TWI641689B - Method for producing antibody or antibody composition - Google Patents

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TWI641689B
TWI641689B TW102139951A TW102139951A TWI641689B TW I641689 B TWI641689 B TW I641689B TW 102139951 A TW102139951 A TW 102139951A TW 102139951 A TW102139951 A TW 102139951A TW I641689 B TWI641689 B TW I641689B
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Abstract

本發明係以含有二種以上Fab的抗體，尤其規定輕鏈-重鏈組合之抗體、及對應的抗體組成物、或此等的製造方法為課題。
依據本發明，提供(1)抗體；或(2)抗體組成物；的製造方法，利用非天然型雙硫鍵的方法。

Description

抗體或抗體組成物的製造方法
本發明係關於含有至少二個相異的Fab區的抗體，尤其規定輕鏈-重鏈組合之抗體、及對應的抗體組成物、或此等的製造方法。
具有二個相異的抗原辨識部位之雙重特異性抗體等之多重特異性抗體，就所謂的可同時結合二個以上相異的抗原之特異性質，期待開發作為醫藥品或診斷藥劑，但生產性低或精製的困難成為障礙，不能邁向實用化。
另外，雖已知幾種多重特異性抗體的有效的製造方法，但多數係藉由規定抗體的重鏈-重鏈間的結合，達成有效地製造多重特異性抗體者(專利文獻1~6)。
另外，以下專利文獻之揭示內容全部係藉由參照而引用於本說明書。
先前技術文獻
專利文獻1：國際公開第98/50431號公報
專利文獻2：國際公開第2010/151792號公報
專利文獻3：美國專利第7,183,076號公報
專利文獻4：國際公開第2009/089004號公報
專利文獻5：國際公開第2007/147901號公報
專利文獻6：國際公開第2011/034605號公報
本發明者等係以製造含有二個相異的Fab區的抗體；或Fab區於至少二個抗體間為相異之組成物時之生產性低或精製困難為課題，努力研究，發現使用非天然型雙硫鍵，可效率佳地製造此等。亦即，依據本發明，可效率佳地製造具有輕鏈及重鏈特定組合之抗體。
依據本發明，提供(1)抗體；或(2)含有抗體之組成物；之製造方法，利用非天然型雙硫鍵之方法。
上述(1)抗體中含有至少二個Fab區，所含Fab區中至少二個相異。
另外，上述(2)組成物係含有至少二種含Fab區之抗體，所含抗體具有的Fab區中，至少二個相異。
藉由此方法，可有效率地製造上述抗體或組成物。
於某型態，此方法係包含於抗體表現之條件下，培養含有編碼抗體之核酸之寄主細胞之步驟。
另外，於某型態，此方法係包含自寄主細胞培養物回收抗體之步驟。
於某型態，至少一個Fab區係含有輕鏈及重鏈之間形成非天然型雙硫鍵之半胱胺酸殘基。
另外，於某型態，某輕鏈及重鏈間之雙硫鍵的位置與 抗體或組成物所含之其他至少一個輕鏈及重鏈間之雙硫鍵的位置相異；或某Fab區與抗體或組成物所含之其他至少一個Fab區相異的位置，形成雙硫鍵。
另外，於某型態，上述非天然型雙硫鍵及上述雙硫鍵係CL區及CH1區之間的雙硫鍵。
另外，依據本發明，提供含第一Fab區與第二Fab區之抗體的製造方法，利用非天然型雙硫鍵之方法。
構成上述第一Fab區之輕鏈及重鏈與構成上述第二Fab區之輕鏈及重鏈係分別不同。
依據此方法，可有效率地製造上述抗體。
於某型態，此方法係包含對應目的抗體之親抗體中，取代第一Fab區之CL區及CH1區中半胱胺酸以外之至少一個胺基酸殘基成形成或可能形成雙硫鍵之半胱胺酸殘基之步驟。
另外，於某型態，此方法係包含藉由形成或可能形成雙硫鍵之半胱胺酸殘基，使於第一Fab區中形成非天然型雙硫鍵之步驟。
另外，於某型態，包含使第一Fab區與第二Fab區於不同的位置，形成雙硫鍵之步驟。
另外，依據本發明，提供以上述方法所製造之抗體。
另外，依據本發明，提供含有至少二個相異的Fab區之抗體。
於某型態，上述抗體中之至少一個Fab區含有於CL區及CH1區之間形成或可能形成非天然型雙硫鍵之半胱 胺酸殘基，藉此形成非天然型雙硫鍵。
另外，於某型態，某CL區及CH1區間的雙硫鍵的位置與其他至少一個CL區及CH1區間的雙硫鍵的位置相異；或某Fab區係於與其他至少一個Fab區相異的位置形成雙硫鍵。
另外，於某型態，抗體係含有二個相異的Fab區而成。
另外，依據本發明，提供以上述方法所製造之組成物。
另外，依據本發明，提供含有至少二個含Fab區之抗體之組成物。此組成物中抗體之Fab區中，至少二個Fab區相異。
於某型態，上述抗體中之至少一個Fab區係含有於輕鏈及重鏈之間形成或可能形成非天然型雙硫鍵之半胱胺酸殘基，藉此形成非天然型雙硫鍵。
另外，於某型態，某抗體之輕鏈及重鏈間的雙硫鍵的位置與其他至少一個抗體的輕鏈及重鏈間的雙硫鍵的位置相異；或某抗體之Fab區係於與其他至少一個抗體之Fab區相異的位置，形成雙硫鍵。
另外，於某型態，上述非天然型雙硫鍵及上述雙硫鍵係於CL區及CH1區間的雙硫鍵。
於某型態，此抗體為多重特異性抗體。於某型態，此抗體為雙重特異性抗體。
於某型態，此抗體係將至少二個抗體片段藉由連接子 或直接連結者。
於某型態，此抗體係抗體片段。
於某型態，此抗體為嵌合抗體、人化抗體或人抗體。
於某型態，此抗體之Fc區係由其他分子所取代之抗體。
另外，依據本發明，提供藉由於選自a)輕鏈116位置-重鏈134位置、b)輕鏈116位置-重鏈141位置、c)輕鏈118位置-重鏈128位置、d)輕鏈121位置-重鏈126位置、e)輕鏈121位置-重鏈127位置、f)輕鏈124位置-重鏈126位置、g)輕鏈162位置-重鏈170位置、h)輕鏈162位置-重鏈171位置及i)輕鏈162位置-重鏈173位置中至少一組之輕鏈-重鏈的位置所導入的半胱胺酸殘基，形成非天然型雙硫鍵之上述的方法、抗體或組成物。
另外，依據本發明，提供藉由於選自b)輕鏈116位置-重鏈141位置、c)輕鏈118位置-重鏈128位置、f)輕鏈124位置-重鏈126位置、g)輕鏈162位置-重鏈170位置、h)輕鏈162位置-重鏈171位置及i)輕鏈162位置-重鏈173位置中至少一組之輕鏈-重鏈的位置所導入的半胱胺酸殘基，形成非天然型雙硫鍵之上述的方法、抗體或組成物。
另外，依據本發明，提供藉由於選自輕鏈為κ鏈時之b)輕鏈116位置-重鏈141位置、f)輕鏈124位置-重鏈126位置及g)輕鏈162位置-重鏈170位置、以及輕鏈為λ鏈時之h)輕鏈162位置-重鏈171位置及i)輕鏈162 位置-重鏈173位置中至少一組之輕鏈-重鏈的位置所導入的半胱胺酸殘基，形成非天然型雙硫鍵之上述的方法、抗體或組成物。
另外，依據本發明，提供於選自a)F116C-S134C、b)F116C-A141C、c)F118C-L128C、d)S121C-F126C、e)S121C-P127C、f)Q124C-F126C、g)S162C-F170C、h)S162C-P171C、i)S162C-V173C、j)F118C-L128C、k)E124C-F126C、l)T162C-F170C、m)T162C-P171C及n)T162C-V173C中至少一組之輕鏈半胱胺酸-重鏈半胱胺酸之間，形成非天然型雙硫鍵之上述的方法、抗體或組成物。
於某型態，於選自b)F116C-A141C、c)F118C-L128C、f)Q124C-F126C、g)S162C-F170C、h)S162C-P171C及i)S162C-V173C中至少一組之輕鏈半胱胺酸-重鏈半胱胺酸之間，形成非天然型雙硫鍵。
另外，於其他型態，於選自輕鏈為κ鏈時之b)F116C-A141C、f)Q124C-F126C及g)S162C-F170C、以及輕鏈為λ鏈時之m)T162C-P171C及n)T162C-V173C中至少一組之輕鏈半胱胺酸-重鏈半胱胺酸之間，形成非天然型雙硫鍵。
另外，依據本發明，提供至少一個Fab區之CL區及CH1區之間未形成非天然型雙硫鍵之上述的方法、抗體或組成物。
另外，依據本發明，提供某Fab區中CL區及CH1區 間的雙硫鍵的位置與其他至少一個Fab區中CL區及CH1區間的雙硫鍵的位置全部相異之上述的方法、抗體或組成物。
另外，依據本發明，提供寄主細胞係真核生物細胞或大腸桿菌之上述的方法。
另外，依據本發明，提供與規定重鏈-重鏈間結合之技術組合之上述的方法、抗體或組成物。
〔圖1〕用以說明本發明(Cys1m技術)之有效性的圖。
〔圖2〕實施例中使用之引子序列一覽。
〔圖3〕實施例中使用之cDNA序列一覽。
〔圖4〕實施例中使用之cDNA等之轉錄產物之序列一覽。
〔圖5〕表示本發明之抗體(Cys1m抗體(抗CD20抗體))中SS鍵形成之SDS-PAGE圖。
〔圖6〕表示本發明之抗體(Cys1m抗體(抗CD37抗體))中SS鍵形成之SDS-PAGE圖。
〔圖7〕表示本發明之抗體(Cys1m抗體)中SS鍵形成之SDS-PAGE圖。
〔圖8〕表示本發明之抗體(Cys1m抗體；抗HER2抗體、抗EGFR抗體、抗CD52抗體)中SS鍵形成之SDS-PAGE圖。
〔圖9〕表示〔輕鏈Cys1m型-重鏈野生型〕抗體(輕鏈為κ鏈)中SS鍵形成之SDS-PAGE圖。
〔圖10〕表示〔輕鏈Cys1m型-重鏈野生型〕或〔輕鏈野生型-重鏈Cys1m型〕抗體(輕鏈為λ鏈)中SS鍵形成之SDS-PAGE圖。
〔圖11〕表示〔輕鏈野生型-重鏈Cys1m型〕抗體(輕鏈為κ鏈)中SS鍵形成之SDS-PAGE圖。
〔圖12〕導入非天然型雙硫鍵之抗CD20抗體之抗原結合能(調查對表現CD20抗原之Ramos細胞之抗原結合能之結果)表示圖。
〔圖13〕導入非天然型雙硫鍵之抗CD20抗體之抗原結合能(調查對表現CD20抗原之Ramos細胞之抗原結合能之結果)表示圖。
〔圖14〕導入非天然型雙硫鍵之抗CD20抗體之抗原結合能(調查對表現CD20抗原之Ramos細胞之抗原結合能之結果)表示圖。
〔圖15〕導入非天然型雙硫鍵之抗CD20抗體之抗原結合能(調查對表現CD20抗原之Ramos細胞之抗原結合能之結果)表示圖。
〔圖16〕導入非天然型雙硫鍵之抗CD20抗體之抗原結合能(調查對表現CD20抗原之Ramos細胞之抗原結合能之結果)表示圖。
〔圖17〕導入非天然型雙硫鍵之抗CD37抗體之抗原結合能(調查對表現CD37抗原之Ramos細胞之抗原結合 能之結果)表示圖。
〔圖18〕導入非天然型雙硫鍵之抗CD37抗體之抗原結合能(調查對表現CD37抗原之Ramos細胞之抗原結合能之結果)表示圖。
〔圖19〕導入非天然型雙硫鍵之抗CD37抗體之抗原結合能(調查對表現CD37抗原之Ramos細胞之抗原結合能之結果)表示圖。
〔圖20〕表示雙重特異性抗體αCD20(Cys1m)/αDR5之蛋白質A親和性精製之結果圖。
〔圖21〕表示F(ab')2解析精製αCD20(Cys1m)/αDR5之結果圖。
〔圖22〕表示F(ab')2解析親抗體αCD20及αDR5之結果圖。
〔圖23〕表示F(ab')2解析精製αCD20(Cys1m)/αCD37之結果圖。
〔圖24〕表示F(ab')2解析親抗體αCD20及αCD37之結果圖。
〔圖25〕表示Fab解析精製αCD20(Cys1m)/αDR5之結果圖。
〔圖26〕表示Fab解析親抗體αCD20、αDR5及輕鏈錯誤結合體之結果圖。
〔圖27〕表示Fab解析αCD20(Cys1m)/αCD37之結果圖。
〔圖28〕表示Fab解析親抗體αCD20、αCD37及輕 鏈錯誤結合體之結果圖。
〔圖29〕表示Fab解析αCD20(Cys1m)/αDR5中蛋白質A親和性精製檢品之結果圖。
〔圖30〕表示Fab解析αCD20(Cys1m)/αCD37中蛋白質A親和性精製檢品之結果圖。
〔圖31〕表示解析對精製αCD20(Cys1m)/αCD37之CD20〔+〕CD37〔-〕細胞之抗原結合能之結果圖。
〔圖32〕表示解析對精製αCD20(Cys1m)/αCD37之CD20〔-〕CD37〔+〕細胞之抗原結合能之結果圖。
〔圖33〕表示解析對精製αDR5/αCD20(Cys1m)之DR5〔+〕CD20〔-〕細胞之抗原結合能之結果圖。
〔圖34〕表示解析對精製αDR5/αCD20(Cys1m)之DR5〔-〕CD20〔+〕細胞之抗原結合能之結果圖。
用以實施發明之最佳型態 〔用語及型態之說明〕
本說明書中，下述用語係具有以下所示的意義，各用語係表示以下所示之各型態者。
「抗體」係指因抗原抗體反應而表示與抗原之結合性之分子，具有一對或二對或其以上之結合部位(Fv)。抗體雖非局限於此者，但例如包含具有含輕鏈及重鏈之一對或二對多胜肽鏈之全長抗體及其一部份(片段)。各輕鏈或重鏈係可含有可變區(對抗原之辨識及結合有關)及恆定 區(限定化，補體依賴性細胞傷害活性及細胞間相互作用有關)。最一般的全長抗體係含有2處的輕鏈可變(VL)區、2處的輕鏈恆定(CL)區、2處的重鏈可變(VH)區及2處的重鏈恆定(CH)區。可變區係含有賦予抗原特異性於抗體之序列之互補性決定區(CDR)及構架區(FR)。
由上述定義顯示，本說明書中「抗體」係除非特別註明，包含二個或三個或其以上之抗體(例如Fab區等之抗體片段)藉由連接子或直接連結者(含複數個抗體片段而成之抗體)。作為如此抗體，雖非受此限定，但可舉例如複數個抗體片段係以連接子所連結之抗體。
