KR20240040107A - 면역글로불린 g를 정제하는 방법 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본원 개시내용은 사람 IgG의 CH3 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 친화성 크로마토그래피 수지를 사용하여 혈장 또는 이의 분획으로부터 면역글로불린 G(IgG) 및 알부민과 같은 기타 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이다. 본원의 개시내용은 또한 상기 방법으로부터 생성된 혈장 단백질 생성물의 제형 및 용도에 관한 것이다.
Description
관련 출원 데이터
본 출원은 2021년 7월 29일자로 출원되고 "면역글로불린 G의 정제 방법 및 이의 용도”라는 발명의 명칭의 호주 특허 출원번호 제2021902332호, 2021년 7월 29일자로 출원되고 "면역글로불린 G의 정제 방법 및 이의 용도”라는 발명의 명칭의 미국 특허 출원번호 제63/227,329호 및 2022년 5월 31일자로 출원되고 "면역글로불린 G의 정제 방법 및 이의 용도"라는 발명의 명칭의 미국 특허 출원번호 제63/365,530호에 대한 우선권을 주장한다.
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본 출원은 전자 형태로 서열 목록과 함께 출원되었다. 상기 서열 목록의 전체 내용은 본원에 참조로 인용된다.
본원 개시내용은 혈장으로부터 면역글로불린 G(IgG) 및 알부민과 같은 기타 단백질을 정제하는 방법 및 이의 혈장 단백질 생성물의 제형 및 용도에 관한 것이다.
면역글로불린 G(IgG)는 혈장에서 가장 풍부한 단백질 중 하나이고, 독소 중화, 보체 활성화 및 옵소닌화를 담당한다. 사람 혈장으로부터 정제된 IgG는 면역 결핍 환자의 감염 예방, 환자의 항체 결핍에 대한 대체 치료요법, 환자의 면역 결핍, 염증성 및 자가 면역 질환, 및 급성 감염과 관련된 병태의 치료에 사용된다. 혈장 유래된 면역글로불린은 주요 혈장 생성물이 되었고 전 세계적으로 소비가 증가하고 있다. 사람 면역글로불린 생성물은 과면역(또는 '특이적') 및 정상(또는 '비특이적') 면역글로불린 둘다 주로 IgG로 이루어진다. 과면역 면역글로불린 생성물은 B형 간염, 파상풍, 수두 대상포진, 및 광견병 면역글로불린을 포함하고, 각 생성물은 공지된 농도의 특정 항체를 함유한다. 정상 다가 사람 면역글로불린(IG)의 항체 특이성은 공여자 집단에서 나타나는 항체 특이성을 반영한다. FDA 승인된 Ig의 목록은 https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/approved-blood-products/immune-globulins에 제공된다. 현재 수개의 상업적 정맥내 IG (IVIG) 생성물 (전형적으로 5% 또는 10% (w/v) 안정화된 용액)이 가용하고 이들은 Privigen® (CSL Behring), Flebogamma® (Grifols), Gamunex®-C (Grifols), Gammagard® (Takeda), 및 Octagam® (Octapharma)을 포함한다. 보다 최근에, 피하 IG (SCIG) 투여는 가용하게 되었다. 상업적 SCIG 생성물(전형적으로 10%, 16.5% 또는 20% (w/v) 안정화된 용액)은 Hizentra® (CSL Behring), Gamunex®-C (Grifols), Xembify® (Grifols), Cutaquig® (Octapharma) 및 Cuvitru® (Takeda)을 포함한다. 다른 IG 생성물은 근육내 (IMIG) 투여된다.
IG 생성물은 주로 IgG 서브클래스 분포가 정의된 IgG를 포함한다: IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4. 그러나 IG 생성물은 다양한 측면에서 다양하다: IgG 단량체, 이량체 및 총체 농도, IgA 및 IgM 함량; 안정화제; 첨가제; 및 불순물 수준(예를 들어, 인자 XI/XIa와 같은 프로테아제). IgA와 관련하여, IgA 결핍 환자에서 아나필락시스 반응을 일으킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 이유로, IG 생성물은 소량의 IgA를 함유하는 것이 바람직하다. IgG를 함유한 IG 생성물의 속성은 해당 관할권에 등록하기 위한 현지 및/또는 지역 약전 요건도 충족해야 한다(문헌참조: 예를 들어. Human Normal Immunoglobulin for Subcutaneous Administration, Ph. Eur. monograph 2788).
혈장 및 이의 분획물로부터 IgG를 정제하는 기존 방법은 크로마토그래피(예를 들어, 친화성 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, SE-HPLC) 및 비-크로마토그래피(침전 및 액체 추출) 정제 방법을 포함한다. 기존 방법의 주요 장애는 IgG를 정제하는 데 드는 높은 비용과 시간, 동일한 혈장 또는 혈장 분획에서 기타 단백질(예를 들어, 알부민 및 응고 인자)을 동시 정제해야 한다는 점, 치료학적 용도를 위해 적합한 품질(예를 들어, 순도 및 안정성)의 생성물인지 확인해야 한다는 점이다. 예를 들어, 친화성 크로마토그래피에 사용되는 친화성 수지는 결합 용량이 상대적으로 낮을 수 있고 평균 크기의 배치에서 크로마토그래피 정제는 수백 리터에 달할 수 있어(대조적으로 혈장 분획은 전형적으로 수천 리터에 달한다) 사용되는 수지의 양, 크로마토그래피 컬럼을 취급하고 포장하는 인프라 및 운영 비용에 막대한 자본이 투자될 수 있다. 현재 기존 기술을 사용하면 혈장 내 존재하는 IgG의 최대 70~75%를 혈장에서 회수할 수 있다.
따라서 당업자에게는 혈장 또는 이의 분획물로부터 IgG를 정제하는 개선된 방법에 대한 필요성이 당업자에게 명백할 것이다.
발명의 개요
본원의 개시내용은 발명자들이 혈장 또는 이의 분획에서 높은 수율(예를 들어, ≥75%)로 IgG를 정제하는 방법을 동정한 것을 기반으로 한다. 상기 방법은 혈장 또는 이의 분획에서 고순도(예를 들어, ≥95%)로 IgG를 회수할 수도 있다. 특히, 발명자들은 사람 IgG의 CH3 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 친화성 크로마토그래피 수지와 함께 연속 친화성 크로마토그래피(예를 들어, 모의 이동 베드(SMB) 크로마토그래피)를 사용하면 기존 생성물과 비교하여 IgG 서브클래스 분포(즉, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)에 미치는 영향을 최소화하면서 혈장으로부터 고수율 및 고순도의 IgG를 정제할 수 있다는 사실을 발견하였다. 추가로, 본원 발명자들은 특정 세척 및 재생 완충액을 사용하면 상기 방법이 추가로 개선된다는 사실을 발견하였다. 상기 방법을 사용하면 더 적은 양의 크로마토그래피 완충액을 사용하고 친화성 수지를 여러 번(적어도 50회) 재사용할 수 있어 혈장 또는 이의 분획으로부터 IgG를 정제하는 데 드는 비용을 더욱 절감할 수 있다는 장점이 있다.
따라서, 본 발명자들의 발견은 IgG 집적된(enriched) 제제를 제조하는 방법의 기반을 제공한다. 이 연구 결과는 또한 대상체의 병태(예를 들어, 원발성 면역결핍 질환, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 만성 면역성 혈소판 감소성 자반증)를 치료, 예방 및/또는 진행을 지연시키기 위한 조성물 또는 IgG의 용도뿐만 아니라 IgG 집적된 제제를 포함하는 약제학적 조성물에 대한 근거를 제공한다.
본원의 개시내용은 사람 IgG의 CH3 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 친화성 크로마토그래피 수지를 제공한다.
본원의 개시내용은 또한 친화성 크로마토그래피를 사용하여 혈장 또는 이의 분획으로부터 IgG를 정제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 사람 IgG의 CH3 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 친화성 크로마토그래피 수지에 IgG를 결합시키고, IgG를 수거하는 것을 포함한다.
본원의 개시내용은 추가로 친화성 크로마토그래피를 사용하여 혈장 또는 이의 분획으로부터 IgG 집적된 제제를 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 사람 IgG의 CH3 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 친화성 크로마토그래피 수지에 IgG를 결합시키고, IgG를 수거하는 것을 포함한다.
본원의 개시내용은 연속 친화성 크로마토그래피를 사용하여 혈장 또는 이의 분획으로부터 IgG를 정제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 사람 IgG의 CH3 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 친화성 크로마토그래피 수지에 IgG를 결합시키고, IgG를 수거하는 것을 포함한다.
본원의 개시내용은 또한 연속 친화성 크로마토그래피를 사용하여 혈장 또는 이의 분획으로부터 IgG 집적된 제제를 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 사람 IgG의 CH3 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 친화성 크로마토그래피 수지에 IgG를 결합시키고, IgG를 수거하는 것을 포함한다.
하나의 예에서, 수지는 낙타 유래 단일 도메인 [VHH] 항체 단편을 포함하는 리간드를 포함한다. 예를 들어, 상기 리간드는 VHH 항체 단편이다. 하나의 예에서, 리간드는 CH1 도메인을 포함하지 않는다.
하나의 예에서, 수지는 가교 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 매트릭스와 아가로스 기반 매트릭스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 매트릭스를 포함한다. 예를 들어, 매트릭스는 가교 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 매트릭스이다. 또 다른 예에서, 매트릭스는 아가로스 기반 매트릭스이다.
하나의 예에서, 수지는 사람 IgG의 CH3 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함하고, 여기서 리간드는 가교 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 매트릭스에 접합된다. 예를 들어, 수지는 가교 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 매트릭스에 접합된 VHH 항체 단편을 포함하는 리간드를 포함한다.
하나의 예에서, 수지는 사람 IgG의 CH3 도메인과 아가로스 기반 매트릭스에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함한다. 예를 들어, 수지는 아가로스 기반 매트릭스에 접합된 VHH 항체 단편을 포함하는 리간드를 포함한다.
하나의 예에서, 수지는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 50%의 아미노산 동일성을 포함하는 서열을 포함하는 VHH 항원 결합 단백질을 포함한다. 하나의 예에서, VHH 항원 결합 단백질은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 예에서, VHH 항원 결합 단백질은 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 50% 아미노산 동일성을 포함하는 서열을 포함한다.
하나의 예에서, 수지는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 50%의 아미노산 동일성을 포함하는 서열을 포함하는 프레임워크 영역을 포함하는 VHH 항원 결합 단백질을 포함한다. 하나의 예에서, 프레임워크 영역은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 프레임워크 영역은 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 50% 아미노산 동일성을 포함하는 서열을 포함한다.
하나의 예에서, 수지는 4개의 프레임워크 영역, FR1, FR2, FR3 및 FR4와 3개의 상보성 결정 영역, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고 이들이 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순서로 작동 가능하게 연결된 아미노산 서열을 포함하는 VHH 항원 결합 단백질을 포함하고, 여기서:
a) CDR1은 서열번호 2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 아미노산 잔기 중 1 또는 2개에서 서열번호 2와는 상이한 아미노산 서열을 갖고;
b) CDR2는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고;
c) CDR3은 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고;상기 프레임워크 영역 각각은 서열번호 1 중 어느 하나의 프레임워크 아미노산 서열과 적어도 50%의 아미노산 동일성을 갖고;
상기 프레임워크 영역 각각은 서열번호 1의 프레임워크 아미노산 서열과 적어도 50% 아미노산 동일성을 갖는다.
하나의 예에서, 수지는 4개의 프레임워크 영역, FR1, FR2, FR3 및 FR4와 3개의 상보성 결정 영역, CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고 이들이 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순서로 작동 가능하게 연결된 아미노산 서열을 포함하는 VHH 항원 결합 단백질을 포함하고, 여기서:
a) CDR1은 서열번호 2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 아미노산 잔기 중 1 또는 2개에서 서열번호 2와는 상이한 아미노산 서열을 갖고;
b) CDR2는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고;
c) CDR3은 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고; 상기 프레임워크 영역 각각은 서열번호 1 중 어느 하나의 프레임워크 아미노산 서열과 적어도 50%의 아미노산 동일성을 갖고;
각 프레임워크 영역은 서열번호 1의 프레임워크 아미노산 서열과 적어도 50%의 아미노산 동일성을 갖고, 항원 결합 단백질이 사람 IgG 분자의 Fc 도메인에 특이적으로 결합하고 뮤린 유래 또는 소 유래의 IgG 분자에는 결합하지 않는다.
하나의 예에서, 수지는 서열번호 2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 아미노산 잔기 중 1 또는 2개에서 서열번호 2와는 상이한 아미노산 서열을 포함하는 CDR1을 포함하는 VHH 항원 결합 단백질을 포함한다.
하나의 예에서, 수지는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2를 포함하는 VHH 항원 결합 단백질을 포함한다.
하나의 예에서, 수지는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하는 VHH 항원 결합 단백질을 포함한다.
하나의 예에서, 상기 방법은 세척 완충액으로 수지를 세척하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 IgG를 수거하기 전에 세척 완충액으로 수지를 세척하는 것을 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 결합된 IgG를 수거하기 전에 세척 완충액으로 수지를 세척하는 것을 포함한다.
하나의 예에서, 상기 방법은 IgG를 수거하는 것의 일부로서 세척 완충액으로 수지를 세척하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 결합된 IgG를 수거하는 것의 일부로서 세척 완충액으로 수지를 세척하는 것을 추가로 포함한다. 이러한 방법에서, 세척은 수지에서 결합되지 않거나 약하게 결합된 IgG를 제거할 수 있다. 이러한 결합되지 않거나 약하게 결합된 IgG는 결합된 IgG를 수거하기 전에 폐기될 수 있다. 대안적으로 결합되지 않거나 약하게 결합된 IgG를 수거한다. 하나의 예에서, 결합되고, 결합되지 않고 약하게 결합된 IgG를 수거한다. 하나의 예에서, 결합되고, 약하게 결합된 IgG를 수거한다. 또 다른 예에서, 결합되지 않고 약하게 결합된 IgG를 수거하지 않는다.
하나의 예에서, 상기 방법은 IgG를 수거하기전에 세척 완충액으로 수지를 세척하는 것을 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 세척 완충액으로 수지로부터의 불순물을 세척하고 IgG를 수거하는 것을 포함한다. 하나의 예에서, 상기 방법은 IgG를 수거하기 전에 세척 완충액으로 수지를 세척하고 통류물을 수거하는 것을 포함한다. 하나의 예에서, 통류물은 불순물을 포함한다. 하나의 예에서, 상기 방법은 IgG를 수거하기 전에 세척 완충액으로 수지를 세척하고 통류물 중에 불순물을 수거하는 것을 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 세척 완충액으로 수지로부터의 불순물을 수거하는 것을 포함한다. 하나의 예에서, 불순물 및 IgG를 수거한다. 예를 들어, 물순물 및 IgG를 함께 수거한다. 또 다른 예에서, 불순물 및 IgG를 별도로 수거한다.
