BRPI0900276B1

BRPI0900276B1 - PROCESSO DE PURIFICAÇÃO DE IMUNOGLOBULINA G (IgG) A PARTIR DO SORO OU PLASMA HUMANO POR CROMATOGRAFIA EM GEL (OMEGA)-AMINOHEXIL-AGAROSE OU (OMEGA)-AMINODECIL- AGAROSE

Info

Publication number: BRPI0900276B1
Application number: BRPI0900276-6A
Authority: BR
Inventors: Maria Cristiane Martins De Souza; Igor Tadeu Lazzarotto Bresolin; Iara Rocha Antunes Pereira; Everson Alves Miranda; Sonia Maria Alves Bueno
Original assignee: Universidade Estadual De Campinas - Unicamp
Priority date: 2009-02-06
Filing date: 2009-02-06
Publication date: 2019-07-30
Also published as: BRPI0900276A2

Abstract

processo de purificação de imunoglobulina g (lgg) a partir do soro ou plasma humano por cromatografia em gel <sym>-aminohexil-agarose ou <sym>-aminodecil-agarose. o invento descreve um processo de purificação de imunoglobulina g (lgg) a partir do soro ou plasma humano por cromatografia negativa em gel co-aminohexil-agarose ou u-aminodecil-agarose. lgg com alto grau de pureza é obtida por cromatografia negativa realizando-se o seguinte procedimento: alimentação da coluna cromatográfica contendo o gel o-aminohexil-agarose ou n-aminodecil-agarose com soro ou plasma "in natura" ou diluído em tampão; lavagem da coluna com tampão e coleta das frações cromatográficas referentes às etapas de injeção e lavagem pois nestas frações encontra-se a lgg purificada; eluição com tampão de alta força iônica das proteínas adsorvidas na coluna cromatográfica, podendo-se utilizar esta fração para purificação de outras proteínas do soro ou plasma; regeneração da coluna com solução de hidróxido de sódio. as frações cromatográficas obtidas das etapas de alimentação e lavagem fornecem lgg com alto grau de pureza.

Description

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a um processo de purificação de imunoglobulina G (IgG), a partir de soluções brutas de soro ou de plasma sanguíneo humano ou animal, que resulta um alto grau de pureza. Este processo pode também ser utilizado para isolar IgG a partir de frações que contenham IgG produzidas durante o fracionamento de plasma sanguíneo humano, de soluções de sobrenadante de cultura celular de hibridomas contendo IgG monoclonal, de soluções de IgG obtidas a partir de extratos vegetais, ou a partir de outras fontes, produzidos pela tecnologia do DNA recombinante em células microbianas, animais, vegetais e em animais, leite e plantas transgênicas.

Fundamentos da Invenção

A imunoglobulina G (IgG), também denominada de anticorpo, é uma proteína sanguínea com papel importante na resposta imune humana e animal em reconhecer agentes estranhos ao organismo, ou seja, é uma proteína de defesa produzida nos últimos estágios da resposta imune. A IgG possui massa molecular de 150 kDa, sendo composta de duas cadeias leves (massa molecular de 25 kDa cada) e duas cadeias pesadas (massa molecular de 50 kDa cada) e pertence a um grupo relacionado a glicoproteínas (Holt et al.,

2003) .

A IgG pode ser obtida a partir do plasma ou soro sanguíneo humano ou animal ou pode também ser produzida através da tecnologia de hibridomas linhagens celulares produzidas pela fusão de mieloma com um linfócito (anticorpos monoclonais) e da tecnologia do DNA recombinante (Roque et al.,

2004) .

Petição 870190055810, de 17/06/2019, pág. 4/11 /28

Relatório Descritivo de Patente de Invenção “PROCESSO DE PURIFICAÇÃO DE IMUNOGLOBULINA G (IgG) A PARTIR DO SORO OU PLASMA HUMANO POR CROMATOGRAFIA EM GEL ωAMINOHEXIL-AGAROSE OU ω-AMINODECIL-AGAROSE”

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a um processo de purificação de imunoglobulina G (IgG), a partir de soluções brutas de soro ou de plasma sangüíneo humano ou animal, que resulta um alto grau de pureza. Este processo pode também ser utilizado para isolar IgG a partir de frações que contenham IgG produzidas durante o fracionamento de plasma sanguíneo humano, de soluções de sobrenadante de cultura celular de hibridomas contendo IgG monoclonal, de soluções de IgG obtidas a partir de extratos vegetais, ou a partir de outras fontes, produzidos pela tecnologia do DNA recombinante em células microbianas, animais, vegetais e em animais, leite e plantas transgênicas.

Fundamentos da Invenção

2003) .

2004) .

2/28

Cerca de 28 milhões de litros de plasma humano são fracionados, por ano, no mundo para obtenção de hemoderivados de importância médicofarmacêutica (Burnouf, 2007). Estes hemoderivados são obtidos a fim de suprir as necessidades de proteínas terapêuticas provenientes do plasma, especialmente albumina (cerca de 200 Kg/milhão de habitantes/ano), de fatores de coagulação sanguínea (cerca de 2,3 UI (Unidade lnternacional)/habitante/ano) e de imunoglobulina G (IgG) (cerca de 15 Kg/milhão de habitantes/ano) (Hemoderivados, 2006).

A IgG é um produto chave dentre os hemoderivados provenientes do fracionamento do plasma humano, decorrente da sua crescente demanda em aplicações terapêuticas, tais como de imunodeficiências congênitas ou adquiridas (por ex., AIDS), de tratamento de deficiências seletivas de anticorpos (por ex., inflamações crônicas), de tratamento de doenças autoimunes (por ex., púrpura trombocitopênica idiopática), de tratamento de alguns tipos de câncer (por ex., leucemia linfocítica crônica) (Bernard et al., 1990, Kempf et al., 2007). Essas doenças requerem grandes doses de IgG para o seu tratamento, podendo chegar a várias gramas por paciente por ano (Bernard et al., 1990, Kempf et al., 2007). Como a demanda de imunoglobulinas é alta, os países que não as produzem em larga escala necessitam importá-las (Hemoderivados, 2006).

Além das aplicações terapêuticas, a IgG (policlonal ou monoclonal) é uma proteína muito utilizada em kits de diagnósticos (Lu et al., 1996, Borjesson et al., 2004) e como ligante em cromatografia de imunoafinidade para purificação de proteínas e antígenos (Muronetz e Korpela, 2003). Para todas as aplicações descritas, é de suma importância a IgG com grau de pureza elevado.

A purificação da IgG humana consiste da separação desta proteína de outras constituintes do plasma ou do soro humano. A albumina (Alb) é a mais abundante das proteínas do plasma ou soro (45 mg/mL), seguida da IgG (8 a 18 mg/mL) (Andrade e Hlady, 1987). A IgG presente no plasma ou soro

3/28 humano ou no plasma ou soro animal é policlonal, contendo anticorpos de especificidades muito diferentes.

Existem vários processos para isolamento da IgG humana, mas o mais empregado é o método descrito por Cohn et al. (1946) (fracionamento com etanol) ou este método com modificações (por exemplo, fracionamento com etanol seguido por cromatografia de troca iônica e filtração em gel) (Tanaka et al., 1998; Tanaka et al., 2000; Burnouf, 2007).

A combinação entre a técnica de precipitação tradicional do plasma por etanol seguida de métodos cromatográficos tem sido utilizada pelas indústrias de hemoderivados para isolar IgG e outras proteínas terapêuticas do plasma. Técnicas cromatográficas inseridas no processo de purificação após a precipitação com etanol fazem com que a IgG seja obtida com um grau de pureza mais elevado (segundo a ANVISA, D.O.U. - Diário Oficial da União; Poder Executivo, de 19 de maio de 2000, a IgG intramuscular deve apresentar pureza de 90% e a IgG endovenosa de 95%), pois são responsáveis por remover proteínas ou substâncias contaminantes que causam efeitos colaterais, além de eliminar produtos químicos empregados para a inativação viral da solução de IgG (Burnouf, 1995; Tanaka et al., 1998; Tanaka et al., 2000; Burnouf e Radosevich, 2001; Burnouf, 2007). Tais processos são baseados em técnicas envolvendo cromatografia de troca iônica (catiônica e aniônica), e como estes adsorventes não apresentam alta seletividade, necessita-se de etapas adicionais para eliminação dos contaminantes. Por exemplo, a cromatografia de permeação em gel é utilizada para obter-se, no final do processo, IgG com alto grau de pureza (Tanaka et al., 1998; Tanaka et al., 2000; Burnouf e Radosevich, 2001). As várias etapas de purificação requeridas para aumento do grau de pureza da IgG diminuem o rendimento e aumentam o custo e o tempo do processo de purificação.