抗體係包含單株抗體、多株抗體、至少2個抗體所形成之多重特異性抗體(例如雙重特異性抗體)、具有所需的生物學活性之抗體片段及Fc區係由其他分子所取代之抗體等。另外，抗體係包含嵌合抗體(例如人化抗體)、(完全)人抗體、多元抗體、改變抗體。
對「改變抗體」，雖非受此限定者，但包含於維持結合能下，使缺失(縮短)或附加(加長)胺基酸序列者、取代部份胺基酸序列者、使缺失或附加糖鏈的一部份或全長者、及其他附加連接子等者以及此等之組合。
另外，尤其抗體含Fc區時，抗體可含糖鏈。藉由哺乳動物細胞所生產的天然抗體，典型上係含藉由N鍵結於Fc區之CH2區段(domain)之Asn297而一般結合之支鏈寡糖(例如參照Wright et al.,(1997)Trends Biotechnol. 15：26-32)。寡糖可含各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)、半乳糖、及唾液酸、以及結合於二支鏈寡糖結構之「主幹部」之GlcNAc之果糖。
另外，抗體係於不損及發明功效之範圍，可為任何型(例如IgG、IgA、IgM、IgD、IgE)、任何亞型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。
可變區係包含可變區中被稱為最高頻率變化之互補性決定區(CDR)或高變區(HVR)之片段、及被稱為比較高度保持之構架區(FR)之片段。天然抗體之輕鏈及重鏈之可變區係分別含有3個CDR及4個FR區。各鏈之CDR係與其他鏈之CDR一同幫助抗體之抗原結合部位的形成(例如參照Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。
所謂「互補性決定區」或「CDR」(或「高變區」、「HVR」或「HV」)係指高頻率可變的，形成環之抗體可變區中之區域。抗體一般含有於VL中3個CDR(CDRL1、CDRL2、CDRL3)、於VH中3個CDR(CDRH1、CDRH2、CDRH3)。
作為CDR定義，於不損及本發明功效之範圍，可使用任意定義。作為CDR定義，並非受此限定者，可使用例如Kabat、Chothia、AbM、contact等之該技術領域所使用之通常的CDR定義。Kabat定義係基於序列變化，最為一般所使用(例如參照Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。Chothia係考量結構的環位置所決定者(例如參照Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。AbM係Kabat與Chothia結構的環之中間定義，依據Oxford Molecular社之AbM抗體模型軟體所使用。contact係基於複合物結晶結構的分析(例如參照MacCallum et al.,J.Mol.Biol.262：732-745(1996))。此等CDR之各定義如下所示。
CDR可含以下中至少一個「擴大CDR」。
VL之24-36或24-34(CDRL1)、46-56或50-56(CDRL2)、89-97或89-96(CDRL3)、VH之26-35(CDRH1)、50-65或49-65(CDRH2)、93-102、94-102或95-102(CDRH3)
抗體之胺基酸殘基之編號係可使用「Kabat編號系統」(依據Kabat之可變區殘基編號或Kabat之胺基酸位置編號)(例如參照Kabat et al.,Sequences of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。此編號係胺基酸序列可含相當於插入可變區之FR或CDR內之附加胺基酸。例如重鏈可變區可包含於重鏈FR殘基82之後(殘基82a、82b及82c等)以及CDRH2之殘基52之後(殘基52a)插入胺基酸。殘基之Kabat號碼係依據標準的Kabat編號序列，藉由於抗體序列之相同區域相互比較而可決定。
另外，特別清楚記載的情況，亦可使用依據Chothia之編號等之該業者已知之其他編號。
「EU編號」或「EU索引」係一般指免疫球蛋白重鏈恆定區時所使用(例如參照國際免疫學情報提供網站(www.imgt.org)；Edelman G.M.et al.,The covalent structure of an entire γG immunoglobulin molecule.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1969,63(1),78-85；Kabat et al.,Sequences of Immunological Interest.5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。「Kabat之EU編號」或「Kabat之EU索引」係組合上述Kabat編號及EU編號之編號，廣泛地使用於人IgG1之編號等。本說明書中，除非特別清楚記載，抗體之胺基酸殘基之編號係使用依據Kabat之EU編號系統之殘基編號。
「所謂Fab區」(或「Fab部份」)係指相當於將抗體以木瓜酵素切斷時所得之2種片段中，具有抗原結合能之片 斷區域，亦指含有來自輕鏈的部份及來自重鏈的部份雙方者。Fab區係典型地含有輕鏈及重鏈的可變區(VL及VL區)，且含有輕鏈之恆定(CL)區及重鏈之第一恆定(CH1)區。Fab區係該技術領域已知之區域，可藉由常法決定。例如目的的區域是否為Fab區，可利用與已知抗體等之相同性而決定或簡單地作為區段集合表示。為可改變Fab區之分界，雖非受此限定者，但典型上人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM中，Fab區係含輕鏈可變區(長度依抗體選殖而異)之輕鏈(κ鏈及λ鏈)全長、及於重鏈可變區(長度依抗體選殖而異)，加入第一恆定(CH1)區而成。
所謂「二個相異的Fab區」係指於構成該Fab區之輕鏈部份及重鏈部份雙方之一次序列、側鏈之修飾或高階結構等，分別有一個或複數個相異點之二個Fab區。
所謂「連接子」係指使某分子與其他分子連接時所使用之連接分子，於該技術領域已知各式各樣者。成為連接對象的分子係包含多胜肽或低分子化合物，可舉抗體片段彼此、或抗體片段與其他成分之連接等為例。作為具體的連接子，並非局限於下述者，可舉例如GS連接子((GGGGS)3)等之數個殘基~數十個殘基長度之胜肽、或N-琥珀醯亞胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸(SPDP)；琥珀醯亞胺基6-3-〔2-吡啶基二硫基〕丙醯胺)己酸(LC-SPDP)；磺基琥珀醯亞胺基6-3-〔2-吡啶基二硫基〕丙醯胺)己酸(Sulfo-LC-SPDP)；N-琥珀醯 亞胺基3-(2-吡啶基二硫基)丁酸(SPDB)；琥珀醯亞胺氧基羰基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯(SMPT)；琥珀醯亞胺基6-(α-甲基)-〔2-吡啶基二硫基〕甲醯胺)己酸(LC-SMPT)；磺基琥珀醯亞胺基6-(α-甲基-〔2-吡啶基二硫基〕丙醯胺)己酸(Sulfo-LC-SMPT)；琥珀醯亞胺基-4-(對馬來醯亞胺苯基)丁酸(SMPB)；磺基琥珀醯亞胺基-4-(對馬來醯亞胺苯基)丁酸(Sulfo-SMPB)；間對馬來醯亞胺苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBS)；間對馬來醯亞胺苯甲醯基-N-羥基磺基琥珀醯亞胺酯(Sulfo-MBS)；S-乙醯基巰基琥珀酸酐(SAMSA)；二甲基3,3-二硫雙丙醯胺(DTBP)；2-亞胺基硫烷鹽；之所謂的低分子化合物。另外，連接子與連接分子之間或連接子內，亦可含有非共價鍵之結合。
胜肽等為「相異」時之相異點，雖非受此限定者，但包含胺基酸序列的相異、附加糖鏈的相異、化學修飾的相異、雙硫鍵的相異等。
另外，本發明中，本發明目的用所使用之半胱胺酸殘基及/或雙硫鍵之相異係不含於上述相異點為宜(亦即，除了本發明目的用所使用之半胱胺酸殘基及/或雙硫鍵之相異以外，具有至少一個相異點為宜)。
所謂「(輕鏈)CL區」係指輕鏈之恆定區，該技術領域已知之區域。CL區係可藉由常法決定，例如目的的區域是否為CL區，可利用與已知抗體等之相同性而決定。為可改變CL區之分界，雖非受此限定者，人κ鏈中，CL 區典型上由109~214而成。另外，人λ鏈中，CL區典型上由109~213而成。
所謂「(重鏈)CH1區」係指重鏈之第一恆定區，該技術領域已知之區域。在此定義之CH1區亦可含連接CH1區之絞鏈區的一部份(可包含於Fab區之絞鏈區)。CH1區係可藉由常法決定，例如目的的區域是否為CH1區，亦可利用與已知抗體等之相同性而決定。為可改變CH1區之分界，雖非受此限定者，但典型上人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4之重鏈中，在此定義之CH1區係由胺基酸殘基號碼118~215及附加絞鏈區的一部份(例如胺基酸殘基號碼216~224)而成，IgM之重鏈中，在此定義CH1區域係由胺基酸基號碼118~216而成。
所謂「Fc區」係指相當於將抗體以木瓜酵素切斷時所得之2種片段中，不具有抗原結合能之片斷區域。Fc區係指典型上一般含有一部份絞鏈區，由重鏈第二恆定(CH2)區及同樣的第三恆定(CH3)區而成之抗體重鏈之C端區域。重鏈Fc區之分界可改變，例如人IgG1重鏈Fc區，一般係由Thr225之胺基酸殘基至CH3區之羧基端而成。
依據抗體之重鏈恆定區之胺基酸序列，抗體被分配於相異的型，例如IgA、IgD、IgE、IgG及IgM之5型，進而IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及IgA2等之亞型。對應上述5個型之重鏈恆定區係分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
另外，抗體之輕鏈係基於其胺基酸序列，可取Kappa(κ)及Lamda(λ)中任一種。
所謂抗體之「作用機能」係指抗體之Fc區具有的生物學活性，依抗體之同型而可改變。抗體之作用機能之例係包含C1q結合性；補體依賴性細胞傷害(CDC)；Fc受器結合性；抗體依賴性細胞介導性細胞傷害(ADCC)；吞噬作用；細胞機能障礙、抑制；毒素之中和；及免疫負責細胞(例如B細胞)活性化。
上述之Fc區通常成為對嗜中性球、巨噬細胞、其他免疫輔助細胞、補體複合體及免疫系統受體之結合部位。此部份亦可改變，此改變係包含例如抗體之胺基酸序列之胺基的附加、缺失、一個或複數個胺基酸的取代、及(亞)類型轉變(class switching)。
另外，抗體亦包含藉由已知之任意方法進行修飾之修飾抗體。例如提高糖鏈修飾(WO0061739等)或Fc區之胺基酸突變(US20050054832A1)等與Fc受體等之結合，可帶來較高的治療效果。
「天然抗體」中，人IgG係由二個相同的輕鏈及二個相同的重鏈而成之分子量約為150kDa之異四聚體糖蛋白質。各輕鏈係藉由一個雙硫鍵結合於重鏈。另一方面，重鏈係藉由複數個雙硫鍵彼此結合，其數量係依IgG之亞型而異。亞型IgG1時，重鏈間存在二個雙硫鍵。因此，鏈間結合相關之雙硫鍵數合計為四個。各鏈係於胺基端側有可變區，於羧基側有恆定區。重鏈的中間部份，亦即CH1 區及CH2區之分界係具有高可塑性之絞鏈區，藉著其中存在的二個雙硫鍵而重鏈彼此結合。另外，藉由疏水的結合力，CH3區彼此間內捲(Involution)。另一方面，CL區係藉由疏水結合力與CH1區內捲，同時亦藉由雙硫鍵結合。該結果係VL區與VH區位置接近。
所謂「單株抗體」係指來自僅一組之抗體基因(輕鏈1種及重鏈1種)，以蛋白質程度實質上均勻抗體之集團。集團所含之各個抗體係除了少量且有存在的可能性之突變(例如自然產生的突變)以外係相同的。另外，單株抗體係不局限其製作方法，可依據各種常法製作。此等之製造方法係包含例如融合瘤法、DNA重組法、噬菌體表現(phage display)技術、以及使具有編碼部份或全部人類免疫球蛋白基因座(immunoglobulin locus)或人類免疫球蛋白序列的基因之動物，生產人或類人抗體之技術等。
所謂「嵌合抗體」係指輕鏈或重鏈或其雙方部份具有來自特定種的胺基酸序列，剩餘部份為來自他種之胺基酸序列而成之抗體。包含例如來自大鼠或小鼠抗體等之動物抗體之可變區與其他分子(例如來自人抗體之恆定區)融合之抗體。
「人化抗體」係嵌合抗體之一種，具有輕鏈及/或重鏈之可變區序列經改變成與已知之人可變區序列大致一致的可變區之抗體。如此改變係傳統技術上已知的，並非局限於此者，典型上係藉由誘導突變或CDR移植所進行。CDR移植係指將具有所需特異性之抗體之CDR，移植於 人抗體之構架，藉此將大部份之非人序列與人序列交換。
例如依據最佳符合法，將提供者抗體之可變區序列，對已知之人可變區序列庫之全體，進行相同性搜尋，將最接近提供者序列之人序列，作為人化抗體之人構架使用。其他方法係使用自輕鏈或重鏈之特定亞型之全部人抗體之相同序列(consensus sequence)所得之特定構架。可使用相同構架於數種相異的人化抗體。
抗體係以保持對抗原之親和性及/或所需之生物學特性而被人化為宜。因此，例如亦可使用親抗體序列及人化序列之三次元模式，進行分析親抗體序列及各種概念上之人化產物之流程。
