KR20160130495A

KR20160130495A - 인간 혈장 단백질의 제조 방법

Info

Publication number: KR20160130495A
Application number: KR1020167028103A
Authority: KR
Inventors: 다미앙 바뗄; 압데사타르 쉬투루; 파트리끄 상땅비앙
Original assignee: 라보라토이레 프란카이즈 듀 프락티온네먼트 에트 데스 바이오테크놀로지스
Priority date: 2014-03-11
Filing date: 2015-03-10
Publication date: 2016-11-11
Also published as: FR3018450A1; EP3116527B1; ES2759259T3; JP2017508759A; IL247508A0; FR3018450B1; US20170073396A1; EP3116527A1; MX2016011641A; WO2015136217A1; AU2015228649A1; CA2942203A1; TW201620925A; CN106103473A

Abstract

본 발명은 멀티컬럼 크로마토그래피에 의한 혈액 혈장으로부터의 혈장 단백질 농축물의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

인간 혈장 단백질의 제조 방법 {METHOD FOR PREPARING HUMAN PLASMA PROTEINS}

본 발명은 혈액 혈장 또는 혈장 분획으로부터, 치료적 용도를 위한 인간 혈장 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.

수 많은 병리학은 현재 하나 이상의 혈장 단백질이 풍부한 혈액 혈장 분획으로 치료된다. 따라서, 응고 인자는 일반적으로 응고 인자 결함과 연관된 출혈을 예방 또는 치료하기 위한 대체 요법에서 사용된다. 피브리노겐은 가장 종종 선천적 또는 중증 무피브리노겐혈증과 연관된 합병증 및 저피브리노겐혈증과 연관된 출혈 증후군 또는 출혈 위험을 치료하기 위해 처방된다. 알부민은 순환 혈액 부피 (확인된 저혈량증) 을 복귀시키고 유지하게 위해 의도된다. 유사하게는, 수 많은 병리학은 현재, 면역글로불린, 특히 면역글로불린 G (IgG) 가 풍부한, 일반적으로 95% 초과의 Ig 를 포함하는, 혈액 혈장 분획으로 치료된다.

예를 들어, 면역글로불린 G, 또는 IgG 농축물이 풍부한 혈액 혈장 분획은 항체 생성이 부족한 일차적 면역 결핍증, 및 특정 이차적 면역결핍증, 예컨대 백혈병, 골수종 또는 재발성 감염 등을 교정하는데 사용된다. Ig 의 투여는 또한 청소년 및 성인의 특발성 혈소판감소증성 자반병 (ITP), 길랭-바레 (Guillain-Barre) 증후군, 탈수성 (demyelinating) 다발성신경증, 다초점성 운동 신경병증, 만성 염증성 탈수성 (demyelinating) 다발성근신경증 (CIDP), 가와사키 질환 (Kawasaki's disease), 다발성 경화증, 스테로이드-저항성 피부근염, 급성 근무력증, 버드샷 맥락망막염 (Birdshot's retinochoroiditis), 태아-모체 ABO 부적합성으로 인한 신생아 황달 (ABO 부적합성으로 인한 신생아의 용혈성 질환) 등의 치료에 유익한 효과를 가질 수 있다.

복합적 치료적 징후, 및 특정한 경우에서 처방될 수 있는 매우 높은 용량 (2 g 이하의 면역글로불린/kg/일) 은, 유럽과 미국에서, 부족할 정도로, 공급에 대해 극한 스트레스를 산출하였다.

또한, 혈액 혈장으로부터 혈장 단백질을 정제하기 위해 수 많은 방법이 개발되어 왔다. 치료적 용도를 위해 혈장 단백질을 추출하는 것을 가능하게 만드는 산업적 공정은 "혈장 분획화" 라고 불린다. 오늘날 일반적으로 사용되는 분획화 기술은 인자 VIII, 폰 빌레브란트 인자, 피브리노겐 및 피브로넥틴이 풍부한 동결침전물을 단리하기 위해, 혈장을 저온에서 해동시키는 것으로 이루어지는, 동결침전 단계로 시작한다. 상청액 분획 (동결상청액) 의 단백질을 이후 에탄올의 존재 하에서 순차적 침전에 의해 분리시킬 수 있다 (Cohn et al. 1946, J. Am. Chem. Soc. 68, 459).

또한 에탄올 분별법을 사용하는 본래의 Cohn 방법의 여러가지 변형이 기재되어 있다. 따라서, Tanaka K. et al., 2000 에 의한 공개문헌 (Braz J Med Bio Res 2000, 33(1): 27-30) 에는 3 가지 유형의 겔, 2 가지 이온-교환 겔 (Q-Sepharose FF 및 Cm-Sepharose FF) 및 겔 여과 단계 (Sephacryl S-300 HR) 상의 크로마토그래피 분리에 의해, Cohn 방법에 따른 에탄올 분별법 후 수득된 분획 "I+II+II" 및 "II+III" 으로부터 면역글로불린 G 를 정제하기 위한 방법을 기술하고 있다.

에탄올 침전에 대한 대안적인 경로가 옥탄산 (또는 카프릴산/카프릴레이트) 으로의 침전을 사용하는, Steinbuch et al. (Rev. Franc. Et. Clin, and Biol. 1969, XIV, 1054) 에 의해 기재되어 있다. 이것은 혈장으로부터 대부분의 단백질을 침전시키고 상청액 중에 면역글로불린을 보유한다. 상기 면역글로불린의 정제는 음이온-교환 수지, DEAE-셀룰로오스 상의 흡착 ("배치" 내) 에 의해 진행되고, 이것은 또한 상청액 중에 면역글로불린을 남긴다. 이후 면역글로불린은 한외여과에 의해 농축된다.

그러나, 상기 에탄올 또는 카프릴산 침전은 단백질의 특정한 변성 및 단백질 응집체의 형성 (특히 면역글로불린 중합체) 을 야기할 수 있고, 이것은 아나필락시스 반응을 야기할 수 있다. 따라서, 예를 들어 프로피오락톤으로의 또는 환원제 및 알킬화제으로의, 또는 pH 4 에서의, 또는 PEG 로의 후속 진행 단계를 진행하여 응집체를 침전시키는 것이 필수적이다. 상기 부가적인 단계는 혈장 단백질 수율을 감소시키는 경향이 있다.

그러므로, 최대의 제조 방법은 분획화된 혈장 1 리터 당 3.5 내지 5.5 g 의 IgG 사이의 IgG 수율을 주장한다 ("A modified caprylic acid method for manufacturing immunoglobulin G from human plasma with high yield and efficient virus clearance" - Vox Sang. 2006 Feb;90(2):97-104 및 "A new methodology for polyvalent intravenous immunoglobulin solution production with a two-stage process of viral inactivation" - Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences vol. 46, n. 4, Oct./Dec., 2010).

게다가, 에탄올 분별법의 사용은 비교적 비용이 든다. 게다가, 1 리터의 혈장의 분획화는 2 l 의 에탄올의 사용을 필요로 한다. 수 천 리터의 혈장을 처리하기 위해서는, 매우 다량의 에탄올을 제조 부위에 직접 저장하는 것 뿐 아니라, 에탄올 분별법에 전용으로 하는 시스템을 냉각시키는 것이 필수적이다. 게다가, 산업석 설비는 큰 부피의 용매를 저장, 처리, 제거 및 가능하게는 재활용하는데 적합해야만 하고, 이것이 상당한 기술적인 제약 및 비용을 나타낸다.

혈장 단백질의 순도는 사용 동안 이들의 최대 효율 및 안정성을 보장하기 위한 중요한 이슈이다. 따라서, 에탄올 또는 카프릴산 분별법은 원하는 순도를 달성하기 위해 다른 정제 단계가 보완되어야만 하나, 상기 작업은 부가적인 생성물 손실로 인해 수율을 해치로도록 수행된다. 상기 부가적인 단계의 경우, 크로마토그래피 기법이 점점더 자주 사용되고 있는데, 이들이 고 수율과 연결된 높은 정제 정도를 특징으로 하기 때문이다. 따라서 관심의 단백질의 완전성을 보존하면서 수율 및 순도를 개선하기 위해 상기 크로마토그래피 기법을 초기 혈장과 가능한 한 가깝게 위치시키는 것이 유리하다. 이것은 비교적 부족한 혈장 단백질 예컨대 인자 XI, 인자 IX, 인자 VIII, 폰 빌레브란트 인자, 단백질 C, 항트롬빈 III, 등을 포획하기 위해 적용된다. 그러나 풍부한 단백질 예컨대 다원자가 면역글로불린, 알부민 및 피브리노겐의 경우에는, 상기 분자를 포획하는데 필요한 크로마토그래피 겔의 부피가 너무 클 것이고 무익한 산업적 도구 (장치 크기 및 겔 비용) 를 산출할 것이다. 일부는 다량의 단백질의 가공을 위한 크로마토그래피 사이클의 축적을 기술하고 있는 반면 ("Description and assessment of an industrial chromatography unit for preparing human plasma albumin" - Biotechnology of Blood Proteins 1993, vol 227, pp. 176-181), 상기 실시는 최적이 아니며 개발되지 않은 채로 남아있다.

따라서, 최종 생성물이 고 순도를 갖고, 잠재적으로 유해한 오염물이 없는 것을 확보하면서, 치료적 용도를 위한 혈장 단백질, 및 특히 면역글로불린, 알부민 및/또는 피브리노겐의 제조 수율을 증가시키려는 큰 필요성이 있다.

일반적으로, 본 발명은 고 수율, 특히 당업자가 알고있는 방법의 수율보다 큰 수율로, 정제된 인간 혈장 단백질의 분획을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. 이를 위해, 본 출원인은 멀티컬럼 크로마토그래피에 의한, 및 특히 소수성 상호작용 또는 화학적 리간드의 조합 (멀티-모달) 을 통한, 멀티컬럼 친화성 또는 이온-교환 크로마토그래피 또는 멀티컬럼 크로마토그래피에 의한 적어도 하나의 정제 단계를 포함하는, 혈액 혈장으로부터의 정제된 인간 혈장 단백질 농축물의 제조 방법을 개발하였다. 더욱 정확하게는, 본 발명에 따른 방법은 전형적으로 사용되는 크로마토그래피 컬럼을, 연속으로 놓인 또는 독립적으로 통제되는, 여러 개의 보다 작은 컬럼으로 나눔으로써 크로마토그래피 단계 상에서 수행하는 것을 제안한다. 멀티컬럼 크로마토그래피를 시행하는 이러한 단계는 한편으로는, 크로마토그래피 겔 내에 존재하는 작용기를 가능한 최대 정도로 사용하는 것, 및 다른 한편으로는, 혈장 단백질 제조 배치 당 사용하고자 하는 크로마토그래피 겔의 부피를 크게 감소시키는 것을 가능하게 한다.

본 발명은 또한 당업자에게 공지된 방법과 비교하여 더 높은 수율로 인간 면역글로불린 (Ig) 농축물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이를 위해, 본 출원인은 에탄올 및/또는 카프릴산을 사용하는 초기 분별 단계가 멀티컬럼 크로마토그래피를 사용하는, 및 특히 소수성 상호작용 또는 또는 화학적 리간드의 조합 (멀티-모달) 을 통한 멀티컬럼 친화성 또는 이온-교환 크로마토그래피 또는 멀티컬럼 크로마토그래피를 사용하는 포획 단계에 의해 대체되는, 정제된 Ig 를 제조하는 방법을 개발하였다. 침전에 의한 단백질 오염물의 제거 단계가 크로마토그래피 전에 수행되지 않는다. 혈액 혈장 또는 혈액 혈장 동결상청액은 상기 멀티컬럼 크로마토그래피에 직접 적용된다. 멀티컬럼 크로마토그래피가 음이온-교환 크로마토그래피인 경우, 본 발명에 따른 방법은 유리하게는 상기 크로마토그래피 후 카프릴산 및/또는 에탄올로의 분별 단계를 포함할 수 있다.

본 발명은 따라서 혈액 혈장 또는 혈장 분획을 멀티컬럼 크로마토그래피에 적용하는 정제 단계를 포함하는, 혈액 혈장으로부터의 치료적 용도를 위한 정제된 혈장 단백질 농축물의 제조 방법에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 혈장 또는 동결침전된 혈장 상청액을 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피에 적용하는 면역글로불린 정제 단계를 포함하는, 혈액 혈장으로부터의 치료적 용도를 위한 인간 면역글로불린 농축물의 제조 방법에 관한 것이다.

