JP5721204B2 - アニオン交換基が固定された多孔膜を用いた抗体モノマーの精製方法 - Google Patents
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本発明は、また、前記多孔膜が、アニオン交換基がグラフト鎖を介して固定された多孔膜であって、各グラフト鎖は1以上の側鎖を有し、前記側鎖がアニオン交換基を有する多孔膜である、前記の抗体モノマーの精製方法に関する。
本発明は、また、前記グラフト鎖が、グリシジルメタクリレートの重合体を含む、前記の抗体モノマーの精製方法に関する。
本発明は、また、前記アニオン交換基がジエチルアミノ基である、前記の抗体モノマーの精製方法に関する。
本発明は、また、前記混合液の、pHが6〜9及び塩濃度が0M〜0.2Mであるか、又は、pHが4〜7及び塩濃度が0.05M〜2Mであり、前記多孔膜に吸着させる工程において、夾雑物を多孔膜に吸着させる、前記の抗体モノマーの精製方法に関する。
本発明は、また、前記抗体モノマーの等電点が7.5以上である、前記の抗体モノマーの精製方法に関する。
本発明は、また、前記抗体モノマーの等電点が7.5未満であり、前記混合液のpHが6〜9及び塩濃度が0M〜0.1Mであり、前記多孔膜に吸着させる工程において、抗体モノマーを多孔膜に吸着させ、さらにその後、pHが4〜9及び塩濃度が0.1M〜2Mの溶出液を前記多孔膜に通液し、前記多孔膜に吸着した抗体モノマーを溶出回収する工程を含む、前記の抗体モノマーの精製方法に関する。
本発明は、また、前記夾雑物が、抗体モノマーの凝集体である、前記の抗体モノマーの精製方法に関する。
混合液中の夾雑物を多孔膜に吸着させる場合には、吸着により夾雑物を混合液から除去し、透過液を抗体モノマーの精製液として回収し;
混合液中の抗体モノマーを多孔膜に吸着させる場合には、まず非吸着の夾雑物を透過液として回収して除去し、その後溶出液を通液して多孔膜に吸着した抗体モノマーを溶出し、抗体モノマーの精製液として回収し;
混合液中の夾雑物及び抗体モノマーの両方を多孔膜に吸着させる場合には、例えば、まず大部分の非吸着の夾雑物を透過液に回収して除去し、その後吸着した残りの夾雑物を保持したまま抗体モノマーのみを溶出する条件の溶出液を用いて抗体モノマーを溶出して回収する、あるいは抗体モノマーのみを保持したまま吸着した夾雑物を先に溶出して除去し、次いで抗体モノマーを溶出して回収する、ことにより抗体モノマーの精製液として回収する方法が挙げられる。
(i)中空糸多孔膜へのグラフト鎖の導入
外径3.0mm、内径2.0mm、空孔率70%、下記(iv)に記載のバブルポイント法で測定した最大細孔径が0.3μmのポリエチレン製中空糸多孔膜を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線200kGyを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン製中空糸多孔膜をガラス反応管に入れて、200Pa以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。ここに40℃に調整したグリシジルメタクリレート(GMA)3体積部、メタノール97体積部よりなる反応液を、中空糸多孔膜の20質量部に注入した後、12分間密閉状態で静置してグラフト重合反応を施し、中空糸多孔膜にグラフト鎖を導入した。なお、GMA及びメタノールよりなる反応液は予め窒素でバブリングして、反応液内の酸素を窒素置換した。
導入GMAのモル数%=(グラフト率/142)/(100/14)×100
・・・(I)
