TWI787590B - 等電點低之抗體的精製方法 - Google Patents

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Abstract

本案發明人等發現:將pI低的抗體使用Protein A管柱精製並進行酸性處理及中和處理後經過一定期間，再進行將生成的抗體的締合體予以去除的步驟，能夠抑制之後之抗體之締合化。本案發明人等發現:藉由將pI低的抗體利用陰離子交換樹脂之結合/洗提模式，再以疏水性交互作用層析或多模式層析樹脂精製，能比起以往更有效率地去除雜質。

Description

等電點低之抗體的精製方法
本發明係關於抗體之精製方法，尤關於等電點(pI)低的抗體用的精製方法。
因為基因重組技術的發達，已能以穩定的供給量提供各種蛋白質製劑。尤其近年來已利用基因重組技術開發了選擇性比通常的醫藥品更高的各式各樣的抗體醫藥品，並已進入臨床試驗。
如此的利用基因重組技術產生的含生理活性蛋白質的製劑中，來自寄主細胞之蛋白質(Host cell proteins)、DNA、為精製原材料之一之樹脂配體片段、來自目的蛋白質之締合體(association)、片段等必須加以去除。又，為了擔保製劑之病毒安全性，精製步驟須顯示充分的病毒去除能力、失活能力。現在，世界衛生組織(WHO)提出生物醫藥品中的DNA的容許量為100pgDNA/一投予量以下。又，世界衛生組織(WHO)提出:針對病毒，當培養液認為有類似反轉錄病毒的粒子存在時，考量精製步驟之反轉錄病毒之去除能力、失活能力，為1個病毒粒子/106 投予量以下。為了符合此基準，一般而言，係藉由將從寄主細胞獲得之含生理活性蛋白質之水性培養基利用親和性層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析、羥基磷灰石層析、疏水性交互作用層析或該等組合進行處理以去除雜質。又，近年來新的精製配體的開發已有進展，除了離子交換作用尚有疏水性交互作用的具兩作用的多模式層析也開始用於精製。
尤其，生理活性蛋白質為使用哺乳動物細胞作為寄主而得之抗體時，係利用Protein A或Protein G結合於IgG之Fc鏈的性質，利用Protein A或Protein G之親和性管柱層析進行處理後再以各種層析進行精製。 例如:日本特表平5-504579號(專利文獻1)中，將由哺乳動物細胞培養獲得之含抗體之水性培養基適用在Protein A或Protein G管柱層析而使管柱吸附抗體，再使用酸性溶液(濃度約0.1M之檸檬酸、pH3.0-3.5)使抗體洗提，將獲得之酸性洗提液按順序適用離子交換管柱層析、尺寸排除管柱層析而進行精製。
為了血中滯留性或體內動態之提高，已知有用來控制抗體之等電點(pI)之胺基酸取代技術，具體而言，藉由改變露出在抗體表面的胺基酸殘基以控制抗體之pI之技術(WO 07/114319(專利文獻2))。天然抗體之等電點(pI)約7.5~9.5之範圍，有比較高的pI。藉由將如此的抗體的胺基酸殘基加以改變而使pI為低，能夠期待抗體之血漿中滯留性、半減期延長，關係到作為醫藥的抗體的投予量減少、投予間隔延長。 但至今為止，並未有人針對適於天然不存在之有低pI之抗體的精製法進行探討、或針對低pI抗體於精製步驟中特有的問題進行探討。因此對於適於如此的低pI抗體的精製方法係完全未知。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1] 日本特表平5-504579號 [專利文獻2] WO 07/114319
(發明欲解決之課題)
本發明之目的係提供特別能從含有pI低之抗體的組成物以良好效率去除雜質之抗體之精製法。 一般，作為從培養液中將抗體予以粗精製之方法，主流係使用Protein A管柱。此時，一般而言，於從管柱之洗提步驟係以酸性溶液進行洗提，再視需要加酸，維持酸性狀態一定時間以進行病毒之失活處理，中和處理後立即移到下一精製步驟。
本案發明人等發現:尤其將pI改變成低值之抗體以通常之精製步驟進行精製時，精製步驟結束後會有新出現締合體的問題。探討此原因的結果，發現:該抗體置於酸性狀態一定時間後進行中和處理時，會有一部分抗體於一定期間、緩慢地進行不可逆締合化的現象。
一般的抗體的pI值高，呈鹼性，故以Protein A親和性樹脂精製後，由於鹼性的特性，係於陽離子交換樹脂以結合/洗提模式、於陰離子交換樹脂以通過(Pass through)模式進行精製。通常，已知:陽離子交換樹脂會去除締合體，陰離子交換樹脂會吸附DNA、寄主細胞蛋白質、病毒這些雜質並去除。但是在研究pI改變為低值之抗體之精製法時，了解到:針對pI改變為低之抗體，以往的精製法對於抗體之培養液中含有的雜質的去除效率不足。 (解決課題之方式)
為了達成上述目的而努力研究，結果本案發明人等發現:將pI低的抗體使用Protein A管柱進行精製並進行中和處理後，經過一定期間後，進行將生成的抗體的締合體予以去除的步驟，能抑制之後之抗體之締合化。 又，發現:藉由將pI低的抗體以陰離子交換樹脂的結合/洗提模式予以精製，能比以往更有效率地去除雜質。又，發現到:藉由使用陰離子交換層析以外，尚使用多模式層析或疏水性交互作用層析，能更去除雜質。
亦即，本發明提供以下[1]~[19]。 [1] 一種方法，係含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物之精製方法，包含以下步驟: (a)將含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物於酸性條件處理; (b)將步驟(a)獲得之酸性組成物予以中和;及 (c)中和後經至少1小時後，從步驟(b)獲得之中和組成物將締合體去除。 [2] 如[1]之方法，其中，步驟(a)係將pI值為3.0~8.0之抗體以Protein A管柱層析精製後實施的病毒失活處理步驟。 [3] 如[1]或[2]之方法，其中，步驟(c)係將步驟(b)獲得之中和組成物予以中和後保持至少1小時後將締合體去除之步驟。 [4] 如[1]至[3]中任一項之方法，其中，締合體之去除係利用陰離子交換層析、疏水性交互作用層析、多模式層析或羥基磷灰石層析進行。 [5] 如[1]至[4]中任一項之方法，其中，抗體之pI值為5.0~7.5。 [6] 如[1]至[4]中任一項之方法，其中，抗體之pI值為5.0~6.5。 [7] 一種方法，係從含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物將雜質去除之方法，包含以下步驟: (a)於陰離子交換樹脂載入含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物， (b)使用比起(a)之組成物之鹽濃度更高鹽濃度之洗提溶液，利用結合/洗提模式從陰離子交換樹脂洗提pI值為3.0~8.0之抗體。 [8] 如[7]之方法，於步驟(b)之前包括使用洗滌溶液將陰離子交換樹脂予以洗滌之步驟。 [9] 如[7]或[8]之方法，其中，步驟(b)之洗提溶液係含有選自於由氯化鈉、Tris鹽、硫酸鈉鹽、磷酸鈉鹽構成之群組中至少1種成分之溶液。 [10] 如[7]至[9]中任一項之方法，更包含以下步驟:將由步驟(b)獲得之含有pI值為3.0~8.0之抗體的洗提產物載入使用具疏水性配體及/或多模式配體之樹脂之層析並取得流過(Flow through)級分及/或洗提級分。 [11] 如[1]至[6]中任一項之方法，其中，締合體之去除係以如[7]至[10]中任一項之方法進行。 [12] 如[1]至[11]中任一項之方法，其中，抗體為人類化抗體或人類抗體。 [13] 如[1]至[12]中任一項之方法，其中，抗體為抗IL-6受體抗體或抗IL-31受體抗體。 [14] 一種含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物之製造方法，係利用如[1]至[13]中任一項之方法，使抗體之締合體之含有比例為3%以下。 [15] 一種組成物，係含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物，抗體之締合體之含有比例為3%以下。 [16] 一種組成物，係依如[14]之含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物之製造方法製造之含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物，締合體之含有比例為3%以下。 [17] 一種含有pI值為3.0~8.0之抗體之醫藥組成物之製造方法，包含以下步驟： 1)依如[14]之含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物之製造方法製造pI值為3.0~8.0抗體及/或含該抗體之組成物;及 2)將步驟1)製造之pI值為3.0~8.0抗體及/或含該抗體之組成物和醫藥上可容許之擔體及/或添加劑混合並製劑化。 [18] 一種從含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物將抗體之締合體去除之方法，包含以下步驟: (a)將含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物以酸性條件處理; (b)將步驟(a)獲得之酸性組成物予以中和;及 (c)中和後經至少1小時後從步驟(b)獲得之中和組成物將締合體去除。 [19] 一種含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物之精製方法，包含以下步驟: (a)將含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物於酸性條件處理; (b)將步驟(a)獲得之酸性組成物予以中和;及 (c)於締合體之形成經過充分的時間後，從步驟(b)獲得之中和組成物將締合體去除。