하나의 예에서, 상기 방법은 세척 분획물을 수거하는 것을 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 IgG를 수거하기전에 세척 분획물을 수거하는 것을 포함한다. 하나의 예에서, 세척 분획물은 불순물을 포함한다. 하나의 예에서, 세척 분획물은 IgG를 포함한다. 예를 들어, 세척 분획물은 결합되지 않은 IgG를 포함한다. 하나의 예에서, 세척 분획물은 약하게 결합된 IgG를 포함한다. 또 다른 예에서, 세척 분획물은 결합되지 않고 약하게 결합된 IgG를 포함한다. 하나의 예에서, 세척 분획물은 불순물 및 IgG를 포함한다.
하나의 예에서, 불순물은 알부민(α-글로불린 및/또는 β-글로불린), 혈장 지질, 혈장 단백질, 프로테아제 (예를 들어, 세린 프로테아제, 칼리크레인, 플라스민 및 FXa), 세린 프로테아제 억제제(예를 들어, C1 억제제, 알파-1- 항트립신 및 항-트롬빈) IgA 및 IgM, 인자 VIII, 피브리노겐, 폰 빌레브란트 인자, 활성화된 응고 인자(예를 들어, FXa, FIXa, FVIIa 및 트롬빈), 인자 XIII, 접촉 시스템 인자 (예를 들어, FXIa, FXIIa 및 혈장 칼리크레인), PKA, 인자 IX, 프로트롬빈 복합체, C1 에스테라제 억제제, 단백질 C, 항-트롬빈 III, RhD 면역글로불린 및/또는 혈소판 막 미세입자를 포함한다.
하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된다.
하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 IgG-집적된 제제이다. 또 다른 예에서, 혈장 단백질 생성물은 정제된 IgG를 포함한다.
하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 결합되고, 결합되지 않고/않거나 약하게 결합된 IgG를 사용하여 생성된다. 예를 들어, 결합되고, 결합되지 않고/않거나 약하게 결합된 IgG를 사용하여 혈장 단백질 생성물을 생성한다. 하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 결합된 IgG를 사용하여 생성된다. 예를 들어, 결합된 IgG를 사용하여 혈장 단백질 생성물을 생성한다. 하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 결합되지 않은 IgG를 사용하여 생성된다. 예를 들어, 결합되지 않은 IgG를 사용하여 혈장 단백질 생성물을 생성한다. 하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 약하게 결합된 IgG를 사용하여 생성된다. 예를 들어, 약하게 결합된 IgG를 사용하여 혈장 단백질 생성물을 생성한다. 하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 결합되고/약하게 결합된 IgG를 사용하여 생성된다. 예를 들어, 결합되고, 약하게 결합된 IgG를 사용하여 혈장 단백질 생성물을 생성한다. 하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 결합되지 않고 약하게 결합된 IgG를 사용하여 생성된다. 예를 들어, 결합되지 않고 약하게 결합된 IgG를 사용하여 혈장 단백질 생성물을 생성한다. 하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 결합되고 결합되지 않은 IgG를 사용하여 생성된다. 예를 들어, 결합되고 결합되지 않은 IgG를 사용하여 혈장 단백질 생성물을 생성한다. 하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 결합되고, 결합되지 않고 약하게 결합된 IgG를 사용하여 생성된다. 예를 들어, 결합되고, 결합되지 않고 약하게 결합된 IgG를 사용하여 혈장 단백질 생성물을 생성한다.
하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 불순물을 사용하여 생성된다. 예를 들어, 불순물을 수거하고 이를 사용하여 혈장 단백질 생성물을 생성한다.
하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 알부민, 세린 프로테아제, 플라스민, FXa, 알파-1-항트립신, IgA, IgM, 인자 VIII, 피브로넥틴, 폰 빌레브란트 인자, 활성화된 응고 인자, 인자 XIII, 접촉 시스템 인자, PKA, 인자 IX, 프로트롬빈 복합체, C1 에스테라제 억제제, 단백질 C, 항-트롬빈 III, RhD 면역글로불린 단백질 생성물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 예에서, 활성화된 응고 인자는 FXa, FIXa, FVIIa 및 트롬빈으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 예를 들어, 활성화된 응고 인자는 FXa이다. 예를 들어, 활성화된 응고 인자는 FIXa이다. 예를 들어, 활성화된 응고 인자는 FVIIa이다. 예를 들어, 활성화된 응고 인자는 트롬빈이다.
하나의 예에서, 접촉 시스템 인자 단백질은 FXIa, FXIIa 및 칼리크레인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 예를 들어, 접촉 시스템 인자 단백질은 FXIa이다. 예를 들어, 접촉 시스템 인자 단백질은 FXII이다. 예를 들어, 접촉 시스템 인자 단백질은 칼리크레인이다.
하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 알부민 단백질 생성물이다. 하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 세린 프로테아제 단백질 생성물이다. 하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 플라스민 단백질 생성물이다. 하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 FXa 단백질 생성물이다. 하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 알파-1-항트립신 단백질 생성물이다. 하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 IgA 단백질 생성물이다. 하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 IgM 단백질 생성물이다. 하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 인자 VIII 단백질 생성물이다. 하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 피브리노겐 단백질 생성물이다. 하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 폰 빌레브란트 인자 단백질 생성물이다. 하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 활성화된 응고 인자단백질 생성물이다. 예를 들어, 혈장 단백질 생성물은 FXa 단백질 생성물이다. 예를 들어, 혈장 단백질 생성물은 FIXa 단백질 생성물이다. 예를 들어, 혈장 단백질 생성물은 FVIIa 단백질 생성물이다. 예를 들어, 혈장 단백질 생성물은 트롬빈 단백질 생성물이다.
하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 인자 XIII 단백질 생성물이다. 하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 접촉 시스템 인자 단백질 생성물이다. 예를 들어, 혈장 단백질 생성물은 FXIa 단백질 생성물이다. 예를 들어, 혈장 단백질 생성물은 FXII 단백질 생성물이다. 예를 들어, 혈장 단백질 생성물은 칼리크레인 혈장 생성물이다. 하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 PKA 단백질 생성물이다. 하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 인자 IX 단백질 생성물이다. 하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 프로트롬빈 복합체 단백질 생성물이다. 하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 C1 에스테라제 억제제 단백질 생성물이다. 하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 단백질 C 단백질 생성물이다. 하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 항-트롬빈 III 단백질 생성물이다. 하나의 예에서, 혈장 단백질 생성물은 RhD 면역글로불린 단백질 생성물이다.
하나의 예에서, 세척 완충액은 25°C에서 pH가 5에서 9 사이이고 해리 상수(pKa)가 6.8에서 8.5 사이이다. 하나의 예에서, 세척 완충액은 25°C에서 pH가 5에서 10 사이이고 해리 상수(pKa)가 6.8에서 8.5 사이이다.
하나의 예에서, 세척 완충액은 5 내지 10의 pH를 갖는다. 하나의 예에서, 세척 완충액은 5 내지 9의 pH를 갖는다. 예를 들어, 세척 완충액은 pH 5, 또는 5.1, 또는 5.2, 또는 5.3, 또는 5.4, 또는 5.5, 또는 5.6, 또는 5.7, 또는 5.8, 또는 5.9, 또는 6.0, 또는 6.1, 또는 6.2, 또는 6.3, 또는 6.4, 또는 6.5, 또는 6.6, 또는 6.7, 또는 6.8, 또는 6.9, 또는 7, 또는 7.1, 또는 7.2, 또는 7.3, 또는 7.4, 또는 7.5, 또는 7.6 또는 7.7 또는 7.8, 또는 7.9, 또는 8.0, 또는 8.1, 또는 8.2, 또는 8.3, 또는 8.4, 또는 8.5, 또는 8.6, 또는 8.7, 또는 8.8, 또는 8.9, 또는 9.0, 또는 9.1 또는 9.2, 또는 9.3, 또는 9.4, 또는 9.5, 또는 9.6, 또는 9.7, 또는 9.8, 또는 9.9, 또는 10.0이다.
하나의 예에서, 세척 완충액은 25°C에서 pH가 7에서 10 사이이고 해리 상수(pKa)가 6.8에서 8.5 사이이다.
하나의 예에서, 세척 완충액은 25°C에서 pH가 7에서 8 사이이고 해리 상수(pKa)가 6.8에서 8.5 사이이다.
하나의 예에서, 세척 완충액은 7 내지 8의 pH를 갖는다. 예를 들어, 세척 완충액은 pH 7, 또는 7.1, 또는 7.2, 또는 7.3, 또는 7.4, 또는 7.5, 또는 7.6 또는 7.7 또는 7.8, 또는 7.9 또는 8.0이다. 하나의 예에서, 세척 완충액은 7.4의 pH를 갖는다.
하나의 예에서, 세척 완충액은 7.4 내지 7.8의 pH를 갖는다. 예를 들어, 세척 완충액은 7.4, 또는 7.5, 또는 7.6 또는 7.7 또는 7.8의 pH를 갖는다.
하나의 예에서, 세척 완충액은 25°C에서 6.8 내지 8.5의 pKa를 갖는다. 예를 들어, 세척 완충액은 25°C에서 6.8, 또는 6.9, 또는 7.0, 또는 7.1, 또는 7.2, 또는 7.3, 또는 7.4, 또는 7.5, 또는 7.6, 또는 7.7, 또는 7.8, 또는 7.9, 또는 8.0, 또는 8.1, 또는 8.2, 또는 8.3, 또는 8.4, 또는 8.5의 pKa를 갖는다.
하나의 예에서, 세척 완충액은 25°C에서 7.21의 pKa를 갖는다.
하나의 예에서, 세척 완충액은 25°C에서 7.4의 pH 및 7.21의 해리 상수 (pKa)를 갖는다.
하나의 예에서, 세척 완충액은 인산이수소나트륨, 나트륨 시트레이트, 이미다졸, Tris, 글리실글라이신, 3-모르폴리노프로판-1-설폰산(MOPS), 피페라진-N,N′-비스(2-에탄설폰산)(PIPES), 2-[(2-하이드록시-1,1-비스(하이드록시메틸)에틸)아미노]에탄설폰산(TES), 비스[(2-하이드록시에틸)아미노]아세트산(비신), 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES), 황산, 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진프로판설폰산(EPPS), N-(하이드록시에틸)피페라진-N'-2-하이드록시프로판설폰산(HEPPSO), 4-(N-모르폴리노)부탄설폰산(MOBS), 피페라진-N,N′-비스(2-하이드록시프로판설폰산)(POPSO), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-3-아미노-2-하이드록시프로판설폰산(TAPSO), 트리신, 트리에탄올아민(TEA) 및 이들의 조합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 완충제를 포함한다. 예를 들어, 세척 완충액은 인산이수소나트륨 완충액이다. 예를 들어, 세척 완충액은 이미다졸 완충액이다. 또 다른 예에서, 세척 완충액은 Tris 완충액이다. 추가의 예에서, 세척 완충액은 글리실글라이신 완충액이다. 하나의 예에서, 세척 완충액은 MOPS 완충액이다. 또 다른 예에서, 세척 완충액은 PIPES 완충액이다. 추가의 예에서, 세척 완충액은 TES 완충액이다. 하나의 예에서, 세척 완충액은 비신(Bicine) 완충액이다. 또 다른 예에서, 세척 완충액은 황산 완충액이다. 추가의 예에서, 세척 완충액은 EPPS 완충액이다. 하나의 예에서, 세척 완충액은 HEPPSO 완충액이다. 또 다른 예에서, 세척 완충액은 MOBS 완충액이다. 추가의 예에서, 세척 완충액은 POPSO 완충액이다. 하나의 예에서, 세척 완충액은 TAPSO 완충액이다. 또 다른 예에서, 세척 완충액은 트리신 완충액이다. 추가의 예에서, 세척 완충액은 TEA 완충액이다. 하나의 예에서, 세척 완충액은 나트륨 시트레이트 완충액이다.
하나의 예에서, 세척 완충액의 완충제는 5mM 내지 200mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 세척 완충액의 완충제는 5mM 내지 10mM, 5mM 내지 20mM, 5mM 내지 50mM, 50mM 내지 100mM, 100mM 내지 150mM, 150mM 내지 200mM 사이의 농도이다. 또 다른 예에서, 세척 완충액의 완충제는 5mM, 또는 10mM, 또는 15mM, 또는 20mM, 또는 25mM, 또는 30mM, 또는 35mM, 또는 40mM, 또는 45mM, 또는 50mM, 또는 55mM, 또는 60mM, 또는 65mM, 또는 70mM, 또는 75mM, 또는 80mM, 또는 85mM, 또는 90mM, 또는 95mM, 또는 100mM, 또는 105mM, 또는 110mM, 또는 115mM, 또는 120mM, 또는 125mM, 또는 130mM, 또는 135mM, 또는 140mM, 또는 145mM, 또는 150mM, 또는 155mM, 또는 160mM, 또는 165mM, 또는 170mM, 또는 175mM, 또는 180mM, 또는 185mM, 또는 190mM, 또는 195mM, 또는 200mM의 농도이다.
하나의 예에서, 세척 완충액의 완충제는 5mM의 농도이다.
하나의 예에서, 세척 완충액의 완충제는 20mM의 농도이다.
하나의 예에서, 세척 완충액의 완충제는 50mM의 농도이다.
하나의 예에서, 세척 완충액의 완충제는 100mM의 농도이다.
하나의 예에서, 세척 완충액의 완충제는 150mM의 농도이다.
하나의 예에서, 세척 완충액의 완충제는 200mM의 농도이다.
하나의 예에서, 세척 완충액은 염화나트륨을 추가로 포함한다. 예를 들어, 세척 완충액은 최대 1000mM 농도의 염화나트륨을 추가로 포함한다. 하나의 예에서, 염화나트륨은 5mM 내지 50mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 염화나트륨은 5mM, 또는 10mM, 또는 15mM, 또는 20mM, 또는 25mM, 또는 30mM, 또는 35mM, 또는 40mM, 또는 45mM, 또는 50mM의 농도이다. 하나의 예에서, 염화나트륨은 50mM 내지 100mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 염화나트륨은 55mM, 또는 60mM, 또는 65mM, 또는 70mM, 또는 75mM, 또는 80mM, 또는 85mM, 또는 90mM, 또는 95mM, 또는 100mM의 농도이다. 하나의 예에서, 염화나트륨은 100 내지 200mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 염화나트륨은 105mM, 또는 110mM, 115mM, 또는120mM, 또는 125mM, 또는 130mM, 또는 135mM, 또는 140mM, 또는 145mM, 또는 150mM, 또는 155mM, 또는 160mM, 또는 165mM 또는 170mM, 또는 175mM, 또는 180mM, 또는 185mM, 또는 190mM, 또는 195mM 또는 200mM의 농도이다. 또 다른 예에서, 염화나트륨은 200mM 내지 300mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 염화나트륨은 200mM, 또는 225mM, 또는 250mM, 또는 275mM, 또는 300mM의 농도이다. 추가의 예에서, 염화나트륨은 300 내지 400mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 염화나트륨은 300mM, 또는 325mM, 또는 350mM, 또는 375mM, 또는 400mM의 농도이다. 하나의 예에서, 염화나트륨은 400mM 내지 500mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 염화나트륨은 400mM, 또는 425mM, 또는 450mM, 또는 475mM, 또는 400mM의 농도이다. 하나의 예에서, 염화나트륨은 500mM 내지 1000mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 염화나트륨은 500mM, 또는 550mM, 또는 600mM, 또는 650mM, 또는 700mM, 또는 750mM, 또는 800mM, 또는 850mM, 또는 900mM, 또는 950 mM 또는 1000mM의 농도이다. 하나의 예에서, 염화나트륨은 1000mM 미만의 농도이다. 예를 들어, 염화나트륨은 500mM의 농도이다.