또다른 예시 구현예에서, 면역글로불린 정제 단계는 혈장 또는 동결침전된 혈장 상청액을 멀티컬럼 음이온-교환 크로마토그래피에 적용함으로써 수행한다. 이후 카프릴산으로의 후속 침전 단계를 구상하는 것이 가능하며, 이의 마지막에 면역글로불린을 함유하는 상청액이 수집된다.

본 발명은 또한 혈장 또는 동결침전된 혈장 상청액을 소수성 상호작용 또는 화학적 리간드의 조합 (멀티-모달) 을 통해, 멀티컬럼 크로마토그래피, 및 특히 멀티컬럼 친화성 또는 이온-교환 크로마토그래피 또는 멀티컬럼 크로마토그래피에 적용하는 알부민 및/또는 피브리노겐 정제 단계를 포함하는, 혈액 혈장으로부터의 치료적 용도를 위한 인간 알부민 및/또는 피브리노겐 농축물의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 멀티컬럼 친화성 또는 이온 교환 크로마토그래피는 관심의 단백질 (피브리노겐 및/또는 알부민) 을 포획하고, 이것은 이후 용리되 수 있다. 본 발명의 또다른 특정 구현예에 따르면, 멀티컬럼 친화성 또는 이온-교환 크로마토그래피는 관심의 단백질 (알부민 및/또는 피브리노겐) 을 비-보유된 분획 내에 수집하기 위해 오염물을 포획한다. 본 발명에 따르면, 그러한 방법은 또한 알부민 및/또는 피브리노겐을 함유하는 분획을 침전에 의해 정제 단계에 적용하는 후속적인 부가적인 단계를 포함할 수 있고, 이의 마지막에 오염물이 용액 중에 남아있다.

일반적으로, 본 발명에 따르면, 혈액 혈장으로부터 직접, 또는 동결상청액으로부터, 또는 에탄올 또는 카프릴산 분획으로부터, 임의로 바이러스 안정한, 또는 중간 정제 단계 및 특히 여과로부터, 또다른 크로마토그래피로부터, 또는 멀티컬럼 크로마토그래피, 등으로부터 산출되는 임의의 생성물로부터, 멀티컬럼 크로마토그래피에 의해 치료적 용도를 위한 혈장 단백질의 정제 단계를 진행하는 것이 가능하다.

본 발명의 특정 구현예에서, 동결침전된 혈장 상청액 또는 혈장은 혈장 단백질을 포획하기 위해 첫번째 멀티컬럼 크로마토그래피에 직접 적용한 다음, 상기 크로마토그래피의 비-보유된 분획을 두번째 혈장 단백질을 포획하기 위해 두번째 멀티컬럼 크로마토그래피에 적용한다.

이어서, 두번째 멀티컬럼 크로마토그래피의 비-보유된 분획을 세번째 혈장 단백질을 정제하기 위해 크로마토그래피, 특히 멀티컬럼 크로마토그래피, 또는 침전 단계에 적용할 수 있다.

특정의 예시 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 멀티컬럼 친화성 또는 이온-교환 크로마토그래피에 의한 동결침전된 혈장 상청액의 정제 단계를 포함하고, 임의로 예를 들어 에탄올로의 상기 분획의 침전에 의해, 알부민 및/또는 피브리노겐을 포함하는 분획 내에 존재하는 오염물의 제거 단계가 뒤따르는, 혈액 혈장으로부터의 치료적 용도를 위한 알부민 및/또는 피브리노겐 농축물의 제조 방법으로 이루어진다. 또다른 예시 구현예에서, 소수성 상호작용 또는 화학적 리간드의 조합 (멀티-모달) 을 통한 멀티컬럼 이온-교환 크로마토그래피 또는 멀티컬럼 크로마토그래피에 의한 정제 단계를 면역글로불린-결손된 혈장 분획에서 수행한다. 유리하게는, 알부민 및/또는 피브리노겐 농축물의 제조 방법을 상기 방법의 마지막에 수집된 혈장 분획을 사용하는, 임의로 멀티컬럼 크로마토그래피에 의한 면역글로불린 농축물의 제조 방법을 따라 수행한다.

따라서, 본 발명은 또한 혈액 혈장 또는 동결침전된 혈장 상청액을 이어서 하기에 직접적으로 적용하는 것으로 이루어지는 단계를 포함하는, 혈액 혈장의 분별 방법에 관한 것이다:

- 소수성 상호작용 또는 화학적 리간드의 조합 (멀티-모달) 을 통한 멀티컬럼 이온-교환 크로마토그래피 또는 멀티컬럼 크로마토그래피 (이의 마지막에 면역글로불린을 함유하는 분획이 수집됨); 이후

- 소수성 상호작용 또는 화학적 리간드의 조합 (멀티-모달) 을 통한 멀티컬럼 이온-교환 크로마토그래피 또는 멀티컬럼 크로마토그래피 (이의 마지막에 알부민을 함유하는 분획이 수집됨); 이후

- 소수성 상호작용 또는 화학적 리간드의 조합 (멀티-모달) 을 통한 멀티컬럼 이온-교환 크로마토그래피 또는 멀티컬럼 크로마토그래피 (이의 마지막에 피브리노겐을 함유하는 분획이 수집됨).

3 개 단계의 순서는 단백질 중 하나의 추출이 2 가지 나머지에 대해 필요한 대로 촉진되도록, 임의로 변형될 수 있다.

- 소수성 상호작용 또는 화학적 리간드의 조합 (멀티-모달) 을 통한 멀티컬럼 이온-교환 크로마토그래피 또는 멀티컬럼 크로마토그래피 (이의 마지막에 피브리노겐을 함유하는 분획이 수집됨); 이후

- 소수성 상호작용 또는 화학적 리간드의 조합 (멀티-모달) 을 통한 멀티컬럼 이온-교환 크로마토그래피 또는 멀티컬럼 크로마토그래피 (이의 마지막에 알부민을 함유하는 분획이 수집됨).

따라서 혈장 분획은 3 개의 멀티컬럼 크로마토그래피에 연속으로 적용되며, 이의 마지막에 면역글로불린, 알부민 및 그 다음 피브리노겐이, 또는 또다른 순서로 연속으로 결손된다.

특정의 예시 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 연속으로 하기를 포함하는, 혈액 혈장으로부터의 치료적 용도를 위한 면역글로불린 농축물의 제조 방법으로 이루어진다:

(a) 혈장의 물리화학적 처리, 예컨대 상대적인 독립체의 가능한 조합의 제한 없이, 용매/세제 또는 세제 단독 또는 용매 단독으로의 처리에 의한 첫번째 바이러스 비활성화 또는 제거 단계;

(b) 단계 (a) 로부터 산출되는 비화성화된 혈장의 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피에 의한 동결침전된 혈장 상청액의 정제 단계;

(c) 임의로 단계 (b) 로부터 산출되는 면역글로불린 농축물로부터의, 특히 멀티컬럼 항-A 및 항-B 친화성 크로마토그래피에 의한 항-헤마글루티닌 항체 제거 단계;

(d) 임의로 단계 (b) 또는 (c) 로부터 산출되는 면역글로불린 농축물의 나노여과에 의한 두번째 바이러스 비활성화 또는 제거 단계; 및

(e) 단계 (b), (c) 또는 (d) 로부터 산출되는 면역글로불린 농축물에 대한 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 안정화제의 첨가 단계.

또다른 특정한 예시 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 연속으로 하기를 포함하는, 혈액 혈장으로부터의 치료적 용도를 위한 면역글로불린 농축물의 제조 방법으로 이루어진다:

(a') 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피에 의한 동결침전된 혈장 상청액의 정제 단계;

(b') 단계 (a') 에서 수득되는 면역글로불린 농축물의 세제/용매에 의한 바이러스 비활성화 또는 제거의 첫번째 단계;

(c') 임의로 단계 (b') 로부터 산출되는 면역글로불린 농축물로부터의, 특히 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피에 의한, 항-A 및 항-B 항체 제거 단계;

(d') 임의로 단계 (b') 또는 (c') 로부터 산출되는 면역글로불린 농축물의 나노여과에 의한 두번째 바이러스 비활성화 또는 제거 단계; 및

(e') 단계 (b'), (c') 또는 (d') 로부터 산출되는 면역글로불린 농축물에 대한 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 안정화제의 첨가 단계.

(A) 동결침전된 혈장 상청액의 에탄올 및/또는 카프릴산 분별 단계;

(B) 임의로 단계 (A) 에서 수득된 용액의 용매/세제에 의한 바이러스 비활성화 또는 제거의 첫번째 단계;

(C) 단계 (A) 또는 (B) 에서 수득된 용액의 멀티컬럼 음이온-교환 크로마토그래피에 의한 정제 단계;

(D) 임의로 단계 (C) 의 마지막에 수득된 면역글로불린 농축물로부터의, 특히 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피에 의한, 항-A 및 항-B 항체 제거 단계;

(E) 임의로 단계 (C) 또는 (D) 의 마지막에 수득된 면역글로불린 농축물의 나노여과에 의한 두번째 바이러스 비활성화 또는 제거 단계; 및

(F) 단계 (C), (D) 또는 (E) 로부터 산출되는 면역글로불린 농축물에 대한 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 안정화제의 첨가 단계.

본 발명은 또한 혈액 혈장 또는 동결침전된 혈장 상청액을 하기에 직접적으로 적용하는 것으로 이루어지는 단계를 포함하는, 혈액 혈장의 분별 방법에 관한 것이다:

- 적어도 하나의 친화성 리간드가 면역글로불린에 특이적으로 결합하는 리간드인 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피 (이의 마지막에 면역글로불린을 함유하는 분획이 수집됨); 및/또는

- 임의로 고도로 염 내성인, 혼합-방식 크로마토그래피라고 불리는 소수성 상호작용 또는 화학적 리간드의 조합 (멀티-모달) 을 통한 멀티컬럼 이온-교환 크로마토그래피 또는 멀티컬럼 크로마토그래피 (이의 마지막에 피브리노겐 및/또는 알부민을 함유하는 분획이 수집됨).

- 적어도 하나의 친화성 리간드가 피브리노겐에 특이적으로 결합하는 리간드인 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피 (이의 마지막에 피브리노겐을 함유하는 분획이 수집됨); 및/또는

- 임의로 고도로 염 내성인, 고정된 방식 크로마토그래피라고 불리는 소수성 상호작용 또는 화학적 리간드의 조합 (멀티-모달) 을 통한 멀티컬럼 이온-교환 크로마토그래피 또는 멀티컬럼 크로마토그래피 (이의 마지막에 알부민을 함유하는 분획이 수집됨).

유리하게는, 면역글로불린을 표적하는 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피가 먼저 실행되고, 피브리노겐 및/또는 알부민을 표적하는 멀티컬럼 친화성 및 이온-교환 크로마토그래피 또는 크로마토그래피가 상기 첫번째 분별 단계로부터 산출되고 면역글로불린 유형 G 가 결손된 분획 상에 실행된다. 알부민의 포획을 위한 멀티컬럼 크로마토그래피는 유리하게는 세번째 위치에서 실행될 수 있다.

본 발명은 또한 혈장 중의 면역글로불린 분포 프로파일과 유사하거나 동일한 면역글로불린 분포 프로파일을 갖는 면역글로불린 유형 G 농축물에 관한 것이다.

우선적으로는, 본 발명에 따른 면역글로불린 농축물은 50 내지 70% IgG1, 25 내지 35% IgG2, 2 내지 8% IgG3 및 1 내지 8% IgG4 를 갖는 IgG 면역글로불린 농축물이다.

본 발명은 추가로 혈장의 항원성 레퍼토아와 유사하거나 동일한 항원성 레퍼토아를 갖는 면역글로불린 농축물에 관한 것이다. 우선적으로는, 본 발명에 따른 면역글로불린 농축물은 종래의 농축물의 항원성 레퍼토아와 유사한 및/또는 이보다 우수한 항원성 레퍼토아를 갖는다.

도 1 (도 1A-1D) 은 본 발명에 따른 방법에서 시행되는 바와 같은 멀티컬럼 크로마토그래피의 원리를 도식으로 나타내고;
도 2 는 본 발명에 따른 방법의 시행 예에 따라, 일련의 멀티컬럼 크로마토그래피에 의해 풍부한 혈장 단백질의 연속 정제 단계의 순서를 도식으로 나타내고;
도 3 은 실시예 2, 3 및 4 에서 실시된 멀티컬럼 크로마토그래피의 마지막에 수득된 분획의 코마시 블루 (Coomassie blue) 염색 및 비-환원 조건 하의 SDS-PAGE 젤의 이미지이다.