以下詳細說明本發明。 本發明係關於從含有等電點(pI)低之抗體的組成物將該抗體之締合體、雜質予以去除之方法。具體而言，本發明係一種從含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物去除其締合體之方法，包含以下步驟: (a)將含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物於酸性條件進行處理; (b)將步驟(a)獲得之酸性組成物予以中和;及 (c)中和後經至少1小時後，從步驟(b)獲得之中和組成物將締合體去除。
本發明中，藉由對於步驟(b)獲得之中和組成物中生成的締合體的形成而言充分的時間經過後，從該組成物將締合體予以去除，能抑制精製後新形成締合體。 具體而言，藉由於中和後經至少1小時後從步驟(b)獲得之中和組成物將締合體去除，能抑制精製後新形成締合體。 亦即，本發明之步驟(c)換言之可為如下。 ・對於締合體之形成充分的時間經過後，從步驟(b)獲得之中和組成物將締合體去除。 ・於相對於步驟(b)獲得之中和組成物能生成之締合體量已形成至少80%以上之締合體後，從該組成物將締合體去除。 ・於相對於步驟(b)獲得之中和組成物保持至少24小時後能形成之締合體量已形成至少80%以上之締合體後，從該組成物將締合體去除。 ・於步驟(b)獲得之中和組成物能發生之締合體之形成已完成80%以上後，從該組成物去除締合體。 ・在步驟(b)獲得之中和組成物中之締合體之形成完成至少1小時之前，從該組成物去除締合體。
本發明係一種從含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物去除雜質之方法，包含以下步驟: (a)對於陰離子交換樹脂載入含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物; (b)使用比(a)之組成物之鹽濃度更高鹽濃度之洗提溶液，利用結合/洗提模式從陰離子交換樹脂洗提pI值為3.0~8.0之抗體。 上述方法中，在步驟(b)之前可包括使用洗滌溶液來洗滌陰離子交換樹脂的步驟。
本發明中，從含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物去除其締合體之方法，也可表達為:從含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物將該抗體(抗體單體)精製之方法、從含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物去除雜質之方法、抑制pI值為3.0~8.0之抗體之締合化之方法等。 又，從含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物去除雜質之方法，也可表達為:從含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物將該抗體(抗體單體)予以精製之方法、從含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物將該抗體之締合體去除之方法等。 本發明中，含有抗體的組成物也可表達為:含有抗體之溶液、抗體之培養液、抗體之培養培養基等。
本發明使用之抗體只要會和所望抗原結合即可，無特殊限制，可為多株抗體亦可為單株抗體，考量能穩定生產均質抗體的觀點，單株抗體較佳。
本發明使用之單株抗體不只包括來自人類、小鼠、大鼠、倉鼠、兔、羊、駱駝、猴等動物來源的單株抗體，也包括嵌合抗體、人類化抗體、雙專一性(bispecific)抗體等人為改變而得的基因重組型抗體。再者，也包括為了改善血中滯留性、體內動態而進行抗體分子物性改變(具體而言，等電點(pI)改變、Fc受容體之親和性改變等)，而將抗體之不變區等予以人為改變過的基因重組型抗體。
又，本發明使用之抗體之免疫球蛋白的類別無特殊限定，可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等IgG、IgA、IgD、IgE、IgM等任一類別，宜為IgG及IgM為較佳。
本發明使用之抗體不只包括具不變區與可變區之抗體(完整(whole)抗體)，也包括Fv、Fab、F(ab)2 等抗體片段、或將抗體之可變區以胜肽連結子等連結子結合而得的1價或2價以上的單條鏈Fv(scFv、sc(Fv)2 )、scFv二元體等雙體抗體(Diabody)等等低分子化抗體等，較佳為完整(whole)抗體。
上述本發明使用之抗體可依該技術領域中具通常知識者周知的方法製作。產生單株抗體的融合瘤，基本上可使用公知技術依以下方式製作。亦即，可將所望抗原、表現所望抗原之細胞作為感作抗原，將其依通常的免疫方法進行免疫，使獲得之免疫細胞依通常的細胞融合法和公知之親代細胞融合，依通常之篩選法，篩選單株抗體產生細胞(融合瘤)以製作。融合瘤之製作，例如可依Milstein等人的方法(Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46)等實施。抗原之免疫原性低的情形，可使其和白蛋白等具有免疫原性的巨大分子結合並進行免疫。
又，可使用從融合瘤選殖抗體基因，納入適當的載體並將其導入到寄主，使用基因重組技術而產生之基因重組型抗體(例如參照:Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990)。具體而言，從融合瘤之mRNA使用反轉錄酵素來合成抗體之可變區(V區)之cDNA。獲得編碼為目的抗體之V區之DNA後，將其和編碼為所望抗體不變區(C區)之DNA連結，並將其納入到表現載體。或也可將編碼為抗體之V區的DNA納入到含有抗體C區之DNA的表現載體。納入到在表現控制區，例如:增強子、啟動子之控制下表現的表現載體。然後，可以此表現載體將寄主細胞予以轉形，使抗體表現。
本發明中，可使用為了使對於人類之異種抗原性降低等而予以人為改變而得的基因重組型抗體，例如:嵌合(Chimeric)抗體、人類化(Humanized)抗體等。該等改變抗體可使用已知方法製造。嵌合抗體，係由人類以外之哺乳動物，例如:小鼠抗體之重鏈、輕鏈之可變區和人類抗體之重鏈、輕鏈之不變區構成的抗體，可藉由將編碼為小鼠抗體之可變區之DNA和編碼為人類抗體之不變區之DNA予以連結，將其納入表現載體並導入到寄主使其產生以獲得。
人類化抗體也稱為再構成(reshaped)人類抗體，係將人類以外之哺乳動物，例如小鼠抗體之互補性決定區(CDR; complementarity determining region)移植到人類抗體之互補性決定區而得者，其一般的基因重組方法亦為已知。具體而言，將設計為將小鼠抗體之CDR與人類抗體之讀框區(framework region；FR)予以連結的DNA序列，使用製成在末端區有重疊部分之數個寡核苷酸以PCR法進行合成。將獲得之DNA與編碼為人類抗體不變區之DNA連結，其次納入表現載體，並將其導入寄主並使其產生可獲得(參照歐洲專利申請案公開編號EP 239400、WO 96/02576)。經由CDR而連結之人類抗體之FR，係選擇互補性決定區形成良好之抗原結合部位者。因應須要，亦可將抗體之可變區之框架區之胺基酸進行取代以使再構成人類抗體之互補性決定區能形成適當的抗原結合部位(Sato, K.et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856)。
為了改善抗體之活性、物性、藥物動態、安全性等而將抗體之胺基酸予以取代之技術，例如以下所述技術亦為已知，本發明使用之抗體也包括施以如此的胺基酸取代(尚包括缺損、附加)之抗體。
對於IgG抗體之可變區施以胺基酸取代之技術，已有人報告利用人類化(Tsurushita N, Hinton PR, Kumar S., Design of humanized antibodies: from anti-Tac to Zenapax., Methods. 2005 May;36(1):69-83.)等使結合活性增強之利用互補性決定區(CDR)之胺基酸取代所為之親和性成熟(affinity maturation)(Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R., A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jun 14;102(24):8466-71.)、利用框架(FR)之胺基酸取代所為之物理化學的安定性之提高(Ewert S, Honegger A, Pluckthun A., Stability improvement of antibodies for extracellular and intracellular applications: CDR grafting to stable frameworks and structure-based framework engineering., Methods. 2004 Oct; 34(2):184-99. Review)。又，作為對於IgG抗體之Fc區施以胺基酸取代之技術，已知有使抗體依存性細胞傷害活性(ADCC)活性、補體依存性細胞傷害活性(CDC)活性增強之技術(Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. 2005 Aug 31;20(1):17-29. Review.)。再者，也有人報告:不只使如此的效應子機能增強，也使抗體之血中半減期提高之Fc之胺基酸取代之技術(Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life., J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56.、Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat Biotechnol. 1997 Jul;15(7):637-40.)。再者，也已知為了進一步改善抗體之物性而將不變區之各種胺基酸取代之技術(WO 09/41613)。
