpo es ovl9hu. En otra modalidad, el anticuerpo es FR1-21.
Varias descripciones para producir tal conjugado maitansinoide-anticuerpo se proporcionan en las patentes de los EE.UU. núm. 6,333,410, 6,441,163, 6,716,821, y 7,368,565 cada una de las que se incorpora a este documento en su totalidad.
En general, una solución de un anticuerpo en amortiguador acuoso se puede incubar con un exceso molar de maitansinoides que tienen una región de disulfuro que porta un grupo reactivo. La mezcla de reacción se puede apagar por la adición de un exceso de amina (tal como etanolamina, taurina, etc.). El conjugado maitansinoide-anticuerpo se puede purificar después por gel filtración. El número de moléculas maitansinoides enlazadas por molécula de anticuerpo se puede determinar por la medición espectrofotométrica de la proporción de la absorbancia a 252 nm y 280 nm. Se usa un promedio de 1-10 moléculas de maitansinoide/molécula de anticuerpo y un promedio de 2-5 se usa también en las modalidades determinadas. El número promedio de moléculas de maitansinoides/anticuerpo puede ser, por ejemplo, aproximadamente de 1-10, 2-5, 3-4, 3.5-4 ó 3.5. En un aspecto, el número promedio de moléculas de maitansinoides/anticuerpo es aproximadamente de 3.5+0.5. En un aspecto, el número promedio de moléculas de maitansinoides/anticuerpo es aproximadamente de 3.5-4.
Los conjugados de anticuerpos con fármacos maitansinoides se pueden evaluar por su capacidad para suprimir la proliferación, in vitro, de varias lineas celulares no deseadas. Por ejemplo, las lineas celulares tales como la linea celular humana KB, se puede fácilmente usar para la evaluación de la citotoxicidad de estos compuestos . Las células a evaluarse se pueden exponer a los compuestos durante 4 a 5 días y las fracciones sobrevivientes de células se miden en ensayos directos por métodos conocidos. Los valores de IC50 se pueden calcular después a partir de los resultados de los ensayos.
Los compuestos de benzodiazepina descritos, por ejemplo, en la publicación de la solicitud de patente de los EE.UU. núm. 2010/0203007 (por ejemplo, indolinobenzodiazepinas o oxazolidinobenzodiazepinas ) , derivados de éstos, intermediarios de éstos, se podrían usar también para preparar fragmentos o conjugados del anticuerpo anti-FOLR 1.
Las benzodiazepinas útiles incluyen los compuestos de Fórmulas (XIV), (XV) y (XVI), en las que los compuestos dímeros de manera opcional portan un grupo de enlace que permite enlazar a los agentes de unión a la célula. en donde la doble línea ~ entre N y C representa un enlace simple o un doble enlace, proporcionando que cuando sea un doble enlace X está ausente y Y es H, y cuando es un simple enlace, X es H o un grupo de protección amina que convierte el compuesto en un profármaco; Y se selecciona de -0R, un éster representado por -OCOR' , un carbonato representado por -OCOOR' , un carbamato representado por -OCONR'R'', una amina o una hidroxil amina representada por NR'R'', amida representada por -NRCOR' , un péptido representado por NRCOP, donde P es un aminoácido o un polipéptido que contiene entre 2 a 20 unidades de aminoácidos, un tioéter representado por SR' , un sulfóxido representado por SOR' , una sulfona representada por -SO2R' , un sulfito -SO3, un bisulfito -OS03, un halógeno, un ciano, un azido o un tiol, donde R, R' y R' ' son iguales o diferentes y se seleccionan a partir de H, alquilos, alquenilos o alquinilos lineales sustituidos y no sustituidos, ramificados o cíclicos que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n, donde n es un número entero de 1 a 2000, aril que tiene de 6 a 10 átomos de carbono, anillo heterocíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono donde el sustituyente se selecciona de un halógeno, 0R , NR8Rg, N02, NRCOR' , SR10, un sulfóxido representado por SOR' , una sulfona representada por -S02R' , un sulfito -S03, un bisulfito -OSO3, una sulfonamida representada por S02NRR' , ciano, un azido , -CORn, OCOR o OCONRiiRj.2, donde las definiciones para R7, R8, R9, Ri0, n y R12 se dan como anteriormente, de forma opcional R' ' es OH; W es C=0, C=S, CH2, BH, SO o S02; Ri, R2, 3/ / RI' R2' R3' y R<J' se seleccionan cada uno independientemente de H, alquilos, alquenilos o alquinilos lineales sustituidos y no sustituidos, ramificados o cíclicos que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n, donde n es un número entero de 1 a 2000, o un sustituyente seleccionado de un halógeno, guanidinio [-NH (C=NH) NH2] , OR7, NR8R9, N02, NRCOR' , SR10, un sulfóxido representado por SOR' , una sulfona representada por -S02R' , un sulfito -S03, un bisulfito -OSO3 , una sulfonamida representada por S02NRR' , ciano, un azido, -COR , OCORn o OCONRnRi2 donde R7, Re, R9, Rio, R11 y R12 se seleccionan cada uno independientemente de H, alquilos, alquenilos o alquinilos lineales sustituidos y no sustituidos, ramificados o cíclicos que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n, donde n es un número entero de 1 a 2000, aril que tiene de 6 a 10 átomos de carbono, anillo heterocíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, de forma opcional Rio es SR13 o COR13 , donde RI3 se selecciona de un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n, donde n es un número entero de 1 a 2000, aril que tiene de 6 a 10 átomos de carbono, anillo heterociclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, opcionalmente Ru es ORn, donde Ri4 tiene la misma definición como R, de forma opcional, cualquiera de uno de Ri, R2, R3, R4, Ri' , R2' , R3' , o R4' es un grupo de enlace que es capaz de enlazar a un agente de unión a la célula a través de un enlace covalente o se selecciona de una unidad polipirrolo, poli-indolilo, poli-imidazolilo, polipirrolo-imidazolilo, poli-pirrolo-indolilo o poliimidazol-indolilo de forma opcional que portan un grupo de enlace que es capaz de enlazar a un agente de unión a la célula; Z se selecciona de (CH2)n, donde n es 1, 2 ó 3, CRi5Ri6, NRi7, 0 o S, donde R15, Ri6 y Ri7 se seleccionan cada uno independientemente de H, de un alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n, donde n es un número entero de 1 a 2000; R6 es OR, SR o NRR' , donde R y R' tienen la misma definición como se dan anteriormente; X' se selecciona de CH2, NR, CO, BH, SO o S02 donde R tiene la misma definición como se da anteriormente; Y' es O, CH2, NR o S, donde R tiene la misma definición que se da anteriormente; Z' es CH2 o (CH2)nf donde n es 2, 3 ó 4, proporcionando que X' , Y' y Z' no sean todos CH2 al mismo tiempo; A y A' son iguales o diferentes y se seleccionan de 0, CRR'O, S, -CRR'S, -NR15 o CRR' NHR15, donde R y R' tienen la misma definición como se dan anteriormente; y donde R15 tiene la misma definición que se da anteriormente para R; D y D' son iguales o diferentes e independientemente seleccionados de alquilos, alquenilos o alquinilos lineales, ramificados o cíclicos, que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, de forma opcional sustituidos 7con un halógeno cualquiera, 0R7, NR8Rg, N02, NRCOR' , SRio, un sulfóxido representado por SOR' , una sulfona por -S02R' , un sulfito -S03, un bisulfito -OSO3, una sulfonamida representada por S02NRR' , ciano, un azido, -CORu, OCORn o 0C0NRnRi2, donde las definiciones de R7, Ra, R9, Rio, R11 y R12 se dan anteriormente, una unidad de polietilenglicol (-0CH2CH2)n, donde n es un número entero de 1 a 2000; L es un grupo fenilo opcional o un anillo heterociclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono que están sustituidos de forma opcional, donde el sustituyente es un grupo de enlace que permite la unión a un agente de unión celular a través de un enlace covalente, o se selecciona de alquilos, alquenilos 0 alquinilos lineales, ramificados o cíclicos, que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, de forma opcional sustituidos con un halógeno cualquiera, OR7, NR8R9, N02, NRCOR', SRiQ, un sulfóxido representado por SOR' , una sulfona representada por -S02R' , un sulfito -SO3, un bisulfito -0S03, una sulfonamida representada por S02NRR' , ciano, un azido, , -CORn, OCORn o OCO R11R12 , donde las definiciones de R7, R8, Rg, Rio, R11 y R12 se dan anteriormente, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n, en donde n es un número entero de 1 a 2000; de forma opcional, el propio L es un grupo de enlace capaz de enlazar a un agente de unión a la célula a través de un enlace covalente; o sus solvatos, sales, hidratos o sales hidratadas, sus isómeros ópticos, racematos, diasterómeros, enantiómeros , o las estructuras polimórficas cristalinas de estos compuestos farmacéuticamente aceptables, proporcionando que el compuesto no tiene más que un grupo de enlace capaz de enlazar un agente de unión a la célula a través de un enlace covalente .
En un aspecto la doble linea ="= entre N y C representa un enlace simple o un doble enlace, proporcionando que cuando sea un doble enlace X está ausente y Y es H, y cuando sea un simple enlace, X es H o un grupo de protección amina, que convierte el compuesto en un profármaco; Y se selecciona de -OR, NR'R", un sulfito -SO3, o un bisulfito -OSO3, donde R se selecciona a partir de alquilos, alquenilos o alquinilos lineales, ramificados o cíclicos, que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n, donde n es un número entero de 1 a 2000, aril que tiene de 6 a 10 átomos de carbono, anillo heterocíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono; W es C=0, CH2 o S02; Ri , R2 , R3 R4/ Ri ' . R2 ' . R3 ' y 4 ' se seleccionan independientemente cada uno a partir de H, N02 o un grupo enlace capaz de enlazar a un agente unión a la célula a través de un enlace covalente; Re es OR18, donde Ríe tiene la misma definición como R ; Z se selecciona de (CH2)nr donde n es 1, 2 ó 3, CR15R16, NR17 , 0 o S, donde R15, i6 y 17 se seleccionan cada uno independientemente de H, de un alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2 ) n , donde n es un número entero de 1 a 2000; X' se selecciona de CH2, o C=0; Y' es O, NR, o S, donde R se define como anteriormente; Z' es CH2 o (CH2)2; A y A' son cada una O.; D y D' son iguales o diferentes y se seleccionan independientemente de alquilos, alquenilos o alquinilos lineales, ramificados o aromáticos, de 1 a 10 átomos de carbono; L es un grupo fenilo opcional o un anillo heterocíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono, que se sustituye de forma opcional, donde el sustituyente es un grupo de enlace que permite la unión al agente de unión celular a través de un enlace covalente, o se selecciona a partir de alquilos, alquenilos o alquinilos lineales, ramificados o cíclicos que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, se sustituye de forma opcional con un halógeno cualquiera, OR7, NR8Rg, NO2, NRCOR' , SR10, un sulfóxido representado por SOR' , una sulfona representada por -S02R' , un sulfito -S03, un bisulfito -OS03, una sulfonamida representada por SO2NRR' , ciano, un azido, -CORn, OCORn ó OCONR11R12, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n, donde n es un número entero de 1 a 2000; de forma opcional, el propio L es un grupo de enlace capaz de enlazar a un agente de unión a la célula a través de un enlace covalente, o sus solvatos, sales, hidratos, sales hidratadas, sus isómeros ópticos, racematos, diasterómeros, enantiómeros o estructuras polimórficas cristalinas de estos compuestos farmacéuticamente aceptables.
En otro aspecto el compuesto se representa por la Fórmula (XVII): en donde la doble línea — entre N y C representa un simple enlace, o un doble enlace, proporcionando que cuando sea un doble enlace X está ausente y Y es H, y cuando es un simple enlace, X es H o un grupo de protección amina que convierte el compuesto en un profármaco, y Y se selecciona de un OH, un éter representado por -0R, un sulfito -S03, o un bisulfito -OSO3, donde R se selecciona de alquilos, alquenilos, alquinilos lineales, ramificados o cíclicos, que portan de 1 a 10 átomos de carbono, Uno de R2 , R3 es un grupo de enlace capaz de enlazar a un agente de unión a la célula a través de un enlace covalente y el otro es H, Uno de L' , L' ' ó L"' es un grupo de enlace capaz de enlazar a un agente de unión celular mientras que los otros son H; L' que pueden ser el grupo de enlace y G es CH o N. Otros ejemplos se describen en la aplicación de patente de los EE.UU.: núm. 61/150,201, el contenido total de la cual se incorpora a este documento como referencia. De este modo en una cierta modalidad, el anticuerpo Mol9hu se conjuga a un benzodiazepeno que tiene una estructura mostrada en XIX-XXII anteriormente. En otra modalidad, el anticuerpo FR-1-21 se conjuga a un benzodiazepeno que tiene una estructura mostrada en XIX-XXII anteriormente.
IV. Polinucleótidos En ciertas modalidades, la invención incluye los polinucleótidos que comprenden polinucleótidos que codifican a un polipéptido que específicamente se une al receptor humano FOLR1 o un fragmento de este polipéptido. Por ejemplo, la invención proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica a un anticuerpo para un F0LR1 humano o codifica a un fragmento de este anticuerpo. Los polinucleotidos de la invención pueden estar en la forma de ARN o en la forma de ADN. El ADN incluye ADNc, ADN genómico y ADN sintético y pueden ser doble cadena o de simple cadena y si es simple cadena pueden ser una cadena codificante o una cadena no codificante (anti - sentido) .
En ciertas modalidades, los polinucleotidos se aislan. En ciertas modalidades los polinucleotidos son sustancialmente puros.
La" invención proporciona un polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada de un grupo consistente de sec. con núm. de ident.: 4, 10, 11, 41, 42, y 88-103. Se proporciona también un polinucleótido que codifica para un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96% al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% de una identidad de secuencia con las sec. con núm. de ident . : 4, 10, 11, 41, 42, y 88-103.
Los polinucleotidos de sec. con núm. de ident.: 5, 14, y 15 comprenden la secuencia que codifica para el dominio variable de una cadena pesada Movl9hu , el dominio variable de una cadena ligera versión 1.00, y el dominio variable de una cadena ligera versión 1.60, respectivamente.
