JP6410711B2 - 繋留軽鎖を有する結合タンパク質 - Google Patents

Description

本発明は、繋留軽鎖を有する結合タンパク質と、それらを作製及び使用するための方法に関する。

多数のヒト疾患が今日、治療用モノクローナル抗体、例えばヒト化、又は完全ヒトモノクローナル抗体によって治療されている。１９７５年に、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎは、定義された特異性のモノクローナル抗体（ｍＡＢ）を分泌する治療用ｍＡＢｓを先導した齧歯類ハイブリドーマを産出し、これらの新規のハイブリドーマ技術を用いる、治療用ｍＡＢの新時代を先導した（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜９７，１９７５）。しかしながら、これらの初期の治療の主要な制限として、エフェクタ機能の欠如、血清半減期の減少、及び望ましくない免疫応答を引き起こす傾向の増加があげられた。キメラ化及びヒト化技術が、これらの望まない特徴を克服することに役だった（Ｃａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｆｒｉｅｍａｒｋ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：２７５〜３１１，１９８６；Ｊａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｏｔｉｓｈ Ｍｅｄ．Ｊ．２９：６７〜８３，１９８４；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２〜１２０７，１９８５）。

２つの樹立されたハイブリドーマ細胞株を一緒に融合して、ハイブリッドハイブリドーマ又はクアドローマを形成することによって（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７〜５４０，１９８３）又は、２つのＦ（ａｂ’）フラグメントを化学的に架橋することによって（Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １６０：１６８６〜１７０１，１９８４）、産出された第一世代の二重特異性抗体（ＢｓｍＡｂ）が、多数の標的の同時調節を可能にした。これらの研究は、ＢｓｍＡｂの治療的潜在力を強調したけれども、齧歯類抗体フラグメントに対する有害なインビボ応答に加えて、これらのアプローチは、精製抗体の大きな均一ロットを産出することに関する、ロジスティックな問題を提示した。例えば、ハイブリッドハイブリドーマによって分泌された重及び軽鎖の無作為連結が結果として、それより望む二重特異性分子が単離されるべき１０の異なる抗体種の産出となる。

最初のヒト化ＢｓｍＡｂ、ＭＤＸ−４４７（Ｃｕｒｎｏｗ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４５：２１０〜２１５，１９９７）が、ＣＤＲグラフト化によって産出され、二重特異性Ｆ（ａｂ’）２分子を作製するために、２つのＦａｂ’ドメインの化学結合が続いて行われた。しかしながら、還元、酸化及び続く精製の段階が、これらの方法の利用から、非常に純粋なＢｓｍＡｂ分子を産出することにおける鍵となるハードルを強調する。ホモダイマー種からのヘテロダイマー種の単離及び精製は、実生産スケールでは不可能である（Ｋａｒａｃａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１１：８４２〜８５４，２０００）。

ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：６４４４〜６４４８，１９９３）、一本鎖ダイアボディ（Ｂｒｕｓｓｅｌｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ４：１１５〜１２３，１９９９，Ｎｅｔｔｌｅｂｅｃｋ ｅｔａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：８８２〜８９１，２００１）、タンデム一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）（二重特異性Ｔ細胞結合分子（ＢｉＴＥ））（Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：７０２１〜７０２５，１９９５）、ノブアンドホールｍＡｂ（Ｒｉｄｇｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９：６１７〜６２１，１９９６）及び二重可変ドメイン抗体（国際特許第ＷＯ２００７／０２４７１５号）を含むさらなるＢｓｍＡｂプラットフォームが開発されてきた。

少なくとも１つの標的を結合し、製造の簡便さと、原価の減少を提供することが可能な、改良された結合タンパク質に対する必要性が本技術分野で存在する。

本発明の一つの態様は、少なくとも１つの抗原に特異的に結合する、繋留軽鎖、第一重鎖及び第二重鎖を含む結合タンパク質である。

本発明の別の態様は、結合タンパク質を産出するのに十分な条件下、宿主細胞を培養することを含む方法にしたがって産出された、繋留軽鎖、第一重鎖及び第二重鎖を含む結合タンパク質であり、そこで宿主細胞には、ベクターが含まれ、ベクターには、繋留軽鎖、第一重鎖及び第二重鎖をコードしている核酸が含まれる。

本発明の別の態様は、本発明の結合タンパク質をコードしている単離されたポリヌクレオチドである。

本発明の別の態様は、本発明の結合タンパク質をコードしている単離されたポリヌクレオチドを含む単離されたベクターである。

本発明の別の態様は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。

本発明の別の態様は、結合タンパク質を産出するのに十分な条件下、本発明の宿主細胞を培養することを含む、本発明の結合タンパク質を作製する方法である。

本発明の別の態様は、第一軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び第一軽鎖定常領域（ＣＬ１）を含む第一軽鎖と、第一重鎖可変領域（ＶＨ１）及び第一重鎖定常領域（ＣＨ１）を含む第一重鎖とを有する第一抗原に結合する抗体を提供することと、第二軽鎖可変領域（ＶＬ２）及び第二軽鎖定常領域（ＣＬ２）を含む第二軽鎖と、第二重鎖可変領域（ＶＨ２）及び第二重鎖定常領域（ＶＣ２）を含む第二重鎖とを有する第二抗原に結合する抗体を提供することと、操作可能に、Ｎ−末端からＣ−末端へＶＨ１−ＣＬ１−リンカー−ＶＨ２−ＣＬ２を連結して、裏返（inside-out）繋留軽鎖を作製することと、操作可能にＮ−末端からＣ−末端へＶＬ１−ＣＨ１を連結して、第一裏返重鎖を作製することと、操作可能にＮ−末端からＣ−末端へＶＬ２−ＣＨ２を連結して、第二裏返重鎖を作製することと、裏返繋留軽鎖、第一裏返重鎖及び第二裏返重鎖を発現させることと、二重特異性結合タンパク質を回収すること、とを含む、裏返繋留軽鎖、第一裏返重鎖及び第二裏返重鎖を含む第一抗原及び第二抗原に結合する二重特異性結合タンパク質の作製の方法である。

本発明の別の態様は、本発明の方法によって産出した二重特異性結合タンパク質である。

本発明の別の態様は、本発明の結合タンパク質及び薬理学的に許容可能な担体を含む医薬組成物である。

繋留軽鎖を有する結合タンパク質のデザインを示している。Ａ）結合タンパク質を含む二価単一特異性繋留軽鎖、Ｂ）二重特異性、繋留軽鎖含有結合タンパク質、Ｃ）二価、裏返繋留軽鎖含有結合タンパク質、Ｄ）二重特異性裏返繋留軽鎖含有結合タンパク質。