又，人類抗體之取得方法亦為已知。例如:將人類淋巴球於體外(in vitro)以所望抗原或表現所望抗原之細胞予以感作，使感作淋巴球和人類骨髓瘤細胞，例如U266融合，亦可獲得具有向抗原之結合活性的所望人類抗體(參照日本特公平1-59878)。又，可藉由將具有人類抗體基因之全部庫存(repertory)之基因轉殖動物以抗原免疫，而取得所望人類抗體(參照WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096、WO 96/33735)。再者，使用人類抗體庫利用淘選取得人類抗體的技術亦為已知。例如:可將人類抗體之可變區以單鏈抗體(scFv)的形式，利用噬菌體展示(phage display)法在噬菌體表面表現，選擇結合於抗原之噬菌體。若能解析選擇之噬菌體之基因，則可決定編碼為結合於抗原之人類抗體之可變區的DNA序列。若明瞭結合於抗原之scFv之DNA序列，則可製作含該序列之適當的表現載體並取得人類抗體。該等方法已為周知，可參考WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388。本發明使用之抗體也包括如此的人類抗體。
當先將抗體基因予以單離，導入到適當寄主並製作抗體時，可使用適當的寄主與表現載體的組合。使用真核細胞作為寄主時，可以使用動物細胞、植物細胞、真菌細胞。動物細胞已知:(1) 哺乳類細胞，例如:CHO、COS、骨髓瘤、BHK (baby hamster kidney)、HeLa、Vero，(2) 兩生類細胞，例如非洲爪蟾卵母細胞、或(3) 昆蟲細胞，例如:sf9、sf21、Tn5等。植物細胞以煙草(Nicotiana)屬，例如煙草(Nicotiana tabacum)等來源之細胞為公知，將其利用癒傷組織培養即可。真菌細胞已知有:酵母，例如:糖化酵母(Saccharomyces)屬，例如啤酒酵母(Saccharomyces serevisiae)，絲狀菌例如:麴菌(Aspergillus)屬，例如黑麴菌(Aspergillus niger)等。使用原核細胞時，有使用細菌細胞之產生系。細菌細胞已知大腸菌(E. coli)、枯草菌。對於該等細胞利用轉形導入目的之抗體基因，並將經轉形的細胞以體外(in vitro)培養，可獲得抗體。
再者，本發明使用之抗體包括抗體片段、低分子化抗體、及抗體修飾物。例如:作為抗體片段、低分子化抗體，可列舉將Fab、F(ab')2、Fv或H鏈與L鏈之Fv以適當連結子連結而得之一價或二價以上之單鏈Fv(scFv、sc(Fv)2 等)(Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883)。具體而言，將抗體利用酵素，例如:木瓜酶、胃蛋白酶處理並生成抗體片段、或建構編碼為此等抗體片段之基因，將其導入到表現載體後，使適當的寄主細胞表現(例如參照Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137)。
作為抗體修飾物，亦可使用和聚乙二醇(PEG)、細胞傷害性藥劑等各種分子結合而得之抗體(Farmaco. 1999 Aug 30;54(8):497-516.、Cancer J. 2008 May-Jun;14(3):154-69.)。本發明使用之抗體也包括該等抗體修飾物。如此的抗體修飾物可藉由對於抗體施以化學性修飾而得。該等方法於此領域中已建立。
本發明使用之抗體可列舉抗組織因子抗體、抗IL-6受體抗體、抗IL-6抗體、HM1.24抗原單株抗體、抗副甲狀腺激素關連胜肽抗體(抗PTHrP抗體)、抗Glypican-3抗體、抗神經節苷脂GM3抗體、抗TPO受器致效劑抗體、凝血第VIII因子代替抗體、抗IL31受體抗體、抗HLA抗體、抗AXL抗體、抗CXCR4抗體、抗NR10抗體、第IX因子與第X因子之雙專一性(Bi-specific)抗體等，但不限定於此等。
本發明使用之理想再構成人類化抗體，可列舉人類化抗介白素6(IL-6)受體抗體(tocilizumab、hPM-1或MRA)(參照WO92/19759)、人類化抗HM1.24抗原單株抗體(參照WO98/14580)、人類化抗副甲狀腺激素関連胜肽抗體(抗PTHrP抗體)(參照WO98/13388)、人類化抗組織因子抗體(參照WO99/51743)、抗Glypican-3人類化IgG1κ抗體(參照PCT/JP05/ 013103)、抗NR10人類化抗體(參照WO2009/072604)、第IX因子與第X因子之雙專一性(Bi-specific)人類化抗體等，但不限定於此等。本發明使用之人類化抗體中特別理想者為:人類化抗IL-6受體抗體、抗NR10人類化抗體、及第IX因子與第X因子之雙專一性(Bi-specific)人類化抗體。
人類IgM抗體宜為抗神經節苷脂GM3重組型人類IgM抗體(參照WO05/05636)等較佳。 低分子化抗體宜為抗TPO受器致效劑雙體抗體(Diabody) (參照WO02/33072)、抗CD47致效劑雙體抗體(Diabody)(參照WO01/66737)等為較佳。
本發明中，等電點低之抗體(低pI抗體)，特別指天然難存在之有低等電點之抗體。如此的抗體的等電點例如為3.0~8.0，較佳為5.0~7.5，更佳為5.0~7.0，再更佳為5.0~6.8，更佳為5.0~6.5，尤佳為5.0~6.0，但不限定於此等。又，天然之(或通常之)抗體通常據認為有7.5~9.5之範圍之等電點。
本發明使用之抗體宜為藉由將露出到抗體表面之胺基酸殘基予以改變而使抗體之pI降低而得之pI改變抗體較佳。如此的pI改變抗體，係指比改變前之抗體之pI值降低1以上，較佳為降低2以上，更佳為降低3以上之抗體。如後述實施例所記載，改變Mab3(等電點：9.4)之胺基酸序列而控制等電點之Mab1之等電點為5.8。又，將依WO2009/072604之實施例12記載之方法製作的完全人類化NS22抗體(等電點：7.8)之胺基酸序列予以改變而控制等電點之Mab2之等電點為5.6。
等電點改良的抗體，可列舉例如:WO 2009/041621記載之為抗IL-6受體之抗體Mab1(H鏈/序列編號：1、L鏈/序列編號：2)、抗NR10人類化抗體，依WO2009/072604之實施例12記載之方法製作之完全人類化NS22抗體(H鏈/序列編號：3、L鏈/序列編號：4)等，但不限定於此等。
作為露出於抗體之表面之胺基酸殘基，於H鏈可變區的情形，可舉例依Kabat編號法之胺基酸殘基H1、H3、H5、H8、H10、H12、H13、H15、H16、H19、H23、H25、H26、H31、H39、H42、H43、H44、H46、H61、H62、H64、H65、H68、H71、H72、H73、H75、H76、H81、H82b、H83、H85、H86、H105、H108、H110、H112之中選出的胺基酸殘基，但不限定於此等。又，為L鏈可變區時，可舉例依Kabat編號法之胺基酸殘基L1、L3、L7、L8、L9、L11、L12、L16、L17、L18、L20、L22、L24、L27、L38、L39、L41、L42、L43、L45、L46、L49、L53、L54、L55、L57、L60、L63、L65、L66、L68、L69、L70、L74、L76、L77、L79、L80、L81、L85、L100、L103、L105、L106、L107之中選出的胺基酸殘基，但不限定於此等。
本發明中，「改變」係指原本的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基、原本的胺基酸殘基缺失、附加新的胺基酸殘基等，但較佳為指原本的胺基酸殘基取代為其他的胺基酸殘基。
胺基酸之中已知存在帶電荷之胺基酸。一般，帶正電荷之胺基酸(正電荷胺基酸)已知為離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)。帶負電荷之胺基酸(負電荷胺基酸)已知為天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)等。其他胺基酸已知為不帶電荷之胺基酸。
本發明中，改變後之胺基酸殘基較佳為從以下(a)或(b)中任一群所含之胺基酸殘基中適當選擇，但不特別限於該等胺基酸。 (a)麩胺酸(E)、天冬胺酸(D) (b)離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)
又，改變前之胺基酸殘基已帶有電荷時，改變為不帶電荷之胺基酸殘基亦為一理想態樣。 亦即，本發明中，改變可列舉: (1)從帶電荷之胺基酸取代為不帶電荷之胺基酸、(2)從帶電荷之胺基酸取代為帶有和該胺基酸為相反電荷之胺基酸、(3)從不帶電荷之胺基酸取代為帶電荷之胺基酸。
等電點之值可依該技術領域中具通常知識者公知之等電點電泳進行測定。又，理論等電點之值，可使用基因及胺基酸序列解析軟體(Genetyx等)計算。
胺基酸殘基之電荷經改變之抗體，可藉由將編碼為抗體之核酸予以改變，將該核酸於寄主細胞培養，從寄主細胞培養物將抗體予以精製以取得。本發明中，「將核酸予以改變」，係指將核酸序列予以改變，以使成為因改變導入之胺基酸殘基所對應之密碼子。更具體而言，係指將核酸之鹼基序列予以改變，以使改變前之胺基酸殘基之密碼子成為因改變而導入之胺基酸殘基之密碼子。亦即，將編碼為被改變之胺基酸殘基之密碼子取代為編碼為因改變而導入之胺基酸殘基之密碼子。如此的核酸的改變，可使用該技術領域中具通常知識者公知之技術，例如:部位專一性變異誘發法、PCR變異導入法等適當進行。
本發明之一理想態樣，可藉由包括以下步驟之方法從含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物將產生之締合體以良好效率去除： (a)將含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物於酸性條件處理; (b)將步驟(a)獲得之酸性組成物予以中和;及 (c)中和後經至少1小時後，從步驟(b)獲得之中和組成物將締合體去除。 本發明中，pI為3.0~8.0之抗體之締合體可列舉1.5元體、二元體、三元體、四元體、五元體等，但不限定於此等。
