CN106029682A - 等电点低的抗体的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明人发现，通过进行下述的步骤可以抑制其后的抗体的缔合化：将pI低的抗体使用蛋白A柱纯化，进行酸性处理和中和处理之后，经过规定的时间，然后除去所产生的抗体的缔合体。而且，本发明人发现：通过利用阴离子交换树脂的结合/洗脱模式、进而利用疏水性相互作用层析或多元层析树脂纯化pI低的抗体，与以往相比可有效地除去杂质。

Description

等电点低的抗体的纯化方法
技术领域
本发明涉及抗体的纯化方法，特别是涉及用于等电点(pI)低的抗体的纯化方法。
背景技术
由于基因重组技术的发展，各种蛋白质制剂能够以稳定的供应量提供。特别是，近年来通过基因重组技术开发了与普通的医药品相比选择性高的各种抗体医药品，且进入了临床试验阶段。
通过这样的基因重组技术生产的含有生理活性蛋白质的制剂中，有必要除去来源于宿主细胞的蛋白质(宿主细胞蛋白，Host cell proteins)或DNA、作为纯化原料之一的树脂配体片段、来源于目标蛋白质的缔合体或片段等。而且，为了确保制剂的病毒安全性，纯化步骤有必要显示具有充分的病毒除去能力或灭活能力。现在，据世界卫生组织(WHO)表示，生物医药品中的DNA的允许量是100pg DNA/一次给予量以下。而且，关于病毒，据世界卫生组织(WHO)表示，在培养液中确认到逆转录病毒样颗粒存在时，在考虑纯化步骤中的逆转录病毒的除去能力或灭活能力的基础上，是1个病毒颗粒/106给予量以下。为了满足该标准，通常，将含有得自宿主细胞的生理活性蛋白质的水性培养基通过用亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析、羟磷灰石层析、疏水性相互作用层析或它们的组合进行处理而除去杂质。而且，近年来，新的纯化配体的开发正在推进，还将具有离子交换作用和疏水性相互作用的两种作用的多元层析用于纯化。
特别是，生理活性蛋白质为将哺乳动物细胞作为宿主而获得的抗体时，利用蛋白A或蛋白G与IgG的Fc链结合的性质，进行基于蛋白A或蛋白G的亲和柱层析的处理之后，利用各种层析进行纯化。
例如，在特表平5-504579号(专利文献1)中，将从哺乳动物细胞培养获得的含有抗体的水性培养基适用于蛋白A或蛋白G柱层析，使抗体吸附于柱上，其后，使用酸性溶液(浓度为约0.1M的柠檬酸、pH3.0-3.5)洗脱抗体，将所获得的酸性洗脱液依次适用于离子交换柱层析、尺寸排阻柱层析，进行纯化。
以血中滞留性或体内动力学的提高为目的，已知有用于控制抗体的等电点(pI)的氨基酸取代技术，具体而言，通过改变(修饰)暴露于抗体表面的氨基酸残基来控制抗体的pI的技术(WO07/114319(专利文献2))。天然抗体的等电点(pI)为约7.5～9.5的范围，具有较高的pI。通过改变这样的抗体的氨基酸残基使pI变低，可期待延长抗体的血浆中滞留性或半衰期，从而关系到作为药物的抗体的给予量的减低或给予间隔的延长。
但是，迄今为止，没有适于天然不存在的具有低pI的抗体的纯化方法的研究、或针对纯化步骤中的低pI抗体特有的问题的研究。因此，关于适于这样低pI抗体的纯化方法完全是未知的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：特表平5-504579号
专利文献2：WO07/114319。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供：特别是可从含有pI低的抗体的组合物中有效除去杂质的抗体的纯化方法。
通常，作为从培养液中粗纯化抗体的方法，以使用蛋白A柱的方法为主流。此时，通常如下进行：在从柱洗脱的步骤中，利用酸性的溶液进行洗脱，并且根据需要添加酸，维持规定时间的酸性状态，进行病毒的灭活处理，在中和处理后立即转移至下一纯化步骤。
本发明人发现了下述的问题：特别是将pI改变成低值的抗体利用通常的纯化步骤纯化时，在纯化步骤结束后会产生新的缔合体。研究其原因，结果发现了下述的现象：该抗体在酸性状态放置规定时间后进行中和处理时，一部分抗体在规定期间渐渐不可逆地缔合化。
通常的抗体，其pI值高且为碱性，因此利用蛋白A亲和树脂进行纯化后，由于碱性的特性，而在阳离子交换树脂中利用结合/洗脱模式、在阴离子交换树脂中利用通过(Passthrough)模式进行纯化。通常，已知在阳离子交换树脂中除去缔合体，在阴离子交换树脂中使DNA、宿主细胞蛋白、病毒等杂质吸附而除去。但是，在pI改变成低值的抗体的纯化方法的研究中，关于改变成pI低的抗体，明确了：在以往的纯化方法中，抗体的培养液中所含的杂质的除去效率不充分。
用于解决课题的手段
本发明人为了实现上述目的而进行了深入的研究，结果发现了：将pI低的抗体使用蛋白A柱纯化，进行中和处理之后，经过规定的期间，然后除去所产生的抗体的缔合体，由此可以抑制其后的抗体的缔合化。
而且，发现了：通过将pI低的抗体利用阴离子交换树脂的结合/洗脱模式纯化，与以往相比，可有效地除去杂质。并且，发现了：通过使用阴离子交换层析、以及多元层析或疏水性相互作用层析，可以进一步除去杂质。
即，本发明提供以下[1]～[19]。
[1] 含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物的纯化方法，该方法包括下述的步骤：
(a) 将含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物在酸性条件下处理的步骤；
(b) 将步骤(a)中获得的酸性组合物中和的步骤；以及
(c) 在中和后至少经过1小时后，从步骤(b)中获得的中和组合物中除去缔合体的步骤。
[2] [1]所述的方法，其中，步骤(a)是将pI值为3.0～8.0的抗体利用蛋白A柱层析纯化之后进行的病毒灭活处理步骤。
[3] [1]或[2]所述的方法，其中，步骤(c)是将步骤(b)中获得的中和组合物在中和后至少保持1小时后除去缔合体的步骤。
[4] [1]～[3]中任一项所述的方法，其中，利用阴离子交换层析、疏水性相互作用层析、多元层析或羟磷灰石层析进行缔合体的除去。
[5] [1]～[4]中任一项所述的方法，其中，抗体的pI值为5.0～7.5。
[6] [1]～[4]中任一项所述的方法，其中，抗体的pI值为5.0～6.5。
[7] 从含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物中除去杂质的方法，该方法包括下述的步骤：
(a) 将含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物负载到阴离子交换树脂上；
(b) 使用比(a)的组合物的盐浓度高的盐浓度的洗脱溶液，利用结合/洗脱模式，从阴离子交换树脂中洗脱pI值为3.0～8.0的抗体的步骤。
[8] [7]所述的方法，其中，在步骤(b)之前包括：使用清洗溶液清洗阴离子交换树脂的步骤。
[9] [7]或[8]所述的方法，其中，步骤(b)的洗脱溶液是含有选自氯化钠、Tris盐、硫酸钠盐、磷酸钠盐的至少一种的溶液。
[10] [7]～[9]中任一项所述的方法，该方法还包括下述的步骤：将通过步骤(b)获得的含有pI值为3.0～8.0的抗体的洗脱产物负载到使用具有疏水性配体和/或多元配体的树脂的层析上，获取流通(Flow through)组分和/或洗脱组分的步骤。
[11] [1]～[6]中任一项所述的方法，其特征在于，通过[7]～[10]中任一项所述的方法进行缔合体的除去。
[12] [1]～[11]中任一项所述的方法，其中，抗体为人源化抗体或人抗体。
[13] [1]～[12]中任一项所述的方法，其中，抗体为抗IL-6受体抗体或抗IL-31受体抗体。
[14] 制备含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物的方法，其中，通过[1]～[13]中任一项所述的方法，使抗体的缔合体的含有比例为3%以下。
[15] 抗体的缔合体的含有比例为3%以下的组合物，其是含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物。
[16] 缔合体的含有比例为3%以下的组合物，其是通过[14]所述的方法制备的含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物。
[17] 制备含有pI值为3.0～8.0的抗体的药物组合物的方法，该方法包括下述的步骤：
1) 通过[14]所述的制备方法，制备pI值为3.0～8.0的抗体和/或含有该抗体的组合物的步骤；以及
2) 将步骤1)中制备的pI值为3.0～8.0的抗体和/或含有该抗体的组合物与药学上可接受的载体和/或添加剂混合制成制剂的步骤。
[18] 从含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物中除去抗体的缔合体的方法，该方法包括以下的步骤：
(a) 将含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物在酸性条件下处理的步骤；
(b) 将步骤(a)中获得的酸性组合物中和的步骤；以及
(c) 在中和后至少经过1小时后，从步骤(b)中获得的中和组合物中除去缔合体的步骤。
[19] 含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物的纯化方法，该方法包括以下的步骤：
(a) 将含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物在酸性条件下处理的步骤；
(b) 将步骤(a)中获得的酸性组合物中和的步骤；以及
(c) 在经过对于缔合体的形成充分的时间之后，从步骤(b)中获得的中和组合物中除去缔合体的步骤。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。
本发明涉及从含有等电点(pI)低的抗体的组合物中除去该抗体的缔合体或杂质的方法。具体而言，本发明涉及从含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物中除去其缔合体的方法，该方法包括以下的步骤：
(a) 将含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物在酸性条件下处理的步骤；
(b) 将步骤(a)中获得的酸性组合物中和的步骤；以及
(c) 在中和后至少经过1小时后，从步骤(b)中获得的中和组合物中除去缔合体的步骤。
本发明中，在经过对于步骤(b)中获得的中和组合物中所产生的缔合体的形成充分的时间之后，从该组合物中除去缔合体，由此可以抑制纯化后的新的缔合体形成。
具体而言，在中和后至少经过1小时后，通过从步骤(b)中获得的中和组合物中除去缔合体，可以抑制纯化后的新的缔合体形成。
即，本发明的步骤(c)还可以表述如下：
・在经过对于缔合体的形成充分的时间之后，从步骤(b)中获得的中和组合物中除去缔合体的步骤
・相对于步骤(b)中获得的中和组合物中可产生的缔合体量，在至少形成80%以上的缔合体之后，从该组合物中除去缔合体的步骤
・相对于将步骤(b)中获得的中和组合物保持至少24小时后形成的缔合体量，在至少形成80%以上的缔合体之后，从该组合物中除去缔合体的步骤
・步骤(b)中获得的中和组合物中可发生的缔合体的形成完成80%以上之后，从该组合物中除去缔合体的步骤
・步骤(b)中获得的中和组合物中缔合体的形成完成的至少1小时前，从该组合物中除去缔合体的步骤。
而且，本发明涉及从含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物中除去杂质的方法，该方法包括下述的步骤：
(a) 将含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物负载到阴离子交换树脂上的步骤；以及
(b) 使用比(a)的组合物的盐浓度高的盐浓度的洗脱溶液，通过结合/洗脱模式，从阴离子交换树脂中洗脱pI值为3.0～8.0的抗体的步骤。
