JP6722455B2 - 等電点の低い抗体の精製方法 - Google Patents
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Description
例えば、特表平5−504579号(特許文献1)では、哺乳動物細胞培養から得られた抗体含有水性培地をプロテインAもしくはプロテインGカラムクロマトグラフィーに適用して抗体をカラムに吸収させ、次いで酸性溶液(濃度約0.1Mのクエン酸、pH3.0−3.5)を用いて抗体を溶出させ、得られる酸性溶出液をイオン交換カラムクロマトグラフィー、サイズ排除カラムクロマトグラフィーに順次適用して精製している。
しかしこれまで、天然には存在しない低いpIを有する抗体に適した精製法の検討や、精製工程における低pI抗体特有の問題についての検討はなされていない。従って、この様な低pI抗体に適した精製方法については全く知られていない。
一般的に、培養液中から抗体を粗精製する方法としては、プロテインAカラムを用いるのが主流である。この際、カラムからの溶出工程において酸性の溶液で溶出を行い、さらに必要に応じて酸を添加して、一定時間酸性状態を維持してウイルスの不活性化処理を行い、中和処理後直ちに次の精製工程に移るのが一般的である。
また、pIが低い抗体を陰イオン交換樹脂のBind/Eluteモードで精製することにより、従来よりも効率的に不純物の除去が可能になることを見出した。また、陰イオン交換クロマトグラフィーに加え、マルチモードクロマトグラフィー或いは疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いることで、より一層の不純物の除去が可能となることを見出した。
〔1〕pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物の精製方法であって、
(a)pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を酸性条件で処理する工程、
(b)工程(a)で得られる酸性組成物を中和する工程、及び
(c)中和後少なくとも1時間経過した後、工程(b)で得られる中和組成物から会合体を除去する工程、を含む方法。
〔2〕工程(a)が、pI値が3.0〜8.0である抗体をプロテインAカラムクロマトグラフィーにより精製した後に行うウイルス不活性化処理工程である、〔1〕記載の方法。
〔3〕工程(c)が、工程(b)で得られる中和組成物を中和後少なくとも1時間保持した後に会合体を除去する工程である、〔1〕又は〔2〕記載の方法。
〔4〕会合体の除去を、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、マルチモードクロマトグラフィーまたはハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより行う、〔1〕乃至〔3〕のいずれかに記載の方法。
〔5〕抗体のpI値が5.0〜7.5である、〔1〕乃至〔4〕のいずれかに記載の方法。
〔6〕抗体のpI値が5.0〜6.5である、〔1〕乃至〔4〕のいずれかに記載の方法。
〔7〕pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物から不純物を除去する方法であって、
(a)陰イオン交換樹脂にpI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を負荷し、
(b)(a)の組成物の塩濃度よりも高い塩濃度の溶出溶液を用いて、Bind/Eluteモードにより、陰イオン交換樹脂からpI値が3.0〜8.0である抗体を溶出させる工程、を含む方法。
〔8〕工程(b)の前に、洗浄溶液を用いて陰イオン交換樹脂を洗浄する工程を含む、〔7〕記載の方法。
〔9〕工程(b)の溶出溶液が、塩化ナトリウム、Tris塩、硫酸ナトリウム塩、リン酸ナトリウム塩からなる群より選択される少なくとも1つを含む溶液である、〔7〕又は〔8〕記載の方法。
〔10〕工程(b)により得られるpI値が3.0〜8.0である抗体を含む溶出産物を疎水性リガンド及び/又はマルチモードリガンドを有する樹脂を用いるクロマトグラフィーに負荷しFlow through画分及び/又は溶出画分を取得する工程をさらに含む、〔7〕乃至〔9〕のいずれかに記載の方法。
〔11〕会合体の除去を〔7〕乃至〔10〕のいずれかに記載の方法で行うことを特徴とする、〔1〕乃至〔6〕のいずれかに記載の方法。
〔12〕抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、〔1〕乃至〔11〕のいずれかに記載の方法。
〔13〕抗体が、抗IL-6レセプター抗体または抗IL-31レセプター抗体である、〔1〕乃至〔12〕のいずれかに記載の方法。
〔14〕〔1〕乃至〔13〕のいずれかに記載の方法によって、抗体の会合体の含有割合が3%以下である、pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を製造する方法。
〔15〕pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物であって、抗体の会合体の含有割合が3%以下である組成物。