La invención proporciona además un polinucleótido que comprende una secuencia que se selecciona de un grupo consistente de las sec. con núm. de ident.: 5, 14, 15, 37, 38, 43, 44, 47, 48, y 120-127. Se incluye también un polinucleótido que tiene al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96% , al menos aproximadamente 97% al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia con las 'sec. con núm. de ident.: 5, 14, 15, 37, 38, 43, 44, 47, 48, y 120-127. De este modo, en ciertas modalidades, el polinucleótido comprende (a) un polinucleótido que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident: 5, y/o (b) un polinucleótido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia con las sec. con núm. de ident.: 14 ó 15. En ciertas modalidades, el polinucleótido comprende (a) un polinucleótido que tiene la secuencia de aminoácido de sec. con núm. de ident: 5, y/o (b) un polinucleótido que tiene la secuencia de aminoácido de sec. con núm. de ident.: 14 ó sec. con núm. de ident.: 15.
En ciertas modalidades, los polinucleótidos comprenden la secuencia que codifica para el polipéptido maduro que se fusiona en el mismo marco de lectura a un polinucleótido que ayuda, por ejemplo, en la expresión y secreción de un polipéptido desde una célula huésped (por ejemplo una secuencia líder que funciona tal como una secuencia secretora para controlar el transporte del polipéptido desde la célula) . El polipéptido que tiene una secuencia líder es una pre-proteína y puede tener una secuencia líder escindida por la célula huésped para formar la forma madura del polipéptido. Los polinucleótidos pueden codificar también para una pro-proteína que es la proteína madura además de unos residuos de aminoácidos adicionados al extremo 5'. Una proteína madura que tiene una pro-secuencia es una pro-proteína y es una forma inactiva de la proteína. Una vez que la pro-secuencia se escinde, permanece la proteína madura activa .
En ciertas modalidades los polinucleótidos comprenden la secuencia que codifica para el polipéptido maduro que se fusiona en el mismo marco de lectura a una secuencia marcadora que permite, por ejemplo, la purificación del polipéptido codificado. Por ejemplo, la secuencia marcadora puede ser una etiqueta de hexa-histidinas suministrada por el vector pQE-9 para proporcionar la purificación del polipéptido maduro fusionado con el marcador en el caso de un huésped bacteriano, o la secuencia marcadora puede ser una etiqueta de hemaglutinina (HA) derivada de la proteína hemaglutinina de la influenza, cuando se usa un huésped de mamífero (por ejemplo células COS-7).
La presente invención se refiere además a las variantes de los polinucleótidos codificantes descritos anteriormente en este documento, por ejemplo, fragmentos, análogos y derivados .
Las variantes de polinucleótidos pueden contener alteraciones en las regiones codificantes, en las regiones no codificantes, o en ambas. En algunas modalidades, las variantes de polinucleótidos contienen alteraciones que producen sustituciones silentes, adiciones o eliminaciones, pero no alteran las propiedades o actividades del polipéptido codificado. En algunas modalidades, las variantes de nucleótidos se producen por sustituciones silentes debido a la degeneración del código genético. Las variantes polinucleótidas pueden se producen por una variedad de razones, por ejemplo para optimizar la expresión del codón para un huésped en particular (los cambios de codones en el ARNm humano a aquellos de preferencia por el huésped bacteriano tal como la E.coli) .
Los vectores y células que comprenden los polinucleótidos descritos en este documento se proporcionan también .
V. Métodos de uso y composiciones farmacéuticas.
Los agentes de unión al FOLR-1 (que incluyen anticuerpos, inmunoconj ugados y polipéptidos ) de la invención son útiles en una variedad de aplicaciones que incluyen, pero no se limitan a, los métodos de tratamiento terapéutico, tal como el tratamiento del cáncer. En ciertas modalidades, los agentes son útiles para inhibir el crecimiento tumoral, inducir la diferenciación, reducir el volumen tumoral, y/o reducir la malignidad de un tumor. Los métodos de uso podrían ser métodos in vitro, ex vivo, o in vivo. En ciertas modalidades, el agente de unión al F0LR1, o el anticuerpo o el inmunoconjugado, o el polipéptido es un antagonista del F0LR1 humano, al que este se une.
En un aspecto, los anticuerpos anti-FOLRl y los inmunoconjugados de la invención son útiles para detectar la presencia de F0LR1 en una muestra biológica. El término "detectar" como se usa en este documento incluye la detección cuantitativa o cualitativa. En ciertas modalidades, una muestra biológica comprende una célula o un tejido. En ciertas modalidades, tales tejidos incluyen tejidos normales o cancerosos que expresan el F0LR1 a niveles superiores en relación a otros tejidos. En ciertas modalidades la sobreexpresión de F0LR1 detecta la presencia del cáncer de ovario, del cáncer de pulmón, del cáncer de cerebro, del cáncer de mama, del cáncer uterino, del cáncer renal y del cáncer pancreático.
En un aspecto, la invención proporciona un método para detectar la presencia de F0LR1 en una muestra biológica. En ciertas modalidades, el método comprende contactar la muestra biológica con un anticuerpo anti-FOLRl bajo condiciones permisivas para la unión del anticuerpo anti-FOLRl a F0LR1, y detectar si un complejo se forma entre el anticuerpo anti- FOLRl y FOLRl.
En un aspecto, la invención proporciona un método para diagnosticar un trastorno asociado a una expresión incrementada de FOLRl. En ciertas modalidades, el método comprende contactar una célula de prueba con un anticuerpo anti-FOLRl, determinar el nivel de expresión (ya sea de forma cuantitativa o cualitativa) de FOLRl por la célula de prueba para detectar la unión del anticuerpo anti-FOLRl a FOLRl; y comparar el nivel de expresión de FOLRl en la célula de prueba con el nivel de expresión de FOLRl por una célula control (por ejemplo, una célula normal de origen de tejido similar a la célula de prueba, o una célula que expresa FOLRl a niveles comparables al de una célula normal) donde un nivel de expresión superior de FOLRl por la célula de prueba cuando se compara con la célula control indica la presencia de un trastorno asociado a la expresión aumentada de FOLRl. En ciertas modalidades, la célula de prueba se obtiene de un individuo sospechoso de tener un trastorno asociado a la expresión incrementada de FOLRl. En ciertas modalidades, el trastorno es un trastorno proliferativo celular, tal como un cáncer o un tumor.
En ciertas modalidades, un método para el diagnóstico o detección, tal como aquellos descritos anteriormente, comprende detectar la unión del anticuerpo anti-FOLRl a FOLRl que se expresa en la superficie de una célula o en una preparación de una membrana que se obtiene de una célula que expresa F0LR1 en su superficie. En ciertas modalidades, el método comprende contactar una célula con un anticuerpo anti-F0LR1 bajo condiciones permisivas para la unión del anticuerpo anti-FOLRl con F0LR1 en la superficie celular. Un ensayo de ejemplo para detectar la unión de un anticuerpo anti-FOLRl a F0LR1 que se expresa en la superficie de una célula es un ensayo "FACS".
Otros métodos determinados se pueden usar para detectar la unión de anticuerpos anti-FOLRl al FOLR1. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, los ensayos de unión al antigeno que son bien conocidos en la técnica tal como inmunotransferencias, radioinmunoensayos , ELISA (ensayo de inmunoabsorción enlazado a enzima), inmunoensayos "sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, inmunoensayos de fluorescencia, inmunoensayos de proteina A e inmuno histoquimica (IHC).
En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-FOLRl se marcan. Los mareajes incluyen, pero no se limitan a, los mareajes o porciones que se detectan directamente (tales como los mareajes fluorescentes, cromofóricos , electro-densos, quimioluminiscentes, y radioactivos) , asi como las porciones, tal como las enzimas o los ligandos, que se detectan indirectamente por ejemplo, a través de una reacción enzimática o una interacción molecular.
En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-FOLRl se inmovilizan sobre una matriz insoluble. La inmovilización implica separar los anticuerpos anti-FOLRl de cualquier FOLRl que permanezca libre en la solución. Esto convencionalmente se logra ya sea por la insolubilización del anticuerpo anti-FOLRl antes del procedimiento del ensayo, como por absorción a una matriz o superficie insoluble en agua ( (Bennich y otros, patente de EE.UU. núm. 3,720,760), o por acoplamiento covalente (por ejemplo mediante el entrecruzamiento con glutaraldehido) , o por la insolubilización del anticuerpo anti-FOLRl después de la formación de un complejo entre el anticuerpo anti-FOLRl y FOLRl, por ejemplo, por inmunoprecipitación .
Cualquiera de las modalidades de anteriores de diagnóstico o la detección se podrían llevar a cabo usando un inmunoconjugado de la invención en lugar de o además con un anticuerpo anti-FOLRl.
En ciertas modalidades, la enfermedad que se trata con el agente de unión al FOLRl o antagonista (por ejemplo un anticuerpo Movl9hu o inmunoconjugado) es un cáncer. En ciertas modalidades, el cáncer se caracteriza por tumores que expresan el receptor 1 de folato que se une al agente de unión FOLRl (por ejemplo, anticuerpo) .
La presente invención proporciona los métodos para tratar el cáncer que comprende administrar de una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de unión al F0LR1 a un sujeto (por ejemplo un sujeto con necesidad de tratamiento) . En ciertas modalidades, el cáncer es un cáncer seleccionado de un grupo consistente de cáncer colorrectal, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de mama, cáncer de cerebro, cáncer de riñon, cáncer de próstata, cáncer gastrointestinal, melanoma, cáncer cérvico, cáncer de vejiga, glioblastoma, cáncer de cabeza y cuello. En ciertas modalidades, el cáncer es un cáncer de ovario. En ciertas modalidades el cáncer es un cáncer de pulmón. En ciertas modalidades el sujeto es un humano.
La presente invención proporciona además los métodos para inhibir el crecimiento tumoral usando los anticuerpos u otros agentes descritos en este documento. En ciertas modalidades, el método para inhibir el crecimiento tumoral comprende contactar in vi tro la célula con un agente de unión a F0LR1 (por ejemplo el anticuerpo) . Por ejemplo, una línea celular inmortalizada o una línea celular de cáncer que expresa F0LR1 se cultiva en el medio al que se le adiciona el anticuerpo u otro agente para inhibir el crecimiento tumoral. En algunas modalidades, las células del tumor se aislan de una muestra de paciente tal como, por ejemplo, una biopsia de tejido, efusión pleural o muestra de sangre, y se cultivan en un medio al que se le adiciona un agente de unión al F0LR1 para inhibir el crecimiento tumoral.
En algunas modalidades, el método para inhibir el crecimiento tumoral comprende contactar in vivo el tumor o las células tumorales con el agente de unión FOLRl (por ejemplo el anticuerpo) . En ciertas modalidades, contactar un tumor o una linea celular de tumor con el agente de unión a FOLRl se aborda en un modelo animal. Por ejemplo, los agentes de unión a FOLRl se pueden administrar a xenoinjertos gue expresan uno o más de los FOLRl que se crecen en ratones inmuno comprometidos (por ejemplo, ratones NOD/SCID) para inhibir el crecimiento tumoral. En algunas modalidades células madres de cáncer se aislan de una muestra de paciente tal como por ejemplo, una biopsia de tejido, una efusión pleural, o muestra de sangre y se inyectan en ratones inmunocomprometidos a los que se le administran después un agente de unión a FOLRl para inhibir el crecimiento tumoral. En ciertas modalidades el agente de unión FOLRl se administra al mismo tiempo o poco tiempo después de la introducción de las células tumorigénicas dentro del animal para prevenir el crecimiento tumoral. En algunas modalidades, el agente de unión al FOLRl se administra como un terapéutico, después de que las células tumorales han crecido hasta un tamaño especifico .
En ciertas modalidades, el método para inhibir el crecimiento tumoral comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del agente de unión al FOLRl. En ciertas modalidades el sujeto es un humano. En ciertas modalidades, el sujeto tiene un tumor o tuvo un tumor eliminado .
En ciertas modalidades, el tumor expresa el receptor del folato al que el agente de unión al FOLRl o el anticuerpo se unen. En ciertas modalidades, el tumor sobreexpresa el FOLRl humano .
En ciertas modalidades, el tumor es un tumor seleccionado del grupo consistente de tumor cerebral, tumor colorrectal, tumor pancreático, tumor de pulmón, tumor de ovario, tumor de hígado, tumor de mama, tumor de riñon, tumor de próstata, tumor gastrointestinal, melanoma, tumor cervical, tumor de vejiga, glioblastoma y tumor de cabeza y cuello. En ciertas modalidades, el tumor es un tumor de ovario .
Además, la invención proporciona un método para reducir la malignidad de un tumor en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva del agente de unión al FOLRl. En ciertas modalidades, el tumor comprende células madres de cáncer. En ciertas modalidades, la frecuencia de células madres de cáncer en el tumor es reducida por la administración del agente.
De este modo, en ciertas modalidades las invenciones proporcionan los métodos para tratar el cáncer usando el anticuerpo - Movl9hu e inmunoconj ugados . En ciertas modalidades, el inmunocon ugado Movl9hu es Movl9hu-SPDB-DM ; Movl9hu-sulfo-SPP-DMl; Movl9hu-SPP-D l; o Moví 9hu-PEG4 -Mal-DM4.
La invención proporciona además los métodos de diferenciación de células tumorales en células no tumorales que comprenden contactar las células tumorales con un agente de unión al FOLRl (por ejemplo, administrar el agente de unión al FOLRl a un sujeto que tiene un tumor que comprende las células tumorales o que tuvo un tumor eliminado) . En ciertas modalidades, las células tumorales son células de tumor de ovario.
La presente invención proporciona además los métodos para reducir la activación de los miofibroblastos en el estroma de un tumor sólido, que comprende contactar el estroma con una cantidad eficaz del agente de unión al FOLRl, polipéptido o anticuerpo.
La presente invención proporciona además las composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los agentes de unión al FOLRl que se describen en este documento. En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas además comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones farmacéuticas encuentran uso al inhibir el crecimiento tumoral y tratar el cáncer en los pacientes humanos.
En ciertas modalidades, las formulaciones se preparan para su almacenamiento y uso por la combinación de un anticuerpo purificado o agente de la presente invención, con un vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, portador, excipiente) (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20ma Edición Mack Publishing, 2000) . Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, tampones no tóxicos tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; sales tal como el cloruro de sodio; antioxidantes que incluyen el ácido ascórbico y metionina; preservativos (por ejemplo cloruro de amonio octadecildimetilbencilo; cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio, fenol, butil o bencil alcohol; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno, catecol, resorcinol; ciclohexanol; 3 pentanol y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (por ejemplo, menos que aproximadamente 10 residuos de aminoácidos) ; proteínas tales como la albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílicos tal como el polivinil pirrolidona; aminoácidos tales como la glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; carbohidratos tal como monosacáridos, disacáridos, glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tal como el EDTA, azúcares tal como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contra iones que forman sales tal como sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos de Zn-proteína) ; y surfactantes no iónicos tal como el T EEN o polietilenglicol (PEG) .