上述方法中，在步骤(b)之前可以包括：使用清洗溶液清洗阴离子交换树脂的步骤。
本发明中，从含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物中除去其缔合体的方法还可以表述为：从含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物中纯化该抗体(抗体单体)的方法、从含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物中除去杂质的方法、抑制pI值为3.0～8.0的抗体的缔合化的方法等。
而且，从含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物中除去杂质的方法还可以表述为：从含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物中纯化该抗体(抗体单体)的方法、从含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物中除去该抗体的缔合体的方法等。
本发明中，含有抗体的组合物还可以表述为：含有抗体的溶液、抗体的培养液、抗体的培养培养基等。
本发明中使用的抗体只要与所期望的抗原结合就没有特别限定，可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体，但从可稳定生产均质的抗体的角度考虑，优选单克隆抗体。
作为本发明中使用的单克隆抗体，不仅包含来自人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、骆驼、猴等动物的单克隆抗体，还包含嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体等进行了人为改变的基因重组型抗体。并且，还包含为了进行以血中滞留性或体内动力学的改善为目的的抗体分子的物性改变(具体而言，等电点(pI)改变、Fc受体的亲和性改变等)而人为改变了抗体的恒定区等的基因重组型抗体。
而且，本发明中使用的抗体的免疫球蛋白类别没有特别限定，可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等的IgG、IgA、IgD、IgE、IgM等任一类别，优选IgG和IgM。
并且，本发明使用的抗体中不仅包含具有恒定区和可变区的抗体(全抗体)，还包含Fv、Fab、F(ab)2等的抗体片段、或将抗体的可变区用肽接头等接头连接而成的1价或2价以上的单链Fv(scFv、sc(Fv)2)或scFv二聚体等的双价抗体(Diabody)等的低分子化抗体等，优选全抗体。
上述的本发明中使用的抗体可通过本领域技术人员熟知的方法制作。对于产生单克隆抗体的杂交瘤，可以基本上使用公知技术如下进行制作。即，将所期望的抗原或表达所期望抗原的细胞用作致敏抗原，用该致敏抗原按照通常的免疫方法进行免疫，利用通常的细胞融合方法使所获得的免疫细胞与公知的母细胞进行融合，利用通常的筛选方法，筛选产生单克隆抗体的细胞(杂交瘤)，由此进行制作。杂交瘤的制作例如可按照Milstein等人的方法(Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46)等进行。抗原的免疫原性低时，可与白蛋白等的具有免疫原性的大分子结合，再进行免疫。
而且，可使用：从杂交瘤克隆抗体基因，插入到适当的载体中，将其导入宿主，使用基因重组技术产生的基因重组型抗体(例如，参照Carl, A. K. Borrebaeck, James, W.Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdomby MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990)。具体而言，使用逆转录酶从杂交瘤的mRNA合成抗体的可变区(V区)的cDNA。当获得编码目标抗体的V区的DNA时，将其与编码所期望的抗体恒定区(C区)的DNA连接，再将其插入到表达载体中。或者，还可将编码抗体V区的DNA插入到含有抗体C区的DNA的表达载体中。插入到表达载体中以在表达调控区例如增强子、启动子的调控下表达。其后，可利用该表达载体转化宿主细胞，使抗体表达。
本发明中，可使用以使对人的异种抗原性降低等为目的而人为改变的基因重组型抗体，例如嵌合(Chimeric)抗体、人源化(Humanized)抗体等。这些改变抗体可使用已知的方法制备。嵌合抗体是由人以外的哺乳动物例如小鼠抗体的重链、轻链的可变区和人抗体的重链、轻链的恒定区构成的抗体，可如下得到：将编码小鼠抗体的可变区的DNA与编码人抗体的恒定区的DNA连接，将其插入到表达载体中并导入宿主而产生。
人源化抗体也称为重构(reshaped)人抗体，将人以外的哺乳动物例如小鼠抗体的互补性决定区(CDR; complementarity determining region)移植到人抗体的互补性决定区而得到的抗体，其通常的基因重组方法也是已知的。具体而言，设计小鼠抗体的CDR与人抗体的框架区(framework region; FR)连接的DNA序列，将其制作成末端部具有重叠部分的多个寡核苷酸，利用PCR法由该多个寡核苷酸进行合成。将所获得的DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接，其后，插入到表达载体并将其导入到宿主而产生，由此获得(参照欧州专利申请公开号EP239400、WO96/02576)。对于经由CDR连接的人抗体的FR，可选择互补性决定区形成良好的抗原结合位点的FR。根据需要，可取代抗体可变区的框架区的氨基酸，以使重构人抗体的互补性决定区形成适当的抗原结合位点(Sato, K等人, Cancer Res. (1993)53, 851-856)。
作为为了改善抗体的活性、物性、药物动力学、安全性等而取代抗体的氨基酸的技术，例如还已知以下所述的技术，本发明所使用的抗体还包含进行了这样的氨基酸取代(还包含缺失或添加)的抗体。
关于对IgG抗体的可变区进行氨基酸取代的技术，报道了：人源化技术(Tsurushita N, Hinton PR, Kumar S., Design of humanized antibodies: fromanti-Tac to Zenapax., Methods. 2005 May; 36(1): 69-83.)；基于用于使结合活性增强的基于互补性决定区(CDR)的氨基酸取代的亲和力成熟技术(Rajpal A, Beyaz N,Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R., Ageneral method for greatly improving the affinity of antibodies by usingcombinatorial libraries., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jun 14; 102(24):8466-71.)；基于框架(FR)的氨基酸取代的提高物理化学稳定性的技术(Ewert S,Honegger A, Pluckthun A., Stability improvement of antibodies forextracellular and intracellular applications: CDR grafting to stableframeworks and structure-based framework engineering., Methods. 2004 Oct; 34(2): 184-99. Review)。而且，作为进行IgG抗体的Fc区的氨基酸取代的技术，已知有使抗体依赖性细胞毒活性(ADCC)或补体依赖性细胞毒活性(CDC)增强的技术(Kim SJ, Park Y,Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeuticantibodies., Mol Cells. 2005 Aug 31; 20(1): 17-29. Review.)。并且，报道了：不仅使这样的效应子功能增强，而且使抗体的血中半衰期提高的Fc的氨基酸取代的技术(Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., Anengineered human IgG1 antibody with longer serum half-life., J Immunol. 2006Jan 1; 176(1): 346-56.；Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D,Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgGfragment by random mutagenesis., Nat Biotechnol. 1997 Jul; 15(7): 637-40.)。并且，还已知以改善抗体的物性为目的的恒定区的各种氨基酸取代技术(WO09/41613)。
而且，人抗体的获取方法也是已知的。例如，在体外用所期望的抗原或表达所期望抗原的细胞致敏人淋巴细胞，使致敏淋巴细胞与人骨髓瘤细胞、例如U266融合，也可以获得具有抗原结合活性的所期望的人抗体(参照特公平1-59878)。而且，通过用抗原免疫具有人抗体基因所有组成成分的转基因动物，可以获取所期望的人抗体(参照WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602、WO94/25585、WO96/34096、WO96/33735)。并且，使用人抗体文库，通过淘选获取人抗体的技术也是已知的。例如，可以将人抗体的可变区以单链抗体(scFv)形式通过噬菌体展示法表达在噬菌体的表面，并选择与抗原结合的噬菌体。分析所选择的噬菌体基因，可以确定编码与抗原结合的人抗体可变区的DNA序列。如果能够明确与抗原结合的scFv的DNA序列，则可制作包含该序列的适当的表达载体，以获取人抗体。这些方法已经是熟知的，可以参照WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388。本发明所使用的抗体还包含这样的人抗体。
将暂时分离的抗体基因导入适当的宿主来制作抗体时，可使用适当的宿主与表达载体的组合。将真核细胞用作宿主时，可使用动物细胞、植物细胞、真菌细胞。作为动物细胞，已知有：(1) 哺乳类细胞，例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK(幼仓鼠肾，baby hamsterkidney)、HeLa、Vero；(2) 两栖类细胞，例如非洲爪蟾卵母细胞；或(3) 昆虫细胞，例如sf9、sf21、Tn5等。作为植物细胞，已知有：来源于烟草(Nicotiana)属例如烟草(Nicotianatabacum)的细胞，可以将其进行愈伤组织培养。作为真菌细胞，已知有：酵母，例如酵母(Saccharomyces)属、例如酿酒酵母(Saccharomyces serevisiae)；丝状真菌，例如曲霉(Aspergillus)属、例如黑曲霉(Aspergillus niger)等。使用原核细胞时，存在使用细菌细胞的产生体系。作为细菌细胞，已知有大肠杆菌(E. coli)、枯草杆菌。通过转化向这些细胞中导入目标抗体基因，将所转化的细胞在体外培养，由此获得抗体。