乾燥したグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜をメタノールに10分以上浸漬して膨潤させた後、純水に浸漬して水置換した。ジエチルアミン50体積部、純水50体積部の混合溶液よりなる反応液を、上記(i)で得られたグラフト反応後の中空糸多孔膜の乾燥重量に対して20質量部、ガラス反応管に入れ、30℃に調整した。ここに純水浸漬後のグラフト鎖を導入した中空糸多孔膜を挿入し、210分間静置して、グラフト鎖のエポキシ基をジエチルアミノ基に置換することにより、アニオン交換基としてジエチルアミノ基がグラフト鎖を介して固定された中空糸多孔膜を得た。得られた中空糸多孔膜は外径3.3mm、内径2.1mmであり、中空糸多孔膜においてグラフト鎖の有するエポキシ基の80%がジエチルアミノ基によって置換されていた。
T=100×N1/N0
=100×{(w1−w0)/M1}/{w0(dg/(dg+100))/M2}
・・・(II)
式(II)中、M1はジエチルアンモニウムの分子量(73.14)、w0はグラフト重合反応後の中空糸多孔膜の重量、w1はジエチルアミノ基置換反応後の中空糸多孔膜の重量、dgはグラフト率、M2はGMAの分子量(142)である。
(ii)で得られた、アニオン交換基としてジエチルアミノ基がグラフト鎖を介して固定された中空糸多孔膜3本を束ね、中空糸多孔膜の中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で両末端をポリスルホン酸製モジュールケースに固定して、アニオン交換が固定された中空糸多孔膜モジュールを作製した。得られたモジュールの内径は0.9cm、長さは約3.3cm、モジュールの内容積は約2mL、モジュール内に占める中空糸多孔膜の有効体積は0.85mL、中空部分を除いた中空糸多孔膜のみの体積は0.53mLであった。これを、以下の実施例等において、評価モジュールとして用いた。
基材としての中空糸多孔膜の最大細孔径を、バブルポイント法を用いて測定した。長さ8cmの中空糸多孔膜の一方の末端を閉塞し、他方の末端に圧力計を介して窒素ガス供給ラインを接続した。この状態で窒素ガスを供給してライン内部を窒素に置換した後、中空糸多孔膜をエタノールに浸漬した。この時、エタノールがライン内に逆流しないように極僅かに窒素で圧力をかけた状態で、中空糸多孔膜を浸漬した。中空糸多孔膜を浸漬した状態で、窒素ガスの圧力をゆっくりと増加させ、中空糸多孔膜から窒素ガスの泡が安定して出始めた圧力Pを記録した。これより、最大細孔径をd、表面張力をγとして、下記式(III)に従って、中空糸多孔膜の最大細孔径を算出した。
d=C1γ/P・・・(III)
式(III)中、C1は定数である。エタノールを浸漬液としたときのC1γ=0.632(kg/cm)であり、上式にP(kg/cm2)を代入することにより、最大細孔径d(μm)を求めた。
抗体モノマーと凝集体の比率はゲルろ過クロマトグラフィーによって評価した。島津製作所株式会社製クロマトグラフLC−10Aシステムにゲルろ過カラムとして東ソー株式会社製TSKgel G3000SWXLを取り付け、バッファーとして0.1Mリン酸+0.2Mアルギニン(pH6.8)を用いて、25℃において流速0.8ml/minでカラムに通液し、ここに評価サンプルを20μL添加した。カラム透過後に抗体モノマーと凝集体はそれぞれ分離した溶出ピークを示し、得られた抗体モノマーと凝集体のピーク面積比から、溶液中でのそれぞれの存在比率を算出した。
pH6、7又はpH8の20mM Tris−HCl緩衝液を作成し、ここに塩化ナトリウム(NaCl)を添加して、塩濃度が所定の値となるように調整した後、抗体タンパク質としてhuman IgG(田辺三菱製薬製、ヴェノグロブリンIH)を2g/Lとなるように添加し、夾雑物として凝集体を含む抗体モノマーの混合液を作成した。また、pH5及びpH6の50mM Acetate−NaOHを作成し、同様にして、塩濃度が所定の値の抗体モノマーと凝集体を含む混合液を作成した。ここで、塩濃度は緩衝液調整時のNaCl添加重量により調整し、pHは市販のpHメーター(東亜ディーケーケー(株)、HM−30S)を用いて測定した。