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar por cualquier número de maneras ya sea por tratamiento local o sistémico. La administración puede ser tópica (tal como una membrana mucosal que incluye la entrega vaginal y rectal) tales como parches transdérmicos, ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, líquidos y polvos; pulmonar (por ejemplo por la inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, que incluyen nebulizador, intratraqueal, intranasal, epidérmico y transdérmico) ; oral; o parenteral, que incluyen inyección o infusión intravenosa, intra arterial, subcutánea, intraperitoneal, o intramuscular; o administración intracraneal (por ejemplo, intratecal o intraventricular ) .
Un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención se puede combinar en una formulación de combinación farmacéutica, o régimen de dosificación tal como terapia de combinación, con un segundo compuesto que tiene propiedades anticancerigenas . El segundo compuesto de una formulación de combinación farmacéutica o régimen de dosificación tiene de preferencia actividades complementarias al ADC de la combinación tal que ellos no se afecten adversamente uno a otro. Las composiciones farmacéuticas que comprenden el agente de unión F0LR1 y el segundo agente contra el cáncer se proporcionan también .
Para el tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada de un anticuerpo o un agente de la presente invención depende del tipo de enfermedad a ser tratada, la gravedad y el curso de la enfermedad, la sensibilidad de la enfermedad, si el anticuerpo o el agente se administra para propósitos terapéuticos o preventivos, previo a la terapia, la historia clínica del paciente, y así sucesivamente a juicio del médico que trata la enfermedad. El anticuerpo o agente se puede administrar una vez o en una serie de tratamientos que duran de varios días a varios meses, o hasta que ocurra la cura o se logre una disminución del estado de la enfermedad (por ejemplo la reducción del tamaño tumoral) . Los esquemas de dosificación óptimos se pueden calcular a partir de las mediciones de la acumulación del fármaco en el cuerpo del paciente y variarán en dependencia de la potencia relativa de un anticuerpo o agente individual. El médico que la administra puede fácilmente determinar las dosis óptimas, las metodologías de dosificación y las tasas de repetición. En ciertas modalidades la dosis es de 0.01 pg a 100 mg por kg de peso corporal y se pueden dar una vez o más diariamente, semanalmente, mensualmente o anualmente. En ciertas modalidades un anticuerpo u otro agente de unión al FOLR1 se administra una vez cada dos semanas o una vez cada tres semanas. En ciertas modalidades, la dosis del anticuerpo u otro agente de unión al F0LR1 es de aproximadamente de 0.1 mg a aproximadamente 20 mg por kg de peso corporal. El médico que trata al sujeto puede estimar las tasas de repetición por dosis basado en la medición de los tiempos de residencia y las concentraciones del fármaco en los fluidos o tejidos corporales .
La terapia de combinación puede proporcionar "sinergia" y probar "sinergismo", es decir el efecto logrado cuando los ingredientes activos se usan juntos es mayor que la suma de los efectos que resultan al usar los compuestos por separados. Un efecto sinérgico se puede obtener cuando los ingredientes activos se: (1) co-formulan y administran o entregan simultáneamente en una formulación combinada de dosis unitaria, (2) entregan de manera alterna o en paralelo como las formulaciones separadas; o (3) por cualquier otro régimen. Cuando se entrega en una terapia alternativa, un efecto sinérgico se puede obtener cuando los compuestos se administran o entregan de forma secuencial, por ejemplo por diferentes inyecciones en jeringuillas separadas. En general, durante la terapia alternativa, una dosis eficaz de cada ingrediente activo se administra de forma secuencial, es decir, consecutivamente, mientras en una terapia combinada, las dosis eficaces de dos o más ingredientes activos se administran juntas.
VI. Kits que comprenden los agentes de unión al FOLRl La presente invención proporciona los kits que comprenden los anticuerpos, los inmunoconjugados, u otros agentes descritos en este documento y se pueden usar para realizar los métodos que se describen en este documento. En ciertas modalidades un kit comprende al menos un anticuerpo purificado contra el receptor 1 de folato humano en uno o más contenedores. En algunas modalidades, los kit comprenden todos los componentes necesarios y/o suficientes para realizar un ensayo de detección, que incluyen todos los controles, instrucciones para realizar las mediciones, y algún programa necesario para el análisis y presentación de los resultados. Una persona con conocimiento en la técnica, reconocerá fácilmente que los anticuerpos que se describen, los inmunoconjugados y otros agentes de la presente invención se pueden incorporar fácilmente dentro de uno de los formatos de los kit establecidos que se conocen bien en la técnica.
Se proporcionan además los kits que comprenden el agente de unión al FOLRl (por ejemplo, un anticuerpo de unión FOLRl) asi como un segundo agente contra el cáncer. En ciertas modalidades, el segundo agente contra el cáncer es un agente quimioterapéutico (por ejemplo gemcitabina o irinotecan) .
Las modalidades de la presente descripción se pueden definir además como referencia para los siguientes ejemplos no limitativos, que describen en detalle la preparación de anticuerpos determinados de la presente descripción y los métodos para usar los anticuerpos de la presente descripción. Será evidente para aquellas personas con conocimiento en la técnica que muchas modificaciones, tanto para materiales como para los métodos, se pueden practicar sin desviar el alcance de la presente descripción.
EJEMPLOS Se entiende que los ejemplos y modalidades descritas en la presente son sólo para fines ilustrativos y que varias modificaciones o cambios a la luz del mismo se sugieren a las personas con experiencia en la materia y se incluirán en el espíritu y alcance de esta solicitud.
Ejemplo 1 Quimerización del anticuerpo monoclonal murino Movl9 Las secuencias de aminoácidos de la región variable de ovl9 se obtuvieron de la base de datos NCBI (accesos CAA68253 para una cadena ligera (sec.con núm. de ident.: 24) y CAA68252 para una cadena pesada (sec.con núm. de ident.: 23)) y a continuación se optimizó codones y se sintetizaron por Blue Heron Biotechnology . La región variable de cadena ligera se clonó en los sitios EcoRI y BsiWI del plásmido pAbKZeo y la región variable de cadena pesada se clonó en los sitios HindIII y Apal del plásmido pAbGINeo.
Ejemplo 2 Humanización de los anticuerpos monoclonales murinos Movl9 y FR1-21 El anticuerpo Movl9 se humanizó siguiendo los métodos de rediseño de la superficie de las regiones de marco descritos anteriormente (Roguska M. y otros, Proc. Nati. Acad. Sci . Estados Unidos, Febrero 1994; 91:969-973) y (Roguska y otros, Protein Eng. 9 (10) : 895-904 (1996)). En resumen, la accesibilidad al solvente promedio de cada residuo de la región de marco de región variable, se calculó mediante el uso de las estructuras resueltas de anticuerpos estrechamente relacionados de la base de datos PDB, y las posiciones con más de un 30% de accesibilidad promedio se marcaron como residuos en la superficie (Pedersen J.T. y otros, J. Mol. Biol. 1994; 235: 959-973). La superficie de la secuencia humana de reemplazo se seleccionó por alineación de las posiciones de la superficie de las secuencias del anticuerpo murino con las correspondientes posiciones de las secuencias de la linea germinal de anticuerpos humanos en la base de datos Kabat (Johnson, G. y Wu, T. T. (2001) Nucleic Acids Research, 29: 205-206) . La superficie de la región variable de cadena ligera humana con la máxima homología (clon DPK19, IMGT locus IGKV2D-30*01 para Movl9 y IMGT locus IGKV1/0R2-0*01 para FR1-21) y superficie de la región variable de cadena pesada humana con la máxima homología (clon 8M27, IMGT locus IGHVl-69*08 para Movl9 y IMGT locus IGHV5-51*02 para FRl-21) se seleccionó para reemplazar las posiciones de la superficie de la región de marco murina de Movl9, se dejan los 6 CDR (Tabla 1) sin cambios. Las posiciones de la superficie y los residuos de Movl9 y FRl-21, murino y humano se presentan en las figuras 1A-1D.
Ninguno de los cambios de residuos suscitó problemas por afectación de las interacciones de cualquiera de las CDR de Movl9 o FRl-21 con sus epitopos objetivos en el receptor 1 de folato, asi que no se consideraron mutaciones inversas de la superficie para las secuencias humanizadas de ambos anticuerpos. La secuencia de Movl9 rediseñada sin embargo introdujo un. sitio consenso de glicosilación N en N74 de una cadena ligera (versión de una cadena ligera 1.00), por lo que una segunda versión humanizada de una cadena ligera se hizo para eliminar este sitio. Una revisión de la base de datos Kabat de secuencia de cadena ligera humana reveló que la treonina es el residuo más común que se encuentra en la posición 74 de una cadena ligera, por lo que la versión 1.60 de una cadena ligera humanizada de Movl9 se construyó con una treonina en la posición 74. La posición 74 no es un residuo de la superficie por lo que esta sustitución de residuos no tiene ningún impacto sobre la humanización mediante el rediseño de la superficie. Los alineamientos de las secuencias de región variable de Movl9 y FRl-21 murino y humanizado se presentan en las Figuras 2A-2D.
Para las secuencias de la región variable de Movl9 y FRl-21 humanizados se optimizaron los codones y se sintetizaron por Blue Heron Biotechnology . Las secuencias están flanqueadas por sitios para enzimas de restricción para facilitar la clonación en marco con las respectivas secuencias constantes en plásmidos de cadena simple para expresión en mamíferos. La región variable de cadena ligera se clonó en los sitios EcoRI y BsiWI del plásmido pAbKZeo. Los ADN de los plásmidos resultantes que codifican una cadena ligera de hu ovl9 se depositaron en la ATCC como núm. depósito de la ATCC PTA-10773 y PTA-10774 y el ADN del plásmido resultante que codifica una cadena ligera del huFRl-21 se depositó como núm. depósito de la ATCC PTA-10776. La región variable de cadena pesada se clonó en los sitios HindIII y Apal del plásmido pAbGINeo. El ADN del plásmido resultante que codifica una cadena pesada de huMovl9 se depositó en la ATCC como núm. depósito de la ATCC PTA-10772 y el ADN del plásmido resultante que codifica una cadena pesada de huFRl-21 se depositó en la ATCC como núm. depósito de la ATCC PTA-10775. Estos plásmidos, se transfectaron como se describe en el Ejemplo 3 para producir huMovl9. El plásmido que codifica cualquiera de las cadenas ligeras hu ovl9 (es decir, las que se depositaron como núm. depósito de la ATCC PTA-10773 o PTA-10774) se pueden combinar con el plásmido que codifica una cadena pesada de huMovl9 para crear un anticuerpo huMovl9 de acuerdo a los métodos dispuestos en la presente ya que son bien conocidos por alguien con experiencia en la materia.
Ejemplo 3 Expresión de anticuerpos recombinantes Las construcciones de los anticuerpos quiméricos y humanizados se produjeron de forma transitoria, ya sea en las células adherentes HEK-293T con un procedimiento estándar de fosfato de calcio (BD Biosciences, CalPhos Mammalian Transfection Kit, Cat # 631312) o en células HEK-293T adaptadas a suspensión con un procedimiento PEI modificado [Durocher Y, Perret S, Kamen A High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic Acids Res. 15 enero 2002; 30(2) :E9] en frascos de agitación. Las transfecciones transitorias PEI se realizaron como se describió previamente (Durocher, Y. y otros, Nucleic Acids Res. 30(2) :E9 (2002)), excepto que las células HEK-293T se cultivaron en Freestyle 293 (Invitrogen) y el volumen del cultivo no se diluyó después de la adición de los complejos PEI-ADN. Tanto las transíecciones transitorias adherentes como en suspensión se incubaron durante una semana y luego el sobrenadante aclarado se purificó mediante una columna de proteína A seguido de una cromatografía en una columna CM de intercambio iónico como se describe a continuación. Como se muestra en la Figura 3, la expresión de huMovl9 fue por lo menos 10 veces más alta que la expresión de Movl9 quimérico en células transíectadas .
Ejemplo 4 Purificación del anticuerpo Los anticuerpos se purificaron del sobrenadante del cultivo celular aclarado, con los métodos estándar, tales como por ejemplo la cromatografía con proteína A o G (HiTrap Proteína A o G HP, 1 mi, Amersham Biosciences) . En resumen, el sobrenadante se preparó para la cromatografía mediante la adición de 1/10 del volumen de 1 M Tris/HCl, pH 8.0. El sobrenadante con pH ajustado se filtró a través de una membrana de filtración de 0.22 m y se carga en la columna equilibrada con amortiguador de unión (PBS, pH 7.3). La columna se lavó con amortiguador de unión hasta que se obtuvo una línea de base estable sin absorbancia a 280 nm. El anticuerpo se eluyó con amortiguador 0.1 M de ácido acético que contiene 0.15 M de NaCl, pH 2.8, con un flujo de 0.5 ml/min. Las fracciones de aproximadamente 0.25 mi se recogieron y neutralizaron por la adición de 1/10 del volumen de 1 M Tris-HCl, pH 8.0. La fracción máxima (s) se dializó durante la noche dos veces contra PBS lx y se esterilizó por filtración a través de una membrana de filtración de 0.2 µp?. El anticuerpo purificado se cuantificó mediante la absorbancia a ?28?· Las fracciones purificadas con la proteina A se purificaron adicionalmente mediante el uso la cromatografía de intercambio iónico (IEX) con la cromatografía con carboximetilcelulosa (CM) . En resumen, a muestras de la purificación con proteína A se les cambió el amortiguador a amortiguador de inicio (fosfato de potasio 10 mM, cloruro de sodio 10 mM, pH 7.5) y se filtró a través de 0.22 \im archivador. La muestra preparada se cargó a continuación sobre una resina CM de flujo rápido (GE Lifesciences ) gue se equilibró con el amortiguador de inicio, a un flujo de 120 cm/hr. El tamaño de la columna se eligió para tener capacidad suficiente para enlazar a todos los anticuerpos de la muestra. La columna se lavó con amortiguador de unión hasta que se obtuvo una línea de base estable sin absorbancia a 280 nm. El anticuerpo se eluyó mediante el inicio de un gradiente de cloruro de sodio de 10 mM a 500 mM en 20 volúmenes de columna (CV) . Se recogieron las fracciones con la lectura UV por encima de 50 mAu del pico principal. La pureza (el porcentaje de monómero y agregados solubles de alto peso molecular) se evaluó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) en un gel TSK G3000SWXL, 7.8 ? 300 mm, con una columna de seguridad SWXL, 6.0 ? 40 mm (Tosoh Bioscience, Montgomeryville, PA) mediante el uso de un sistema Agilent HPLC 1100 (Agilent, Santa Clara, CA) . Las fracciones con la pureza deseada (> 95%) se agruparon, el amortiguador se cambió por PBS (pH 7.4) mediante el uso del sistema TFF, y esterilizado por filtración a través de una membrana de filtración de 0.2 im. El anticuerpo purificado se examinó adicionalmente por su pureza mediante la SEC y la concentración de IgG se determinó por medición de la absorbancia a 280 nm mediante el uso de un coeficiente de extinción de 1.47. La dilución se hizo cuando fue necesaria. Por otra parte, la hidroxiapatita cerámica (CHT) se puede usar para pulir los anticuerpos tanto murino como humanizado con una mayor selectividad. La resina CHT de Tipo II con 40 µt?. de tamaño de partícula (Bio-Rad Laboratories) se aplicó a los anticuerpos pulidos con un protocolo similar a la cromatografía de IEX. El amortiguador de inicio de CHT fue fosfato sódico 20 mM, pH 7.0 y el anticuerpo se eluyó con un gradiente de fosfato sódico de 20 a 160 mM por encima de 20 CV.