并且，本发明所使用的抗体中包含抗体片段或低分子化抗体、以及抗体修饰物。例如，作为抗体片段或低分子化抗体，可举出：Fab、F(ab')2、Fv、或将H链与L链的Fv用适当的接头连接而得的一价或二价以上的单链Fv(scFv、sc(Fv)2等)(Huston, J. S.等人, Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883)。具体而言，利用酶例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶处理抗体，生成抗体片段，或者，构建编码这些抗体片段的基因，将其导入表达载体之后，在适当的宿主细胞中表达(例如，参照Co, M. S.等人, J. Immunol. (1994) 152,2968-2976；Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496；Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515；Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663；Rousseaux, J.等人, MethodsEnzymol. (1986) 121, 663-669；Bird, R. E. and Walker, B. W., TrendsBiotechnol. (1991) 9, 132-137)。
作为抗体修饰物，还可使用与聚乙二醇(PEG)或细胞毒性药物等的各种分子结合的抗体(Farmaco. 1999 Aug 30; 54(8): 497-516.；Cancer J. 2008 May-Jun; 14(3):154-69.)。本发明所使用的抗体中还包含这些抗体修饰物。这样的抗体修饰物可通过对抗体进行化学修饰而获得。这些方法在该领域中已经确立。
作为本发明中使用的抗体，可举出：抗组织因子抗体、抗IL-6受体抗体、抗IL-6抗体、HM1.24抗原单克隆抗体、抗甲状旁腺激素相关肽抗体(抗PTHrP抗体)、抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体、抗神经节苷脂GM3抗体、抗TPO受体激动剂抗体、第VIII凝固因子替代抗体、抗IL31受体抗体、抗HLA抗体、抗AXL抗体、抗CXCR4抗体、抗NR10抗体、因子IX与因子X的双特异性抗体等，但不限于这些。
作为本发明中使用的优选的重构人源化抗体，可举出：人源化抗白细胞介素6(IL-6)受体抗体(托珠单抗(Tocilizumab)、hPM-1或MRA)(参照WO92/19759)、人源化抗HM1.24抗原单克隆抗体(参照WO98/14580)、人源化抗甲状旁腺激素相关肽抗体(抗PTHrP抗体)(参照WO98/13388)、人源化抗组织因子抗体(参照WO99/51743)、抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3人源化IgG1κ 抗体(参照PCT/JP05/013103)、抗NR10人源化抗体(参照WO2009/072604)、因子IX与因子X的双特异性人源化抗体等，但不限于这些。作为本发明中使用的人源化抗体，特别优选为人源化抗IL-6受体抗体、抗NR10人源化抗体、以及因子IX与因子X的双特异性人源化抗体。
作为人IgM抗体，优选抗神经节苷脂GM3重组型人IgM抗体(参照WO05/05636)等。
作为低分子化抗体，优选抗TPO受体激动剂双价抗体(Diabody)(参照WO02/33072)、抗CD47激动剂双价抗体(Diabody)(参照WO01/66737)等。
本发明中，等电点低的抗体(低pI抗体)是指，特别是在天然中难以存在的具有低等电点的抗体。作为这样的抗体的等电点，例如可举出：3.0～8.0、优选5.0～7.5、更优选5.0～7.0、更优选5.0～6.8、进一步优选5.0～6.5、特别优选5.0～6.0，但不限于这些。需要说明的是，天然的(或通常的)抗体被认为通常具有7.5～9.5范围的等电点。
并且，作为本发明中使用的抗体，优选通过改变暴露于抗体表面的氨基酸残基使抗体的pI降低的pI改变抗体。这样的pI改变抗体是指，与改变前的抗体的pI相比，使pI降低1以上、优选2以上、进一步优选3以上的抗体。如后述的实施例所记载，将Mab3(等电点：9.4)的氨基酸序列改变来控制等电点的Mab1的等电点为5.8。而且，将利用WO2009/072604的实施例12中记载的方法制作的完全人源化NS22抗体(等电点：7.8)的氨基酸序列改变来控制等电点的Mab2的等电点为5.6。
作为等电点得到改良的抗体，例如可举出：WO2009/041621中记载的抗IL-6受体抗体Mab1(H链/SEQ ID NO: 1、L链/SEQ ID NO: 2)、为抗NR10人源化抗体并通过WO2009/072604的实施例12中记载的方法制作的完全人源化NS22抗体(H链/SEQ ID NO: 3、L链/SEQID NO: 4)等，但不限于这些。
作为暴露于抗体表面的氨基酸残基，H链可变区的情形，可举出：选自基于Kabat编号的下述氨基酸残基中的氨基酸残基：H1、H3、H5、H8、H10、H12、H13、H15、H16、H19、H23、H25、H26、H31、H39、H42、H43、H44、H46、H61、H62、H64、H65、H68、H71、H72、H73、H75、H76、H81、H82b、H83、H85、H86、H105、H108、H110、H112，但不限于这些。而且，L链可变区的情形，可举出：选自基于Kabat编号的下述氨基酸残基中的氨基酸残基：L1、L3、L7、L8、L9、L11、L12、L16、L17、L18、L20、L22、L24、L27、L38、L39、L41、L42、L43、L45、L46、L49、L53、L54、L55、L57、L60、L63、L65、L66、L68、L69、L70、L74、L76、L77、L79、L80、L81、L85、L100、L103、L105、L106、L107，但不限于这些。
本发明中，“改变”是指，将原氨基酸残基取代成其它氨基酸残基、使原氨基酸残基缺失、添加新的氨基酸残基等，优选是指将原氨基酸残基取代成其它氨基酸残基。
在氨基酸之中，已知存在带有电荷的氨基酸。通常，作为带有正电荷的氨基酸(正电荷氨基酸)，已知有赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)。作为带有负电荷的氨基酸(负电荷氨基酸)，已知有天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)等。已知将这些以外的氨基酸看作不带有电荷的氨基酸。
作为本发明中改变后的氨基酸残基，优选可从以下的(a)或(b)任一组所含的氨基酸残基中适当选择，不特别限于这些的氨基酸。
(a) 谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)；
(b) 赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)。
而且，改变前的氨基酸残基已经带有电荷时，改变成不带有电荷的氨基酸残基也是优选方案之一。
即，作为本发明中的改变，可举出：
(1) 从带有电荷的氨基酸取代成不带有电荷的氨基酸；
(2) 从带有电荷的氨基酸取代成与该氨基酸带有相反电荷的氨基酸；
(3) 从不带有电荷的氨基酸取代成带有电荷的氨基酸。
等电点的值可通过本领域技术人员公知的等电点电泳进行测定。而且，理论等电点的值可使用基因和氨基酸序列分析软件(Genetyx等)进行计算。
氨基酸残基的电荷得到改变的抗体可如下获取：改变编码抗体的核酸，将该核酸在宿主细胞中培养，从宿主细胞培养物中纯化抗体。本发明中“改变核酸”是指，改变核酸序列使形成对应于通过改变而导入的氨基酸残基的密码子。更具体而言，是指，改变核酸的核苷酸序列使改变前的氨基酸残基的密码子成为通过改变而导入的氨基酸残基的密码子。即，编码待改变的氨基酸残基的密码子被编码通过改变而导入的氨基酸残基的密码子取代。关于这样的核酸的改变，本领域技术人员可采用公知技术、例如位点特异性诱变法、PCR突变导入法等适当进行。
在本发明的优选的一个方案中，通过包括以下步骤的方法，可以从含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物中有效除去所产生的缔合体：
(a) 将含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物在酸性条件下处理的步骤；
(b) 将步骤(a)中获得的酸性组合物中和的步骤；以及
(c) 在中和后至少经过1小时后，从步骤(b)中获得的中和组合物中除去缔合体的步骤。
作为本发明中的pI为3.0～8.0的抗体的缔合体，可举出：1.5聚体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体等，但不限于这些。
通过本发明的方法，可有效除去在溶液中产生的低pI抗体的缔合体，且可抑制其后新缔合体产生的风险。本发明中，作为将含有抗体的组合物处理的酸性条件，可示例：通常为pH2.0～4.0，优选为pH3.0～3.9，进一步优选为pH3.1～3.8，但不限于这些。
作为将含有抗体的组合物在酸性条件下处理的方法，可举出：将盐酸、柠檬酸、磷酸、乙酸等公知的酸添加到含有抗体的组合物中的方法，但不限于这些。
本发明中，优选将在酸性条件下处理了的含有抗体的组合物保持规定的时间。作为保持时间，例如可举出：15分钟～4小时、优选30分钟～2小时、进一步优选1～1.5小时，但不限于这些。
本发明中，中和酸性组合物的步骤是指，将经酸性处理的含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物中和的步骤。作为中和后的pH值，可举出：通常pH4.5～8.5、优选pH6.5～8.5、进一步优选pH7.0～8.5，但不限于这些。
根据本申请的实施例的结果判明了：本发明的抗体的纯化方法中，使上述酸性组合物的pH值提高的步骤(中和的步骤等)间断性地进行时，每次都持续形成缔合体。因此，本发明的抗体的纯化方法或缔合体的除去方法中，优选除去所生成的抗体的缔合体的步骤最终在使pH值提高的步骤(中和的步骤等)结束之后进行。而且，优选在进行缔合体的除去之后不进行再次使pH值提高的步骤。
而且，本发明中，可以进一步包括下述的步骤：将含有抗体的酸性组合物中和，在比抗体的pI低的pH值下，将该组合物保持规定时间时，将该组合物的pH值调节成比抗体的pI高的值，将该组合物保持规定时间的步骤。
更具体而言，本发明涉及含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物的纯化方法，该方法包括下述的步骤：
(a) 将含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物在酸性条件下处理的步骤；
(b) 将步骤(a)中获得的酸性组合物中和，在比抗体的pI低的pH值下保持该组合物的步骤；
(c) 将步骤(b)中获得的中和组合物的pH值调节成比抗体的pI高的值的步骤；和
(d) 在中和后至少经过1小时后，从步骤(b)中获得的中和组合物中除去缔合体的步骤。
作为比抗体的pI低的pH值，可示例：比抗体的pI例如低0.3以上、优选低0.5以上、进一步优选低1.0以上的pH值，但不限于这些。另一方面，作为比抗体的pI高的pH值，可示例：比抗体的pI例如高0.3以上、优选高0.5以上、进一步优选高1.0以上的pH值，但不限于这些。而且，作为保持中和后的组合物的时间，例如可示例：1小时以上(例如，1小时～7天、优选1～3天)、优选2小时以上(例如，2小时～7天、优选2～72小时)、更优选6小时以上(例如，6小时～7天、优选6～72小时)、进一步优选12小时以上(例如，12小时～7天、优选12～72小时)，但不限于这些。
中和可使用缓冲液进行。作为用于中和的缓冲液，通常，只要是用于pH值调节的缓冲液即可，没有特别限定，例如可举出Tris、磷酸氢二钠等，优选可举出Tris，但不限于这些。
本发明的特征在于，首次发现了：将含有抗体的酸性溶液中和之后，在一定的时间持续地不断生成不可逆性的缔合体。这样的现象是对于pI未改变的通常的抗体(pI为9左右的抗体)观察不到的现象。虽然生成不可逆性缔合体的原因仍不清楚，但认为可能是由于：低pI抗体在酸性溶液中受到应激、在抗体pI值的附近调节组合物的pH值、或通过跨越抗体pI值进行组合物的pH值调节而引起的抗体分子的电荷变化等。无论如何，在本发明的方法中，将经酸性处理的pI值为3.0～8.0的抗体中和之后，经过一定的时间，然后除去所生成的抗体缔合体，由此防止在缔合体除去后产生新的缔合体。