依本發明之方法能將溶液中產生之低pI抗體之締合體以良好效率去除，且可壓抑之後重新生成締合體的風險。本發明中，處理含抗體之組成物之酸性條件，通常例如為pH 2.0~4.0，較佳為pH 3.0~3.9，更佳為pH 3.1~3.8，但不限定於此等。 將含抗體之組成物以酸性條件處理之方法，可列舉將鹽酸、檸檬酸、磷酸、乙酸等公知之酸加到含抗體之組成物中之方法，但不限定於此等。 本發明中，將經酸性條件處理之含抗體之組成物保持一定時間較佳。保持時間，例如15分鐘~4小時，較佳為30分鐘~2小時，更佳為1~1.5小時，但不限定於此等。
本發明中，將酸性組成物予以中和之步驟，係指將經酸性處理之含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物予以中和之步驟。中和後之pH通常可列舉pH 4.5~8.5，較佳為pH 6.5~8.5，更佳為pH 7.0~8.5，但不限定於此等。
依本申請案之實施例之結果了解:於本發明之抗體之精製方法，當間歇地實施使上述酸性組成物之pH上昇之步驟(中和步驟等)時，締合體不易形成。因此本發明之抗體之精製方法或締合體之去除方法中，將生成之抗體之締合體予以去除之步驟，宜於最終使pH上昇之步驟(中和步驟等)結束後進行較佳。又，締合體去除後，宜不實施再度使pH上昇之步驟較佳。
本發明中，當將含抗體之酸性組成物中和，並於比抗體之pI更低之pH將該組成物保持一定時間時，可更包括將該組成物之pH調整為比抗體之pI更高之值並保持該組成物一定時間之步驟。更具體而言，本發明係關於含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物之精製方法，包括以下步驟: (a)將含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物於酸性條件處理; (b)將步驟(a)獲得之酸性組成物中和，並於比抗體之pI更低之pH保持該組成物; (c)將步驟(b)獲得之中和組成物之pH調整為比抗體之pI更高之值;及 (d)中和後經至少1小時後，從步驟(b)獲得之中和組成物將締合體去除。就比抗體之pI更低之pH，可列舉比抗體之pI低例如0.3以上，較佳為0.5以上，更佳為1.0以上之pH，但不限定於此等。另一方面，比抗體之pI更高之pH，可列舉比抗體之pI高例如0.3以上，較佳為0.5以上，更佳為1.0以上之pH，但不限定於此等。又，保持中和後之組成物之時間，例如1小時以上(例如:1小時~7日，較佳為1~3日)，較佳為2小時以上(例如2小時~7日，較佳為2~72小時)，又更佳為6小時以上(例如6小時~7日，較佳為6~72小時)，更佳為12小時以上(例如12小時~7日，較佳為12~72小時)，但不限定於此等。
中和可使用緩衝液進行。中和使用之緩衝液，只要是通常用於pH調整之緩衝液即可，無特殊限制，例如:Tris、磷酸氫2鈉等，較佳為Tris，但不限定於此等。
本發明之特徵為:首次發現將含抗體之酸性溶液予以中和後，會有一定時間繼續地持續生成不可逆性的締合體。如此的現象是在pI未改變之通常的抗體(pI為9附近的抗體)未發現到的現象。生成不可逆性之締合體的原因雖不詳，據認為原因係:低pI抗體在酸性溶液中受到壓力(stress)、在抗體之pI值附近組成物進行pH之調整或跨越pI值進行組成物之pH之調整導致抗體分子之電荷變化等。不論如此，本發明之方法在將經酸性處理之pI值為3.0~8.0之抗體中和後，經一定時間經過後將生成之抗體之締合體予以去除，藉此可防止締合體去除後新產生締合體。
更具體而言，中和後直到抗體之締合體之去除為止之時間通常為1小時以上(例如:1小時~7日，較佳為1~3日)，較佳為2小時以上(例如2小時~7日，較佳為2~72小時)，更佳為6小時以上(例如6小時~7日，較佳為6~72小時)，更佳為12小時以上(例如12小時~7日，較佳為12~72小時)，尤佳為20小時、23小時、24小時或66小時或更久，但不限定於此等。
或本發明中，締合體形成經充分時間後，從已中和之組成物將締合體去除。本發明中，對於締合體之形成而言充分的時間，係指期待於已中和之組成物形成締合體的抗體為了形成締合體的必要時間。對於本發明之締合體之形成為充分的時間，不只包括為了期待形成締合體之全部抗體形成締合體所必要之時間，也包括期待形成締合體之抗體之中，至少50%以上，較佳為70%以上，更佳為80%以上，尤佳為90%以上之抗體形成締合體所必要的時間。只要是該技術領域中具通常知識者，即可考慮實施例1所示之締合體之生成時間，設定中和後直到抗體之締合體之去除為止的時間。
或本發明中，也可於相對於中和組成物可能生成之締合體量至少有50%以上，較佳為70%以上，更佳為80%以上，尤佳為90%以上之締合體形成後，從該組成物將締合體去除。本發明中，中和組成物可能生成之締合體量，係指中和組成物中由期待形成締合體之抗體所形成之締合體之量。中和組成物中可能生成之締合體量，可列舉於中和後通常保持1小時以上(例如:1小時~7日，較佳為1~3日)，較佳為2小時以上(例如2小時~7日，較佳為2~72小時)，更佳為6小時以上(例如6小時~7日，較佳為6~72小時)，尤佳為24小時後形成之締合體之量，但不限定於此等。
或本發明中，中和組成物可能產生之締合體之形成至少有50%以上，較佳為70%以上，更佳為80%以上，尤佳為90%以上完成後，從該組成物將締合體去除亦可。本發明中，中和組成物可能產生之締合體之形成，係指期待形成締合體之抗體形成締合體。
或本發明中，也可於中和組成物中之締合體之形成完成的至少1小時前從該組成物將締合體去除。本發明中，締合體之形成完成，係指期待形成締合體之抗體所為之締合體之形成完成。本發明之締合體之形成完成，不只包括期待形成締合體之全部抗體形成締合體，也包括期待形成締合體之抗體之中，至少50%以上，較佳為70%以上，更佳為80%以上，尤佳為90%以上之抗體已完成締合體之形成。
抗體之締合體之形成是否已完成，可依例如:後述實施例所示方法，於中和處理後經時地將本發明之中和組成物以尺寸排除層析(SEC)分析，並將生成的締合體量作圖以確認。
本發明中，可使用陰離子交換層析、多模式層析、疏水性交互作用層析、羥基磷灰石層析等，依公知方法去除生成的締合體。尤其使用陰離子交換層析或羥基磷灰石層析較佳。 又，藉由使用後述陰離子交換層析之結合/洗提模式實施精製步驟，能有效率地去除本發明之締合體。
本發明中，陰離子交換樹脂只要顯示陰離子交換作用即可，並不限定。陰離子交換樹脂可列舉: YMC-BioPro(YMC公司)、 Q Sepharose High Performance(GE Healthcare公司)、 Q Sepharose Fast Flow(GE Healthcare公司)、 Q Sepharose XL(GE Healthcare公司)、 Capto Q ImpRes(GE Healthcare公司)、 Capto Q(GE Healthcare公司)、 Capto DEAE(GE Healthcare公司)、 SOURCE 30Q(GE Healthcare公司)、 SOURCE 15Q(GE Healthcare公司)、 POROS HQ(Life technologies公司)、 POROS D(Life technologies公司)、 POROS PI(Life technologies公司)、 Eshumuno Q(Merck Millipore公司)、 Fractogel TMAE(Merck Millipore公司)、 Fractogel DEAE(Merck Millipore公司)、 Macro-Prep Q(Bio-Rad Laboratories公司)、 Macro-Prep DEAE(Bio-Rad Laboratories公司)、 Giga Cap Q-650M(TOSOH公司)、 Giga Cap DEAE-650M(TOSOH公司)、 Q HyperCel(PALL公司) 等，但不限定於此等。
又，羥基磷灰石管柱層析用之樹脂，可列舉: Ceramic Hydroxyapatite(Bio-Rad Laboratories公司)、 Ceramic Fluoloapatite(Bio-Rad Laboratories公司)、 MPC Ceramic Hydroxyfluoloapatite(Bio-Rad Laboratories公司)、 HA Ultragel(PALL公司) 等，但不限定於此等。
又，多模式層析用之樹脂，可列舉 Capto Adhere(GE Healthcare公司)、 Capto MMC(GE Healthcare公司)、 Eshumuno HCX(Merck Millipore公司) ，但不限定於此等。
又，疏水性交互作用層析用之樹脂可列舉: Phenyl Sepharose High Performance(GE Healthcare公司)、 Butyl Sepharose High Performance(GE Healthcare公司)、 Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(GE Healthcare公司)、 Butyl-S Sepharose 6 Fast Flow(GE Healthcare公司)、 Butyl Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare公司)、 Octyl Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare公司)、 Capto Phenyl ImpRes(GE Healthcare公司)、 Capto Phenyl(GE Healthcare公司)、 Capto Butyl(GE Healthcare公司)、 Capto Octyl(GE Healthcare公司)、 Fractogel Phenyl(Merck Millipore公司)、 Fractogel Propyl(Merck Millipore公司)、 TOYOPEARL Butyl(TOSOH公司)、 TOYOPEARL Ether(TOSOH公司)、 TOYOPEARL Hexyl(TOSOH公司)、 TOYOPEARL Phenyl(TOSOH公司)、 TOYOPEARL PPG(TOSOH公司)、 TOYOPEARL SuperButyl(TOSOH公司)、 TOYOPEARL Butyl-600(TOSOH公司)、 Macro-Prep HIC(Bio-Rad Laboratories公司) 等，但不限定於此等。