하나의 예에서, 세척 완충액은 염화나트륨을 추가로 포함하고, 여기서 염화나트륨은 145mM의 농도이다.
하나의 예에서, 세척 완충액은 염화나트륨을 추가로 포함하고, 여기서 염화나트륨은 500mM의 농도이다.
하나의 예에서, 세척 완충액은 20mM 인산이수소나트륨, 145mM 염화나트륨을 포함하고 pH는 7.4이다.
하나의 예에서, 세척 완충액은 20mM 인산이수소나트륨, 500mM 염화나트륨을 포함하고 pH는 7.4이다.
하나의 예에서, 세척 완충액은 2가 염을 추가로 포함한다. 예를 들어, 세척 완충액은 최대 1000mM 농도의 2가 염을 추가로 포함한다. 하나의 예에서, 2가 염은 5mM 내지 50mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 2가 염은 5mM, 또는 10mM, 또는 15mM, 또는 20mM, 또는 25mM, 또는 30mM, 또는 35mM, 또는 40mM, 또는 45mM, 또는 50mM의 농도이다. 또 다른 예에서, 2가 염은 50mM 내지 100mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 2가 염은 55mM, 또는 60mM, 또는 65mM, 또는 70mM, 또는 75mM, 또는 80mM, 또는 85mM, 또는 90mM, 또는 95mM, 또는 100mM의 농도이다. 하나의 예에서, 2가 염은 100 내지 200mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 2가 염은 105mM, 또는 110mM, 115mM, 또는 120mM, 또는 125mM, 또는 130mM, 또는 135mM, 또는 140mM, 또는 145mM, 또는 150mM, 또는 155mM, 또는 160mM, 또는 165mM 또는 170mM, 또는 175mM, 또는 180mM, 또는 185mM, 또는 190mM, 또는 195mM 또는 200mM의 농도이다. 또 다른 예에서, 2가 염은 200 내지 300mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 2가 염은 200mM, 또는 225mM, 또는 250mM, 또는 275mM, 또는 300mM의 농도이다. 추가의 예에서, 2가 염은 300 내지 400mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 2가 염은 300mM, 또는 325mM, 또는 350mM, 또는 375mM, 또는 400mM의 농도이다. 하나의 예에서, 2가 염은 400mM 내지 500mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 2가 염은 400mM, 또는 425mM, 또는 450mM, 또는 475mM, 또는 400mM의 농도이다. 또 다른 예에서, 2가 염은 500mM 내지 1000mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 2가 염은 500mM, 또는 550mM, 또는 600mM, 또는 650mM, 또는 700mM, 또는 750mM, 또는 800mM, 또는 850mM, 또는 900mM, 또는 950mM, 또는 1000mM의 농도이다. 하나의 예에서, 2가 염은 500mM의 농도이다. 하나의 예에서, 2가 염은 1000mM 미만의 농도이다.
하나의 예에서, 세척 완충액은 최대 1000mM 농도의 염화나트륨 및/또는 2가 염을 포함한다. 예를 들어, 세척 완충액은 약 500mM 농도의 염화나트륨 및/또는 2가 염을 포함한다.
하나의 예에서, 2가 염은 염화마그네슘, 염화칼슘, 염화바륨, 염화구리(II), 염화니켈, 염화망간 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 예를 들어, 2가 염은 염화마그네슘이다. 하나의 예에서, 2가 염은 염화칼슘이다. 또 다른 예에서, 2가 염은 염화바륨이다. 추가의 예에서, 2가 염은 염화구리이다. 하나의 예에서, 2가 염은 염화니켈이다. 또 다른 예에서, 2가 염은 염화망간이다.
하나의 예에서, 방법은 용출 완충액을 사용하여 수지로부터 IgG를 용출시켜 IgG를 수거하는 것을 포함한다. 예를 들어, 방법은 용출 완충액을 사용하여 수지로부터 결합된 IgG를 용출시켜 결합된 IgG를 수거하는 것을 포함한다.
하나의 예에서, 용출 완충액은 3 내지 5 사이의 pH를 갖는다. 예를 들어, 용출 완충액은 3, 또는 3.1, 또는 3.2, 또는 3.3, 또는 3.4, 또는 3.5, 또는 3.6, 또는 3.7, 또는 3.8, 또는 3.9, 또는 4, 또는 4.1, 또는 4.2, 또는 4.3, 또는 4.4, 또는 4.5, 또는 4.6, 또는 4.7, 또는 4.8, 또는 4.9, 또는 5의 pH를 갖는다.
하나의 예에서, 용출 완충액은 4의 pH를 갖는다.
하나의 예에서, 용출 완충액은 나트륨 아세테이트, 아세트산 및 나트륨 시트레이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된 완충제를 포함한다. 하나의 에에서, 용출 완충액은 나트륨 아세테이트, 아세트산, 나트륨 시트레이트 및 인산이수소나트륨을 포함한다. 하나의 예에서, 용출 완충액은 인산나트륨 완충액 및/또는 아세테이트 완충액이거나 이를 포함한다. 예를 들어, 용출 완충액은 나트륨 아세테이트를 포함한다. 예를 들어, 용출 완충액은 아세트산을 포함한다. 예를 들어, 용출 완충액은 나트륨 시트레이트를 포함한다. 예를 들어, 용출 완충액은 인산이수소나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 용출 완충액의 완충제는 5mM 내지 200mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 용출 완충액의 완충제는 5mM 내지 10mM, 또는 5mM 내지 20mM, 또는 5mM 내지 50mM, 또는 50mM 내지 100mM, 또는 100mM 내지 150mM, 또는 150mM 내지 200mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 세척 완충액의 완충제는 5mM, 또는 10mM, 또는 15mM, 또는 20mM, 또는 25mM, 또는 30mM, 또는 35mM, 또는 40mM, 또는 45mM, 또는 50mM, 또는 55mM, 또는 60mM, 또는 65mM, 또는 70mM, 또는 75mM, 또는 80mM, 또는 85mM, 또는 90mM, 또는 95mM, 또는 100mM, 또는 105mM, 또는 110mM, 또는 115mM, 또는 120mM, 또는 125mM, 또는 130mM, 또는 135mM, 또는 140mM, 또는 145mM, 또는 150mM, 또는 155mM, 또는 160mM, 또는 165mM, 또는 170mM, 또는 175mM, 또는 180mM, 또는 185mM, 또는 190mM, 또는 195mM, 또는 200mM의 농도이다.
하나의 예에서, 용출 완충액의 완충제는 5mM의 농도이다.
하나의 예에서, 용출 완충액의 완충제는 20mM의 농도이다.
하나의 예에서, 용출 완충액의 완충제는 50mM의 농도이다.
하나의 예에서, 용출 완충액의 완충제는 100mM의 농도이다.
하나의 예에서, 용출 완충액의 완충제는 150mM의 농도이다.
하나의 예에서, 용출 완충액의 완충제는 200mM의 농도이다.
하나의 예에서, 용출 완충액은 아세테이트 완충액이거나 이를 포함한다. 예를 들어, 나트륨 아세테이트 완충액.
하나의 예에서, 용출 완충액은 포스페이트 완충액 및/또는 아세테이트 완충액이거나 이를 포함한다. 예를 들어, 용출 완충액은 인산이수소나트륨 및/또는 나트륨 아세테이트 완충액이거나 이를 포함한다. 하나의 예에서, 용출 완충액은 포스페이트 완충액이거나 이를 포함한다.
하나의 예에서, 용출 완충액은 3 내지 5 사이의 pH의 아세테이트 완충액이거나 이를 포함한다. 예를 들어, 용출 완충액은 3, 또는 3.1, 또는 3.2, 또는 3.3, 또는 3.4, 또는 3.5, 또는 3.6, 또는 3.7, 또는 3.8, 또는 3.9, 또는 4, 또는 4.1, 또는 4.2, 또는 4.3, 또는 4.4, 또는 4.5, 또는 4.6, 또는 4.7, 또는 4.8, 또는 4.9, 또는 5의 pH의 아세테이트 완충액이거나 이를 포함한다. 하나의 예에서, 용출 완충액은 4의 pH의 아세테이트 완충액이거나 이를 포함한다. 예를 들어, 용출 완충액은 4의 pH의 나트륨 아세테이트 완충액이거나 이를 포함한다.
하나의 예에서, 용출 완충액은 3 내지 5 사이의 pH의 포스페이트 및/또는 아세테이트 완충액이거나 이를 포함한다. 예를 들어, 용출 완충액은 3, 또는 3.1, 또는 3.2, 또는 3.3, 또는 3.4, 또는 3.5, 또는 3.6, 또는 3.7, 또는 3.8, 또는 3.9, 또는 4, 또는 4.1, 또는 4.2, 또는 4.3, 또는 4.4, 또는 4.5, 또는 4.6, 또는 4.7, 또는 4.8, 또는 4.9, 또는 5의 pH의 포스페이트 및/또는 아세테이트 완충액이거나 이를 포함한다. 하나의 예에서, 용출 완충액은 4의 pH의 포스페이트 및/또는 아세테이트 완충액이거나 이를 포함한다.
하나의 예에서, 용출 완충액은 3 내지 5 사이의 pH의 포스페이트 완충액이거나 이를 포함한다. 예를 들어, 용출 완충액은 3, 또는 3.1, 또는 3.2, 또는 3.3, 또는 3.4, 또는 3.5, 또는 3.6, 또는 3.7, 또는 3.8, 또는 3.9, 또는 4, 또는 4.1, 또는 4.2, 또는 4.3, 또는 4.4, 또는 4.5, 또는 4.6, 또는 4.7, 또는 4.8, 또는 4.9, 또는 5의 pH의 포스페이트 완충액이거나 이를 포함한다. 하나의 예에서, 용출 완충액은 4의 pH의 포스페이트 완충액이거나 이를 포함한다.
하나의 예에서, 용출 완충액은 10 mM, 또는 11 mM, 또는 12 mM, 또는 13 mM, 또는 14 mM, 또는 15 mM, 또는 16 mM, 또는 17 mM, 또는 18 mM, 또는 19 mM, 또는 20 mM의 포스페이트 및/또는 아세테이트 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 용출 완충액은 10 mM, 또는 11 mM, 또는 12 mM, 또는 13 mM, 또는 14 mM, 또는 15 mM, 또는 16 mM, 또는 17 mM, 또는 18 mM, 또는 19 mM, 또는 20 mM의 아세테이트 완충액을 포함한다. 예를 들어, 용출 완충액은 20mM의 아세테이트 완충액을 포함한다. 하나의 예에서, 용출 완충액은 20mM의 나트륨 아세테이트 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 용출 완충액은 10 mM, 또는 11 mM, 또는 12 mM, 또는 13 mM, 또는 14 mM, 또는 15 mM, 또는 16 mM, 또는 17 mM, 또는 18 mM, 또는 19 mM, 또는 20 mM의 포스페이트 완충액을 포함한다. 예를 들어, 용출 완충액은 20mM의 포스페이트 완충액을 포함한다. 하나의 예에서, 용출 완충액은 20mM의 나트륨 포스페이트 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 용출 완충액은 4의 pH의 20mM 나트륨 아세테이트를 포함한다.
하나의 예에서, 용출 완충액은 염화나트륨을 추가로 포함한다. 예를 들어, 용출 완충액은 최대 150mM 농도의 염화나트륨을 추가로 포함한다. 하나의 예에서, 염화나트륨은 50 내지 100mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 염화나트륨은 5mM, 10mM, 15mM, 20mM, 25mM, 30mM, 35mM, 40mM, 45mM, 또는 50mM의 농도이다. 또 다른 예에서, 염화나트륨은 100 내지 150mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 염화나트륨은 55mM, 60mM, 65mM, 70mM, 75mM, 80mM, 85mM, 90mM, 95mM, 100mM, 105mM, 110mM, 115mM, 120mM, 125mM, 130mM, 135mM, 140mM, 145mM 또는 150mM의 농도이다.
하나의 예에서, 용출 완충액은 2가 염을 추가로 포함한다. 예를 들어, 용출 완충액은 최대 150mM 농도의 2가 염을 추가로 포함한다. 하나의 예에서, 2가 염은 50 내지 100mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 2가 염은 5mM, 10mM, 15mM, 20mM, 25mM, 30mM, 35mM, 40mM, 45mM, 또는 50mM의 농도이다. 또 다른 예에서, 2가 염은 100 내지 150mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 2가 염은 55mM, 60mM, 65mM, 70mM, 75mM, 80mM, 85mM, 90mM, 95mM, 100mM, 105mM, 110mM, 115mM, 120mM, 125mM, 130mM, 135mM, 140mM, 145mM 또는 150mM의 농도이다.
하나의 예에서, 2가 염은 염화마그네슘, 염화칼슘, 염화바륨, 염화구리(II), 염화니켈, 염화망간 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 예를 들어, 2가 염은 염화마그네슘이다. 예를 들어, 2가 염은 염화칼슘이다. 하나의 예에서, 2가 염은 염화바륨이다. 또 다른 예에서, 2가 염은 염화구리이다. 추가의 예에서, 2가 염은 염화니켈이다. 하나의 예에서, 2가 염은 염화망간이다.
하나의 예에서, 상기 방법은 평형화 완충액으로 수지를 평형화시키는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 수지는 수지상에 IgG를 포함하는 혈장 또는 이의 분획물을 부하하기 전에 평형화시킨다.
하나의 예에서, 상기 방법은 5 내지 9 사이의 pH를 갖는 평형화 완충액으로 수지를 평형화시키는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 평형화 완충액은 5, 또는 5.1, 또는 5.2, 또는 5.3, 또는 5.4, 또는 5.5, 또는 5.6, 또는 5.7, 또는 5.8, 또는 5.9, 또는 6.0, 또는 6.1, 또는 6.2, 또는 6.3, 또는 6.4, 또는 6.5, 또는 6.6, 또는 6.7, 또는 6.8, 또는 6.9, 또는 7, 또는 7.1, 또는 7.2, 또는 7.3, 또는 7.4, 또는 7.5, 또는 7.6 또는 7.7 또는 7.8, 또는 7.9, 또는 8.0, 또는 8.1, 또는 8.2, 또는 8.3, 또는 8.4, 또는 8.5, 또는 8.6, 또는 8.7, 또는 8.8, 또는 8.9, 또는 9.0의 pH를 갖는다.
하나의 예에서, 상기 방법은 7 내지 8 사이의 pH를 갖는 평형화 완충액으로 수지를 평형화시키는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 평형화 완충액은 7, 또는 7.1, 또는 7.2, 또는 7.3, 또는 7.4, 또는 7.5, 또는 7.6 또는 7.7 또는 7.8, 또는 7.9 또는 8의 pH이다. 하나의 예에서, 평형화 완충액은 7.4의 pH이다.