更具体而言，作为中和后至进行抗体的缔合体除去为止的时间，可示例：通常1小时以上(例如，1小时～7天、优选1～3天)、优选2小时以上(例如，2小时～7天、优选2～72小时)、更优选6小时以上(例如，6小时～7天、优选6～72小时)、进一步优选12小时以上(例如，12小时～7天、优选12～72小时)、特别优选20小时、23小时、24小时或66小时或其以上，但不限于这些。
或者，本发明中，在经过对于缔合体的形成充分的时间之后，从中和的组合物中除去缔合体。本发明中，对于缔合体的形成充分的时间是指，被中和的组合物中期待形成缔合体的抗体形成缔合体所必要的时间。本发明的对于缔合体的形成充分的时间，不仅包含期待形成缔合体的所有抗体形成缔合体所必要的时间，还包含期待形成缔合体的抗体中至少50%以上、优选70%以上、进一步优选80%以上、特别优选90%以上的抗体形成缔合体所必要的时间。本领域技术人员可考虑实施例1所示的缔合体的生成时间，设定中和后至进行抗体缔合体的除去为止的时间。
或者，本发明中，还可在相对于中和组合物中能够产生的缔合体量，至少形成50%以上、优选70%以上、进一步优选80%以上、特别优选90%以上的缔合体之后，从该组合物中除去缔合体。本发明中，中和组合物中能够产生的缔合体量是指，由中和组合物中期待形成缔合体的抗体形成的缔合体的量。作为中和组合物中能够产生的缔合体量，可示例：中和后，保持通常1小时以上(例如，1小时～7天、优选1～3天)、优选2小时以上(例如，2小时～7天、优选2～72小时)、进一步优选6小时以上(例如，6小时～7天、优选6～72小时)、特别优选24小时后所形成的缔合体的量，但不限于这些。
或者，本发明中，还可以在中和组合物中能够引起的缔合体的形成至少完成50%以上、优选70%以上、进一步优选80%以上、特别优选90%以上之后，从该组合物中除去缔合体。本发明中，中和组合物中能够引起的缔合体的形成是指，期待形成缔合体的抗体形成缔合体。
或者，本发明中，还可以在中和组合物中缔合体的形成完成的至少1小时前，从该组合物中除去缔合体。本发明中，缔合体的形成完成是指，期待形成缔合体的抗体的缔合体形成完成。对于本发明的缔合体的形成完成，不仅指期待形成缔合体的所有抗体形成缔合体，而且指期待形成缔合体的抗体中至少50%以上、优选70%以上、进一步优选80%以上、特别优选90%以上的抗体的缔合体形成完成。
抗体的缔合体的形成是否完成，可如下进行确认：例如，如后述的实施例所示的方法，中和处理后经时性地将本发明的中和组合物利用尺寸排阻层析(SEC)进行分析，将所产生的缔合体量制图。
本发明中，可使用阴离子交换层析、多元层析、疏水性相互作用层析、羟磷灰石层析等，利用公知的方法，除去所产生的缔合体。特别优选使用阴离子交换层析或羟磷灰石层析。
而且，通过使用基于后述的阴离子交换层析的结合/洗脱模式的纯化步骤，可有效地除去本发明的缔合体。
本发明中，阴离子交换树脂只要显示阴离子交换作用则没有限定。作为阴离子交换树脂，可举出：
YMC-BioPro(YMC公司)、
Q Sepharose High Performance(GE Healthcare公司)、
Q Sepharose Fast Flow(GE Healthcare公司)、
Q Sepharose XL(GE Healthcare公司)、
Capto Q ImpRes(GE Healthcare公司)、
Capto Q(GE Healthcare公司)、
Capto DEAE(GE Healthcare公司)、
SOURCE 30Q(GE Healthcare公司)、
SOURCE 15Q(GE Healthcare公司)、
POROS HQ(Life technologies公司)、
POROS D(Life technologies公司)、
POROS PI(Life technologies公司)、
Eshumuno Q(Merck Millipore公司)、
Fractogel TMAE(Merck Millipore公司)、
Fractogel DEAE(Merck Millipore公司)、
Macro-Prep Q(Bio-Rad Laboratories公司)、
Macro-Prep DEAE(Bio-Rad Laboratories公司)、
Giga Cap Q-650M(TOSOH公司)、
Giga Cap DEAE-650M(TOSOH公司)、
Q HyperCel(PALL公司)等，但不限于这些。
而且，作为用于羟磷灰石柱层析的树脂，可示例：
Ceramic Hydroxyapatite(Bio-Rad Laboratories公司)、
Ceramic Fluoloapatite(Bio-Rad Laboratories公司)、
MPC Ceramic Hydroxyfluoloapatite(Bio-Rad Laboratories公司)、
HA Ultragel(PALL公司)等，但不限于这些。
而且，作为用于多元层析的树脂，可示例：
Capto Adhere(GE Healthcare公司)、
Capto MMC(GE Healthcare公司)、
Eshumuno HCX(Merck Millipore公司)，但不限于这些。
而且，作为用于疏水性相互作用层析的树脂，可示例：
Phenyl Sepharose High Performance(GE Healthcare公司)、
Butyl Sepharose High Performance(GE Healthcare公司)、
Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(GE Healthcare公司)、
Butyl-S Sepharose 6 Fast Flow(GE Healthcare公司)、
Butyl Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare公司)、
Octyl Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare公司)、
Capto Phenyl ImpRes(GE Healthcare公司)、
Capto Phenyl(GE Healthcare公司)、
Capto Butyl(GE Healthcare公司)、
Capto Octyl(GE Healthcare公司)、
Fractogel Phenyl(Merck Millipore公司)、
Fractogel Propyl(Merck Millipore公司)、
TOYOPEARL Butyl(TOSOH公司)、
TOYOPEARL Ether(TOSOH公司)、
TOYOPEARL Hexyl(TOSOH公司)、
TOYOPEARL Phenyl(TOSOH公司)、
TOYOPEARL PPG(TOSOH公司)、
TOYOPEARL SuperButyl(TOSOH公司)、
TOYOPEARL Butyl-600(TOSOH公司)、
Macro-Prep HIC(Bio-Rad Laboratories公司)等，但不限于这些。
缔合体是否被除去，可利用尺寸排阻层析(SEC)等本领域技术人员公知的方法进行判定，但不限于此。
本发明中，在酸性条件下处理的含有抗体的组合物可通过蛋白A柱层析等公知的纯化方法进行纯化。即，本发明的缔合体的除去方法可在“将(a)含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物在酸性条件下处理的步骤”之前，包括“将含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物利用蛋白A柱层析进行纯化的步骤”。
而且，本发明中，在用于除去pI值为3.0～8.0的抗体的缔合体的上述步骤(a)～(c)之后，可以包括：利用后述的阴离子交换层析的结合/洗脱模式(结合/洗脱组分)的纯化步骤、和/或、利用多元层析的流通模式(流通组分)或疏水性相互作用层析的流通模式的纯化步骤。若将这些步骤组合，则也包含除去缔合体以外的杂质，可有效地纯化pI值为3.0～8.0的抗体。
即，本发明涉及从含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物中有效除去杂质的方法，该方法包括以下的步骤：
(a) 将含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物负载于阴离子交换树脂的步骤；和
(b) 使用比(a)的组合物的盐浓度高的盐浓度的洗脱溶液，通过结合/洗脱模式，从阴离子交换树脂中洗脱pI值为3.0～8.0的抗体的步骤。
上述方法中，在步骤(b)之前，还包括：使用清洗溶液清洗阴离子交换树脂的步骤。
如后所述，本发明中，来自阴离子交换树脂的洗脱组分还可进一步供于多元层析或疏水性相互作用层析。由此可以进一步除去杂质。
所除去的杂质只要是目标蛋白质以外的物质，则可以是任何物质。作为杂质的例子，可举出：来源于宿主细胞的蛋白质(宿主细胞蛋白，Host cell proteins)或DNA、蛋白A(来自柱的洗脱物)、来源于目标蛋白质的缔合体或片段、病毒、内毒素、培养基成分Hy-Fish(FL)、IGF、胰岛素、抗生物质、消泡剂等，但不限于这些。本发明中，优选可除去宿主细胞蛋白或DNA、蛋白A、来源于目标蛋白质的缔合体(例如，抗体的缔合体)、病毒，但不限于这些。
通过本发明的方法除去的病毒没有特别限定。本发明的病毒中包含DNA病毒和RNA病毒。作为DNA病毒，可举出：MVM等的细小病毒，作为RNA病毒，可举出：MuLV等的逆转录病毒、Reo3等的呼肠孤病毒，但不限于这些。作为通过本发明的方法除去的病毒的具体例子，例如可举出：MuLV、PRV、Reo3、MVM、SV40、VSV、单纯疱疹病毒、CHV、辛德毕斯病毒、腮腺炎病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、风疹病毒、流感病毒、带状疱疹病毒、巨细胞病毒、副流感病毒、EB、HIV、HA、HB、NANB、ATL、ECHO、细小病毒等的病毒，优选可举出：MuLV、Reo3、MVM、PRV、SV40等的病毒，但不限于这些。
本发明中，活用低pI抗体的特征，初次确立了对于迄今为止的具有较高的pI的抗体未能实现的、基于阴离子柱的结合/洗脱模式的抗体的纯化方法。而且，初次确立了：通过将其与多元层析或疏水性相互作用层析结合使用，可更一步除去杂质的纯化方法。
本发明的方法中，作为利用阴离子交换树脂纯化含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物的条件，通常使用经下述缓冲液平衡的柱来进行：添加有浓度1～100mmol/L的Tris、BIS-TRIS、组氨酸，以氯离子、醋酸根离子作为反离子，pH值为pH6～pH9的缓冲液。优选使用经下述缓冲液平衡的柱来进行：添加有浓度10～50mmol/L的Tris，以氯离子或醋酸根离子作为反离子，pH值为pH7～pH8的缓冲液，但不限于这些。
其次，在本发明的方法中，可以包括：清洗吸附有pI值为3.0～8.0的抗体的阴离子交换树脂的步骤。清洗在与通常的平衡化条件同样的条件下进行；或者，相比洗脱的条件使用低浓度、或者同等或较高pH值的缓冲液来进行。具体而言，使用经下述缓冲液平衡的柱来进行：添加有浓度1～100mmol/L的Tris、BIS-TRIS、组氨酸，以氯离子、醋酸根离子作为反离子，pH值为pH6～pH9的缓冲液。优选使用下述缓冲液来进行：添加有浓度10～50mmol/L的Tris，以氯离子或醋酸根离子作为反离子，pH值为pH7～pH8的缓冲液，但不限于这些。