상세한 설명

정의

"혈장 단백질" 은 본 발명에 따르면 혈액 혈장에 함유된, 임의의 단백질, 및 더욱 특히 산업적 또는 치료적 관심의 임의의 단백질을 의미한다. 혈액 혈장 단백질에는 알부민, 알파/마크로글로불린, 항키모트립신, 항트롬빈, 항트립신, Apo A, Apo B, Apo C, Apo D, Apo E, Apo F, Apo G, 베타 XIIa, C1-억제제, C-반응성 단백질, C7, C1r, C1s, C2 C3, C4, C4bP, C5, C6, C1q, C8, C9, 카르복시펩티다아제 N, 세룰로플라스민, 인자 B, 인자 D, 인자 H, 인자 I, 인자 IX, 인자 V, 인자 VII, 인자 VIIa, 인자 VIII, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 피브리노겐, 피브로넥틴, 합토글로빈, 하에모펙신, 헤파린 조인자 II, 히스티딘 풍부 GP, IgA, IgD, IgE, IgG, ITI, IgM, 키니나아제 II, 키니노겐 HPM, 라이소자임, PAI 2, PAI I, PCI, 플라스민, 플라스민 억제제, 플라스미노겐, 프리알부민, 프리칼리크레인, 프로페르딘, 프로테아제 넥신 INH, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 프로트롬빈, 혈청 아밀로이드 단백질 (SAP), TFPI, 티올-프로테이나아제, 트롬보모듈린, 조직 인자 (TF), TPA, 트랜스코발라민 II, 트랜스코르틴, 트랜스페린, 비트로넥틴, 및 폰 빌레브란트 인자가 포함된다.

특히, 혈장 단백질에는 응고 단백질, 즉, 혈전의 형성을 초래하는 연쇄 반응 캐스케이드에 관여하는 혈장 단백질이 포함된다. 응고 단백질에는 인자 I (피브리노겐), 인자 II (프로트롬빈), 인자 V (프로악셀레린), 인자 VII (프로콘버틴), 인자 VIII (항-혈우병 인자 A), 인자 IX (항-혈우병 인자 B), 인자 X (Stuart 인자), 인자 XI (Rosenthal 인자 또는 PTA), 인자 XII (Hageman 인자), 인자 XIII (피브린 안정화 인자 또는 FSF), PK (프리칼리크레인), HMWK (고 분자량 키니노겐), 인자 III (트롬보플라스틴 또는 조직 인자), 헤파린 조인자 II (HCII), 단백질 C (PC), 트롬보모듈린 (TM), 단백질 S (PS), 폰 빌레브란트 인자 (WF) 및 조직 인자 경로 억제제 (TFPI), 또는 조직 인자가 포함된다.

특정 구현예에서, 혈장 단백질은 효소적 활성을 갖는 응고 단백질로 이루어진다. 효소적 활성을 갖는 응고 단백질에는 인자 II (프로트롬빈), 인자 VII (프로콘버틴), 인자 IX (항-혈우병 인자 B), 인자 X (Stuart 인자), 인자 XI (Rosenthal 인자 또는 PTA), 인자 XII (Hageman 인자), 인자 XIII (피브린 안정화 인자 또는 FSF) 및 PK (프리칼리크레인) 의 활성화된 형태가 포함된다.

본 발명의 문맥에서, 용어 "인간 면역글로불린" 또는 "인간 Ig" 는 면역글로불린 A (IgA), 면역글로불린 E (IgE), 면역글로불린 M (IgM) 또는 면역글로불린 G (IgG) 일 수 있는 다원자가 면역글로불린을 말한다. 본 발명에 따른 인간 면역글로불린은 유리하게는 IgG (서브클래스 (IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4) 와 관계 없이) 이다. 이들은 전체 면역글로불린, 또는 다원자가 면역글로불린 제작 공정 동안 수득되는 임의의 중간 분획일 수 있다.

"혈장 분획" 이란 하나 이상의 정제 단계에 적용되었던, 혈장의 임의의 일부 또는 부차적-일부를 의미한다. 따라서 혈장 분획에는 동결침전된 혈장 상청액, 혈장 동결침전물 (재현탁됨), 에탄올 분별법 (Cohn or Kistler & Nitschmann 방법에 따름) 에 의해 수득된 분획 I 내지 V, 카프릴산 및/또는 카프릴레이트로의 침전 후 수득된 상청액 및 침전물, 크로마토그래피의 용리액 및 멀티컬럼 크로마토그래피를 포함하는 크로마토그래피 컬럼의 비흡착된 분획 및 여과액이 포함된다.

본 발명에 따르면, "동결침전된 혈장 상청액" 또는 "동결상청액" 은 동결된 혈장을 해동 후 수득된 액체 상 (동결침전) 에 상응한다. 특히, 동결상청액은 -10 ℃ 내지 -40 ℃ 의 온도에서 혈액 혈장을 동결시킨 다음, 0 ℃ 내지 +6 ℃, 우선적으로는 0 ℃ 내지 +1 ℃ 의 온도에서 부드럽게 해동시킨 후, 동결침전물 및 동결상청액을 분리하기 위해, 해동된 혈장의 원심분리에 의해 수득될 수 있다. 동결침전물은 피브리노겐, 피브로넥틴, 폰 빌레브란트 인자 및 인자 VIII 에 농축되어 있는 반면, 동결상청액은 보체 인자, 비타민 K 의존성 인자 예컨대 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 인자 II, 인자 VII, 인자 IX 및 인자 X, 피브리노겐 및 면역글로불린 및 알부민을 함유한다.

"정제 단계" 는 제공된 분획 내에, 관심의 생성물, 및 특히 혈장 단백질을 풍부하게 하는 것을 가능하게 하는 방법의 임의의 단계를 의미한다.

본 발명에 따른 제조 방법은 주로 혈액 혈장으로부터 또는 임의의 혈장 분획으로부터 치료적 용도를 위해 혈장 단백질을 정제하기 위한 멀티컬럼 크로마토그래피 단계의 사용에 기반한다. 이러한 멀티컬럼 크로마토그래피 단계의 시행은 면역글로불린 농축물의 제조에 특히 적합하다. 게다가, 본 발명에 따르면, 인간 혈액 혈장 또는 인간 혈액 혈장 동결상청액을 멀티컬럼 크로마토그래피에 직접 적용하는 것이 가능하다. 물론, 멀티컬럼 크로마토그래피에 의한 정제의 업스트림에 여과 및/또는 에탄올/카프릴산 분별 단계를 구상하는 것도 또한 가능하다.

이러한 멀티컬럼 크로마토그래피의 사용은 일반적으로 치료적 용도를 위한 혈장 단백질의 비용의 산업적 규모에서의 감소를 가능하게 한다. 특히, 멀티컬럼 크로마토그래피는 상기 컬럼의 총 포화시 크로마토그래피 지지체를 사용하는 것을 가능하게 하는데, 이것은 통상의 실시가 관심의 분자의 10% 누출이 검출되자마자 용량을 제한하게 되는 통상의 크로마토그래피보다 소량의 겔을 필요로 한다. 유사하게는, 용리, 세정 및 위생처리 상이 더 작은 컬럼에서 실시되므로, 용액 및 완충액 필요성이 통상의 크로마토그래피와 비교하여 크게 감소된다. 크로마토그래피의 캐스케이드에 의한 혈장 분자의 분별법의 원리는 이미 기재되어 있는데 (John Curling et al. "A comparative study of Cohn and chromatographic fractionation using a novel affinity "Cascade Process"" PPB congress May 2005), 이것은 연관된 낮은 용량 및 생산성 때문에 오로지 산업적 관심에 제한된다. 특히 놀랍고 유리한 방식으로, 본 발명에 따른 멀티컬럼 크로마토그래피의 용도는, 시간 단위 및 겔의 부피 당 추출된 생성물의 질량 단위로 표현되는 더 큰 포획 용량 및/또는 더 높은 생산성을 가능하게 함으로써, 캐스케이드 크로마토그래피의 원리를 훨씬 더 매력적으로 만든다.

멀티컬럼 크로마토그래피의 원리는 도 1 에 도식적으로 나타내진다. 이러한 멀티컬럼 크로마토그래피는 크로마토그래피에서 통상적으로 사용되는 컬럼 (크로마토그래피 지지체) 의, 보다 작은 크기의 것이고 하나의 출구가 다른 것의 입구와 연결되도록 서로 링크된 여러 개의 컬림 (동일한 크로마토그래피 지지체의) 으로의 분별법을 가능하게 한다.

일반적으로, 멀티컬럼 크로마토그래피는 상이한 특성의 여러 개의 크로마토그래피 컬럼의 병치 (연속으로 또는 동시에) 는 배제한다.

요약하면, 정제되게 되는 분획은 컬럼 1 상에 주입되고 (도 1A), 그의 출구는 컬럼 2 에 연속으로 연결된다. 따라서, "비-흡착된" 수집된 분획으로 들어가는 대신 컬럼 1 을 떠나는 관심의 혈장 단백질의 누출을 컬럼 2 (가드 컬럼) 상에 수집하고, 이 위에서 관심의 잔류 혈장 단백질이 흡착될 수 있을 것이다. 컬럼 1 에 이어 연속으로 위치한, 가드 컬럼의 수 2, 3, 4, 등은 통제하고자 하는 관심의 단백질의 누출 비율에 따라 다르다 (본원에 기재된 예에서는, 3 개의 가드 컬럼 2-4 가 나타내진다). 일단 컬럼 1 의 로딩 및 이후 세척이 완료되면 (도 1A 및 1B), 이것은 용리 (도 1C), 재생 (도 1D) 및 임의로 평형 (표시되지 않음) 단계를 개별적으로 겪기 위해, 다른 컬럼 2-4 로부터 분리될 수 있다. 일단 컬럼 1 이 재평형화되면, 이것은 최종 가드 컬럼, 등으로서, 다시 연속으로 위치될 수 있다.

동시에, 컬럼 2 (이것은 부분적으로 로딩됨) 가 그 다음 첫번째 위치로 움직이고 차례로 혈장 분획의 로딩을 겪으며, 이의 누출이 다시 이어지는 가드 컬럼 3 및 4 등에 수집된다.

멀티컬럼 크로마토그래피는 따라서 누출이 가드 컬럼 상에 수집되므로, 돌파 (breaking through) 에 의한 물질의 손실 없이 겔의 포화를 최적화하는 것을 가능하게 한다.

본 발명에 따르면, 여러 가지 멀티컬럼 크로마토그래피 기법이 사용될 수 있다. 특히 공지된 것은 Stimulated Moving Bed (SMB) 기술이며, 이로부터 Sequential 멀티컬럼 크로마토그래피 (SMCC) 기술이 파생되었고, 이것이 본 발명에 따른 방법의 시행에 특히 적합하다. 멀티컬럼 크로마토그래피의 구현예의 예시는 특허 출원 WO2007/144476 및 WO2009/122281 에 기재되어 있다.

본 발명에 따르면, 멀티컬럼 크로마토그래피는 친화성, 이온-교환 (음이온 또는 양이온), 소수성 상호작용, 혼합-방식 또는 크기-배제 크로마토그래피일 수 있다. 우선적으로는, 멀티컬럼 크로마토그래피는 멀티컬럼 친화성, 혼합-방식 또는 음이온-교환 크로마토그래피이다.

본 발명의 특정 예시 구현예에서, 멀티컬럼 크로마토그래피는 방사상 크로마토그래피, 즉, 방사상 컬럼을 사용하는 크로마토그래피이다. 본 발명에 따르면, 더 큰 외부 직경의 표면적 (입구 면) 과 더 작은 내부 직경의 표면적 (출구 면) 사이에 적어도 2 의 비를 갖는 방사상 컬럼을 사용하는 것이 가능하다. 상기 컬럼은 로딩 유속을 증가시키는 것을 가능하게 해서, 본 방법을 큰 부피의 혈장이 처리되어야 하는 경우 및/또는 관심의 혈장 단백질, 예컨대 면역글로불린이 이의 분자적 완전성을 보존하도록 빠르게 정제되어야만 하는 경우, 특히 유리하게 만든다. 유사하게는, 이것은 정제 단계 기간을 감소시키고 따라서 시간 단위 당 배치의 수를 증폭시키는 것을 가능하게 한다.

필요에 따라, 더욱 특히 처리하고자 하는 혈장의 부피에 따라, 수 밀리리터 (예를 들어, 실험실 규모에의 시행을 위해), 예를 들어 5 내지 20 ml 에서, 수백 또는 수천 리터 (산업적 규모), 예를 들어 200 내지 2000 l 의 크로마토그래피 컬럼이 사용될 수 있다. 컬럼의 각각의 범위에 대해, 또한 정지상을 형성하는 겔 층의 높이, 예를 들어 6 cm, 12 cm 또는 18 cm 를 조정하는 것을 가능하게 한다. 당업자는 처리하고자 하는 부피 및/또는 원하는 유속에 따라, 컬럼의 수, 이들의 면적 및 겔의 높이를 조정하는 방법을 알고 있다.