是否已去除締合體，可依尺寸排除層析(SEC)等該技術領域中具通常知識者公知之方法判定，但不限定於此。
本發明中，以酸性條件處理之含抗體之組成物，可為依Protein A管柱層析等公知精製方法精製者。亦即本發明之締合體之去除方法，可於「(a)將含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物以酸性條件處理之步驟」之前，包括「將含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物利用Protein A管柱層析進行精製之步驟」。
本發明中，用以去除pI值為3.0~8.0之抗體之締合體之上述步驟(a)-(c)之後，可包括將後述陰離子交換層析之利用結合/洗提模式(結合/洗提級分)所為之精製步驟、及/或利用多模式層析之流過(Flow through)模式(通過級分)或疏水性交互作用層析之流過(Flow through)模式所為之精製步驟。若將此等予以組合，也能去除締合體以外之雜質，能有效率地將pI值為3.0~8.0之抗體予以精製。
亦即，本發明係關於以包括以下步驟從含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物以良好效率去除雜質之方法： (a)對於陰離子交換樹脂載入含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物;及 (b)使用比(a)之組成物之鹽濃度更高鹽濃度之洗提溶液，利用結合/洗提模式從陰離子交換樹脂洗提pI值為3.0~8.0之抗體。 上述方法中，可於步驟(b)之前，附加使用洗滌溶液將陰離子交換樹脂予以洗滌之步驟。
如後述，本發明也可更將來自陰離子交換樹脂之洗提級分提供給多模式層析或疏水性交互作用層析。藉此，能更去除雜質。
被去除之雜質只要是目的蛋白質以外之物質即可，可為任意物質。雜質，例如:來自寄主細胞之蛋白質(Host cell proteins)、DNA、Protein A(來自管柱之洗提物)、來自目的蛋白質之締合體、片段、病毒、內毒素、培養基成分Hy-Fish(FL)、IGF、胰島素、抗生物質、消泡劑等，但不限定於此等。本發明中，較佳為可去除寄主細胞蛋白質(Host cell proteins)、DNA、Protein A、來自目的蛋白質之締合體(例如抗體之締合體)、病毒，但不限定於此等。
依本發明之方法可去除之病毒無特殊限制。本發明之病毒包括DNA病毒及RNA病毒。DNA病毒，可列舉MVM等細小病毒(parvovirus)、為RNA病毒之MuLV等反轉錄病毒、Reo 3等里奧病毒(reovirus)，但不限定於此等。依本發明之方法可去除之病毒之具體例，例如:MuLV、PRV、Reo 3、MVM、SV40、VSV、單純皰疹(Herpes simplex)病毒、CHV、辛德畢斯病毒(sindbis virus)、腮腺炎病毒、痘瘡病毒(Vaccinia virus)、麻疹病毒、德國麻疹(Rubella)病毒、流感病毒、帶狀疱疹(Herpes zoster)病毒、巨細胞病毒、副流感病毒、EB、HIV、HA、HB、NANB、ATL、ECHO、細小病毒等病毒，較佳為MuLV、Reo 3、MVM、PRV、SV40等病毒，但不限定於此等。
本發明中，首先發揮低pI抗體之特徵，確立了至今為止無法以有比較高之pI之抗體達成之利用陰離子管柱之結合/洗提模式所為之抗體之精製方法。又，也一併首次確立藉由多模式層析或疏水性交互作用層析，能更去除雜質之精製方法。
本發明之方法中，作為利用陰離子交換樹脂將含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物予以精製之條件，通常係使用經濃度1~100 mmol/L之Tris、Bis-Tris、組胺酸，及添加作為抗衡離子之氯化物離子、乙酸離子，pH為pH 6至pH 9之緩衝液平衡化之管柱進行。較佳為使用經濃度10~50 mmol/L之Tris，添加作為抗衡離子之氯化物離子或乙酸離子，且pH為pH 7至pH 8之緩衝液平衡化之管柱進行，但不限定於此等。
其次，本發明之方法中，可包括洗滌已吸附pI值為3.0~8.0之抗體的陰離子交換樹脂的步驟。洗滌係使用和通常之平衡化條件為同樣條件或比洗提之條件更低濃度或同等或更高pH的緩衝液進行。具體而言，使用經濃度1~100 mmol/L之Tris、Bis-Tris、組胺酸，添加作為抗衡離子之氯化物離子、乙酸離子，且pH為pH 6至pH 9之緩衝液平衡化的管柱進行。較佳為使用經濃度10~50 mmol/L之Tris且添加作為抗衡離子之氯化物離子或乙酸離子，pH為pH 7至pH 8之緩衝液進行，但不限定於此等。
其次，本發明之方法中，使用比含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物之鹽濃度更高鹽濃度之洗提溶液，從陰離子交換樹脂以結合/洗提模式洗提抗體。就洗提條件而言，通常使用濃度1~500 mmol/L之Tris、Bis-Tris、組胺酸，添加作為抗衡離子之氯化物離子、乙酸離子，視需要更添加氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、磷酸鈉，且pH為pH 6至pH 9之緩衝液進行。較佳為使用濃度10~500 mmol/L之Tris，添加作為抗衡離子之氯化物離子或乙酸離子，視需要更添加50~500 mmol/L之氯化鈉、磷酸鈉、硫酸鈉的pH為pH 7至pH 8之緩衝液進行，但不限定於此等。可列舉比含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物之鹽濃度還高鹽之濃度，例如5mmol/L以上，較佳為10mmol/L以上，但不限定於此等。洗提溶液可列舉含有選自於由氯化鈉、Tris鹽、硫酸鈉鹽、磷酸鈉鹽構成之群組中之至少1種的溶液，但不限定於此等。
本發明中，也可將由陰離子交換樹脂獲得之含pI值為3.0~8.0之抗體之洗提級分(洗提液)使用多模式層析(例如具有疏水性交互作用與陰離子交換作用之兩作用的樹脂)進一步精製。 利用多模式層析樹脂所為之含抗體之組成物之精製，通常使用濃度1~500 mmol/L之Tris、Bis-Tris、組胺酸並添加作為抗衡離子之氯化物離子、乙酸離子，且視需要更添加氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硫酸銨、檸檬酸鈉、精胺酸，pH為pH 4至pH 9之緩衝液進行。較佳為使用經濃度10~500 mmol/L之Tris，添加作為抗衡離子之氯化物離子或乙酸離子，視需要更添加50~500 mmol/L之氯化鈉及/或硫酸鈉的pH為pH 6至pH 7之緩衝液平衡化的管柱進行，但不限定於此等。
將依本發明之方法獲得之陰離子交換層析之洗提級分載入於多模式層析，就流過(Flow through)級分及/或洗提級分可獲得含目的之pI值為3.0~8.0之抗體的級分。通常，負荷級分係預先調整成和平衡化條件為同樣的pH，視需要更添加和平衡化使用之緩衝液為同樣的鹽。 本發明中，流過(Flow through)級分係指對於管柱載入的級分之中，未吸附於管柱而是回收的級分(雜質吸附於管柱，目的物質不吸附於管柱)。而洗提級分，係指對於管柱載入的級分之中，流過比載入的級分的鹽濃度還高鹽濃度之緩衝液而回收的級分(目的物質(視情形，雜質亦會)吸附於管柱)。
本發明中，可以將由陰離子交換樹脂獲得之含pI值為3.0~8.0之抗體的洗提級分(洗提液)使用疏水性交互作用層析進一步精製。 利用疏水性交互作用層析樹脂所為之含抗體之組成物之精製，通常使用濃度1~500 mmol/L之Tris、Bis-Tris、組胺酸，添加作為抗衡離子之氯化物離子、乙酸離子，視需要更添加氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硫酸銨、檸檬酸鈉、精胺酸，pH為pH 4至pH 9之緩衝液進行。較佳為使用經濃度10~500 mmol/L之Tris，添加作為抗衡離子之氯化物離子或乙酸離子，視需要更添加50~500 mmol/L之氯化鈉及/或硫酸鈉的pH為7至8之緩衝液平衡化的管柱進行，但不限定於此等。
可將依本發明之方法獲得之陰離子交換層析之洗提級分對於疏水性交互作用層析載入，作為流過(Flow through)級分及/或洗提級分，獲得含有目的抗體之級分。通常，負荷級分預先調整成和平衡化條件為同樣的pH，視需要更添加和平衡化使用之緩衝液為同樣的鹽。 本發明之方法中，藉由使緩衝液及負荷級分為不含氯化物離子之組成，可期待緩衝液用槽及級分用槽之防銹效果。
本發明之從含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物去除雜質之方法中，對於陰離子交換樹脂載入之組成物，可以為在對陰離子交換樹脂載入之前依Protein A管柱層析等公知之精製方法精製過者。又，對於陰離子交換樹脂載入之組成物可為供包括以下(a)-(c)之步驟者。 (a)將含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物於酸性條件保持; (b)將步驟(a)獲得之酸性組成物予以中和;及 (c)中和後經至少1小時後，從步驟(b)獲得之中和組成物將締合體去除。