本発明で使用するところ用語「結合タンパク質」は、１つの繋留免疫グロブリン軽鎖及び２つの免疫グロブリン重鎖又はそのフラグメントを含む１つ以上の抗原に特異的に結合するタンパク質を意味する。免疫グロブリン軽鎖及び重鎖の構造はよく公知である。

本明細書で使用するところの用語「裏返軽鎖」は、軽鎖定常領域に操作可能に連結した重鎖可変領域から由来する可変領域を有する合成免疫グロブリン軽鎖を意味する。本明細書で使用するところの用語「裏返重鎖」は、重鎖定常領域に操作可能に連結した軽鎖可変領域から由来する可変領域を有する合成免疫グロブリン重鎖を意味する。本明細書で使用するところの用語「裏返繋留軽鎖」は、ポリペプチドリンカーを介して、そのＣ−末端から第二裏返軽鎖のＮ−末端までを操作可能に連結した第一裏返軽鎖を有する繋留軽鎖を意味する。典型的に、「裏返」軽鎖及び重鎖は、抗原に特異的に結合する存在している抗体のＶ領域交換によって産出される（Ｓｉｍｏｎ ａｎｄ Ｒａｊｅｗｓｋｙ，ＥＭＢＯ Ｊ．９：１０５１〜１０５６，１９９０）。

本明細書で記載するところの用語「繋留軽鎖」は、ポリペプチドリンカーを介してそのＣ−末端から第二軽鎖のＮ−末端までを操作可能に連結した第一軽鎖を有する合成抗体鎖を意味する。第一及び第二軽鎖は、天然に存在するか、又は合成されてよい。

本明細書で使用するところの用語「可変領域」は、抗原結合部位（例えばＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）及びフレームワーク（例えばＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）のアミノ酸配列を含む、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）又は抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を意味する。軽鎖可変領域（ＶＬ）は、カッパ（κ）又はラムダ（λ）でありえ、抗体ＩＧＶＫ又はＩＧＶＬ及びＩＧＪＫ又はＩＧＪＬ遺伝子によってコードされ、重鎖可変領域（ＶＨ）は、抗体ＩＧＶＨ、ＩＧＤＨ及びＩＧＪＨ遺伝子によってコードされる。ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子座、抗体遺伝子構造、遺伝子再構成及び配列のゲノム的構成は、当該技術分野で公知である。

抗体可変領域は、３つの「抗原結合部位」によって中断された「フレームワーク」領域からなる。抗原結合部位は、様々な用語を用いて定義される：（ｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＶＨ中３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）及びＶＬ中３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）が、配列可変性に基づく（Ｗｕ ａｎｄ Ｋａｂａｔ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２：２１１〜２５０，１９７０；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）。（ｉｉ）「超可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」、ＶＨ中３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ中３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）は、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７，１９８７）によって定義されたような構造的に超可変である抗体可変ドメインの領域を意味する。他の用語としては、「ＩＭＧＴ−ＣＤＲ」（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５〜７７，２００３）及び「Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｓｉｄｕｅ Ｕｓａｇｅ」（ＳＤＲＵ）（Ａｌｍａｇｒｏ，Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２〜１４３，２００４）が挙げられる。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）は、抗原結合部位の標準化番号及び定義を提供する。ＣＤＲ、ＨＶ及びＩＭＧＴ概要説明の対応が、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５〜７７，２００３にて記述されている。

「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」は、抗原結合部位であると定義されたもの以外の可変領域の残りの配列である。フレームワークは典型的に、４つの領域、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４に分けられ、それぞれの可変領域中、３つの抗原結合部位に対する足場を形成する。抗原結合部位が、以上で記述されたような様々な用語によって定義可能であるので、フレームワークの実際のアミノ酸配列は、どのようにして抗原結合部位が定義されたかに依存する。

本明細書で使用するところの用語「定常領域」は、抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）又は抗体重鎖定常領域（ＣＨ）を意味する。重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、抗体は、５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭに割当可能である。ＩｇＡ及びＩｇＧは、イソ型のＩｇＡ₁、ＩｇＡ₂、ＩｇＧ₁、ＩｇＧ₂、ＩｇＧ₃及びＩｇＧ₄へと更に細かく分類される。抗体定常領域の配列はよく公知である。

本明細書で使用するところの用語「二重特異性」は、異なる抗原又は異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する２つの抗原結合部位を含むように遺伝子操作される結合タンパク質を意味する。

本明細書で使用するところの用語「単一特異性」は、結合タンパク質が、それぞれが同一抗原又はエピトープに結合する１つ以上の抗原結合部位を有することを意味する。

本明細書で使用するところの用語「リンカー」又は「ポリペプチドリンカー」は、ペプチド結合によって連結した２つ以上のアミノ酸残基を含むポリペプチドリンカーを意味する。そのようなリンカーポリペプチドが、当該技術分野で公知である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４〜６４４８，１９９３；Ｐｏｌｊａｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１〜１１２３，１９９４を参照のこと）。例示的リンカーには、グリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）、例えば（Ｇ₄Ｓ）₆（配列番号２）のような（Ｇ_xＳ）_n（ｘ＝３〜４、ｙ＝４〜１０）が含まれる。当該技術分野で公知のリンカーは、繋留軽鎖を産するために一緒に２つの軽鎖を操作可能に連結可能である限り、本発明において、任意に選択され、使用されてよい。ペプチドリンカーは、長さにして、約２〜７０アミノ酸、約５〜５０アミノ酸、約１０〜４０アミノ酸又は約２０アミノ酸であってよい。本明細書で使用するところの用語「操作可能に連結した」は、それらの意図する様式において機能するような、成分の位置決めを意味する。リンカーの長さは、形成された結合タンパク質が、少なくとも１つの所定の抗原に結合する能力に関して、重鎖を伴って発現した異なる長さのリンカーによって、操作可能に連結した一連の繋留軽鎖を試験することによって、実験的に決定されてよい。

本明細書で使用するところの用語「特異的に結合する」又は「特異的に結合」は、所定の抗原への、結合タンパク質の結合を意味する。結合の親和力は、解離定数（Ｋ_D）に関して定義される。約１０^-8Ｍ以下のような、約１０^-9Ｍ以下、約１０^-10Ｍ以下、約１０^-11Ｍ以下、約１０^-12Ｍ以下、またはそれ以下のような、Ｋ_Dが約１０^-7Ｍ未満の場合に、結合タンパク質は抗原に特異的に結合し、少なくとも１００倍少ない、例えば少なくとも１，０００倍少ない、少なくとも１０，０００倍少ないような、（ＢＳＡ又はカゼインのような）非特異的抗原に結合するその親和力よりも少なくとも１０倍低いＫ_Dに相当する親和力で、所定の抗原に結合する。二重特異性結合タンパク質は、２つの異なる抗原又はエピトープに特異的に結合する。親和力は、よく公知の方法を用いて、例えば、プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｅｗｅｄｅｎ）を用いるインビトロアッセイにて、測定可能である。