Quando IgG (policlonal ou monoclonal) é destinada para fins laboratoriais ou diagnóstico, a sua purificação tem sido realizada sem prétratamento do soro humano ou animal (soro bruto diluído em tampão) ou do sobrenadante de cultura celular de hibridomas (IgG monoclonal) por

4/28 cromatografia de afinidade, na maioria das vezes, com proteínas A ou G imobilizadas.

Proteína A é um receptor Fc bacteriano encontrado na superfície da parede celular, ou secretado pela maioria das linhagens de Staphylococcus aureus e a proteína G é extraída da parede celular de um grupo de bactérias G Streptococus. As proteínas A e G são capazes de ligar-se à região Fc de IgG humana e de vários animais, no entanto, com reatividades diferentes (Boyle e Reis, 1987). A cromatografia utilizando proteínas A ou G como ligante de afinidade é um método bem conhecido para purificação de IgG, apresentando alta especificidade (Boyle et al., 1993). Apesar da maioria dos estudos realizados no âmbito de purificação de IgG empregando proteínas A ou G terem se mostrado promissores, há restrições quanto a utilização destes ligantes. O alto custo limita sua utilização, além de requererem condições de baixo pH para a eluição da IgG adsorvida, provocando, em alguns casos, inativação desta, ou seja, a perda da sua atividade biológica. Além disso, as proteínas A e G apresentam outros inconvenientes, tais como toxicidade em caso de desprendimento da matriz cromatográfica, perda da atividade biológica com o tempo de utilização (acarretando em perda da capacidade do adsorvente) e a possibilidade de contaminação bacteriana durante a estocagem do adsorvente (Füglistaller, 1989; Blank et al., 2001). A proteína A apresenta ainda a restrição de não adsorver a subclasse 3 de IgG humana, a subclasse 1 de rato, vaca e ovelha e as subclasses 2a e 2b de rato (Boyle et al, 1993). Os géis ω-aminohexil-agarose e ω-aminodecil-agarose permitem a purificação de todas as subclasses de IgG, no entanto, purifica as imunoglobulinas G de ponto isoelétrico entre 7,0 a 9,5.

Breve Descrição da Invenção

A presente invenção compreende, um processo de purificação de IgG com alto grau de pureza, a partir da utilização de adsorventes de baixo custo para minimizar o número de etapas, e eliminar problemas da técnica de cromatografia de afinidade tais como perda da capacidade do adsorvente com o tempo de utilização, toxicidade em caso de desprendimento do ligante da

5/28 matriz cromatográfica, perda da atividade biológica da IgG devido a eluição realizada em valores de baixo pH, estocagem do adsorvente com menor possibilidade de contaminação bacteriana. Além disso, elimina-se com este processo a combinação de técnicas de precipitação com etanol e cromatografia de troca-iônica, fornecendo um novo processo de purificação de IgG com bom rendimento, baixo custo e/ou alto grau de pureza. Empregam-se, para isso, adsorventes com ligantes não biológicos imobilizados.

A presente invenção se baseia no processo de obtenção da IgG com alto grau de pureza purificando-a a partir de soluções de soro ou do plasma sanguíneo pela técnica de cromatografia negativa em géis de agarose com poliaminas imobilizadas. A cromatografia negativa, utilizada em nível laboratorial por vários pesquisadores para purificação de diversas biomoléculas, é uma técnica na qual a molécula de interesse é recuperada com alta pureza nas etapas de alimentação e lavagem da coluna, enquanto as demais permanecem retidas na coluna cromatográfica (Petsch et al., 1998; Pitiot et al., 2001)

Como resultado deste processo, é obtida uma solução de IgG com alto grau de pureza, na maioria dos casos acima 90%, e com rendimentos de processo variando de 20 a 93%. A principal vantagem da invenção está na obtenção de IgG com alto grau de pureza em uma única etapa, sem a necessidade de pré-tratamento do soro ou do plasma sanguíneo ou de soluções de sobrenadante de cultura celular de hibridomas ou de soluções de extratos vegetais. Além disso, faz-se uso de adsorventes de baixo custo, com ligantes não biológicos imobilizados (poliaminas como ω-aminodecil, ωaminohexil ou as outras citadas anteriormente). Estes adsorventes podem ser regenerados após o procedimento cromatográfico e ser utilizados por muitos ciclos de purificação de IgG, processos não descritos no estado da técnica. Breve descrição das Figuras

A Figura 1(a) mostra o perfil cromatográfico da purificação de IgG humana a partir do soro humano por cromatografia negativa em gel ωaminodecil-agarose em Hepes 25 mmol/L, pH 6,8. Volume de alimentação de

6/28

1,5 mL de soro humano diluído vinte vezes (volume final de 30,0 mL). Solução de soro a uma concentração de 3,09 mg/mL de proteína total. Total de proteína total injetada: 92,82 mg. (I) Injeção da amostra; (L) lavagem; (E) eluição; (R) regeneração.

A Figura 1(b) mostra a eletroforese SDS-PAGE a 7,5% sob condições não redutoras das frações de alimentação, lavagem e eluição do experimento de purificação de IgG humana a partir do soro humano em gel ω-aminodecilagarose: Faixas: HMW: marcador de alta massa molecular; 1-30: frações da alimentação; 31-36: frações da lavagem; 65-66: frações da eluição; M: marcador de IgG humana (Aventis-Behring).

A Figura 2(a) mostra o perfil cromatográfico da purificação de IgG humana a partir plasma humano por cromatografia negativa em gel ωaminodecil-agarose, em Mops 25 mmol/L, pH 7,9. Volume do leito: 3,0 mL. Vazão: 0,5 mL/min. Frações coletadas: 1,0 mL. Volume de alimentação de 0,75 mL de plasma humano diluído vinte vezes (volume final de 15,0 mL). Solução de plasma a uma concentração de 3,40 mg/mL de proteína total. Total de proteína total injetada: 51,0 mg. (I) Injeção da amostra; (L) lavagem; (E) eluição; (R) regeneração.

A Figura 2 (b) mostra a eletroforese SDS-PAGE a 7,5%, amostras em condições não-redutoras das frações de alimentação, lavagem, eluição e regeneração do experimento de purificação de IgG humana a partir do plasma humano em gel ω-aminodecil-agarose: Faixas: HMW: marcador de alta massa molecular; 1-15: frações da alimentação; 16-22: frações da lavagem; 40-41: frações da eluição; 42: fração da regeneração; M: marcador de IgG humana (Aventis-Behring).

A Figura 3(a) mostra o perfil cromatográfico da purificação de IgG de coelho a partir de soro de coelho por cromatografia negativa em gel ωaminodecil-agarose em Hepes 25 mmol/L, pH 6,8.. Volume de alimentação de 50 pL de soro de coelho diluído vinte vezes (volume final de 1,0 mL). Solução de soro a uma concentração de 2,70 mg/mL de proteína total. Total de proteína

7/28 total injetada: 2,70 mg. Volume do leito: 2,0 mL. (I) Injeção da amostra; (L) lavagem; (E) eluição; (R) regeneração.

A Figura 3(b) mostra a eletroforese SDS-PAGE a 7,5% sob condições não redutoras das frações de alimentação, lavagem e de eluição do experimento de purificação de IgG de coelho a partir de soro de coelho em gel ω-aminodecil-agarose. Faixas: HMW: marcador de alta massa molecular; (I): amostra de injeção; 4-6: frações da lavagem; 10-11: frações de eluição; 20: fração de regeneração; M: marcador de IgG humana (Aventis-Behring).

A Figura 4(a) mostra o perfil cromatográfico da purificação de IgG humana a partir de solução de proteínas de extrato de soja orgânica em ωaminodecil-agarose, em Hepes 25 mmol/L, pH 6,8. Volume do leito: 2,0 mL. Vazão: 0,5 mL/min. Frações coletadas: 1,0 mL. Volume de injeção de 1,0 mL de extrato de soja com “spiking” de 20 pL de IgG humana (concentração de IgG na solução de extrato de soja de 0,91 mg/mL). Total de proteína total injetada: 5,35 mg. (I) injeção da amostra; (L) lavagem; (E) eluição; (R) regeneração.