특정 예시에서, 특히 동결상청액으로부터 직접 면역글로불린 농축물을 제조하기 위해, 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피가 유리하게는 사용된다.

대부분의 친화성 겔 (친화성 크로마토그래피의 정지상을 형성하는), 특히 산업적으로 사용되는 것들은, 이온-교환 겔 (20-30 g/l 대 80-100 g/l) 보다 4 내지 5 배 작은 최대 면역글로불린 (Ig) 로딩 용량을 갖는 것으로 알려져 있다. 따라서 일반적으로 큰 부피의 혈장을 처리하기 위해 필요한 친화성 겔의 양이 컬럼을 경제적으로 실행불가능하게 만든다고 인정된다.

그러나, 본 출원인은 상기 단점이 크로마토그래피 컬럼의 여러 개의 더 작은 컬럼, 특히 3 내지 8 개의 컬럼, 우선적으로는 3 내지 5 개의 컬럼으로의 분할에 의해 반대될 수 있다는 것을 발견하였다. 다중 크로마토그래피 컬럼의 사용은 관심의 단백질의 로딩 동안 주요한 컬럼(들) 을 탈출한 관심의 혈장 단백질을 포획할, 하나 이상의 주요한 컬럼(들), 가드 컬럼을 연속으로 두는 것을 가능하게 만든다. 상기 주요한 컬럼(들) 내에 존재하는 친화성 리간드는 이후 포화되어 크로마토그래피 겔의 최대 용량에 도달하도록 한다. 상기 컬럼(들) 은 이후 개별적으로 용리하게 되는 시스템 외부로 빠져나가고 관심의 단백질을 수집하도록 한다. 가드 컬럼은 이후 차례로 주요한 컬럼(들) 이 된다. 3 내지 50 회의 연속 사이클, 바람직하게는 5 내지 30, 더욱 바람직하게는 7 내지 15 회의 연속 사이클로부터, 친화성 리간드의 사용을 최대화하고 따라서 관심의 분자를 포획 및 용리하는데 필요한 겔의 총 부피를 감소시키는 것을 가능하게 한다.

유리하게는, 친화성 리간드는 항체, 항체 단편, 항체 유도체 또는 화학적 리간드 예컨대 펩티드, 모방 펩티드, 펩토이드, 나노피틴 또는 올리고뉴클레오티드 리간드 예컨대 앱타머로부터 선택된다.

예를 들어, 고 유속으로 작동하는 것을 가능하게 만드는 가교연결된 아가로오스 매트릭스를 포함하는 겔은 관심의 단백질에 결합할 수 있는 친화성 리간드와 조합으로 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 친화성 리간드는 면역글로불린 내의 인간 Ig 의 Fc 단편 또는 임의의 보존된 서열에 결합하는 것을 가능하게 한다.

또다른 특정 구현예에서, 사용되는 친화성 리간드는 Ig 의 Fc 단편을 인지하고 매트릭스, 예를 들어 IgSelect 겔 (GE Healthcare 사제) 에 커플링된 재조합 단백질이다.

유리하게는, 리간드는 면역글로불린 클래스 (예를 들어, 면역글로불린 G) 을 특이적으로 인지하도록 및/또는 하나 이상의 면역글로불린 서브클래스 (예를 들어, IgG1 및/또는 IgG2 및/또는 IgG3 및/또는 IgG4) 를 특이적으로 인지하도록 선택될 수 있다. 또다른 특정 구현예에서, 사용되는 친화성 리간드는 단백질 G 이며, 이것은 IgG 에 대한 친화성을 갖고, 유리하게는 IgA 에 대한 친화성을 갖지 않는다. 또다른 특정 구현예에서, 사용되는 친화성 리간드는 단백질 A 이며, 이것은 IgG1, IgG2 및 IgG4 에 특이적으로 결합하나, IgG3 의 포획은 허용하지 않는다.

특정의 예시 구현예에서, 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피의 친화성 리간드는 면역글로불린 G 에 대한 친화성을 갖고, 유리하게는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 에 대한 친화성을 갖는 리간드로부터 선택된다. 더욱 특히, 본 발명의 방법에 따라 수득되는 IgG 농축물은 유리하게는 혈장의 것과 유사한 IgG 서브클래스 분포 프로파일을 갖는다. 특히, 본 발명의 방법에 따른 IgG 농축물은 유리하게는 50 내지 70% IgG1, 25 내지 35% IgG2, 2 내지 8% IgG3 및 1 내지 8% IgG4, 또는 더욱 바람직하게는 60 내지 70% IgG1, 30 내지 35% IgG2, 3 내지 6% IgG3 및 2 내지 5% IgG4 를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 수득되는 농축물은 혈장에 비해 IgG3 및/또는 IgG4 서브클래스가 조금 감소될 수 있고, 생성물은 그럼에도 불구하고 혈장의 것과 유사한 IgG 서브클래스 레퍼토아를 갖는 생성물과 치료적 효능이 필적하도록 남아있다.

또다른 특정의 예시 구현예에서, 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피의 친화성 리간드는 피브리노겐 또는 알부민에 대한 친화성을 갖는다. 더욱 특히, 본 발명은 또한 혈장 또는 동결침전된 혈장 상청액을, 친화성 리간드(들) 이 피브리노겐 및/또는 알부민에 대한 친화성을 갖는 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피에 적용하는, 혈액 혈장으로부터 직접적으로 인간 피브리노겐 및/또는 알부민 농축물을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. 사용되는 리간드는 특히 임의의 시판 이용가능한 리간드, 예를 들어, CaptureSelect HSA (Life Technologies) 친화성 리간드 또는 CaptureSelect Fibrinogen (Life Technologies) 친화성 매트릭스 리간드일 수 있다.

유리하게는, 본 발명의 방법에 대해 선택되는 친화성 리간드는 산업적 용도에 부합하는 위생처리 및/또는 집중적인 재사용의 조건에 대해 저항성이 있다. 특정의 구현예에서, 친화성 리간드는 따라서 유리하게는 펩티드 및/또는 펩토이드 (조합적 생물학, 예컨대 파지 디스플레이로부터 산출됨), 나노피틴 (극한조건 박테리아로부터 추출됨), 및/또는 앱타머로부터 선택된다.

특정 예시에서, 친화성 리간드는 앱타머, 및 특히 핵 앱타머이다. 본원에서 사용되는 용어 "앱타머" 는 단일-가닥 핵산 분자, DNA 또는 RNA, 및 특히 인간 Ig 의 Fc 단편에 또는 면역글로불린의 보존된 서열에 대한 결합에 의해, 관심의 단백질, 예를 들어 면역글로불린에 특이적으로 결합할 수 있는 단일-가닥 핵산 분자를 말한다. 유리하게는, 앱타머는 면역글로불린 클래스 (예를 들어, 면역글로불린 G) 를 특이적으로 인지하도록 및/또는 하나 이상의 면역글로불린 서브클래스 (예를 들어, IgG1 및/또는 IgG2 및/또는 IgG3 및/또는 IgG4) 를 특이적으로 인지하도록 선택될 수 있다. 앱타머는 일반적으로 5 내지 120 개의 뉴클레오티드를 포함하고, 소위 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 방법에 의해 시험관 내에서 선택될 수 있다. "핵 앱타머" 는 본 발명에 따르면 단일-가닥 핵산, 및 특히 인간 IgG 의 Fc 단편에 특이적으로 결합하는 단일-가닥 핵산을 의미한다.

앱타머는 다수의 장점을 갖는다. 이들의 올리고뉴클레오티드 특징으로 인해, 앱타머는 친화성 리간드로서 사용 문맥에서 다양한 위생처리 전략을 가능하게 하는, 엄격한 물리화학적 조건 (DMSO 의 존재, 매우 산성 또는 매우 염기성 pH, 유기 용매의 사용 또는 고온) 에 대한 높은 저항성 및 낮은 면역원성을 갖는다. 따라서, 통상의 크로마토그래피에 비해 다중 사이클 및 높은 로딩량에도 불구하고, 크로마토그래피 컬럼을 세정하고 이들의 오염을 제한하며, 바이러스 또는 프라이온 오염 위험을 감소시키기 위해, 위생처리 단계를 진행함으로써 친화성 겔의 수명을 증가시키는 것이 가능하다. 앱타머는, 이들의 핵산 유형 구조 덕분에, 염기성 pH 에서의 위생처리에 특히 적합하며, 100 내지 200 회 사이클의 재사용을 가능하게 한다.

본 출원인의 특허 출원 FR 2 970 003 은 고정화된 핵 앱타머로의 친화성 지지체 제조 방법을 기재한다. 특히, 상기 출원은 그의 표면에 활성화된 카르복실산 기를 갖는 고체 지지체 상에 그래프팅시킴으로써, 적어도 하나의 반응성 아민 작용기를 포함하는 핵산의 고정화 방법을 기재한다.

특정 구현예에서, 멀티컬럼 크로마토그래피는 유리하게는 연속의 크로마토그래피 컬럼을 사용하는, 하나 이상의 연속의 정제 단계에 적용될 수 있다. 그러므로, 첫번째 멀티컬럼 크로마토그래피에 의해 보유되지 않은 분획이 관심의 기타 혈장 단백질을 가장 적합한 순서로 정제하는데 사용될 수 있다. 특정의 예시 구현예에서, 첫번째 멀티컬럼 크로마토그래피는 면역글로불린을 정제하기 위해 혈액 혈장 또는 동결침전물 상에서 실시된다. 상기 첫번째 정제로부터 산출되는 혈장 분획을 알부민을 정제하기 위해 두번째 멀티컬럼 크로마토그래피에 적용한다. 면역글로불린 및 알부민이 결손된, 상기 두번째 멀티컬럼 크로마토그래피로부터 산출되는 혈장 분획을 이후 피브리노겐, 등을 정제하기 위해 세번째 멀티컬럼 크로마토그래피에 적용할 수 있다. 특히 혈장을 연속 흐름에서 처리하여, 면역글로불린, 알부민 및/또는 피브리노겐을 특히, 응고 캐스케이드를 활성화시키지 않으면서, 연속적으로 정제하도록 하는 것이 가능하다.

또다른 특정의 예시 구현예에서, 첫번째 멀티컬럼 크로마토그래피를 면역글로불린을 정제하기 위해 혈액 혈장 또는 동결침전물 상에서 실시한다. 상기 첫번째 정제로부터 산출되는 혈장 분획을 피브리노겐을 정제하기 위해 두번째 멀티컬럼 크로마토그래피에 적용한다. 면역글로불린 및 피브리노겐이 결손된, 상기 두번째 멀티컬럼 크로마토그래피로부터 산출되는 혈장 분획을 이후 알부민, 등을 정제하기 위해 세번째 멀티컬럼 크로마토그래피에 적용할 수 있다. 특히 혈장을 연속 흐름에서 처리하여, 면역글로불린, 피브리노겐 및/또는 알부민을 특히, 응고 캐스케이드를 활성화시키지 않으면서, 연속적으로 정제하도록 하는 것이 가능하다.

본 발명에 따르면, 치료적 용도를 위한 인간 혈장 단백질 농축물의 제조 방법은 또한 하기 단계 중 적어도 하나를 포함할 수 있다:

(i) 바이러스 비활성화 또는 바이러스 제거 단계;

(ii) 이온-교환 크로마토그래피 단계;

(iii) 특히 친화성 크로마토그래피에 의한, 항-A 및 항-B 항체 제거 단계;

(iv) 카프릴산 및/또는 카프릴레이트로의 침전 단계;

(v) 한외여과에 의한 농축 단계;

(vi) 제형화 단계.

유리하게는, 본 발명에 따른 제조 방법은 치료적 용도를 위한 인간 단백질 농축물을 수득하는 것을 가능하게 하고, 단계 (i) 내지 (vi) 중 적어도 하나의 후속 단계를 포함할 수 있다.

특정의 예시 구현예에서, 제조 방법은 임의로 단계 (i) 내지 (vi) 중 하나 이상의 후속 단계를 포함하는, 치료적 용도를 위한 인간 면역글로불린 농축물을 수득하는 것을 가능하게 한다.

또다른 특정의 예시 구현예에서, 제조 방법은 임의로 단계 (i) 내지 (vi) 중 하나 이상의 후속 단계를 포함하는, 치료적 용도를 위한 알부민 농축물을 수득하는 것을 가능하게 한다.