〔16〕〔14〕記載の方法によって製造されるpI値が3.0〜8.0である抗体含有組成物であって、会合体の含有割合が3%以下である組成物。
〔17〕以下の工程を含む、pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する医薬組成物を製造する方法:
1)〔14〕記載の製造方法により、pI値が3.0〜8.0である抗体及び/又は当該抗体を含有する組成物を製造する工程、及び
2)工程1)で製造されるpI値が3.0〜8.0である抗体及び/又は当該抗体を含有する組成物を、医薬的に許容される担体及び/又は添加剤と混合して製剤化する工程。
〔18〕pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物から抗体の会合体を除去する方法であって、
(a)pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を酸性条件で処理する工程、
(b)工程(a)で得られる酸性組成物を中和する工程、及び
(c)中和後少なくとも1時間経過した後、工程(b)で得られる中和組成物から会合体を除去する工程、を含む方法。
〔19〕pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物の精製方法であって、
(a)pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を酸性条件で処理する工程、
(b)工程(a)で得られる酸性組成物を中和する工程、及び
(c)会合体の形成に十分な時間が経過した後、工程(b)で得られる中和組成物から会合体を除去する工程、を含む方法。
本発明は、等電点(pI)の低い抗体を含有する組成物から当該抗体の会合体や不純物を除去する方法に関する。具体的には本発明は、pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物からその会合体を除去する方法であって、
(a)pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を酸性条件で処理する工程、
(b)工程(a)で得られる酸性組成物を中和する工程、及び
(c)中和後少なくとも1時間経過した後、工程(b)で得られる中和組成物から会合体を除去する工程
を含む方法に関する。
具体的には、中和後少なくとも1時間経過した後、工程(b)で得られる中和組成物から会合体を除去することにより、精製後の新たな会合体形成を抑制することができる。
即ち、本発明の工程(c)は次のように言い換えることもできる。
・会合体の形成に十分な時間が経過した後、工程(b)で得られる中和組成物から会合体を除去する工程
・工程(b)で得られる中和組成物において生じ得る会合体量に対し少なくとも80%以上の会合体が形成された後、当該組成物から会合体を除去する工程
・工程(b)で得られる中和組成物を少なくとも24時間保持した後に形成され得る会合体量に対し少なくとも80%以上の会合体が形成された後、当該組成物から会合体を除去する工程
・工程(b)で得られる中和組成物において起こり得る会合体の形成が80%以上完了した後、当該組成物から会合体を除去する工程
・工程(b)で得られる中和組成物において会合体の形成が完了する少なくとも1時間前に、当該組成物から会合体を除去する工程
(a)陰イオン交換樹脂にpI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を負荷する工程、及び
(b)(a)の組成物の塩濃度よりも高い塩濃度の溶出溶液を用いて、Bind/Eluteモードにより、陰イオン交換樹脂からpI値が3.0〜8.0である抗体を溶出させる工程、
を含む方法に関する。
上記方法においては、工程(b)の前に、洗浄溶液を用いて陰イオン交換樹脂を洗浄する工程を含むことができる。
また、pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物から不純物を除去する方法は、pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物から当該抗体(抗体モノマー)を精製する方法、pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物から当該抗体の会合体を除去する方法などと表現することもできる。
本発明においては、抗体を含有する組成物は抗体を含有する溶液、抗体の培養液、抗体の培養培地などと表現することもできる。
低分子化抗体としては、抗TPO受容体アゴニストDiabody(WO02/33072参照)、抗CD47アゴニストDiabody(WO01/66737参照)などが好ましい。
(a)グルタミン酸(E)、アスパラギン酸(D)
(b)リジン(K)、アルギニン(R)、ヒスチジン(H)
すなわち、本発明における改変としては、(1)電荷を有するアミノ酸から電荷を有さないアミノ酸への置換、(2)電荷を有するアミノ酸から当該アミノ酸とは反対の電荷を有するアミノ酸への置換、(3)電荷を有さないアミノ酸から電荷を有するアミノ酸への置換が挙げられる。