A Figura 4(b) mostra a eletroforese SDS-PAGE a 7,5% sob condições não-redutoras das frações de injeção, lavagem e eluição do experimento de purificação de IgG humana a partir de solução de proteínas de extrato de soja orgânica em gel ω-aminodecil-agarose. Faixas: HMW: marcador de alta massa molecular; I: amostra de injeção; L: “pool” das frações 3 a 8 da lavagem; E: “pool” das frações 34 a 36 da eluição e R: “pool” das frações 50 a 51 da regeneração; M marcador de IgG (Aventis Behring).

A Figura 4(c) mostra a eletroforese SDS-PAGE a 12,5% sob condições não-redutoras das frações de injeção, lavagem e eluição do experimento de purificação de IgG humana a partir de solução de proteínas de extrato de soja orgânica em gel ω-aminodecil-agarose. Faixas: LMW: marcador de baixa massa molecular; I: amostra de injeção; L: “pool” das frações 3 a 8 da lavagem; E: “pool” das frações 34 a 36 da eluição e R: “pool” das frações 50 a 51 da regeneração.

A Figura 5(a) mostra o perfil cromatográfico da purificação de IgG humana a partir do soro humano por cromatografia negativa em gel ω8/28 aminohexil-agarose em Hepes 25 mmol/L pH 6,8. Volume de alimentação de

1,5 mL de soro humano diluído vinte vezes (volume final de 30,0 mL). Solução de soro a uma concentração de 3,29 mg/mL de proteína total. Total de proteína total injetada: 97,28 mg. (I) injeção da amostra; (L) lavagem; (E) eluição; (R) regeneração.

A Figura 5(b) mostra a eletroforese SDS-PAGE a 7,5% sob condições não redutoras das frações de alimentação, lavagem e da eluição do experimento de purificação de IgG humana a partir do soro humano em gel ωaminohexil-agarose. Faixas: HMW: marcador de alta massa molecular; 6-30: frações de alimentação;31-38: frações da lavagem; 60-62: frações da eluição; R: fração da regeneração; M: marcador de IgG humana (Aventis Behring).

A Figura 6(a) mostra o perfil cromatográfico da purificação de IgG humana a partir plasma humano por cromatografia negativa em ω-aminohexilagarose, em Mops 25 mmol/L, pH 7,9. Volume do leito: 3,0 mL. Vazão: 0,5 mL/min. Frações coletadas: 1,0 mL. Volume de alimentação de 0,75 mL de plasma humano diluído vinte vezes (volume final de 15,0 mL). Solução de plasma a uma concentração de 3,40 mg/mL de proteína total. Total de proteína total injetada: 51,03 mg. (I) Injeção da amostra; (L) lavagem; (E) eluição; (R) regeneração.

A Figura 6(b) mostra a eletroforese SDS-PAGE a 7,5%, sob condições não-redutoras das frações de alimentação, lavagem e eluição do experimento de purificação de IgG humana a partir do plasma humano em gel co-aminohexilagarose. Faixas: HMW: marcador de alta massa molecular; I: amostra de plasma humano; 6-15: frações de alimentação; 16-22: frações de lavagem; 4243: frações de eluição; R: fração de regeneração; M: marcador de IgG humana (Aventis-Behring).

Descrição Detalhada da invenção

Os exemplos aqui descritos tem o intuito somente de exemplificar algumas das inúmeras formas de realização da invenção, e portanto devem ser encarados de forma ilustrativa, e não restritiva.

9/28

A presente invenção refere-se a um processo de purificação de IgG com a utilização de adsorventes de baixo custo. Dentro do âmbito deste invento, o termo imunoglobulina G refere-se a imunoglobulinas G policlonais (origem humana e animal) e monoclonais (provenientes de cultura de células de hibridomas), bem como as obtidas por via da tecnologia do DNA recombinante, produzidas em células microbianas, de inseto, animais ou vegetais ou em plantas transgênicas. E também IgG policlonal adicionada como “skiping” em extrato de grãos de soja.

Os materiais compreendendo IgG a ser purificada incluem, sem limitações, soro e/ou plasma sanguíneo e/ou bruto, sobrenadante de cultura celular (contendo anticorpos monoclonais) ou soluções de extratos vegetais contendo IgG, sendo tais expressões intercambiáveis e com o intuito de designar uma solução compreendendo IgG.

No presente documento a Imunoglobulina G é denominada IgG; Tris(hidroximetil) aminometano é denominado Tris-HCI; Bis[2-hidroxietil]aminotris[hidroximetil]metano é denominado Bis-Tris-HCI; Ácido [3-N-morfolino] propanosulfônico é denominado Mops; Ácido [Ν-2-hidroxietilpiperazina] N’-2etanolsulfônico é denominado Hepes, Ácido [Ν-2-hidroxietilpiperazina] N’-3propanolsulfônico é denominado Hepps; Ácido [2-N-morfolino] etanosulfônico é denominado MES; Ácido [piperazina] N,N’-bis-2-etanosulfônico é denominado Pipes; Fosfato de sódio é denomindo fosfato; acetato de sódio é denominado acetato; 1,4 butanodiol diglicidil éter é denominado bisoxirano; albumina é denominada de Alb e transferrina é denominada de Trf.

O resultado surpreendente obtido pela invenção está na obtenção de IgG com alto grau de pureza em uma única etapa, sem a necessidade de prétratamento do soro ou do plasma sanguíneo, soluções de sobrenadante de cultura celular de hibridomas contendo IgG monoclonal ou de soluções de IgG obtidas a partir de extratos vegetais.

Os géis utilizados no processo de purificação podem ser de agarose reticulada (2, 4 ou 6%) ou não reticulada para uso em equipamentos de baixa ou de média pressão, mas preferencialmente com 4% de reticulação. Gel este

10/28 que pode ser ativado com reagentes de ativação como brometo de cianogênio (CNBr), epicloridrina, bisoxirano, periodato, glutaraldeído, cloreto de tosila ou de tresila ou carbonildiimidazol, mas preferencialmente com bisoxirano (1,4 butanoldiol diglicidil éter). As poliaminas a serem imobilizadas no gel de agarose para atuarem como ligantes da cromatografia negativa podem ser ωaminohexil, ω-aminooctil, ω-aminodecil ou ω-aminododecil, mas preferencialmente ω-aminohexil ou ω-aminodecil. As poliaminas se diferem com relação ao número de carbonos da cadeia alifática, ou seja, 6 carbonos para aminohexil, 8 carbonos para aminooctil, 10 carbonos para aminodecil e 12 carbonos para aminododecil. A interação entre o ligante poliamina e as proteínas do soro ou plasma sanguíneo são do tipo carga-carga ou cargadipolo, podendo ainda ocorrer pontes de hidrogênio e interações hidrofóbicas com a cadeia alifática da poliamina.

Preferencialmente usa-se géis contendo poliaminas com 6 e 10 carbonos, pois as mesmas fornecem um grau de pureza mais elevado e melhor rendimento. A vantagem do uso das poliaminas está na obtenção de IgG com alta pureza em uma única etapa (em geral, com bom rendimento) e, além disso, de obter IgG em pHs em torno do fisiológico, miniminzando a perda de atividade da proteína alvo.

Destaca-se que deve ser observado que a invenção pode ser aplicada a outros anticorpos policlonais e monoclonais, incluindo os obtidos a partir de outras fontes, produzidos pela tecnologia do DNA recombinante em células microbianas, animais, vegetais e em animais, leite e plantas transgênicas.

Processo de purificação de IgG

A cromatografia negativa consiste na passagem de uma solução de alimentação contendo a proteína a separar (neste caso IgG), injetada na coluna cromatográfica, sendo que as moléculas que tem afinidade pelo ligante imobilizado (neste caso as poliaminas aminohexil, aminooctil, aminodecil ou aminododecil) são retidas no adsorvente, enquanto que a proteína alvo (neste caso IgG) passa pela coluna sem ou com pouca interação. A não-retenção da molécula alvo (IgG) durante a etapa de alimentação e lavagem do adsorvente

11/28 (passagem do mesmo tampão utilizado na etapa de alimentação (compreendendo tampões de 10 a 100 mmol/L, preferencialmente a 25 mmol/L, podendo ser utilizado o tampão selecionado dentre: Tris-HCl, Bis-Tris-HCI, Mops, Hepes, Mes, Hepps, Pipes, fosfato e acetato, sendo que o pH depende do tampão utilizado, desde que esteja na sua respectiva faixa tamponante) para eliminação de proteínas presentes nos poros ou retidas no espaço intersticial do gel) representa a principal e única etapa da purificação, na qual a molécula não retida (neste caso a IgG) é eliminada da coluna cromatográfica. Caso as proteínas adsorvidas na coluna sejam produtos de interesse, elas podem ser recuperadas através do enfraquecimento das interações proteínaligante, variando-se as condições do meio através da aplicação de um tampão específico (tampão de dessorção que pode ser o mesmo tampão utilizado na etapa de alimentação acrescido de NaCI, podendo ser utilizado de 100 mmol/L a 1,5 mol/L de NaCI, preferencialmente 1,0 mol/L). Caso as proteínas adsorvidas na coluna não forem produtos de interesse, estes podem ser descartados na etapa de regeneração do adsorvente utilizando-se solução de hidróxido de sódio a 25 ou 50mmol/L.