또다른 특정의 예시 구현예에서, 제조 방법은 임의로 단계 (i) 내지 (vi) 중 하나 이상의 후속 단계를 포함하는, 치료적 용도를 위한 피브리노겐 농축물을 수득하는 것을 가능하게 한다.

예를 들어, 혈액 혈장 또는 동결상청액을 멀티컬럼 크로마토그래피, 특히 멀티컬럼 친화성 또는 음이온-교환 크로마토그래피에 직접적으로 적용함으로써 수득된 인간 혈장 단백질 농축물 및/또는 면역글로불린 농축물은, 유리하게는 적어도 하나의 감염원 (infectious agent) 의 제거 또는 비활성화의 적어도 하나의 단계를 거칠 수 있다.

단계 (i) 에서 표적화된 감염원 중에서, 바이러스 및 UTA (unconventional transmissible agents: 비통상 전염원) 예컨대 프리온이 언급될 수 있다.

바이러스 비활성화는 종종 화학약품으로의 처리, 예를 들어 용매 및/또는 세제로의 처리, 및/또는 열로의 처리 (파스퇴르화 및/또는 건조 가열) 및/또는 조사 (감마 및/또는 UV-C) 및/또는 pH 처리 (산성 pH 에서의 처리) 를 포함한다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 단계 (i) 는 용매 및 세제로의 적어도 하나의 처리를 포함한다. 용매 및 세제로의 처리 (일반적으로 용매/세제 또는 S/D 처리로 불림) 는 특히 트리-n-부틸포스페이트 (TnBP) 및/또는 Triton X-100, Tween (바람직하게는 Tween 80), 나트륨 콜레이트 및 2-[4-(2,4,4-트리메틸펜탄-2-일)페녹시]에탄올 (Octoxinol) 로부터 선택되는 세제로의 처리를 포함한다.

나노여과는 또한 감염원, 특히 바이러스 및 UTA 를 제거하는데 사용될 수 있다. 혈장 단백질의 경우, 나노여과는 일반적으로 80 nm 보다 작은 공극 크기의 필터를 통한 관심의 단백질 농축물의 여과를 말한다. 예를 들어, 하기 필터가 이용가능하다: BioEx, Planova? 75 nm, Planova? 35 nm, Planova? 20 nm 또는 Planova? 15 nm (Asahi corporation), Ultipor DV 50 또는 DV 20 (Pall Corporation), Virosart CPV (Sartorius), Viresolve NFR 또는 NFP (Millipore). 나노여과는 유리하게는 단일 필터 또는 연속의 동일한 또는 감소하는 공극 크기의 여러 개의 필터 상에서 실시될 수 있다.

감염원은 또한 심층 여과에 의해 제거될 수 있다. 이용가능한 필터는 예를 들어, 재생된 셀룰로오스로 구성된 필터로서, 여과 보조제가 첨가될 수 있다 (예컨대 Celite, 펄라이트 또는 Kieselguhr), Cuno (Zeta+ VR 시리즈 필터), Pall-Seitz (P-series Depth Filter) 또는 Sartorius (Virosart CPV, Sartoclear P 심층 필터) 사에서 판매됨.

특정 구현예에서, 바이러스 비활성화 단계는 유리하게는 혈장 또는 동결침전된 혈장 상청액 또는 재현탁된 혈장 동결침전물 상에서 직접적으로 실시될 수 있어, 정제하고자 하는 단백질 전체가 멀티컬럼 크로마토그래피의 처리 업스트림으로부터 이득을 얻는다.

또다른 특정 구현예에서, 미정제 혈장 및/또는 동결침전된 혈장 상청액 및/또는 재현탁된 혈장 동결침전물을 심층 여과 또는 여과 시퀀스 (sequence), 예를 들어 폴리프로필렌 필터 또는 6 μm, 1 μm, 이후 0.45 - 0.2 μm 의 등가 매질, 멀티컬럼 크로마토그래피의 업스트림 상에 적용할 수 있다. 이러한 예비 단계는 유리하게는 멀티컬럼 크로마토그래피에서 사용되는 컬럼의 미성숙한 오염을 방지 및/또는 감소시키는 것을 가능하게 한다. 또다른 특정 구현예에서, 사용되는 심층 필터(들) 은 처리된 혈장 분획 중의 지방의 감소를 허용하는 탈지 심층 필터(들) (예를 들어, Cuno 또는 Pall-Seitz) 이다.

유리하게는, 바이러스 비활성화 또는 제거 단계 (i) 에는 이온-교환 크로마토그래피 단계 (ii) 가 이어진다.

특정 예시에서, 이온-교환 크로마토그래피 단계 (ii) 는 음이온- 또는 양이온-교환 크로마토그래피이다. 이러한 음이온- 또는 양이온-교환 크로마토그래피 단계는 본 출원인의 특허 출원 EP 0 703 922 및 WO 99/64462 에 기재되어 있다.

특정 예시에서, 음이온-교환 크로마토그래피 단계 (ii) 는 본 출원인의 특허 출원 WO2002/092632 및 WO2013/007740 에 기재된 바와 같은, DEAE 또는 TMAE 또는 QAE 기로 그래프트된, 가교연결된 다당류 겔 또는 비닐 또는 아크릴 중합체 겔 상에서 시행될 수 있다.

또다른 특정 예시에서, 멀티컬럼 음이온-교환 및/또는 혼합-방식 크로마토그래피는 고 염분을 가진 매질 예컨대 크로마토그래피에 의해 보유되지 않는 혈장 또는 분획 내에 혈장 단백질을 포획하는 것을 가능하게 만드는 고도로 염 내성인 매트릭스 상에서 실시된다. 유리하게는, 고도로 염 내성인 멀티컬럼 음이온-교환 및/또는 혼합 방식 크로마토그래피는 STAr AX 겔 (PALL BIOSEPRA 사제), Capto MMC 겔 (GE Healthcare 사제) 또는 ESHMUNO HCX 겔 (Merck 사제), 또는 당업자에게 공지된 임의의 등가 겔 상에서 실시된다.

특히, 치료적 용도를 위한 면역글로불린 농축물의 제조를 위해서, 음이온-교환 크로마토그래피 단계 (ii) 는 하기를 포함할 수 있다:

- 용매-세제 처리 (단계 (i)) 를 겪은 용액을 pH 8 내지 10 으로 조정하는 단계;

- pH 8 내지 10 로 완충액 내에 미리 평형화된 크로마토그래피 컬럼 상에의 이들의 로딩, 이것은 면역글로불린의 흡착 및 유출물 내의 비흡착된 단백질의 통과를 가능하게 함;

- 모든 비흡착된 단백질 및 용매/세제 혼합물이 제거될 때까지 동일한 완충액으로의 세정;

- 및 면역글로불린을 적합한 완충액으로 용리하는 단계.

상기 용리는 pH 4 내지 7, 바람직하게는 pH 6.2 의 포스페이트 완충액으로 실시하여 면역글로불린을 용리할 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 또한 항-A 및/또는 항-B 항체 제거 단계 (iii) 를 포함할 수 있다. 특정 예에서, 항-A 및/또는 항-B 항체 제거 단계 (iii) 은 단계 (ii) 의 마지막에 수득된 용액에서 실시된다. 상기 단계는 예를 들어, 본 출원인의 특허 출원 WO 2007/077365 에 기재된 방법에 따라 실시될 수 있다. 그러므로, 치료적 용도를 위한 면역글로불린 농축물의 제조 경우에서, 단계 (ii) 에서 수득되는 용액을, 그 매트릭스가 혈액 그룹 A 및/또는 B 와 항원과 관련하여 유사한 올리고당 기로 그래프트된 지지체, 또는 그 매트릭스가 혈액 그룹 A 및/또는 B 와 항원과 관련하여 유사한 올리고당 기로 그래프트된 지지체의 혼합물 상에, 상기 다원자가 면역글로불린 농축물의 침투에 의해 면역친화성 크로마토그래피에 의한 항-A 및 항-B 항체 제거 단계에 적용할 수 있다. 특정 구현예에서, 항-A 및/또는 항-B 항체 제거 단계 (iii) 는 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피에 의해 실시된다.

특정한 경우에, 본 발명에 따른 방법은 카프릴산 및/또는 카프릴레이트로의 침전 단계 (iv) 를 포함할 수 있다. 일반적으로, 카프릴산 및/또는 카프릴레이트를, 약한 산성 매질에 첨가하는 것은, 상청액 중에 남아있는 Ig 를 제외한, 혈장 단백질을 침전시키는 것을 가능하게 한다. 본 발명에 따르면, 멀티컬럼 크로마토그래피에 의한 정제 단계 전 또는 후에 상기 카프릴산 침전 단계 (iv) 를 진행하는 것이 가능하다.

특정의 예시 구현예에서, 멀티컬럼 음이온-교환 크로마토그래피에 의한 관심의 혈장 단백질의 정제 단계에 이어 후속 카프릴산 및/또는 카프릴레이트 침전 단계가 뒤따른다. 멀티컬럼 이온-교환 크로마토그래피/카프릴산 침전의 이러한 조합은 Ig 농축물 (특히 IgG 농축물) 및/또는 알부민 및/또는 피브리노겐 농축물을 제조하는데 특히 유리할 수 있다.

특히, 치료적 용도를 위한 면역글로불린 농축물의 제조를 위해, 카프릴산으로의 침전 단계 (iv) 가 하기로 이루어지는 단계를 포함할 수 있다:

- 임의로 혈장 분획의 pH 를 3.0 내지 6.0, 우선적으로는 pH 4 의 값으로 조정하는 단계;

- 카프릴산을 혈장 분획에 첨가하는 단계;

- 원심분리 또는 여과하여 IgG-풍부 상청액을 수집하는 단계.

본 발명에 따른 방법은 유리하게는 한외여과에 의한 하나 이상의 농축 단계 (v) 를 포함할 수 있다. 예를 들어, Ig 농축물의 제조 동안, 임의로 미리 단계 (i) 내지 (iv) 중 하나 및/또는 다른 것에 적용된, 멀티컬럼 크로마토그래피 단계로부터 산출되는 Ig-풍부 분획을, 멤브레인 한외여과에 적용하는 것이 가능하다.

하나 이상의 약학적으로 허용가능한 안정화제를 인간 혈장 단백질 농축물에 첨가하는 단계 (vi) 를 포함시키는 것도 또한 가능하다. 본 발명에 따르면, 제형화 단계 (vi) 전에, 나노여과에 의해 부가적인 바이러스 안전 단계 (i) 을 포함시키는 것도 가능하다.

약학적으로 허용가능한 안정화제는 출원 FR 03 08403 에 기재된 바와 같은 혈장 단백질 농축물, 특히 부형제에 적합한 제형, 및 우선적으로는 본 출원인의, 출원 FR 03 04388, FR 08 59117, FR 10 54721 및 FR 10 55825 에 기재된 바와 같은 면역글로불린 농축물, 및 특히 부형제에 적합한 제형을 의미한다.

제형화 단계 (vi) 에는 임의로 단계 (vi) 에서 수득된 상기 약학 제제의 동결 또는 동결-건조의 단계 (vii) 가 후속될 수 있다.

유리하게는, 본 발명에 따른 방법은 특히 냉각 저장 단계를 피함으로써, 면역글로불린 농축물, 및/또는 피브리노겐 및/또는 알부민 농축물의 제조를 가능하게 한다.

유리하게는, 본 발명에 따른 방법은 5 g/l 의 혈장보다 우수한 수율, 바람직하게는 6 g/l 의 혈장보다 우수한 수율로 면역글로불린 농축물을 수득하는 것을 가능하게 한다. 매우 유리한 방식으로, 본 발명에 따른 방법은 7-8 g/l 의 초기 혈장과 가까운 면역글로불린 수율을 수득하기 위해 최적화된다.

유리하게는, 본 발명에 따른 방법은 30 g/l 보다 우수한, 매우 유리하게는 35 g/l 보다 우수한 수율을 가진 알부민 농축물을 수득하는 것을 가능하게 만든다. 피브리노겐과 관련해서는, 혈장 수준이 약 3 g/l 이므로, 친화성 포획 단계 유리하게는 하나의 단계에서 이의 80% 를 포획하는 것을 가능하게 만든다. 바람직하게는, 연속 크로마토그래피는 90% 보다 우수한 수율을 달성하는 것을 가능하게 만든다.