Ejemplo 5 Desarrollo de anticuerpos murinos anti-FOLRl Hubo dos series diferentes de inmunización detección. La primera serie ha dado lugar a la generación del clon FR1-21, la segunda serie se ha traducido en la generación de los clones FR1-48, FR1-49, FR1-57 y FR1-65. En la primera serie los ratones se inmunizaron por vía subcutánea con aproximadamente 5xl06 células KB que expresan FOLRl (American Tissue Culture Collection, ATCC CCL-17) . En la segunda serie las células 300-19 que expresan FOLRl humano en su superficie fueron usadas para inmunizar ratones. Para hacer estas células, la secuencia de aminoácido humano FOLRl se obtuvo del sitio web de la NCBI (acceso NP_057937), luego se le optimizaron los codones y fue sintetizada por Blue Heron biotechnologies, flanqueada por sitios de restricción EcoRI y Xbal para facilitar la clonación en el vector de expresión mamífero pSRa. Las células 300-19, una linea celular pre-B derivada de un ratón Balb/c (Reth et al., Nature, 317:353-355 (1985) ) , se transfectaron con el plásmido de expresión pSRa-FolRl para expresar de forma estable en la superficie celular altos niveles de FOLRl humano. Los protocolos estándar de inmunización conocidos por aquellos con experiencia, por ejemplo, como los usados en ImmunoGen, Inc. se aplicaron para ambas series. Los ratones inmunizados con antigeno se retaron tres dias antes de ser sacrificados para la generación de hibridomas. Los bazos de los ratones se recogieron de acuerdo a los protocolos estándares de los animales, como, por ejemplo, moler el tejido entre dos portaobjetos microscópicos helados estériles, para obtener una suspensión de células individuales en medio RPMI-1640. Las células del bazo se centrifugaron, se sedimentaron, se lavaron, y se fundieron con un mieloma murino, tal como, por ejemplo, células P3X63Ag8.653 (Kearney y otros, J. Immunol., 123:1548-1550 (1979)) mediante polietilenglicol-1500 (Roche 783 641) . Las células fundidas se resuspendieron en medio de selección RPMI-1640 que contiene hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) (Sigma, H-0262) y se seleccionaron para el crecimiento en placas de cultivo de 96 pocilios de fondo plano (Corning-Costar 3596, 0.2 mi de suspensión celular por pocilio) a 37° C con C02 al 5%. Después de 5 días de incubación, 0.1 mi de sobrenadante de cultivo se retiró de cada pocilio y se reemplazó con 0.1 mi de RPMI-1640 que contiene el suplemento de hipoxantina-timidina (HT) (Sigma, H-0137) . La incubación a 37° C con C02 al 5% se continuó hasta que los clones de hidridomas estaban listos para la detección de anticuerpos. Otras técnicas de inmunización y producción de hibridomas también se pueden usar, se incluyen las descritas en Langone y otros (Eds., " Immunochemical Techniques, Part I", Methods in Enzymology, Academic Press, volumen 121, Florida) y Harlow y otros ( "Ant ibodies : A Laboratory Manual"; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1988)).
Tabla IB: Se proporcionan las CDR de cadena pesada y ligera de FR1-48, 49, 57, y 65. La definición de Kabat para la CDR2 de cadena pesada se da también para los anticuerpos murino y humano .
Ejemplo 6 Detección y selección de hibridoma Las células FOLR1-300-19 transfectadas con FOLRl humano y las células KB se usan en la primera y segunda series de detecciones correspondientemente. Los sobrenadantes de cultivo de los hibridomas se seleccionaron por citometria de flujo para la secreción de anticuerpos monoclonales que se unen a células positivas a F0LR1, tales como células 300-19 que expresan F0LR1 o células KB, pero no a las células negativas a FOLR1, tales como células 300-19 no transfectadas . 0.1 mi de sobrenadante del hibridoma se incubó durante 3 horas, ya sea con células FOLRl-positivas o células 300-19 no transfectadas (1 xlO5 células por muestra) en 0.1 mi de amortiguador FACS (medio RPMI-1640 suplementado con 2% de suero normal de cabra) . Después, las células se centrifugaron, se sedimentaron, se lavaron y se incubaron durante 1 hora con 0.1 mi de un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado con PE (tal como los obtenidos de, por ejemplo, el Laboratorio Jackson, 6 ug/ml en amortiguador FACS) . Las células se centrifugaron, se sedimentaron de nuevo, se lavaron con amortiguador FACS y se resuspendieron en 0.2 mi de PBS con formaldehido al 1%. La fluorescencia asociada a la célula se midió usando un citómetro de flujo FACSCalibur con el muestreador multipocillos HTS o con un citómetro de flujo FACSArray y se analizaron mediante CellQuest Pro (todos de BD Biosciences, San Diego, Estados Unidos) . Los clones de hibridomas positivos se subclonaron por dilución limitante. Un subclon de cada hibridoma, el cual mostró la misma reactividad contra FOLR1 que las células párenteles por citometría de flujo, se eligió para su posterior análisis. Los subclones estables se cultivaron y el isotipo de cada anticuerpo anti-FOLRl secretado se identificó usando los reactivos comerciales para isotipaje (Roche 1493027) . Los anticuerpos murinos se purificaron con proteina A a partir de los medios de cultivo de hibridomas aclarados como se describe anteriormente. Estos anticuerpos se designaron como anticuerpos FR-1.
Ejemplo 7 Purificación del anticuerpo monoclonal murino Los anticuerpos se purificaron a partir de sobrenadantes de subclones de hibridomas mediante el uso de métodos estándares, tales como, por ejemplo la cromatografía por proteína A o G (HiTrap Proteína A o G HP, 1 mi, Amersham Biosciences) . En resumen, el sobrenadante se preparó para la cromatografía mediante la adición de 1/10 del volumen de 1 M Tris/HCl, pH 8.0. El sobrenadante con pH ajustado se filtró a través de una membrana de filtración de 0.22 pm y se cargó en la columna equilibrada con amortiguador de unión (PBS, pH 7.3). La columna se lavó con amortiguador de unión hasta que se obtuvo una línea de base estable sin absorbancia a 280 nm. El anticuerpo se eluyó con amortiguador 0.1 M de ácido acético que contiene 0.15 M de NaCl, pH 2.8, con un flujo de 0.5 ml/min. Las fracciones de aproximadamente 0.25 mi se recogieron y neutralizaron por la adición de 1/10 del volumen de 1 M Tris-HCl, pH 8.0. La fracción máxima (s) se dializó durante la noche dos veces contra PBS lx y se esterilizó por filtración a través de una membrana de filtración de 0.2 µ?a. El anticuerpo purificado se cuantificó mediante la absorbancia a A28o.
Ejemplo 8 Caracterización de la unión, por citometria de flujo La especificidad de unión se comprobó por citometria de flujo mediante el uso de anticuerpos purificados. Los histogramas de FACS que demuestran la unión de anticuerpos anti-FOLRl a las células 300-19 que expresan FOLR1 y la ausencia de unión a las células 300-19 parentales se muestran en la Figura . Cada anticuerpo se incubó durante 3 horas con las células 300-19 que expresan FOLRl o con las células 300-19 no transfectadas (lxlO5 células por muestra) en 0.1 mi de amortiguador FACS (medio RPMI-1640 suplementado con 2% de suero de cabra normal) . Después, las células se sedimentaron, se lavaron y se incubaron durante 1 hora con 0.1 mi de un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado con FITC (tal como los que se pueden obtener a partir de, por ejemplo, el Laboratorio Jackson, 6 µg/ml en amortiguador FACS) . Las células se sedimentaron nuevamente, se lavaron con amortiguador FACS y resuspendieron en 200 µ? de PBS con formaldehído al 1%. Las muestras se obtuvieron mediante el uso de un citómetro de flujo FACSCalibur con el muestreador multipocillos HTS o un citómetro de flujo FACSArray y se analizaron mediante CellQuest Pro (todos de BD Biosciences, San Diego, Estados Unidos) . Los histogramas de FACS de los anticuerpos anti-FOLRl mostraron un cambio de fluorescencia, mientras que las células 300-19 parentales no. Además, ningún cambio significativo de fluorescencia se detectó cuando cualquiera de las lineas celulares se incubó sólo con un anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado con FITC solo.
Ejemplo 9 Clonación y secuenciación de las regiones VL y VH de muFRl-21 El ARN celular total se preparó a partir de 5xl06 células del hibridoma mediante el uso de un kit de RNeasy (QIAGEN) según el protocolo del fabricante. El ADNc se sintetizó posteriormente partir de ARN total mediante el uso del kit de síntesis de ADNc, SuperScript II (Invitrogen) . El procedimiento para la primera ronda de reacción de PCR degenerado sobre el ADNc derivado de células de hibridoma se basó en los métodos descritos en Wang y otros ( (2000) J Immunol Methods . 13 enero; 233 (1-2) : 167-77) y Co y otros, ((1992) J Immunol. 15 febrero; 148 (4) : 1149-54) . Las secuencias de VH se amplificaron por PCR mediante el uso de los siguientes cebadores degenerados: EcoMHl CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC (sec. con núm. de ident . : 50) £coMH2 CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG (sec. con núm. de ident.: 51) y BamIgGl GGAGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC (sec. con núm. de ident . : 52) . Las secuencias de la VL se amplificaron por PCR mediante el uso de los siguientes cebadores degenerados: SacIMK GGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA (sec. con núm. de ident. : 53) y HindKL TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC (sec. con núm. de ident.: 54). (Bases mixtas se definen como sigue: N=G+A+T+C, S=G+C, Y=C+T, M=A+C, R=A+G, W=A+T) .
Las mezclas de reacción de PCR se corrieron en un gel de 1% de agarosa de baja fusión, las bandas de 300-400 pb se cortaron, se purificaron mediante el uso de mini columnas de ADN Zymo, y se enviaron a Agencourt Biosciences para la secuenciación . Los respectivos cebadores de PCR 5 'y 3' se usaron como cebadores de secuenciación para generar el ADNc de la región variable de ambas direcciones. Las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL se obtuvieron mediante la traducción del ADN resultado de la secuenciación con el software VectorNTI.
Para identificar artefactos de la secuenciación con el cebador del extremo 5' en las secuencias preliminares del ADNc de la región variable, el sitio NCBI IgBlast (www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) se usó para la búsqueda de las secuencias de la linea germinal de ratón de la que se derivaron las secuencias del anticuerpo. Las secuencias limpias de la región variable se combinaron con las secuencias de referencia NCBI para las regiones constantes de anticuerpos específicos para ensamblar' secuencias de longitud completa del anticuerpo murino. El peso molecular de las cadenas murinas ligeras y pesadas de Frl-21 esperadas se calcularon y compararon con la masa medida por cromatografía líquida/análisis espectrofotométrico de masa (LC/MS) . La cadena pesada FR1-21 murina coincidió con la masa medida, pero para la cadena ligera se requirió un esfuerzo de secuenciación de la secuenciación para determinar la secuencia del extremo 5'. El cebador de PCR CD37-lLCleadl (ttttgaattcgccaccatgaagtttccttctcaacttct ) se diseñó para alinearse a la secuencia de la línea germinal vinculada al líder del anticuerpo murino de manera que esta nueva reacción de PCR diera una secuencia de ADNc de la región variable completa, inalterada por los cebadores. Las reacciones de PCR, las purificaciones de banda, y la secuenciación se realizaron como se describió anteriormente y la nueva secuencia completa codificó una cadena ligera que coincidió con la masa de una cadena ligera Frl-21 medida por LC/MS.
Ejemplo 10 Expresión de los anticuerpos de referencia La secuencia de aminoácidos del anticuerpo Morphotech anti-FOLRl, MorAb-003 (Farletuzumab) , se obtuvo de la lista de las Denominaciones Comunes Internacionales para sustancias farmacéuticas (DCI) de la Organización Mundial de la Salud (OMS) , y se optimizaron los codones y se sintetizaron mediante Blue Heron Biotechnology . La secuencia de la región variable de cadena ligera está flanqueada por los sitios para las enzimas de restricción EcoRI y BsiWI y la secuencia de la región variable de una cadena pesada flanqueada por los sitios para las enzima de restricción HindIII y Apal para la clonación en el marco de las respectivas secuencias constante en plásmidos de cadena simple para expresión en mamíferos. La clonación, expresión y purificación se llevaron a cabo como se describió para Movl9 y Frl-21 humanizados citados anteriormente.