人化抗體係對於接受者抗體(人抗體)，對於提供者抗體(例如鼠抗體)，亦可含未發現之殘基。藉由將小鼠單株抗體人化，減低人抗小鼠抗體(HAMA)反應。
「人抗體」係指輕鏈及重鏈雙方之恆定區及可變區皆為來自人或實質上與其相同之抗體、及/或使用在此所揭示之用以製造人抗體之任一項技術所製造之抗體。
人抗體係可藉由各種傳統技術製作，可舉以下方法為例。
將選自來自人之噬菌體表現庫(phage display library)之Fv選殖(clone)可變區序列，藉由與已知之人恆定區序列組合，可製作人抗體。
另外，對抗原刺激反應，不產生內因性免疫球蛋白，藉由投與抗原於可產生人抗體之完全資料庫之基因轉殖動 物(例如小鼠；例如免疫化基因轉殖鼠(XenoMouse))，可調製人抗體(例如參照關於XENOMOUSE技術之美國專利第6075181號及第6150584號)。另外，已知生殖細胞系突變體小鼠之抗體重鏈結合區(JH)基因之同型結合體(homozygote)缺失係不產生內因性抗體，對此小鼠，移植導入人生殖細胞系免疫球蛋白基因序列之胚性幹細胞之小鼠，藉由投與抗原而產生人抗體(例如參照Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,2551-2555(1993)；Jakobovits et al.,Nature 362,255-258(1993)；Bruggermann et al.,Year in Immunol.,7：33-40(1993))。
另外，人抗體亦可藉由人的B細胞融合瘤技術製作(例如參照Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103：3557-3562(2006))。用以生產人單株抗體之人骨髓瘤及小鼠-人異骨髓瘤細胞株係記載於例如Kozbor，J.Immunol.133,3001-3005(1984)；Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；Boerner et al.,J.Immunol.,147：86-95(1991)。
另外，人抗體係具有與非人親抗體(例如小鼠抗體)類似的親和性及特性時，為自非人親抗體得到人抗體，亦可使用基因重排(亦稱為抗原決定位印模；例如參照國際公開第93/06213號)。與藉由CDR移植之非人抗體之人化不同，藉由此技術，亦可得到完全不具有非人起源之 FR或CDR殘基之人抗體。
所謂「抗體片段」係指含足以賦予抗原結合之可變區序列之抗體的一部份。所謂作為本發明對象所使用時之抗體片段係指含有一對或二對以上之輕鏈可變區與重鏈可變區之組合之抗體的一部份。如此之抗體的一部份並非受此限定者，含Fv、Fab、F(ab')2。
此等抗體片段係可依常法製作，例如可藉由胃蛋白酶消化等之抗體之蛋白質分解切斷法、操作抗體的輕鏈及重鏈之cDNA，產生輕鏈及重鏈片段之基因重組法等製作。抗體之胃蛋白酶處理係產生「F(ab')2」片段，其具有二個抗原結合部位，可交叉結合(cross-linking)抗原。
開發用以產生抗體片段之各種技術。例如此等片段可藉由抗體之蛋白質分解(切斷、消化)而誘導(例如參照Morimoto et al.,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)；Brennan et al.,Science,229：81-83(1985))。另外，此等片段亦可藉由基因重組寄主細胞(例如大腸桿菌)直接產生。另外，使自寄主細胞回收的Fab'-SH片段化學性結合，亦可形成F(ab')2片段(例如參考Carter et al.,Bio/Technology(NY)10：163-167(1992))。
「Fv片段」係含完全的抗原結合部位之最小抗體片段。雙股Fv一般係由一個輕鏈可變區段及一個重鏈可變區段的二聚體而成。
「Fab」片段係含輕鏈及重鏈之可變區(VL及VH 區)，具有輕鏈恆定(CL)區及及重鏈第一恆定(CH1)區之抗體片段。另外，「F(ab')2片段」係之間以鉸鏈半胱胺酸殘基形成之雙硫鍵結合之Fab'片段對。
「多株抗體」係指具有3個或其以上之抗原結合部位之抗體。多株抗體一般具有二聚體化區段(例如Fc區或絞鏈區)及3個或其以上(例如3至8，尤其4)之抗原結合部位(例如參照Tutt et al.,J.Immunol.147：60-69(1991))。
「多重特異性抗體」係指對至少二個相異的抗原，具有結合特異性之抗體(亦含抗體片段)，亦包含雙重特異性抗體。
雙重特異性抗體係依據已知的方法而可製作。例如雙重特異性抗體係可藉由具有相異特異性之二個免疫球蛋白輕鏈-重鏈對之同時表現而製造(例如參照Milstein and Cuello,Nature,305：537-539(1983)；國際公開第93/08829號；Traunecker et al.,EMBO J.10：3655-3659(1991))。此時，因為輕鏈及重鏈隨機締合(association)，所以此等之融合瘤(四個雜種)係產生10個相異抗體的混合物，其中一個具有正確的雙重特異性結構，藉由親和層析法等分離、精製。關於此，亦已知更適合地得到如此組合之雙重特異性抗體的方法，亦可使用此(例如參照國際公開第94/04690號)。關於用以產生雙重特異性抗體之更詳細內容，例如參照Suresh et al.,Methods in Enzymology,121：210-228(1986)。
所謂「具有結合能」係指分子(例如抗體)對其結合對象(例如抗原)，具有結合(主要是非共價鍵)的能力，尤其特異結合能力。
「結合親和性」係指分子(例如抗體)之單一結合部位與其結合對象(例如抗原)之間之非共價鍵的相互作用之綜合強度。除非特別清楚記載，結合親和性係指反映結合對的成員(例如抗體與抗原)之間之1：1相互作用之結合親和性。一般分子X之對其對象Y之親和性係以解離定數(Kd)表示。親和性係可依據該業者已知之方法測定。相對於低親和性抗體緩慢地結合於抗原，迅速地解離之趨勢，高親和性抗體係採更長久結合於抗原之狀態。
對於抗體，亦包含與一個或複數個藥劑複合之抗體(如此抗體亦特別稱為「藥劑結合抗體」或「ADC」)。另外，抗體亦包含與胜肽、多胜肽或蛋白質複合之抗體。另外，對於抗體，亦包含與一個或複數個標示標誌(放射性同位素等)複合之可偵測所標示之抗體。另外，未與藥劑、標示標誌或多胜肽等複合之抗體，特別稱為單獨的抗體(naked antibodies)。
如此之複合抗體，抗體(Ab)係希望介在連接子(L)，將一個或複數個藥劑部份(D)(或胜肽、多胜肽、蛋白質或標示標誌部份)，例如每1個抗體複合1至20個藥劑部份。如此之複合抗體係藉由已知之有機化學反應以及試劑之手段而可製造。
複合抗體係可以上述方法以外製作，亦可例如作為藉 由基因重組技術之融合蛋白質，或使用多重特異性抗體，或藉由胜肽合成製作。
「多胜肽」一般係指含多於約10個胺基酸之胜肽或蛋白質。
多胜肽係可作為抗體之抗原。另外，對於各種多胜肽之抗體，已知於醫療等之許多領域係有效的。
多胜肽係包含哺乳動物多胜肽(尤其人多胜肽)、原核生物多胜肽等，尤其作為產業上有效者，可列舉增殖因子、激素、細胞激素及此等之受體、凝血因子及抗凝血因子等。
多胜肽並非局限於此者，包含血管緊張肽原酶；成長激素(人成長激素、牛成長激素等)；成長激素釋出因子；副甲狀腺素；甲狀腺刺激素；脂蛋白；α-1抗胰蛋白酶；胰島素(A鏈、B鏈)；前胰島素；卵泡刺激素；抑鈣素(Calcitonin)；黃體形成素；升糖素；第八凝血因子(VIII：C)；第九凝血因子(IX)；組織因子；溫韋伯氏因子；蛋白質C；心房性鈉利尿因子；血栓溶素(Urokinase)；t-pA；蛙皮素(bombesin)；凝血酶；HGF；TNF-α；TNF-β；TNFR(TNFR1、TNFR2等)；TGF-α；TGF-β；(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5等)；腦啡肽酶；RANTES；MIPI-1；血清白蛋白；穆勒氏管抑制物質(Mullerian inhibiting substance)；鬆弛素(A鏈、B鏈)；前鬆弛素；性腺刺激素；β-乙內醯胺分解酶(β-lactamase)；DNase；抑制 素(inhibin)；活化素(Activin)；VEGF；VEGFR；整合素(integrin)；蛋白質A；蛋白質D；類風濕因子(rheumatoid factor)；BDNF；神經滋養因子(neurotrophin)(NT-3、NT-4、NT-5、NT-6等)；NGF-β；PDGF；纖維母細胞增殖因子(aFGF、bFGF)等；EGF；EGFR；HER2；類胰島素增殖因子(IGF-I、IGFII等)；類胰島素增殖因子結合蛋白質；細胞死亡受器(DR3、DR4、DR5等)；Fas配體；Fas受體；CD-3；CD-4；CD-8；CD-10；CD-11；CD-19；CD-20；CD-25；CD-32；CD-30；CD-33；CD-37；CD-52；HLA-DR；GPIIb；IgE；C5；CCR-4；α4-整合素；RANKL；CTLA4；Blys；NGEP；MUC-1；CEA；EpCAM；紅血球生成素；BMP；抗毒素(immunotoxin)；干擾素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ等)；菌落刺激因子(M-CSF、GM-CSF、G-CSF等)；介白素(IL-1至IL-13等)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)；T細胞受體；崩壞促進因子；病毒抗原(HIV鞘膜等)；抗體；及上述之多胜肽片段。
「多核苷酸」或「核酸」係指任意長度之核苷酸聚合物，包含DNA及RNA。核苷酸係包含去氧核苷酸、核糖核苷酸、經修飾核苷酸(例如甲基化核苷酸)或鹽基、及/或此等之類似物。核苷酸係藉由DNA或RNA聚合酶或合成反應所連接。聚核苷酸或核酸亦可包含核苷酸連接後之修飾(例如與標誌或保護基之結合)。另外，所謂「寡核苷 酸」係指短，一般為單鏈之多核酸。並非受此限定者，可指一般未達約200之核苷酸長度之合成多核苷酸。
「載體」係指可輸送其他核酸之核酸分子。載體包含質體(連接附加DNA之環狀雙股DNA)、噬菌體載體(phage vector)(連接附加多核苷酸之噬菌體)、病毒載體(連接附加多核苷酸之病毒)等。某載體係可於導入其之寄主細胞內，進行自我複製(例如具有細菌之複製起始點之細菌載體與基因附體(episome)哺乳動物載體)。其他載體係導入於寄主細胞時，插入寄主細胞之基因中，與寄主基因一起複製(例如非基因附體哺乳動物載體)。進而，某載體係可命令此等結合可作用之基因的表現。稱如此載體為表現載體或基因重組表現載體。一般基因重組DNA技術中有效的表現載體多採用質體的型態。
具有一定序列相同性之多胜肽或核酸係對於成為基本的胺基酸或核苷酸序列，可含幾個胺基酸或核苷酸的突變(改變)。如此修飾係以可提升對象分子的特性(例如抗體的結合親和性及/或生物學的特性)者尤佳。多胜肽之胺基酸序列突變體係可藉由導入適當的核苷酸變化於多胜肽之核酸，或胜肽合成而調製。如此突變係包含胺基酸序列內殘基的缺失及/或插入及/或取代。只要於對象分子保持所需特徵之範圍內，可任意組合缺失、插入及取代。
對於某序列，作為導入突變之方法，包含自天然源的單離(天然產生的胺基酸/核苷酸序列突變體時)、部份特異的突變、誘導PCR突然變異、及導入盒式突變，但 不局限於此等。
為增加或減少糖化程度，多胜肽係可改變。多胜肽之糖化係典型的N結合或O結合中任一種。所謂N結合係指碳水化合物對天冬醯胺殘基支鏈的結合。天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸(X係除了脯胺酸以外之任意胺基酸)之三胜肽序列係糖鏈部分酵素結合於天冬醯胺支鏈用之辨識序列。因此，多胜肽中存在此等三胜肽序列之任一種時，將存在潛在的糖化部位。O結合糖化係指於羥胺基酸，最一般為絲胺酸或蘇胺酸，結合一個糖類N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖，亦結合於5-羥脯胺酸或5-羥賴胺酸。
對多胜肽之糖化部位的附加或缺失係可藉由製作或去除一個或複數個上述三胜肽序列(N結合糖化部位者)，使胺基酸序列變化而達成。此變化係藉由對成為基本的多胜肽序列，附加、缺失或取代一個或複數個絲胺酸或蘇胺酸殘基所進行(O-結合糖基化部位時)。
另外，結合於多胜肽之寡糖(糖鏈)係自天然體所改變者，亦可含具有某胺基酸序列之多胜肽者。
另外，胺基酸殘基適合的取代係保存性取代，其一例如表2所示。將如此胺基酸取代，導入多胜肽，對於所需活性/效果(例如抗原結合性、免疫原性、ADCC或CDC等)，可篩選取代體。
非保存性取代係將此等分類之一員，交換成其他分類，於保持所需特徵之範圍，亦可進行非保存性取代。
對於抗體之突變體，亦可改變親抗體之互補性決定區(CDR)及/或構架區(FR)之胺基酸殘基。作為自親抗體製作突變體之方法，並非局限於此者，可列舉親和性成熟法(例如使用噬菌體表現法者)。另外，亦可藉由分析抗原抗體複合體之結晶結構，決定候補突變點，製作突變體。
所謂「天然型雙硫鍵」係指通常存在於野生型多胜肽(抗體等)之半胱胺酸-半胱胺酸間之共價鍵。
所謂「非天然型雙硫鍵」係指於上述「天然型雙硫鍵」以 外的位置所形成之半胱胺酸-半胱胺酸間之共價鍵。