其次，在本发明的方法中，使用比含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物的盐浓度高的盐浓度的洗脱溶液，通过结合/洗脱模式从阴离子交换树脂中洗脱抗体。作为洗脱条件，通常使用下述缓冲液来进行：添加有浓度1～500mmol/L的Tris、BIS-TRIS、组氨酸，以氯离子、醋酸根离子作为反离子，根据需要进一步添加氯化钠、氯化钾、硫酸钠、磷酸钠，pH值为pH6～pH9的缓冲液。优选使用下述缓冲液来进行：添加有浓度10～500mmol/L的Tris，以氯离子或醋酸根离子作为反离子，根据需要进一步添加50～500mmol/L的氯化钠、磷酸钠、硫酸钠，pH值为pH7～pH8的缓冲液，但不限于这些。作为比含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物的盐浓度高的盐浓度，例如可举出：5mmol/L以上、优选10mmol/L以上，但不限于这些。作为洗脱溶液，可举出：含有选自氯化钠、Tris盐、硫酸钠盐、磷酸钠盐的至少一种的溶液，但不限于这些。
本发明中，还可以将从阴离子交换树脂中获得的含有pI值为3.0～8.0的抗体的洗脱组分(洗脱液)使用多元层析(例如，具有疏水性相互作用和阴离子交换作用的两种作用的树脂)进一步纯化。
就利用多元层析树脂纯化含有抗体的组合物而言，通常使用下述缓冲液来进行：添加有浓度1～500mmol/L的Tris、BIS-TRIS、组氨酸，以氯离子、醋酸根离子作为反离子，根据需要进一步添加氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸铵、柠檬酸钠、精氨酸，pH值为pH4～pH9的缓冲液。优选使用经下述缓冲液平衡的柱来进行：添加有浓度10～500mmol/L的Tris，以氯离子或醋酸根离子作为反离子，根据需要进一步添加50～500mmol/L的氯化钠和/或硫酸钠，pH值为pH6～pH7的缓冲液，但不限于这些。
将通过本发明的方法获得的阴离子交换层析的洗脱组分负载于多元层析，可以以流通组分和/或洗脱组分的形式获得含有目标的pI值为3.0～8.0的抗体的组分。通常，负载组分可预先调节成与平衡化条件同样的pH值，根据需要可进一步添加与用于平衡化的缓冲液同样的盐。
本发明中，流通组分是指，负载于柱的组分中未吸附于柱而回收的组分(杂质吸附于柱，目标物质未吸附于柱)。另一方面，洗脱组分是指，负载于柱的组分中流过比负载的组分的盐浓度高的盐浓度的缓冲液而回收的组分(目标物质吸附于(根据情况也有杂质)柱)。
而且，本发明中，从阴离子交换树脂获得的含有pI值为3.0～8.0的抗体的洗脱组分(洗脱液)，还可使用疏水性相互作用层析进一步纯化。
就利用疏水性相互作用层析树脂纯化含有抗体的组合物而言，通常使用下述缓冲液来进行：添加有浓度1～500mmol/L的Tris、BIS-TRIS、组氨酸，以氯离子、醋酸根离子作为反离子，根据需要进一步添加氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸铵、柠檬酸钠、精氨酸，pH值为pH4～pH9的缓冲液。优选使用经下述缓冲液平衡的柱来进行：添加有浓度10～500mmol/L的Tris，以氯离子或醋酸根离子作为反离子，根据需要进一步添加50～500mmol/L的氯化钠和/或硫酸钠，pH值为7～8的缓冲液，但不限于这些。
将通过本发明方法获得的阴离子交换层析的洗脱组分负载于疏水性相互作用层析，可以以流通组分和/或洗脱组分的形式获得含有目标抗体的组分。通常，负载组分可预先调节成与平衡化条件同样的pH值，根据需要，可进一步添加与用于平衡化的缓冲液同样的盐。
本发明的方法中，通过将缓冲液和负载组分调制成不含氯离子的组成，可以期待缓冲液用罐和组分用罐的防锈效果。
本发明的从含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物中除去杂质的方法中，对于负载于阴离子交换树脂的组合物，在负载于阴离子交换树脂之前，可利用蛋白A柱层析等公知的纯化方法纯化。而且，负载于阴离子交换树脂的组合物可以供于包括以下(a)～(c)的步骤：
(a) 将含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物在酸性条件下保持的步骤；
(b) 将步骤(a)中获得的酸性组合物中和的步骤；以及
(c) 在中和后至少经过1小时后，从步骤(b)中获得的中和组合物中除去缔合体的步骤。
关于杂质是否被除去的判定，杂质为蛋白质时，可利用尺寸排阻层析(SEC)来进行，但不限于这些。
而且，杂质为DNA时，可利用qPCR法、阈值法等来进行，但不限于这些。
杂质为来源于细胞的蛋白质(Host cell protein/HCP)时，可利用使用抗HCP抗体的ELISA法来进行，但不限于这些。
杂质为蛋白A时，可利用使用抗蛋白A抗体的ELISA法来进行，但不限于这些。
杂质为病毒时，可利用qPCR法、组织感染法、噬菌斑法等来进行，但不限于这些。
杂质为IGF时，可利用使用抗IGF抗体的ELISA法来进行，但不限于这些。
杂质为胰岛素时，可利用使用抗胰岛素抗体的ELISA法来进行，但不限于这些。
杂质为FL时，可利用使用抗FL抗体的ELISA法来进行，但不限于这些。
杂质为消泡剂时，可利用NMR来进行，但不限于这些。
杂质为内毒素时，根据将鲎的血细胞提取成分LAL(鲎阿米巴样细胞溶解物，Limulus Amebocyte Lysate)活化的反应，利用比色法或比浊法进行测定，但不限于这些。
杂质为抗生物质时，利用使用特异性识别庆大霉素等抗生物质的抗体的ELISA法，测定其浓度，但不限于这些。
而且，本发明涉及pI值为3.0～8.0的抗体的制备方法，该方法包括下述的步骤：从含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物中除去该抗体的缔合体和/或杂质的步骤。而且，本发明涉及含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物的制备方法，该方法包括下述的步骤：
(a) 获取含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物的步骤；以及
(b) 使用本说明书中记载的纯化方法等，从步骤(a)的组合物中纯化pI值为3.0～8.0的抗体的步骤。
抗体的纯化包含：从含有抗体的组合物中除去抗体的缔合体和/或杂质。本发明中获得的含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物中，关于缔合体的含有比例，例如可举出：5%以下、优选4%以下、特别优选3%以下，但不限于这些。本发明中，缔合体的含有比例是指，形成缔合体的抗体相对于组合物中所含的抗体的比例。
而且，本发明涉及通过本说明书中记载的纯化方法等或制备方法获得的pI值为3.0～8.0的抗体、或含有该抗体的组合物。而且，本发明涉及通过本说明书中记载的纯化方法等或制备方法获得的pI值为3.0～8.0的抗体、或含有该抗体的药物组合物。本发明的药物组合物可以含有药学上可接受的载体和/或添加剂。
并且，本发明涉及制备含有pI值为3.0～8.0的抗体的药物组合物的方法，该方法包括以下的步骤：
1) 通过本说明书中记载的方法获取pI值为3.0～8.0的抗体的步骤；以及
2) 将步骤1)中制备的pI值为3.0～8.0的抗体与药学上可接受的载体和/或添加剂混合制成制剂的步骤。
本发明的药物组合物可以是溶液制剂(含有抗体的溶液制剂)或冻干剂。本发明的溶液制剂还包含冻干制剂的制备步骤中的冻干处理前的溶液或再溶解后的溶液。本发明的溶液制剂优选在制备过程中不包括冻干步骤而制备的溶液制剂。而且，本发明的冻干剂可通过本领域技术人员公知的方法将本发明的溶液制剂冻干而获得。
而且，本发明的制剂中根据需要可以包含：冻结保护剂、悬浮剂、助溶剂、等渗剂、保存剂、吸附防止剂、稀释剂、赋形剂、pH值调节剂、镇痛剂、含硫还原剂、抗氧化剂等添加材料或载体。
作为冻结保护剂，例如可举出：海藻糖、蔗糖、山梨糖醇等的糖类，但不限于这些。
作为助溶剂，例如可举出：聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚山梨醇酯80、烟酰胺、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、聚乙二醇、蓖麻油脂肪酸乙酯等，但不限于这些。
作为等渗剂，例如可举出：氯化钠、氯化钾、氯化钙等，但不限于这些。
作为保存剂，例如可举出：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、山梨酸、苯酚、甲酚、氯甲酚等，但不限于这些。
作为吸附防止剂，例如可举出：人血清白蛋白、卵磷脂、葡聚糖、环氧乙烷/环氧丙烷共聚物、羟丙基纤维素、甲基纤维素、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙二醇等，但不限于这些。
作为含硫还原剂，例如可举出：Ｎ-乙酰半胱氨酸、Ｎ-乙酰高半胱氨酸、硫辛酸、硫二甘醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨糖醇、巯基乙酸及其盐、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、碳原子数1～7的硫代链烷酸等具有巯基的化合物等，但不限于这些。
作为抗氧化剂，例如可举出：异抗坏血酸、二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚、α-生育酚、生育酚醋酸酯、Ｌ-抗坏血酸及其盐、Ｌ-抗坏血酸棕榈酸盐、Ｌ-抗坏血酸硬脂酸酯、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、没食子酸三戊酯、没食子酸丙酯、或乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、焦磷酸钠、偏磷酸钠等的螯合剂，但不限于这些。
本发明的制剂，可以以口服或胃肠外的任一种形式给予，通常，通过胃肠外途径给予。具体而言，可通过注射、经皮、经粘膜、经鼻、经肺等给予。作为注射剂型的例子，例如可通过皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射等全身或局部给予。皮下注射时，虽然有注射液量的限制，但可使1次抗体给予量为大量(100～200mg左右)。因此，本发明的制剂特别适用于皮下给予(注射)。
需要说明的是，本说明书中引用的所有现有技术文献均作为参照而纳入本说明书中。
实施例
以下，通过实施例进一步详细地说明本发明，但本发明的范围不仅仅限于这些实施例。
实施例1. 通过病毒灭活和中和后的保持来抑制后续步骤中的缔合体形成
本实施例中，提供了以下的抗体。
Mab1：WO2009/041621中记载的抗IL-6受体抗体，通过改变Mab3的氨基酸使pI值达到5.8。Mab1抗体的氨基酸序列由H链/SEQ ID NO: 1、L链/SEQ ID NO: 2表示。
Mab2：利用WO2009/072604的实施例12中记载的方法制作的完全人源化NS22抗体，即抗NR10(IL-31受体)抗体。抗体类别为IgG2，是通过改变氨基酸序列使pI值降低至5.6的抗体。Mab2抗体的氨基酸序列由H链/SEQ ID NO: 3、L链/SEQ ID NO: 4表示。
Mab3：托珠单抗(H链/SEQ ID NO: 5、L链/SEQ ID NO: 6)。pI值为9.4。
使用CHO细胞稳定表达株，利用本领域技术人员公知的方法表达上述抗体，利用包含蛋白A柱层析的本领域技术人员公知的方法进行纯化，用于下述实施例的缔合体的除去的评价。
将Mab1和Mab2分别模仿实际生产及纯化步骤中的病毒灭活步骤，向纯化的抗体溶液中添加1mol/L盐酸，然后在pH3.8以下保持了30分钟以上。将保持了的组分用1～2mol/LTris在pH6.5以上进行了中和处理。使用中和后的保持时间不同的组分，利用包含羟磷灰石柱层析的本领域技术人员公知的方法或包含阴离子交换层析的方法除去缔合体，高纯度地进行了纯化。将除去了缔合体的组分进一步保持，使用尺寸排阻层析(SEC)，利用面积百分比法，算出了与纯化后的保持时间对应的缔合体量。