(a)pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を酸性条件で処理する工程、
(b)工程(a)で得られる酸性組成物を中和する工程、及び
(c)中和後少なくとも1時間経過した後、工程(b)で得られる中和組成物から会合体を除去する工程、
を含む方法によって、pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物から生じる会合体を効率よく除去することができる。
本発明におけるpIが3.0〜8.0である抗体の会合体としては、1.5量体、二量体、三量体、四量体、五量体などが挙げられるがこれらに限定されない。
抗体を含有する組成物を酸性条件で処理する方法としては、塩酸、クエン酸、リン酸、酢酸など公知の酸を、抗体を含有する組成物に添加する方法が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明においては、酸性条件で処理した抗体を含有する組成物を、一定時間保持することが好ましい。保持時間としては、例えば15分〜4時間、好ましくは30分〜2時間、さらに好ましくは1〜1.5時間が挙げられるがこれらに限定されない。
(a)pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を酸性条件で処理する工程、
(b)工程(a)で得られる酸性組成物を中和し、抗体のpIよりも低いpHで当該組成物を保持する工程、
(c)工程(b)で得られる中和組成物のpHを、抗体のpIよりも高い値に調整する工程、及び、
(d)中和後少なくとも1時間経過した後、工程(b)で得られる中和組成物から会合体を除去する工程、
を含む方法に関する。抗体のpIよりも低いpHとしては、抗体のpIよりも例えば0.3以上、好ましくは0.5以上、さらに好ましくは1.0以上低いpHを例示することができるがこれらに限定されない。一方、抗体のpIよりも高いpHとしては、抗体のpIよりも例えば0.3以上、好ましくは0.5以上、さらに好ましくは1.0以上高いpHを例示することができるがこれらに限定されない。また中和後の組成物を保持する時間としては、例えば1時間以上(例えば、1時間〜7日間、好ましくは1〜3日間)、好ましくは2時間以上(例えば2時間〜7日間、好ましくは2〜72時間)、さらに好ましくは6時間以上(例えば6時間〜7日間、好ましくは6〜72時間)、さらに好ましくは12時間以上(例えば12時間〜7日間、好ましくは12〜72時間)を例示することができるがこれらに限定されない。
また、後述する陰イオン交換クロマトグラフィーのBind/eluteモードによる精製工程を用いることにより、効率的に本発明の会合体を除去することができる。
YMC-BioPro(ワイエムシィ社)、
Q Sepharose High Performance(GE Healthcare社)、
Q Sepharose Fast Flow(GE Healthcare社)、
Q Sepharose XL(GE Healthcare社)、
Capto Q ImpRes(GE Healthcare社)、
Capto Q(GE Healthcare社)、
Capto DEAE(GE Healthcare社)、
SOURCE 30Q(GE Healthcare社)、
SOURCE 15Q(GE Healthcare社)、
POROS HQ(Life technologies社)、
POROS D(Life technologies社)、
POROS PI(Life technologies社)、
Eshumuno Q(Merck Millipore社)、
Fractogel TMAE(Merck Millipore社)、
Fractogel DEAE(Merck Millipore社)、
Macro-Prep Q(Bio-Rad Laboratories社)、
Macro-Prep DEAE(Bio-Rad Laboratories社)、
Giga Cap Q-650M(TOSOH社)、
Giga Cap DEAE-650M(TOSOH社)、
Q HyperCel(PALL社)
などが挙げられるがこれらに限定されない。
Ceramic Hydroxyapatite(Bio-Rad Laboratories社)、
Ceramic Fluoloapatite(Bio-Rad Laboratories社)、
MPC Ceramic Hydroxyfluoloapatite(Bio-Rad Laboratories社)、
HA Ultragel(PALL社)
などを例示することができるがこれらに限定されない。
Capto Adhere(GE Healthcare社)、
Capto MMC(GE Healthcare社)、
Eshumuno HCX(Merck Millipore社)
を例示することができるがこれらに限定されない。
Phenyl Sepharose High Performance(GE Healthcare社)、
Butyl Sepharose High Performance(GE Healthcare社)、
Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(GE Healthcare社)、