因此，形成雙硫鍵之半胱胺酸殘基的一方為天然型雙硫鍵殘基(通常存在於野生型多胜肽之半胱胺酸殘基)，另一方為非天然型雙硫鍵(存在於與天然型雙硫鍵殘基不同位置之半胱胺酸殘基)時，作為雙硫鍵全體，可稱為非天然型雙硫鍵。非天然型雙硫鍵係以形成雙硫鍵之二個半胱胺酸殘基雙方為非天然型半胱胺酸殘基為宜。
另外，本說明書中，所謂「雙硫鍵」之記載係特別記載或只要不違反本發明之目的，可作為包含「天然型雙硫鍵」及「非天然型雙硫鍵」雙方之總稱使用。
非天然型雙硫鍵殘基係只要不違反本發明之目的，可以任何方法導入目的的輕鏈或重鏈，可使用該領域已知的全部方法。具體上，藉由將存在於目的位置之胺基酸殘基，取代為半胱胺酸殘基，或插入半胱胺酸殘基於目的位置，可導入半胱胺酸殘基。如此之取代或插入係可使用已知之基因改變技術等之胺基酸殘基之改變方法而進行。
關於天然型雙硫鍵，可進一步由其交聯樣式分為於相同多胜肽鏈內所形成之「鏈內鍵」及於異種多胜肽鏈間所形成之「鏈間鍵」。例如人IgG1抗體時，前者係各區段內各1條，分子全體合計存在12條。另一方面，後者係於重鏈-重鏈間2條，輕鏈-重鏈間各存在1條。因此，人IgG1抗體時，天然型雙硫鍵係每1個分子，合計存在16條。此天然型雙硫鍵之條數及其位置係依抗體的型及亞型而異，分別為原有的。例如人IgG1抗體之輕鏈-重鏈間之鏈 間鍵時，CL區之胺基酸位置214之半胱胺酸殘基及CH1區之胺基酸位置220之半胱胺酸殘基間，形成雙硫鍵，IgG2、IgG3、IgG4、IgM抗體之輕鏈-重鏈間之鏈間鍵時，CL區之胺基酸位置214之半胱胺酸殘基及CH1區之胺基酸位置131之半胱胺酸殘基間，形成雙硫鍵。
所謂「於相異的位置形成雙硫鍵」(雙硫鍵之位置相異)係指比較存在於二個多胜肽或其部份之雙硫鍵時，一方以與另一方不同的模式形成雙硫鍵(一方雖存在，但另一方存在不存在之雙硫鍵)。此時，二個多胜肽或其部份之間，可有一致(重複)的雙硫鍵(尤其鏈內鍵一致為宜)。就減低二個多胜肽或其部份交叉的觀點，一致的雙硫鍵數量(鏈內鍵除外)係2、1或0為宜，以0最好。
另外，關於二個雙硫鍵之異同，構成各個雙硫鍵之二個半胱胺酸殘基的雙方皆為相同或對應的位置時，為「相同」，至少一方為實質上相異的位置時，為「相異」。為減少交叉，雙方位置皆相異尤佳，但並非受此限定者。
另外，作為「不形成雙硫鍵之胺基酸殘基」，典型上可列舉半胱胺酸以外之胺基酸殘基、及將半胱胺酸殘基之SH基，化學修飾成不能雙硫鍵結之狀態者。將可形成雙硫鍵之半胱胺酸殘基，取代成此等胺基酸殘基，可防止雙硫鍵形成。取代半胱胺酸殘基成不能形成雙硫鍵之胺基酸殘基時，大多所使用的是取代成丙胺酸或絲胺酸。
或者可維持目的之多胜肽機能時，藉由使半胱胺酸殘基缺失，亦可使不形成雙硫鍵，此時可說是改變半胱胺酸 殘基成「不形成雙硫鍵之胺基酸殘基」。
所謂「精製」係指除去雜質以使對象分子以所含檢品中之重量，於檢品中存在濃度至少為95%，至少為98%，或至少為99%。
所謂「被單離」係指對象分子從自然環境通常所附加之至少一種其他類似分子(多胜肽、核酸等)被分離及/或被回收之狀態。通常，被單離的分子係經過至少一個精製步驟所調製。關於多胜肽，並非局限於此者，例如被精製(1)以勞里法(Lowry method)測定時之純度至不超過95%或99重量%、(2)藉由使用胺基酸序列決定裝置，足以得到至少15個N端或內部胺基酸序列的殘基、或(3)藉由使用卡馬西藍(Coomasie Blue)或銀染色之非還原或還原條件下之SDS-PAGE至成為均勻時，可稱為充份地被單離者。
所謂「組成物」係指使用於本發明內容時，i)含至少二個抗體之組成物，或ii)含抗體及其他成分之組成物中任一種，除非特別清楚記載，亦包含任一種型態。作為i)之意義所使用之組成物，可舉例如使至少二個抗體於同一個細胞中共同表現之細胞、或自該細胞所調製之組成物等。作為其他成份，於不違反使用組成物之目的之範圍內，可使用任意成分，但以使用藥學上所容許的載體尤佳。
所謂「藥學上所容許的載體」，並非受此限定者，可舉例如滅菌水或生理食鹽水、安定劑、賦形劑、抗氧化劑 (抗壞血酸等)、緩衝劑(磷酸、檸檬酸、其他有機酸及其鹽等)、防腐劑、界面活性劑(聚山梨糖醇酯、聚乙二醇等)、螯合劑(EDTA等)、結合劑、pH調節劑、細胞(哺乳類之紅血球等)等。另外，亦可含蛋白質(低分子量之多胜肽、血清白蛋白、果膠、免疫球蛋白等)、胺基酸(甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸、組織胺酸、賴胺酸等)及其鹽、單糖(葡萄糖、甘露糖、半乳糖等)或多醣(麥芽糖、海藻糖、麥芽三糖、糊精、右旋糖酐(dextran)、蔗糖等)等之糖類、糖醇(甘露糖醇或山梨糖醇等)、碳水化合物、合成高分子(聚稀烴、聚苯乙烯、苯乙烯．二乙烯基苯共聚物、聚丙烯酸甲酯、聚醯胺等)或天然高分子(纖維素、瓊脂糖(agarose)、幾丁質、幾丁聚醣(chitosan)等)及此等之交聯體。
為注射用之水溶液時，亦可與例如生理食鹽水、含葡萄糖或其他輔助藥(D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化鈉等)之等張液、適當的助溶劑(例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非離子性界面活性劑(聚山梨糖醇酯20、聚山梨糖醇酯80、聚山梨糖醇酯120、聚氧乙烯硬化萞麻油等))等併用。另外，因應需要，亦可將本發明之雙重特異性抗體封入微膠囊(羥甲基纖維素、果膠、聚甲基丙烯酸甲酯等之微膠囊)，或成為膠體藥物傳輸系統(微脂粒(Liposome)、白蛋白微球(albumin microsphere)、微乳膠(Microemulsion)、奈米粒子及奈米膠囊等)。
「至少一個」係指一個或其以上，包含二個、三個、四個或五個、或組合上、形式上可取得之上限值之約5%(或其以上)、約10%(或其以上)、約20%(或其以上)、約50%(或其以上)、約80%(或其以上)。上限係於不損及本發明之目的、或作為抗體等之該發明對象之功效之範圍，該業者可適當決定。如此之上限係包含二個、三個、四個或五個、或組合上、形式上可取得之上限值之約5%(或其以上)、約10%(或其以上)、約20%(或其以上)、約50%(或其以上)、約80%(或其以上)或100%。「至少二個」並非以「至少一個」的下限為一個，而為二個者，其他相同。
用以實施發明之最佳型態
以下係使用用以實施本發明之型態，詳細地說明本發明，本發明並非受此限定者。
此等型態係可單獨，亦可組合複數個。另外，對於各型態的定義或詳細內容，亦參照前述之〔用語及型態之說明〕。
本發明係關於藉由改變雙硫鍵之形成位置，規定輕鏈-重鏈間結合之方法者，輕鏈-重鏈組合存在複數種類時，可有效率地製造含輕鏈及重鏈之抗體(參照圖1)。
本發明之某型態為含有至少二個相異的Fab區之抗體；或含有至少二個含Fab區之抗體，該Fab區於至少二個抗體間為相異之組成物；之製造方法，包含 i)於前述抗體表現之條件下，培養含有編碼前述抗體之核酸之寄主細胞之步驟、及ii)自寄主細胞培養物回收前述抗體之步驟，前述核酸係至少編碼一個含有前述Fab區之輕鏈及重鏈之間形成非天然型雙硫鍵之半胱胺酸殘基之區域，藉由前述非天然型雙硫鍵的存在，Fab區中輕鏈及重鏈間之雙硫鍵的位置與其他至少一個Fab區中輕鏈及重鏈間之雙硫鍵的位置相異之方法。
於某種型態，於上述方法中，上述非天然型雙硫鍵及上述雙硫鍵係CL區及CH1區之間之雙硫鍵。
另外，本發明之某種型態為含有含第一輕鏈及重鏈之第一Fab區及含分別與前述第一輕鏈及重鏈相異之第二輕鏈及重鏈之第二Fab區之抗體之製造方法，包含a)將至少一個前述抗體之親抗體之第一Fab區之CL區及CH1區中半胱胺酸以外之胺基酸殘基，取代成形成雙硫鍵之半胱胺酸殘基之步驟，及b)藉由前述形成雙硫鍵之半胱胺酸殘基，使於第一Fab區中形成非天然型雙硫鍵之步驟，藉由前述非天然型雙硫鍵的存在，第一Fab區與第二Fab區於不同的位置，形成雙硫鍵之方法。
另外，本發明之其他型態為含有至少二個相異的Fab區之抗體，至少一個Fab區含有於CL區及CH1區之間形成非天然型雙硫鍵之半胱胺酸殘基，藉此形成非天然型雙硫鍵， 藉由前述非天然型雙硫鍵的存在，Fab區中CL區及CH1區間的雙硫鍵的位置與其他至少一個Fab區中CL區及CH1區間的雙硫鍵的位置相異之抗體。
某種型態係上述抗體含有至少二個相異的Fab區。
另外，本發明之其他型態為含有至少二個含Fab區之抗體，該Fab區於至少二個抗體間為相異之組成物，至少一個Fab區係含有於輕鏈及重鏈之間形成非天然型雙硫鍵之半胱胺酸殘基，藉此形成非天然型雙硫鍵，藉由前述非天然型雙硫鍵的存在，Fab區中輕鏈及重鏈間之雙硫鍵的位置與其他至少一個Fab區中輕鏈及重鏈間之雙硫鍵的位置相異之組成物。
某種型態係於上述組成物中，上述非天然型雙硫鍵及上述雙硫鍵係CL區及CH1區之間之雙硫鍵。
上述抗體或組成物，典型上亦可藉由前述抗體或組成物之製造方法製造。
依據本發明，藉由規定各Fab區中輕鏈-重鏈組合，減少前述組合之隨機性引起之非期待組合之抗體產生量，因此，可有效率地製造含有至少二個相異的Fab區之抗體(含第一Fab區及第二Fab區之抗體)；或含有至少二個含相異的Fab區之抗體之組成物。
本發明中，藉由使輕鏈-重鏈(尤其CL區-CH1區)間，形成非天然型雙硫鍵，輕鏈-重鏈(尤其CL區-CH1區)間之雙硫鍵的位置，於二個Fab區間(尤其第一輕鏈及重鏈與第二輕鏈及重鏈之間)，不完全一致。據此，以 CL區-CH1區間之結合於各Fab區成為特異者為宜。為使雙硫鍵於二個Fab區間不完全一致，將一方之CL區-CH1區間之雙硫鍵的一部份非天然型化(一方為天然型雙硫鍵，另一方為非天然型雙硫鍵)或於與一方的非天然型雙硫鍵相異的位置，使另一方形成非天然型雙硫鍵(雙方皆為非天然型雙硫鍵)。
另外，至少二個相異的Fab區間，CH1區-CL區間之雙硫鍵不交叉，或於如此組合之交叉減少的位置形成雙硫鍵尤佳。
另外，第一輕鏈及第二重鏈、第二輕鏈及第一重鏈之間不形成雙硫鍵，或於如此組合之交叉減少的位置形成雙硫鍵尤佳。
本發明之某種型態，於某Fab區中CL區及CH1區間的雙硫鍵的位置與其他至少一個Fab區中CL區及CH1區間的雙硫鍵的位置完全相異之上述任一種方法、抗體或組成物。
取代成半胱胺酸殘基而可形成非天然型雙硫鍵之胺基酸殘基的位置，或交叉少的非天然型雙硫鍵形成位置係基於嘗試形成的目的抗體之立體結構的資料所決定。大部份的情況，記載所需的各個原子座標的立體結構資料係可自Protein Data Bank(PDB)等公開的資料庫免費取得。取得之座標資料係藉由使用一般稱為計算化學軟體之專用軟體，計算立體結構，可以模擬可視化投影於PC顯示器。另外，任意原子間的距離或結合角度，進而結合能量計算 等，大部份的情況亦以計算化學軟體。所謂抗體分子內存在的天然型雙硫鍵係存在於半胱胺酸殘基之支鏈末端之硫原子彼此共價鍵結者，負責鏈間鍵時，預測支鍵朝向係彼此相對之趨勢。將此反映於結構計算，設定兩半胱胺酸殘基之β碳間的距離小於其α碳間的距離之條件係適當的。
例如人IgG1抗體之輕鏈-重鏈間之鏈間鍵時，CL區之胺基酸位置214之半胱胺酸殘基及CH1區之胺基酸位置220之半胱胺酸殘基間所形成的雙硫鍵，計算上述α碳間距離(Cα-Cα')係4.441Å，上述β碳間距離(Cβ-Cβ')係3.832Å(PDB登錄：1L71)。
參照關於此等結果或雙硫鍵之已知資料，例如設定Cα-Cα'為7.0Å以下，Cβ-Cβ'為5.5Å以下，且β碳間距離<α碳間距離，自存在於鄰接滿足此條件之胺基酸殘基對之胜肽鏈之胺基酸殘基群，藉由計算選出時，亦即此等將成為對半胱胺酸殘基之有力的取代候補對。以Cα-Cα'及Cβ-Cβ'，計算所使用的值並非局限於上述值者，作為例示，可使用分別為7.5Å以下，8Å以下，8.5Å以下，9Å以下，9.5Å以下或10Å以下，以及6Å以下，6.5Å以下，7Å以下，7.5Å以下，8Å以下或8.5Å以下之值的組合。
另外，本發明之實施中所使用之胺基酸殘基之改變方法並非特別限定者，可使用可達成目的的全部方法。本發明中胺基酸殘基之改變係典型上藉由改變編碼目的位置胺基酸之核酸，藉由取代．缺失．附加半胱胺酸殘基所進行，但並非受此限定者，亦可藉由化學的修飾等而改變胱胺酸 殘基等。另外，「取代胺基酸殘基」係包含取代編碼胺基酸殘基之核酸，藉此結果上之取代胺基酸殘基亦為當然的事。半胱胺酸殘基取代不能形成雙硫鍵之胺基酸殘基時，大多所使用的是取代成丙胺酸殘基或絲胺酸殘基。
另外，因為本發明並非受特定的CDR序列等限定者，所以成為本發明對象之抗體，亦可具有對應對任何抗原之抗體之Fab區。
作為容易形成非天然型雙硫鍵之位置，並非受此限定者，但可列舉(1)輕鏈116位置-重鏈126位置、輕鏈116位置-重鏈127位置、輕鏈116位置-重鏈128位置、輕鏈116位置-重鏈134位置、輕鏈116位置-重鏈141位置、輕鏈118位置-重鏈126位置、輕鏈118位置-重鏈127位置、輕鏈118位置-重鏈128位置、輕鏈118位置-重鏈134位置、輕鏈118位置-重鏈141位置、輕鏈121位置-重鏈126位置、輕鏈121位置-重鏈127位置、輕鏈121位置-重鏈128位置、輕鏈121位置-重鏈134位置、輕鏈121位置-重鏈141位置、輕鏈124位置-重鏈126位置、輕鏈124位置-重鏈127位置、輕鏈124位置-重鏈128位置、輕鏈124位置-重鏈134位置或輕鏈124位置-重鏈141位置、及(2)輕鏈162位置-重鏈170位置、輕鏈162位置-重鏈171位置或輕鏈162位置-重鏈173位置間。