Na presente tecnologia o processo de purificação de IgG usando adsorvente de baixo custo por cromatografia negativa compreende o seguinte procedimento:

a) Diluir o soro ou plasma sanguíneo com tampão de adsorção (mesmo utilizado para equilibrar a coluna cromatográfica). Pode-se utilizar também soro ou plasma bruto, soluções que contenham IgG obtidas em etapas de fracionamento do plasma por precipitação com etanol. Pode-se ainda usar sobrenadante de cultura celular (contendo anticorpos monoclonais) ou soluções de extratos vegetais contendo IgG;

b) Injetar a solução de soro ou plasma diluído em tampão (sem prétratamento) e lavar com tampão a coluna cromatográfica empacotada com a fase estacionária poliamina-agarose (pode ser utilizado preferencialmente ωaminodecil-agarose ou ω-aminohexil-agarose). Pode-se injetar de 10 a 20

12/28 vezes o volume da coluna com a solução de soro ou plasma diluído em tampão (diluído 5, 10, 20, 30 ou 50 vezes);

c) Coletar as frações cromatográficas referentes à etapa de injeção e lavagem. Nestas frações encontram-se IgG purificada;

d) Eluir as proteínas adsorvidas na fase estacionária com tampão de alta força iônica (elevada concentração de NaCI, podendo ser utilizado de 100 mmol/L a 1,5 mol/L, preferencialmente 1,0 mol/L);

e) Opcionalmente, regenerar a coluna com solução de hidróxido de sódio a 25 ou 50 mmol/L.

O processo de purificação de IgG compreende o uso de uma coluna cromatográfica de baixa ou média pressão disponível comercialmente. A coluna cromatográfica pode ser de plástico, aço ou vidro com dimensões de 5,0 mm a 1,0 m de diâmetro interno e 5 a 200 cm de comprimento, sendo para a presente invenção concretização preferencialmente de 10 mm de diâmetro interno e 10 cm de comprimento. A coluna é utilizada para o empacotamento do adsorvente (fase estacionária). Podem ser utilizados os adsorventes contendo ligantes imobilizados selecionados dos grupo de poliaminas aminohexil, aminooctil, aminodecil e aminododecil, como: ω-aminodecilagarose, ou ω-aminooctil-agarose ou ω-aminohexil-agarose ou ωaminododecil-agarose, para a presente invenção preferencialmente ο ωaminodecil-agarose e o ω-aminohexil-agarose, ambos com grau de reticulação da agarose compreendendo 2 a 6%, preferencialmente 4%, podendo também usar agarose não reticulada. Os géis de agarose podem ser ativados para posterior imobilização da poliamina com reagentes epoxi selecionados dentre: epicloridrina, 1,4 butanodioldiglicidil éter, 1,4 etanodioldiglicidil éter, 1,4 propanodioldiglicidil éter, preferencialmente 1,4 butanodioldiglicidil éter, preferencialmente o 1,4 butanodioldiglicidil éter. Os géis de agarose podem ainda ser ativados com outros reagentes tais como brometo de cianogênio (CNBr), glutaraldeído, periodato, cloreto de tosila ou de tresila ou carbonildiimidazol. Pode-se também, após ativação do gel acoplar covalentemente braços espaçadores compreendendo moléculas com 8 a 14

13/28 átomos, preferencialmente 10 a 12 átomos. Neste presente invento, os adsorventes utilizados tinham espaçadores de 12 átomos e foram adquiridos comercialmente, da marca Sigma-Aldrich (EUA). Estes adsorventes podem, caso se queira ser preparados em laboratório.

Em seguida, a coluna cromatográfica é acoplada a qualquer tipo de sistema cromatográfico de baixa pressão que seja composto de uma bomba peristáltica, um monitor de absorbância a 280 nm, um coletor de frações e um registrador.

Após o acoplamento da coluna cromatográfica no sistema cromatográfico, a mesma deve ser equilibrada com o tampão de adsorção compreendendo 10 a 100 mmol/L, preferencialmente a 25 mmol/L, podendo ser utilizado o tampão selecionado dentre:Tris-HCI (tris(hidroximetil) aminometano), Bis-Tris-HCI (Bis[2-hidroxietil]amino-tris[hidroximetil]metano), Mops (ácido [3-Nmorfolino] propanosulfônico), Hepes (ácido [Ν-2-hidroxietilpiperazina] N’-2etanolsulfônico) Mes (ácido [2-N-morfolino] etanosulfônico), Hepps (ácido [N-2hidroxietilpiperazina] Ν’-3-propanolsulfônico, Pipes (ácido [piperazina] N,N’-bis-

2-etanosulfônico), fosfato de sódio e acetato de sódio, sendo que o pH depende do tampão utilizado, desde que esteja na sua respectiva faixa tamponante. A corrente de saída da coluna é conectada a um monitor de medida de absorbância a 280 nm. Finalizada a etapa de equilíbrio da coluna, o soro ou plasma, diluído de 5 a 50 vezes (por exemplo), preferencialmente vinte vezes no tampão de adsorção, é alimentado na coluna cromatográfica com a uma vazão de cerca de 0,1 a 3,0 mL/min, preferencialmente 0,5 mL/min (correspondente a uma velocidade superficial de 38,2 cm/h). Esta vazão pode ser aumentada ou diminuída, de acordo com a reticulação da agarose utilizada. O volume de alimentação pode ser de 1 a 20 vezes o volume da coluna cromatográfica, preferencialmente 10 vezes o volume da coluna. Durante a alimentação da coluna com soro ou plasma diluído, a solução de saída da coluna contendo IgG purificada é coletada em tubos de ensaio de vidro ou plástico em um coletor de frações. Posteriormente a coluna é lavada, com o mesmo tampão de adsorção, para eliminar a IgG não adsorvida que ficou retida

14/28 fracamente nos interstícios do gel. Essa solução é também coletada em tubos de vidro ou plástico como descrito anteriormente. As demais proteínas do soro ou plasma adsorvidas na fase estacionária podem ser recuperadas, dessorvendo-as pela alimentação da coluna com o tampão de adsorção contendo de 0,1 a 1,5 mol/L de cloreto de sódio (NaCI), preferencialmente 1,0 mol/L. As frações de saída são coletadas em tubos de ensaio em um coletor de frações. Finalmente, a fase estacionária é regenerada com uma solução de NaOH a 10 a 200 mmol/L, preferencialmente 50 mmol/L, seguido pela lavagem com água ultrapura para que a coluna cromatográfica possa ser re-utilizada em um novo ciclo.

Resumindo, o procedimento do processo de purificação de IgG é descrito a seguir:

1) Equilíbrio da coluna cromatográfica com o tampão de adsorção (selecionado dentre os citados anteriormente);

2) Alimentação da solução de soro ou de plasma sangüíneo diluído em tampão de adsorção, ou de soluções de IgG adicionadas como “spiking” em extratos protéicos vegetais, em coluna cromatográfica contendo o gel de agarose com a poliamina imobilizada (preferencialmente ω-aminodecil-agarose ou ω-aminohexil-agarose). Nesta etapa obtém-se IgG com alto grau de pureza;

3) Lavagem da coluna cromatográfica com o tampão de adsorção com o intuito de remover as proteínas fracamente adsorvidas ou presentes nos interstícios do gel. Nesta etapa também obtém-se IgG com alto grau de pureza;

4) Eluição das proteínas adsorvidas (dessorção) por aplicação de tampão contendo alta força iônica (pode-se usar 1,0 mol/L de cloreto de sódio adicionado ao tampão de adsorção);

5) Opcionalmente, regeneração do adsorvente com solução de hidróxido de sódio de 10 a 200 mmol/L, seguida de lavagem da coluna com água ultrapura, para ser utilizado em um novo ciclo.