本明細書で使用するところの用語「抗原」は、本発明の結合タンパク質によって認識されるエピトープを意味する。抗原は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質等の部分でありうる。

本明細書で使用するところの用語「Ｋ_D」は、当該技術分野で公知であるような、特定の結合タンパク質−抗原相互作用の解離定数を意味する。

本明細書で使用するところの用語「Ｋ_on」は、当該技術分野で公知なような、抗体／抗原複合体を形成するための、抗原に対する結合タンパク質の結合に対する会合速度定数を意味する。

本明細書で使用するところの用語「Ｋ_off」は、当該技術分野で公知なような、抗体／抗原複合体からの、結合タンパク質の解離に対する解離速度定数を意味する。

本明細書で使用するところの用語「エピトープ」は、結合タンパク質が特異的に結合する抗原の一部を意味する。エピトープは通常、アミノ酸又は多糖類側鎖のような、部位の化学的に活性な（極性、非極性又は疎水性などの）表面グルーピングからなり、特定の３次元構造特性及び特定の帯電特性を有しうる。エピトープは事実上直鎖状であってもよく、又はアミノ酸の直線状の配列ではなく、抗原の連続していないアミノ酸間の空間的な関係によって形成される不連続エピトープ（例えば、立体構造エピトープ）であってもよい。立体構造エピトープには、抗原の直線状配列の異なる部分のアミノ酸同士が３次元空間で近接するような抗原の折り畳みによって生じるエピトープが含まれる。

本明細書で使用するところの用語「実質的に同一」は、比較されている２つのポリペプチド配列が、同一であるか、ポリペプチドの結合特性において変化とならない置換を有することを意味する。典型的に、これには、同様の電荷、疎水性又は立体化学特性を有するアミノ酸、又はアラニンでの１つ以上のアミノ酸置換が含まれる。機能保存的アミノ酸置換が、当業者によって決定され、試験されうる。アミノ酸置換の例を表１に示す。

本発明は、少なくとも１つの抗原に特異的に結合する結合タンパク質を提供し、したがって治療及び診断適用にて広く使用可能である。本発明は、遺伝子操作を受けた繋留軽鎖を、重鎖と共発現させて、高い親和力で、少なくとも１つの所定の抗原に結合する機能的な結合タンパク質を形成可能である、という発見に基づいて居る。本発明の結合タンパク質は、二重特異性であるように遺伝子操作し、発現及び精製プロトコールを促進し、収率を改善する一方で、Ｆｃエフェクタ機能を維持することが可能である。

本発明は、本発明の結合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド、又はその相補的な核酸、ベクター、宿主細胞及びそれらを作製し、使用する方法を提供する。

繋留軽鎖を含む結合タンパク質
図１は、繋留軽鎖を含む結合タンパク質の様々なデザインを示している。

抗体ドメインが、以下のように、本明細書で引用される。
ｉ．ＶＬ１：第一軽鎖可変領域
ｉｉ．ＶＬ２：第二軽鎖可変領域
ｉｉｉ．ＣＬ：軽鎖定常領域
ｉｖ．ＶＨ１：第一重鎖可変領域
ｖ．ＶＨ２：第二重鎖可変領域
ｖｉ．ＣＨ：重鎖定常領域

引用したリンカーはポリペプチドリンカーである。

本発明の結合タンパク質の抗原結合部位は、ＶＬ１／ＶＨ１及びＶＬ２／ＶＨ２対によって形成される。２つの対が同一又は異なる抗原に結合し、結果として単一特異性又は二重特異性結合タンパク質となりうる。

１つの実施形態において、本発明の結合タンパク質は、繋留軽鎖、第一重鎖及び第二重鎖を含み、ここで結合タンパク質は少なくとも１つの抗原に特異的に結合する。

他の実施形態において、結合タンパク質は、ＶＬ１−ＣＬ−リンカー−ＶＬ２−ＣＬを含む繋留軽鎖と、ＶＨ１−ＣＨを含む第一重鎖と、ＶＨ２−ＣＨを含む第二重鎖と、を含む。

他の実施形態において、本発明の結合タンパク質は、裏返繋留軽鎖、第一裏返重鎖及び第二裏返重鎖を含み、そこで結合タンパク質は、少なくとも１つの抗原に特異的に結合する。

他の実施形態において、結合タンパク質は、ＶＨ１−ＣＬ−リンカー−ＶＨ２−ＣＬを含む裏返繋留軽鎖と、ＶＬ１−ＣＨを含む第一裏返重鎖と、ＶＬ２−ＣＨを含む第二裏返重鎖と、を含む。

本発明の結合タンパク質の裏返繋留軽鎖及び裏返重鎖を可変ドメイン交換を用いて作製可能であり、そこで可変ドメインは典型的に、抗原に特異的に結合する抗体に由来する（Ｓｉｍｏｎ ａｎｄ Ｒａｊｅｗｓｋｙ，ＥＭＢＯ Ｊ ９：１０５１〜１０５６，１９９０を参照のこと）。

他の実施形態において、本発明の結合タンパク質には、ＶＨ１−ＣＬ−リンカー−ＶＨ２−ＣＬを含む裏返繋留軽鎖と、ＶＬ１−ＣＨを含む第一裏返重鎖と、ＶＬ２−ＣＨを含む第二裏返重鎖とが含まれ、そこで結合タンパク質は二重特異性である。

本発明の二重特異性結合タンパク質の裏返繋留軽鎖及び裏返重鎖は、可変ドメイン交換を用いて産出可能であり、そこで可変ドメインは典型的に、異なる抗原にそれぞれ特異的に結合する２つの抗体に由来する（Ｓｉｍｏｎ ａｎｄ Ｒａｊｅｗｓｋｙ，ＥＭＢＯ Ｊ ９：１０５１〜１０５６，１９９０を参照のこと）。裏返繋留軽鎖を作製するための可変ドメイン交換を用いた二重特異性結合分子の産出が、異なる抗原特異性がタンデムで加えられ、単一組換え体タンパク質として発現可能な、高い特異性の軽鎖分子を産出するための新規のアプローチを提示する。例示的二重特異性結合タンパク質において、ＶＬ１及びＶＨ１は、第一抗原に特異的に結合する抗体から由来し、ＶＬ２及びＶＨ２は、第二抗原に特異的に結合する抗体から由来する。他の例示二重特異性結合タンパク質において、裏返繋留軽鎖は、それぞれ異なる抗原に特異的に結合する第一及び第二抗体から由来したＶＨ１及びＶＨ２を含み、そこで第一及び第二裏返重鎖中のＶＬ１及びＶＬ２ドメインは、同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を有し、すなわちＶＬ１及びＶＬ２は、第一抗原に特異的に結合する第一抗体から由来する。多くの抗体、例えばＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）（Ｖｏｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２３：１６１０〜１６１４，２００９）は、主にそれらの重鎖を通して抗原に結合する。繋留裏返軽鎖を作製することにより、第一抗原に特異的に結合する第一抗体の重鎖可変領域特異性と、第二抗原に特異的に結合する第二抗体が、裏返繋留軽鎖内に移入されることが許容され、１つの裏返重鎖のみが、共発現及び結合特異性の維持に必要であるような、従来の抗体と同様の様式にて、本発明の二重特異性結合タンパク質の発現及び精製が許容される。