上記の参考例3で作成した抗体モノマーと凝集体の混合液10mLを、参考例1で作成した評価モジュールに透過させた。その際、事前に評価モジュールには抗体モノマーと凝集体を含まない同じpHと塩濃度の緩衝液を20mL通液し、評価モジュールを平衡化しておいた。また、混合液の透過後、平衡化に用いたものと同じ緩衝液4mLをモジュール内に残存する抗体モノマーの洗浄液として通液し、これも透過液に加えて14mLの透過液を回収した。回収した透過液は参考例2の方法により、抗体モノマーと凝集体の比率を測定し、評価モジュールに通液する前の比率と比較した。溶液は評価モジュール内の中空糸多孔膜の内側から外側に向かって流速2mL/minにて通液した。評価はGEヘルスケアバイオサイエンス製AKTAexplorer100を用い、評価液の280nmのUV吸光度を測定し、下記式(IV)に従って、UV吸光度から精製後の抗体モノマーの回収率を評価した。
回収率(%)=(14×I1)/(10×I0)×100・・・(IV)
式(IV)中、I0及びI1はそれぞれモジュール透過前の混合液及び回収した透過液の280nmのUV吸光度である。
参考例3で得られたpH8.0及び塩濃度0Mの、抗体モノマーと凝集体を含む混合液中の、全抗体タンパク質中の凝集体比率を参考例2の方法により測定したところ、5.09%であった。またこの混合液の280nmのUV吸光度は754mAUであった。参考例4に従い、参考例3で得られたpH8.0及び塩濃度0Mの、抗体モノマーと凝集体を含む混合液を、参考例1で作成した評価モジュールに、10mL通液し、洗浄液も含めて14mLを透過液として回収した。得られた透過液に含まれる全抗体タンパク質中の凝集体比率を参考例2の方法により測定したところ、0.12%であった。また、透過液の280nmのUV吸光度は457mAUであり、全抗体モノマーの回収率は85%であった。これにより、凝集体が除去された抗体モノマーが高い回収率で得られることが示された。
参考例1で作成した評価モジュールの代わりに市販のアニオン交換クロマトグラフィーカラム(GEヘルスケア製、HiTrapDEAE FF 1mL)を用い、通液速度を1mL/minにした以外は、実施例1と同様にして、抗体モノマー精製評価を行った。得られた透過液に含まれる全抗体タンパク質中の凝集体比率を参考例2の方法により測定したところ、3.89%であり、通液速度を半分にしたにも関わらず、凝集体の除去率は極めて低かった。また、透過液の280nmのUV吸光度は289mAUであり、回収率は54%であり、回収率も低かった。
参考例3で得られたpH7.0及び塩濃度0Mの、抗体モノマーと凝集体を含む混合液中の、全抗体タンパク質中の凝集体比率を参考例2の方法により測定したところ、5.47%であった。またこの混合液の280nmのUV吸光度は770mAUであった。参考例4に従い、参考例3で得られたpH7.0及び塩濃度0Mの、抗体モノマーと凝集体を含む混合液を、参考例1で作成した評価モジュールに、10mL通液し、洗浄液も含めて14mLを透過液として回収した。得られた透過液に含まれる全抗体タンパク質中の凝集体比率を参考例2の方法により測定したところ、0.49%であった。また、透過液の280nmのUV吸光度は506mAUであり、回収率は92%であった。これにより、凝集体が除去された抗体モノマーが高い回収率で得られることが示された。