하나의 예에서, 평형화 완충액은 인산이수소나트륨, 나트륨 시트레이트, 이미다졸, 트리스, 글리실글라이신, MOPS, PIPES, TES, 비신, HEPES, EPPS, HEPPSO, MOBS, POPSO, TAPSO, 트리신, TEA 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 완충제를 포함한다. 예를 들어, 평형화 완충액은 인산이수소나트륨 완충액이다. 또 다른 예에서, 평형화 완충액은 나트륨 시트레이트 완충액이다. 추가의 예에서, 평형화 완충액은 이미다졸 완충액이다. 하나의 예에서, 평형화 완충액은 Tris 완충액이다. 또 다른 예에서, 평형화 완충액은 글리실글라이신 완충액이다. 추가의 예에서, 평형화 완충액은 MOPS 완충액이다. 하나의 예에서, 평형화 완충액은 PIPES 완충액이다. 또 다른 예에서, 평형화 완충액은 TES 완충액이다. 추가의 예에서, 평형화 완충액은 비신 완충액이다. 하나의 예에서, 평형화 완충액은 황산 완충액이다. 또 다른 예에서, 평형화 완충액은 EPPS 완충액이다. 추가의 예에서, 평형화 완충액은 HEPPSO 완충액이다. 하나의 예에서, 평형화 완충액은 MOBS 완충액이다. 또 다른 예에서, 평형화 완충액은 POPSO 완충액이다. 추가의 예에서, 평형화 완충액은 TAPSO 완충액이다. 하나의 예에서, 평형화 완충액은 트리신 완충액이다. 또 다른 예에서, 평형화 완충액은 TEA 완충액이다.
하나의 예에서, 평형화 완충액의 완충제는 5mM 내지 200mM 사이의 농도이다. 하나의 예에서, 평형화 완충액의 완충제는 5mM 내지 50mM 사이의 농도, 예를 들어, 5mM, 또는 10mM, 또는 15mM, 또는 20mM, 또는 25mM, 또는 30mM, 또는 35mM, 또는 40mM, 또는 45mM, 또는 50mM의 농도이다. 또 다른 예에서, 평형화 완충액의 완충제는 50mM 내지 100mM 사이의 농도, 예를 들어, 55mM, 또는 60mM, 또는 65mM, 또는 70mM, 또는 75mM, 또는 80mM, 또는 85mM, 또는 90mM, 또는 950 mM 또는 100mM의 농도이다. 추가의 예에서, 평형화 완충액은 100mM 내지 150mM 사이의 농도, 예를 들어, 105mM, 또는 110mM, 또는 115mM, 또는 120mM, 또는 125mM, 또는 130mM, 또는 135mM, 또는 140mM, 또는 145mM, 또는 150mM의 농도이다. 하나의 예에서, 평형화 완충액은 150mM 내지 200mM 사이의 농도, 예를 들어, 155mM, 또는 160mM, 또는 165mM, 또는 170mM, 또는 175mM, 또는 180mM, 또는 185mM, 또는 190mM, 또는 195mM, 또는 200mM의 농도이다.
하나의 예에서, 평형화 완충액의 완충제는 5mM의 농도이다.
하나의 예에서, 평형화 완충액의 완충제는 20mM의 농도이다.
하나의 예에서, 평형화 완충액의 완충제는 50mM의 농도이다.
하나의 예에서, 평형화 완충액의 완충제는 100mM의 농도이다.
하나의 예에서, 평형화 완충액의 완충제는 150mM의 농도이다.
하나의 예에서, 평형화 완충액의 완충제는 200mM의 농도이다.
하나의 예에서, 평형화 완충액은 염화나트륨을 추가로 포함한다. 예를 들어, 평형화 완충액은 최대 1000mM 농도의 염화나트륨을 추가로 포함한다. 하나의 예에서, 염화나트륨은 5mM 내지 50mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 염화나트륨은 5mM, 또는 10mM, 또는 15mM, 또는 20mM, 또는 25mM, 또는 30mM, 또는 35mM, 또는 40mM, 또는 45mM, 또는 50mM의 농도이다. 하나의 예에서, 염화나트륨은 50mM 내지 100mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 염화나트륨은 55mM, 또는 60mM, 또는 65mM, 또는 70mM, 또는 75mM, 또는 80mM, 또는 85mM, 또는 90mM, 또는 95mM, 또는 100mM의 농도이다. 하나의 예에서, 염화나트륨은 100 내지 200mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 염화나트륨은 105mM, 또는 110mM, 115mM, 또는120mM, 또는 125mM, 또는 130mM, 또는 135mM, 또는 140mM, 또는 145mM, 또는 150mM, 또는 155mM, 또는 160mM, 또는 165mM 또는 170mM, 또는 175mM, 또는 180mM, 또는 185mM, 또는 190mM, 또는 195mM 또는 200mM의 농도이다. 또 다른 예에서, 염화나트륨은 200mM 내지 300mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 염화나트륨은 200mM, 또는 225mM, 또는 250mM, 또는 275mM, 또는 300mM의 농도이다. 추가의 예에서, 염화나트륨은 300 내지 400mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 염화나트륨은 300mM, 또는 325mM, 또는 350mM, 또는 375mM, 또는 400mM의 농도이다. 하나의 예에서, 염화나트륨은 400mM 내지 500mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 염화나트륨은 400mM, 또는 425mM, 또는 450mM, 또는 475mM, 또는 400mM의 농도이다. 하나의 예에서, 염화나트륨은 500mM 내지 1000mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 염화나트륨은 500mM, 또는 550mM, 또는 600mM, 또는 650mM, 또는 700mM, 또는 750mM, 또는 800mM, 또는 850mM, 또는 900mM, 또는 950 mM 또는 1000mM의 농도이다. 하나의 예에서, 염화나트륨은 1000mM 미만의 농도이다. 예를 들어, 염화나트륨은 500mM의 농도이다.
하나의 예에서, 평형화 완충액은 염화나트륨을 추가로 포함하고, 여기서 염화나트륨은 145mM의 농도이다.
하나의 예에서, 평형화 완충액은 염화나트륨을 추가로 포함하고, 여기서 염화나트륨은 500mM의 농도이다.
하나의 예에서, 평형화 완충액은 2가 염을 추가로 포함한다. 예를 들어, 평형화 완충액은 최대 1000mM 농도의 2가 염을 추가로 포함한다. 하나의 예에서, 2가 염은 5mM 내지 50mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 2가 염은 5mM, 또는 10mM, 또는 15mM, 또는 20mM, 또는 25mM, 또는 30mM, 또는 35mM, 또는 40mM, 또는 45mM, 또는 50mM의 농도이다. 또 다른 예에서, 2가 염은 50mM 내지 100mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 2가 염은 55mM, 또는 60mM, 또는 65mM, 또는 70mM, 또는 75mM, 또는 80mM, 또는 85mM, 또는 90mM, 또는 95mM, 또는 100mM의 농도이다. 하나의 예에서, 2가 염은 100 내지 200mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 2가 염은 105mM, 또는 110mM, 115mM, 또는 120mM, 또는 125mM, 또는 130mM, 또는 135mM, 또는 140mM, 또는 145mM, 또는 150mM, 또는 155mM, 또는 160mM, 또는 165mM 또는 170mM, 또는 175mM, 또는 180mM, 또는 185mM, 또는 190mM, 또는 195mM 또는 200mM의 농도이다. 또 다른 예에서, 2가 염은 200 내지 300mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 2가 염은 200mM, 또는 225mM, 또는 250mM, 또는 275mM, 또는 300mM의 농도이다. 추가의 예에서, 2가 염은 300 내지 400mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 2가 염은 300mM, 또는 325mM, 또는 350mM, 또는 375mM, 또는 400mM의 농도이다. 하나의 예에서, 2가 염은 400mM 내지 500mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 2가 염은 400mM, 또는 425mM, 또는 450mM, 또는 475mM, 또는 400mM의 농도이다. 또 다른 예에서, 2가 염은 500mM 내지 1000mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 2가 염은 500mM, 또는 550mM, 또는 600mM, 또는 650mM, 또는 700mM, 또는 750mM, 또는 800mM, 또는 850mM, 또는 900mM, 또는 950mM, 또는 1000mM의 농도이다. 하나의 예에서, 2가 염은 1000mM 미만의 농도이다. 예를 들어, 2가 염은 500mM의 농도이다.
하나의 예에서, 2가 염은 염화마그네슘, 염화칼슘, 염화바륨, 염화구리(II), 염화니켈, 염화망간 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 예를 들어, 2가 염은 염화마그네슘이다. 하나의 예에서, 2가 염은 염화칼슘이다. 또 다른 예에서, 2가 염은 염화바륨이다. 추가의 예에서, 2가 염은 염화구리이다. 하나의 예에서, 2가 염은 염화니켈이다. 또 다른 예에서, 2가 염은 염화망간이다.
하나의 예에서, 평형화 완충액의 조성은 세척 완충액과 동일하다. 예를 들어, 평형화 완충액은 20mM 인산이수소나트륨, 145mM 염화나트륨을 포함하고 pH는 7.4이다. 또 다른 예에서, 평형화 완충액은 20mM 인산이수소나트륨, 500mM 염화나트륨을 포함하고 pH는 7.4이다.
하나의 예에서, 수지는 i) 수지를 스트립핑한 후 또는 ii) 수지를 스트립핑하지 않고 평형화시킨다. 예를 들어, 수지를 스트립핑한 후 수지를 평형화시킨다. 또 다른 예에서, 수지를 스트립핑하지 않고 수지를 평형화시킨다.
하나의 예에서, 상기 방법은 7 내지 8 사이의 pH를 갖는 평형화 완충액으로 수지를 스트립핑한 후 수지를 평형화시키는 것을 추가로 포함한다.
하나의 예에서, 상기 방법은 수지로부터 IgG를 수거한 후에 스트립핑 완충액으로 수지를 스트립핑함을 임의로 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 수지로부터 IgG를 수거한 후에 스트립핑 완충액으로 수지를 스트립핑함을 추가로 포함한다. 또 다른 예에서, 상기 방법은 수지로부터 IgG를 수거한 후에 스트립핑 완충액으로 수지를 스트립핑함을 포함하지 않는다. 예를 들어, 수지로부터 IgG를 수거한 후에 수지를 스트립핑하지 않는다.
하나의 예에서, 스트립핑 완충액은 2 내지 3 사이의 pH를 갖는다. 예를 들어, 스트립핑 완충액은 2, 또는 2.1, 또는 2.2, 또는 2.3, 또는 2.4, 또는 2.5, 또는 2.6 또는 2.7 또는 2.8, 또는 2.9 또는 3의 pH를 갖는다. 하나의 예에서, 스트립핑 완충액은 2.5의 pH이다.
하나의 예에서, 스트립핑 완충액은 인산이수소나트륨, 글라이신 및 나트륨 시트레이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된 완충제를 포함한다. 예를 들어, 스트립핑 완충액은 인산이수소나트륨을 포함한다. 예를 들어, 스트립핑 완충액은 글라이신을 포함한다. 예를 들어, 스트립핑 완충액은 나트륨 시트레이트를 포함한다.
하나의 예에서, 스트립핑 완충액의 완충제는 10mM 내지 500mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 스트립핑 완충액의 완충제는 10mM 내지 20mM, 또는 10mM 내지 50mM, 또는 10mM 내지 100mM, 또는 10mM 내지 100mM, 또는 10mM 내지 200mM, 또는 10mM 내지 300mM, 또는 10mM 내지 400mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 스트립핑 완충액의 완충제는 10mM, 또는 15mM, 또는 20mM, 또는 25mM, 또는 30mM, 또는 35mM, 또는 40mM, 또는 45mM, 또는 50mM, 또는 55mM, 또는 60mM, 또는 65mM, 또는 70mM, 또는 75mM, 또는 80mM, 또는 85mM, 또는 90mM, 또는 95mM, 또는 100mM, 또는 105mM, 또는 110mM, 또는 115mM, 또는 120mM, 또는 125mM, 또는 130mM, 또는 135mM, 또는 140mM, 또는 145mM, 또는 150mM, 또는 155mM, 또는 160mM, 또는 165mM, 또는 170mM, 또는 175mM, 또는 180mM, 또는 185mM, 또는 190mM, 또는 195mM, 또는 200mM, 또는 210mM, 또는 220mM, 또는 230mM, 또는 240mM, 또는 250mM, 또는 260mM, 또는 270mM, 또는 280mM, 또는 290mM, 또는 300mM, 또는 210mM, 또는 220mM, 또는 230mM, 또는 240mM, 또는 250mM, 또는 260mM, 또는 270mM, 또는 280mM, 또는 300mM, 또는 290mM, 또는 300mM, 또는 310mM, 또는 320mM, 또는 330mM, 또는 340mM, 또는 350mM, 또는 360mM, 또는 370mM, 또는 380mM, 또는 390mM, 또는 400mM, 또는 410mM, 또는 420mM, 또는 430mM, 또는 440mM, 또는 450mM, 또는 460mM, 또는 470mM, 또는 480mM, 또는 480mM, 또는 490mM, 또는 500mM의 농도이다.
하나의 예에서, 스트립핑 완충액의 완충제는 5mM의 농도이다.
하나의 예에서, 스트립핑 완충액의 완충제는 20mM의 농도이다.
하나의 예에서, 스트립핑 완충액의 완충제는 50mM의 농도이다.
하나의 예에서, 스트립핑 완충액의 완충제는 100mM의 농도이다.
하나의 예에서, 스트립핑 완충액의 완충제는 150mM의 농도이다.
하나의 예에서, 스트립핑 완충액의 완충제는 200mM의 농도이다.
하나의 예에서, 스트리핑 완충액의 완충제는 250mM의 농도이다.
하나의 예에서, 스트립핑 완충액의 완충제는 300mM의 농도이다.
하나의 예에서, 스트립핑 완충액의 완충제는 350mM의 농도이다.
하나의 예에서, 스트립핑 완충액의 완충제는 400mM의 농도이다.
하나의 예에서, 스트립핑 완충액의 완충제는 450mM의 농도이다.
하나의 예에서, 스트리핑 완충액의 완충제는 500mM의 농도이다.
하나의 예에서, 스트립핑 완충액은 20mM 인산이수소나트륨을 포함하고, pH는 2.5이다.
하나의 예에서, 스트립핑 완충액은 염화나트륨을 추가로 포함한다. 예를 들어, 스트립핑 완충액은 최대 1000mM 농도의 염화나트륨을 추가로 포함한다. 하나의 예에서, 염화나트륨은 5mM 내지 50mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 염화나트륨은 5mM, 또는 10mM, 또는 15mM, 또는 20mM, 또는 25mM, 또는 30mM, 또는 35mM, 또는 40mM, 또는 45mM, 또는 50mM의 농도이다. 하나의 예에서, 염화나트륨은 50mM 내지 100mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 염화나트륨은 55mM, 또는 60mM, 또는 65mM, 또는 70mM, 또는 75mM, 또는 80mM, 또는 85mM, 또는 90mM, 또는 95mM, 또는 100mM의 농도이다. 하나의 예에서, 염화나트륨은 100 내지 200mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 염화나트륨은 105mM, 또는 110mM, 115mM, 또는120mM, 또는 125mM, 또는 130mM, 또는 135mM, 또는 140mM, 또는 145mM, 또는 150mM, 또는 155mM, 또는 160mM, 또는 165mM 또는 170mM, 또는 175mM, 또는 180mM, 또는 185mM, 또는 190mM, 또는 195mM 또는 200mM의 농도이다. 또 다른 예에서, 염화나트륨은 200mM 내지 300mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 염화나트륨은 200mM, 또는 225mM, 또는 250mM, 또는 275mM, 또는 300mM의 농도이다. 추가의 예에서, 염화나트륨은 300 내지 400mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 염화나트륨은 300mM, 또는 325mM, 또는 350mM, 또는 375mM, 또는 400mM의 농도이다. 하나의 예에서, 염화나트륨은 400mM 내지 500mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 염화나트륨은 400mM, 또는 425mM, 또는 450mM, 또는 475mM, 또는 400mM의 농도이다. 하나의 예에서, 염화나트륨은 500mM 내지 1000mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 염화나트륨은 500mM, 또는 550mM, 또는 600mM, 또는 650mM, 또는 700mM, 또는 750mM, 또는 800mM, 또는 850mM, 또는 900mM, 또는 950 mM 또는 1000mM의 농도이다. 하나의 예에서, 염화나트륨은 1000mM 미만의 농도이다.