Ejemplo 11 Actividad ADCC de hu ovl9 Un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) se usó para medir la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) de las lineas de células tumorales mediante el uso de células asesinas naturales humanas (NK) recién aisladas como células efectoras (por ejemplo, Shields, J. Biol. Chem. , 276 ( 9) : 6591-6604 (2001)). Las células NK se aislaron por primera vez de la sangre humana procedente de un donante normal (Research Blood Components, Inc., Brighton, MA) , mediante el uso de un protocolo modificado para el NK Isolation Kit II (Miltenyi Biotech, 130-091-152) . La sangre se diluyó dos veces con PBS lx. 25 mi de sangre diluida se colocaron cuidadosamente sobre 25 mi de Ficoll Paque en un tubo cónico de 50 mi y se centrifugó a 400 g durante 45 min a TA. Las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) se obtuvieron de la interfaz, se transfirieron a un nuevo tubo cónico de 50 mi, y se lavaron una vez con PBS lx. Las células se resuspendieron en 2 mi de amortiguador de aislamiento de NK (1 x PBS, 0.5% de BSA, EDTA 2 mM) , y de 500 µ? del cóctel anticuerpo-biotina se añadió a la suspensión de células. El cóctel anticuerpo-biotina contiene anticuerpos biotinilados que se unen a los linfocitos, a excepción de las células NK, lo que resulta en una selección negativa de las células NK. La mezcla se incubó a 4o C durante 10 minutos y a continuación se agregaron 1.5 mi de amortiguador de aislamiento de NK y 1 mi de micro perlas anti-biotina . La mezcla de anticuerpos y células se incubó durante otros 15 minutos a 4o C. A continuación, las células se lavaron una vez con 50 mi de amortiguador de aislamiento de NK y se resuspendieron en 3 mi de amortiguador de aislamiento de NK. Después, se montó una columna MACS LS en el separador de autoMACS (Miltenyi Biotech) y se pre-lavó con 3 mi de amortiguador de aislamiento de NK. La suspensión celular se aplicó automáticamente en la columna, se lavó y la fracción efluente con las células NK sin etiqueta se recogió en un nuevo tubo cónico de 50 mi. Las células NK resultantes se sembraron en 30 mi de medio RPMI completo (RPMI-1640 suplementado con suero fetal bovino al 5%, 1% de penicilina-estreptomicina, HEPES 1 mM, piruvato de sodio 1 mM, 1% de solución de aminoácidos no esenciales 100X MEM) durante la noche. El análisis posterior y todas las diluciones se realizaron en medio RHBP (medio RPMI 1640 suplementado con HEPES 20 mM, pH 7.4, 0.1% de BSA y 1% de penicilina estreptomicina) . Varias concentraciones de anticuerpos en el medio RHBP se distribuyeron por duplicado en alícuotas de 50 µ?/pocillo en una placa de 96 pocilios de fondo redondo. Las células objetivo se resuspendieron a 106 células/ml en medio RHBP y se agregaron 100 µ?/pocillo en cada pocilio que contenía diluciones del anticuerpo. La placa que contiene las células objetivo y las diluciones del anticuerpo se incubó durante 30 minutos a 37° C. Las células N se agregaron a los pocilios que contienen las células objetivo a 50 µ?/pocillo. La relación típica fue aproximadamente de 1 célula objetivo a 3-4 células NK. Por lo menos los siguientes controles se establecieron para cada experimento: células NK solas, células objetivo solas (liberación de LDH espontánea), células objetivo con células NK (liberación de LDH independiente de anticuerpo) , células objetivo con 10% de Tritón X-100 (máxima liberación de LDH) . Las mezclas se incubaron a 37° C durante 4 horas para permitir la lisis celular. Las placas se centrifugaron durante 10 minutos a 1200 rpm, y 100 µ? del sobrenadante se transfirió cuidadosamente a una nueva placa de 96 pocilios de fondo plano. La mezcla de reacción de la LDH (100 µ?/pocillo) del Kit de detección de la citotoxicidad (Roche 1 644 793) se añadió a cada pocilio y se incubó a temperatura ambiente durante 5 a 30 min. La densidad óptica de las muestras se midió a 490 nm (OD490) . El porciento de lisis especifica de cada muestra se determinó mediante el uso de la siguiente fórmula: porciento de lisis especifica = (valor de la muestra liberación espontánea) / (liberación máxima - liberación espontánea) *100.
La incubación con huMovl9 condujo a una buena actividad ADCC contra las células IGROV-1 en presencia de las células efectoras NK. La actividad ADCC en las células IGROV-1 se comparó para huMovl9, huFR-1-21, Mor003 y chTKl (control de isotipo) (Figura 6). El tratamiento con 0.9 ng/ml de huMovl9 resultó en aproximadamente 30% de lisis de las células IGROV-1, similar a la actividad que se observó con los otros anticuerpos anti-FOLRl. La actividad ADCC para huMovl9 tuvo una EC50 de 0.20 ng/ml, huFr-1-21 tuvo una ECs0 de 0.11 ng/ml, Mor003 de 0.16 ng/ml y chTKl no mostró ninguna actividad en contra las células IGROV-1.
Ejemplo 12 Preparación de inmunoconjugados anti-FOLRl Preparación de huM0V19vl .6-sulfo-SPDB-DM4 El ligando ejemplar 2-sulfo-SPDB se disolvió en DMA. El anticuerpo huMOV19vl.6 se incubó a 8 mg/ml con un exceso molar de 12 veces el ligando 2-sulfo-SPDB durante aproximadamente 2 horas a 25° C a pH 7.5. La mezcla de reacción se purificó mediante el uso de una columna de Sephadex™ G25F equilibrado con 50 mM de amortiguador fosfato de potasio que contiene NaCl 50 mM, EDTA 2 mM, pH 6.5. El maitansinoide DM4 se disolvió en dimetilacetamida (DMA, la concentración final es de 5%) y un exceso molar de 1.7 veces en comparación con el ligando se añadió gota a gota al anticuerpo modificado con sulfo-SPDB. La mezcla de reacción se ajustó a pH 7.5 con 1 m de amortiguador HEPES. Después de la incubación durante toda la noche a temperatura ambiente, el anticuerpo conjugado se purificó mediante cromatografía en Sephadex™ G25F equilibrada con histidina 10 mM, glicina 250 mM, un 1% de sacarosa, pH 5.5, el número de moléculas DM4 enlazadas por molécula de anticuerpo se determinó mediante el uso de los coeficientes de extinción del anticuerpo y de maitansinoide previamente reportado (Widdison, WC, y otros, J Med Chem, 49:4392-4408 (2006)). El porcentaje del total de especies maitansinoides libres se determinó como se describió anteriormente. Los conjugados con 3.5-4 moléculas DM4 por anticuerpo huMovl9vl.6 se obtuvieron con <1% presente como maitansinoide no conjugado.
Preparación de huMOV19vl .6-SPP-DM1 El ligando ejemplar 4- (2-piridilditio) pentanoato de N-succinimidilo (SPP) se disolvió en etanol . El anticuerpo huMOV19vl.6 se incubó a 8 mg/ml con un exceso molar de 6.5 a 6 veces del ligando SPP durante aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente en amortiguador fosfato de potasio 50 mM (pH 6.5) que contenia NaCl 50 mM, EDTA 2 mM, y 5% de etanol . El anticuerpo modificado SPP se diluyó dos veces en PBS, pH 6.5, y se modificó, con un exceso molar de 1.5 veces de maitansinoide DM1 mediante la adición de una solución concentrada (15-30 mM) de DM1 en dimetilacetamida (DMA) . La concentración de DMA se ajustó al 5% y después de la incubación durante la noche a temperatura ambiente, el anticuerpo conjugado se purificó mediante cromatografía en Sephadex™ G25F equilibrada 10 mM, glicina 250 mM, un 1% de sacarosa pH 5.5. El número de moléculas DM1 enlazadas por molécula de anticuerpo se determinó mediante el uso de los coeficientes de extinción del anticuerpo y DM1 que se informó anteriormente (Liu y otros, Proc. Nati. Acad. Sci . Estados Unidos, 93, 8618-8623 (1996)). El porcentaje del maitansinoide libre presente después de la reacción de conjugación se determinó mediante la inyección de 20 a 50 iq del conjugado en una columna HiSepTM equilibrada en 25% de acetonitrilo en amortiguador acetato de amonio 100 mM, pH 7.0 y se eluyó en acetonitrilo. El área del pico del total de la especie maitansinoide libre (eluida en el gradiente e identificada por comparación del tiempo de elución con estándares conocidos) se midió con un detector de absorbancia establecido a una longitud de onda de 252 nm y se comparó con el área de los picos relacionados con maitansinoide enlazado (eluido en el pico conjugado en la columna de flujo a través de fracciones) para calcular el porcentaje del total de especies maitansinoide libre. Los conjugado con 3.5-4 moléculas de DM1 por huMOV19vl.6 se obtuvieron con < 1% presente como maitansinoide no conjugado.
Preparación de huMOV19vl.6 SPDB-DM4 El ligando ejemplar N-succinimidilo 4- (2-piridilditio) butanoato (SPDB) se disolvió en etanol . El anticuerpo huMOV19vl.6 se incubó a 8 mg/ml con un exceso molar de 5.5-5 veces del ligando SPDB durante aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente en amortiguador fosfato de potasio 50 mM (pH 6.5) que contenia NaCl 50 mM, EDTA 2 mM, y 3% de etanol. El anticuerpo modificado con SPDB se diluyó dos veces en PBS, pH 6.5, y se modificó, con un exceso molar de 1.5 veces del maitansinoide DM4 por la adición de una solución concentrada (15-30 mM) de DM4 en dimetilacetamida (DMA) . Después de la incubación durante la noche a temperatura ambiente, el anticuerpo conjugado se purificó mediante cromatografía en Sephadex™ G25F equilibrada con histidina 10 mM, 250 mM de glicina, un 1% de sacarosa pH 5.5. El número de moléculas DM4 acopladas por molécula de anticuerpo se determinó mediante el uso de los coeficientes de extinción para el anticuerpo y maitansinoide anteriormente reportados (Widdison, WC, y otros, J Med Chem, 49:4392-4408 (2006)). El porcentaje del total de especies maitansinoides libres se determinó como se describió anteriormente. Los conjugados con 3.5-4 moléculas DM4 por anticuerpo huMOV19vl.6 se obtuvieron con < 1% presente como maitansinoide no conjugado.
Preparación de huMOVl9vl .0-3-sulfo-mal-DM4 El ligando NHS-3-sulfo-mal y DM4 se disolvieron por separado en DMA. El ligando y el tiol DM4 se mezclaron en una solución de DMA conteniendo un 40% 200 mM amortiguador succinato, EDTA 2 mM, pH5.0 para dar una relación molar de DM4 a ligando de 1.6:1 y una concentración final de DM4 igual a 10 mm. La mezcla se hizo reaccionar durante 2 horas a 25C. Sin purificación, la mezcla de reacción se añadió de manera que un equivalente de 9.6 exceso molar del ligando al anticuerpo fue añadido a una solución del anticuerpo huMOV19vl.O en amortiguador fosfato (pH 7.5) en condiciones de conjugación final del anticuerpo 4mg/ml, el 90% amortiguador fosfato/10% DMA pH 7.5 (v/v) . Después de una incubación durante la noche a temperatura ambiente, la mezcla de conjugación se purificó por cromatografía en Sephadex G25 equilibrada en PBS pH 7.5. El huMOV19vl .0-3-sulfo-mal-DM4 se dializó luego en un amortiguador que contenía fosfato 9.55 mM, 139.6 NaCl mM, pH6.5. El número de moléculas DM4 acopladas por molécula de anticuerpo se determinó usando los coeficientes de extinción del anticuerpo y maitansinoide anteriormente reportados (Widdison, WC, y otros, J Med Chem, 49:4392-4408 (2006)). El porcentaje del total de las especies de maitansinoide libres se determinó como se describió anteriormente. Los conjugados con 3.5-4 moléculas DM4 por anticuerpo huMOV19vl.O se obtuvieron con <1% presente como maitansinoide no conjugado.
Preparación de huMOV19vl .0-SMCC-DM1 El ligando NHS-sulfo-SMCC y DM1 se disolvieron por separado en el DMA. El ligando tiol y DM1 se mezclaron en una solución de DMA que contenia un 40% de amortiguador succinato 200 mM, EDTA 2 mM, pH5.0 para dar una relación molar de DM1 a ligando de 1.2:1 y una concentración final de DM1 igual a 3.75 mM. La mezcla se hizo reaccionar durante 75 minutos a 20°C. Sin purificación, la mezcla de reacción se añadió de manera que un equivalente de 6.4 exceso molar del ligando a anticuerpo fue añadido a una solución del anticuerpo huMOV19vl.O en amortiguador fosfato (pH 7.5) en condiciones de conjugación final de 4mg/ml de anticuerpo, el 88% de fosfato de potasio 50 mM, NaCl 50 mM, EDTA 2 mM, pH 7.5/12% DMA pH 7.5 (v/v) . Después de 2 horas de incubación a 20°C, la mezcla de conjugación se purificó mediante cromatografía en Sephadex G25 equilibrada en PBS pH 7.5. El huMOV19vl .0-SMCC- DM1 se dializó después en un amortiguador que contenía glicina 250 mM, histidina 10 mM pH 5.5. El número de moléculas DM1 acopladas por molécula de anticuerpo se determinó mediante el uso de los coeficientes de extinción del anticuerpo y maitansinoide anteriormente reportados ( iddison, WC, y otros, J Med Chem, 49:4392-4408 (2006)). El porcentaje del total de especies maitansinoide libre se determinó como se describió anteriormente. Los conjugados con 3.5-4 moléculas de DM1 por anticuerpo huMOV19vl .0 se obtuvieron con < 2.8% presente como maitansinoide no conj ugado .
Preparación de huMOV19vl .0-PEG4-mal-DMl El reactivo de la etapa 1 NHS-PEG4-mal-DMl se disolvió en el DMA. El anticuerpo huMovl9vl.0 se incubó a 5mg/ml con un exceso molar de 5.7 veces de NHS-PEG4-mal-DMl durante la noche a 25°C en KPi 50 mM, NaCl 50 mM, EDTA 2 mM, pH 7.5 y 10% de DMA por volumen. La mezcla de reacción se purificó por columna de Sephadex G25 equilibrada en PBS pH 7.5. El huMOVl9vl .0-PEG4-mal-DMl se dializó en amortiguador que contenía glicina 250 mM, histidina 10 mM pH 5.5. El número de moléculas DM1 acopladas por molécula de anticuerpo se determinó mediante el uso de los coeficientes de extinción del anticuerpo y maitansinoide que se reportaron anteriormente (Widdison, WC, y otros, J Med Chem, 49:4392- 4408 (2006) ) . El porcentaje del total de especies maitansinoide libre se determinó como se describió anteriormente. Los conjugados con 3.5-4 moléculas de DM1 por anticuerpo huMOVl9vl.O se obtuvieron con < 1.1% presente como maitansinoide no conjugado.
Ejemplo 13 Afinidad de unión de los anticuerpos y los conjugados La afinidad de unión de los anticuerpos anti-FOLRl y de sus conjugados SPDB-DM , PEG4Mal-DM4, SMCC-DMl, o anti-FOLRl-sulfo-SPDB-DM4 se analizaron por citometria de flujo. Las células SKOV3 que expresan FOLR1 se incubaron con diferentes concentraciones de anticuerpos anti-FOLRl o sus conjugados y se procesaron como se describió anteriormente para el análisis de citometria de flujo. El análisis de los datos se realizó mediante CellQuest Pro (BD Biosciences, San Diego, Estados Unidos) y para cada muestra la intensidad de fluorescencia media para FL1 (IFM) se exportó y se gráfico en función de la concentración de los anticuerpos en un gráfico semilogaritmico . Una curva dosis-respuesta se generó por regresión no lineal y el valor de la constante de equilibrio de disociación (Kd) aparente de las muestras examinadas para la unión a las células SKOV3 se calculó mediante el uso de GraphPad Prism v4 (software GraphPad, San Diego, CA) y se presentó en la Figura 5. Los resultados demuestran que la conjugación ya sea a DM1 como a DM4 a través de cualquiera de los ligandos que se usaron, no altera notablemente la afinidad de ninguno de los anticuerpos (por ejemplo, huMovl9) .