２つの軽鎖を繋留するために使用可能な例示リンカーは、ポリグリシン又はグリシン及びセリンを含むリンカーである。新規な連結した融合ポリペプチドへとポリペプチドを連結するための、天然に存在する、並びに人工的なペプチドリンカーの利用が、当該技術分野で公知である（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：５２６０〜５２６８，１９８９； Ａｌｆｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：７２５〜７３１，１９９５； Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＆ Ｓａｕｅｒ，Ｂｉｏｃｈｍｉｓｔｒｙ ３５：１０９〜１１６，１９９６；米国特許第５，８５６，４５６号）。例示的リンカーは、（Ｇ₄Ｓ）₄（配列番号１）、（Ｇ₄Ｓ）₆（配列番号２）、（Ｇ₄Ｓ）₈（配列番号３）及び（Ｇ₄Ｓ）₁₀（配列番号４）である。

本発明の結合タンパク質の可変領域は、キメラ、ヒト化、ヒト適応又はヒト可変領域のような、ヒト、ウサギ、マウス又はラットのような任意の哺乳動物又は齧歯類可変領域であってよい。

繋留軽鎖定常領域（ＣＬ）は、ヒト、ウサギ、マウス又はラットのような、任意の哺乳動物又は齧歯類定常領域でありうる。例示的軽鎖定常領域は、ヒトＣλ（配列番号５）及びＣλ（配列番号６）である。

本発明の例示結合タンパク質中の重鎖は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡまたはＩｇＭイソ型のものであってよい。例示重鎖定常領域（ＣＨ）は、ヒト、ウサギ、マウス又はラットのような、任意の哺乳動物又は齧歯類定常領域から由来してよい。例えば、有用なヒト重鎖定常領域は、ＩｇＧ１（配列番号７）、ＩｇＧ２（配列番号８）又はＩｇＧ４（配列番号９）型のものである。

本発明の結合タンパク質は、糖付加、異性化、脱グリコシル化、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部位の付加（ペグ化）及び脂質化のような天然には発生しない共有結合性修飾のような工程によって翻訳後修飾されうる。このような修飾は、インビボ又はインビトロで行われてもよい。例えば、本発明の結合タンパク質を、それらの薬物動態特性を改善するために、ポリエチレングリコールに接合させてよい（ＰＥＧ化）。接合は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば治療的抗体のＰＥＧとの接合が、機能を干渉することなしに、薬物動態を増強することが示されて来た（Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８７：３８２〜３９０，２０００；Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ １５：４０９〜４１８，２００４；Ｌｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １６：１０６〜１１９，２００１；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１６：７６１〜７７０，２００３）。

本発明の結合タンパク質は、当業者に公知の技術によって、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食作用（（ＡＤＣＰ）及び／又は補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）のような、それらのＦｃ仲介エフェクタ機能に対して最適化可能である。「Ｆｃ」は、よく公知の用語であり、抗体のパパイン開裂に基づいて定義される。Ｆｃ遺伝子改変のための重鎖残基中の好適な置換が、当該技術分野で公知である（概略について、Ｓｔｒｏｈｌ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：６８５〜９１，２００９を参照のこと）。

本発明の結合タンパク質を作製する方法
本発明の結合タンパク質は、鋳型として望む抗原に結合する既存の抗体を用い、標準の分子生物学技術を用いて遺伝子操作することによって産出可能である。ＰＣＲ法を使用し、続いて標準クローニングを使用して、繋留軽鎖及び重鎖を産出可能である。繋留軽鎖及び重鎖をコードしている核酸を、同一又は異なる発現ベクター内に挿入し、シグナル配列、プロモーター、エンハンサー及び転写終結配列のような制御配列に操作可能に連結させる（Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１００２９〜１００３２，１９８９、国際特許第９０／０７８６１号、Ｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，１１４９，１９９１を参照のこと）。

本発明の１つの実施形態は、裏返繋留軽鎖、第一裏返重鎖及び第二裏返重鎖を含む第一抗原と第二抗原とに結合する二重特異性結合タンパク質を作製する方法であり、
ａ）第一軽鎖可変領域（ＶＬ１）と、第一軽鎖定常領域（ＣＬ１）と、を含む第一軽鎖と、第一重鎖可変領域（ＶＨ１）と第一重鎖定常領域（ＣＨ１）とを含む第一重鎖、を有する第一抗原に結合する抗体を提供することと、
ｂ）第二軽鎖可変領域（ＶＬ２）と第二軽鎖定常領域（ＣＬ２）とを含む第二軽鎖と、第二重鎖可変領域（ＶＨ２）と第二重鎖定常領域（ＶＣ２）とを含む第二重鎖と、を有する第二抗原に結合する抗体を提供することと、
ｃ）リンカーを提供することと、
ｄ）Ｎ−末端からＣ−末端まで、ＶＨ１−ＣＬ１−リンカー−ＶＨ２−ＣＬ２を操作可能に連結して、裏返繋留軽鎖を産出することと、
ｅ）Ｎ−末端からＣ−末端まで、ＶＬ１−ＣＨ１を操作可能に連結して、第一裏返重鎖を産出することと、
ｆ）Ｎ−末端からＣ−末端まで、ＶＬ２−ＣＨ２を操作可能に連結して、第二裏返重鎖を産出することと、
ｇ）裏返繋留軽鎖、第一裏返重鎖及び第二裏返重鎖を発現させることと、
ｈ）二重特異性結合タンパク質を回収すること、とを含む。

本発明の結合タンパク質の繋留軽鎖及び重鎖可変領域は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７，１９７５のハイブリドーマ法によって作製された抗体から由来してよい。非ヒトドナー免疫グロブリンから由来したＣＤＲと、１つ以上のヒト免疫グロブリンから由来したフレームワークを有するヒト適応ｍＡｂから由来する可変領域を、米国特許第５，２２５，５３９にて開示されたような、当業者に公知の技術によって調製可能である。ヒト適応に有用なヒトフレームワーク配列は当業者であれば関連するデータベースから選別することができる。ヒト適応ｍＡｂは任意に、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８６：１００２９〜１００３２，１９８９及びＨｏｄｇｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：４２１，１９９１にて開示されたもののような技術によって、結合親和力を保存するために、改変したフレームワーク支持残基を組み込むことによってさらに改変可能である。