作為更具體的容易形成非天然型雙硫鍵之位置之組合，並非受此限定者，可舉例a)輕鏈116位置-重鏈134 位置、b)輕鏈116位置-重鏈141位置、c)輕鏈118位置-重鏈128位置、d)輕鏈121位置-重鏈126位置、e)輕鏈121位置-重鏈127位置、f)輕鏈124位置-重鏈126位置、g)輕鏈162位置-重鏈170位置、h)輕鏈162位置-重鏈171位置及i)輕鏈162位置-重鏈173位置間。此等位置所導入之半胱胺酸殘基係存在於比較接近的位置及支鏈方向，可形成雙硫鍵。可舉例如更適合之輕鏈為λ鏈時之c)輕鏈118位置-重鏈128位置、f)輕鏈124位置-重鏈126位置、g)輕鏈162位置-重鏈170位置、h)輕鏈162位置-重鏈171位置及i)輕鏈162位置-重鏈173位置間。
非天然型雙硫鍵係以藉由於選自a)輕鏈116位置-重鏈134位置、b)輕鏈116位置-重鏈141位置、c)輕鏈118位置-重鏈128位置、f)輕鏈124位置-重鏈126位置、g)輕鏈162位置-重鏈170位置、h)輕鏈162位置-重鏈171位置及i)輕鏈162位置-重鏈173位置中至少一組之輕鏈-重鏈的位置所導入的半胱胺酸殘基所形成為宜。此等位置係更確實地顯示於輕鏈所導入之半胱胺酸殘基未與重鏈220位置之半胱胺酸殘基交叉。輕鏈為λ鏈時，非天然型雙硫鍵係進而以藉由於f)輕鏈124位置-重鏈126位置以外的位置所導入的半胱胺酸殘基所形成為宜，進而以藉由於c)輕鏈118位置-重鏈128位置、g)輕鏈162位置-重鏈170位置、h)輕鏈162位置-重鏈171位置或i)輕鏈162位置-重鏈173位置所導入的半胱胺酸 殘基所形成尤佳。
非天然型雙硫鍵係以藉由於選自b)輕鏈116位置-重鏈141位置、c)輕鏈118位置-重鏈128位置、d)輕鏈121位置-重鏈126位置、e)輕鏈121位置-重鏈127位置、f)輕鏈124位置-重鏈126位置、g)輕鏈162位置-重鏈170位置、h)輕鏈162位置-重鏈171位置及i)輕鏈162位置-重鏈173位置中至少一組之輕鏈-重鏈的位置所導入的半胱胺酸殘基所形成尤佳。此等位置係更確實地顯示於重鏈所導入之半胱胺酸殘基未與輕鏈214位置之半胱胺酸殘基交叉。輕鏈為λ鏈時，非天然型雙硫鍵係進而藉由於c)輕鏈118位置-重鏈128位置、f)輕鏈124位置-重鏈126位置、g)輕鏈162位置-重鏈170位置、h)輕鏈162位置-重鏈171位置或i)輕鏈162位置-重鏈173位置所導入的半胱胺酸殘基所形成尤佳。
非天然型雙硫鍵係進而以藉由於選自b)輕鏈116位置-重鏈141位置、c)輕鏈118位置-重鏈128位置、f)輕鏈124位置-重鏈126位置、g)輕鏈162位置-重鏈170位置、h)輕鏈162位置-重鏈171位置及i)輕鏈162位置-重鏈173位置中至少一組之輕鏈-重鏈的位置所導入的半胱胺酸殘基所形成尤佳。於此等位置所導入之半胱胺酸殘基係更確實地顯示未與天然型雙硫鍵交叉。輕鏈為λ鏈時，非天然型雙硫鍵係進而以藉由於f)輕鏈124位置-重鏈126位置以外的位置所導入之半胱胺酸殘基所形成尤佳。
非天然型雙硫鍵係進而以於選自b)輕鏈116位置-重鏈141位置、f)輕鏈124位置-重鏈126位置、g)輕鏈162位置-重鏈170位置、h)輕鏈162位置-重鏈171位置及i)輕鏈162位置-重鏈173位置中至少一組之輕鏈-重鏈的位置所導入的半胱胺酸殘基所形成尤佳。於此等位置導入半胱胺酸殘基以實施本發明時，可達成極佳之收量、交叉性。非天然型雙硫鍵進一步更適合的是輕鏈為κ鏈時，藉由於b)輕鏈116位置-重鏈141位置、f)輕鏈124位置-重鏈126位置或g)輕鏈162位置-重鏈170位置所導入之半胱胺酸殘基所形成，輕鏈為λ鏈時，藉由於h)輕鏈162位置-重鏈171位置及i)輕鏈162位置-重鏈173位置所導入之半胱胺酸殘基所形成之非天然型雙硫鍵。另外，就精製的簡便性之觀點，非天然型雙硫鍵係以於f)輕鏈124位置-重鏈126位置間或i)輕鏈162位置-重鏈173位置間所形成更佳，以於f)輕鏈124位置-重鏈126位置間所形成最好。
本段落之型態中，輕鏈為λ鏈時，非天然型雙硫鍵係以藉由於f)輕鏈124位置-重鏈126位置以外的位置所導入之半胱胺酸殘基所形成尤佳。
對於於上述位置導入的半胱胺酸殘基，並非受此限定者，可舉例半胱胺酸取代或插入於以下位置，或藉由半胱胺酸取代或插入以下之胺基酸。
輕鏈(κ鏈)：116位置(F116C)、118位置(F118C)、121位置(S121C)、124位置(Q124C)、 162位置(S162C)
輕鏈(λ鏈)：118位置(F118C)、124位置(E124C)、162位置(T162C)
重鏈：126位置(F126C)、127位置(P127C)、128位置(L128C)、134位置(S134C)、141位置(A141C)、170位置(F170C)、171位置(P171C)、173位置(V173C)
另外，本發明之進一步型態係至少一個Fab區之CL區及CH1區之間，不形成天然型雙硫鍵，或至少一個Fab區不含有於輕鏈及重鏈之間可形成天然型雙硫鍵之半胱胺酸殘基之上述任一種方法、抗體或組成物。此型態係於至少一個Fab區中，不形成天然型雙硫鍵，取而代之的是僅介在非天然型雙硫鍵，形成輕鏈及重鏈間的結合。此時，其他Fab區可形成天然型雙硫鍵，亦可形成別的非天然型雙硫鍵。
作為天然型雙硫鍵之一例，並非受此限定者，可列舉輕鏈之胺基酸位置214之半胱胺酸殘基及重鏈之胺基酸位置220之半胱胺酸殘基間，形成雙硫鍵。
上述任一種方法、抗體或組成物係進一步適用於用以規定重鏈-重鏈間組合之技術，包含為此之步驟之方法，或藉此所製造之抗體或組成物亦可。作為如此技術，並非受此限定者，可列舉Knobs-into-holes技術(例如美國專利第7,183,076號公報；國際公開第98/50431號公報(日本專利第4324231號))、藉由靜電吸引力之異種間結合 (例如國際公開第2009/089004號公報、國際公開第2007/147901號公報)、藉由附荷電白胺酸拉鏈結構(leucine zipper)之異種間結合(例如國際公開第2011/034605號公報)、藉由輕鏈重鏈交換表現之有效率的生產法(例如國際公開第2009/0802513號公報)、藉由蛋白質A親和層析法精製(國際公開第2010/151792號公報)。此等之任一項技術亦可與本發明組合使用，此時亦包含於本發明之技術範圍。使此等技術與本發明組合時，將可極有效率地製造規定輕鏈-重鏈及重鏈-重鏈間之抗體或組成物(例如多重特異性抗體等)。
另外，本發明之進一步型態係抗體為多重特異性抗體(尤其雙重特異性抗體)之上述任一種型態之方法、抗體或組成物。
作為多重特異性抗體之製造方法，已知有雜交-雜交瘤技術(Milstein and Cuello,Nature 305；537-539(1983))。因為此方法亦包含免疫球蛋白之輕鏈及重鏈隨機組合，所以雙重特異性抗體時，此等融合瘤(四源雜交瘤(quadroma))具有產生10種相異的抗體分子的混合物之可能性。此等中僅1種具有正確的雙重特異性結構，所以藉由此方法所需的多重特異性抗體之收率低(參照圖1)。另外，所需之多重特異性抗體之精製，雖使用親和層析等所使用之但一般不容易提高所需的多重特異性抗體之純度。
另外，於多重特異性抗體之製造中，以克服起因於輕 鏈及重鏈之隨機組合的困難性為目的之技術，雖已知幾種，但其大多係規定重鏈-重鏈間之結合者。
對此，本發明係關於藉由使雙硫鍵變化，規定輕鏈-重鏈間結合之方法者，以與傳統改良技術相異的機構，可有效率地製造多重特異性抗體。進而，亦可與規定重鏈-重鏈間結合之方法等之傳統技術組合使用，此時，將可進一步有效率地製造多重特異性抗體。
另外，本發明之進一步型態，抗體係將至少二個抗體片段藉由連接子或直接連接者之方法、抗體或組成物。
另外，本發明之進一步型態，抗體為抗體片段之上述任一種型態之方法、抗體或組成物。製造單一抗體片段時，適用本發明時，以含有2對以上輕鏈部份及重鏈部份之組合之抗體片段為宜，如此的抗體片段並非受此限定者，包含F(ab')2。另外，製造含抗體片段之組成物時，適用本發明時，以含有1對以上輕鏈部份及重鏈部份之組合之抗體的組成物為宜，如此組合物並非受此限定者，包含含Fv、Fab、F(ab')2之組成物。
抗體藉由抗體片段，其生產性佳，且對表現標的分子之組織或病灶部位之移行、滲透佳。
另外，本發明之進一步型態係抗體之Fc區為其他分子所取代之上述之任一種型態之方法、抗體或抗體組成物。本發明之對象為抗體時，抗體可具有Fc區，但該Fc區於不違反本發明目的之範圍下，可採取任何結構。亦即，本發明之抗體中，不僅為Fc區突變之抗體，亦包含 Fc區為通常Fc區以外之分子所取代之廣義的抗體分子。因應抗體的使用用途、目的，亦知悉可使用許多分子作為取代分子，可舉例如聚核苷酸、核苷酸、多胜肽、胜肽、聚乙二醇類、胺基酸(例如甘胺酸、組織胺酸等)、糖鏈、低分子化合物、脂質、磷脂質(例如卵磷酯等)、維生素(例如生物素)、酵素等。
另外，本發明之進一步型態係抗體為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM抗體之上述任一種型態之方法、抗體或抗體組成物。
另外，本發明之進一步型態係抗體之輕鏈為κ鏈之上述任一種型態之方法、抗體或抗體組成物。
本發明之進一步型態係抗體為嵌合抗體、人化抗體或人抗體之上述任一種型態之方法、抗體或組成物。嵌合抗體、人化抗體或人抗體於不損及發明功效之範圍下，可為前述嵌合抗體、人化抗體或人抗體中任一種。以抗體為人抗體為宜。藉由人抗體達到所謂的減低抗原性、改善體內動態的功效。另外，藉由以人抗體為對象，亦可活用最大極限之本說明書所記載之發現。
本發明之進一步型態係寄主細胞為真核生物細胞或大腸桿菌之上述任一種型態之方法。因為本發明並非依賴寄主細胞之方法，所以可使用適合製造抗體的任何寄主細胞，作為製造抗體常用的寄主細胞係適合使用真核生物細胞或大腸桿菌。作為真核生物細胞，並非受此限定者，可舉例如酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或其他之來自 多細胞生物之有核細胞。
抗體的一般製造方法概要如下所述。上述任一種型態之方法係可再含一個或複數個以下詳述之步驟或實施型態等。
(1)免疫
對哺乳動物投與所得之抗原，進行免疫。抗原亦可與佐藥混合使用。作為哺乳動物，適合使用小鼠，更適合使用BALB/c小鼠。免疫係對相同的哺乳動物，可進行單數次，亦可進行複數次。
(2)篩選
自脾細胞依據常法製作融合瘤，以抗體價等所需活性為指標，進行篩選。亦可於得到脾細胞之前，以免疫之哺乳動物單位，以血清抗體價等之血清中活性為指標，進行篩選。篩選係使用ELISA進行為宜。
(3)大量調製
將篩選選出之融合瘤，投與於小鼠腹腔，使產生腹水，採取該含抗體之腹水，進行精製而得抗體。小鼠係以使用SCID小鼠為宜。精製係以使用層析法為宜，以親和層析法，例如蛋白質G親和層析法等尤佳。
(4)基因重組生產
關於篩選所得之抗體係藉由自產生該抗體之融合瘤，取得cDNA等，可於其他細胞製造基因重組體，如此型態亦包含於上述製造方法。
使用所得之cDNA，於其他細胞製造基因重組體之方 法的詳細內容如後述。
本發明之某種型態係編碼上述任一種型態之抗體之核酸。核酸係以DNA為宜。
上述任一種型態之之核酸係依據常法而可單離、決定序列。並非受此限定者，例如可使用設計以特異地增幅輕鏈及/或重鏈等之寡核苷酸引子而決定序列。另外，為使經單離之核酸選殖(clone)及表現，可導入基因於原核或真核細胞。如此步驟係可參照例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual(CSHL Press)、Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons,Inc.)、Antibody Engineering(Springer)；Antibodies：A Laboratory Manual(CSHL Press)。
另外，本發明之某種型態係含有上述任一種型態之核酸之載體。典型上，此載體係依據常法將經單離之上述任一種型態之核酸，插入載體而可得。載體係以可複製之載體為宜，以具有啟動子之載體(表現載體)尤佳。載體並非受此限定者，一般含訊號序列、複製起點、一個或複數個選擇基因、啟動子、增強子元件(enhancer element)、及轉錄結束序列中之一個或複數個成分。關於各成分，敍述如下。
(1)訊號序列
並非只是直接藉由基因組換方法生產目的多胜肽，而是可以與訊號序列等之融合胜肽產生。訊號序列係依寄主細胞所辨識而加工(亦即，藉由信號肽酶 (signalpeptidase)切斷)者。原核生物寄主細胞係可使用例如鹼性磷酸酶(Alkaline Phosphatase)、青黴素酶、Ipp或熱安定之腸毒素II判讀序列等之原核生物訊號序列作為訊號序列。作為酵母之訊號序列，可使用例如酵母轉化酶判讀序列、α因子判讀序列、酸性磷酸酶判讀序列或糖化酵素(glucoamylase)判讀序列、或國際公開第90/13646號所記載之訊號等。哺乳動物細胞係可使用例如單純疱疹gD訊號等之病毒分泌判讀序列或哺乳動物之訊號序列。
(2)複製起點
許多載體(例如表現載體及選殖載體)係於一個或複數個被選出的寄主細胞中含可複製載體之核酸序列。一般，選殖載體中，此序列係與寄主染色體DNA分開，可複製載體者，含複製開始點或自律的複製序列。如此之序列對於大多的細菌、酵母及病毒係熟知的。來自質體pBR322之複製開始點係適合於大部份的葛蘭氏陰性細菌，2μ質體開始點係適合於酵母，各種病毒開始點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV、BPV等)係適用於哺乳動物細胞中選殖載體。一般哺乳動物之表現載體係無須複製起點(實際上SV40開始點係典型上(作為啟動子)多被使用。)