Ejemplo 14 Ensayos de citotoxicidad in vitro La capacidad de los conjugados ejemplares muFRl-9, muFRl-13, muFRl-22, muFRl-23, huFRl-23, muFRl-21, y huFRl-21 para inhibir el crecimiento celular se midió mediante el uso de los ensayos de citotoxicidad in vitro por el método que se describe en Kovtun YV y otros {Cáncer Res 66: 3214-3221 (2006) ) . Un conjugado PEG4-mal-DM4 en varias concentraciones se añadió a las células KB que expresan FOLRl en una placa de 96 pocilios a 1 000 células por pocilio en 100 µ? de medio RPMI completo (RPMI-1640, 10% de suero fetal bovino, glutamina 2 mM, 1% de gentamicina, todos los reactivos de Invitrogen) . Los anticuerpos y los conjugados se diluyeron en medio completo RPMI con una serie de dilución de 3 veces y se añadieron 100 µ? por pocilio. La concentración final típicamente estuvo en el intervalo de 3xl0"8 M a 4.6xl0~12 M. Los pocilios de control que contienen las células y el medio, pero carecen de los conjugados, y los pocilios con medio solo, se incluyeron en cada placa de ensayo. Las placas se incubaron de cuatro a seis días a 37°C en una atmósfera humidificada con 5% de C02. El reactivo WST-8, 10% v/v (Dojindo Molecular Technologies, Gaithersburg, MD, Estados Unidos) , se añadió a los pocilios y las placas se incubaron a 37°C durante 2-6 h. El WST-8 se redujo por las deshidrogenasas en las células vivas a un naranja (máximo producto formazán que es soluble en medio de cultivo de tejidos. La cantidad de formazán producido es directamente proporcional al número de células vivas. Las placas se analizaron mediante la medición de la absorbancia a 450 nm (A450) y a 650 nm (A650) en un lector de placas de pocilios múltiples. En primer lugar, el fondo de la opalescencia de las células (A6so) se restó de A650. El resultado de A*450 se usó para determinar la fracción de las células supervivientes. El fondo de absorbancia A*450 fue la de los pocilios con medio WST-8 sólo. La fracción de supervivientes se calculó de la siguiente manera: Porcentaje de viabilidad = 100 x (A*45o muestra tratada - fondo ?*450) / (?*450 muestra no tratada - fondo A*450 ) . Los valores de la fracción superviviente se graficaron contra la concentración del anticuerpo o del conjugado en un gráfico semi-log para cada tratamiento. A partir de estos datos, se determinaron los valores de IC50 mediante el uso de GraphPad Prism v4 (software GraphPad, San Diego, CA) y se presentaron en la Figura 5. Los resultados que se muestran en la Figura 5 demuestran que todas las con ugaciones son igualmente activas en su potencia citotóxica contra las células KB que expresan FOLR1. A fin de verificar la especificidad de los conjugados anti-FOLRl- maitansinoide hacia FOLRl, sus actividades se evaluaron en presencia de un exceso de anticuerpos no conjugados contra las células KB. La adición de un exceso de anticuerpos de competencia no conjugados a los conjugados suprimió su citotoxicidad, como se ve en la Figura 7. Estos datos indican que los conjugados matan las células KB de forma dependiente del antigeno. Datos adicionales demostraron que huMovl9-SPDB-DM4 indujo la detención del ciclo celular en la fase G2/M en las células KB en ensayos in vitro.
Ejemplo 15 Eficacia, in vivo, de los conjugados huMovl9-PEG4Mal-DM4 y huMovl9-SPDB-DM4 en comparación con conjugados similares que no están dirigidos en un modelo KB de xenoinjerto El conjugado escindible huMovl9-SPDB-DM4 que está dirigido a FOLRl en comparación con huC242-SPDB-DM4 que no está dirigido, y el conjugado no escindible huMovl9-PEG4-Mal-DM4 en comparación con huC242-PEG4Mal-DM4 que no está dirigido se probaron mediante el uso de un modelo establecido de xenotrasplante de células KB implantado por vía subcutánea en ratones SCID. Los ratones se asignaron al azar por el peso corporal en los grupos de tratamiento y se trataron de forma individual (conjugados SPDB) el día 3 después de la inoculación de células, o tres veces por semana en los días 3, 10 y 17 después de la inoculación de células con 5 y 10 mg/kg de un conjugado, respectivamente. El volumen tumoral medio de los diferentes grupos de tratamiento se representó en la Figura 8. Los tratamientos, ya sea con huMovl9-SPDB-DM4, o huMovl9-PEG4Mal-DM4 resultaron en una disminución en el volumen tumoral promedio en comparación con el control de PBS, mientras que los tratamientos con cualquiera de los respectivos conjugados que no están dirigidos, no produjeron ningún efecto significativo.
Ejemplo 16 Eficacia, in vivo, de los conjugados anti-FOLRl-PEG4Mal-DM4 en un modelo de xenoinjerto de KB Los conjugados PEG4Mal-DM4 de los anticuerpos ejemplares anti-FOLRl huMovl9, muFR-1-9, muFR-1-13, muFR-1-22, muFR-1-23, y huFR-1-21 se probaron mediante el uso de un modelo establecido de xenoinjertos de células KB implantado por via subcutánea en ratones SCID. Los ratones se asignaron al azar por el peso corporal en los grupos de tratamiento y se trataron una vez en el día 3 después de la inoculación de células con 10 mg/kg de uno de los conjugados enumerados anteriormente o sólo con PBS. Se demostró anteriormente que HuMovl9-PEG4Mal-DM4 es similar al conjugado PEG4Mal-DM4 de muFR-1-9, muFR-1-13, muFR-1-22, muFR-1-23, y huFR-1-21 en su potencia citotóxica in vitro. El HuMovl9-PEG4Mal-DM4 y el huFR-l-21-PEG4Mal-DM4 fueron significativamente más potentes in vivo que cualquiera de los otros conjugados, resultando en una disminución más pronunciada en el volumen tumoral promedio (Figuras 9 y 10) . Se demostró también que la potencia es dependiente de la dosis (Figura 11) y la elección del ligando juega también un papel (Figuras 12 y 13) .
Ejemplo 17 Eficacia, in vivo, de los conjugados anti-FOLRl-sulfo-SPDB- DM4 en un modelos de xenoinjerto Los conjugados anti-FOLRl huMovl9-sulfo-SPDB-DM4 se probaron en tres xenoinjertos de adenocarcinoma seroso de ovario: OVCAR-3, IGROV-1, y OV-90. Cada uno de estos xenoinjertos de tumores mostró niveles de expresión de FOLR1 comparable a los tumores de los pacientes cuando se mide mediante un método calibrado de tinción inmunohistoquimica (IHC) sobre secciones incluidas en parafina y fijadas en formalina. Los ratones portadores de xenoinjerto de tumores subcutáneos establecidos (aproximadamente 100 mm3) se trataron con una única inyección intravenosa del conjugado huMovl9-sulfo-SPDB-DM4 en 1.2, 2.5 y 5.0 mg/kg (en base a la concentración de anticuerpos; Las Figuras 14-16 muestran la concentración del maitansinoide conjugado en µg/kg) . El conjugado se activó en los tres modelos evaluados. En el xenoinjerto OVCAR-3, la dosis mínima eficaz (DME) fue de 1.2 mg/kg (Figura 14). Los niveles de dosis más altas fueron de gran actividad, dando lugar a regresiones completas (RC) en 4/6 y 2/6 ratones en los grupos de tratamiento de 2.5 y 5.0 mg/kg, respectivamente. El tratamiento con el conjugado resultó en una fuerte actividad antitumoral en ambos modelos de xenoinjerto IGROV-1 y OV-90, con un DME de 2.5 mg/kg, con una única inyección (Figuras 15 y 16) . Estos datos demuestran la fuerte actividad antitumoral de los conjugados huMovl9-sulfo-SPDB-DM4 contra los xenoinjertos de tumores de ovario con niveles de expresión de F0LR1 comparables a los tumores de pacientes.
Ejemplo 18 Efecto de los acopladores en la eficacia de los inmunoconj ugados El anticuerpo anti-FOLRl hu ovl9 se acopló a DM1 o DM4 a través de los acopladores que contienen disulfuros escindibles SPP, SPDB, o sulfo SPDB, o por el ligando no escindibles SMCC. La actividad citotóxica in vitro de estos conjugados sobre las lineas celulares KB, IGROV-1 y JEG-3 se examinó. El análisis por FACS indicó que las células KB (cuello uterino) tenían > 2.000.000 sitios de unión del anticuerpo por célula. Las células IGROV-1 (ovario) tenían 260,000 sitios de unión por célula, y las células JEG-3 (coriocarcinoma) tenían 40,000 sitios de unión por célula. Los resultados de la citotoxicidad in vitro se resumen en la Tabla 2 a continuación. Los conjugados escindibles presentaron notablemente mayor actividades in vitro en comparación con los conjugados de SMCC.
Tabla 2: Efecto de los ligandos inmunocon ugados en la citoxicidad in vitro.
Las actividades in vivo de los conjugados en los modelos tumorales de KB y OVCAR-3- positivos para FOLR1 también se probaron. Los resultados que se muestran en la Figura 17 demuestran que los conjugados escindibles SPDB-DM4 y de sulfo-SPDB-DM son más potentes que el conjugado no escindibles SMCC-DM1 in vivo. Además, entre los conjugados escindibles, el conjugado SPP-DM1 fue menos activo que cualquiera de los conjugados SPDB-DM4 o sulfo-SPDB-DM4 , en ambos modelos de xenoinjerto (Figuras 18A-18B) . Los dos últimos conjugados fueron igualmente activos contra los tumores KB, mientras que el conjugado sulfo-SPDB-DM4 fue más activo contra el modelo OVCAR-3. Los datos obtenidos mediante el modelo OVCAR-3 se resumen en la Tabla 3 a continuación.
Tabla 3: Efecto de los ligandos inmunoconjugados en el tamaño del tumor en modelo de xenoinjerto de OVCAR-3.
Estos datos demuestran que los inmunoconjugados que contienen un ligando escindible muestran mayor eficacia tanto ?? vitro como in vivo, y los inmunoconj ugados anti-FOLRl que contienen sulfo-SPDB son muy activos en modelos tumorales.
Ejemplo 19 Eficacia in vitro e in vivo de los conjugados SMCC-DMl del anticuerpo huFRl Los Anti-FOLRl huFRl-48, huFRl-49, huFRl-57, y huFRl-65 se conjugaron con el ligando SMCC y DM1 y, como se describió anteriormente, se analizaron los efectos sobre las células KB, in vivo, usando de los modelos de xenoinjerto anteriormente descritos. Si bien cada uno de los anticuerpos mostró una eficacia similar en el modelo de células KB, los immunocojugados huFRl-48, huFRl-49, huFRl-57, y huFRl-65 mostraron una eficacia variable, pero significativa in vivo a una dosis de 200 \ig/kg en un sistema de modelo de xenoinjerto (Tabla 4 y Figura 19) .
Tabla 4: Eficacia in vitrg e in vivo de los conjugados SMCC-DM1 del anticuerpo huFRl Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patentes, sitios de Internet, y números de acceso/ bases de datos de secuencias (incluidas las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos) citados en la presente se incorporan como referencia en su totalidad para todos los propósitos, en la misma medida en que cada publicación individual, patente, solicitud de patente, sitio de Internet, o número de acceso/ bases de datos de secuencias se indica específica e individualmente para ser incorporada como referencia .
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (127)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión al antigeno del mismo que se une de forma especifica a un receptor 1 de folato, caracterizado porque comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GYFMN (sec. con núm. de ident.rl); una CDR2 de cadena pesada que comprende RIHPYDGDTFYNQXaaiFXaa2Xaa3 (sec. con núm. de ident.:56) y una CDR3 de cadena pesada que comprende YDGSRAMDY (sec. con núm. de ident.:3); y (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende KASQSVSFAGTSLMH (sec. con núm. de ident.:7); una CDR2 de cadena ligera que comprende RASNLEA (sec. con núm. de ident.:8); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSREYPYT (sec. con núm. de ident.:9); en donde Xaai se selecciona de K, Q, H, y R; Xaa2 se selecciona de Q, H, N, y R, y Xaa3 se selecciona de G, E, T, S, A y V.
2. El anticuerpo humanizado o un fragmento de unión al antigeno del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se une de forma especifica a un receptor 1 de folato humano sustancialmente con la misma afinidad que el anticuerpo quimérico Movl9.
3. El anticuerpo humanizado o un fragmento de unión al 'antigeno del mismo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la afinidad de unión se mide por citometria de flujo, Biacore, o radioinmunoensayo .
4. El anticuerpo humanizado o un fragmento de unión al antigeno del mismo de conformidad con las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la secuencia CDR2 de cadena pesada comprende RIHPYDGDTFYNQKFQG (sec. con núm. de ident.:2).
5. Un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión al antigeno del mismo que se une de forma especifica a un receptor 1 de folato, caracterizado porque comprende: (a) una CDRl de cadena pesada que comprende GYFMN (sec. con núm. de ident.:l), o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; una CDR2 de cadena pesada que comprende RIHPYDGDTFYNQKFQG (sec. con núm. de ident.:2), o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; y una CDR3 de cadena pesada que comprende YDGSRAMDY (sec. con núm. de ident.:3), o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; y/o (b) una CDRl de cadena ligera que comprende KASQSVSFAGTSL H (sec. con núm. de ident.:7), o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; una CDR2 de cadena ligera que comprende RASNLEA (sec. con núm. de ident . : 8 ) , o una variante de ésta que comprende 1, 2 , 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos; y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSREYPYT (sec. con núm. de ident.: 9), o una variante de ésta que comprende 1, 2, 3, ó 4 sustituciones conservativas de aminoácidos.
6. Un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión al antigeno del mismo que se une de forma especifica a un receptor 1 de folato humano, caracterizado porque comprende la cadena pesada de la sec. con núm. de ident . : 6.
7. Un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión al antigeno del mismo caracterizado porque es codificado por el ADN plásmido depositado en la ATCC el 7 de abril de 2010 y que tiene los núms . de depósito de la ATCC PTA-10772, PTA-10773, ó 10774.