하나의 예에서, 스트립핑 완충액은 2가 염을 추가로 포함한다. 예를 들어, 스트립핑 완충액은 최대 1000mM 농도의 2가 염을 추가로 포함한다. 하나의 예에서, 2가 염은 5mM 내지 50mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 2가 염은 5mM, 또는 10mM, 또는 15mM, 또는 20mM, 또는 25mM, 또는 30mM, 또는 35mM, 또는 40mM, 또는 45mM, 또는 50mM의 농도이다. 또 다른 예에서, 2가 염은 50mM 내지 100mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 2가 염은 55mM, 또는 60mM, 또는 65mM, 또는 70mM, 또는 75mM, 또는 80mM, 또는 85mM, 또는 90mM, 또는 95mM, 또는 100mM의 농도이다. 하나의 예에서, 2가 염은 100 내지 200mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 2가 염은 105mM, 또는 110mM, 115mM, 또는 120mM, 또는 125mM, 또는 130mM, 또는 135mM, 또는 140mM, 또는 145mM, 또는 150mM, 또는 155mM, 또는 160mM, 또는 165mM 또는 170mM, 또는 175mM, 또는 180mM, 또는 185mM, 또는 190mM, 또는 195mM 또는 200mM의 농도이다. 또 다른 예에서, 2가 염은 200 내지 300mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 2가 염은 200mM, 또는 225mM, 또는 250mM, 또는 275mM, 또는 300mM의 농도이다. 추가의 예에서, 2가 염은 300 내지 내지 400mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 2가 염은 300mM, 또는 325mM, 또는 350mM, 또는 375mM, 또는 400mM의 농도이다. 하나의 예에서, 2가 염은 400mM 내지 500mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 2가 염은 400mM, 또는 425mM, 또는 450mM, 또는 475mM, 또는 400mM의 농도이다. 또 다른 예에서, 2가 염은 500mM 내지 1000mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 2가 염은 500mM, 또는 550mM, 또는 600mM, 또는 650mM, 또는 700mM, 또는 750mM, 또는 800mM, 또는 850mM, 또는 900mM, 또는 950mM, 또는 1000mM의 농도이다. 하나의 예에서, 2가 염은 1000mM 미만의 농도이다.
하나의 예에서, 2가 염은 염화마그네슘, 염화칼슘, 염화바륨, 염화구리(II), 염화니켈, 염화망간 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 예를 들어, 2가 염은 염화마그네슘이다. 예를 들어, 2가 염은 염화칼슘이다. 예를 들어, 2가 염은 염화바륨이다. 예를 들어, 2가 염은 염화구리이다. 예를 들어, 2가 염은 염화니켈이다. 예를 들어, 2가 염은 염화망간이다.
하나의 예에서, 수지는 평형화된다. 하나의 예에서, 수지를 스트립핑한 후 수지를 평형화시킨다. 하나의 예에서, 상기 방법은 수지를 스트립핑한 후 7 내지 8 사이의 pH를 갖는 평형화 완충액으로 수지를 평형화시키는 것을 추가로 포함한다.
하나의 예에서, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) 7 내지 8 사이의 pH를 갖는 평형화 완충액으로 수지를 평형화시키는 단계;
b) 수지로부터 결합된 IgG를 수거한 후 2 내지 3 사이의 pH를 갖는 스트립핑 완충액으로 수지를 스트립핑하는 단계; 및/또는
c) 수지를 스트립핑 한 후 평형화 완충액으로 수지를 평형화시키는 단계.
하나의 예에서, 수지를 스트립핑하지 않고 수지를 평형화시킨다. 예를 들어, 상기 방법은 스트립핑 완충액으로 수지를 스트립핑하지 않고 수지로부터 결합된 IgG를 수거한 후 수지를 평형화 완충액으로 평형화시키는 것을 포함한다. 하나의 예에서, 상기 방법은 수지로부터 결합된 IgG를 수거한 후 7 내지 8의 pH를 갖는 평형화 완충액으로 수지를 평형화시키는 것을 포함한다.
하나의 예에서, 상기 방법은 수지를 재생하는 것을 추가로 포함한다.
하나의 예에서, 상기 방법은 수지를 살균하는 것을 추가로 포함한다.
하나의 예에서, 상기 방법은 혈장 또는 이의 분획물을 친화성 크로마토그래피 수지에 부하하는 것을 포함한다.
하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획물은 혈장 또는 이의 분획물을 부하하는 동안 적어도 0.1분 동안 수지와 접촉시킨다. 예를 들어, 혈장 또는 이의 분획물은 적어도 0.25분, 또는 0.5분, 또는 1분, 또는 1.5분, 또는 2분, 또는 2.5분, 또는 3분, 또는 3.5분, 또는 4분, 또는 4.5분 또는 5분 동안 수지와 접촉시킨다. 예를 들어, 혈장 또는 이의 분획물은 적어도 0.1분, 0.25분, 0.3분, 0.35분, 0.4분, 0.45분, 0.5분, 또는 1분, 또는 1.5분, 또는 2분, 또는 2.5분, 또는 3분, 또는 3.5분, 또는 4분, 또는 4.5분 또는 5분 동안 수지와 접촉시킨다.
하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획물은 혈장 또는 이의 분획물을 부하하는 동안 최대 5분 동안 수지와 접촉시킨다.
하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획물은 혈장 또는 이의 분획물을 부하하는 동안 0.25 내지 5분 동안 수지와 접촉시킨다. 예를 들어, 부하 동안에, 혈장 또는 이의 분획물을 0.25분, 0.3분, 0.35분, 0.4분, 0.45분, 0.5분, 또는 1분, 또는 1.5분, 또는 2분, 또는 2.5분, 또는 3분, 또는 3.5분, 또는 4분, 또는 4.5분 또는 5분 동안 수지와 접촉시킨다. 하나의 예에서, 부하동안에 혈장 또는 이의 분획물은 적어도 0.25분 동안 수지와 접촉시킨다.
하나의 예에서, 완충액은 방법의 하나 이상의 비-부하 단계(들) 동안에 적어도 0.1분 동안 수지와 접촉시킨다.
하나의 예에서, 완충액은 연속 크로마토그래피 방법의 하나 이상의 비-부하 단계(들) 동안에 최대 5분 동안 수지와 접촉시킨다.
하나의 예에서, 완충액은 연속 크로마토그래피 방법의 하나 이상의 비-부하 단계(들) 동안에 적어도 0.1 내지 5분에 수지와 접촉시킨다. 예를 들어, 완충액은 적어도 0.1분, 또는 0.25분, 또는 0.5분, 또는 1분, 또는 1.5분, 또는 2분, 또는 2.5분, 또는 3분, 또는 3.5분, 또는 4분, 또는 4.5분 또는 5분 동안 수지와 접촉시킨다.
하나의 예에서, 비-부하 단계는 평형 단계, 세척 단계, 용출 단계, 스트립 단계, 재평형화 단계 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 예에서, 비-부하 단계는 평형화 단계이다.
하나의 예에서, 비-부하 단계는 세척 단계이다.
하나의 예에서, 비-부하 단계는 용출 단계이다.
하나의 예에서, 비-부하 단계는 스트립 단계이다.
하나의 예에서, 비-부하 단계는 재-평형화 단계이다.
하나의 예에서, 연속 크로마토그래피 방법의 하나 이상의 비-부하 단계(들) 동안 수지와 접촉하는 완충액은 평형화 완충액, 세척 완충액, 스트립핑 완충액 및 재-평형화 완충액으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 예를 들어, 완충액은 평형화 완충액이다. 또 다른 예에서, 완충액은 세척 완충액이다. 추가의 예에서, 완충액은 스트립핑 완충액이다. 하나의 예에서, 완충액은 재-평형화 완충액이다.
하나의 예에서, 평형화 완충액은 0.1 내지 5분 동안 수지와 접촉시킨다.
하나의 예에서, 세척 완충액은 0.1 내지 5분 동안 수지와 접촉시킨다.
하나의 예에서, 용출 완충액은 0.1 내지 5분 동안 수지와 접촉시킨다.
하나의 예에서, 스트립핑 완충액은 0.1 내지 5분 동안 수지와 접촉시킨다.
하나의 예에서, 상기 방법은 수지로부터 결합된 IgG를 수거하기 전에컬럼 용적 (CV) 미만의 용출 완충액의 용적과 수지를 접촉시킴을 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 수지로부터 결합된 IgG를 수거하기 전에컬럼 용적 (CV) 미만의 용출 완충액의 용적과 수지를 접촉시키는 ‘사전 용출’ 단계를 포함한다. 하나의 예에서, 상기 방법은 수지로부터 결합된 IgG를 수거하기 전에 CV 미만의 용출 완충액의 용적으로 수지를 세척시킴을 포함한다. 예를 들어, 수지로부터 결합된 IgG를 수거하기 전에 수지를 세척하기 위해 사용되는 용출 완충액의 용적은 최대 0.5 CV이다. 예를 들어, 수지로부터 결합된 IgG를 수거하기 전에 수지를 세척하기 위해 사용되는 용출 완충액의 용적은 0.5 내지 1.0 CV이다. 예를 들어, 수지로부터 결합된 IgG를 수거하기 전에 수지를 세척하기 위해 사용되는 용출 완충액의 용적은 0.1 CV, 또는 0.2 CV, 또는 0.3 CV, 또는 0.4 CV, 또는 0.5 CV, 또는 0.6 CV, 또는 0.7 CV, 또는 0.8 CV, 또는 0.9 CV이다.
하나의 예에서, 용출 완충액의 용적은 0.1 CV이다.
하나의 예에서, 용출 완충액의 용적은 0.2 CV이다.
하나의 예에서, 용출 완충액의 용적은 0.3 CV이다.
하나의 예에서, 용출 완충액의 용적은 0.4 CV이다.
하나의 예에서, 용출 완충액의 용적은 0.5 CV이다.
하나의 예에서, 용출 완충액의 용적은 0.6 CV이다.
하나의 예에서, 용출 완충액의 용적은 0.7 CV이다.
하나의 예에서, 용출 완충액의 용적은 0.8 CV이다.
하나의 예에서, 용출 완충액의 용적은 0.9 CV이다.
하나의 예에서, 상기 방법은 CV 미만의 용출 완충액의 용적으로 수지를 수거하는 단계를 수행한 후 수지로부터 결합된 IgG를 용출시킴을 포함한다.
일반적으로 IgG는 혈장 내 5~15g/L의 농도로 존재한다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
하나의 예에서, 혈장 분획은 저온 풍부 혈장, 저온 결핍 혈장, 상등액 I(SNⅠ), Cohn 분획 II(Fr II), Cohn 분획 II+III(Fr II+III), Cohn 분획 I+II+III(FrI+II+III), Kistler/Nitschmann 침전물 A(KN A), Kistler/Nitschmann 침전물 B(KN B), 상등액 B의 Kistler/Nitschmann 침전물(KN B+1), 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 예에서, 혈장 분획은 저온 풍부 혈장이다. 예를 들어, 혈장 분획은 저온 결핍 혈장이다. 예를 들어, 혈장 분획은 상등액 I (SN I)이다. 예를 들어, 혈장 분획은 Cohn 분획 II (Fr II)이다. 예를 들어, 혈장 분획은 Cohn 분획 II + III(Fr II + III)이다. 예를 들어, 혈장 분획은 Cohn 분획 I + II + III(FrI+II+III)이다. 예를 들어, 혈장 분획은 Kistler/Nitschmann 침전물 A (KN A)이다. 예를 들어, 혈장 분획은 Kistler/Nitschmann 침전물 B (KN B)이다. 예를 들어, 혈장 분획은 상등액 B의 Kistler/Nitschmann 침전물 (KN B+1)이다.
하나의 예에서, 혈장 분획은 현탁된 페이스트이다. 예를 들어, 현탁된 페이스트는 Cohn 분획 II(Fr II), Cohn 분획 II+III(Fr II+III), Cohn 분획 I+II+III(FrI+II+III), Kistler/Nitschmann 침전물 A(KN A), Kistler/Nitschmann 침전물 B(KN B), 상등액 B의 Kistler/Nitschmann 침전물(KN B+1), 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 예를 들어, 현탁된 페이스트는 Cohn 분획 II (Fr II) 페이스트이다. 하나의 예에서, 현탁된 페이스트는 Cohn 분획 II+III (Fr II+III) 페이스트이다. 또 다른 예에서, 현탁된 페이스트는 Cohn 분획 I + II + III(FrI+II+III) 페이스트이다. 예를 들어, 현탁된 페이스트는 Kistler/Nitschmann 침전물 A (KN A) 페이스트이다. 또 다른 예에서, 현탁된 페이스트는 Kistler/Nitschmann 침전물 B (KN B) 페이스트이다. 추가의 예에서, 현탁된 페이스트는 상등액 B의 Kistler/Nitschmann 침전물 (KN B+1) 페이스트이다.
하나의 예에서, 혈장 분획은 포유동물 혈장 분획, 사람 혈장 분획, 말 혈장 분획 및 소 혈장 분획으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 예에서, 혈장 분획은 포유동물 혈장 분획이다.
하나의 예에서, 혈장 분획은 사람 혈장 분획이다.
하나의 예에서, 혈장 분획은 말 혈장 분획이다.
하나의 예에서, 혈장 분획은 소 혈장 분획이다.
하나의 예에서, 혈장 분획은 사람 폴리클로날 항체를 포함하는 소 혈장 분획이다.