参考例3で得られたpH8.0及び塩濃度0.05Mの、抗体モノマーと凝集体を含む混合液中の、全抗体タンパク質中の凝集体比率を参考例2の方法により測定したところ、4.71%であった。またこの混合液の280nmのUV吸光度は738mAUであった。参考例4に従い、参考例3で得られたpH8.0及び塩濃度0.05Mの、抗体モノマーと凝集体を含む混合液を、参考例1で作成した評価モジュールに、10mL通液し、洗浄液も含めて14mLを透過液として回収した。得られた回収液に含まれる全抗体タンパク質中の凝集体比率を参考例2の方法により測定したところ、0.77%であった。また、透過液の280nmのUV吸光度は496mAUであり、回収率は94%であった。これにより、凝集体が除去された抗体モノマーが高い回収率で得られることが示された。
参考例3で得られたpH6.0及び塩濃度0.5Mの、抗体モノマーと凝集体の混合液中の、全抗体タンパク質中の凝集体比率を参考例2の方法により測定したところ、3.87%であった。またこの混合液の280nmのUV吸光度は732mAUであった。参考例4に従い、参考例3で得られたpH6.0及び塩濃度0.5Mの、抗体モノマーと凝集体を含む混合液を、参考例1で作成した評価モジュールに、10mL通液し、洗浄液も含めて14mLを透過液として回収した。得られた透過液に含まれる全抗体タンパク質中の凝集体比率を参考例2の方法により測定したところ、0.86%であった。また、透過液の280nmのUV吸光度は513mAUであり、回収率は98%であった。これにより、凝集体が除去された抗体モノマーが高い回収率で得られることが示された。
Claims (11)
- 抗体モノマー及び夾雑物を含む混合液からの抗体モノマーの精製方法であって、
アニオン交換基が固定された多孔膜に、混合液を通液し、夾雑物を多孔膜に吸着させる工程を含み、
前記多孔膜が、アニオン交換基がグラフト鎖を介して固定された多孔膜であって、各グラフト鎖は1以上の側鎖を有し、前記側鎖がアニオン交換基を有する多孔膜であり、
前記グラフト鎖が、グリシジルメタクリレートの重合体を含み、
前記アニオン交換基がジエチルアミノ基であり、
前記混合液の、pHが6〜9及び塩濃度が0M〜0.2Mであるか、又は、pHが4〜7及び塩濃度が0.05M〜2Mである、抗体モノマーの精製方法。 - 前記混合液の通液流速が120/0.53(V/h)以上である、請求項1に記載の抗体モノマーの精製方法。
- 前記抗体モノマーの等電点が7.5以上である、請求項1または2に記載の抗体モノマーの精製方法。
- 前記抗体モノマー及び夾雑物を含む混合液が、抗体モノマーを5g/L以上、夾雑物を1g/L以上含んでいる、請求項1〜3のいずれかに記載の抗体モノマーの精製方法。
- 前記夾雑物が、抗体モノマーの凝集体である、請求項1〜4のいずれかに記載の抗体モ
ノマーの精製方法。 - 前記多孔膜の基材がポリエチレンである、請求項1〜5のいずれかに記載の抗体モノマーの精製方法。
- 前記多孔膜の形態が中空糸膜である、請求項1〜6のいずれかに記載の抗体モノマーの精製方法。
- 前記多孔膜の最大細孔径が、アニオン交換基の固定及びグラフト鎖の導入前の状態で、0.1μm〜1.0μmである、請求項1〜7のいずれかに記載の抗体モノマーの精製方法。
- 前記多孔膜の空孔率が5%〜99%である、請求項1〜8のいずれかに記載の抗体モノマーの精製方法。
- 前記混合液を流速120/0.53(V/h)で通液した際の、抗体モノマーの回収率が85%以上である、請求項1〜9のいずれかに記載の抗体モノマーの精製方法。
- 前記混合液を流速120/0.53(V/h)で通液した際の、透過液に含まれる抗体タンパク質中の凝集体比率が、前記混合液に含まれる抗体タンパク質中の凝集体比率の(0.86/3.87)x100(%)以下である、請求項1〜10のいずれかに記載の抗体モノマーの精製方法。
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