유리한 방식으로, 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 면역글로불린 농축물은 혈장의 항원성 레퍼토아와 유사한 또는 동일한 항원성 레퍼토아를 갖는다. 특정한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 면역글로불린 농축물은 종래 기술의 농축물의 항원성 레퍼토아와 유사한 및/또는 우수한 항원성 레퍼토아를 갖는다. 게다가, 본 발명에 따른 방법 동안의 면역글로불린의 제한된 손실은 유리하게는 혈장의 것과 유사한 면역글로불린 분포를 보유하고 넓은 항원성 패널을 보존하는 것을 가능하게 한다.

본 발명에 따른 방법은 따라서 특정 항원 표적에 대항하여 면역글로불린의 분획을 제조하기에 특히 유리하다.

마찬가지로, 본 발명에 따른 방법은, 특히 면역글로불린이 이미 결손된 혈장 분획으로부터, 알부민 농축물의 제조에 특히 유리하다. 본 발명에 따른 멀티컬럼 크로마토그래피의 단계는 90% 이상의 포획 수율을 가능하게 한다. 통상의 크로마토그래피 단계 동안의 겔의 용량이 일반적으로 25 내지 30 g/l 의 겔임에도 불구하고, 본 발명에 따른 멀티컬럼 음이온-교환 또는 소수성-상호작용 크로마토그래피 또는 화학적 리간드의 조합 (멀티-모달) 의 사용은 50 g/l 이상의 겔의 용량, 즉, 지지체의 동적 용량의 총 포화를 수득하는 것을 가능하게 한다.

하기 실시예는 본 발명을 설명하나, 그 범위를 제한하는 것은 아니다.

실시예 1: 동결상청액 상의 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피에 의한 면역글로불린 농축물의 제조

재료 & 방법

동결상청액

8 내지 10 g/l 의 IgG 를 포함하는 약 5 리터의 인간 혈장 동결상청액 (배치 13500-13L-06002 및 13500-13L-06007) 의 2 개 배치를 700 ml 분획으로 분할한 다음, -80 ℃ 에서 동결시켰다. 사용된 배치의 특징을 하기 표 1 에 나타낸다.

표 1: 동결상청액 내의 IgG 서브클래스의 분포

시험 동안, 필요한 부피의 동결상청액을 25 ℃ 의 내부 온도를 초과하지 않는 생성물과 함께 37 ℃ 수조에서 20-30 분 동안 해동시킨다.

완충액

친화성 크로마토그래피 방법의 다양한 단계 동안 사용되는 완충액의 조성을 하기 표 2 에 요약한다.

표 2: 친화성 크로마토그래피에 대한 완충액

이온-교환 크로마토그래피 방법의 다양한 단계 동안 사용되는 완충액의 조성을 하기 표 3 에 요약한다.

표 3: 이온-교환 크로마토그래피에 대한 완충액.

크로마토그래피 겔

친화성 크로마토그래피의 경우, IgSelect? 겔 (GE Healthcare 사제) 를 사용한다 (배치 번호 10035817 및 10017479). 사용되는 친화성 리간드는 BAC 로부터의 리간드 (BioAffinityCompany) 이며, 이것은 인간 IgG 의 Fc 단편에 특이적으로 결합한다. 상기 리간드는 Ig 의 흡착을 용이하게 하는 긴 탄소 스페이서를 통해 매트릭스 베이스에 커플링된, 14 kD 재조합 단백질이다. Ig 는 다중점 (multipoint) 아미드 결합을 통해 스페이서와 커플링된다.

이온-교환 크로마토그래피의 경우, 강한 음이온-교환 겔인, Fractogel? EMD TMAE 가 사용된다 (배치 번호 09L03583). 상기 겔은 그 위에 트리메틸아미노에틸 (TMAE) 기가 그래프트된 가교연결된 폴리메타그릴레이트 수지로 이루어진다.

컬럼

멀티컬럼 친화성 크로마토그래피의 경우, Proxcys 사의 3 내지 5 개의 방사상 컬럼, 참조 μ-RFC 5.0-6.0 (배치 1303B014 - 겔 부피: 10 ml; 겔 높이: 12 cm; 입구 직경 대 출구 직경의 비: 2:1) 를 BioSc Lab 자동화 시스템 (Novasep) 과 조합으로 사용하였다.

TMAE 크로마토그래피의 경우, 겔 부피 41 ml, 높이 20.4 cm, 및 표면적 2.0 ㎠ 를 가진 XK 16 컬럼 (GE Healthcare) 을 AKTA Purifier 10 자동화 시스템 (GE Healthcare) 과 함께 사용하였다.

한외여과

30 kDa 절삭값 (cut-off) 및 50 ㎠ 의 표면적 (참고 C1PA45544) 을 가진 Millipore Biomax 30 (PES) 카세트를 사용한다.

멸균 여과

5 ㎠ 의 표면적 및 0.45 μm 및 0.2 μm 의 다공성을 가진 Sartorius Minisart 필터 (참고 16537 및 16532) 를 사용한다.

시험

멀티컬럼 친화성 크로마토그래피

겔 흡착 및 세정 상 동안 연속으로 순차적으로 연결된 4 개의 컬럼 상에서 시험을 실시하였다 - 26 g 의 IgG/l 의 겔의 로딩량, 5 분의 접촉 시간, 7.3 내지 7.8 의 결합 pH, 용리는 0.1 M 글리신, pH 3 용액으로 시행됨.

겔을 각각의 크로마토그래피 후에 재생시켰다.

재생은 2 CV 의 2 M 나트륨 클로라이드 용액을 통과시키는 것으로 이루어졌다.

크로마토그래피를 280 nm 에서 OD 를 기록하고 IgG 수율 (혼탁 어세이) 을 계산함으로써 모니터링하였다.

작업 유속은 2.3 ml/분이었고, 이것은 흡착 동안 2 분의 접촉 시간에 상응한다.

멀티컬럼 친화성 크로마토그래피 단계를 하기 표 4 에 요약한 대로 진행하였다.

표 4: 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피 단계

S/D 처리 및 TMAE 크로마토그래피

외피 바이러스를 비활성화시키기 위해 S/D 처리를 약 30 분 동안 실시한다. 이후 생성물을 TMAE 겔 상에 주입하기 전에 pH 및 전도도에 대해 조정한다.

이후 TMAE 겔의 비-흡착된 분획을 수집하고 (제거된 분획); 기준선으로의 복귀 및 컬럼 세정 후, 겔 용리액을 하기 상에 대해 수집한다.

한외여과

한외여과 단계는 80-120 g/l 의 중간 농도에서 TMAE 컬럼의 용리액을 투석하고 농축하는 것을 가능하게 한다.

제형

생성물을 제형화 완충액 (만니톨, 글리신, 폴리소르베이트 80) 을 첨가함으로써 제형화시켰다. 생성물의 최종 농도를 50 g/l 로 조정한다.

수득된 생성물을 0.45 및 0.22 μm 필터 시퀀스 상에서 멸균 여과한다. 이것을 이후 4.0-7.0℃ 의 온도에서 액체 상태로 샘플로 만들고 저장한다.

결과

에탄올로의 첫번째 정제 단계 분별법을 갖는 방법에 따라 수득된 50 g/l 면역글로불린 IgG (참조 생성물) 와의 비교를 위해 최종 생성물 상에서 분석을 수행하였다.

- 혼탁법에 의한 총 IgG 및 서브클래스의 어세이 (표 6).

- ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 에 의한 IgA, IgM 및 IgE 의 어세이 (표 7).

표 5: IgG 서브클래스의 분포

표 6: 오염 단백질 농도의 분석

동결상청액으로부터 직접 IgG 를 정제하기 위한 상기 조건은 참조 생성물에 대한 품질과 등가의 생성물을 산출한다는 것이 명시된다. 게다가, 상기 표 6 에 명시된 바와 같이 혈장의 것에 접근하는 분포를 가진, 모든 IgG 서브클래스의 전환이 관찰된다.

더욱 흥미롭게는, IgSelect 겔을 사용하는 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피는 90% 보다 우수한 단계 수율, 및 동결상청액 리터 당 수집된 7.4 g 의 IgG 를 갖는다. 친화성 겔로부터 비-흡착된 분획 내의 완전한 IgG 결손이 명시된다.

표 7: 멀티컬럼 IgSelect 친화성 수율

결론적으로, 멀티컬럼 크로마토그래피에 의한 혈장 동결상청액으로부터 직접적인 IgG 의 정제는, 특히 일 당 혈장 수 천 리터의 부피를 처리하기 위한, 산업적 규모에서 절대적으로 가능하다.

예를 들어, 4500 리터의 인간 혈장의 산업적 배치를 처리하기 위해, 하기를 사용할 수 있다: 50 l 및 12 cm 의 겔 높이를 가진 4 개의 컬럼, 겔 리터 당 27 g 의 IgG 에 상응하는 동결상청액 로딩량, 100 내지 300 cm/h 의 선형 흡착 유속, 및 200 내지 600 cm/시간의 겔 세정 및 용리 단계에 대한 보다 높은 선형 유속을 가짐.

70 리터의 겔의 3 개의 컬럼 또는 40 리터의 겔의 5 개의 컬럼으로 구성된 배치가 가능하며, 전체 배치를 처리하는데 실시하게 되는 사이클 횟수는 사용되는 원료의 부피에 의해 결정된다.

이러한 시행은, 심지어 산업적 규모에서도, 규제 요건을 충족하고 약학적 용도에 필요한 모든 품질 (순도, 생물학적 안정성, IgG 서브클래스 분포, 등) 을 갖는 면역글로불린 농축물을 수득하는 것을 가능하게 한다. 특히, 혈장의 4 가지 IgG 서브클래스의 보존이 관찰된다. 용매/세제 혼합물을 제거하기 위해, IgA 및 IgE, TMAE 크로마토그래피를 그 다음 포함시킬 수 있다.

게다가, 80% 폴리소르베이트와 함께, NaCl 로의 전-용리와 동시에, 또는 우레아/아세트산 분획 중의 혼합물로서 겔을 세정하는 단계를 제공하는 것이 가능하다.

실시예 2: 혈장 상의 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피에 의한 면역글로불린의 포획

재료 & 방법

8 내지 10 g/l 의 IgG 를 포함하는, 약 30 l 의 혈장 집단을 형성하는 것을 가능하게 한 인간 혈장의 백을, 첫번째 멀티컬럼 크로마토그래피를 통해 면역글로불린을 추출하기 위해 25℃ 의 내부 온도를 초과하는 생성물 없이 37℃ 수조에서 해동하였다.

표 8: 혈장 집단 내 IgG 서브클래스의 분포

완충액

친화성 크로마토그래피 방법의 다양한 단계에서 사용되는 완충액의 조성을 하기 표 9 에 요약한다.

표 9: 친화성 크로마토그래피에 대한 완충액

크로마토그래피에 대한 겔

친화성 크로마토그래피의 경우, Life Technologies 사의 CaptureSelect FcXL 친화성 겔 (Ref. 19432801L, Batch No. 200814-03) 이 사용된다. 사용되는 친화성 리간드는 BAC 사의 리간드 (BioAffinityCompany) 이며, 이것은 4 인간 IgG 서브클래스의 CH3 도메인에 특이적으로 결합한다. 본 리간드는 14kD 재조합 단백질이다.

컬럼

멀티컬럼 친화성 크로마토그래피의 경우, Proxcys 사로부터의 4 개의 방사상 컬럼 (MD 122 MK III - 겔 부피: 1.0 l 의 겔의 총 친화성 겔 부피에 대해 컬럼 당 250 ml; 겔 높이: 12 cm; 입구 직경/출구 직경 비: 2/1) 이 BioSc M pilot 자동화 시스템 (Novasep) 과 조합으로 사용되었다.

시험

멀티컬럼 친화성 크로마토그래피

21 g 의 IgG/l 의 겔에 상응하는 혈장 로딩량, 3 내지 4 분의 접촉 시간, 7.1 내지 7.8 의 비-개질된 혈장 흡착 pH 를 가진 자동화된 시스템에 의해 순차적으로 통제된, 4 개의 컬럼 상에서 시험을 실시하였다, 용리는 아세트산 용액 (pH 3.0) 에서 시행됨. 겔은 각각의 크로마토그래피 후 재생시켰다.

크로마토그래피를 280 nm 에서 OD 를 기록하고 용리액 집단 상에서 IgG 수율을 계산함으로써 (혼탁법 어세이) 모니터링하였다. 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피 단계는 하기 표 10 에 요약된 바와 같이 진행하였다.

표 10: 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피 단계

과도한 산성 pH 에서 IgG 의 응집 위험을 제한하기 위해, 수득된 친화성 컬럼의 용리액을 1 M 나트륨 히드록시드 용액을 사용하여 pH 4.8 로 조정하였다.