在羟磷灰石柱层析中，关于Mab1，利用10mmol/L磷酸缓冲液(pH6.5)将柱进行了平衡化之后，负载了经中和处理的组分。利用10mmol/L磷酸缓冲液(pH6.5)将柱进行了清洗之后，通过利用500mmol/L NaCl、10mmol/L磷酸缓冲液(pH6.5)使盐浓度提高，从而使Mab1洗脱。关于Mab2，利用10mmol/L磷酸缓冲液(pH6.5)将柱进行了平衡化之后，负载了经中和处理的组分。利用100mmol/L MES、5mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)将柱进行了清洗之后，通过利用200mmol/L NaCl、17.5mmol/L磷酸缓冲液(pH6.6)使盐浓度提高，从而使Mab2洗脱。
在阴离子交换层析中，关于Mab1，利用20mmol/L Tris-醋酸缓冲液(pH8.0)将柱进行了平衡化之后，负载了经中和处理的组分。利用20mmol/L Tris-醋酸缓冲液(pH8.0)将柱进行了清洗之后，通过利用267mmol/L Tris-醋酸缓冲液(pH8.0)使盐浓度提高，从而使Mab1洗脱。关于Mab2，利用20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.0)将柱进行了平衡化之后，负载了经中和处理的组分。利用20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.0)将柱进行了清洗之后，通过利用350～360mmol/L NaCl、20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.0～7.2)使盐浓度提高，从而使Mab2洗脱。
关于Mab3，也同样利用盐酸保持之后，进行中和处理，算出了中和后的保持时间中的缔合体量。
实施尺寸排阻层析(SEC)，以分析各保持时间中的抗体的缔合体量。利用下述流动相将各样本稀释至约1.0g/L，利用G3000SWXL柱(Tosoh)分析了这些样本。流动相使用包含300mmol/L NaCl的50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.5)，以流速0.5ml/min进行了分析。将比单体更早洗脱的峰作为缔合体进行分析，利用面积百分比法算出了单体和缔合体的含量(%)。
将Mab1和Mab2的、中和后的保持时间和实施羟磷灰石柱层析后的缔合体量(缔合体的比例)示于表1。将实施阴离子交换层析后的缔合体量示于表2。将Mab1、Mab2、Mab3的、与中和后的保持时间对应的缔合体量示于表3。根据这些结果明确了：关于Mab1和Mab2任一种，即使在中和后利用层析立即除去缔合体也会再度形成缔合体，相对于此，通过在中和后放置规定时间后进行纯化，则纯化后的缔合体增加几乎观察不到。另一方面，关于Mab3，可以判断为：观察不到中和后的缔合体的增加，不需要到下一个步骤为止的保持时间。
[表1]
[表2]
[表3]
※1 在低pH3.1下保存1小时后，在pH7.0下中和(利用蛋白A柱纯化后的抗体溶液中的醋酸浓度：50mM)
※2 在低pH3.1下保存1小时后，在pH7.0下中和(利用蛋白A柱纯化后的抗体溶液中的醋酸浓度：20mM)
※3 在低pH3.6下保存1小时后，在pH7.0下中和(利用蛋白A柱纯化后的抗体溶液中的醋酸浓度：50mM)
※4 在低pH3.4下保存1小时后，在pH7.0下中和(利用蛋白A柱纯化后的抗体溶液中的醋酸浓度：20mM)
※5 在低pH3.4下保存1小时后，在pH7.0下中和(利用蛋白A柱纯化后的抗体溶液中的盐酸浓度：2.5mM)。
实施例2. 低pI抗体的纯化过程
实施例2-1. Mab1在阴离子交换层析的含氯化钠洗脱液中的缔合体除去
抗IL-6受体抗体Mab1为低pI(pI<8; pI5.8)的改变抗体，使用CHO细胞稳定表达株，利用本领域技术人员公知的方法，使其表达，利用包含蛋白A柱层析的本领域技术人员公知的方法高纯度地进行纯化，用于下述的实施例的纯化。
将Mab1模拟实际生产及纯化步骤中的病毒灭活步骤，向纯化的抗体溶液中添加1mol/L盐酸，在pH3.6以下保持了30分钟以上。将保持了的组分用1mol/L Tris在pH7以上进行了中和处理。然后，保持24小时以上用于纯化。
作为阴离子交换层析，使用表4所示的市售树脂进行了纯化。用20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)将柱进行了平衡化之后，负载了经中和处理的组分。用20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)将柱进行了清洗之后，通过利用20mmol/L Tris-HCl、100～150mmol/LNaCl缓冲液(pH8.0)使盐浓度提高，从而使Mab1洗脱。使用尺寸排阻层析(SEC)，利用面积百分比法，算出了纯化后的缔合体量。
[表4]
实施尺寸排阻层析(SEC)，以分析各保持时间中的抗体的缔合体量。利用下述流动相将各样本稀释至约1.0g/L，利用G3000SWXL柱(Tosoh)分析了这些样本。流动相使用包含300mmol/L NaCl的50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.5)，以流速0.5ml/min进行了分析。将比单体更早洗脱的峰作为缔合体进行分析，利用面积百分比法算出了单体和缔合体的含量(%)。
将Mab1的、阴离子交换层析纯化后的缔合体量示于表5。根据该结果明确了：在阴离子交换层析中分离了Mab1的单体和缔合体。
[表5]
。
实施例2-2. Mab2在阴离子交换层析的含氯化钠洗脱液中的缔合体除去
抗IL-31受体抗体Mab2是低pI(pI<8; pI5.6)的改变抗体，使用CHO细胞稳定表达株，利用本领域技术人员公知的方法，使其表达，利用包含蛋白A的本领域技术人员公知的方法高纯度地进行纯化，用于下述的实施例的纯化。
将Mab2模拟实际生产及纯化步骤中的病毒灭活步骤，向纯化的抗体溶液中添加1mol/L盐酸，在pH3.6以下保持了30分钟以上。将保持了的组分用1mol/L Tris在pH7以上进行了中和处理。然后，保持20小时以上用于纯化。
作为阴离子交换层析，使用表6所示的市售树脂进行了纯化。用20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.0或8.0)将柱进行了平衡化之后，负载了经中和处理的组分。用20mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7.0)将柱进行了清洗之后，通过利用20mmol/L Tris-HCl、200～300mmol/L NaCl缓冲液(pH7.0)使盐浓度提高，从而使Mab2洗脱。使用尺寸排阻层析(SEC)，利用面积百分比法，算出了纯化后的缔合体量。
[表6]
将Mab2的、阴离子交换层析纯化后的缔合体量示于表7。根据该结果明确了：在阴离子交换层析中分离了Mab2的单体和缔合体。
[表7]
。
实施例2-3. Mab1在阴离子交换层析的各种洗脱液中的缔合体除去
将Mab1模拟实际生产及纯化步骤中的病毒灭活步骤，向纯化的抗体溶液中添加1mol/LHCl，在pH3.6以下保持了30分钟以上。将保持了的组分用1mol/L Tris在pH7.0以上进行了中和处理。然后，保持24小时以上用于纯化。
作为阴离子交换层析，使用表8所示的市售树脂进行了纯化。用20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)或20mmol/L Tris-醋酸缓冲液(pH8.0)将柱进行了平衡化之后，负载了经中和处理的组分。用20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)或20mmol/L Tris-醋酸缓冲液(pH8.0)将柱进行了清洗之后，通过利用240～270mmol/L Tris-醋酸缓冲液(pH8.0)或40～60mmol/L磷酸钠缓冲液(pH8.0)或20mmol/L Tris-HCl中包含20～50mmol/L硫酸钠的缓冲液(pH8.0)使盐浓度提高，从而使Mab1洗脱。使用尺寸排阻层析(SEC)，利用面积百分比法，算出了纯化后的缔合体量。
[表8]
将Mab1的、阴离子交换层析纯化后的缔合体量示于表9。根据该结果明确了：在阴离子交换层析中分离了Mab1的单体和缔合体。
[表9]
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实施例2-4. Mab1在阴离子交换层析的含Tris洗脱液中的病毒清除能力
将Mab1模拟实际生产及纯化步骤中的病毒灭活步骤，向纯化的抗体溶液中添加1mol/L盐酸，在pH3.6以下保持了30分钟以上。将保持了的组分用1mol/L Tris在pH7以上进行了中和处理。然后，保持20小时以上用于纯化。
作为阴离子交换层析，使用市售的POROS HQ树脂(Life technologies公司制造)进行了纯化。用20mmol/L Tris-醋酸缓冲液(pH7.8)将柱进行了平衡化之后，负载了向经中和处理的组分中添加有逆转录病毒的模型病毒MuLV而得的物质。用20mmol/L Tris-醋酸缓冲液(pH7.8)将柱进行了清洗之后，通过利用225～275mmol/L Tris-醋酸缓冲液(pH7.8)使盐浓度提高，从而使Mab1洗脱。纯化后测定负载组分和洗脱组分的病毒效价，算出了病毒量。
将Mab1的、阴离子交换层析纯化中的病毒清除能力示于表10。根据该结果明确了：通过利用阴离子交换层析使用Tris-醋酸进行纯化，可以有效除去病毒。
[表10]
。
实施例2-5. Mab2在阴离子交换层析的含Tris洗脱液中的缔合体除去
将Mab2模拟实际生产及纯化步骤中的病毒灭活步骤，向纯化的抗体溶液中添加1mol/L盐酸，在pH3.6以下保持了30分钟以上。将保持了的组分用1mol/L Tris在pH7以上进行了中和处理。然后，保持20小时以上用于纯化。
作为阴离子交换层析，使用表11所示的市售树脂进行了纯化。用20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.0或8.0)将柱进行了平衡化之后，负载了经中和处理的组分。用20mmol/LTris-醋酸缓冲液(pH7.0或8.0)将柱进行了清洗之后，通过利用300～500mmol/L Tris-醋酸(pH7.0或8.0)使盐浓度提高，从而使Mab2洗脱。使用尺寸排阻层析(SEC)，利用面积百分比法，算出了纯化后的缔合体量。
[表11]
将Mab2的、阴离子交换层析纯化后的缔合体量示于表12。根据该结果明确了：在阴离子交换层析中分离了Mab2的单体和缔合体。
[表12]
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实施例2-6. Mab2在阴离子交换层析的含Tris洗脱液中的病毒清除能力
将Mab2模拟实际生产及纯化步骤中的病毒灭活步骤，向纯化的抗体溶液中添加1mol/L盐酸，在pH3.6以下保持了30分钟以上。将保持了的组分用1mol/L Tris在pH7以上进行了中和处理。然后，保持20小时以上用于纯化。
作为阴离子交换层析，使用市售的POROS PI树脂(Life technologies公司制造)进行了纯化。用20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)将柱进行了平衡化之后，负载了向经中和处理的组分中添加有逆转录病毒的模型病毒MuLV而得的物质。用20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)将柱进行了清洗之后，通过利用470mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)使盐浓度提高，从而使Mab2洗脱。纯化后测定负载组分和洗脱组分的病毒效价，算出了病毒量。