(3)選擇基因
許多載體(例如表現載體及選殖載體)典型上含有亦被稱為選擇標誌之選擇基因。作為典型的選擇基因可列舉 (a)對如胺基青黴素、新黴素、甲胺蝶呤(methotrexate)或四環黴素之抗生素或其他毒素之耐性賦與基因、(b)彌補營養要求性缺陷之基因、或(c)供給不能自(特定的)培養基得到的重要營養素之基因(例如對Bacillus之D-丙胺酸消旋酵素(alanine racemase)。
(4)啟動子
許多載體(例如表現載體及選殖載體)一般係藉由寄主生物體所辨識，於編碼目的多胜肽之核酸上游含啟動子。作為適合原核生物寄主使用之啟動子，可列舉phoA啟動子、β-乙內醯胺分解酶及乳糖啟動子系、鹼性磷酸酶、色胺酸(trp)啟動子系、及融合瘤啟動子(例如tac啟動子)。但是，其他細菌啟動子亦適合。例如細菌系所使用之載體係於編碼多胜肽之核酸上游含夏因-達爾加諾序列(S.D.)序列。另外，對於真核生物，亦已知啟動子序列。實質上所有的真核生物基因係具有自轉錄開始部位約25至30個鹽基上游所發現之AT-Rich區。多數的基因之自轉錄開始位置約70至80個鹽基上游所發現之其他序列係N為任意核苷酸之CNCAAT區。
於大部份的真核生物基因之3'端係有附加polyA於mRNA之3'端之訊號之AATAAA序列。此等序列可適當地插入真核生物之表現載體。
(5)增強子元件
DNA之轉錄係常常可藉由插入增強子序列於載體中 而增強。現在已知來自哺乳動物基因之許多增強子序列(珠蛋白(globin)、彈性蛋白酶(elastase)、白蛋白、α-胎兒蛋白(α-fetoprotein)及胰島素)。然而，典型上，多使用來自真核細胞病毒之增強子序列。可舉例如複製起點之後期側之SV40增強子(100-270鹽基對)、巨細胞病毒(Cytomegalovirus)初期啟動子增強子、複製起點之後期側之多瘤病毒增強子及腺病毒增強子(亦參照Yaniv,Nature,297：17-18(1982))。增強子係可於聚多胜肽編碼序列之5'或3'位置插入載體中，但以位置於5'位為宜。
(6)轉錄終止序列
真核生物寄主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或其他來自多細胞生物之有核細胞)所使用之許多載體(例如表現載體)係可含轉錄終止及mRNA之安定化所需序列。如此序列一般係可自真核生物或病毒之DNA或cDNA之5'，有時3'之非轉譯區取得。此等區域係包含於編碼多胜肽之mRNA之非轉譯部份，作為多腺核苷酸化片段所轉錄之核苷酸片段。一個有效的轉錄終止成份係牛成長激素多腺核苷酸化區域(例如參照國際公開第94/11026號)。
通常藉由於不產生抗體的寄主細胞(例如大腸桿菌細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、或骨髓瘤細胞)，形質導入(transduction)上述中任一種型態的核酸，於適當的營養培養基中進行培養，亦可使生產藉由 該核酸所編碼之抗體(例如參照Skerraet al.,Curr.Opinion in Immunol.,5：256-262(1993)；Pluckthun,Immunol.Revs.130：151-188(1992))。之後，例如藉由自寄主細胞糊，分離可溶性分離部份與抗體，進行精製(例如因應同型，使用蛋白質A或G管柱)，可製造抗體。
寄主細胞係可於各種培養基培養。市售培養基，例如HamF10(Sigma)、MEM(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)及DMEM(Sigma)適用於培養寄主細胞。此等培養基係因應需要，可以補充激素及/或其他增殖因子(例如胰島素、運鐵蛋白(Transferrin)、上皮增殖因子)、鹽類(例如氯化鈉、鈣、鎂、磷酸鹽)、緩衝溶液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷、胸苷)、抗生素(例如GENTAMYCIN)、微量元素(最終濃度係於微莫耳範圍，通常存在的無機化合物等)及葡萄糖或等價的能源。亦又可含有相關業者已知之適當濃度之其他必要的補充物質。關於各個寄主細胞之適合的培養條件，例如溫度、pH等，對於各個寄主細胞，相關業者係明白的，並且於單純的條件檢討範圍內。
使用基因重組技術時，抗體係細胞內、細胞膜周質空間(periplasmic space)所產生、或培養基中所直接分泌。
抗體為細胞內所產生時，作為第1步驟係藉由例如離心分離或超濾去除不需要物質(細胞細片等)。Carter et al.,Bio/Technology(NY)10：163-167(1992)係記載大腸桿菌之細胞膜周質空間(periplasmic space)所分泌之抗體之單離方法。簡單敍述時，將細胞糊，於醋酸鈉(pH3.5)、EDTA、及苯甲基磺醯氟(PMSF)的存在下，進行冷解凍約30分鐘。細胞細片係可以離心分離去除。
抗體為培養基所分泌時，將由此表現系的上清液，一般使用蛋白質濃縮過濾器(例如Amicon或Pellicon之超濾過濾器)進行濃縮。於上述之任意步驟包含PMSF等之蛋白酶抑制劑，亦可抑制抗體分解，並且亦可使用抗生素防止外來性污染生物的增殖。
自細胞調製之抗體組成物係可使用例如羥磷灰石層析(hydroxyapatite chromatography)、疏水性相互作用層析、凝膠電泳、透析及親和層析精製。典型上係以親和層析為適用的精製步驟。作為親和層析之蛋白質A/G之適合性係依賴抗體中存在的免疫球蛋白Fc區的種及同型。蛋白質A係依據人γ1、γ2、或γ4重鏈，可使用於精製抗體(例如參照Lindmark et al.,J.Immunol.Methods.62：1-13(1983))。蛋白質G係適合使用於全部的小鼠同型及含人γ3之全部的人γ重鏈(例如參照Gusset al.,EMBO J.5：1567-1575(1986))。親和配體所結合之基質係以瓊脂膠(Agarose)最多，但亦可使用其他材料。孔控制玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯等之機械性安定的基質係可比瓊脂膠可達成者流量更快及處理時間更短。抗體含CH3 區段時，Bakerbond ABX樹脂(J.T.Baker、Phillipsburg、NJ)適用於精製。因應所回收的抗體，亦可利用離子交換管柱之分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、以二氧化矽之層析、以肝素之層析、聚焦層析(Chromatofocusing)、SDS-PAGE、及硫酸銨沈澱法。
上述預備的精製步驟中，對含目的抗體及混入物之混合液，亦可施以例如使用pH約2.5-4.5，以低鹽濃度(例如約0-0.25M NaCl)為宜之沖提緩衝溶液之低pH疏水性相互作用層析。
〔其他型態〕
上述任一種型態之抗體係依情況，亦可與藥學上所容許的載體等一同構成組成物或製劑。另外，上述任一種型態之抗體係可使用於一般抗體所使用之各種用途。
多重特異性抗體所使用之代表性用途，舉例如下。
〔偵測、診斷〕
多重特異性抗體係可有效地使用於競爭性結合分析法(Competition binding assay)、直接及間接三明治分析法及免疫沈澱法等之已知的分析法。
另外，用以固定酵素免疫分析所使用之酵素，亦可使用多重特異性抗體。設計多重特異性抗體之某Fab區結合於酵素表面特定的抗原決定位(epitope)而不發生酵素抑制，結合其他Fab區於所需部位中確實的高酵素密度之固定化基質，可敏感度佳地進行酵素免疫分析。
多重特異性抗體又可使用於用以進行腫瘤等各種疾病之in vivo免疫診斷或in vitro免疫診斷(Songsivilai et al.,Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990))。此時，多重特異性抗體的某Fab區係與腫瘤相關抗原結合，其他Fab區係可與放射性核素(radionuclide)結合之螯合劑等之可偵測之標誌結合。
〔疾病治療〕
藉由多重特異性抗體所提供與標的細胞(例如特定臟器等)結合之一個Fab區以及與藥劑(低分子藥劑、多胜肽等)結合之其他Fab區，藉由特異地送達藥劑等於標的細胞，可適用於治療上。
另外，藉由多重特異性抗體所提供與標的(例如病原體或腫瘤細胞)結合之一個Fab區以及與T細胞受體或Fcγ受體等之細胞傷害性誘導因子結合之其他Fab區，藉由限定細胞傷害性的對象，可適用於治療上。此時，使用多重特異性抗體，將可使對象之細胞性免疫防禦機構特異地朝向於腫瘤細胞或感染性病原體。
另外，藉由多重特異性抗體所提供與標的(例如病原體或腫瘤細胞)上之某抗原(例如膜蛋白質、受體蛋白質等)結合之一個Fab區以及與同一標的或同一種標的上之其他抗原結合之其他Fab區，藉由改變細胞傷害性強度等(例如提升ADCC、誘導細胞凋亡(apoptosis)等)，可適用於治療上。
另外，多重特異性抗體係可作為纖維蛋白溶解劑或疫 苗佐劑使用。進而，此等抗體於感染性疾病的處置中可以使用(例如將作用細胞(Effector Cell)對感染HIV病毒或流感病毒等病毒之細胞或Toxoplasma gondii等之原生動物進行標的化用)，或可使用於送達血藍蛋白(immunocyanin)於腫瘤細胞用，或將免疫複合體於細胞表面受體進行標的化用。
以上係對本發明之實施型態進行敍述，此等係本發明之舉例，亦可採用上述以外之各種組成。
例如將具有滿足本發明條件之結構之多胜肽鏈，於in vitro，使化學結合時，想增加特定的輕鏈-重鏈間結合時(製造多重特異性抗體時)等，本發明亦適用，如此方法亦包含於本發明之型態。
實施例
以下係藉由實施例說明本發明，但此等實施例並非限定本發明者。另外，實施例中所言及之市售試劑，若無特別表示，依據製造者之使用說明或規定法使用。
該實施例，首先最初導入非天然型雙硫鍵(Cys1m)之突變體係顯示分子量及機能上與野生型抗體同等。其次，非天然型雙硫鍵之結合選擇性高，亦即顯示不與天然型雙硫鍵交叉。最後，由各種解析結果，證明藉由利用Cys1m，可簡便地製作作為IgG型之完全形態之雙重特異性抗體。
〔實施例1〕 〔表現載體之構建〕
用以使各種抗體分子表現之載體，使用市售之表現載體pcDNA3.1(+)(Invitrogen社)。於一個載體上，串聯配置輕鏈之表現單位(啟動子、目的基因、PolyA序列)及重鏈之表現單位(同)，以單一載體之基因導入，使抗體可表現。以使用的啟動子及選殖而得到之cDNA鹽基序列如圖2及圖3所示，轉錄產物之胺基酸序列如圖4所示。
(1-i)非天然型雙硫鍵導入處之搜尋
結構搜尋係使用Chemical Computing Group社之計算化學軟體「MOE」進行。Protein Data Bank(PDB)內之人Fab之立體結構資料中，輕鏈為κ鏈之IgG1抗體之初期結構係重鏈為γ1型且輕鏈為κ型，使用解像度為最高之1.8Å之PDB ID：1L71之資料，輕鏈為λ型之IgG1抗體之初期結構係重鏈為γ1型且輕鏈為λ型，使用解像度為最高之1.9Å之PDB ID：2FB4資料。
考慮導入新穎的雙硫鍵時，突變元之殘基彼此之α碳間距離以及β碳間距離為某程度接近係重要之報告(Sowdhamini R,et al.,Protein Eng.,95-103,1989)，搜尋關於κ鏈係α碳間距離為7.0Å以下，β碳間距離為5.5Å以下之殘基對，關於λ鏈係α碳間距離為10Å以下，β碳間距離為8Å以下之殘基對。
(I-ii)人輕鏈基因之取得
人κ型輕鏈基因係以來自健康人(成人)之末梢血液白血球之RNA而調製的cDNA基因庫(BioChain社，C1234148-10)為模板，進行PCR選殖而得。此時之PCR引子係參照GenBank登錄：J00241而設計(圖2之序列P01及P02)。另外，為容易進行選殖，預先使限制酵素位置內包於兩個引子。選殖PCR產物於選殖載體(pBluescriptII等)後，確認鹽基序列，選出兩辨識序列間之序列與J00241相同之選殖株(野生型：圖3之序列N01、圖4之序列A01)。將含有連接於此之上游部之分泌訊號序列(統一成抗DR5抗體之序列)之輕鏈可變區之基因(抗CD20抗體、抗CD37抗體或抗DR5抗體)，進行選殖，此與經選殖之κ鏈恆定區以此順序連接，配置於表現載體之啟動子的下游。
人λ型輕鏈基因係以與人κ型輕鏈基因相同的步驟得到。此時之PCR引子係參照GenBank登錄：J00252而設計(圖2之序列P03及P04)。另外，為使容易選殖，預先使限制酵素位置內包於兩個引子。選殖PCR產物於選殖載體(pB1uescriptII等)後，確認鹽基序列，選出兩辨識序列間之序列與J00252相同之選殖株。以選殖此λ鏈恆定區之載體為模板，使用設計輕鏈可變區與λ鏈恆定區連接之正股引子(sense primer)(圖2之序列P05)及λ鏈恆定區C端之反股引子(Anti-sense primer)(圖2之 序列P04)，再次進行PCR，得到可變區連接用λ鏈恆定區(野生型：圖3之序列N02、圖4之序列A02)。將含有連接於此之上游部之分泌訊號序列(統一成抗DR5抗體之序列)之輕鏈可變區之基因(抗CD20抗體)，進行選殖，此與可變區連接用λ鏈恆定區以此順序連接，配置於表現載體之啟動子的下游。