完全ヒト抗体から由来した可変領域を、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６〜８５９，１９９４；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５〜８５１，１９９６；及びＭｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６〜１５６，１９９７にて参照される技術によって、ヒト免疫グロブリントランスジェニックマウスから調製可能である。完全ヒト抗体もまた、例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７〜８６，２０００；およびＫｒｅｂｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５４：６７〜８４ ２００１；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３９７：３８５〜９６，２０１０にて参照された技術によって、ファージディスプレイライブラリから調製及び最適化可能である。

本発明の結合タンパク質の可変領域はまた、リボソームディスプレイ（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９０２２〜６，１９９４）及びバクテリアディスプレイ（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，７９：４９６〜５０３，２００２）を用いて、抗体ライブラリーから誘導可能でもある。

本発明の結合タンパク質を、例えばクロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティ及びサイズカラムクロマトグラフィー）によって、免疫グロブリン分子を精製するために使用される標準法によって精製してよい。本発明の結合タンパク質又はそのフラグメントを、精製を促進するために、本明細書で記述した、又は当該技術分野で公知の異種ポリペプチド配列に融合可能である。

抗原に対する本発明の結合タンパク質の親和力を、任意の好適な方法を用いて実験的に決定可能である（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）、及び本明細書で記述した方法を参照のこと）。特定の結合タンパク質−抗原相互作用の測定された親和力は、異なる条件（例えば、容量オスモル濃度、ｐＨ）下で測定したときに様々であり得る。したがって、親和力及び他の抗原結合パラメータ（例えば、Ｋ_D、Ｋ_on、Ｋ_off）の測定は、結合タンパク質と抗原の標準化溶液、本明細書で記述した緩衝液のような、標準化緩衝液にて好ましく実施される。

ポリヌクレオチド、ベクター及び宿主細胞
本発明は、インビトロ転写／翻訳のために使用される直鎖ＤＮＡ配列、その組成物の真核、原核、又はフィラメントファージ発現、分泌及び／又はディスプレイと適合するベクターを含む、単離ポリヌクレオチドとして、又は発現ベクターの一部として、又は直鎖ＤＮＡ配列の一部として、本発明の結合タンパク質をコードしている核酸を提供する。特定の例示ポリヌクレオチドが本明細書で開示されるが、しかしながら、所与の発現システム中の遺伝コードの縮退又はコドン選好を考えたときに、本発明の結合タンパク質をコードする他のポリヌクレオチドが、また本発明の範囲内である。

本発明のポリヌクレオチドは、自動化ポリヌクレオチドシンセサイザー上での固相ポリヌクレオチド合成のような化学合成によって産出して良く、一本鎖又は二本鎖分子へとにアセンブリしてよい。別の方法としては、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲに続いて慣用的なクローニングを行うなどの他の手法により製造され得る。所与の公知の配列のポリヌクレオチドを製造する、又は得るための手法は、当該技術分野において公知である。

本発明のポリヌクレオチドは、プロモーター又はエンハンサー配列、イントロン、ポリアデニル化シグナルなどのような、少なくとも１つの非コード配列を含んでよい。ポリヌクレオチド配列はまた、タンパク質の精製又は検出を促進するために、例えばマーカー、又はヘキサヒスチジン又はＨＡタグのようなタグ配列を、又はシグナル配列をコードする更なるアミノ酸をコードしているさらなる配列を含んでもよい。

例示的ポリヌクレオチドには、ＣＭＶプロモーターに対する配列、シグナル配列、及び本発明の結合タンパク質の裏返繋留軽鎖又は裏返重鎖をコードしている配列、ＳＶ４０ポリアデニル化部位、及び細菌の複製起点（ｏｒｉ）が含まれる。

本発明の別の実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを少なくとも１つ含むベクターである。こうしたベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現ベクター、トランスポゾンに基づいたベクター、又は任意の手段によって特定の生物又は遺伝子的バックグラウンドに本発明のポリヌクレオチドを導入するのに適した他の任意のベクターであってよい。かかるベクターは、かかるベクターによってコードされるポリペプチドの発現を制御、調整、誘発、又は許容することができる核酸配列要素を含む発現ベクターであってもよい。このような要素は、転写エンハンサー結合部位、ＲＮＡポリメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、及び所与の発現システムにおけるコードされたポリペプチドの発現を促進する他の部位を含んでよい。このような発現系は、当該技術分野において公知の、細胞を用いる、又は無細胞の系であってよい。

本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。このような宿主細胞は、真核細胞、細菌細胞、植物細胞又は古細菌細胞であってもよい。真核細胞の例としては、哺乳動物、昆虫、鳥類又は他の動物由来のものが挙げられる。哺乳動物真核細胞としては、ＳＰ２／０（ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳ０（ＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ），Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ，ＥＣＡＣＣ Ｎｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６４６）及びＡｇ６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８０）マウス細胞株などのハイブリドーマ又はミエローマなどの不死化細胞株が挙げられる。ヒト骨髄腫細胞株の一例としては、Ｕ２６６（ＡＴＴＣ ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）が挙げられる。他の有用な細胞株としては、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−６１）又はＤＧ４４又はＨｅｋ２９３細胞株のようなチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株が挙げられる。

本発明の結合タンパク質の利用
本明細書で記述し、以上で記述したいずれかの方法によって産出された結合タンパク質の組成物を、ヒト疾患の症状、又は細胞、組織、器官、体液又は一般に宿主中の特定の病理を診断、モニタ、調節、処置、緩和、発生の防止補助、または減少させるために使用してよい。特定の目的のために遺伝子操作された結合タンパク質を、免疫仲介、又は免疫欠損疾患、代謝疾患、心血管障害又は疾患、悪性疾患、精神障害又は疾患、細菌、バクテリア又は寄生虫感染のような感染、又は腫脹、痛み、及び組織壊死又は線維化を含む他の公知の、又は特定の関連状態を処置するために使用してよい。

そのような方法には、有効量の、抗原に特異的に結合する少なくとも１つの結合タンパク質を含む、組成物又は医薬組成物を、症状、効果又は機構におけるそのような調節、処置、緩和、防止又は減少を必要としている細胞、組織、器官、動物又は患者に投与することが含まれうる。有効量は、本明細書に記載のように、又は関連分野で公知のように、公知の方法を用いて行い決定するとき、単回（例えば、ボーラス）、複数回、若しくは持続投与あたり約０．００１〜５００ｍｇ／ｋｇの量、又は単回、複数回、若しくは持続投与あたり血清濃度が０．０１〜５０００μｇ／ｍＬの血清濃度を達成する量、又はこの中の任意の有効範囲若しくは値を含んでよい。