Butyl-S Sepharose 6 Fast Flow(GE Healthcare社)、
Butyl Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare社)、
Octyl Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare社)、
Capto Phenyl ImpRes(GE Healthcare社)、
Capto Phenyl(GE Healthcare社)、
Capto Butyl(GE Healthcare社)、
Capto Octyl(GE Healthcare社)、
Fractogel Phenyl(Merck Millipore社)、
Fractogel Propyl(Merck Millipore社)、
TOYOPEARL Butyl(TOSOH社)、
TOYOPEARL Ether(TOSOH社)、
TOYOPEARL Hexyl(TOSOH社)、
TOYOPEARL Phenyl(TOSOH社)、
TOYOPEARL PPG(TOSOH社)、
TOYOPEARL SuperButyl(TOSOH社)、
TOYOPEARL Butyl-600(TOSOH社)、
Macro-Prep HIC(Bio-Rad Laboratories社)
などを例示することができるがこれらに限定されない。
(a)陰イオン交換樹脂にpI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を負荷する工程、及び
(b)(a)の組成物の塩濃度よりも高い塩濃度の溶出溶液を用いて、Bind/eluteモードにより、陰イオン交換樹脂からpI値が3.0〜8.0である抗体を溶出させる工程
を含む方法によって、pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物から不純物を効率よく除去する方法に関する。
上記方法においては、付加的に、工程(b)の前に、洗浄溶液を用いて陰イオン交換樹脂を洗浄する工程を含むことができる。
マルチモードクロマトグラフィー樹脂による抗体を含有する組成物の精製は、通常、濃度1〜500 mmol/Lのトリス、ビストリス、ヒスチジンでカウンターイオンとして塩化物イオン、酢酸イオンを添加し、必要に応じてさらに塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、アルギニンを添加しpHがpH 4からpH 9の緩衝液を用いて行われる。好ましくは、濃度10〜500 mmol/Lのトリスでカウンターイオンとして塩化物イオン或いは酢酸イオンを添加し、必要に応じてさらに50〜500 mmol/Lの塩化ナトリウム及び/又は硫酸ナトリウムを添加したpHがpH 6からpH 7の緩衝液で平衡化したカラムを用いて行われるが、これらに限定されない。
本発明においてFlow through画分とは、カラムに負荷した画分のうち、カラムに吸着することなく回収される画分を指す(不純物がカラムに吸着し、目的物質はカラムに吸着しない)。一方溶出画分とは、カラムに負荷した画分のうち、負荷した画分の塩濃度よりも高い塩濃度の緩衝液を流して回収される画分を指す(目的物質が(場合によっては不純物も)カラムに吸着する)。
疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂による抗体を含有する組成物の精製は、通常、濃度1〜500 mmol/Lのトリス、ビストリス、ヒスチジンでカウンターイオンとして塩化物イオン、酢酸イオンを添加し、必要に応じてさらに塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、アルギニンを添加しpHがpH 4からpH 9の緩衝液を用いて行われる。好ましくは、濃度10〜500 mmol/Lのトリスでカウンターイオンとして塩化物イオン或いは酢酸イオンを添加し、必要に応じてさらに50〜500 mmol/Lの塩化ナトリウム及び/又は硫酸ナトリウムを添加したpHが7から8の緩衝液で平衡化したカラムを用いて行われるがこれらに限定されない。
本発明の方法において、緩衝液及び負荷画分を塩化物イオンを含まない組成にすることで緩衝液用タンク及び画分用タンクの防錆の効果が期待される。
(a)pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を酸性条件で保持する工程、
(b)工程(a)で得られる酸性組成物を中和する工程、及び
(c)中和後少なくとも1時間経過した後、工程(b)で得られる中和組成物から会合体を除去する工程。
またDNAの場合はqPCR法、スレッシュホールド法などにより行うことができるがこれらに限定されない。
細胞由来タンパク質(Host cell protein/HCP)の場合は、抗HCP抗体を用いるELISA法により行うことができるがこれらに限定されない。
プロテインAの場合は抗プロテインA抗体を用いるELISA法により行うことができるがこれらに限定されない。
ウイルスの場合はqPCR法、組織感染法、プラーク法などにより行うことができるがこれらに限定されない。