멀티컬럼 FcXL 친화성 크로마토그래피 용리액의 투석여과 (Diafiltration) 농도

용리액을 물에서 투석여과하고, 약 70 g/l 의 농도를 수득하기 위해 30 kDa 의 절삭값 역치를 갖는 멤브레인 상에서 농축하였다.

결과

한외여과-농축된 멀티컬럼 크로마토그래피 용리액에서 분석을 실시하였다.

- 혼탁법에 의한 총 IgG 및 IgG 서브클래스의 어세이 (표 11).

- ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 에 의한 IgA, IgM 및 IgE 의 어세이 (표 12).

표 11: 용리액 한외여과 및 농축 후 실시된 IgG 서브클래스 분포

표 12: IgG 한외여과 및 농축 후 실시된 오염물 단백질의 함량 분석

혈장으로부터 직접 IgG 를 정제하기 위한 상기 조건이 매우 양호한 품질의 생성물을 산출한다는 것이 명시된다. 게다가, 상기 표 11 에 나타낸 바와 같이, 혈장의 것에 접근하는 분포를 가진 모든 IgG 서브클래스의 보존이 관찰된다.

더욱 유리하게는, FeXL 겔을 사용하는 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피는 90% 보다 우수한, 즉, 처리된 혈장 리터 당 수집된 7.5 g 의 IgG 보다 우수한 단계 수율을 갖는다. 완전한 IgG 결손이 친화성 겔로부터의 비-흡착된 분획 중에서 명시된다. 부가적으로, 알부민 및 피브리노겐은 겔로부터의 비-흡착된 분획 내에 전적으로 수집된다.

표 13: 멀티컬럼 FcXL 친화성 수율 (pH 4.8 로 조정된 용리액의 상태)

결론적으로, 멀티컬럼 크로마토그래피에 의한 혈장으로부터 직접적인 IgG 의 정제는, 특히 일 당 혈장 수 천 리터의 부피를 처리하기 위한, 산업적 규모에서 전적으로 구상될 수 있다.

표 14: 통상의 크로마토그래피 및 멀티컬럼 크로마토그래피 중의 FcXl 친화성 겔과의 IgG 포획 용량의 비교 (등가의 크로마토그래피 완충액).

이러한 시행은, 심지어 산업적 규모에서도, 혈장에 존재하는 면역글로불린을 극도로 효과적으로 포획하는 것을 가능하게 한다. 이것은 또한 단일 단계에서, 치료적 면역글로불린의 집단의 추출된 품질을 보존하는 큰 순도의 용리액을 수득하는 것을 가능하게 만든다. 특히, 혈장의 4 가지 IgG 서브클래스의 보존 및 IgA, IgM 및 IgE 의 양호한 제거가 관찰된다. 잔류 미량의 IgA, IgM 및 IgE 를 제거하기 위해, TMAE 유형의 이온-교환 크로마토그래피 (Merck) 가 이후 구상될 수 있다.

실시예 3: 멀티컬럼 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 화학적 리간드의 조합 (멀티-모달) 에 의한 알부민의 포획

재료 및 방법

실시예 2 에 따른 IgG 의 정제 방법 마지막에 수집된 IgG-결손된 혈장을 사용하고, 알부민은 사용된 친화성 겔에 모두 결합되는 것은 아니다.

혈장 분획의 특징은 다음과 같다:

0.01 M 시트레이트 완충액 중의, 16.15 g/l 의 인간 알부민, pH = 6.5, 12 mS/cm 의 전도도.

크로마토그래피 방법의 다양한 단계에서 사용된 완충액의 조성은 하기 표 15 에 요약된다.

표 15: 혼합-방식 멀티컬럼 크로마토그래피에 대한 완충액.

혼합-방식 크로마토그래피 겔

알부민 크로마토그래피의 경우, HEA Hypercel 유형의 염-저항성 혼합-방식 겔을 사용한다.

컬럼

각각 10 ml 의, 연속하는 5 개의 방사상 컬럼을, BioSc Lab 자동화 시스템 (Novasep) 과 조합으로 사용하였다. 각각 164 분의 6 회 사이클, 즉, 약 17 시간의 연속 작업을 실시한다.

본 실시예에 적용된 멀티컬럼 크로마토그래피 조건은 알부민의 사실상 완전한 포획을 확인하는 것을 가능하게 하였으며, 매우 적은 알부민이 비-흡착된 분획에 남아있었다. 하기 표는 수집된 각 분획 내의 수율 및 관심의 정제된 분획 내에 달성된 초소 순도를 요약한다.

표 16: SDS-PAGE 전기영동에 의한 알부민 수율 및 순도의 추정

적어도 70% 의 용량 습득이 통상의 시험과 비교하여 멀티컬럼 크로마토그래피 시험 동안 관찰되는데, 10% 의 누출이 컬럼 출구에서 도달할 때 로딩을 중단한다. 표 17 은 2 가지 조건에 대해 계산된 습득을 요약한다.

표 17: 통상의 크로마토그래피 및 멀티컬럼 크로마토그래피 중의 HEA 겔의 포획 용량의 비교 (등가의 크로마토그래피 완충액).

표 17 로부터의 결과는 오직 약 3.4% 의 알부민이 흡착되지 않았다는 것을 보여준다. 약 80% 의 전기영동 순도가 관찰된다.

pH = 3.9 에서의 용리 후, 88% 수율이 수득되었다. 본 시험은 혈액 혈장 알부민의 적어도 96% 가 HEA-HyperCel 지지체 상에서 멀티컬럼 크로마토그래피 방식에 따라 크로마토그래피에 의해 포획되었고, 상기 알부민의 적어도 88% 가 용리 시 수집되었으며, 이것이 적어도 80% 의 포획/용리 균형에 상응한다는 것을 보여준다. 상기 겔 상의 멀티컬럼 크로마토그래피는 30 g/l 로부터 통상의 크로마토그래피에서 52 g/l 까지의 겔의 용량의 변화, 즉, 70% 의 배치에 의해 필요한 총 겔 부피에서의 감소를 가능하게 하였다.

인간 혈장이 약 40 g/l 의 알부민으로 구성되므로, 본 실시예에 따라 적어도 33 g/l 가 정제될 수 있다.

실시예 4 : 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피에 의한 피브리노겐의 포획

재료 & 방법

혈장 분획

실시예 3 에 따른 알부민의 정제를 위한 방법의 마지막에 수집된 (14 시간 동안 2 개의 멀티컬럼 크로마토그래피에 대한 통과), IgG- 및 알부민-결손된 혈장을, 이것을 -80℃ 에서 동결 및 저장한 다음 크로마토그래피에 의한 피브리노겐 포획 날짜에 해동한 후 사용한다.

혈장 분획의 특징: 항원성 피브리노겐: 0.32 g/l.

완충액

크로마토그래피 방법의 다양한 단계에서 사용된 완충액의 조성을 하기 표 18 에 요약한다.

표 18: 친화성 크로마토그래피에 대한 완충액.

친화성 크로마토그래피 겔

크로마토그래피의 경우, CaptureSelect 피브리노겐 친화성 겔 (Life Technologies ref. 191291050, 배치 171013-01) 을 사용하며, 이의 피브리노겐 포획 특징을 하기 표 19 에 요약한다.

표 19: CaptureSelect 피브리노겐 겔의 용량

컬럼

5 ml 축 컬럼 (참조 Tricorn 5/100 (GE Healthcare), 컬럼 부피: 1.6 ml; 컬럼 높이: 8 cm) 을 사용하였다.

친화성 정제

해동된 면역글로불린- 및 알부민-결손될 혈장을, 평형된 피브리노겐 CaptureSelect 친화성 컬럼 상에 개질 없이 주입한다. 약 10 g/l 의 로딩량을 적용하였다. 용리액의 피브리노겐 함량을 ELISA 방법에 의해 어세이하였다.

결과

상기 방법 종료시, 피브리노겐 수율은 70% 이다. 수득된 생성물은 1.3 mg/ml 의 항원성 피브리노겐 농도를 갖는다.

본 시험은 오직 크로마토그래피 단계 (바이러스 비활성화 및 여과 단계 외에) 를 연속으로 사용함으로써 혈장의 3 개의 풍부한 단백질을 포획하는 것이 가능하다는 것을 명백하게 입증한다.

본 예에서, 2 개의 연속 멀티컬럼 크로마토그래피 및 통상의 크로마토그래피를 교대로 실시하였으며, 비-흡착된 분획을 연속으로 재처리하였다. 10 시간이 넘는 상기 크로마토그래피 시퀀스 (도 2) 는 포획된 분자 및 특히 최종적으로 정제된 분자 (이것은 이 경우 피브리노겐임) 의 품질에 유해하지 않다. 피브리노겐은 비-환원 조건 하의 SDS PAGE 및 면역글로불린의 포획의 다양한 연속 크로마토그래피의 코마시 블루 염색, 이후 알부민이 포획 및, 최종적으로, 이어지는 피브리노겐의 포획에 의해 제시되는 바와 같이, 정제 방법 전반적으로 이의 완전성을 매우 대부분 보유하였다 (도 3).

본 도 3 에서, 시작 혈장 및 이후 용리액 및 비-보유된 분획은 포획된 분자 및 포획된 분자가 있는 용리액의 농축물과 관련해 혈장의 연속적인 결손을 보여준다.

웰 1 은 분자량 마커에 상응하고, 웰 2 는 미정제된 정상 혈장에 상응한다.

웰 3 및 4 는 실시예 2 에서 수득된 분획에 상응한다.

웰 5 및 6 은 실시예 3 에서 수득된 분획에 상응한다.

웰 7 및 8 은 실시예 4 에서 수득된 분획에 상응한다.

340 kDa 의 분자량을 갖는 피브리노겐은 멀티컬럼 면역글로불린 포획 크로마토그래피의 비-보유된 분획 및 이후 멀티컬럼 알부민 포획 크로마토그래피의 비-보유된 분획 내에서 이의 분자적 완전성을 대부분 유지한다. 피브리노겐의 부재가 피브리노겐 포획 친화성 크로마토그래피의 비-보유된 분획에서 관찰되고, 상기 피브리노겐은 완전히 포획되고 상기 크로마토그래피의 용리액 중에서 대부분 미손상된 구조로 발견된다.