本発明の結合タンパク質を含む医薬組成物
治療的利用のために、抗原に特異的に結合する結合タンパク質を、薬理学的に許容可能な担体中、活性成分として、有効量の結合タンパク質を含む医薬組成物として調製してよい。用語「担体」は、活性化合物と共に投与される希釈剤、助剤、賦形剤、又はビヒクルのことを指す。かかるビヒクルは、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油等の、石油、動物、植物、又は合成物由来のものを含む、水及び油等の液体であってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを使用することができる。これらの溶液は滅菌液であり、一般的に、粒子状物質を含まない。これらは、従来の公知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することができる。組成物は、ｐＨ調節及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤などのような、生理的条件に近くするために必要な、薬理学的に許容可能な補助物質を含んでよい。そのような薬理学的処方中の本発明の結合タンパク質の濃度は、広く様々であり、すなわち、約０．５重量％未満、通常少なくとも約１重量％から、１５又は２０重量％まででありえ、選択された特定の投与様式にしたがって、必要な用量、流体体積、粘度などに主に基づいて選択されるであろう。他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む、好適なビヒクル及び処方が、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ ２００６，Ｐａｒｔ ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｐ ６９１〜１０９２（とりわけｐｐ．９５８〜９８９を参照のこと）にて記述される。

本発明の結合タンパク質の治療的利用のための投与様式は、当該技術分野で公知のように、錠剤、カプセル、溶液、粉末、ゲル、粒子中の処方を用いて、そしてシリンジ、移植デバイス、浸透圧性ポンプ、マイクロポンプ、又は当業者によって理解される他の方法を用いて、非経口投与、例えば皮膚内、筋肉内、腹腔内、静脈内又は皮下、肺、経粘膜（経口、経鼻、経膣、直腸）のような薬剤を宿主に送達する任意の好適な経路であってよい。部位特異的投与は、例えば、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、血管内、膀胱内、病巣内、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮送達によって達成され得る。

本発明は一般論として記述されてきているが、本発明の実施形態は、特許請求の範囲を限定するように解釈されるべきではない以下の実施例で更に開示される。

材料と方法
クローニングと発現
重及び軽鎖を、標準法を用いてクローン化した。裏返繋留軽鎖を作製するために、抗原に特異的に結合する抗体の重鎖可変領域を、Ｉｇκ定常領域上に操作可能に連結した。裏返重鎖を作製するために、抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域を、ヒトＩｇＧ１定常領域上に操作可能に連結した。繋留裏返軽鎖を、種々の長さの（Ｇ₄Ｓ）リンカーを介して、２つの裏返軽鎖を操作可能に連結することによって作製して、ＶＨ−Ｉｇκ−リンカー−Ｉｇκポリペプチドを作製した。

ＶＨ及びＶＬドメインのための鋳型として使用された抗体は、（米国特許出願公開第２０１２−００９３８３３Ａ１号にて記述された）抗ヒトオンコスタチンＭ抗体ＯＳＭＭ５５及びＯＳＭＭ６９、（米国特許出願第１３／３９８８８１号にて記述された）抗ヒト組織因子抗体ＴＦ７Ｍ１６及びＴＦ７Ｍ５８、及び抗マウス組織因子抗体ＭＴＦＭ２７であった。

Ｈｅｋ２９３−Ｆ細胞に、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）Ｍａｘトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ＃ １６４４７）を用いて産出された構造物を一過性にトランスフェクトし、発現した抗体を、タンパク質ＡとＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００サイズ排除カラムを用いて、４日間培養の後に、培地から精製した。モノマーピークに相当する画分を回収し、プールした。精製したタンパク質の量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び解析サイズ排除ＨＰＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣシステム）によって査定した。精製したタンパク質を、アッセイを実施するまで、４℃にて保存した。

タンパク質の精製
精製を、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣクロマトグラフィーシステムを用いて実施した。一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−Ｆ細胞からの細胞上清を、トランスフェクション後４日で回収し、遠心（３０分間、６０００ｒｐｍ）によって清澄化し、濾過（０．２μｍ ＰＥＳ膜、Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）した。１〜２Ｌスケールにてトランスフェクトした試料を、Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅコンセントレーター（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）を用いて１０倍に濃縮した。濃縮した試料をついで、１×ＰＢＳの最終濃度まで、１０×ＰＢＳで希釈し、再び０．２μＭ濾過した。希釈した上清を、約１０ｍｇタンパク質／ｍｌ樹脂の相対濃度にて、平衡化（ＰＢＳ、ｐＨ ７）ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｗａｕｋｅｓｈａ、ＷＩ）上にロードした。ローディング後、カラムをＰＢＳ、ｐＨ７にて洗浄し、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ ３．５の１０×カラム体積で溶出した。タンパク質画分を、１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０の添加によって中和した。ピーク画分をプールし、濃縮し、ＰＢＳ、ｐＨ ７．２で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００サイズ排除カラム上にロードした。モノマーピークに相当する画分を回収し、プールした。精製したタンパク質の量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３）と解析サイズ排除ＨＰＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣシステム）によって査定した。精製したタンパク質を、アッセイを実施するまで、４℃にて保存した。

ビアコア解析
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて親和力測定を、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００光バイオセンサ（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて実施した。回収したデータを、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア、バージョン３．２（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて処理した。データの動態解析を、グローバルフィットでの１：１結合モデルを用いて実施した。それぞれのｍＡｂの結果を、Ｋａ（会合速度）、Ｋｄ（解離速度）、及びＫ_D（親和力定数）の形で報告した。

抗ＯＳＭ抗体およそ９，０００ＲＵ（応答ユニット）／ウェルの抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｃａｔ＃１０９−００５−０９８）を、製造業者取扱説明書にしたがって、ＣＭ−５チップ（ビアコア、Ｃａｔ＃ＢＲ−１０００−１４）のカルボキシメチル化デキストラン表面に固定化した。動態実験を、ランニング緩衝液（ＤＰＢＳ＋０．００５％Ｐ２０＋３ｍＭ ＥＤＴＡ＋１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中、２５℃にて実施した。２５ｎＭ〜０．３９１ｎＭのヒトＯＳＭ ＥＣＤ（配列番号１０）の連続希釈をランニング緩衝液中で調製した。約５０〜７０ＲＵのｍＡｂを、センサーチップのフローセル２〜４上で捕獲した。フローセル１は、参照表面として用いた。ｍＡｂの捕獲後、５０μｍ／分にて、抗原の３分間注入（会合相）と、２０〜１２０分間の緩衝液フロー（解離相）を続けた。チップ表面を、５０μＬ／分にて、１００ｍＭ Ｈ₃ＰＯ₄（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃ ７９６１）の１８秒間の第二注入の２パルスによって再生した。