하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획을 정화한다. 혈장 또는 이의 분획의 정화 방법은 당업자에게 자명하고/하거나 본원에 기재되어 있다. 예를 들어, 혈장 또는 이의 분획을 필터에 통과시킴으로써 혈장 또는 이의 분획을 정화한다. 예를 들어, 심층 또는 막 필터를 사용할 수 있다. 예를 들어, 혈장 또는 이의 분획은 필터의 조합에 통과시킨다. 예를 들어, 조합은 1.2 및 0.45/0.22 μm의 막 필터의 조합일 수 있다. 예를 들어, 혈장 또는 이의 분획을 심층 필터(예를 들어, BECO® 심층 필터)에 통과시켜 혈장 또는 이의 분획을 정화한다. 하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획을 하나 이상의 심층 필터(들)을 포함하는 필터 프레스(예를 들어, BECO® 통합 플레이트 또는 콤팩트 플레이트)에 통과시켜 혈장 또는 이의 분획을 정화한다. 하나의 예에서, 필터 프레스는 하나 이상의 필터 보조제(들)(예를 들어, 셀룰로스 기반 필터 보조제, 예를 들어 Diacel® 150)을 추가로 포함한다. 하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획을 지질 특이적 필터(예를 들어, Zeta Plus TM DEL 시리즈 필터)에 통과시켜 혈장 또는 이의 분획을 정화한다. 예를 들어, 혈장 분획은 정화된 상등액 I (SN I)이다. 예를 들어, 혈장 분획은 정화된 Cohn 분획 II (Fr II)이다. 예를 들어, 혈장 분획은 정화된 Cohn 분획 II + III(Fr II + III)이다. 예를 들어, 혈장 분획은 정화된 Cohn 분획 I+II+III (FrI+II+III)이다. 예를 들어, 혈장 분획은 정화된 Kistler/Nitschmann 침전물 A (KN A)이다. 예를 들어, 혈장 분획은 정화된 Kistler/Nitschmann 침전물 B (KN B)이다. 예를 들어, 혈장 분획은 상등액 B의 정화된 Kistler/Nitschmann 침전물 (KN B+1)이다.
하나의 예에서, 혈장 분획은 정화된 저온 풍부 혈장이다.
하나의 예에서, 혈장 분획은 정화된 저온 결핍 혈장이다.
하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획은 약 32°C의 제1 온도로 가온시킨 다음 연속 친화성 크로마토그래피 단계 전에 약 21°C의 제2 온도로 냉각시킨다. 하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획은 약 32°C의 제1 온도로 있고 이어서 연속 친화성 크로마토그래피 단계 전에 약 21°C의 제2 온도로 있다.
하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획은 연속 친화성 크로마토그래피 단계 전에 2°C 내지 35°C 범위의 온도에 있다. 하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획은 연속 친화성 크로마토그래피 단계 전에 2°C 내지 28°C 범위의 온도에 있다. 예를 들어, 온도는 10°C 내지 28°C의 범위, 예를 들어, 10°C, 또는 11°C, 또는 12°C, 또는 13°C, 또는 14°C, 15°C, 또는 16°C, 또는 17°C, 또는 18°C, 또는 19°C, 또는 20°C, 또는 21°C, 또는 22°C, 또는 23°C, 또는 24°C, 또는 25°C, 또는 26°C, 또는 27°C, 또는 28°C이다. 예를 들어, 온도는 10°C 내지 28°C의 범위, 예를 들어,10°C, 또는 11°C, 또는 12°C, 또는 13°C, 또는 14°C, 15°C, 또는 16°C, 또는 17°C, 또는 18°C, 또는 19°C, 또는 20°C, 또는 21°C, 또는 22°C, 또는 23°C, 또는 24°C, 또는 25°C, 또는 26°C, 또는 27°C, 또는 28°C, 또는 29oC, 또는 30oC, 또는 31oC, 또는 32oC, 또는 33oC, 또는 34oC, 또는 35oC이다. 하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획은 연속 친화성 크로마토그래피 수지 상에 부하하기 전에 2°C 내지 35°C 범위의 온도에 있다. 하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획은 연속 친화성 크로마토그래피 수지 상에 부하하기 전에 2°C 내지 28°C 범위의 온도에 있다. 예를 들어, 온도는 10°C 내지 35°C 범위에 있다. 예를 들어, 혈장 또는 이의 분획은 30°C 내지 35°C 범위의 온도에 있다. 예를 들어, 혈장 또는 이의 분획은 적어도 32°C의 온도에 있다. 예를 들어, 혈장 또는 이의 분획은 32°C 내지 35°C 범위의 온도에 있다. 하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획은 32°C의 온도에 있다. 예를 들어, 온도는 10°C 내지 28°C 범위에 있다. 하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획은 2°C 내지 25°C 범위의 온도에 있다. 예를 들어, 온도는 10°C 내지 25°C 범위에 있다. 하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획은 20°C 내지 25°C 범위의 온도에 있다. 예를 들어, 혈장 또는 이의 분획은 21°C의 온도에 있다. 하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획은 2°C 내지 20°C 범위의 온도에 있다. 예를 들어, 온도는 10°C 내지 20°C 범위에 있다. 하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획은 2°C 내지 18°C 범위의 온도에 있다. 예를 들어, 온도는 10°C 내지 18°C 범위에 있다. 하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획은 2°C 내지 15°C 범위의 온도에 있다. 예를 들어, 온도는 10°C 내지 15°C 범위에 있다. 하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획은 2°C 내지 10°C 범위의 온도에 있다. 예를 들어, 혈장 또는 이의 분획은 2°C, 또는 3°C, 또는 4°C, 또는 5°C, 또는 6°C, 또는 7°C, 또는 8°C, 또는 9°C, 또는 10°C의 온도에 있다.
하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획은 2°C의 온도에 있다.
하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획은 10°C의 온도에 있다.
하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획은 18°C의 온도에 있다.
하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획은 21°C의 온도에 있다.
하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획은 28°C의 온도에 있다.
하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획은 32°C의 온도에 있다.
하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획은 최대 48시간동안 온도에 있다. 예를 들어, 혈장 또는 이의 분획을 연속 친화성 크로마토그래피 수지상에 혈장 또는 이의 분획을 부하하기 전에 최대 48시간 동안 온도에서 유지한다. 하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획은 부하 전에 최대 2시간, 또는 4시간, 또는 6시간, 또는 8시간, 또는 10시간, 또는 12시간, 또는 14시간, 또는 16시간, 또는 18시간, 또는 20시간, 또는 22시간, 또는 24시간, 또는 26시간, 또는 28시간, 또는 30시간, 또는 32시간, 또는 34시간, 또는 36시간, 또는 38시간, 또는 40시간, 또는 42시간, 또는 44시간, 또는 46시간 동안 온도에서 유지된다. 예를 들어, 혈장 또는 이의 분획은 부하 전에 0 내지 2시간, 2 내지 24시간, 또는 4 내지 24시간, 또는 8 내지 24시간, 또는 12 내지 24시간, 또는 18 내지 24시간, 또는 24 내지 48시간 또는 36 내지 48시간 동안 온도에서 유지된다.
하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획은 30°C 내지 38°C 범위의 제1 온도로 있고 이어서 연속 친화성 크로마토그래피 단계 전에 2°C 내지 28°C 범위의 제2 온도로 있다. 예를 들어, 혈장 또는 이의 분획을 30°C 내지 38°C 범위의 제1 온도로 가온시킨 다음 연속 친화성 크로마토그래피 단계 전에 2°C 내지 28°C 범위의 제2 온도로 냉각시킨다. 하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획은 30°C 내지 35°C 범위의 제1 온도로 가온시킨 다음 연속 친화성 크로마토그래피 단계 전에 18°C 내지 25°C의 제2 온도로 냉각시킨다. 예를 들어, 혈장 또는 이의 분획은 약 30°C, 또는 약 31°C, 또는 약 32°C, 또는 약 33°C, 또는 약 34°C 또는 약 35°C의 제1 온도로 가온시킨다. 하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획은 약 18℃, 또는 약 19℃, 또는 약 20℃, 또는 약 21℃, 또는 약 22℃, 또는 약 23℃, 또는 약 24℃, 또는 약 25℃의 제2 온도로 냉각된다.
하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획은 최대 48시간동안 제1 및/또는 제2 온도에 있다. 예를 들어, 혈장 또는 이의 분획을 연속 친화성 크로마토그래피 수지상에 혈장 또는 이의 분획을 부하하기 전에 최대 48시간 동안 제1 및/또는 제2 온도에서 유지한다. 하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획은 부하 전에 최대 2시간, 또는 4시간, 또는 6시간, 또는 8시간, 또는 10시간, 또는 12시간, 또는 14시간, 또는 16시간, 또는 18시간, 또는 20시간, 또는 22시간, 또는 24시간, 또는 26시간, 또는 28시간, 또는 30시간, 또는 32시간, 또는 34시간, 또는 36시간, 또는 38시간, 또는 40시간, 또는 42시간, 또는 44시간, 또는 46시간 동안 제1 및/또는 제2 온도에서 유지된다. 예를 들어, 혈장 또는 이의 분획은 부하 전에 0 내지 2시간, 2 내지 24시간, 또는 4 내지 24시간, 또는 8 내지 24시간, 또는 12 내지 24시간, 또는 18 내지 24시간, 또는 24 내지 48시간 또는 36 내지 48시간 동안 제1 및/또는 제2 온도에서 유지된다.
하나의 예에서, 연속 친화성 크로마토그래피는 모의 이동 베드(SMB) 크로마토그래피, 주기적 역류 크로마토그래피(PCC), 연속 역류 접선 크로마토그래피(CCTC) 및 연속 역류 나선형 크로마토그래피(CCSC)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 예에서, 연속 친화성 크로마토그래피는 모의 이동 베드 (SMB) 크로마토그래피이다. 또 다른 예에서, 연속 친화성 크로마토그래피는 주기적 역류 크로마토그래피(PCC)이다. 추가의 예에서, 연속 친화성 크로마토그래피는 연속 역류 접선 크로마토그래피(CCTC)이다. 하나의 예에서, 연속 친화성 크로마토그래피는 연속 역류 나선형 크로마토그래피(CCSC)이다.
하나의 예에서, 수지는 슬러리 형태이다. 예를 들어, 수지는 슬러리 형태의 수지 입자를 포함한다.
하나의 예에서, 슬러리는 각 컬럼이 막을 포함하는 하나 이상의 컬럼을 통과한다. 예를 들어, 믹은 중공 섬유 막이다.
하나의 예에서, 슬러리는 막을 포함하는 일련의 2개 이상의 컬럼을 통과한다. 예를 들어, 슬러리는 2개, 또는 3개, 또는 4개, 또는 5개, 또는 6개, 또는 7개, 또는 8개, 또는 9개, 또는 10개, 또는 11개, 또는 12개의 컬럼을 통과한다.
하나의 예에서, 슬러리는 일련의 2개의 컬럼을 통과한다.
하나의 예에서, 슬러리는 일련의 3개의 컬럼을 통과한다.
하나의 예에서, 슬러리는 일련의 4개의 컬럼을 통과한다.
하나의 예에서, 슬러리는 일련의 5개의 컬럼을 통과한다.
하나의 예에서, 슬러리는 일련의 6개의 컬럼을 통과한다.
하나의 예에서, 슬러리는 일련의 7개의 컬럼을 통과한다.
하나의 예에서, 슬러리는 일련의 8개의 컬럼을 통과한다.
하나의 예에서, 슬러리는 일련의 9개의 컬럼을 통과한다.
하나의 예에서, 슬러리는 일련의 10개의 컬럼을 통과한다.
하나의 예에서, 슬러리는 일련의 11개의 컬럼을 통과한다.
하나의 예에서, 슬러리는 일련의 12개의 컬럼을 통과한다.
하나의 예에서, 수지는 각 컬럼이 하나 이상의 구역을 포함하는 하나 이상의 컬럼에 팩킹한다. 예를 들어, 수지는 일련의 2개 이상의 컬럼에 팩킹시킨다. 예를 들어, 수지는 2개, 또는 3개, 또는 4개, 또는 5개, 또는 6개, 또는 7개, 또는 8개, 또는 9개, 또는 10개, 또는 11개, 또는 12개의 일련의 컬럼에 팩킹시킨다.
하나의 예에서, 수지는 일련의 2개의 컬럼에 팩킹시킨다.
하나의 예에서, 수지는 일련의 3개의 컬럼에 팩킹시킨다.
하나의 예에서, 수지는 일련의 4개의 컬럼에 팩킹시킨다.
하나의 예에서, 수지는 일련의 5개의 컬럼에 팩킹시킨다.
하나의 예에서, 수지는 일련의 6개의 컬럼에 팩킹시킨다.
하나의 예에서, 수지는 일련의 7개의 컬럼에 팩킹시킨다.
하나의 예에서, 수지는 일련의 8개의 컬럼에 팩킹시킨다.
하나의 예에서, 수지는 일련의 9개의 컬럼에 팩킹시킨다.
하나의 예에서, 수지는 일련의 10개의 컬럼에 팩킹시킨다.
하나의 예에서, 수지는 일련의 11개의 컬럼에 팩킹시킨다.
하나의 예에서, 수지는 일련의 12개의 컬럼에 팩킹시킨다.
예를 들어, 구역은 평형화 구역, 결합 구역, 세척 구역, 용출 구역, 스트립핑 구역 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 예에서, 구역은 평형화 구역, 결합 구역, 세척 구역, 용출 구역, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 예에서, 구역은 평형화 구역이다. 또 다른 예에서, 구역은 결합 구역이다. 추가의 예에서, 구역은 세척 구역이다. 하나의 예에서, 구역은 용출 구역이다. 또 다른 예에서, 구역은 스트립핑 구역이다. 하나의 예에서, 스트립핑 구역이 없다. 추가의 예에서, 구역은 세척/용출 구역이다. 하나의 예에서, 구역은 평형화/결합 구역이다. 또 다른 예에서, 구역은 결합/세척 구역이다.
하나의 예에서, 수지는 각 컬럼이 하나의 구역을 포함하는 하나 이상의 컬럼(들)에 팩킹시킨다.
하나의 예에서, 수지는 각 컬럼이 2개의 구역을 포함하는 하나 이상의 컬럼(들)에 팩킹시킨다.
하나의 예에서, 수지는 각 컬럼이 4개의 구역을 포함하는 하나 이상의 컬럼(들)에 팩킹시킨다.
하나의 예에서, 2개 이상의 컬럼은 입구 및 출구 밸브를 포함하는 유체 도관에 의해 유동적으로 연결 및 분리된다.
하나의 예에서, 수지는 제1 컬럼과 하나 이상의 후속 컬럼에 팩킹시킨다.
하나의 예에서, 제1 컬럼에는 수지의 동적 결합 용량(DBC) 이상의 농도로 IgG가 부하된다.
수지의 DBC를 결정하는 것은 당업자에게 자명하고/하거나 본원에 기재된다. 예를 들어, 수지의 DBC는 컬럼에 IgG를 부하하고 예를 들어, 크로마토그래피 시스템의 UV 추적에 의해 결합되지 않은 IgG가 컬럼을 통과하는 농도를 모니터링하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 수지의 DBC는 수지 ㎖당 5㎎, 또는 10㎎, 또는 20㎎, 또는 30㎎, 또는 40㎎, 또는 50㎎, 또는 60㎎, 또는 70㎎ IgG이다.
하나의 예에서, 수지의 DBC는 수지 ㎖당 적어도 5mg IgG이다.
하나의 예에서, 수지의 DBC는 수지 ㎖당 적어도 10 mg IgG이다.
하나의 예에서, 수지의 DBC는 수지 ㎖당 적어도 20 mg IgG이다.
하나의 예에서, 수지의 DBC는 수지 ㎖당 40 mg IgG이다.
하나의 예에서, 제1 컬럼에는 수지 ㎖당 5㎎, 또는 10㎎, 또는 20㎎, 또는 30㎎, 또는 40㎎, 또는 50㎎, 또는 60㎎, 또는 70㎎ 초과의 IgG 농도의 IgG를 부하한다.