8. Un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión al antigeno del mismo que compite con el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque es para la unión especifica a un receptor 1 de folato humano.
9. Un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión al antigeno del mismo, caracterizado porque comprende un dominio variable de cadena pesada al menos aproximadamente 90% idéntico a la sec. con núm. de ident.: 4, y un dominio variable de cadena ligera al menos aproximadamente 90% idéntico a la sec. con núm. de ident.:10 o la sec. con núm. de ident . : 11.
10. El anticuerpo humanizado o un fragmento de unión al antigeno del mismo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el dominio variable de cadena pesada es al menos aproximadamente 95% idéntico a la sec. con núm. de ident.: 4, y el dominio variable de cadena ligera es al menos aproximadamente 95% idéntico a la sec. con núm. de ident.: 10 o la sec. con núm. de ident.: 11.
11. El anticuerpo humanizado o un fragmento de unión al antigeno del mismo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el dominio variable de cadena pesada es al menos aproximadamente 99% idéntico a la sec. con núm. de ident.: 4, y el dominio variable de cadena ligera es al menos aproximadamente 99% idéntico a la sec. con núm. de ident.: 10 o la sec. con núm. de ident.: 11.
12. El anticuerpo humanizado o un fragmento de unión al antigeno del mismo de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el dominio variable de cadena pesada es idéntico a la sec. con núm. de ident.: 4, y el dominio variable de cadena ligera es idéntico a la sec. con núm. de ident.: 10 o la sec. con núm. de ident.: 11.
13. El anticuerpo humanizado o un fragmento de unión al antigeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque el anticuerpo se expresa al menos diez veces más que chMovl9 en células eucariotas .
14. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque las células eucariotas son células HEK-293T.
15. Un polipéptido que se une de forma especifica a un receptor 1 de folato humano, caracterizado porque comprende: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 4 ; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident.: 10 o la sec. con núm. de ident.: 11.
16. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 4 ; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident.: 10 o la sec. con núm. de ident.: 11.
17. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque comprende: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 4 ; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident.: 10 o la sec. con núm. de ident.: 11.
18. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque comprende: (a) el polipéptido de la sec. con núm. de ident. :4; y/o (b) el polipéptido de la sec. con núm. de ident.: 10 o la sec. con núm. de ident.: 11.
19. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque comprende: (a) el polipéptido de la sec. con núm. de ident. : 4 ; y (b) el polipéptido de la sec. con núm. de ident.: 10 o la sec. con núm. de ident.: 11.
20. Un anticuerpo un fragmento de unión al antigeno del mismo que se une de forma especifica a un receptor 1 de folato humano, caracterizado porque comprende: (a) una CDRl de cadena pesada que comprende SSYGMS (sec. con núm. de ident. :30); una CDR2 de cadena pesada que comprende TISSGGSYTY (sec. con núm. de ident. :31); y/o una CDR3 de cadena pesada que comprende DGEGGLYA DY (sec. con núm. de ident. :32); y/o (b) una CDRl de cadena ligera que comprende KASDHINNWLA (sec. con núm. de ident. :27); una CDR2 de cadena ligera que comprende GATSLET (sec. con núm. de ident. :28); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQYWSTPFT (sec. con núm. de ident . :29) .
21. Un anticuerpo un fragmento de unión al antigeno del mismo que se une de forma especifica a un receptor 1 de 5 folato humano, caracterizado porque comprende: (a) una CDRl de cadena pesada que comprende TNYWMQ (sec. con núm. de ident.: 60); una CDR2 de cadena pesada que comprende AIYPGNGDSR (sec. con núm. de ident.: 61); y/o una CDR3 de cadena pesada que comprende RDGNYAAY (sec. con núm. 10 de ident.: 62); y/o (b) una CDRl de cadena ligera que comprende RASENIYSNLA (sec. con núm. de ident. :57); una CDR2 de cadena ligera que comprende AATNLAD (sec. con núm. de ident. :58); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QHFWASPYT (sec. con núm. de 15. ident. : 59) .
22. Un anticuerpo un fragmento de unión al antigeno del mismo que se une de forma especifica a un receptor 1 de folato humano, caracterizado porque comprende: (a) una CDRl de cadena pesada que comprende TNYWMY (sec. 20 con núm. de ident.: 66); una CDR2 de cadena pesada que comprende AIYPGNSDTT (sec. con núm. de ident. :67); y/o una CDR3 de cadena pesada que comprende RHDYGAMDY (sec. con núm. de ident . : 68 ) ; y/o (b) una CDRl de cadena ligera que comprende RASENIYTNLA 5 (sec. con núm. de ident. :63); una CDR2 de cadena ligera que comprende TASNLAD (sec. con núm. de ident.:64); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QHFWVSPYT (sec. con núm. de ident . : 65 ) .
23. Un anticuerpo un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une de forma específica a un receptor 1 de folato humano, caracterizado porque comprende: (a) una CDRl de cadena pesada que comprende SSFGMH (sec. con núm. de ident. :72); una CDR2 de cadena pesada que comprende YISSGSSTIS (sec. con núm. de ident. :73); y/o una CDR3 de cadena pesada que comprende EAYGSSMEY (sec. con núm. de ident.: 74); y/o (b) una CDRl de cadena ligera que comprende RASQNINNNLH (sec. con núm. de ident.: 69); una CDR2 de cadena ligera que comprende YVSQSVS (sec. con núm. de ident. :70); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSNSWPHYT (sec. con núm. de ident . : 71 ) .
24. Un anticuerpo un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une de forma específica a un receptor 1 de folato humano, caracterizado porque comprende: (a) una CDRl de cadena pesada que comprende TSYTMH (sec. con núm. de ident. :78); una CDR2 de cadena pesada que comprende YINPISGYTN (sec. con núm. de ident. :79); y/o una CDR3 de cadena pesada que comprende GGAYGRKPMDY (sec. con núm. de ident.: 80); y/o (b) una CDRl de cadena ligera que comprende KASQNVGPNVA (sec. con núm. de ident.:75); una CDR2 de cadena ligera que comprende SASYRYS (sec. con núm. de ident.:76); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQYNSYPYT (sec. con núm. de ident . : 77 ) .
25. Un polipéptido que se une de forma especifica a un receptor 1 de folato humano, caracterizado porque comprende: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 97 ; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident. : 96.
26. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque comprende: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 97 ; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident.: 96.
27. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque comprende: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident. : 97; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 96.
28. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque comprende: (a) el polipéptido de la sec. con núm. de ident. :97; y/o (b) el polipéptido de la sec. con núm. de ident. :96.
29. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque comprende el polipéptido de la sec. con núm. de ident.: 97 y el polipéptido de la sec. con núm. de ident. : 96.
30. Un polipéptido que se une de forma especifica al receptor 1 de folato humano, caracterizado porque comprende: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 99; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident. : 98.
31. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque comprende: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 99; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident. : 98.
32. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque comprende: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 99/ y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident.: 98.
33. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque comprende: (a) el polipéptido de la sec. con núm. de ident. :99; y/o (b) el polipéptido de la sec. con núm. de ident.: 98.
34. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque comprende el polipéptido de la sec. con núm. de ident. :99 y el polipéptido de la sec. con núm. de ident.: 98.
35. Un polipéptido que se une de forma especifica a un receptor 1 de folato humano, caracterizado porque comprende: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 101; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 100.
36.. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque comprende: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 101; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident. : 100.
37. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque comprende: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 101; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident. : 100.
38. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque comprende (a) el polipéptido de la sec. con núm. de ident. :101; y/o (b) el polipéptido de la sec. con núm. de ident. :100.
39. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque comprende el polipéptido de la sec. con núm. de ident.: 101 y el polipéptido de la sec. con núm. de ident. : 100.
40. Un polipéptido que se une de forma especifica a un receptor 1 de folato humano, caracterizado porque comprende: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 103; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident. : 102.
41. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque comprende: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 103; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 102.
42. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque comprende: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident. : 103; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident. : 102.
43. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque comprende: (a) el polipéptido de la sec. con núm. de ident.:103; y/o (b) el polipéptido de la sec. con núm. de ident.:102.
44. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque comprende el polipéptido de la sec. con núm. de ident.:103 y el polipéptido de la sec. con núm. de ident. : 102.
45. Un polipéptido que se une de forma especifica a un receptor 1 de folato humano, caracterizado porque comprende: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 113 ; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident.: 112.
46. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque comprende: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 113; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 112.
47. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque comprende: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 113 ; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident. : 112.
48. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque comprende: (a) el polipéptido de la sec. con núm. de ident. :113; y/o (b) el polipéptido de la sec. con núm. de ident. :112.
49. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque comprende el polipéptido de la sec. con núm. de ident.: 113 y el polipéptido de la sec. con núm. de ident . : 112.
50. Un polipéptido que se une de forma especifica a un receptor 1 de folato humano, caracterizado porque comprende: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 115 ; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 11 .
51. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque comprende: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 115; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident.: 114.
52. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque comprende: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 115; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 114.
53. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque comprende: (a) el polipéptido de la sec. con núm. de ident. :115; y/o (b) el polipéptido de la sec. con núm. de ident.: 114.
54. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque comprende el polipéptido de la sec. con núm. de ident.: 115 y el polipéptido de la sec. con núm. de ident. : 114.
55. Un polipéptido que se une de forma especifica a un receptor 1 de folato humano, caracterizado porque comprende: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 117 ; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident. : 116.
56. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque comprende : (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 117 ; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 116.
57. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque comprende : (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 117 / y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident.: 116.
58. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque comprende: (a) el polipéptido de la sec. con núm. de ident. :117; y/o (b) el polipéptido de la sec. con núm. de ident.:] 16.
59. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque comprende el polipéptido de la sec. con núm. de ident.:117 y el polipéptido de la sec. con núm. de ident . : 116.
60. Un polipéptido que se une de forma especifica a un receptor 1 de folato humano, caracterizado porque comprende: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident.: 119; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 118.
61. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque comprende: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident . : 119; y/o (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident. : 118.
62. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque comprende: (a) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident.: 119; ylo (b) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia con la sec. con núm. de ident. : 118.
63. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque comprende: (a) el polipéptido de la sec. con núm. de ident. :119; y/o (b) el polipéptido de la sec. con núm. de ident.: 118.
6 . El polipéptido de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque comprende el polipéptido de la sec. con núm. de ident. :119 y el polipéptido de la sec. con núm. de ident. : 118.
65. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25-65, caracterizado porque es un anticuerpo .
66. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-24 caracterizado porque es un anticuerpo de longitud completa.
67. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-24, caracterizado porque es un fragmento de unión al antigeno.
68. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión al antigeno comprende un Fab, un Fab1, un F(ab')2, un Fd, un Fv o scFv de cadena simple, un Fv enlazado a disulfuro, un dominio V-NAR, un IgNar, un intracuerpo, una IgG-CH2, un minicuerpo, un F(ab')3, un tetracuerpo, un triacuerpo, un diacuerpo, un anticuerpo de dominio simple, DVD- Ig, Fcab, mAb2, un (scFv)2, o un scFv-Fc.
69. El anticuerpo o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-68, caracterizado porque se une a un receptor 1 de folato humano con un Kd de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 10 n .
70. El anticuerpo o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-69, caracterizado porque se une al receptor 1 de folato humano con un Kd de aproximadamente 1.0 nM o mejor.
71. El anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 69 ó 70, caracterizado porque la afinidad de unión se mide por citometria de flujo, Biacore, o radioinmunoensayo .
72. Un método para preparar el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-24, caracterizado porque comprende (a) cultivar una célula que expresa el anticuerpo; y (b) aislar el anticuerpo de la célula cultivada.
73. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque la célula es una célula eucariota.
74. Un inmunoconjugado que tiene la Fórmula (A) - (L) -(C) , caracterizado porque: (A) es un anticuerpo o fragmento de unión al antigeno o polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-71; (L) es un ligando; y (C) es un agente citotóxico. en donde el ligando (L) enlaza (A) a (C) .
75. El inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque el ligando se selecciona del grupo consistente de un ligando escindióle, un ligando no escindióle, un ligando hidrófilo, y un ligando basado en ácido dicarboxilico .
76. El inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque el ligando se selecciona del grupo consistente de : iV-succinimidil 4- (2-piridilditio) pentanoato (SPP) o N-succinimidil 4- (2-piridilditio) -2-sulfopentanoato (sulfo-SPP) ; N-succinimidil 4- (2-piridilditio) butanoato (SPDB) o W-succinimidil 4- (2-piridilditio) -2-sulfobutanoato (sulfo-SPDB) ; N-succinimidil 4- (maleimidametil) ciclohexanecarboxilato (SMCC) ; N-sulfosuccinimidil 4- (maleimidametil ) ciclohexanecarboxilato (sulfoS CC) ; W-succinimidil-4- (iodoacetil) -aminobenzoato (SIAB) ; y el éster de N-succinimidil- [ (N-maleimidapro-pionamida) -tetraetilenglicol] (NHS-PEG4-maleimida) .
77. El inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque el ligando es N-succinimidil- [ (N-maleimidopropionamido) -tetraetilenglicol] éster (NHS-PEG4-maleimida) .
78. El inmunoconj ugado de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque el ligando es N- succinimidil 4- (2-piridilditio) butanoato (SPDB) o N-succinimidil 4- (2-piridilditio) -2-sulfobutanoato (sulfo-SPDB) .
79. El inmunoconj ugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 74-78, caracterizado porque el agente citotóxico se selecciona del grupo consistente de un maitansinoide, análogo de maitansinoide, benzodiazepina, taxoide, CC-1065, análogo de CC-1065, duocarmicina, análogo de duocarmicina, caliqueamicina, dolastatina, análogo de dolastatina, auristatina, derivado de tomaimicina y derivado de leptomicina o un profármaco del agente.
80. El inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 79, caracterizado porque el agente citotóxico es un maitansinoide.
81. El inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque el agente citotóxico es (2 ' ) -deacetil- (2 ' ) - ( 3-mercapto-l-oxopropil ) -maitansina o N (2 ' ) -deacetil-N2- (4-mercapto-4-metilo-l-oxopentil) -maitansina .
82. Un inmunoconjugado, caracterizado porque comprende: (A) un anticuerpo humanizado que comprende el dominio variable de cadena pesada de las sec. con núm. de ident.:97, 99, 101, ó 103, y el dominio variable de cadena ligera de las sec. con núm. de ident.:96, 98, 100, ó 102; (L) N-succinimidil 4- (maleimidometil ) ciclohexanocarboxilato (SMCC) ; y (C) N (2 ' ) -deacetil-N (2' ) - (3-mercapto-l-oxopropil) -maitansina; en donde (L) se une a (A) a (C) .