抗組織因子抗体およそ１９，０００ＲＵ（応答ユニット）の抗ＩｇＧ Ｆｃ抗体（抗マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ ｃａｔ＃３１５−００５−０４６）と抗ヒト（Ｊａｃｋｓｏｎ ｃａｔ＃１０９−００５−０９８）の混合物）を、ＣＭ−５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｃａｔ＃ＢＲ−１０００−１４）のカルボキシメチル化デキストラン表面に固定化した。動態実験を、ランニング緩衝液（ＤＰＢＳ＋０．００５％Ｐ２０＋３ｍＭ ＥＤＴＡ＋１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中、３７℃にて実施した。９００ｎＭ〜０．４１２ｎＭのヒトＴＦ ＥＣＤ（配列番号１１）及びマウスＴＦ ＥＣＤ（配列番号１２）の連続希釈をランニング緩衝液中で調製した。約２００〜３００ＲＵのｍＡｂを、センサーチップのフローセル２〜４上で捕獲した。フローセル１は、参照表面として用いた。ｍＡｂの捕獲後、５０μｍ／分にて、抗原の３分間注入（会合相）と、１０分間の緩衝液フロー（解離相）を続けた。チップ表面を、上記のように再生した。

抗体の二重特異性機能を、それぞれ５分間、３００ｎＭヒトＴＦ ＥＣＤ及びマウスＴＦ ＥＣＤの連続注入を用いて試験した。チップ表面を、上記のように再生した。あるいは、アッセイを、その上に約９００ＲＵのビオチン化ヒトＴＦ ＥＣＤを捕獲した、ストレプトアビジンセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｃａｔ＃ ＢＲ−１０００−３２）を用いて実施した。抗原の捕獲の後、ｍＡｂ（３００ｎＭ）の５分間注入と、マウスＴＦ ＥＣＤの５分間注入を続けた。チップ表面を、上記のように再生した。

親和力測定のために、成熟ヒトのヒトオンコスタチンＭ（ｈＯＳＭ）ポリペプチド（配列番号１０）、ヒト組織因子（ｈＴＦ）ポリペプチド（配列番号１１）又はマウス組織因子（ｍＴＦ）ポリペプチド（配列番号１２）を使用した。

実施例１．繋留軽鎖結合タンパク質
抗オンコスタチンＭ抗体ＯＳＭＭ５５から由来した２つのＯＳＭＬ１８６軽鎖を、同一の抗体から由来した重鎖ＯＳＭＨ１４と共発現及びアセンブリされるように、伸張、不定形リンカーを介して、一緒に繋留して、機能的結合タンパク質を形成した。同様に、抗オンコスタチンＭ抗体ＯＳＭＭ６９からの２つのＯＳＭＬ１７８軽鎖を一緒に繋留し、同一の抗体から由来した重鎖ＯＳＭＨ１７と共発現させた。４つの異なる長さのリンカー（Ｇ₄Ｓ）₄（配列番号１）（Ｇ₄Ｓ）₆（配列番号２）、（Ｇ₄Ｓ）₈（配列番号３）及び（Ｇ₄Ｓ）₁₀（配列番号４）を、それぞれの繋留軽鎖に関して、繋留されていない軽鎖を有する親抗体と比較して、最適な抗体アセンブリ（より高い次元の「ポリマー」の欠如）、結合及び機能を促進するその能力に関して試験した。表２は、作製された結合タンパク質と、それらの軽鎖及び重鎖起源を示している。繋留軽鎖は、ヒトＩｇｋのものであり、重鎖はヒトＩｇＧ１型のものである。得られた結合タンパク質を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて解析し、それらの結合親和力をＢｉａｃｏｒｅを用いて評価した。

Ｌｃ＝軽鎖
Ｈｃ＝重鎖
ＴＬｃ＝繋留軽鎖

ＯＳＭに特異的に結合する発現した繋留軽鎖の大部分は、単量体形態である。リンカー長は、オリゴマーよりもモノマーを形成する傾向にあり、（Ｇ₄Ｓ）₆リンカーを有する繋留軽鎖は結果として、もっとも高い程度の単量体モノクローナル抗体となった。繋留軽鎖ＯＳＭ結合タンパク質は、可変領域が由来する抗体と比較した時に、同様の親和力を保持した。

実施例２．裏返及び裏返繋留軽鎖含有結合タンパク質
裏返軽鎖及び重鎖、及び裏返繋留軽鎖を作製し、それより可変領域が由来した親抗体と比較した時に、機能的結合タンパク質へのそれらのアセンブリと、それらの特徴の保持を評価した。

裏返抗体を、Ｖ領域交換、例えば親抗体の重鎖及び軽鎖間でのＶＬとＶＨ領域の交換によって作製した。

例えば、結合タンパク質ＢＩＳＭ７を、親抗体重鎖のＶＨ領域（ＴＦ７Ｈ１６ＶＨ）を、親抗体軽鎖のＶＬ領域（ＴＦ７Ｌ２ＶＬ）で置換することによって作製して、裏返重鎖を形成し、親抗体軽鎖のＶＬ領域（ＴＦ７Ｌ２ＶＬ）を、親抗体のＶＨ領域（ＴＦ７Ｈ１６ＶＨ）で置換して、裏返軽鎖を作製した。

繋留裏返軽鎖を、（Ｇ₄Ｓ）₆リンカーを介して、２つの同一の裏返軽鎖を操作可能に連結することによって作製した。作製された裏返軽鎖又は裏返繋留軽鎖及び裏返重鎖を、表４にて示した対として共発現させ、ヒト組織因子（ｈＴＦ）に対する精製した結合タンパク質の親和力をＢｉａｃｏｒｅを用いて測定した（表５）。良好に発現した裏返鎖と裏返繋留軽鎖を有する両方の結合タンパク質が、単量体形状で単離され、親抗体と比較した時に、同様の親和力を維持した。