IGFの場合は抗IGF抗体を用いるELISA法により行うことができるがこれらに限定されない。
インスリンの場合は抗インスリン抗体を用いるELISA法により行うことができるがこれらに限定されない。
FLの場合は抗FL抗体を用いるELISA法により行うことができるがこれらに限定されない。
消泡剤の場合はNMRにより行うことができるがこれらに限定されない。
エンドトキシンの場合は、カブトガニの血球抽出成分LAL(Limulus Amebocyte Lysate)を活性化する反応に基づき、比色法や比濁法により測定されるがこれらに限定されない。
抗生物質の場合はゲンタマイシンなどの抗生物質を特異的に認識する抗体を用いたELISA法により、その濃度を測定するがこれらに限定されない。
(a)pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を取得する工程、及び
(b)本明細書に記載の精製方法等を用いて、工程(a)の組成物から、pI値が3.0〜8.0である抗体を精製する工程、
を含む。
1)本明細書に記載の方法によりpI値が3.0〜8.0である抗体を取得する工程、及び
2)工程1)で製造したpI値が3.0〜8.0である抗体を、医薬的に許容される担体及び/又は添加剤と混合して製剤化する工程。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
本実施例においては以下の抗体を供した。
Mab1: WO 2009/041621に記載された抗IL-6レセプター抗体で、Mab3のアミノ酸を改変してpI値5.8とした抗体である。Mab1抗体のアミノ酸配列はH鎖/配列番号:1、L鎖/配列番号:2で表される。
Mab2:WO2009/072604の実施例12に記載の方法で作製した完全ヒト化NS22抗体である抗NR10(IL-31レセプター)抗体である。抗体クラスはIgG2で、アミノ酸配列を改変してpI値を5.6に低下させた抗体である。Mab2抗体のアミノ酸配列はH鎖/配列番号:3、L鎖/配列番号:4で表される。
Mab3:トシリツマブ(H鎖/配列番号:5、L鎖/配列番号:6)。pI値は9.4である。
Mab3についても同様に塩酸で保持した後中和処理し,中和後の保持時間における会合体量を算出した。
※2 Low pH 3.1に1時間保持後pH7.0に中和(Protein Aカラムでの精製後の抗体溶液中の酢酸濃度:20mM)
※3 Low pH 3.6に1時間保持後pH7.0に中和(Protein Aカラムでの精製後の抗体溶液中の酢酸濃度:50mM)
※4 Low pH 3.4に1時間保持後pH7.0に中和(Protein Aカラムでの精製後の抗体溶液中の酢酸濃度:20mM)
※5 Low pH3.4に1時間保持後pH7.0に中和(Protein Aカラムでの精製後の抗体溶液中の塩酸濃度:2.5mM)
実施例2-1.Mab1の陰イオン交換クロマトグラフィーにおける塩化ナトリウム含有溶出液での会合体除去
抗IL-6レセプター抗体であるMab1は低pI(pI<8; pI 5.8)の改変抗体であり、CHO細胞安定発現株を用いて当業者に公知の方法で発現させ、Protein Aカラムクロマトグラフィーを含む当業者公知の方法で高純度に精製し、下記の実施例の精製に用いた。
Mab1を実生産精製工程におけるウイルス不活化工程を模して、精製された抗体溶液に1 mol/L 塩酸を添加してpH 3.6以下で30分以上保持した。保持した画分を1 mol/L TrisにてpH 7以上に中和処理した。その後24時間以上保持して精製に用いた。
陰イオン交換クロマトグラフィーとして表4に示す市販の樹脂を用いて精製を行った。20 mmol/L Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)でカラムを平衡化した後に、中和処理した画分を負荷した。20 mmol/L Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)でカラムを洗浄した後に、20 mmol/L Tris-HCl, 100〜150 mmol/L NaCl緩衝液(pH 8.0)により塩濃度を上昇させることでMab1を溶出させた。精製後の会合体量をサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を用いて面積百分率法により算出した。
抗IL-31レセプター抗体であるMab2は低pI(pI<8; pI 5.6)の改変抗体であり、CHO細胞安定発現株を用いて当業者に公知の方法で発現させ、Protein Aを含む当業者公知の方法で高純度に精製し、下記の実施例の精製に用いた。
Mab2を実生産精製工程におけるウイルス不活化工程を模して、精製された抗体溶液に1 mol/L 塩酸を添加してpH 3.6以下で30分以上保持した。保持した画分を1 mol/L TrisにてpH 7以上に中和処理した。その後20時間以上保持して精製に用いた。