雜質是否已去除之判定，於雜質為蛋白質的情形，可依尺寸排除層析(SEC)進行，但不限定於此等。 DNA的情形，可利用qPCR法、閾值(threshold)法等進行，但不限定於此等。 為來自細胞之蛋白質(Host cell protein/HCP)的情形，可依使用抗HCP抗體之ELISA法進行，但不限定於此等。 Protein A的情形，可依使用抗Protein A抗體之ELISA法進行，但不限定於此等。 病毒的情形，可使用qPCR法、組織感染法、溶菌斑(plaque)法等進行，但不限定於此等。 IGF的情形，可依使用抗IGF抗體之ELISA法進行，但不限定於此等。 胰島素的情形，可依使用抗胰島素抗體之ELISA法進行，但不限定於此等。 FL的情形，可依使用抗FL抗體之ELISA法進行，但不限定於此等。 消泡劑之情形，可依NMR進行，但不限定於此等。 內毒素的情形，可依據將鱟魚之血球萃取成分LAL(Limulus Amebocyte Lysate)予以活化的反應，利用比色法、比濁法測定，但不限定於此等。 抗生物質的情形，可依使用專一性認識慶大黴素等抗生素之抗體的ELISA法測定其濃度，但不限定於此等。
本發明關於一種pI值為3.0~8.0抗體之製造方法，包括從含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物去除該抗體之締合體及/或雜質之步驟。又，本發明關於含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物之製造方法。該方法包含以下步驟: (a)取得含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物;及 (b)使用本說明書記載之精製方法等，從步驟(a)之組成物精製pI值為3.0~8.0之抗體。
抗體之精製包括從含抗體之組成物去除抗體之締合體及/或雜質。本發明獲得之含pI值為3.0~8.0之抗體之組成物中，締合體之含有比例例如5%以下，較佳為4%以下，尤佳為3%以下，但不限定於此等。本發明中，締合體之含有比例，係指形成締合體之抗體相對於組成物所含之抗體之比例。
又，本發明關於依本說明書記載之精製方法等或製造方法獲得之pI值為3.0~8.0之抗體、或含該抗體之組成物。本發明關於依本說明書記載之精製方法等或製造方法獲得之pI值為3.0~8.0之抗體、或含該抗體之醫藥組成物。本發明之醫藥組成物可含有醫藥上可容許之擔體及/或添加劑。
本發明關於製造含有pI值為3.0~8.0之抗體的醫藥組成物的方法，包含以下步驟。 1)依本說明書記載之方法取得pI值為3.0~8.0之抗體;及 2)將於步驟1)製得之pI值為3.0~8.0之抗體和醫藥上可容許之擔體及/或添加劑混合並製劑化。
本發明之醫藥組成物可為溶液製劑(含抗體之溶液製劑)、或冷凍乾燥劑。本發明之溶液製劑也包括冷凍乾燥製劑之製造步驟中之冷凍乾燥處理前之溶液或再溶解後之溶液。本發明之溶液製劑，宜為於製造過程不包括冷凍乾燥步驟而製造之溶液製劑較佳。又，本發明之冷凍乾燥劑可藉由將本發明之溶液製劑依該技術領域中具通常知識者公知之方法予以冷凍乾燥以獲得。
本發明之製劑中，視需要可包括冷凍保護劑、懸浮劑、溶解輔助劑、等張化劑、防腐劑、吸附防止劑、稀釋劑、賦形劑、pH調整劑、止痛劑、含硫還原劑、抗氧化劑等添加劑、擔體。
冷凍保護劑例如:海藻糖(trehalose)、蔗糖、山梨醇等糖類，但不限定於此等。
溶液輔助劑例如:聚氧乙烯硬化篦麻油、聚山梨糖醇酯80、菸鹼醯胺、聚氧乙烯山梨糖醇酐月桂酸酯、聚乙二醇(Macrogol)、篦麻油脂肪酸乙酯等，但不限定於此等。
等張化劑例如:氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等，但不限定於此等。
防腐劑例如:對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、山梨酸、苯酚、甲酚、氯甲酚等，但不限定於此等。
吸附防止劑，例如:人類血清白蛋白、卵磷脂、聚葡萄糖、環氧乙烷・環氧丙烷共聚物、羥基丙基纖維素、甲基纖維素、聚氧乙烯硬化篦麻油、聚乙二醇等，但不限定於此等。
含硫還原劑，例如:N-乙醯基半胱胺酸、N-乙醯基高半胱胺酸、硫辛酸(Thioctic acid)、硫二甘醇(thiodiglycol)、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨醇、硫甘醇酸及其鹽、硫代硫酸鈉、麩胱甘肽(glutathione)、碳原子數1~7之硫烷酸等具有氫硫基者等，但不限定於此等。
抗氧化劑例如: 異抗壞血酸(Erythorbic acid)、二丁基羥基甲苯、丁基羥基苯甲醚、α-生育酚、乙酸生育酚、L-抗壞血酸及其鹽、L-抗壞血酸棕櫚酸酯、L-抗壞血酸酸硬脂酸酯、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、没食子酸三戊酯、没食子酸丙酯或乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、焦磷酸鈉、偏磷酸鈉等螯合劑，但不限定於此等。
本發明之製劑可以用經口或非經口任一者的方式投予，通常係以非經口路徑投予。具體而言，利用注射、經皮、經黏膜、經鼻、經肺等投予。注射劑型之例子，例如可利用皮下注射、靜脈內注射、肌肉內注射等進行全身或局部投予。皮下注射的情形，注射液量有限制，但每1次的抗體投予量可設為大量(100~200 mg左右)。故本發明之製劑特別適於皮下投予(注射)用。 本說明書所引用的全部先前技術文獻，納入於本說明書作為參考。 [實施例]
以下利用實施例對於本發明詳細說明，但本發明之範圍不僅限定於此等實施例。
實施例1.利用病毒失活及中和後之保持所為之後步驟抑制締合體形成 本實施例提供以下的抗體。 Mab1：為WO 2009/041621記載之抗IL-6受體抗體，係改變Mab3之胺基酸而使pI值成為5.8之抗體。Mab1抗體之胺基酸序列以H鏈/序列編號：1、L鏈/序列編號：2表示。 Mab2：依WO2009/072604之實施例12記載之方法製作的完全人類化NS22抗體抗NR10(IL-31受體)抗體。抗體類別為IgG2，係改變胺基酸序列而使pI值降低成5.6之抗體。Mab2抗體之胺基酸序列以H鏈/序列編號：3、L鏈/序列編號：4表示。 Mab3：tocilizumab(H鏈/序列編號：5、L鏈/序列編號：6)。pI值為9.4。
上述抗體，係使用CHO細胞安定表現株依該技術領域中具通常知識者公知之方法使其表現，並以包括Protein A管柱層析之步驟之該技術領域中具通常知識者公知之方法進行精製，使用於下列實施例之締合體去除評價。
將Mab1及Mab2分別仿效實際生產精製步驟中之病毒失活步驟，於已精製抗體的溶液加入1 mol/L鹽酸，於pH 3.8以下保持30分鐘以上。將保持的級分於1~2 mol/L Tris在pH 6.5以上進行中和處理。使用中和後之保持時間不同的級分，利用包括羥基磷灰石管柱層析之步驟之該技術領域中具通常知識者公知之方法、或包括陰離子交換層析之步驟之方法去除締合體，精製成高純度。將已去除締合體之級分進一步保持，使用尺寸排除層析(SEC)依面積百分率法算出因應精製後之保持時間的締合體量。
羥基磷灰石管柱層析中，針對Mab1，係以10 mmol/L磷酸緩衝液(pH 6.5)將管柱予以平衡後，將經中和處理之級分載入。以10 mmol/L磷酸緩衝液(pH 6.5)將管柱洗滌後，利用500 mmol/L NaCl, 10 mmol/L磷酸緩衝液(pH 6.5)使鹽濃度上昇以洗提Mab1。針對Mab2，以10 mmol/L磷酸緩衝液(pH 6.5)將管柱平衡後，將經中和處理之級分載入。以100 mmol/L MES, 5 mmol/L磷酸緩衝液(pH 6.0)將管柱洗滌後，利用200 mmol/L NaCl, 17.5 mmol/L磷酸緩衝液(pH 6.6)使鹽濃度上昇以進行洗提。
陰離子交換層析時，針對Mab1，以20 mmol/L Tris-乙酸緩衝液(pH 8.0)將管柱平衡後，將經中和處理之級分載入。以20 mmol/L Tris-乙酸緩衝液(pH 8.0)將管柱洗滌後，利用267 mmol/L Tris-乙酸緩衝液(pH 8.0)使鹽濃度上昇以洗提Mab1。針對Mab2，以20 mmol/L Tris-HCl緩衝液(pH 7.0)將管柱平衡化後，將經中和處理之級分載入。以20 mmol/L Tris-HCl緩衝液(pH 7.0)將管柱洗滌後，利用350~360 mmol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl緩衝液(pH 7.0~7.2)使鹽濃度上昇以進行洗提。 針對Mab3，也同樣以鹽酸保持後進行中和處理，計算於中和後之保持時間之締合體量。
尺寸排除層析(SEC)，係為了分析於各保持時間之抗體之締合體量而實施。將各樣本利用下列移動相稀釋成約1.0 g/L，將此等利用G3000SWXL管柱(東曹)進行分析。移動相使用含300 mmol/L NaCl之50 mmol/L磷酸緩衝液(pH7.5)，以流速0.5 ml/min進行分析。將比單體更快洗提的峰部作為締合體，進行解析，依面積百分率法算出單體與締合體之含量(%)。
Mab1及Mab2之中和後之保持時間及羥基磷灰石管柱層析實施後之締合體量(締合體之比例)示於表1。陰離子交換層析實施後之締合體量示於表2。Mab1、Mab2、Mab3之因應中和後之保持時間之締合體量示於表3。由該等結果可知:Mab1及Mab2均為，即使於中和後立即以層析將締合體去除，仍會再度形成締合體，相對於此，藉由於中和後放置一定時間後進行精製，精製後之締合體幾乎未見增加。而Mab3，於中和後之締合體未見增加，可判斷無須直到次一步驟的保持時間。