将Mab2的、阴离子交换层析纯化中的病毒清除能力示于表13。根据该结果明确了：通过利用阴离子交换层析使用Tris-HCl进行纯化，可以除去病毒。
[表13]
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实施例2-7. 利用阴离子交换层析和多元层析来纯化Mab1
使用CHO细胞稳定表达株，利用本领域技术人员公知的方法表达Mab1，利用包含蛋白A柱层析的本领域技术人员公知的方法高纯度地进行纯化之后，利用实施例2-3和2-4中所示的阴离子交换层析进行纯化，用于下述的实施例的纯化。
使用醋酸将阴离子交换层析的洗脱组分调节至pH6.5±0.3。使用市售的CaptoAdhere(GE Healthcare公司制造)作为多元层析(疏水＋阴离子交换)的树脂进行了纯化。用250+/-25mmol/L Tris-醋酸缓冲液(pH6.5)将柱进行了平衡化之后，负载了经pH值调节的组分。回收了流通组分的Mab1。
通过这些一系列的纯化，使来源于步骤的杂质DNA除去至<1.0pg/mg-Mab1(不足定量极限)、宿主细胞蛋白除去至<17ng/mg-Mab1(不足定量极限)、浸出蛋白A除去至<0.4ng/mg-Mab1(不足定量极限)，同时如实施例2-3所示，可除去Mab1的缔合体。关于病毒清除能力，除了如实施例2-4所示的充分的病毒清除能力之外，在多元层析步骤中对于逆转录病毒的模型病毒MuLV也可确保5.42 Log10的高病毒清除能力。
DNA按照定量PCR法进行了测定。宿主细胞蛋白按照使用抗宿主细胞蛋白抗体的ELISA法进行了测定。浸出蛋白A按照使用抗蛋白A抗体的ELISA法进行了测定。
实施例2-8. 利用阴离子交换层析和疏水性相互作用层析来纯化Mab2
使用CHO细胞稳定表达株，利用本领域技术人员公知的方法，使Mab2表达，利用包含蛋白A的本领域技术人员公知的方法高纯度地进行纯化之后，利用实施例2-2和2-6中所示的阴离子交换层析进行纯化，用于下述的实施例的纯化。
向阴离子交换层析的洗脱组分中添加盐(例如，硫酸钠)使终浓度达到250mmol/L以上，调节至pH6.8～8.0，使用疏水性相互作用层析的树脂(例如，具有苯基的树脂)进行了纯化。用与所添加的盐具有同等浓度的缓冲液(pH6.8～8.0)进行了平衡化之后，负载组分，回收了流通组分的Mab2。
通过这些一系列的纯化，使来源于步骤的杂质DNA除去至1.9pg/mg-Mab2、宿主细胞蛋白除去至<8.0ng/mg-Mab2(不足定量极限)、浸出蛋白A除去至<0.4ng/mg-Mab2(不足定量极限)，同时如实施例2-2所示，可除去Mab2的缔合体。关于病毒清除能力，除了如实施例2-6所示的充分的病毒清除能力之外，在疏水性相互作用层析步骤中对于逆转录病毒的模型病毒MuLV也可确保5.94 Log10的高病毒清除能力，对于细小病毒的模型病毒MVM也可确保1.55 Log10的高病毒清除能力。
DNA按照定量PCR法进行了测定。宿主细胞蛋白按照使用抗宿主细胞蛋白抗体的ELISA法进行了测定。浸出蛋白A按照使用抗蛋白A抗体的ELISA法进行了测定。
实施例3. 取决于病毒灭活后的中和后的保持pH值的不同的缔合体形成
本实施例中，提供了以下的抗体。
Mab1：WO2009/041621中记载的抗IL-6受体抗体，通过改变Mab3的氨基酸使pI值达到5.8。Mab1抗体的氨基酸序列由H链/SEQ ID NO: 1、L链/SEQ ID NO: 2表示。
使用CHO细胞稳定表达株，利用本领域技术人员公知的方法，使上述抗体表达，利用包含蛋白A柱层析的本领域技术人员公知的方法进行纯化，用于评价下述的实施例的缔合体形成量。
将Mab1模拟实际生产及纯化步骤中的病毒灭活步骤，向纯化的抗体溶液中添加1mol/L盐酸，在pH3.8以下保持了30分钟以上。将保持了的组分用2mol/L Tris、在比当抗体的pI低的pH5.0和比pI高的pH7.0下进行了中和处理。中和后，随着时间采集样本，测定了缔合体量。并且，关于用pH5.0中和的样本，在22小时中和保持后进一步添加2mol/L Tris，保持在高于pI的pH7.0下，随着时间采集样本，测定了缔合体量。使用尺寸排阻层析(SEC)，利用面积百分比法，算出了缔合体量。
实施尺寸排阻层析(SEC)，以分析各保持时间中的抗体的缔合体量。利用下述流动相将各样本稀释至约1.0g/L，利用G3000SWXL柱(Tosoh)分析了这些样本。流动相使用包含300mmol/L NaCl的5mmol/L磷酸缓冲液(pH7.5)，以流速0.5ml/min进行了分析。将比单体更早洗脱的峰作为缔合体进行分析，利用面积百分比法算出了单体和缔合体的含量(%)。
将在pH7.0下保持时随着时间的缔合体增加量和在pH5.0下保持22小时后在pH7.0下保持时随着时间的缔合体增加量示于表14(在pH7.0下保持时)和表15(在pH5.0下保持22小时后提高至pH7.0时)。根据这些结果明确了：将Mab1在pH5.0(比Mab1的pI低)下中和，即使随着时间的缔合体增加稳定，如再次使pH值提高至pH7.0(比Mab1的pI高)进行保持，则再次可见随着时间的缔合体增加，保持规定时间后变得稳定。
[表14]
[表15]
。
产业实用性
根据本发明可以提供：可有效除去特别是含有pI低的抗体的组合物中所含的抗体的缔合体或杂质的纯化方法。根据本发明可以提供：含有缔合体生成得到抑制的抗体的制剂。本发明的纯化方法在要求高纯度的生物医药品的制备中有用。

Claims (19)

1.含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物的纯化方法，该方法包括下述的步骤：
(a) 将含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物在酸性条件下处理的步骤；
(b) 将步骤(a)中获得的酸性组合物中和的步骤；以及
(c) 在中和后至少经过1小时后，从步骤(b)中获得的中和组合物中除去缔合体的步骤。
2.权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)是将pI值为3.0～8.0的抗体利用蛋白A柱层析纯化之后进行的病毒灭活处理步骤。
3.权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(c)是将步骤(b)中获得的中和组合物在中和后至少保持1小时后除去缔合体的步骤。
4.权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，利用阴离子交换层析、疏水性相互作用层析、多元层析或羟磷灰石层析进行缔合体的除去。
5.权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，抗体的pI值为5.0～7.5。
6.权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，抗体的pI值为5.0～6.5。
7.从含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物中除去杂质的方法，该方法包括下述的步骤：
(a) 将含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物负载到阴离子交换树脂上；
(b) 使用比(a)的组合物的盐浓度高的盐浓度的洗脱溶液，利用结合/洗脱模式，从阴离子交换树脂中洗脱pI值为3.0～8.0的抗体的步骤。
8.权利要求7所述的方法，其中，在步骤(b)之前包括：使用清洗溶液清洗阴离子交换树脂的步骤。
9.权利要求7或8所述的方法，其中，步骤(b)的洗脱溶液是包含选自氯化钠、Tris盐、硫酸钠盐、磷酸钠盐的至少一种的溶液。
10.权利要求7～9中任一项所述的方法，该方法还包括下述的步骤：将通过步骤(b)获得的含有pI值为3.0～8.0的抗体的洗脱产物负载到使用具有疏水性配体和/或多元配体的树脂的层析，获取流通组分和/或洗脱组分的步骤。
11.权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于，通过权利要求7～10中任一项所述的方法进行缔合体的除去。
12.权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，抗体为人源化抗体或人抗体。
13.权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，抗体为抗IL-6受体抗体或抗IL-31受体抗体。
14.制备含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物的方法，其中，通过权利要求1～13中任一项所述的方法，使抗体的缔合体的含有比例为3%以下。
15.抗体的缔合体的含有比例为3%以下的组合物，其是含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物。
16.缔合体的含有比例为3%以下的组合物，其是通过权利要求14所述的方法制备的含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物。
17. 制备含有pI值为3.0～8.0的抗体的药物组合物的方法，该方法包括以下的步骤：
1) 通过权利要求14所述的制备方法，制备pI值为3.0～8.0的抗体和/或含有该抗体的组合物的步骤；以及
2) 将步骤1)中制备的pI值为3.0～8.0的抗体和/或含有该抗体的组合物与药学上可接受的载体和/或添加剂混合制成制剂的步骤。
18.从含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物中除去抗体的缔合体的方法，该方法包括以下的步骤：
(a) 将含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物在酸性条件下处理的步骤；
(b) 将步骤(a)中获得的酸性组合物中和的步骤；以及
(c) 在中和后至少经过1小时后，从步骤(b)中获得的中和组合物中除去缔合体的步骤。
19.含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物的纯化方法，该方法包括下述的步骤：
(a) 将含有pI值为3.0～8.0的抗体的组合物在酸性条件下处理的步骤；
(b) 将步骤(a)中获得的酸性组合物中和的步骤；以及
(c) 在经过对于缔合体的形成充分的时间之后，从步骤(b)中获得的中和组合物中除去缔合体的步骤。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114181300A (zh) * 2021-12-20 2022-03-15 方坦思(上海)生物医药有限公司 一种高纯度单克隆抗体的制备方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10858391B2 (en) 2015-07-31 2020-12-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for purifying composition comprising antibodies with anionic polymer
MX2019007564A (es) 2016-12-23 2019-09-06 Serum Institute Of India Pvt Ltd Metodos mejorados para estimular la productividad de anticuerpos en el cultivo de celulas de mamiferos y reducir la agregacion durante los procesos de formulacion corriente abajo y formulaciones de anticuerpos estables obtenidas a partir de los mismos.