Para verificar os resultados do processo de purificação, procedimentos analíticos foram realizados. As frações obtidas da cromatografia negativa para purificação de IgG foram analisadas por SDS-PAGE, em gel de poliacrilamida a

15/28

7,5% e 12,5% e sob condições desnaturantes e não redutoras, segundo procedimento de Laemmli (1970) e coloração com nitrato de prata, conforme Morrissey (1981).

As frações cromatográficas foram analisadas por nefelometria visando determinar as quantidades das proteínas IgG, IGA, IgM, albumina (Alb) e transferrina (Trf) humanas, segundo procedimento descrito pelo fabricante do nefelômetro Beckman Array 360 System (Beckman, EUA).

A quatidade de proteína toral presente nas frações cromatográficas e nas amostras de injeção foi determinada pelo método colorimétrico de Bradford (1976), utilizando albumina do soro bovino (BSA) como proteínas de referência.

Exemplo 1

Este exemplo descreve o processo de purificação de IgG policlonal humana a partir do soro humano, por cromatografia negativa em gel ωaminodecil-agarose.

O soro humano foi diluído vinte vezes em tampão Hepes a 25 mmol/L, pH 6,8, denominado de adsorção. A coluna cromatográfica de vidro da marca GE Healthcare, modelo C 10/10 (10 mm de diâmetro interno e 10 cm de altura) foi preenchida com 3,0 mL de gel ω-aminodecil-agarose e, em seguida, o gel foi equilibrado com tampão de adsorção Hepes 25 mmol/L, pH 6,8 a uma vazão de 0,5 mL/min. Um volume de 1,5 mL de soro humano diluído vinte vezes em tampão de adsorção (volume final de 30,0 mL), a uma concentração inicial de 3,09 mg/mL de proteína total, foi alimentado na coluna na mesma vazão. As frações da corrente de saída da coluna referentes à etapa cromatográfica de alimentação foram coletadas em volumes de 1,0 mL em tubos de ensaio.

A lavagem da coluna foi efetuada com o tampão de adsorção e as frações da corrente de saída da coluna referentes à etapa cromatográfica de lavagem também foram coletadas em volumes de 1,0 mL em tubos de ensaio. A eluição das proteínas adsorvidas foi realizada com o mesmo tampão de adsorção, acrescido de 1,0 mol/L de cloreto de sódio (NaCI), mantendo-se o pH ajustado em 6,8. As frações da corrente de saída da coluna referentes à etapa cromatográfica de eluição foram coletadas em volumes de 1,0 mL em tubos de

16/28 ensaio. Os resultados desta cromatografia negativa para purificação de IgG humana em gel ω-aminodecil-agarose e a eletroforese SDS-PAGE para determinação da pureza das frações cromatográficas estão apresentados nas Figuras 1a e 1b.

Realizaram-se análises nefelométricas para determinar a concentração de IgG, IgA (imunoglobulina A), IgM (imunoglobulina M), Alb (albumina) e Trf (transferrina) e calcular a porcentagem de recuperação, pureza e o fator de purificação da IgG das frações cromatográficas coletadas e os resultados estão apresentados na Tabela 1. As análises foram realizadas agrupando-se (“pool”) 10 as frações cromatográficas referentes à purificação de IgG contidas na etapa de alimentação (frações 1-26, eletroforese Figura 1b), “pool” das frações 27-36 referentes as etapas de alimentação e lavagem (eletroforese Figura . 1b) e “pool” das frações da etapa de eluição (frações 65 e 66, Figura 1b).

Tabela 1: Massa de proteínas obtida por nefelometria referente ao “pool” das 15 frações das etapas cromatográficas da purificação de IgG humana a partir do soro humano por cromatografia negativa em gel ω-aminodecil-agarose

Etanas	Proteínas (mg)	Purificação de IgG
	IgG	Alb	Trf	IgA	IgM	PT^a	Pureza¹³ (%)	FP^C
Solução inicial	18,09	54,6	2,95	2,07	2,06	92,82	19,5	1,0
Alimentação (frações 1 a 26) Alimentação +	13,52	n.d	n.d	n.d	n.d	10,65	126,9	6,5
Lavagem	3,26	0,176	0,155	n.d	n.d	3,43	95,1	4,9
(frações 27 a 36)
Eluição	1,22	52,6	2,71	2,02	1,93	75,59	1,6	0,1
Regeneração	-	-	-	-	-	0,41	-	-

^a PT: proteína total, dosagem pelo método de Bradford , 1976.

^b Pureza: razão entre a massa de IgG e a massa de proteína total x 100

17/28 ^c FP: Fator de purificação, razão entre a pureza do material na etapa indicada e a pureza do material injetado *n.d.: abaixo do limite de detecção do aparelho (0,93 mg/dL para IgG, 0,62 mg/dL para Alb, 1,11 mg/dL para IgA, 0,69 mg/dL para IgM e 0,35 mg/dL para Trf).

Neste exemplo é mostrado que a IgG obtida nas frações não retidas de 1 a 26 desta cromatografia foram consideradas eletroforeticamente puras. Tem-se que, do total de IgG alimentada na coluna, 92,7% da IgG foi purificada pela cromatografia negativa com grau de pureza de 98% (baseado nas análises nefelométricas de IgG, IgA, IgM, albumina e transferrina) em gel ωaminodecil-agarose (frações de 1 a 36). Essa porcentagem foi calculada como a razão entre a massa de IgG obtida na etapa de alimentação e lavagem (Tabela 1) e a massa de IgG contida no material inicial injetado vezes 100. Os valores de pureza que constam na Tabela 1 para as frações de alimentação estão acima de 100%, pois o método de Bradford, que é um método utilizado para determinação de proteína total, subestima a concentração de IgG nestas frações, uma vez que elas estão com grau de pureza elevado. O método de Bradford apresenta grande variação de resposta, dependendo da proteína dosada, sendo que para Alb a apresenta a maior sensibilidade (Hammond e Kruger, 1988).

Exemplo 2

Este exemplo descreve o processo de purificação de IgG policlonal humana a partir do plasma humano, por cromatografia negativa em gel ωaminodecil-agarose.

O plasma humano foi diluído vinte vezes em tampão Mops a 25 mmol/L, pH 7,9. Este tampão foi chamado de tampão de adsorção. A coluna cromatográfica de vidro da marca GE Healthcare, modelo C 10/10 (10 mm de diâmetro interno e 10 cm de altura) foi preenchida com 3,0 mL de gel ωaminodecil-agarose e, em seguida, equilibrada com tampão de adsorção Mops a 25 mmol/L, pH 7,9, a uma vazão de 0,5 mL/min. Um volume de 0,75 mL de plasma humano diluído vinte vezes em tampão de adsorção (volume final de 15,0 mL), a uma concentração inicial de 3,40 mg/mL de proteína total, foi alimentado na coluna na mesma vazão. As frações da corrente de saída da

18/28 coluna referentes à etapa cromatográfica de alimentação foram coletadas em volumes de 1,0 mL em tubos de ensaio. A lavagem da coluna foi efetuada com o tampão de adsorção e as frações da corrente de saída da coluna referentes à etapa cromatográfica de lavagem também foram coletadas em volumes de 1,0 5 mL em tubos de ensaio. A eluição das proteínas adsorvidas foi realizada com o mesmo tampão de adsorção, acrescido de 1,0 mol/L de cloreto de sódio (NaCI), mantendo-se o pH ajustado em 7,9. As frações da corrente de saída da coluna referentes à etapa cromatográfica de eluição foram coletadas em volumes de 1,0 mL em tubos de ensaio. Os resultados da cromatografia 10 negativa para purificação de IgG humana em gel ω-aminodecil-agarose e a eletroforese SDS-PAGE para determinação da pureza das frações cromatográficas estão apresentados nas Figuras 2a e 2b e na Tabela 2.

Tabela 2: Massa de proteínas obtida por nefelometria referente ao “pool” das frações das etapas cromatográficas da purificação de IgG humana a partir do 15 plasma por cromatografia negativa em gel ω-aminodecil-agarose em Mops 25 mmol/L pH 7,9.