陰イオン交換クロマトグラフィーとして表6に示す市販の樹脂を用いて精製を行った。20 mmol/L Tris-HCl緩衝液(pH 7.0或いは8.0)でカラムを平衡化した後に、中和処理した画分を負荷した。20 mmol/L Tris-HCl緩衝液(pH 7.0)でカラムを洗浄した後に、20 mmol/L Tris-HCl, 200〜300 mmol/L NaCl緩衝液(pH 7.0)により塩濃度を上昇させることでMab2を溶出させた。精製後の会合体量をサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を用いて面積百分率法により算出した。
Mab1を実生産精製工程におけるウイルス不活化工程を模して、精製された抗体溶液に1 mol/L HClを添加してpH 3.6以下で30分以上保持した。保持した画分を1 mol/L TrisにてpH 7.0以上に中和処理した。その後24時間以上保持して精製に用いた。
陰イオン交換クロマトグラフィーとして表8に示す市販の樹脂を用いて精製を行った。20 mmol/L Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)或いは20 mmol/L Tris-酢酸緩衝液(pH 8.0)でカラムを平衡化した後に、中和処理した画分を負荷した。20 mmol/L Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)或いは20 mmol/L Tris-酢酸緩衝液(pH 8.0)でカラムを洗浄した後に、240〜270 mmol/L Tris-酢酸緩衝液(pH 8.0)或いは40〜60 mmol/L リン酸ナトリウム緩衝液(pH 8.0)或いは20 mmol/L Tris-HClに20〜50 mmol/Lの 硫酸ナトリウムを含む緩衝液(pH 8.0)により塩濃度を上昇させることでMab1を溶出させた。精製後の会合体量をサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を用いて面積百分率法により算出した。
Mab1を実生産精製工程におけるウイルス不活化工程を模して、精製された抗体溶液に1 mol/L 塩酸を添加してpH 3.6以下で30分以上保持した。保持した画分を1 mol/L TrisにてpH 7以上に中和処理した。その後20時間以上保持して精製に用いた。
陰イオン交換クロマトグラフィーとして市販のPOROS HQ樹脂(Life technologies社製)を用いて精製を行った。20 mmol/L Tris-酢酸緩衝液(pH 7.8)でカラムを平衡化した後に、中和処理した画分にレトロウイルスのモデルウイルスであるMuLVを添加したものを負荷した。20 mmol/L Tris-酢酸緩衝液(pH 7.8)でカラムを洗浄した後に、225〜275 mmol/L Tris-酢酸緩衝液(pH 7.8)により塩濃度を上昇させることでMab1を溶出させた。精製後に負荷画分と溶出画分のウイルス力価を測定してウイルス量を算出した。
Mab2を実生産精製工程におけるウイルス不活化工程を模して、精製された抗体溶液に1 mol/L 塩酸を添加してpH 3.6以下で30分以上保持した。保持した画分を1 mol/L TrisにてpH 7以上に中和処理した。その後20時間以上保持して精製に用いた。
陰イオン交換クロマトグラフィーとして表11に示す市販の樹脂を用いて精製を行った。20 mmol/L Tris-HCl緩衝液(pH 7.0或いは8.0)でカラムを平衡化した後に、中和処理した画分を負荷した。20 mmol/L Tris-酢酸緩衝液(pH 7.0或いは8.0)でカラムを洗浄した後に、300〜500 mmol/L Tris-酢酸(pH 7.0或いは8.0)により塩濃度を上昇させることでMab2を溶出させた。精製後の会合体量をサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を用いて面積百分率法により算出した。
Mab2を実生産精製工程におけるウイルス不活化工程を模して、精製された抗体溶液に1 mol/L 塩酸を添加してpH 3.6以下で30分以上保持した。保持した画分を1 mol/L TrisにてpH 7以上に中和処理した。その後20時間以上保持して精製に用いた。
陰イオン交換クロマトグラフィーとして市販のPOROS PI樹脂(Life technologies社製)を用いて精製を行った。20 mmol/L Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)でカラムを平衡化した後に、中和処理した画分にレトロウイルスのモデルウイルスであるMuLVを添加したものを負荷した。20 mmol/L Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)でカラムを洗浄した後に、470 mmol/L Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)により塩濃度を上昇させることでMab2を溶出させた。精製後に負荷画分と溶出画分のウイルス力価を測定してウイルス量を算出した。
Mab1はCHO細胞安定発現株を用いて当業者に公知の方法で発現させ、Protein Aカラムクロマトグラフィーを含む当業者公知の方法で高純度に精製したのち、実施例2-3及び2-4で示した陰イオン交換クロマトグラフィーで精製し、下記の実施例の精製に用いた。
陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出画分に酢酸を用いてpH 6.5+/-0.3に調整した。マルチモードクロマトグラフィー(疎水+陰イオン交換)の樹脂として市販のCapto Adhere(GE Healthcare社製)を用いて精製を行った。250+/-25 mmol/L Tris-酢酸緩衝液(pH 6.5)でカラムを平衡化した後に、pH調整した画分を負荷した。Flow through画分のMab1を回収した。
DNAは定量PCR法にて測定した。Host cell proteinsは抗Host cell proteins抗体を用いたELISA法にて測定した。leached Protein Aは抗Protein A抗体を用いたELISA法にて測定した。
Mab2をCHO細胞安定発現株を用いて当業者に公知の方法で発現させ、Protein Aを含む当業者公知の方法で高純度に精製したのち、実施例2-2及び2-6で示した陰イオン交換クロマトグラフィーで精製し、下記の実施例の精製に用いた。
陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出画分に塩(例えば硫酸ナトリウム)を終濃度が250 mmol/L以上となるように添加してpH 6.8〜8.0に調整し、疎水性相互作用クロマトグラフィーの樹脂(例えばPhenyl基を有する樹脂)を用いて精製を行った。添加した塩と同程度の濃度を含む緩衝液(pH6.8〜8.0)で平衡化した後に、画分を負荷し、Flow through画分のMab2を回収した。
DNAは定量PCR法にて測定した。Host cell proteinsは抗Host cell proteins抗体を用いたELISA法にて測定した。leached Protein Aは抗Protein A抗体を用いたELISA法にて測定した。
本実施例においては以下の抗体を供した。
Mab1: WO 2009/041621に記載された抗IL-6レセプター抗体で、Mab3のアミノ酸を改変してpI値5.8とした抗体である。Mab1抗体のアミノ酸配列はH鎖/配列番号:1、L鎖/配列番号:2で表される。
Claims (10)
- pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物の精製方法であって、
(a)pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を酸性条件で処理する工程、
(b)工程(a)で得られる酸性組成物を中和する工程、
(c)工程(b)で得られる中和組成物を中和後少なくとも1時間保持する工程、及び
(d)工程(c)で得られる中和組成物から会合体を除去する工程、を含む方法。 - 工程(a)が、pI値が3.0〜8.0である抗体をプロテインAカラムクロマトグラフィーにより精製した後に行うウイルス不活性化処理工程である、請求項1記載の方法。
- 会合体の除去を、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、マルチモードクロマトグラフィーまたはハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより行う、請求項1又は2に記載の方法。
- 抗体のpI値が5.0〜7.5である、請求項1乃至3のいずれかに記載の方法。
- 抗体のpI値が5.0〜6.5である、請求項1乃至3のいずれかに記載の方法。
- 会合体の除去を、
(i)陰イオン交換樹脂に前記工程(c)で得られる前記中和組成物を負荷する工程、
(ii)(i)の組成物の塩濃度よりも高い塩濃度の溶出溶液を用いて、Bind/Eluteモードにより、陰イオン交換樹脂からpI値が3.0〜8.0である抗体を溶出させる工程、及び
(iii)工程(ii)により得られる溶出産物を疎水性リガンド及び/又はマルチモードリガンドを有する樹脂を用いるクロマトグラフィーに負荷しFlow through画分及び/又は溶出画分を取得する工程、を含む方法で行うことを特徴とする、請求項1乃至5のいずれかに記載の方法。 - 抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項1乃至6のいずれかに記載の方法。
- 抗体が、抗IL-6レセプター抗体または抗IL-31レセプター抗体である、請求項1乃至7のいずれかに記載の方法。
- 請求項1乃至8のいずれかに記載の方法によって、抗体の会合体の含有割合が3%以下である、pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を製造する方法。
- pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物から抗体の会合体を除去する方法であって、
(a)pI値が3.0〜8.0である抗体を含有する組成物を酸性条件で処理する工程、
(b)工程(a)で得られる酸性組成物を中和する工程、
(c)工程(b)で得られる中和組成物を中和後少なくとも1時間保持する工程、及び
(d)工程(c)で得られる中和組成物から会合体を除去する工程、を含む方法。
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