Claims

혈액 혈장 또는 혈장 분획을 멀티컬럼 크로마토그래피에 적용하는 정제 단계를 포함하는, 혈액 혈장으로부터의 치료적 용도를 위한 정제된 혈장 단백질 농축물의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 혈장 분획이 동결침전된 혈장 상청액, 재현탁된 혈장 동결침전물, 에탄올 분별법에 의해 수득된 분획 I 내지 V, 카프릴산 및/또는 카프릴레이트로의 침전 후 수득된 상청액 및 침전물, 크로마토그래피에 의해 보유되지 않는 용리물 또는 분획, 여과액으로부터 선택되는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 치료적 용도를 위한 정제된 혈장 단백질 농축물이 면역글로불린, 알부민, 응고 인자 예컨대 피브리노겐 (인자 I), 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 XI, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 (von Willebrand) 인자, 프로트롬빈 복합체 또는 PPSB (인자 II, VII, IX, X), 활성화된 프로트롬빈 복합체, 생물학적 부착제, 및 프로테아제 억제제 예컨대 알파-1 항트립신, C1-에스테라아제 억제제 또는 항트롬빈, 단독 또는 혼합물로, 알파/마크로글로불린, 항키모트립신, 항트립신, Apo A, Apo B, Apo C, Apo D, Apo E, Apo F, Apo G, 베타 XIIa, C-반응성 단백질, C7, C1r, C1s, C2 C3, C4, C4bP, C5, C6, C1q, C8, C9, 카르복시펩티다아제 N, 세룰로플라스민, 인자 B, 인자 D, 인자 H, 피브로넥틴, 합토글로빈, 하에모펙신, 헤파린 조인자 II, 히스티딘 풍부 GP, 키니나아제 II, 키니노겐 HPM, 라이소자임, PAI 2, PAI I, PCI, 플라스민, 플라스민 억제제, 플라스미노겐, 프리알부민, 프리칼리크레인 (prekallikrein), 프로페르딘, 프로테아제 넥신 INH, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 혈청 아밀로이드 단백질 (SAP), TFPI, 티올-프로테이나아제, 트롬보모듈린, 조직 인자 (TF), TPA, 트랜스코발라민 II, 트랜스코르틴, 트랜스페린, 비트로넥틴으로부터 선택되는 혈장 단백질을 함유하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적 용도를 위한 정제된 혈장 단백질 농축물이 면역글로불린 농축물인 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적 용도를 위한 정제된 혈장 단백질 농축물이 알부민 및/또는 피브리노겐 농축물인 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적 용도를 위한 정제된 혈장 단백질 농축물이 피브리노겐 및/또는 알부민 및 면역글로불린 농축물인 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 멀티컬럼 크로마토그래피가 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피인 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 혈장 또는 동결침전된 혈장 상청액이 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피로 이루어진 인간 면역글로불린의 정제 단계에 직접 적용되는 방법.
제 8 항에 있어서, 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피의 친화성 리간드가 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 에 대해 친화성을 갖는 리간드로부터 선택되는 방법.
제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피가 항체, 항체 단편, 항체 유도체, 화학적 리간드 예컨대 펩티드, 모방 펩티드, 펩토이드, 나노피틴, 및 올리고뉴클레오티드 리간드 예컨대 앱타머로부터 선택되는 친화성 리간드를 사용하는 방법.
제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피가 산업적 용도에 호환되는 위생처리 및/또는 집중적인 재사용 조건에 대해 저항성인 친화성 리간드, 특히 펩티드, 펩토이드, 나노피틴 및 앱타머로부터 선택되는 친화성 리간드를 사용하는 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 멀티컬럼 크로마토그래피가 멀티컬럼 이온-교환 크로마토그래피, 예컨대 멀티컬럼 음이온- 또는 양이온-교환 크로마토그래피, 또는 멀티컬럼 소수성 상호작용 크로마토그래피, 또는 멀티컬럼 혼합-방식 크로마토그래피 또는 멀티컬럼 크기-배제 크로마토그래피인 방법.
제 12 항에 있어서, 멀티컬럼 음이온-교환 크로마토그래피가 DEAE 또는 TMAE 또는 QAE 기로 그래프트된, 가교연결된 다당류 겔 또는 비닐 또는 아크릴 중합체 겔 상에 시행되는 방법.
제 13 항에 있어서, 멀티컬럼 음이온-교환 및/또는 혼합-방식 크로마토그래피가 고 염분을 갖는 배지 중의 혈장 단백질, 예컨대 크로마토그래피에 의해 보유되지 않는 혈장 또는 분획을 포획하기 위해, 고도의 염 내성인 매트릭스 상에서 수행되는 방법.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 혈장 또는 동결침전된 혈장 상청액이 멀티컬럼 음이온-교환 크로마토그래피로 이루어지는 인간 면역글로불린의 정제 단계에 직접 적용되고, 임의로 상기 인간 면역글로불린을 함유하는 분획이 카프릴산으로의 침전에 의해 후속 정제 단계에 적용되어, 면역글로불린을 함유하는 상청액이 수집되는 방법.
제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 혈장 또는 동결침전된 혈장 상청액이 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피 또는 멀티컬럼 음이온-교환 크로마토그래피로 이루어지는 알부민 및/또는 피브리노겐의 정제 단계에 직접 적용되고, 임의로 알부민 및/또는 피브리노겐을 함유하는 분획이 카프릴산으로의 침전에 의해 후속 정제 단계에 적용되어, 알부민 및/또는 피브리노겐을 함유하는 분획이 수집되는 방법.
제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 멀티컬럼 크로마토그래피가 연속으로 3 내지 8 개의 컬럼, 우선적으로는 3 내지 5 개의 컬럼을 포함하고, 및/또는 멀티컬럼 크로마토그래피 컬럼이 방사상 컬럼인 방법.
제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 부가적인 단계 중 적어도 하나를 포함하는 방법:
- 탈지 및/또는 여과 단계;
- 카프릴산으로의 침전 단계;
- 임의로 용매-세제 처리 및/또는 나노여과를 포함하는, 바이러스 비활성화 또는 제거 단계;
- 이온-교환 크로마토그래피 단계, 및 특히 음이온- 또는 양이온-교환 크로마토그래피 단계, 음이온-교환 크로마토그래피 단계는 우선적으로는 DEAE 또는 TMAE 또는 QAE 기로 그래프트된, 가교연결된 다당류 겔 또는 비닐 중합체 겔 상에서 시행됨;
- 특히 친화성 크로마토그래피 예컨대 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피에 의한, 항-A 및 항-B 항체 제거 단계;
- 한외여과에 의한 농축 단계;
- 제형화 단계.
제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 안정화제의 치료적 용도를 위한 정제된 혈장 단백질 농축물에 대한 첨가를 포함하는 제형화 단계, 및 임의로 제형화 단계의 마지막에 수득된 약학 제제의 동결 또는 동결-건조의 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 연속으로 하기 단계를 포함하는 방법:
(a) 혈장의 용매/세제에 의한 비활성화의 첫번째 단계;
(b) 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피에 의해, 단계 (a) 에서 수득된 비활성화된 혈장으로부터의 면역글로불린의 정제 단계; 이후
(c) 임의로 단계 (b) 로부터 산출되는 면역글로불린 농축물로부터의, 특히 친화성 크로마토그래피에 의한 항-A 및 항-B 항체 제거 단계; 이후
(d) 임의로 단계 (b) 또는 (c) 로부터 산출되는 면역글로불린 농축물의 나노여과에 의한 두번째 바이러스 제거 단계; 및
(e) 단계 (b), (c) 또는 (d) 로부터 산출되는 면역글로불린 농축물에 대한 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 안정화제의 첨가 단계.
제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 연속으로 하기 단계를 포함하는 방법:
(a') 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피에 의한 동결침전된 혈장 상청액으로부터 면역글로불린의 정제 단계; 이후
(b') 단계 (a') 에서 수득되는 면역글로불린 농축물의 용매/세제에 의한 비활성화의 첫번째 단계; 이후
(c') 임의로 단계 (b') 로부터 산출되는 면역글로불린 농축물로부터의, 특히 친화성 크로마토그래피에 의한, 항-A 및 항-B 항체 제거 단계; 이후
(d') 임의로 단계 (b') 또는 (c') 로부터 산출되는 면역글로불린 농축물의 나노여과에 의한 두번째 바이러스 제거 단계; 및
(e') 단계 (b'), (c') 또는 (d') 로부터 산출되는 면역글로불린 농축물에 대한 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 안정화제의 첨가 단계.
제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 연속으로 하기 단계를 포함하는 방법:
(A) 동결침전된 혈장 상청액의 에탄올 및/또는 카프릴산 분별 단계; 이후
(B) 임의로 단계 (A) 에서 수득된 용액의 용매/세제에 의한 바이러스 비활성화 또는 제거의 첫번째 단계; 이후
(C) 단계 (A) 또는 (B) 에서 수득된 용액의 멀티컬럼 음이온-교환 크로마토그래피에 의한 면역글로불린의 정제 단계; 이후
(D) 임의로 단계 (C) 의 마지막에 수득된 면역글로불린 농축물로부터의, 특히 친화성 크로마토그래피에 의한, 항-A 및 항-B 항체 제거 단계;
(E) 임의로 단계 (C) 또는 (D) 의 마지막에 수득된 면역글로불린 농축물의 나노여과에 의한 두번째 바이러스 제거 단계; 및
(F) 단계 (C), (D) 또는 (E) 로부터 산출되는 면역글로불린 농축물에 대한 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 안정화제의 첨가 단계.
제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 혈액 혈장 또는 동결침전된 혈장 상청액을 하기에 적용하는 것으로 이루어지는 단계를 포함하는 방법:
- 적어도 하나의 친화성 리간드가 면역글로불린에 특이적으로 결합하는 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피 (이의 마지막에 면역글로불린을 함유하는 분획이 수집됨); 및/또는
- 소수성 상호작용 또는 화학적 리간드의 조합 (멀티-모달) 을 통한 멀티컬럼 이온-교환 크로마토그래피 또는 멀티컬럼 크로마토그래피 (이의 마지막에 피브리노겐 및/또는 알부민을 함유하는 분획이 수집됨),
및 임의로, 알부민 및/또는 피브리노겐을 함유하는 분획의 카프릴산으로의 침전에 의한 후속 정제 단계,
및/또는 임의로 하기 후속 단계 중 적어도 하나:
- 바이러스 비활성화 또는 바이러스 제거 단계,
- 이온-교환 크로마토그래피 단계,
- 특히 친화성 크로마토그래피에 의한, 항-A 및 항-B 항체 제거 단계,
- 한외여과에 의한 농축 단계,
- 제형화 단계.
제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 동결침전된 혈장 상청액을 -10 ℃ 내지 -40 ℃ 의 온도에서 혈액 혈장의 침전에 의해 미리 수득한 다음, 0 ℃ 내지 +1 ℃ 의 온도에서 부드럽게 해동시킨 후, 동결침전물 및 동결상청액을 분리하기 위해, 해동된 혈장의 원심분리에 의해 수득하는 방법.
제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 혈장 또는 동결침전된 혈장 상청액을 첫번째 혈장 단백질을 포획하기 위해 첫번째 멀티컬럼 크로마토그래피에 직접 적용한 다음, 첫번째 멀티컬럼 크로마토그래피로부터의 비-보유된 분획을 두번째 혈장 단백질을 포획하기 위해 두번째 멀티컬럼 크로마토그래피에 적용하는 방법.
제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 두번째 멀티컬럼 크로마토그래피로부터의 비-보유된 분획을 세번째 혈장 단백질을 정제하기 위해, 세번째 크로마토그래피, 우선적으로는 멀티컬럼 크로마토그래피, 또는 침전 단계에 적용하는 방법.
제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 멀티컬럼 친화성 또는 이온-교환 크로마토그래피로부터의 보유된 분획이 관심의 혈장 단백질, 우선적으로는 피브리노겐 및/또는 알부민이고, 상기 관심의 혈장 단백질이 이후 임의로 용리되는 방법.
제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 멀티컬럼 친화성 또는 이온-교환 크로마토그래피로부터의 보유된 분획이 오염물을 함유하고, 비-보유된 분획이 관심의 단백질, 우선적으로는 알부민 및/또는 피브리노겐을 포함하는 방법.
혈액 혈장 또는 동결침전된 혈장 상청액 또는 혈장 분획을 하기에 직접적으로 적용하는 것으로 이루어지는 단계:
- 적어도 하나의 친화성 리간드가 면역글로불린에 특이적으로 결합하는 리간드인 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피 (이의 마지막에 면역글로불린을 함유하는 분획이 수집됨); 및
- 임의로 고도로 염 내성인, 멀티컬럼 이온-교환 및/또는 혼합-방식 크로마토그래피 (이의 마지막에 알부민 및/또는 피브리노겐을 함유하는 분획이 수집됨); 및 임의로
- 침전 및/또는 크로마토그래피에 의해 피브리노겐 및/또는 알부민을 함유하는 멀티컬럼 크로마토그래피를 진행함으로써 보유되지 않는 상기 분획의 정제 단계
를 포함하는, 혈액 혈장의 분별 방법.
혈액 혈장 또는 동결침전된 혈장 상청액 또는 혈장 분획을 하기에 직접적으로 적용하는 것으로 이루어지는 단계를 포함하는, 혈액 혈장의 분별 방법:
- 적어도 하나의 친화성 리간드가 면역글로불린에 특이적으로 결합하는 리간드인 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피 (이의 마지막에 면역글로불린을 함유하는 분획이 수집됨); 및/또는
- 적어도 하나의 친화성 리간드가 피브리노겐에 특이적으로 결합하는 리간드인 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피 (이의 마지막에 피브리노겐을 함유하는 분획이 수집됨); 및/또는
- 적어도 하나의 친화성 리간드가 알부민에 특이적으로 결합하는 리간드인 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피 (이의 마지막에 알부민을 함유하는 분획이 수집됨).
제 26 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린에 결합하는 멀티컬럼 친화성 크로마토그래피가 멀티컬럼 크로마토그래피 또는 알부민 및/또는 피브리노겐에 결합하는 크로마토그래피의 업스트림에서 실시되는 분별 방법.
혈장 중의 면역글로불린 분포 프로파일과 유사한 또는 일치하는 면역글로불린 분포 프로파일을 갖는 면역글로불린 농축물.
제 32 항에 있어서, 상기 농축물이 50 내지 70% IgG1, 25 내지 35% IgG2, 2 내지 8% IgG3 및 1 내지 8% IgG4 를 갖는 면역글로불린 G 농축물인 면역글로불린 농축물.
혈장의 항원성 레퍼토아와 유사한 또는 일치하는 항원성 레퍼토아를 갖는 면역글로불린 농축물.
제 34 항에 있어서, 상기 농축물의 항원성 레퍼토아가 종래 기술의 농축물의 항원성 레퍼토아와 유사한 및/또는 그보다 우수한 것을 특징으로 하는 면역글로불린 농축물.