Etapas	Proteínas (mg)	Purificação de IgG
IgG	Alb	Trf	igA	igM	PT^a	Pureza (%)^b	FP^C
Solução inicial	10,4	29,3	1,65	1,05	1,19	51,0	20,4	1,0
Alimentação (frações
3 a 10)	1,94	n.d*	n.d	n.d	n.d	1,89	102,6	5,0
Alimentação +
Lavagem (frações 11	6,07	n.d	0,32	n.d	n.d	6,57	92,4	4,5
a 22)
Eluição	1,85	28,2	1,31	1,02	1,16	40,4	4,6	0,2
Regeneração	-	-	-	-	-	0,49	-	-

^a PT: Proteína total, dosada pelo método de Bradford, 1976 ^b Pureza: razão entre a massa de IgG e a massa de proteína total x 100

19/28 ^c FP: Fator de purificação, razão entre a pureza do material na etapa indicada e a pureza do material injetado *n.d.: abaixo do limite de detecção do aparelho (0,93 mg/dl_ para IgG, 0,62 mg/dL para Alb, 1,11 mg/dL para IgA, 0,69 mg/dL para IgM e 0,35 mg/dL para Trf).

Neste exemplo é mostrado que a IgG obtida nas frações não retidas de 3 a 10 desta cromatografia foram consideradas eletroforeticamente pura. Temse que, do total de IgG alimentada na coluna, 77% da IgG foi purificada com grau de pureza de 96% (baseado nas análises nefelométricas de IgG, IgA, IgM, albumina e transferrina) pela cromatografia negativa em gel ω-aminodecilagarose a partir do plasma humano (frações de 3 a 22). Essa porcentagem foi calculada como a razão entre a massa de IgG obtida na etapa de alimentação e lavagem (Tabela 2) e a massa de IgG contida no material inicial injetado vezes 100. Os valores de pureza que constam na Tabela 2 para as frações de alimentação estão acima de 100%, pois o método de Bradford, que é um método utilizado para determinação de proteína total, subestima a concentração de IgG nestas frações, uma vez que elas estão com grau de pureza elevado. O método de Bradford apresenta grande variação de resposta, dependendo da proteína dosada (Hammond e Kruger, 1988), sendo que para Alb a apresenta a maior sensibilidade.

Exemplo 3

Este exemplo descreve o processo de purificação de IgG policlonal de coelho a partir do soro de coelho, por cromatografia negativa em gel ωaminodecil-agarose.

O soro de coelho foi diluído vinte vezes em tampão Hepes a 25 mmol/L, pH 6,8. Este tampão foi chamado de tampão de adsorção. A coluna cromatográfica de vidro da marca GE Healthcare, modelo C 10/10 (10 mm de diâmetro interno e 10 cm de altura), foi preenchida com 2,0 mL de gel ωaminodecil-agarose e, em seguida, equilibrada com tampão de adsorção Hepes 25 mmol/L, pH 6,8 a uma vazão de 0,5 mL/min. Um volume de 50 pL de soro de coelho diluído vinte vezes em tampão de adsorção (volume final de 1,0 mL), a uma concentração inicial de 2,70 mg/mL de proteína total, foi alimentada na coluna na mesma vazão. As frações da corrente de saída da coluna

20/28 referentes à etapa cromatográfica de alimentação foram coletadas em volumes de 1,0 mL em tubos de ensaio. A lavagem da coluna foi efetuada com o tampão de adsorção e as frações da corrente de saída da coluna referentes à etapa cromatográfica de lavagem também foram coletadas em volumes de 1,0 mL em tubos de ensaio. A eluição das proteínas adsorvidas foi realizada com o mesmo tampão de adsorção, acrescido de 1,0 mol/L de cloreto de sódio (NaCI), mantendo-se o pH ajustado em 6,8. As frações da corrente de saída da coluna referentes à etapa cromatográfica de eluição foram coletadas em volumes de 1,0 mL em tubos de ensaio. Os resultados da cromatografia negativa para purificação de IgG de coelho em gel ω-aminodecil-agarose e a eletroforese SDS-PAGE para determinação da pureza das frações cromatográficas estão apresentados nas Figuras 3a e 3b e na Tabela 3.

Volume do leito: 2,0 mL. (I) Injeção da amostra; (L) lavagem; (E) eluição; (R) regeneração.

Tabela 3: Massa de proteínas totais referente ao “pool” das frações das etapas cromatográficas da purificação de IgG de coelho a partir de soro de coelho por cromatografia negativa em gel ω-aminodecil-agarose.

Etapas	Proteínas totais³
(mg)	%
Injeção	2,70	100,00
Lavagem	0,04	1,43
Eluição	2,35	86,77
Regeneração	0,06	2,29
Recuperação	2,45	90,49

^a Dosagem pelo método de Bradford , 1976.

Neste exemplo é mostrado que 0,04 mg de IgG de coelho foi purificada pela cromatografia negativa em gel ω-aminodecil-agarose. Essa massa de proteína foi calculada com base na medida de proteína total. A IgG obtida nas frações não retidas de 4 a 6 desta cromatografia foram consideradas eletroforeticamente puras.

Exemplo 4 /28

Este exemplo descreve o processo de purificação de IgG policlonal humana adicionada como “spiking” em extrato protéico de grãos de soja orgânica, por cromatografia negativa em gel ω-aminodecil-agarose.

Os grãos de soja orgânica da marca Jasmine (PR, Brasil), lote 402, foram moldas a seco utilizando um micro moinho de facas (Tecnal TE - 648, Brasil). A farinha de soja foi peneirada utilizando-se a fração passante em peneira de abertura de 0,50 mm. Em seguida, a farinha de soja foi desengordurada utilizando-se hexano (Merck, Alemanha), a 60°C, em aparelho tipo Soxhlet, conforme descrito por Robic (2005). Um volume de 400 mL de hexano foi usado para 100 g de farinha de soja durante 6 horas e a mesma foi retirada do aparelho e deixada no dessecador à temperatura ambiente durante 8 horas para evaporação do hexano. Após o desengorduramento, a extração das proteínas de soja foram efetuadas em um béquer de 250 mL, adicionandose 5,0 g de farinha de soja desengordurada que foram agitados com 100 mL de tampão fosfato de sódio 50 mmol/L pH 7,0 por 30 min, a 20°C. Utilizou-se agitador mecânico modelo Q-251D (IKA Labortechnic, Alemanha) com impelidor do tipo pás inclinadas (4 cm de diâmetro e inclinação de 45°, construído pela Kroma, Brasil) a uma rotação de 500 rpm por 30 min. A suspensão foi centrifugada a 10.000 g por 20 min a 5 °C em uma centrífuga (5804R, Eppendorf, Alemanha). O sobrenadante foi removido, filtrado em membrana com diâmetro de poro de 3 pm (Inlab, Brasil), trocado o tampão para Hepes 25 mmol/L a pH 6,8 e a esta solução foi acrescido IgG humana na concentração de 50 mg/mL (“spiking”).

A coluna cromatográfica de vidro da marca GE Healthcare, modelo C 10/10 (10 mm de diâmetro interno e 10 cm de altura) foi preenchida com 2,0 mL de gel ω-aminodecil-agarose e, em seguida, foi equilibrada com tampão de adsorção Hepes 25 mmol/L, pH 6,8 a uma vazão de 0,5 mL/min. Um volume de 1,0 mL de extrato de grãos de soja orgânica contendo IgG humana policlonal (20 pL de uma solução de IgG a 50 mg/mL) a uma concentração inicial de 5,35 mg/mL de proteína total, foi alimentada na coluna na mesma vazão. As frações da corrente de saída da coluna referentes à etapa cromatográfica de

22/28 alimentação foram coletadas em volumes de 1,0 mL em tubos de ensaio. A lavagem da coluna foi efetuada com o tampão de adsorção e as frações da corrente de saída da coluna referentes à etapa cromatográfica de lavagem também foram coletadas em volumes de 1,0 mL em tubos de ensaio e, posteriormente, agrupadas em um único frasco de vidro, formando um “pool”. A eluição das proteínas adsorvidas foi realizada com o mesmo tampão de adsorção, acrescido de 1,0 mol/L de cloreto de sódio (NaCI), mantendo-se o pH ajustado em 6,8. As frações da corrente de saída da coluna referentes à etapa cromatográfica de eluição foram coletadas em volumes de 1,0 mL em tubos de ensaio. As frações de eluição foram agrupadas em um único frasco de vidro, formando um “pool”. Os resultados da cromatografia negativa para purificação de IgG humana adicionada (“spiking”) em solução protéica de extrato de soja, em gel ω-aminodecil-agarose e as eletroforeses SDS-PAGE para determinação da pureza das frações cromatográficas estão apresentados nas Figuras 4a, 4b e 4c e na Tabela 4.