하나의 예에서, 제1 컬럼에는 수지의 최대 DBC의 농도로 IgG를 부하한다. 예를 들어, 제1 컬럼에는 수지 ㎖당 최대 5㎎, 또는 10㎎, 또는 20㎎, 또는 30㎎, 또는 40㎎의 IgG 농도의 IgG를 부하한다.
하나의 예에서, 제1 컬럼에는 수지의 mL 당 5초과의 IgG 농도로 IgG를 부하한다.
하나의 예에서, 제1 컬럼에는 수지 ㎖당 10㎎ 초과의 IgG 농도로 IgG를 부하한다.
하나의 예에서, 제1 컬럼에는 수지의 mL 당 20mg 초과의 IgG 농도로 IgG를 부하한다.
하나의 예에서, 제1 컬럼에는 수지의 mL 당 최대 40mg의 IgG 농도로 IgG를 부하한다.
하나의 예에서, 하나 이상의 후속 컬럼(들)에는 수지의 최대 DBC의 농도로 IgG를 부하한다.
하나의 예에서, 하나 이상의 후속 컬럼(들)에는 수지 ㎖당 최대 5㎎, 또는 10㎎, 또는 20㎎, 또는 30㎎, 또는 40㎎의 IgG 농도로 IgG를 부하한다.
하나의 예에서, 하나 이상의 후속 컬럼(들)에는 수지의 mL 당 최대 20 mg IgG 농도로 IgG를 부하한다.
하나의 예에서, 하나 이상의 후속 컬럼(들)에는 수지의 mL 당 최대 30 mg IgG 농도로 IgG를 부하한다.
하나의 예에서, 하나 이상의 후속 컬럼(들)에는 수지의 mL 당 최대 40 mg IgG 농도로 IgG를 부하한다.
하나의 예에서, 상기 방법은 세척 완충액을 사용하여 제1 컬럼으로부터 결합되지 않은 IgG를 하나 이상의 후속 컬럼(들)으로 세척하고, 결합된 IgG를 수거하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 결합된 IgG는 제1 열과 하나 이상의 후속 컬럼(들)으로부터 수거한다. 예를 들어, 결합된 IgG는 세척 단계 없이 제1 컬럼으로부터 수거한다. 예를 들어, 본원에 기재된 용출 완충액으로 결합된 IgG를 용출하여 제1 컬럼으로부터 결합된 IgG를 수거한다. 예를 들어, 결합된 IgG는 본원에 기재된 세척 완충액으로 세척한 후 하나 이상의 후속 컬럼(들)로부터 수거한다. 예를 들어, 결합된 IgG는 세척 완충액으로 수지를 세척하고 본원에 기재된 용출 완충액으로 결합된 IgG를 용출시킨 후 하나 이상의 후속 컬럼(들)로부터 수거한다.
하나의 예에서, 상기 방법은 본원에 기재된 세척 완충액으로 하나 이상의 후속 컬럼(들)을 세척하고, 하나 이상의 후속 컬럼(들)으로부터 결합된 IgG를 수거하는 것을 추가로 포함한다.
하나의 예에서, 상기 방법은 하나 이상의 후속 컬럼(들)에서 결합된 IgG를 수거할 때 제1 컬럼을 스트립핑하고/하거나 평형화하는 것을 추가로 포함한다. 하나의 예에서, 상기 방법은 하나 이상의 후속 컬럼(들)에서 결합된 IgG를 수거할 때 제1 컬럼을 평형화하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 하나 이상의 후속 컬럼(들)에서 결합된 IgG를 수거할 때 제1 컬럼을 스트립핑하는 것을 포함하지 않는다.
하나의 예에서, 상기 방법은 제1 컬럼에서 결합된 IgG를 수거할 때에 하나 이상의 후속 컬럼(들)을 스트립핑하고/하거나 평형화시키는 것을 추가로 포함한다. 하나의 예에서, 상기 방법은 제1 컬럼에서 결합된 IgG를 수거할 때에 하나 이상의 후속 컬럼(들)을 스트립핑하고/하거나 평형화시키는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 제1 컬럼에서 결합된 IgG를 수거할 때에 하나 이상의 후속 컬럼(들)을 스트립핑하는 것을 포함하지 않는다.
하나의 예에서, 상기 방법은 하나 이상의 후속 컬럼(들)을 본원에 기재된 세척 완충액으로 세척할 때에 제1 컬럼을 스트립핑하고/하거나 평형화시키는 것을 추가로 포함한다. 하나의 예에서, 상기 방법은 하나 이상의 후속 컬럼(들)을 본원에 기재된 세척 완충액으로 세척할 때에 제1 컬럼을 평형화시키는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 하나 이상의 후속 컬럼(들)을 본원에 기재된 세척 완충액으로 세척할 때에 제1 컬럼을 스트립핑하는 것을 포함하지 않는다.
하나의 예에서, 상기 방법은 제1 컬럼을 본원에 기재된 세척 완충액으로 세척할 때에 하나 이상의 후속 컬럼(들)을 스트립핑하고/하거나 평형화하는 것을 추가로 포함한다. 하나의 예에서, 상기 방법은 제1 컬럼을 본원에 기재된 세척 완충액으로 세척할 때에 하나 이상의 후속 컬럼(들)을 평형화하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 제1 컬럼을 본원에 기재된 세척 완충액으로 세척할 때에 하나 이상의 후속 컬럼(들)을 스트립핑하는 것을 포함하지 않는다.
하나의 예에서, 수지는 적어도 2 cm의 총 베드 높이를 갖는다. 예를 들어, 수지는 2 cm 내지 30 cm 사이의 총 베드 높이를 갖는다. 예를 들어, 수지는 10 cm 내지 30 cm 사이의 총 베드 높이를 갖는다. 예를 들어, 수지는 30 cm 내지 70 cm 사이의 총 베드 높이를 갖는다. 예를 들어, 수지는 2cm, 또는 6 cm, 또는 10 cm, 또는 15cm, 또는 20 cm, 또는 25 cm, 또는 30 cm, 또는 35 cm, 또는 40 cm, 또는 45 cm, 또는 50 cm, 또는 55 cm, 또는 60 cm, 또는 65 cm, 또는 70 cm의 총 베드 높이를 갖는다.
하나의 예에서, 수지는 적어도 2 cm의 총 베드 높이를 갖는다.
하나의 예에서, 수지는 6 cm의 총 베드 높이를 갖는다.
하나의 예에서, 수지는 20 cm의 총 베드 높이를 갖는다.
하나의 예에서, 수지는 30 cm의 총 베드 높이를 갖는다.
하나의 예에서, 수지는 50 cm의 총 베드 높이를 갖는다.
하나의 예에서, 수지는 70 cm의 총 베드 높이를 갖는다.
하나의 예에서, 컬럼은 5cm 내지 200cm 사이의 직경을 갖는다. 예를 들어, 컬럼은 5 cm, 또는 10 cm, 또는 20 cm, 또는 30 cm, 또는 40 cm, 또는 50 cm, 또는 60 cm, 또는 70 cm, 또는 80 cm, 또는 90 cm, 또는 100 cm, 또는 110 cm, 또는 120 cm, 또는 130 cm, 또는 140 cm, 또는 150 cm, 또는 160 cm, 또는 170 cm, 또는 180 cm, 또는 190 cm, 또는 200 cm의 직경을 갖는다.
하나의 예에서, 컬럼은 5 cm의 직경을 갖는다.
하나의 예에서, 컬럼은 20 cm의 직경을 갖는다.
하나의 예에서, 컬럼은 50 cm의 직경을 갖는다.
하나의 예에서, 컬럼은 100 cm의 직경을 갖는다.
하나의 예에서, 컬럼은 200 cm의 직경을 갖는다.
하나의 예에서, 상기 방법은 에탄올 침전, 옥탄산 분획화, 막 또는 수지 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이소아글루티닌 친화성 크로마토그래피), 바이러스 불활성화, 바이러스 여과 및 한외 여과/정용여과로부터 선택된 하나 이상의 단계를 추가로 포함하고, 여기서 단계(들)은 연속 친화성 크로마토그래피 단계 전 또는 후에 수행된다. 예를 들어, 상기 방법은 에탄올 침전을 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 옥탄산 분획화를 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 막 크로마토그래피를 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 이온 교환 크로마토그래피를 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 음이온 교환 크로마토그래피를 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 양이온 교환 크로마토그래피를 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 이소아글루티닌 친화성 크로마토그래피를 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 바이러스 불활성화를 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 나노여과를 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 한외여과/정용여과를 추가로 포함한다.
하나의 예에서, 상기 방법은 음이온 교환 크로마토그래피 및 바이러스 여과를 추가로 포함한다.
하나의 예에서, 상기 방법은 낮은 pH 항온처리, 심층 여과, 음이온 교환 크로마토그래피 및 바이러스 여과를 추가로 포함한다.
하나의 예에서, 낮은 pH 항온처리는 세제의 존재하에 수행된다. 예를 들어, 상기 방법은 세제의 존재하에 낮은 pH 항온처리를 추가로 포함한다.
하나의 예에서, 상기 방법은 이온 교환 크로마토그래피를 추가로 포함하고, 여기서 이온 교환 크로마토그래피 단계는 통류 모드에서 작동하는 음이온 교환 수지를 사용하는 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함한다.
하나의 예에서, 통류물 및/또는 세척 후 용출물을 수거한다. 예를 들어, 통류물을 수거한다. 또 다른 예에서, 세척 후 용출물을 수거한다. 하나의 예에서, 통류물 및/또는 세척 후 용출물을 수거한다. 용출 단계가 아닌, 통류물 및 세척후 용출물만이 수거(즉, 풀링된)되는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
하나의 예에서, 음이온 교환 수지는 약음이온 교환기, 강음이온 교환기 및 혼합 모드 음이온 교환기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 예에서, 음이온 교환 수지는 약음이온 교환기이다.
하나의 예에서, 음이온 교환 수지는 혼합 모드 음이온 교환기이다.
하나의 예에서, 음이온 교환 수지는 강음이온 교환기이다. 하나의 예에서, 이온 교환 크로마토그래피 단계는 통류 모드에서 작동하는 강음이온 교환 수지를 사용하는 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함한다. 하나의 예에서, 강음이온 교환 수지는 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 매트릭스로 이루어진 매트릭스를 포함한다. 하나의 예에서, 강음이온 교환 수지는 4급화 폴리에틸렌이민 작용 그룹을 포함한다.
하나의 예에서, 음이온 교환 수지는 평형화 전에 평형화 전 완충액으로 세척한다. 사전 평형화 단계는 제1 실행 및/또는 수지 저장 후에만 수행된다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
하나의 예에서, 사전 평형화 완충액은 인산일나트륨(NaH2PO4), 인산이나트륨 (Na2HPO4), 인산 (H3PO4) 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 예에서, 사전 평형화 완충액은 Na2HPO4를 포함한다.
하나의 예에서, 사전 평형화 완충액은 Na3PO4를 포함한다.
하나의 예에서, 사전 평형화 완충액은 NaH2PO4를 포함한다.
하나의 예에서, 사전 평형화 완충액은 Na2HPO4 및 NaH2PO4를 포함한다.
하나의 예에서, 사전 평형화 완충액은 50 mM 내지 150 mM 범위의 농도로 완충액을 포함한다. 예를 들어, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 또는 150 mM의 농도이다. 하나의 예에서, 사전 평형화 완충액은 100mM 농도의 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 사전 평형화 완충액은 50 mM 내지 150 mM 범위의 농도로 NaH2PO4를 포함한다. 예를 들어, 사전 평형화 완충액은 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 또는 150 mM의 농도로 NaH2PO4를 포함한다. 하나의 예에서, 사전 평형화 완충액은 100mM 농도의 NaH2PO4를 포함한다.
하나의 예에서, 사전 평형화 완충액은 5.8 내지 6.6 범위의 pH이다. 예를 들어, 사전 평형화 완충액은 약 5.8, 또는 약 5.9, 또는 약 6.0, 또는 약 6.1, 또는 약 6.2, 또는 약 6.3, 또는 약 6.4, 또는 약 6.5, 또는 약 6.6의 pH이다. 하나의 예에서, 사전 평형화 완충액은 6.2의 pH이다.
하나의 예에서, 사전 평형화 완충액은 염을 추가로 포함한다. 예를 들어, 사전 평형화 완충액은 염화나트륨을 추가로 포함한다. 하나의 예에서, 염화나트륨은 100 mM 내지 1000mM 범위의 농도이다. 예를 들어, 사전 평형화 완충액은 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM, 500 mM, 600 mM, 700 mM, 800 mM, 900 mM, 또는 1000 mM의 농도로 염화나트륨을 포함한다. 하나의 예에서, 사전 평형화 완충액은 1000mM 농도의 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 음이온 교환 수지는 1000mM NaH2PO4와 1000mM 염화나트륨, pH 6.2을 포함하는 사전 평형화 완충액으로 사전 평형화된다. 하나의 예에서, 음이온 교환 수지는 1000mM NaH2PO4와 1000mM 염화나트륨, pH 6.2를 포함하는 사전 평형화 완충액으로 사전 평형화된다.
하나의 예에서, 사전 평형화 완충액의 용적은 적어도 2 CV이다. 예를 들어, 사전 평형화 완충액의 용적은 2 CV, 또는 3 CV, 또는 4 CV, 또는 5 CV, 또는 6 CV, 또는 7 CV, 또는 8 CV, 또는 9 CV, 또는 10 CV이다. 하나의 예에서, 사전 평형화 완충액의 용적은 적어도 2 CV 내지 10 CV이다.
하나의 예에서, 사전 평형화 완충액의 용적은 적어도 10 CV이다. 예를 들어, 사전 평형화 완충액의 용적은 10 CV, 또는 11 CV, 또는 12 CV, 또는 13 CV, 또는 14 CV, 또는 15 CV, 또는 16 CV, 또는 17 CV, 또는 18 CV, 또는 19 CV 또는 20 CV이다. 하나의 예에서, 사전 평형화 완충액의 용적은 15 CV이다.
하나의 예에서, 음이온 교환 수지는 인산일나트륨(NaH2PO4), 인산이나트륨(Na2HPO4), 인산(H3PO4), 나트륨 시트레이트, 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES), Bis-Tris, L-히스티딘 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 평형화 완충액으로 평형화된다.
하나의 예에서, 음이온 교환 수지는 Na2HPO4를 포함하는 평형화 완충액으로 평형화된다.
하나의 예에서, 음이온 교환 수지는 H3PO4를 포함하는 평형화 완충액으로 평형화된다.
하나의 예에서, 음이온 교환 수지는 NaH2PO4를 포함하는 평형화 완충액으로 평형화된다.
하나의 예에서, 음이온 교환 수지는 Na2HPO4 및 NaH2PO4를 포함하는 평형화 완충액으로 평형화된다.
하나의 예에서, 음이온 교환 수지는 MES를 포함하는 평형화 완충액으로 평형화된다.
하나의 예에서, 음이온 교환 수지는 나트륨 시트레이트를 포함하는 평형화 완충액으로 평형화된다.
하나의 예에서, 음이온 교환 수지는 Bis-Tris를 포함하는 평형화 완충액으로 평형화된다.
하나의 예에서, 음이온 교환 수지는 L-히스티딘을 포함하는 평형화 완충액으로 평형화된다.