[表1]
  中和後保持時間 羥基磷灰石管柱層 析實施後經過時間 締合體量
Mab1 0小時 0小時 0.7%
6小時 1.4%
24小時 1.9%
48小時 1.9%
24小時 0小時 0.0%
24小時 0.1%
66小時 0小時 0.0%
24小時 0.1%
Mab2 0小時 0小時 0.1%
25小時 0.4%
48小時 0.4%
72小時 0.4%
20小時 0小時 0.1%
24小時 0.1%
55小時 0.1%
72小時 0.1%
24小時 0小時 0.0%
23小時 0.1%
49小時 0.0%
69小時 0.0%
[表2]
  中和後保持時間 陰離子交換管柱層 析實施後經過時間 締合體量
Mab1 1.5小時 0小時 2.2%
4小時 2.5%
24小時 2.7%
23小時 0小時 3.0%
24小時 3.0%
Mab2 0小時 0小時 1.4%
24小時 3.5%
48小時 3.6%
6小時 0小時 0.7%
19小時 0.8%
24小時 0小時 0.8%
24小時 0.8%
[表3]
  中和後保持時間 締合體量 條件
Mab1 0.7小時 15.54% ※1
6.7小時 19.85%
9.7小時 20.64%
12.7小時 21.35%
24.7小時 20.85%
0小時 10.26% ※2
6小時 15.02%
9小時 15.75%
12小時 16.33%
24小時 16.38%
Mab2 0小時 2.73% ※3
2小時 2.80%
4小時 2.94%
5小時 2.92%
6小時 3.05%
7小時 2.99%
8小時 3.09%
9小時 3.03%
0小時 2.26% ※4
14小時 3.36%
17小時 3.36%
20小時 3.41%
24小時 3.50%
39小時 3.48%
49小時 3.39%
64小時 3.48%
Mab3 0小時 0.90% ※5
2小時 0.80%
6小時 0.80%
24小時 0.80%
48小時 0.70%
※1　於低pH 3.1保持1小時後中和至pH7.0 (以Protein A管柱精製後之抗體溶液中之乙酸濃度：50mM) ※2　於低pH 3.1保持1小時後中和至pH7.0 (以Protein A管柱精製後之抗體溶液中之乙酸濃度：20mM) ※3　於低pH 3.6保持1小時後中和至pH7.0 (以Protein A管柱精製後之抗體溶液中之乙酸濃度：50mM) ※4　於低pH 3.4保持1小時後中和至pH7.0 (以Protein A管柱精製後之抗體溶液中之乙酸濃度：20mM) ※5　於低pH3.4保持1小時後中和至pH7.0 (以Protein A管柱精製後之抗體溶液中之鹽酸濃度：2.5mM)
實施例2.低pI抗體之精製處理 實施例2-1.以Mab1之陰離子交換層析之含氯化鈉之洗提液之締合體去除 為抗IL-6受體之抗體Mab1為低pI(pI>8; pI 5.8)之改變抗體，使用CHO細胞安定表現株依該技術領域中具通常知識者公知之方法使其表現，並以包括Protein A管柱層析之步驟之該技術領域中具通常知識者公知之方法精製成高純度，供下列實施例之精製使用。 將Mab1仿效實際生產精製步驟之病毒失活步驟，於已精製的抗體溶液添加1 mol/L鹽酸，於pH 3.6以下保持30分鐘以上。將保持的級分以1 mol/L Tris進行中和處理成pH 7以上。之後保持24小時以上並用於精製。 陰離子交換層析使用表4所示之市售樹脂進行精製。以20 mmol/L Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)將管柱平衡後，將經中和處理之級分載入。以20 mmol/L Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)將管柱洗滌後，利用20 mmol/L Tris-HCl, 100~150 mmol/L NaCl緩衝液(pH 8.0)使鹽濃度上昇，以洗提Mab1。精製後之締合體量，使用尺寸排除層析(SEC)依面積百分率法算出。
[表4]
Figure 02_image001
尺寸排除層析(SEC)係為了分析於各保持時間之抗體之締合體量而實施。將各樣本利用下列移動相稀釋成約1.0 g/L，將此等利用G3000SWXL管柱(東曹)進行分析。移動相使用含300 mmol/L NaCl之50 mmol/L磷酸緩衝液(pH7.5)，以流速0.5 ml/min進行分析。將比單體更快洗提的峰部作為締合體，進行解析，依面積百分率法算出單體與締合體之含量(%)。
Mab1之陰離子交換層析精製後之締合體量示於表5。由此結果可知:於陰離子交換層析已將Mab1之單體與締合體分離。
[表5]
Figure 02_image003
以實施例2-2.以Mab2之陰離子交換層析之含氯化鈉之洗提液之締合體去除 抗IL-31受體之抗體Mab2為低pI(pI>8; pI 5.6)之改變抗體，使用CHO細胞安定表現株依該技術領域中具通常知識者公知之方法使其表現，並以包括Protein A管柱層析之步驟之該技術領域中具通常知識者公知之方法精製成高純度，供下列實施例之精製使用。 將Mab2仿效實際生產精製步驟之病毒失活步驟，於已精製的抗體溶液添加1 mol/L鹽酸，於pH 3.6以下保持30分鐘以上。將保持的級分以1 mol/L Tris進行中和處理成pH 7以上。之後保持20小時以上並用於精製。 陰離子交換層析使用表6所示之市售樹脂進行精製。以20 mmol/L Tris-HCl緩衝液(pH 7.0或8.0)將管柱平衡後，將經中和處理之級分載入。以20 mmol/L Tris-HCl緩衝液(pH 7.0)將管柱洗滌後，利用20 mmol/L Tris-HCl, 200~300 mmol/L NaCl緩衝液(pH 7.0)使鹽濃度上昇，以洗提Mab2。精製後之締合體量，使用尺寸排除層析(SEC)依面積百分率法算出。
[表6]
Figure 02_image005
Mab2之陰離子交換層析精製後之締合體量示於表7。由此結果可知:於陰離子交換層析已將Mab2之單體與締合體分離。
[表7]
Figure 02_image007
實施例2-3.以Mab1之陰離子交換層析之各種洗提液之締合體去除 將Mab1仿效實際生產精製步驟之病毒失活步驟，於已精製的抗體溶液添加1 mol/L鹽酸，於pH 3.6以下保持30分鐘以上。將保持的級分以1 mol/L Tris進行中和處理成pH 7以上。之後保持24小時以上並用於精製。 陰離子交換層析使用表8所示之市售樹脂進行精製。以20 mmol/L Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)或20 mmol/L Tris-乙酸緩衝液(pH 8.0)將管柱平衡後，將經中和處理之級分載入。以20 mmol/L Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)或20 mmol/L Tris-乙酸緩衝液(pH 8.0)將管柱洗滌後，以於240~270 mmol/L Tris-乙酸緩衝液(pH 8.0)或40~60 mmol/L磷酸鈉緩衝液(pH 8.0)或20 mmol/L Tris-HCl含20~50 mmol/L之硫酸鈉的緩衝液(pH 8.0)使鹽濃度上昇，以洗提Mab1。精製後之締合體量使用尺寸排除層析(SEC)依面積百分率法算出。
[表8]
Figure 02_image009
Mab1之陰離子交換層析精製後之締合體量示於表9。由此結果可知:於陰離子交換層析已將Mab1之單體與締合體分離。
[表9]
Figure 02_image011
實施例2-4.Mab1之陰離子交換層析之含Tris洗提液的病毒廓清能力 將Mab1仿效實際生產精製步驟之病毒失活步驟，於已精製之抗體溶液添加1 mol/L鹽酸，於pH 3.6以下保持30分鐘以上。將保持之級分以1 mol/L Tris進行中和處理成pH 7以上。之後保持20小時以上而後用於精製。 陰離子交換層析使用市售之POROS HQ樹脂(Life technologies公司製)進行精製。以20 mmol/L Tris-乙酸緩衝液(pH 7.8)將管柱平衡後，載入在經中和處理之級分中添加了反轉錄病毒之模式病毒MuLV者。以20 mmol/L Tris-乙酸緩衝液(pH 7.8)將管柱洗滌後，利用225~275 mmol/L Tris-乙酸緩衝液(pH 7.8)使鹽濃度上昇以洗提Mab1。精製後測定載入級分與洗提級分之病毒力價，並算出病毒量。
Mab1之陰離子交換層析精製之病毒廓清能力示於表10。由此結果可明白:藉由以陰離子交換層析使用Tris-乙酸進行精製，能有效地去除病毒。
[表10]
Figure 02_image013
實施例2-5.以Mab2之陰離子交換層析之含Tris之洗提液去除締合體 將Mab2仿效實際生產精製步驟之病毒失活步驟，於已精製之抗體溶液中添加1 mol/L鹽酸，於pH 3.6以下保持30分鐘以上。將保持之級分以1 mol/L Tris進行中和處理成pH 7以上。之後保持20小時以上而用於精製。 陰離子交換層析使用表11所示之市售樹脂進行精製。以20 mmol/L Tris-HCl緩衝液(pH 7.0或8.0)將管柱予以平衡，之後將經中和處理之級分載入。以20 mmol/L Tris-乙酸緩衝液(pH 7.0或8.0)將管柱洗滌，之後利用300~500 mmol/L Tris-乙酸(pH 7.0或8.0)使鹽濃度上昇以洗提Mab2。精製後之締合體量係使用尺寸排除層析(SEC)依面積百分率法算出。
[表11]
Figure 02_image005
Mab2之陰離子交換層析精製後之締合體量示於表12。由此結果可知:於陰離子交換層析，Mab2之單體與締合體分離。
[表12]
Figure 02_image015