(I-iii)人IgG1基因之取得
人IgG1重鏈恆定區(CH1區~CH3區)之基因係以抽取自健康人(成人)之末梢血液白血球之RNA為材料，合成cDNA後，進行PCR選殖而得。此時之PCR引子係參照GenBank登錄：J00228而設計(圖2之序列P06及P07)。另外，為容易進行選殖，預先使限制酵素辨識序列內包於兩個PCR引子。選殖PCR產物於選殖載體(pBluescriptII等)後，確認鹽基序列，選出兩辨識序列間之序列與J00228相同之選殖株(野生型：圖3之序列N03、圖4之序列A03)。將含有連接於此之上游部之分泌訊號序列之重鏈可變區之基因(抗CD20抗體、抗CD37抗體或抗DR5抗體)，進行選殖，此與經選殖之重鏈恆定區以此順序連接，配置於表現載體之啟動子的下游。
(I-iv)非天然型雙硫鍵結合抗體表現載體之取得
為使輕鏈-重鏈間之天然型雙硫鍵無效化，同時進行 取代負責Cys成Ser(輕鏈：C214S，重鏈：C220S)。
κ鏈輕鏈中，設計具有C214S突變之正股引子(圖2之序列P08)及反股引子(圖2之序列P09)，適當組合使用於此等之上游側設計之各種Cys突變導入用引子(圖2之序列P10~P18)、於最上游設計之來自載體序列之正股引子(圖2之序列P19)及於最下游側設計之來自載體序列之反股引子(圖2之序列P20)，以人κ型輕鏈基因(野生型)為模板，進行PCR，得到目的之導入突變基因片段群。適當地將此等於PCR連接，進行選殖後，確認序列(圖3之序列N04~N08，圖4之序列A04~A08)。接著，將各個與表現載體上之野生型基因之相同區域交換，得到目的之導入突變輕鏈基因群。
λ鏈輕鏈中，設計具有C214S突變之反股引子(圖2之序列P21)，適當組合使用於此等之上游側設計之各種Cys突變導入用引子(圖2之序列P22~P26)、及於最上游設計之正股引子(圖2之序列P05)，以人λ型輕鏈基因(野生型)為模板，進行PCR，得到目的之導入突變基因片段群。適當地將此等於PCR連接，進行選殖後，確認序列(圖3之序列N09~N11，圖4之序列A09~A11)。接著，將各個與表現載體上之野生型基因之相同區域交換，得到目的之導入突變輕鏈基因群。
重鏈中，使用具有C220S突變之正股引子(圖2之序列P27)、反股引子(圖2之序列P28)、各種Cys突變導入用引子(圖2之序列P29~P43)、最上游側設計之 來自抗CD20抗體之重鏈可變區之序列之正股引子及於最下游設計之來自CH2區段之序列之反股引子(圖2之序列P44)，以人IgG1基因為模板，進行PCR，得到目的之導入突變基因片段群。適當地將此等因應需要於PCR連接，進行選殖後，確認序列(圖3及圖4之序列N12~N19及A12~A19)。接著，將各個與表現載體上之野生型基因之相同區域交換，得到表現目的之導入突變重鏈基因群。
(I-v)蛋白質A親和性缺失型抗體表現載體之取得
調製雙重特異性抗體時，將相異的序列之重鏈彼此結合之分子(雜合體(heterozygote))，以蛋白質A結合能的差異為指標，考慮使一方重鏈之蛋白質A結合能缺失而可簡便且有效地精製。亦即，將IgG1上之負責殘基之H435及Y436，取代成不具有蛋白質A結合能之IgG3型(H435R/Y436F)。野生型重鏈(記為〔1〕)及該突變型重鏈(記為〔3〕)而成的雜合體(〔1〕/〔3〕)係呈現野生型純合體(homozygote)(〔1〕/〔1〕)及突變型純合體(〔3〕/〔3〕)的中間的蛋白質A結合能，該結果係於使用蛋白質A管柱親和層析中，至今已確認三者可分別精製。
參照對人IgG3型重鏈之GenBank登錄：X03604，設計具有H435R/Y436F突變之正股引子(圖2之序列P45)及反股引子(圖2之序列P46)。使用此等與來自載體序 列之正股引子(圖2之序列P19)及反股引子(圖2之序列P47)，以人IgG1重鏈恆定區基因為模板，進行PCR，得到突變上游側基因片段及突變下游側基因片段。使兩片段以PCR連接。進而，以此為模板，使用上游端及下游端之引子(圖2之序列P19、P47)，進行PCR，得到目的的基因片段後，進行選殖，確認序列(圖3之序列N20，圖4之序列A20)。接著，經由限制酵素處理，調製SacII-Xhol片段後，將此與表現載體上之野生型基因之相同區域交換，得到目的之表現導入突變重鏈基因之載體。
〔各種抗體的表現與精製〕 (II-i)基因導入
使用市售試劑組，以基因導入品質精製各種表現載體後，使用293fectin(Invitrogen社，12347-019)，依照廠商指示書，基因導入於FreeStyle293-F細胞(Invitrogen社，R790-07)。
(II-ii)藉由親和層析精製
自培養上清液精製親抗體(成為形成多重特異性抗體基礎之各個抗體)等時，使用HiTrap Protein-A HP管柱或HiTrap Protein-G HP管柱(GE Healthcare Bio-Sciences社)，依照廠商指示書，進行大量精製。所得之精製分離部份係對PBS-T(10mM Na2HPO4，150mM NaCl，0.07% 之Tween-80，pH7.0)進行透析，於4℃保存直至使用時。
(II-iii)藉由強陽離子交換層析，精製雙重特異性抗體
使用強陽離子交換管柱PL-SCX(Polymer Laboratories社，4.6 ×150mm，1000Å)。於移動相A液(10mM MES，pH6.0)、移動相B液(500mM NaCl之10mM MES，pH6.0)及流速1ml/min，將移動相B液之混合率為2%之初期移動相，以管柱體積換算為5倍量以上送液，預先平衡化管柱。負載以蛋白質A親和層析精製之0.2~1mg之弱結合分離部份(重鏈〔1〕〔3〕型雜合體=雙重特異性抗體)(0min)，使於管柱電荷結合。以上述初期移動相洗淨5分鐘後(0→5min)，將B液之混合率，以0.8%/min增加之直線梯度，沖提47.5分鐘(5→52.5min，2→40%)，依序回收結合成分。之後，立即以B液混合率為100%，進行管柱洗淨。其間，記錄於280nm之吸收，偵測蛋白質之沖提行動。回收之雙重特異性抗體(主要波峰)係因應需要，對PBS-T(pH7.0)進行透析，於4℃保存。
〔抗體之特性解析〕 (III-i)SDS-PAGE
確認已精製之雙重特異性抗體如設計之分子量係以下述步驟，進行非還原條件下之SDS-PAGE。另外，由該結 果亦確認輕鏈-重鏈間之結合限定化狀況。
各檢品係使用樣品處理液(Cosmobio製，423420：TrisSDS樣品處理液等)SDS化後，供應於適當丙烯醯胺濃度之預鑄膠片(Precast Gel)(Marisol製，GM-1020-3N：調整10-20%等)，於含有SDS之非還原條件下，進行泳動。接著，凝膠係施以一般所使用之染色方法，例如，藉由亮藍(Coomassie Brilliant Blue)R250溶液施以染色，進行蛋白質條帶之可視化。
(III-ii)F(ab')2解析
因為雙重特異性抗體係同時具有來自兩方親抗體之2種Fab，所以由此調製F(ab')2時，具有所謂的呈現來自兩方親抗體之該中間性質之物理化學的特徵。確認結構上真的雙重特異性係使用已精製之雙重特異性抗體，以下述步驟進行胃蛋白酶處理及F(ab')2解析。
將50μg之已精製之雙重特異性抗體(無透析處理)，對含0.07%Tween-80之30mM醋酸鈉(pH4.0))，溶解成最終濃度為10μg/100μL左右後，每50μg基質添加8.5U之使以0.2M醋酸鈉(pH4.0)膨潤之固相化胃蛋白酶(SIGMA社，Pepsin-Agarose from porcine gastric mucosa等)。將此以120rpm振盪下，使於37℃進行切斷反應1小時後，以離心分離型過濾器(寶酒造製，9040：SUPREC-01等)處理，回收該過濾液。立即添加、攪拌30%體積量之2.5M Tris-HCl(pH8.0)，使反應液中和。 接著，於使用強離子交換管柱PL-SCX之HPLC中移動相A液，使用添加Tween-80成0.07%之緩衝溶液，進行透析或脫鹽管柱處理後，依照上述(II-iii)，藉由強陽離子交換層析進行分析。
(III-iii)Fab解析
因為雙重特異性抗體同時具有來自兩方親抗體之2種Fab，所以由此調製Fab時，具有所謂的偵測出來自兩方親抗體之2種Fab之物理化學的特徵。確認結構上真的雙重特異性係使用已精製之雙重特異性抗體，以下述步驟進行木瓜酵素處理及Fab解析。
將60μg之已精製的雙重特異性抗體，溶解於200μL之PBS-T(pH7.0)後，每60μg基質添加0.12U之使以30μL之1M Tris-40mM EDTA(pH7.4)、30μL之10mM之半胱胺酸、及0.1M Tris-4mM EDTA(pH7.4)膨潤之固相化木瓜酵素(SIGMA社，P-4406：Papain Agarose from papaya latex等)。將此以PBS-T(pH7.0)增量至300μL後，以120rpm振盪下，使於37℃進行切斷反應16小時。接著，與上述(III-ii)同樣地以離心分離型過濾器處理，回收過濾液後，經由透析或藉由脫鹽管柱處理之緩衝溶液之交換，依照上述(II-iii)，藉由強陽離子交換層析進行分析。
(III-iv)抗原結合能解析
因為雙重特異性抗體係同時具有來自兩方親抗體之2種Fab，所以具有所謂的可結合於表現對應抗原之標的細胞雙方之生物學的特徵。確認結構上真的雙重特異性係使用已精製之雙重特異性抗體，以下述步驟進行結合能解析。
將標的細胞以2×105cell/well，接種於96孔盤後，添加50μL之溶解於5%之含FBS之PBS(5%FBS/PBS)之各濃度之多重特異性抗體檢品，使細胞分散。使於冰上進行反應30min後，以200μL之5%FBS/PBS洗淨細胞2次。接著，添加50μL之以5%FBS/PBS稀釋之Phycoerythrin(PE)標示的抗人IgGFc抗體(例如Rockland社，709-1817，稀釋100倍)，再次使細胞分散。使於冰上進行反應30min後，與先前同樣地洗淨細胞2次。最後使分散於200μL之1%福馬林後，以流式細胞儀(flow cytometer)測定各個標的細胞呈現的螢光量，算出平均螢光強度(MFI)。
〔選定非天然型雙硫鍵導入突變體候補〕
以計算化學軟體「MOE」搜尋的結果，發現除了κ鏈係與存在於野生型抗體既有的Cys殘基製作雙硫鍵的可能性高之1組外，9組的作為可導入非天然型雙硫鍵之殘基對候補。此等位置、α碳間距離(Cα-Cα')及β碳間距離(Cβ-Cβ')如表3所示。另外，λ鏈係發現5組之作為可導入非天然型雙硫鍵之殘基對候補。此等位置、α碳間距 離(Cα-Cα')及β碳間距離(Cβ-Cβ')如表4所示。另外，輕鏈係λ鏈之胺基酸殘基之編碼係依與κ鏈之序列比較而決定。
非天然型雙硫鍵導入位置之搜尋結果一覽
表3記載之各突變體係實際上使表現以確認輕鏈-重鏈間是否形成非天然型雙硫鍵。於表現載體上之野生型抗CD20抗體基因及野生型抗CD37抗體基因，個別導入表3 記載之Cys1m(a)~(i)之各突變後，使各個基因導入於FreeStyle293-F細胞並表現，以HiTrap蛋白質A管柱簡易精製來自該上清液之抗體成分。將此等供予SDS-PAGE之結果如圖5及圖6所示。除了Cys1m(e)之突變體，於表示與野生型同等分子量之約150kDa的位置，觀察到主要條帶。
另外，關於表4記載之各突變體，實際上使表現以確認輕鏈-重鏈間是否形成非天然型雙硫鍵。於表現載體上之野生型抗CD20抗體之CL區之基因，移植入λ 1型CL之基因，作為λ 1型CL基因表現載體。於此λ 1型CL基因表現載體，個別導入表4記載之Cys1m(j)~(n)之各突變後，與上述同樣地使各個基因導入於FreeStyle293-F細胞並表現，以HiTrap蛋白質A管柱簡易精製來自該上清液之抗體成分。將此等供予SDS-PAGE之結果如圖7所示。全部的突變體中，於與野生型同等分子量之約150kDa的位置，觀察到主要條帶。因此，確認藉由導入Cys1m突變，可於輕鏈-重鏈間形成非天然型雙硫鍵，可適用而不依賴抗體之輕鏈之亞型。
另一方面，於表現載體上之野生型抗HER2抗體基因、抗EGFR抗體基因及抗CD52抗體基因，導入表3記載之Cys1m(f)之突變後，與上述同樣地使基因導入於FreeStyle293-F細胞並表現，以HiTrap蛋白質A管柱簡易精製來自該上清液之抗體成分，將此等供予SDS-PAGE。結果如圖8所示。導入Cys1m(f)型突變之任一 種抗體亦於表示與野生型同等分子量之約150kDa的位置，觀察到主要條帶，確認導入Cys1m突變係可適用而不依賴抗體之可變區之序列。
接著，確認輕鏈或重鏈之各突變體是否不與天然型的輕鏈或重鏈形成雙硫鍵。於表現載體上之野生型抗CD20抗體之輕鏈基因或重鏈基因中任一方，導入上述突變，使用此等，與上述同樣地進行表現實驗與用以確認其之SDS-PAGE解析。導入突變於輕鏈時之SDS-PAGE之結果如圖9及圖10所示。除了κ鏈S121C(以Cys1m(d)及(e)使用)及λ鏈E124C(以Cys1m(k)使用)以外之輕鏈突變體，於被認為重鏈二聚體及輕鏈的位置觀察到條帶，與野生型同等分子量之約150kDa的位置，未見到主要條帶。另一方面，導入突變於重鏈時之SDS-PAGE之結果如圖10及圖11所示。除了重鏈S134C(以Cys1m(a)使用)以外之重鏈突變體，於被認為輕鏈的單體、及重鏈二聚體及單體的位置觀察到條帶，與野生型同等分子量之約150kDa的位置，未見到主要條帶。因此，顯示輕鏈或重鏈之各突變體係不與天然型的輕鏈或重鏈形成雙硫鍵。