CA3052911A1 (en) * 2017-02-08 2018-08-16 Novartis Ag Fgf21 mimetic antibodies and uses thereof
JP7074859B2 (ja) * 2017-12-22 2022-05-24 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 疎水性相互作用クロマトグラフィーによる軽鎖誤対合抗体変種の枯渇の方法
KR102337683B1 (ko) * 2018-09-21 2021-12-13 주식회사 녹십자 고효율 항-tfpi 항체 조성물

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101874042A (zh) * 2007-09-26 2010-10-27 中外制药株式会社 利用cdr的氨基酸取代来改变抗体等电点的方法
JP2010241761A (ja) * 2009-04-09 2010-10-28 Asahi Kasei Chemicals Corp アニオン交換基が固定された多孔膜を用いた抗体モノマーの精製方法
CN102257005A (zh) * 2008-10-20 2011-11-23 雅培制药有限公司 在抗体纯化过程中的病毒灭活
WO2013012022A1 (ja) * 2011-07-19 2013-01-24 中外製薬株式会社 アルギニンアミドまたはその類似化合物を含む安定なタンパク質含有製剤

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4891312A (en) * 1986-08-13 1990-01-02 Monsanto Company Monoclonal antibody specific for human colon fibroblast-derived t-PA
JPS63149900A (ja) 1986-12-15 1988-06-22 Toshiba Corp 半導体メモリ
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
WO1992020791A1 (en) 1990-07-10 1992-11-26 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
GB9022547D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Purified immunoglobulin
WO1992019759A1 (en) 1991-04-25 1992-11-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human interleukin 6 receptor
DK0605522T3 (da) 1991-09-23 2000-01-17 Medical Res Council Fremgangsmåde til fremstilling af humaniserede antistoffer
ES2227512T3 (es) 1991-12-02 2005-04-01 Medical Research Council Produccion de anticuerpos contra auto-antigenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago.
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
JP3507073B2 (ja) 1992-03-24 2004-03-15 ケンブリッジ アンティボディー テクノロジー リミティド 特異的結合対の成員の製造方法
CA2140638C (en) 1992-07-24 2010-05-04 Raju Kucherlapati Generation of xenogeneic antibodies
JPH08510116A (ja) * 1993-04-09 1996-10-29 カイロン コーポレイション 二重特異性抗原結合分子
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
GB9313509D0 (en) 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
EP0731842A1 (en) 1993-12-03 1996-09-18 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
EP0770628B9 (en) 1994-07-13 2007-02-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human interleukin-8
CA2219361C (en) 1995-04-27 2012-02-28 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
BR9713294A (pt) 1996-09-26 2000-10-17 Chugai Pharmaceutical Co Ltd "anticorpos contra proteìna relacionada a hormÈnio de paratiróide humano"
UA76934C2 (en) 1996-10-04 2006-10-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Reconstructed human anti-hm 1.24 antibody, coding dna, vector, host cell, method for production of reconstructed human antibody, pharmaceutical composition and drug for treating myeloma containing reconstructed human anti-hm 1.24 antibody
ES2364266T3 (es) 1998-04-03 2011-08-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anticuerpo humanizado hacia el factor tisular humano (tf) y procedimiento para construir el anticuerpo humanizado.
TWI242043B (en) 2000-03-10 2005-10-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Polypeptide inducing apoptosis
AU2002210917B2 (en) 2000-10-20 2006-05-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Degraded TPO agonist antibody
EP1652925B1 (en) 2003-07-15 2010-12-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha IgM PRODUCTION BY TRANSFORMED CELLS AND METHODS FOR QUANTIFYING SAID IgM PRODUCTION
BRPI0415887B1 (pt) 2003-10-27 2021-01-26 Wyeth métodos para a remoção de agregados de elevado peso molecular utilizando cromatografia de hidroxiapatita
US20080058507A1 (en) 2004-02-11 2008-03-06 Hui Liu Method For The Removal Of Aggregate Proteins From Recombinant Samples Using Ion Exchange Chromatography
ES2568436T3 (es) 2006-03-31 2016-04-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Procedimiento para controlar la farmacocinética en sangre de anticuerpos
US7691980B2 (en) * 2007-01-09 2010-04-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enhanced capacity and purification of antibodies by mixed mode chromatography in the presence of aqueous-soluble nonionic organic polymers
NZ581395A (en) 2007-05-14 2012-08-31 Biogen Idec Inc Single-chain fc (scfc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto
BRPI0814355A2 (pt) 2007-08-10 2015-01-27 Centocor Ortho Biotech Inc Fragmentos de clivagem de imunoglobulina como indicadores de doença e composições para detecção e ligação dos mesmos
CN101939425B (zh) 2007-09-26 2014-05-14 中外制药株式会社 抗il-6受体抗体
SG10201605394SA (en) 2007-09-26 2016-08-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Modified Antibody Constant Region
RU2531521C2 (ru) 2007-12-05 2014-10-20 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антитело против nr10 и его применение
US8168759B2 (en) * 2008-07-18 2012-05-01 Bristol-Myers Squibb Company Compositions monovalent for CD28 binding and methods of use
JP2010041761A (ja) * 2008-07-31 2010-02-18 Thk Co Ltd リニアモータ
CA2911256A1 (en) * 2008-10-20 2010-12-09 Robert K. Hickman Isolation and purification of antibodies using protein a affinity chromatography
WO2010106812A1 (en) 2009-03-19 2010-09-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical formulation containing improved antibody molecules
SG10201501342UA (en) * 2010-02-24 2015-04-29 Immunogen Inc Folate receptor 1 antibodies and immunoconjugates and uses thereof
CN103339507A (zh) * 2010-08-26 2013-10-02 霍夫曼-拉罗奇有限公司 DCC第五纤连蛋白III型域的重组Fc融合蛋白
JP6023715B2 (ja) * 2010-10-11 2016-11-09 アッヴィ・バハマズ・リミテッド タンパク質の精製方法
AU2011320318B9 (en) * 2010-10-29 2015-11-19 Immunogen, Inc. Non-antagonistic EGFR-binding molecules and immunoconjugates thereof
JP6253986B2 (ja) * 2010-11-19 2017-12-27 モルフォシス・アーゲー コレクション及びその使用方法
CN103442760B (zh) * 2011-04-05 2016-10-26 瑞思迈有限公司 呼吸设备
KR20210025692A (ko) * 2011-12-22 2021-03-09 제넨테크, 인크. 이온 교환 막 크로마토그래피
TWI593705B (zh) * 2011-12-28 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101874042A (zh) * 2007-09-26 2010-10-27 中外制药株式会社 利用cdr的氨基酸取代来改变抗体等电点的方法
CN102257005A (zh) * 2008-10-20 2011-11-23 雅培制药有限公司 在抗体纯化过程中的病毒灭活
JP2010241761A (ja) * 2009-04-09 2010-10-28 Asahi Kasei Chemicals Corp アニオン交換基が固定された多孔膜を用いた抗体モノマーの精製方法
WO2013012022A1 (ja) * 2011-07-19 2013-01-24 中外製薬株式会社 アルギニンアミドまたはその類似化合物を含む安定なタンパク質含有製剤

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114181300A (zh) * 2021-12-20 2022-03-15 方坦思(上海)生物医药有限公司 一种高纯度单克隆抗体的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
TWI715524B (zh) 2021-01-11
IL246367A0 (en) 2016-08-31
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EP3088411A1 (en) 2016-11-02
KR102344170B1 (ko) 2021-12-27
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