83. Un inraunocon ugado, caracterizado porque comprende: (A) un anticuerpo humanizado que comprende el dominio variable de cadena pesada de la sec. con núm. de ident.:4, y el dominio variable de cadena ligera de la sec. con núm. de ident.: 10 o la sec. con núm. de ident.: 11; (L) N-succinimidil - [ (N-maleimidopropionamido) -tetraetilenglicol] éster (NHS-PEG4-maleimida) ; y (C) (2 ' ) -deacetil-N2- (4-mercapto-4-metil-l-oxopentil) -maitansina; en donde (L) enlaza (A) a (C) .
84. Un inmunoconj ugado, caracterizado porque comprende: (A) un anticuerpo humanizado que comprende el dominio variable de cadena pesada de la sec. con núm. de ident . : 4 , y el dominio variable de . cadena ligera de la sec. con núm. de ident.: 10 o la sec. con núm. de ident. : 11; (L) N-succinimidil 4- (2-piridilditio) butanoato (SPDB) ; y (C) (21 ) -deacetil-N2- ( 4-mercapto-4-metil-l-oxopentil ) -maitansina; en donde (L) enlaza (A) a (C) .
85. Un inmunoconjugado, caracterizado porque comprende: (A) un anticuerpo humanizado que comprende el dominio variable de cadena pesada de la sec. con núm. de ident.: 4, y el dominio variable de cadena ligera de la sec. con núm. de ident.:10 o la sec. con núm. de ident.:ll; (L) N-succinimidil 4- ( 2-piridilditio) -2-sulfobutanoato (sulfo-SPDB) y (C) (2 ' ) -deacetil-N2- ( 4-mercapto-4-metil-l-oxopentil) -maitansina ; en donde (L) enlaza (A) a (C) .
86. Un inmunoconj ugado, caracterizado porque comprende: (A) un anticuerpo humanizado que comprende el dominio variable de cadena pesada de la sec. con núm. de ident.:4, y el dominio variable de cadena .ligera de la sec. con núm. de ident.:10 o la sec. con núm. de ident.rll; (L) N-succinimidil 4- (2-piridilditio) -2-sulfopentanoato (sulfo-SPP); y (C) (21 ) -deacetil- (2 ' ) -( 3-mercapto-l-oxopropil ) -maitansina; en donde (L) enlaza (A) a (C) .
87. Un inmunoconj ugado, caracterizado porque comprende: (A) un anticuerpo humanizado que comprende el dominio variable de cadena pesada de la sec. con núm. de ident.:4, y el dominio variable de cadena ligera de la sec. con núm. de ident.:10 o la sec. con núm. de ident.rll; (L) N-succinimidil 4- (2-piridilditio) pentanoato (SPP) ; y (C) (2 ' ) -deacetil-N (2 ' ) - (3-mercapto-l-oxopropil) -maitansina ; en donde (L) enlaza (A) a (C) .
88. El inmunoconjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 74-87, caracterizado porque comprende, además, un segundo (C) .
89. El inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado porque comprende, además, un tercer (C) .
90. El inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 89, caracterizado porque comprende, además, un cuarto (C) .
91. El inmunoconjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 74-90, caracterizado porque comprende 2-6 (C) .
92. El inmunoconjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 74-90, caracterizado porque comprende 3-4 (C) .
93. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el anticuerpo, fragmento de unión al antigeno, polipéptido, o inmunocon ugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-71 y 74-92, y un portador farmacéuticamente aceptable.
94. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el inmunoconjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 74-92, en donde los inmunoconj ugados tiene un promedio de aproximadamente 3 a aproximadamente 4 (C) por (A) .
95. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque los inmunoconjugados tiene un promedio de aproximadamente 3.5 ± 0.5 (C) por (A).
96. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 93-95, caracterizada porque comprende, además, un segundo agente contra el cáncer.
97. Un reactivo diagnóstico, caracterizado porque comprende el anticuerpo, fragmento de unión al antigeno, polipéptido, o inmunocon ugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-71 y 74-92, el cual está marcado.
98. El reactivo diagnóstico de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado porque la marca se selecciona del grupo consistente de un radiomarcado, un fluoróforo, un cromóforo, un agente de imagen y un ion metálico .
99. Un kit, caracterizado porque comprende el anticuerpo, fragmento de unión al antigeno, polipéptido, o inmunoconj ugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-71 y 74-92.
100. Un método para inhibir el crecimiento tumoral en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo, el fragmento de unión al antigeno, polipéptido, inmunoconjugado, o composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-71 y 71-95.
101. Un método para inhibir el crecimiento tumoral en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un inmunoconjugado que tiene la Fórmula (A) - (L) - (C) , en donde: (A) es un anticuerpo o fragmento de unión al antigeno del mismo que se une de forma especifica a un receptor 1 de folato humano; (L) es un ligando; y (C) es una citotoxina seleccionada del grupo consistente de un maitansinoide y un análogo de maitansinoide; en donde (L) une a (A) a (C) y en donde el inmunoconjugado reduce media del volumen tumoral al menosdos veces en un modelo de xenoinjerto de KB.
102. El método de conformidad con la reivindicación 101, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión al antigeno del mismo comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GYFMN (sec. con núm. de ident.rl); una CDR2 de cadena pesada que comprende RIHPYDGDTFYNQXaaiFXaa2Xaa3 (sec. con núm. de ident.:56); y una CDR3 de cadena pesada que comprende YDGSRAMDY (sec. con núm. de ident.:3); y (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende KASQSVSFAGTSLMH (sec. con núm. de ident.:7); una CDR2 de cadena ligera que comprende RASNLEA (sec. con núm. de ident.:8); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSREYPYT (sec. con núm. de ident.:9); en donde Xaai se selecciona de K, Q, H, y R; Xaa2 se selecciona de Q, H, N, y R, y Xaa3 se selecciona de G, E, T, S, A y V.
103. El método de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque el CDR2 de cadena pesada comprende RIHPYDGDTFYNQKFQG (sec. con núm. de ident.:2).
104. El método de conformidad con la reivindicación 101, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión al antigeno del mismo es codificado por el ADN plásmido depositado en la ATCC el 7 de abril de 2010 y que tiene los núm. de depósito de la ATCC PTA-10772, PTA-10773, ó 10774.
105. El método de conformidad con la reivindicación 101, caracterizado porque el inmunoconjugado comprende: (A) un anticuerpo humanizado que comprende el dominio variable de cadena pesada de la sec. con núm. de ident.:4, y el dominio variable de cadena ligera de la sec. con núm. de ident.:10 o la sec. con núm. de ident.rll; (L) N-succinimidil - [ (N-maleimidopropionamido) -tetraetilenglicol] éster (NHS-PEG4-maleimida) ; y (C) N (2 ' ) -deacetil-N2- (4-mercapto-4-metil-l-oxopentil) -maitansina .
106. El método de conformidad con la reivindicación 101, caracterizado porque el inmunoco jugado comprende: (A) un anticuerpo humanizado que comprende el dominio variable de cadena pesada de la sec. con núm. de ident.:4, y el dominio variable de cadena ligera de la sec. con núm. de ident.:10 o la sec. con núm. de ident.:ll; (L) N-succinimidil 4- (2-piridilditio) butanoato (SPDB) ; y (C) N (2 ' ) -deacetil-N2- (4-mercapto-4-metil-l-oxopentil) -maitansina; en donde (L) enlaza (A) a (C) .
107. El método de conformidad con la reivindicación 101/ caracterizado porque el inmunoconjugado comprende: (A) un anticuerpo humanizado que comprende el dominio variable de cadena pesada de la sec. con núm. de ident.:4, y el dominio variable de cadena ligera de la sec. con núm. de ident.:10 o la sec. con núm. de ident.rll; (L) W-succinimidil 4- (2-piridilditio) -2-sulfobutanoato (sulfo-SPDB) y (C) N (21 ) -deacetil-N2- (4-mercapto-4-metil-l-oxopentil) -maitansina ; en donde (L) enlaza (A) a (C) .
108. El método de conformidad con la reivindicación 101, caracterizado porque el inmunoconj ugado comprende: (A) un anticuerpo humanizado que comprende el dominio variable de cadena pesada de la sec. con núm. de ident.:4, y el dominio variable de cadena ligera de la sec. con núm. de ident.:10 o la sec. con núm. de ident.:ll; (L) N-succinimidil 4- (2-piridilditio) -2-sulfopentanoato (sulfo-SPP); y (C) N(2' ) -deacetil- (21 ) - (3-mercapto-l-oxopropil) -maitansina; en donde (L) enlaza (A) a (C) .
109. El método de conformidad con la reivindicación 101, caracterizado porque el inmunocon ugado comprende: (A) un anticuerpo humanizado que comprende el dominio variable de cadena pesada de la sec. con núm. de ident.:4, y el dominio variable de cadena ligera de la sec. con núm. de ident.:10 o la sec. con núm. de ident.:ll; (L) N-succinimidil 4- (2-piridilditio) pentanoato (SPP) ; y (C) (2 ' ) -deacetil-N (2 ' ) - (3-mercapto-l-oxopropil) -maitansina ; en donde (L) enlaza (A) a (C) .
110. El método de conformidad con la reivindicación 101, caracterizado porque el anticuerpo es el anticuerpo huFR-1-21 depositado en la ATCC el 7 de abril de 2010 y que tiene los núms. de depósito de la ATCC PTA-10775 y PTA-10776.
111. El método de conformidad con la reivindicación 101, caracterizado porque el anticuerpo es el anticuerpo huFRl-21 en donde el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende SSYG S (sec. con núm. de ident.:30); una CDR2 de cadena pesada que comprende TISSGGSYTY (sec. con núm. de ident.:31); y una CDR3 de cadena pesada que comprende DGEGGLYAMDY (sec. con núm. de ident . : 32 ) ; y (b) una CDRl de cadena ligera que comprende KASDHINNWLA (sec. con núm. de ident. :27); una CDR2 de cadena ligera que comprende GATSLET (sec. con núm. de ident. :28); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQYWSTPFT (sec. con núm. de ident. :29) .
112. El método de conformidad con la reivindicación 101, caracterizado porque el anticuerpo es el anticuerpo huFRl-48 en donde el anticuerpo comprende: (a) una CDRl de cadena pesada que comprende TNYWMQ (sec. con núm. de ident.: 60); una CDR2 de cadena pesada que comprende AIYPGNGDSR (sec. con núm. de ident. :61); y una CDR3 de cadena pesada que comprende RDGNYAAY (sec. con núm. de ident.: 62); y (b) una CDRl de cadena ligera que comprende RASENIYSNLA (sec. con núm. de ident. :57); una CDR2 de cadena ligera que comprende AATNLAD (sec. con núm. de ident. :58); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QHFWASPYT (sec. con núm. de ident. : 59) .
113. El método de conformidad con la reivindicación 101, caracterizado porque el anticuerpo es el anticuerpo huFRl-49 en donde el anticuerpo comprende: (a) una CDRl de cadena pesada que comprende TNYWMY (sec. con núm. de ident.: 66); una CDR2 de cadena pesada que comprende AIYPGNSDTT (sec. con núm. de ident.:67); y una CDR3 de cadena pesada que comprende RHDYGAMDY (sec. con núm. de ident . : 68 ) ; y (b) una CDRl de cadena ligera que comprende RASENIYTNLA (sec. con núm. de ident. :63); una CDR2 de cadena ligera que comprende TASNLAD (sec. con núm. de ident. :64); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QHFWVSPYT (sec. con núm. de ident . : 65 ) ,
114. El método de conformidad con la reivindicación 101, caracterizado porque el anticuerpo es el anticuerpo huFRl-57 en donde el anticuerpo comprende: (a) una CDRl de cadena pesada que comprende SSFGMH (sec. con núm. de ident.: 72); una CDR2 de cadena pesada que comprende YISSGSSTIS (sec. con núm. de ident. :73); y una CDR3 de cadena pesada que comprende EAYGSS EY (sec. con núm. de ident . : 74 ) ; y (b) una CDRl de cadena ligera que comprende RASQNINNNLH (sec. con núm. de ident. :69); una CDR2 de cadena ligera que comprende YVSQSVS (sec. con núm. de ident. :70); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSNSWPHYT (sec. con núm. de ident. :71) .
115. El método de conformidad con la reivindicación 101, caracterizado porque el anticuerpo es el anticuerpo huFRl-65 en donde el anticuerpo comprende: (a) una CDRl de cadena pesada que comprende TSYTMH (sec. con núm. de ident.:78) una CDR2 de cadena pesada que comprende YINPISGYTN (sec. con núm. de ident.:79); y una CDR3 de cadena pesada que comprende GGAYGRKPMDY (sec. con núm. de ident . : 80) ; y (b) una CDRl de cadena ligera que comprende KASQNVGPNVA (sec. con núm. de ident. :75) una CDR2 de cadena ligera que comprende SASYRYS (sec. con núm. de ident.: 76); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQYNSYPYT (sec. con núm. de ident . : 77 ) .
116. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 100-115, caracterizado porque el tumor es un tumor seleccionado del grupo consistente de tumor de ovario, tumor cerebral, tumor de mamas, tumor uterino, tumor endometrial, tumor pancreático, tumor renal, y tumor de pulmón.
117. El método de conformidad con la reivindicación 116, caracterizado porque el tumor es un tumor de ovario.
118. El método de conformidad con la reivindicación 116, caracterizado porque el tumor es un tumor de pulmón.
119. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 100-118, caracterizado porque el crecimiento tumoral se inhibe para tratar el cáncer.
120. El método de conformidad con la reivindicación 119, caracterizado porque comprende, además, administrar un segundo agente anticanceroso al sujeto.
121. El método de conformidad con la reivindicación 120, caracterizado porque el segundo agente contra el cáncer es un agente quimioterapéutico .
122. Una célula aislada, caracterizada porque produce el anticuerpo, fragmento de unión al antigeno, o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-71.
123. Un aislado caracterizado porque comprende una secuencia al menos 90% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo consistente de las sec. con núm. de ideen 5, 14, 15, 37, 38, 43, 44, 47, 48, y 120-127.
124. El aislado de conformidad con la reivindicación 123, caracterizado porque la secuencia es al menos 95% idéntica a la secuencia seleccionada del grupo consistente de las sec. con núm. de 5, 14, 15, 37, 38, 43, 44, 47, 48, y 120-127.
125. El aislado de conformidad con la reivindicación 124, caracterizado porque la secuencia es al menos 99% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo consistente de las sec. con núm. de 5, 14, 15, 37, 38, 43, 44, 47, 48, y 120-127.
126. Un vector caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 123-125.
127. Una célula huésped caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 126.
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