最後，進行抗原結合能是否因導入恆定區之非天然型雙硫鍵而受到影響之確認。使用以HiTrap蛋白質A管柱簡易精製之Cys1m型之抗CD20抗體，調查對於表現CD20抗原之Ramos細胞之抗原結合能之結果如圖12~16所示。Cys1m(a)~(n)突變體之抗原結合能與野生型 抗體(wt)的幾乎未見有差異。
另外，對具有非天然型雙硫鍵之抗CD37抗體(Cys1m型抗CD37抗體)，使用表現CD37抗原之Ramos細胞，與抗CD20抗體之實驗同樣地調查Cys1m(a)~(i)突變體之抗原結合能時，顯示與抗CD20抗體時同樣的結果(圖17~19)。
綜合以上的結果時，於上述實驗之形成非天然型雙硫鍵之半胱胺酸殘基與天然型雙硫鍵之交叉少，具有高結合選擇性。另外，導入非天然型雙硫鍵對抗原結合能無影響。
〔雙重特異性抗體的調製〕
作為用於表現實驗之具有非天然型雙硫鍵之抗CD20抗體(αCD20)之組合對象，使用抗DR5抗體(αDR5)及抗CD37抗體(αCD37)，進行雙重特異性抗體的調製。實施例使用之Cys1m係(b)、(c)、(f)、(g)及(h)5種，導入αCD20。用以精製重鏈雜合體(〔1〕〔3〕結合體)之蛋白質A親和性缺失突變係導入於αDR5、αCD37或αCD20(記為〔3〕)。
調製雙重特異性抗體αCD20(Cys1m)/αDR5時之蛋白質A親和層析之結果如圖20所示。剛負載後的洗淨中所見之最初大的波峰係不能結合於蛋白質A之重鏈〔3〕〔3〕型純合體(符合αDR5)。藉由後續之沖提操作，回收於35~40分鐘附近之弱結合性之重鏈〔1〕〔3〕型雜 合體(符合αCD20(Cys1m)/αDR5，雙重特異性抗體)，接著於55~60分鐘附近之強結合性之重鏈〔1〕〔1〕型純合體(符合αCD20)。任一種非天然型雙硫鍵導入突變體，皆與野生型(wt)相同的沖提圖譜，突變導入對該精製法不造成不良影響。相同組合中，導入蛋白質A親和性缺失突變〔3〕於αCD20之αDR5/αCD20(Cys1m)時，同樣地沖提成為3支波峰(未揭示資料)。
對於另一方組合之雙重特異性抗體αCD20(Cys1m)/αCD37之組合，亦進行同樣的實驗時，同樣地沖提成為3支波峰，自沖提時間早者，符合αCD37(重鏈〔3〕〔3〕型純合體)、αCD20(Cys1m)/αCD37(重鏈〔1〕〔3〕型雜合體)、αCD20(重鏈〔1〕〔1〕型純合體)。
對於各個，回收重鏈〔1〕〔3〕型雜合體(雙重特異性抗體)分離部份，緩衝溶液交換後，供予強陽離子交換層析，回收其主要波峰。再次進行緩衝溶液交換，成為雙重特異性抗體之最終精製品。
〔雙重特異性抗體之品質確認〕
可同時結合於相異的2種抗原之雙重特異性抗體，因為同時具有來自可辨識各個抗原之2種親抗體之Fab，所以其F(ab')2解析，理論上，來自兩親抗體調製之F(ab')2時之中間的沖提時間偵測出1支波峰。將已精製之雙重特異性抗體αCD20(Cys1m)/αDR5，以木瓜酵素處理， F(ab')2解析結果如圖21所示。本檢品係於33min附近見有主要波峰，此符合雙重特異性抗體之F(ab')2。其沖提時間係圖22所示之另行解析之親抗體αDR5(30min)及αCD20(36min)之中間。
另一方組合之雙重特異性抗體αCD20(Cys1m)/αCD37時之結果如圖23所示。該組合於超過30min時見有F(ab')2波峰。該組合亦與先前同樣地為親抗體αCD37(25min)及αCD20(36min)之中間的沖提時間(圖24)。
可同時結合於相異的2種抗原之雙重特異性抗體，因為同時具有來自辨識各個抗原之2種親抗體之Fab，所以其Fab解析係於與分別來自兩親抗體調製Fab時相同的沖提時間，偵測出2支波峰。將已精製之雙重特異性抗體αCD20(Cys1m)/αDR5，以木瓜酵素處理，Fab解析結果如圖25所示。各檢品於共通之18min附近之波峰係藉由木瓜酵素切斷而產生的Fc。另一方面，25.5min附近的波峰係αDR5特異的Fab，29~30min的波峰係αCD20特異的Fab(圖26)。另外調製之強制的使輕鏈錯誤結合之抗體檢品之解析結果，該組合中之輕鏈錯誤結合體之Fab係αDR5(輕鏈)-αCD20(重鏈)時，於22min附近沖提，另一方面，αCD20(輕鏈)-αDR5(重鏈)時，於37min附近沖提(圖26)。此等來自錯誤結合Fab等之不純物質之波峰，本精製檢品3種完全未被偵測出。
雙重特異性抗體αCD20(Cys1m)/αCD37之Fab解 析結果如圖27所示。另外，解析各個親抗體之結果如圖27所示。任一種雙重特異性抗體檢品係與上述同樣的結果。亦即，於18min附近被偵測出Fc波峰，並且於23min附近被偵測出αCD37之Fab的波峰，於29~30min附近被偵測出αCD20之Fab的波峰。解析另外調製之強制錯誤結合抗體之結果，該組合中之輕鏈錯誤結合體之Fab係αCD37(輕鏈)-αCD20(重鏈)時，於22.5min附近沖提，另一方面，αCD20(輕鏈)-αCD37(重鏈)時，於28min附近及於31min附近沖提(圖28)。此等之來自錯誤結合Fab等之不純物質之波峰，本精製檢品3種完全未被偵測出。
以使用蛋白質A親和性精製檢品之Fab解析表示，可明白地顯示藉由導入非天然型雙硫鍵之輕鏈-重鏈間的結合限定化之功效。雙重特異性抗體αCD20(Cys1m)/αDR5之結果如圖29所示，同αCD20(Cys1m)/αCD37之結果如圖30所示。未導入突變之野生型時，任一種組合例皆明顯地偵測出各2種錯誤結合Fab。另一方面，導入突變時，此等銳減，尤其Cys1m(f)及(g)時，偵測出少許的程度。
雙重特異性抗體αCD20(Cys1m)/αCD37係機能上雙重特異性抗體如圖31及32所示。陰性對照之親抗體αCD37(wt)不能結合之狀況，αCD20(Cys1m)/αCD37相對於CD20陽性CD37陰性細胞(導入CD20基因於SP2/0細胞，以FACS確認其表現者)，明顯具有結合 能。相對於另一方之測定細胞之CD20陰性CD37陽性細胞(導入CD37基因於SP2/0細胞，以FACS確認其表現者)，陰性對照之親抗體αCD20(wt)不能結合之狀況，αCD20(Cys1m)/αCD37具有結合能。雙重特異性抗體αDR5/αCD20(Cys1m)亦同樣地可得到所謂的機能上雙重特異性之結果(圖33及34)，顯示該技術之有效性係普遍的。
就以上所示之結果，確認藉由本發明之使用非天然型雙硫鍵之鏈間鍵限定化技術，可效率佳且簡便地製作雙重特異性抗體等之具有相異的Fab區之抗體。
以上，依據用以實施發明之型態的記載所說明之各種型態並非限定本發明者，為企圖舉例所揭示者。本發明之技術範圍係依專利申請範圍之記載所決定者，該業者可於專利申請範圍所記載之發明的技術範圍，變更各種設計。
另外，本說明書所引用之專利、專利申請及出版物的揭示內容全部藉由參照而引用於本說明書。
<110> ZENYAKU KOGYO KABUSHIKIKAISHA
<120> 抗體的製造方法，及抗體及製造組成
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Claims (23)

  1. 一種方法，為含有至少二個相異的Fab區之抗體；或含有至少二個含Fab區之抗體，該Fab區於至少二個抗體間為相異之組成物之製造方法，其特徵係包含i)於前述抗體表現之條件下，培養含有編碼前述抗體之核酸之寄主細胞之步驟、及ii)自寄主細胞培養物回收前述抗體之步驟，前述核酸係至少編碼一個含有前述Fab區之輕鏈及重鏈之間形成非天然型雙硫鍵之半胱胺酸殘基之區域，藉由前述非天然型雙硫鍵的存在，Fab區中輕鏈及重鏈間之雙硫鍵的位置與其他至少一個Fab區中輕鏈及重鏈間之雙硫鍵的位置相異，其係藉由於選自輕鏈116位置-重鏈134位置、輕鏈116位置-重鏈141位置、輕鏈118位置-重鏈128位置、輕鏈121位置-重鏈126位置、輕鏈124位置-重鏈126位置、輕鏈162位置-重鏈170位置、輕鏈162位置-重鏈171位置及輕鏈162位置-重鏈173位置中至少一組之輕鏈-重鏈的位置所導入的半胱胺酸殘基，形成非天然型雙硫鍵。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中前述非天然型雙硫鍵及前述雙硫鍵係CL區及CH1區之間之雙硫鍵。
  3. 一種方法，含有含第一輕鏈及重鏈之第一Fab區及含分別與前述第一輕鏈及重鏈相異之第二輕鏈及重鏈之第二Fab區之抗體之製造方法，其特徵係包含a)將至少一個前述抗體之親抗體之第一Fab區之CL區及CH1區中半胱胺酸以外之胺基酸殘基，取代成形成雙硫鍵之半胱胺酸殘基之步驟，及b)藉由前述形成雙硫鍵之半胱胺酸殘基，使於第一Fab區中形成非天然型雙硫鍵之步驟，藉由前述非天然型雙硫鍵的存在，第一Fab區與第二Fab區於不同的位置，形成雙硫鍵，其係藉由於選自輕鏈輕鏈116位置-重鏈134位置、輕鏈116位置-重鏈141位置、輕鏈118位置-重鏈128位置、輕鏈121位置-重鏈126位置、輕鏈124位置-重鏈126位置、輕鏈162位置-重鏈170位置、輕鏈162位置-重鏈171位置及輕鏈162位置-重鏈173位置中至少一組之輕鏈-重鏈的位置所導入的半胱胺酸殘基，形成非天然型雙硫鍵。
  4. 一種抗體，為含有至少二個相異的Fab區之抗體，其特徵係至少一個Fab區含有於CL區及CH1區之間形成非天然型雙硫鍵之半胱胺酸殘基，藉此形成非天然型雙硫鍵，藉由前述非天然型雙硫鍵的存在，Fab區中CL區及CH1區間的雙硫鍵的位置與其他至少一個Fab區中CL區及CH1區間的雙硫鍵的位置相異，其係藉由於選自輕鏈116位置-重鏈134位置、輕鏈116位置-重鏈141位置、輕鏈118位置-重鏈128位置、輕鏈121位置-重鏈126位置、輕鏈124位置-重鏈126位置、輕鏈162位置-重鏈170位置、輕鏈162位置-重鏈171位置及輕鏈162位置-重鏈173位置中至少一組之輕鏈-重鏈的位置所導入的半胱胺酸殘基，形成非天然型雙硫鍵。
  5. 如申請專利範圍第4項之抗體，其含有至少二個相異的Fab區。
  6. 一種組成物，為含有至少二個含Fab區之抗體，該Fab區於至少二個抗體間為相異之組成物，至少一個Fab區係含有於輕鏈及重鏈之間形成非天然型雙硫鍵之半胱胺酸殘基，藉此形成非天然型雙硫鍵，藉由前述非天然型雙硫鍵的存在，Fab區之輕鏈及重鏈間的雙硫鍵的位置與其他至少一個Fab區之輕鏈及重鏈間的雙硫鍵的位置相異，其係藉由於選自輕鏈116位置-重鏈134位置、輕鏈116位置-重鏈141位置、輕鏈118位置-重鏈128位置、輕鏈121位置-重鏈126位置、輕鏈124位置-重鏈126位置、輕鏈162位置-重鏈170位置、輕鏈162位置-重鏈171位置及輕鏈162位置-重鏈173位置中至少一組之輕鏈-重鏈的位置所導入的半胱胺酸殘基，形成非天然型雙硫鍵。
  7. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之方法，其中抗體為多重特異性抗體。
  8. 如申請專利範圍第4項或第5項項之抗體，其為多重特異性抗體。
  9. 如申請專利範圍第7項之方法，其中多重特異性抗體為雙重特異性抗體。
  10. 如申請專利範圍第8項之抗體，其中多重特異性抗體為雙重特異性抗體。
  11. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之方法，其中抗體係將至少二個抗體片段藉由連接子或直接連結者。
  12. 如申請專利範圍第4項或第5項之抗體，其中抗體係將至少二個抗體片段藉由連接子或直接連結者。
  13. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之方法物，其中抗體係抗體片段。
  14. 如申請專利範圍第4項或第5項之抗體，其中抗體係抗體片段。
  15. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之方法，其中抗體之Fc區係由其他分子所取代。
  16. 如申請專利範圍第4項或第5項之抗體，其中抗體之Fc區係由其他分子所取代。
  17. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之方法，其中抗體為嵌合抗體、人化抗體或人抗體。
  18. 如申請專利範圍第4項或第5項之抗體，其中抗體為嵌合抗體、人化抗體或人抗體。
  19. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之方法，其中至少一個Fab區之CL區及CH1區之間未形成非天然型雙硫鍵。
  20. 如申請專利範圍第4項或第5項之抗體，其中至少一個Fab區之CL區及CH1區之間未形成非天然型雙硫鍵。
  21. 如申請專利範圍第19項之方法，其中某Fab區中CL區及CH1區間的雙硫鍵的位置與其他至少一個Fab區中CL區及CH1區間的雙硫鍵的位置全部相異。
  22. 如申請專利範圍第20項之抗體，其中某Fab區中CL區及CH1區間的雙硫鍵的位置與其他至少一個Fab區中CL區及CH1區間的雙硫鍵的位置全部相異。
  23. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中寄主細胞係真核生物細胞或大腸桿菌。
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