實施例2-6.Mab2之陰離子交換層析之含Tris之洗提液之病毒廓清能力 將Mab2仿效實際生產精製步驟之病毒失活步驟，於已精製之抗體溶液添加1 mol/L鹽酸，於pH 3.6以下保持30分鐘以上。將保持之級分以1 mol/L Tris進行中和處理成pH 7以上。之後保持20小時以上而後用於精製。 陰離子交換層析使用市售之POROS PI樹脂(Life technologies公司製)進行精製。以20 mmol/L Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)將管柱平衡後，載入在經中和處理之級分中添加了反轉錄病毒之模式病毒MuLV者。以20 mmol/L Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)將管柱洗滌後，利用470 mmol/L Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)使鹽濃度上昇以洗提Mab2。精製後測定載入級分與洗提級分之病毒力價，並算出病毒量。
Mab2之陰離子交換層析精製之病毒廓清能力示於表13。由此結果可明白:藉由以陰離子交換層析使用Tris-HCl進行精製，能去除病毒。
[表13]
Figure 02_image017
實施例2-7.Mab1之以陰離子交換層析及多模式層析之精製 將Mab1使用CHO細胞安定表現株以該技術領域中具通常知識者公知之方法使其表現，以包括Protein A管柱層析之步驟之該技術領域中具通常知識者公知之方法精製為高純度後，以實施例2-3及2-4所示之陰離子交換層析進行精製，並用於下列實施例之精製。 陰離子交換層析之洗提級分使用乙酸調整成pH 6.5+/ -0.3。使用市售之Capto Adhere(GE Healthcare公司製)作為多模式層析(疏水＋陰離子交換)之樹脂進行精製。以250+/-25 mmol/L Tris-乙酸緩衝液(pH 6.5)將管柱予以平衡後，載入經pH調整的級分。回收流過(Flow through)級分的Mab1。
利用此等一連串精製，可將來自步驟之雜質DNA去除至>1.0 pg/mg-Mab1(小於定量極限)、寄主細胞蛋白質(Host cell proteins)去除至>17 ng/mg-Mab1(小於定量極限)、淋溶(leached) Protein A去除至>0.4 ng/mg-Mab1(小於定量極限)，並如實施例2-3所示，可去除Mab1之締合體。針對病毒廓清能力，除了實施例2-4所示之充分的病毒廓清能力，於多模式層析步驟亦能擔保反轉錄病毒之模式病毒MuLV為5.42 Log10 之高病毒廓清能力。 DNA係以定量PCR法測定。寄主細胞蛋白質(Host cell proteins)係以使用抗寄主細胞蛋白質抗體之ELISA法測定。淋溶(leached)Protein A係以使用抗Protein A抗體之ELISA法測定。
實施例2-8.Mab2之以陰離子交換層析及疏水性交互作用層析之精製 將Mab2使用CHO細胞安定表現株以該技術領域中具通常知識者公知之方法使其表現，以包括Protein A之該技術領域中具通常知識者公知方法精製為高純度後，以實施例2-2及2-6所示之陰離子交換層析進行精製，並用於下列實施例之精製。 於陰離子交換層析之洗提級分添加鹽(例如硫酸鈉)，使終濃度成為250 mmol/L以上，調整為pH 6.8~8.0，使用疏水性交互作用層析之樹脂(例如具Phenyl基之樹脂)進行精製。以含有和添加之鹽為同程度之濃度之緩衝液(pH6.8~8.0)予以平衡後，載入級分，回收流過(Flow through)級分之Mab2。
利用此等一連串精製，可將來自步驟之雜質DNA去除至1.9 pg/mg-Mab2、寄主細胞蛋白質去除至>8.0 ng/mg-Mab2(小於定量極限)、淋溶Protein A去除至>0.4 ng/mg-Mab2(小於定量極限)，且可如實施例2-2所示，去除Mab2之締合體。針對病毒廓清能力，除了實施例2-6所示充分的病毒廓清能力，於疏水性交互作用層析步驟亦能擔保反轉錄病毒之模式病毒MuLV為5.94 Log10 、細小病毒之模式病毒MVM為1.55 Log10 之高病毒廓清能力。 DNA係以定量PCR法測定。寄主細胞蛋白質係利用使用抗寄主細胞蛋白質抗體之ELISA法測定。leached Protein A係利用使用抗Protein A抗體之ELISA法測定。
實施例3.病毒失活後之中和後之保持pH的不同所致之締合體形成 本實施例提供以下的抗體。 Mab1：為WO 2009/041621記載之抗IL-6受體抗體，係將Mab3之胺基酸予以改變成pI值5.8的抗體。Mab1抗體之胺基酸序列以H鏈/序列編號：1、L鏈/序列編號：2表示。
將上述抗體使用CHO細胞安定表現株依該技術領域中具通常知識者公知之方法使其表現，以包括Protein A管柱層析之步驟的該技術領域中具通常知識者公知之方法精製，使用於下列實施例之締合體形成量評價。
將Mab1仿效實際生產精製步驟之病毒失活步驟，於已精製之抗體溶液添加1 mol/L鹽酸，於pH 3.8以下保持30分鐘以上。將保持的級分於2 mol/L Tris，以比該抗體之pI低的pH5.0及比pI高的pH7.0進行中和處理。中和後，經時取樣，測定締合體量。再者，針對於pH5.0中和的樣本，於22小時中和保持後進一步添加2 mol/L Tris，保持於比pI高的pH7.0，經時取樣，測定締合體量。締合體量係使用尺寸排除層析(SEC)依面積百分率法算出。
尺寸排除層析(SEC)係為了分析於各保持時間之抗體之締合體量而實施。將各樣本以下列移動相稀釋成約1.0 g/L，將此等以G3000SWXL管柱(東曹)進行分析。移動相使用含300 mmol/L NaCl之50 mmol/L磷酸緩衝液(pH7.5)，以流速0.5 ml/min進行分析。將比單體更早洗提出的峰部作為締合體進行解析，依面積百分率法算出單體與締合體之含量(%)。
於pH7.0保持時的逐步的締合體增加量、與於pH5.0保持22小時後再於pH7.0保持時之逐步的締合體增加量，示於表14(於pH 7.0保持的情形)及表15(於pH5.0保持22小時保持後提高為pH7.0的情形)。由該等結果，可知: 即便將Mab1以pH5.0(比Mab1之pI更低)中和，逐步的締合體增加為安定，但若再度將pH上升至pH7.0(比Mab1之pI更高)並保持，則會再見到逐步的締合體增加，保持一定時間後安定。
[表14]
Figure 02_image019
[表15]
Figure 02_image021
[產業利用性]
依本發明，提供能將特別是含有pI低之抗體的組成物所含之抗體之締合體、雜質以良好效率去除之精製法。依本發明，可提供包含締合體之生成受抑制之抗體的製劑。本發明之精製方法在要求高純度之生物醫藥品之製造有用。
無。
無。
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Claims (10)

  1. 一種從含有pI值為5.0~6.0之抗體之組成物將雜質去除之方法，包含以下步驟(a)~(c)：(a)於陰離子交換樹脂載入含有pI值為5.0~6.0之抗體之組成物，(b)使用比起(a)之組成物之鹽濃度更高鹽濃度之洗提溶液，利用結合/洗提模式從陰離子交換樹脂洗提pI值為5.0~6.0之抗體，以及(c)將由該步驟(b)所獲得之含有pI值為5.0~6.0之抗體的洗提產物，載入使用具疏水性配體及/或多模式配體之樹脂之層析，並取得流過(Flow through)級分及/或洗提級分。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其包含於步驟(b)之前使用洗滌溶液將陰離子交換樹脂予以洗滌之步驟。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中，該步驟(b)之洗提溶液係含有選自於由氯化鈉、Tris鹽、硫酸鈉鹽、磷酸鈉鹽構成之群組中至少1種成分之溶液。
  4. 一種精製含有pI值為5.0~6.0之抗體之組成物之方法，包含：(i)將含有pI值為5.0~6.0之抗體之組成物於酸性條件處理；(ii)將步驟(i)獲得之酸性組成物予以中和；(iii)將步驟(ii)獲得之中和組成物予以中和後保持至少1小時；以及(iv)依申請專利範圍第1至3項中任一項所述之方法，從步驟(iii)獲得之中和組成物將締合體去除。
  5. 如申請專利範圍第4項之方法，其中，步驟(iii)是將步驟(ii)獲得之中和組成物予以中和後保持至少6小時。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其中，該抗體為人類化抗體或人類抗體。
  7. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其中，該抗體為抗IL-6受體抗體或抗IL-31受體抗體。
  8. 一種含有pI值為5.0~6.0之抗體之組成物之製造方法，係利用如申請專利範圍第1至7項中任一項之方法，使抗體之締合體之含有比例為3%以下。
  9. 一種含有pI值為5.0~6.0之抗體之醫藥組成物之製造方法，包含以下步驟：1)依如申請專利範圍第8項之含有pI值為5.0~6.0之抗體之組成物之製造方法，製造pI值為5.0~6.0抗體及/或含該抗體之組成物；及2)將步驟1)所製造之pI值為5.0~6.0抗體及/或含該抗體之組成物，和醫藥上可容許之擔體及/或添加劑混合並製劑化。
  10. 一種含有pI值為3.0~8.0之抗體之醫藥組成物之製造方法，包含以下步驟：1)製造含有抗體之締合體之含有比例為3%以下且pI值為3.0至8.0之抗體之組合物，包含以下步驟(a)~(d)：(a)將含有pI值為3.0~8.0之抗體之組成物於酸性條件處理，(b)將步驟(a)獲得之酸性組成物予以中和，(c)將步驟(b)獲得之中和組成物予以中和後保持至少1小時，以及(d)從步驟(c)獲得之中和組成物將締合體去除，以及2)將步驟1)製造之pI值為3.0~8.0之抗體及/或含該抗體之組成物與醫藥上可容許之擔體及/或添加劑混合並製劑化。
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