Tabela 4: Massa de proteínas obtida pelo método de Bradford e nefelometria referente ao “pool” das frações das etapas cromatográficas da purificação de IgG humana a partir de extrato protéico de grãos de soja com “spiking” de IgG humana por cromatografia negativa em gel ω-aminodecil-agarose em Hepes 25 mmol/L pH 6,8.

Etapas	PT^a (mg)	IgG⁶(mg)	M^c %	Pureza^d %
Injeção	5,35	0,91	100,0	17,0
“Pool” das frações 3 a 8 da
Lavagem	0,25	0,24	26,9	95,9
“Pool” das frações 34 a 36 da
Eluição	4,55	0,60	65,7	13,1
Regeneração	-	-	-	-
Recuperação	-	0,84	92,6	-

^a PT: proteína total, massa determinada pelo método de Bradford, 1976 ^b massa determinada por nefelometria

23/28 ^c M: massa de IgG em cada etapa dividida pela massa de IgG inicial no processo x 100 ^d Massa de IgG do “pool”dividida pela massa de proteína total do “pool x 100

Neste exemplo é mostrado que 26,9% da IgG humana foi purificada com grau de pureza de 96% (baseado nas análises nefelométricas de IgG, IgA, IgM, albumina e transferrina) na fração de lavagem pela cromatografia negativa em gel ω-aminodecil-agarose a partir de solução de proteínas de extrato de soja. Essa porcentagem foi calculada como a razão entre a massa de IgG obtida na etapa de alimentação (Tabela 4) e a massa de IgG contida no material inicial injetado vezes 100. A IgG obtida na fração de lavagem desta cromatografia foi considerada eletroforeticamente de alta pureza, podendo ser observado traços de proteína da soja.

Exemplo 5

Este exemplo descreve o processo de purificação de IgG policlonal humana a partir do soro humano, por cromatografia negativa em gel ωaminohexil-agarose.

O soro humano foi diluído vinte vezes em tampão Hepes a 25 mmol/L, pH 6,8. Este tampão foi chamado de tampão de adsorção. A coluna cromatográfica de vidro da marca GE Healthcare, modelo C 10/10 (10 mm de diâmetro interno e 10 cm de altura), foi preenchida com 3,0 mL de gel ωaminohexil-agarose e, em seguida, foi equilibrada com tampão de adsorção Hepes a 25 mmol/L, pH 6,8, a uma vazão de 0,5 mL/min. Um volume de 1,5 mL de soro humano diluído vinte vezes em tampão de adsorção (volume final de 30,0 mL), a uma concentração inicial de 3,29 mg/mL de proteína total, foi alimentada na coluna na mesma vazão. As frações da corrente de saída da coluna referentes à etapa cromatográfica de alimentação foram coletadas em volumes de 1,0 mL em tubos de ensaio. A lavagem da coluna foi efetuada com o tampão de adsorção e as frações da corrente de saída da coluna referentes à etapa cromatográfica de lavagem também foram coletadas em volumes de 1,0 mL em tubos de ensaio. A eluição das proteínas adsorvidas foi realizada com o mesmo tampão de adsorção, acrescido de 1,0 mol/L de cloreto de sódio (NaCI), mantendo-se o pH ajustado em 6,8. As frações da corrente de saída da

24/28 coluna referentes à etapa cromatográfica de eluição foram coletadas em volumes de 1,0 mL em tubos de ensaio. As frações de eluição foram agrupadas em um único frasco de vidro, formando dois “pools”. Os resultados da cromatografia negativa para purificação de IgG humana em gel ω-aminohexilagarose e a eletroforese SDS-PAGE para determinação da pureza das frações cromatográficas estão apresentados nas Figura 5a e 5b e na Tabela 5.

Tabela 5: Massa de proteínas obtida por nefelometria referente ao “pool” das frações das etapas cromatográficas da purificação de IgG humana a partir do soro humano por cromatografia negativa em gel ω-aminohexil-agarose.

Purificação de Proteínas (mg)

IgG

Etapas ----------------------------------------------------_K------Pureza^b

	IgG	Alb	Trf	IgA	IgM	PT^a	(%)	Π T o
Solução inicial	16,53	56,10	3,36	2,14	2,12	97,28	17,0	1,0
Alimentação	10,12	n.d	n.d	n.d	n.d	8,43	120,0	7,1
Lavagem	2,57	n.d	n.d	n.d	n.d	2,08	123,4	7,3
Eluição	3,10	54,90	3,29	2,11	2,10	83,40	3,7	0,2
Regeneração	-	-	-	-	-	0,17	-	-

^a Proteína Total: Dosagem pelo Método de Bradford, 1976.

^b Pureza: Pureza: razão entre a massa de IgG e a massa de proteína total x 100 ^c FP: Fator de purificação, razão entre a pureza do material na etapa indicada e a pureza do material injetado *n.d.: abaixo do limite de detecção do aparelho (0,93 mg/dL para IgG, 0,62 mg/dL para Alb, 1,11 mg/dL para IgA, 0,69 mg/dL para IgM e 0,35 mg/dL para Trf).

Neste exemplo é mostrado que a IgG obtida nas frações não retidas de 1 a 38 desta cromatografia foi considerada eletroforeticamente pura. Tem-se que, do total de IgG alimentada na coluna, 76,8% da IgG foi purificada pela cromatografia negativa com grau de pureza de 100% (baseado nas análises nefelométricas de IgG, IgA, IgM, albumina e transferrina) em gel ωaminohexil-agarose a partir do soro humano. Essa porcentagem foi calculada como a razão entre a massa de IgG obtida nas etapas de alimentação e lavagem (Tabela 5) e a massa de IgG contida no material inicial injetado vezes

25/28

100. Os valores de pureza que constam na Tabela 5 para as frações de alimentação e lavagem estão acima de 100%, pois o método de Bradford, que é um método utilizado para determinação de proteína total, subestima a concentração de IgG nestas frações, uma vez que elas estão com grau de pureza elevado. O método de Bradford apresenta grande variação de resposta, dependendo da proteína dosada, sendo que para Alb a apresenta a maior sensibilidade (Hammond e Kruger, 1988).

Exemplo 6

Este exemplo descreve o processo de purificação de IgG policlonal humana a partir do plasma humano, por cromatografia negativa em gel ωaminohexil-agarose.

O plasma humano foi diluído vinte vezes em tampão Mops a 25 mmol/L, pH 7,9. Este tampão foi chamado de tampão de adsorção. A coluna cromatográfica de vidro da marca GE Healthcare, modelo C 10/10 (10 mm de diâmetro interno e 10 cm de altura) foi preenchida com 3,0 mL de gel ωaminohexil-agarose e, em seguida, foi equilibrada com tampão de adsorção Mops a 25 mmol/L, pH 7,9, a uma vazão de 0,5 mL/min. Um volume de 0,75 mL de plasma humano diluído vinte vezes em tampão de adsorção (volume final de 15,0 mL), a uma concentração inicial de 3,40 mg/mL de proteína total, foi alimentada na coluna na mesma vazão. As frações da corrente de saída da coluna referentes à etapa cromatográfica de alimentação foram coletadas em volumes de 1,0 mL em tubos de ensaio. A lavagem da coluna foi efetuada com o tampão de adsorção e as frações da corrente de saída da coluna referentes à etapa cromatográfica de lavagem também foram coletadas em volumes de 1,0 mL em tubos de ensaio. A eluição das proteínas adsorvidas foi realizada com o mesmo tampão de adsorção, acrescido de 1,0 mol/L de cloreto de sódio (NaCI), mantendo-se o pH ajustado em 7,9. As frações da corrente de saída da coluna referentes à etapa cromatográfica de eluição foram coletadas em volumes de 1,0 mL em tubos de ensaio. As frações de eluição foram agrupadas em um único frasco de vidro, formando dois “pools”. Os resultados da cromatografia negativa para purificação de IgG humana em gel ω-aminohexil

26/28 agarose e a eletroforese SDS-PAGE para determinação da pureza das frações cromatográficas estão apresentados nas Figuras 6a e 6b e na Tabela 6.

Tabela 6: Massa de proteínas obtida por nefelometria referente ao “pool” das frações das etapas cromatográficas da purificação de IgG humana a partir do plasma humano por cromatografia negativa em gel ω-aminohexil-agarose.