^*マウス組織因子に対して結合する
ＮＢ＝結合なし

実施例３．二重特異性裏返繋留軽鎖結合タンパク質
二重特異性結合タンパク質を、異なる抗原特異性を有する２つの裏返可変領域を有する繋留裏返軽鎖を裏返重鎖と共発現することによって作製した。抗マウス組織因子抗体ＭＴＦＭ２７が、マウス組織因子に特異的に結合するが、ヒトオルソログには交差せず、抗ヒトＴＦ抗体ＴＦ７Ｍ５８は、ヒトＴＦに特異的に結合するが、マウスＴＦには結合を示さない。繋留裏返二重特異性軽鎖を、ＭＴＦＭ２７ ＶＨドメインを、ヒトＣκに、ＴＦ７Ｍ５８ ＶＨドメインをヒトＣκに操作可能に連結することによって作製し、２つの裏返軽鎖を、（Ｇ，₄Ｓ）₆リンカーを用いて操作可能に連結した。親抗体ＭＴＦＭ２７とＴＦ７Ｍ５８は、同一の軽鎖（ＴＦ７Ｌ２）を共有し、したがって１つの裏返重鎖のみを、抗体ＴＦ７Ｍ５８のＶＬを、ヒトＩｇＧ１定常領域に結合することによって作製した。作製した軽鎖及び重鎖を共発現させ、得られた二重特異性結合タンパク質（ＴＦ７Ｍ１６６８、表４）を、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて、ヒト及びマウス組織因子に対するそれらの結合親和力に関して解析した。表５は、ヒト及びマウスＴＦに対する結合タンパク質の親和力を示している。

配列表

Claims (18)

1. 少なくとも１つの抗原に特異的に結合する、繋留軽鎖と、第一重鎖と、第二重鎖と、を含む結合タンパク質であって、
   前記繋留軽鎖が、裏返繋留軽鎖であって、前記第一重鎖が、第一裏返重鎖であって、前記第二重鎖が第二裏返重鎖であり、
   前記裏返繋留軽鎖がＶＨ１−ＣＬ−リンカー−ＶＨ２−ＣＬを含み、前記第一裏返繋留重鎖がＶＬ１−ＣＨを含み、前記第二裏返繋留重鎖がＶＬ２−ＣＨを含み、
   ｉ）ＶＬ１が第一軽鎖可変領域であって、
   ｉｉ）ＶＬ２が第二軽鎖可変領域であって、
   ｉｉｉ）ＣＬが軽鎖定常領域であって、
   ｉｖ）ＶＨ１が第一重鎖可変領域であって、
   ｖ）ＶＨ２が第二重鎖可変領域であって、
   ｖｉ）ＣＨが重鎖定常領域であって、
   ｖｉｉ）リンカーが、（Ｇ ₄ Ｓ） ₄ （配列番号１）、（Ｇ ₄ Ｓ） ₆ （配列番号２）、（Ｇ ₄ Ｓ） ₈ （配列番号３）、又は（Ｇ ₄ Ｓ） ₁₀ （配列番号４）である、
   前記結合タンパク質。
2. ＶＬ１及びＶＬ２が、同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の結合タンパク質。
3. 二重特異性である、請求項１に記載の結合タンパク質。
4. ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＨ１及びＶＨ２が、ヒト、ヒト化又は齧歯類ポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の結合タンパク質。
5. ＣＬがカッパ（κ）又はラムダ（λ）型のものであり、ＣＨが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４型のものである、請求項１に記載の結合タンパク質。
6. ＣＬ及びＣＨが、ヒト由来のものである、請求項１に記載の結合タンパク質。
7. 前記結合タンパク質が、大きくて１０^-9の解離定数（Ｋ_D）にて、少なくとも１つの抗原と結合する、請求項１に記載の結合タンパク質。
8. 前記結合タンパク質が、少なくとも１０⁴Ｍ^-1ｓ^-1の会合速度定数（Ｋｏｎ）にて、少なくとも１つの抗原に結合する、請求項１に記載の結合タンパク質。
9. 前記結合タンパク質が、大きくて１０^-4ｓ^-1の解離速度定数（Ｋｏｆｆ）にて、少なくとも１つの抗原に結合する、請求項１に記載の結合タンパク質。
10. 宿主細胞を、結合タンパク質を産出するのに十分な条件下で培養することを含む方法にしたがって産出された結合タンパク質であって、該宿主細胞が、少なくとも１つのベクターを含み、該少なくとも１つのベクターが、繋留軽鎖、第一重鎖及び第二重鎖をコードしている核酸を含む、請求項１に記載の結合タンパク質。
11. 請求項１に記載の結合タンパク質をコードしている単離ポリヌクレオチド。
12. 請求項１１に記載の単離ポリヌクレオチドを含むベクター。
13. 請求項１２に記載のベクターを含む宿主細胞。
14. 前記結合タンパク質を産出するのに十分な条件下、請求項１３に記載の宿主細胞を培養することを含む、請求項１に記載の結合タンパク質を作製する方法。
15. 裏返繋留軽鎖と、第一裏返重鎖と、第二裏返重鎖を含む、第一抗原と、第二抗原とに結合する二重特異性結合タンパク質を作製する方法であって、
    ａ）第一軽鎖可変領域（ＶＬ１）と、第一軽鎖定常領域（ＣＬ１）と、を含む第一軽鎖と、第一重鎖可変領域（ＶＨ１）と第一重鎖定常領域（ＣＨ１）とを含む第一重鎖、を有する第一抗原に結合する抗体を提供することと、
    ｂ）第二軽鎖可変領域（ＶＬ２）と第二軽鎖定常領域（ＣＬ２）とを含む第二軽鎖と、第二重鎖可変領域（ＶＨ２）と第二重鎖定常領域（ＶＣ２）とを含む第二重鎖と、を有する第二抗原に結合する抗体を提供することと、
    ｃ）リンカーを提供することと、
    ｄ）Ｎ−末端からＣ−末端まで、ＶＨ１−ＣＬ１−リンカー−ＶＨ２−ＣＬ２を操作可能に連結して、裏返繋留軽鎖を産出することと、
    ｅ）Ｎ−末端からＣ−末端まで、ＶＬ１−ＣＨ１を操作可能に連結して、第一裏返重鎖を産出することと、
    ｆ）Ｎ−末端からＣ−末端まで、ＶＬ２−ＣＨ２を操作可能に連結して、第二裏返重鎖を産出することと、
    ｇ）裏返繋留軽鎖、第一裏返重鎖及び第二裏返重鎖を発現させることと、
    ｈ）二重特異性結合タンパク質を回収すること、を含み、
    前記リンカーが、（Ｇ ₄ Ｓ） ₄ （配列番号１）、（Ｇ ₄ Ｓ） ₆ （配列番号２）、（Ｇ ₄ Ｓ） ₈ （配列番号３）、又は（Ｇ ₄ Ｓ） ₁₀ （配列番号４）である、
    前記方法。
16. ＶＬ１とＶＬ２が、同一のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の方法。
17. 請求項１５に記載の方法によって産出された二重特異性結合タンパク質。
18. 請求項１の結合タンパク質と、薬理学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。

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