Etapas	Proteínas (mg)	Purificação de IgG
IgG	Alb	Trf	IgA	IgM	PT^a	Pureza⁰ (%)	FP^C
Solução	8,07	27,9	1,74	1,00	1,09	51,03	15,8	1,0
inicial
Alimentação	3,08	n.d*	n.d	n.d	n.d	2,49	123,7	7,8
Lavagem	2,51	n.d	n.d	n.d	n.d	2,30	109,0	6,9
Eluição	1,89	25,7	1,64	1,02	1,1	43,95	4,3	0,3
Regeneração	-	-	-	-	-	0,68	-	-
^a PT: Proteína total, dosada pelo método de Bradford, 1976

^b Pureza: Pureza: razão entre a massa de IgG e a massa de proteína total x 100 ^c FP: Fator de purificação, razão entre a pureza do material na etapa indicada e a pureza do material injetado 'n.d.: abaixo do limite de detecção do aparelho (0,93 mg/dl_ para IgG, 0,62 mg/dl_ para Alb, 1,11 mg/dL para IgA, 0,69 mg/dL para IgM e 0,35 mg/dL para Trf).

Neste exemplo é mostrado que, do total de IgG alimentada na coluna cromatográfica, 69,3% da IgG foi purificada pela cromatografia negativa com grau de pureza de 100%(baseado nas análises nefelométricas de IgG, IgA, IgM, albumina e transferrina) em gel ω-aminohexil-agarose a partir do plasma humano. Essa porcentagem foi calculada como a razão entre a massa de IgG obtida na etapa de alimentação e lavagem (Tabela 6) e a massa de IgG contida no material inicial injetado vezes 100. A IgG obtida nas frações não retidas de 6 a 22 desta cromatografia foram consideradas eletroforeticamente de alta pureza, podendo ser observado traços de proteína do plasma. Os valores de pureza que constam na Tabela 6 para as frações de alimentação e lavagem estão acima de 100%, pois o método de Bradford, que é um método utilizado

27/28 para determinação de proteína total, subestima a concentração de IgG nestas frações, uma vez que elas estão com grau de pureza elevado. O método de Bradford apresenta grande variação de resposta, dependendo da proteína dosada, sendo que para Alb a apresenta a maior sensibilidade (Hammond e Kruger, 1988).

Referências

Andrade D.; Hlady V.; Annals New York Academy of Science, 516, 158-172, 1987.

Bernard, J.; Levy, J.P.; Varet, B.; Clauvel, J.P.; Rain, J.D.; Sultan, Y. Hématologie, Masson, Paris, p. 193-267, 1990.

Blank, G.S.; Zapata, G.; Fahrner, R.; Milton, M.; Yedinak, C.; Knudsen, H.; Schmelzer C.; Bioseparation, 10, 65-71, 2001.

Borjesson P.K.E.; Postema E.J.; de Bree R.; Roos J.C.; Leemans C.R.; Kairemo K.J.A.; van Dongen G.A.M.S.; Oral Oncology, 40, 761-772, 2004.

Boyle, M.D.P.; Reis, K.J.; Bio/Technology, 5, 1987.

Bradford, Μ. M.; Analytical Biochem, v. 72, p. 248-254, 1976.

Burnouf, T.; J. Chromatogr B, 664, 3-15, 1995.

Burnouf, T.; Transfusion Medicine Reviews, 27, 101-117, 2007.

Burnouf, T.; Radosevich, M.; Biochem Biophys Methods, 49, 575-586, 2001. Cohn E.J.; Strong L.E.; Hughes Jr W.L.; Mulford D.J.; Ashworth J.N.; Melin M.;

Taylor H.L.; J American Chem Soc, 68, 459-475, 1946.

Fuglistaller, P.; J Immunol Methods, 124, 171-177, 1989.

Hammond, J.B.; Kruger, N.J. The Bradford method for protein quantification. In Methods in Molecular Bioiogy, New Protein Techniques, Vol 3, Walker, J.M. (ed.), Springer Verlag, NY, p. 25-33, 1988.

Hemoderivados, ANBIO, Associação Nacional de Biossegurança, www.anbio.org.br/pdf/2/tr07_hemoderivados.pdf, acessado em agosto 2006.

Holt, L.J.; Herring, C.; Jespers, L.S.; Woolven, B.P.; Tomlinson, I.A., Trends Biotechnol, 21, 484-490, 2003.

Kempf, C.; Stucki, M.; Boschetti, N.; Biologicals, 35, 35-42, 2007.

Laemmli, U.K. Nature, v. 227, p. 680-685, 1970.

28/28

Lu B.; Smyth M.R.; OKennedy R.; Analyst, 121, R29-R32, 1996.

Morrissey, J.H.; Analytical Biochem, v. 117, p. 307-310, 1981.

Muronetz V.I.; Korpela T.; J Chromatogr B, 790, 53-66, 2003.

Petsch, D.; Deckwer, W.D; Anspach, F.B.; Legallais, C., Vijayalakhimi, M.; J 5 Chromatogr B, 707, 1998, 121-130.

Pitiot, O.; Nedonchelle, E.; Legallais, C., Vijayalakshmi, Μ. A., J Chromatogr B, 758, 173-182, 2001.

Robic, G. Soja como biorreator: estudo de extração e purificação de proteína recombinante utilizando β-glucuronidase, Campinas: Faculdade de 10 Engenharia Química, Universidade Estadual de Campinas, 82p. Dissertação (Mestrado), 2005.

Roque, A.C.A.; Lowe, C.R.; Taipa, M.A.; Biotechnol Progress, v. 20, p. 639-654, 2004.

Tanaka K., Sawatani E., Dias G.A., Shigueoka E.M., Campos T.C.X.B., Nakao 15 H.C., Arashiro F.; Braz J Med Bio Res, 33, 27-30, 2000.

Tanaka K., Sawatani E., Shigueoka E.M., Campos T.C.X.B., Nakao H.C., Dias G.A., Fujta R.K., Arashiro F.; Braz J Med Bio Res, 31, 1375-1381, 1998.

Claims

Reivindicações

1. Processo de purificação de imunoglobulina (IgG) caracterizado por compreender as etapas de:

a) Diluir o material compreendendo IgG com tampão de adsorção;

b) Injetar o material diluído em tampão e lavar com tampão a coluna cromatográfica empacotada com a fase estacionária poliamina-agarose, sendo que a poliamina-agarose é selecionada dentre o grupo que compreende (ômega)-aminohexil, (ômega)-aminooctil, (ômega)-aminodecil, (ômega)aminododecil e combinações das mesmas, preferencialmente (ômega)aminohexil e/ou (ômega)-aminodecil.

c) Coletar as frações cromatográficas referentes à etapa de injeção e lavagem;

d) Eluir as proteínas adsorvidas na fase estacionária com tampão de alta força iônica; e
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo material compreendendo IgG ser escolhido do grupo que compreende soro e/ou plasma sanguineo e/ou bruto, sobrenadante de cultura celular, opcionalmente contendo anticorpos monoclonais do tipo IgG, soluções de extratos vegetais e combinações dos mesmos.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo material ser soro e/ou plasma sanguineo.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo tampão de adsorção ser escolhido do grupo que compreende Tris-HCl, BisTris-HCl, Mops, Hepes, Mes, Hepps, Pipes, fosfato e acetato.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela concentração do tampão ser de 10 a 100 mmol/L.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela concentração ser 25 mmol/L.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela diluição do material contendo IgG ser de até 50 vezes.

Petição 870190055810, de 17/06/2019, pág. 5/11

2 / 2
8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela agarose compreender um grau de reticulação de 2 a 6%.
9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo grau de reticulação ser 4%.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela agarose ser não reticulada.
11. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo volume injetado ser de 10 a 20 vezes o volume da coluna cromatográfica empacotada.
12. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo tampão de alta força iônica compreender de 100 mmol/L a 1,5 mol/L.
13. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo tampão compreender aproximadamente 1,0 mol/L.
14. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo tampão ser escolhido do grupo que compreende Tris-HCl, Bis-Tris-HCl, Mops, Hepes, Mes, Hepps, Pipes, fosfato e acetato.
15. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de após a etapa (d) opcionalmente, em uma etapa (e) a coluna ser regenerada com solução de hidróxido de sódio.
16. Processo, de acordo com as reivindicações 1 e 15, caracterizado pelo hidróxido de sódio estar em uma concentração de 25 a 50 mmol/L.