하나의 예에서, 평형화 완충액은 5mM 내지 50mM 범위의 농도이다. 예를 들어, 평형화 완충액은 5 mM, 또는 10 mM, 또는 20 mM, 또는 30 mM, 또는 40 mM, 또는 50 mM의 농도이다. 하나의 예에서, 평형화 완충액은 5 mM의 농도이다. 또 다른 예에서, 평형화 완충액은 10 mM의 농도이다. 추가의 예에서, 평형화 완충액은 20 mM의 농도이다. 하나의 예에서, 평형화 완충액은 30 mM의 농도이다. 또 다른 예에서, 평형화 완충액은 40 mM의 농도이다. 추가의 예에서, 평형화 완충액은 50 mM의 농도이다.
하나의 예에서, 평형화 완충액은 5 mM 내지 150 mM 범위의 농도로 NaH2PO4를 포함한다. 하나의 예에서, 평형화 완충액은 10 mM 내지 50 mM 범위의 농도로 NaH2PO4를 포함한다. 예를 들어, 평형화 완충액은 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM의 농도로 NaH2PO4를 포함한다. 하나의 예에서, 평형화 완충액은 5mM 농도의 NaH2PO4를 포함한다. 하나의 예에서, 평형화 완충액은 10mM 농도의 NaH2PO4를 포함한다.
하나의 예에서, 평형화 완충액은 5.8 내지 6.6 범위의 pH이다. 예를 들어, 평형화 완충액은 약 5.8, 또는 약 5.9, 또는 약 6.0, 또는 약 6.1, 또는 약 6.2, 또는 약 6.3, 또는 약 6.4, 또는 약 6.5, 또는 약 6.6의 pH이다. 하나의 예에서, 평형화는 6.2의 pH이다.
하나의 예에서, 음이온 교환 수지는 5.8 내지 6.6 범위의 pH로 포스페이트 완충액을 포함하는 평형화 완충액으로 평형화된다. 하나의 예에서, 평형화 완충액은 pH 6.0의 포스페이트 완충액을 포함한다. 하나의 예에서, 평형화 완충액은 pH 6.2의 포스페이트 완충액을 포함한다. 하나의 예에서, 평형화 완충액은 pH 6.6의 포스페이트 완충액을 포함한다. 하나의 예에서, 음이온 교환 수지는 5mM NaH2PO4, pH 6.2를 포함하는 평형화 완충액으로 평형화된다. 하나의 예에서, 음이온 교환 수지는 10 mM NaH2PO4, pH 6.2를 포함하는 평형화 완충액으로 평형화된다.
하나의 예에서, 음이온 교환 수지는 5.8 내지 6.6 범위의 pH로 MES 완충액을 포함하는 평형화 완충액으로 평형화된다. 하나의 예에서, 평형화 완충액은 pH 6.0의 MES 완충액을 포함한다. 하나의 예에서, 평형화 완충액은 pH 6.2의 MES 완충액을 포함한다. 하나의 예에서, 평형화 완충액은 pH 6.6의 MES 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 음이온 교환 수지는 5.8 내지 6.6 범위의 pH로 Bis-Tris 완충액을 포함하는 평형화 완충액으로 평형화된다. 하나의 예에서, 평형화 완충액은 pH 6.0의 Bis-Tris 완충액을 포함한다. 하나의 예에서, 평형화 완충액은 pH 6.2의 Bis-Tris 완충액을 포함한다. 하나의 예에서, 평형화 완충액은 pH 6.6의 Bis-Tris 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 음이온 교환 수지는 5.8 내지 6.6 범위의 pH로 L-히스티딘 완충액을 포함하는 평형화 완충액으로 평형화된다. 하나의 예에서, 평형화 완충액은 pH 6.0의 L-히스티딘 완충액을 포함한다. 하나의 예에서, 평형화 완충액은 pH 6.2의 L-히스티딘 완충액을 포함한다. 하나의 예에서, 평형화 완충액은 pH 6.6의 L-히스티딘 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 평형화 완충액의 용적은 적어도 2 CV이다. 예를 들어, 평형화 완충액의 용적은 2 CV, 또는 3 CV, 또는 4 CV, 또는 5 CV, 또는 6 CV, 또는 7 CV, 또는 8 CV, 또는 9 CV, 또는 10 CV이다. 하나의 예에서, 평형화 완충액의 용적은 2 CV 내지 10 CV이다.
하나의 예에서, 평형화 완충액의 용적은 적어도 10 CV이다. 예를 들어, 평형화 완충액의 용적은 10 CV, 또는 11 CV, 또는 12 CV, 또는 13 CV, 또는 14 CV, 또는 15 CV, 또는 16 CV, 또는 17 CV, 또는 18 CV, 또는 19 CV 또는 20 CV이다. 하나의 예에서, 평형화 완충액의 용적은 15 CV이다.
하나의 예에서, 음이온 교환 수지에는 수지의 L 당 5 g의 IgG 내지 수지의 L 당 15g IgG의 농도로 IgG를 부하한다. 예를 들어, 수지에는 수지 L 당 5g, 또는 6g, 또는 7g, 또는 8g, 또는 9g, 또는 10g, 또는 11g, 또는 12g, 또는 13g, 또는 14g, 또는 15g의 IgG를 부하한다. 하나의 예에서, 수지에는 수지 L 당 15 g의 IgG를 부하한다.
하나의 예에서, 음이온 교환 수지에는 부하 L 당 5 g의 IgG 내지 부하 L 당 15g의 IgG 범위의 농도로 IgG를 부하한다. 예를 들어, 수지에는 5g/L, 또는 6 g/L, 또는 7 g/L, 또는 8 g/L, 또는 9 g/L, 또는 10 g/L, 또는 11 g/L, 또는 12 g/L, 또는 13 g/L, 또는 14 g/L, 또는 15 g/L의 IgG를 부하한다. 하나의 예에서, 수지에는 부하 L 당 15 g의 IgG를 부하한다.
하나의 예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 포스페이트 완충액, 나트륨 시트레이트 완충액, 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 완충액, 아세트산 완충액, Bis-tris 완충액 및 L-히스티딘 완충액으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 부하 후 세척 완충액을 포함한다. 하나의 예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 포스페이트 완충액, 나트륨 시트레이트 완충액 및 아세트산 완충액으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 부하 후 세척 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 5mM 내지 50mM 범위의 농도이다. 하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 10mM 내지 50mM 범위의 농도이다. 예를 들어, 부하 후 세척 완충액은 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 또는 50 mM의 농도이다. 하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 5 mM의 농도이다. 하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 10 mM의 농도이다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 포스페이트 완충액을 포함한다. 예를 들어, 포스페이트 완충액은 인산일나트륨(NaH2PO4), 인산이나트륨 (Na2HPO4), 인산 (H3PO4) 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 Na2HPO4를 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 H3PO4를 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 NaH2PO4를 포함한다. 예를 들어, 부하 후 세척 완충액은 5 mM NaH2PO4를 포함한다. 또 다른 예에서, 부하 후 세척 완충액은 10mM NaH2PO4를 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 Na2HPO4 및 NaH2PO4를 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 나트륨 시트레이트 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 아세트산 완충액을 포함한다. 예를 들어, 부하 후 세척 완충액은 나트륨 아세테이트를 포함한다. 예를 들어, 부하 후 세척 완충액은 5 mM 아세트산을 포함한다. 또 다른 예에서, 부하 후 세척 완충액은 10 mM 아세트산을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 포스페이트 완충액 및 아세트산 완충액을 포함한다. 예를 들어, 부하 후 세척 완충액은 NaH2PO4 및 나트륨 아세테이트를 포함한다. 예를 들어, 부하 후 세척 완충액은 5 mM NaH2PO4 및 10mM 나트륨 아세테이트를 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 MES 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 Bis-Tris 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 L-히스티딘 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 5.0 내지 약 8.0 범위의 pH를 갖는다. 예를 들어, 부하 후 세척 완충액은 5.5 내지 7.0 범위의 pH를 갖는다. 또 다른 예에서, 부하 후 세척 완충액은 5.8 내지 6.6 범위의 pH를 갖는다. 예를 들어, 부하 후 세척 완충액은 약 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5 또는 6.6의 pH이다. 하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 6.0의 pH이다. 하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 6.2의 pH이다. 또 다른 예에서, 부하 후 세척 완충액은 6.6의 pH이다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 염을 추가로 포함한다. 예를 들어, 염은 염화나트륨이다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 염을 포함하지 않는다.
하나의 예에서, 염화나트륨은 0 mM 내지 200 mM 사이의 농도이다. 하나의 예에서, 염화나트륨은 0 mM 내지 50 mM의 농도이다. 하나의 예에서, 염화나트륨은 0 mM 내지 100 mM의 농도이다. 예를 들어, 염화나트륨은 20 mM 내지 1500 mM 사이의 농도이다. 하나의 예에서, 염화나트륨은 20 mM 내지 80 mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 염화나트륨은 약 20 mM, 또는 30 mM, 또는 40 mM, 또는 50 mM, 또는 60 mM, 또는 70 mM, 또는 80 mM의 농도이다. 하나의 예에서, 염화나트륨은 약 20 mM의 농도이다. 하나의 예에서, 염화나트륨은 약 25 mM의 농도이다. 예를 들어, 염화나트륨은 50mM의 농도이다. 하나의 예에서, 염화나트륨은 약 70 mM의 농도이다. 하나의 예에서, 염화나트륨은 120 mM 내지 200 mM 사이의 농도이다. 예를 들어, 염화나트륨은 150mM의 농도이다. 또 다른 예에서, 염화나트륨은 200 mM의 농도이다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 5.8 내지 6.6 범위의 pH의 포스페이트 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.0의 포스페이트 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.2의 포스페이트 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.6의 포스페이트 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.0의 포스페이트 완충액 및 0 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.0의 포스페이트 완충액 및 20 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.0의 포스페이트 완충액 및 50 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.6의 포스페이트 완충액 및 0 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.6의 포스페이트 완충액 및 25 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.6의 포스페이트 완충액 및 50 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.2의 포스페이트 완충액 및 0 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 5.8 내지 6.6 범위의 pH의 MES 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.0의 MES 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.6의 MES 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.0의 MES 완충액 및 20 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.0의 MES 완충액 및 50 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.0의 MES 완충액 및 25 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.6의 MES 완충액 및 50 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 5.8 내지 6.6 범위의 pH의 나트륨 시트레이트 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.0의 나트륨 시트레이트 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.6의 나트륨 시트레이트 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.0의 나트륨 시트레이트 완충액 및 20 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.0의 나트륨 시트레이트 완충액 및 50 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.6의 나트륨 시트레이트 완충액 및 25 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.6의 나트륨 시트레이트 완충액 및 50 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 5.8 내지 6.6 범위의 pH의 나트륨 아세테이트 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.0의 나트륨 아세테이트 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.2의 나트륨 아세테이트 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.6의 나트륨 아세테이트 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.0의 나트륨 아세테이트 완충액 및 0 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.0의 나트륨 아세테이트 완충액 및 20 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.0의 나트륨 아세테이트 완충액 및 50 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.6의 나트륨 아세테이트 완충액 및 0 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.6의 나트륨 아세테이트 완충액 및 25 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.6의 나트륨 아세테이트 완충액 및 50 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.2의 나트륨 아세테이트 완충액 및 0 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 5.8 내지 6.6 범위의 pH의 포스페이트 및 나트륨 아세테이트 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.0의 포스페이트 및 나트륨 아세테이트 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.2의 포스페이트 및 나트륨 아세테이트 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.6의 포스페이트 및 나트륨 아세테이트 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.0의 포스페이트 및 나트륨 아세테이트 완충액 및 0 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.0의 포스페이트 및 나트륨 아세테이트 완충액 및 20 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.0의 포스페이트 및 나트륨 아세테이트 완충액 및 50 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.6의 포스페이트 및 나트륨 아세테이트 완충액 및 0 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.6의 포스페이트 및 나트륨 아세테이트 완충액 및 25 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.6의 포스페이트 및 나트륨 아세테이트 완충액 및 50 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.2의 포스페이트 및 나트륨 아세테이트 완충액 및 0 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 5.8 내지 6.6 범위의 pH의 Bis-Tris 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.0의 Bis-Tris 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.6의 Bis-Tris 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.0의 Bis-TRis 완충액 및 20 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.0의 Bis-TRis 완충액 및 50 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.6의 Bis-Tris 완충액 및 25 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.6의 Bis-Tris 완충액 및 50 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 5.8 내지 6.6 범위의 pH의 L-히스티딘 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.0의 L-히스티딘 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.6의 L-히스티딘 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.0의 L-히스티딘 완충액 및 20 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.0의 L-히스티딘 완충액 및 50 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.6의 L-히스티딘 완충액 및 25 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액은 pH 6.6의 L-히스티딘 완충액 및 50 mM 염화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액의 용적은 1 내지 5 CV이다. 예를 들어, 부하 후 세척 완충액의 용적은 1 CV, 또는 2 CV, 또는 3 CV, 또는 4 CV, 또는 5 CV이다. 하나의 예에서, 부하 후 세척 완충액의 용적은 3 CV이다.
하나의 예에서, 음이온 교환 수지는 염화나트륨, 인산이수소나트륨, 수산화나트륨, 아세트산 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 재생 완충액으로 재생된다.
하나의 예에서, 음이온 교환 수지는 염화나트륨, 포스페이트 완충액, 수산화나트륨 완충액, 아세트산 완충액 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 재생 완충액으로 재생된다.
하나의 예에서, 음이온 교환 수지는 포스페이트 완충액을 포함하는 재생 완충액으로 재생된다. 예를 들어, 포스페이트 완충액은 인산일나트륨(NaH2PO4), 인산이나트륨 (Na2HPO4), 인산 (H3PO4) 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 예에서, 재생 완충액은 Na2HPO4를 포함한다.
하나의 예에서, 재생 완충액은 H3PO4를 포함한다.
하나의 예에서, 재생 완충액은 NaH2PO4를 포함한다.
하나의 예에서, 재생 완충액은 Na2HPO4 및 NaH2PO4를 포함한다.
하나의 예에서, 재생 완충액은 염화나트륨을 포함한다. 또 다른 예에서, 재생 완충액은 수산화나트륨을 포함한다. 추가의 예에서, 재생 완충액은 아세트산을 포함한다.
하나의 예에서, 재생 완충액은 염화나트륨 및 포스페이트 완충액을 포함한다. 하나의 예에서, 재생 완충액은 염화나트륨 및 인산이수소나트륨(NaH2PO4)을 포함한다. 하나의 예에서, 재생 완충액은 염화나트륨 및 Na2HPO4를 포함한다. 하나의 예에서, 재생 완충액은 염화나트륨 및 H3PO4를 포함한다. 하나의 예에서, 재생 완충액은 염화나트륨 및 Na2HPO4 및 NaH2PO4를 포함한다.
하나의 예에서, 재생 완충액은 1M 염화나트륨 및 10mM 인산이수소나트륨, pH 6.2를 포함한다.
하나의 예에서, 재생 완충액은 1M 염화나트륨 및 10mM Na2HPO4, pH 6.2를 포함한다.
하나의 예에서, 재생 완충액은 1M 염화나트륨 및 10mM H3PO4, pH 6.2를 포함한다.
하나의 예에서, 재생 완충액은 1M 염화나트륨 및 10mM Na2HPO4 및 NaH2PO4, pH 6.2를 포함한다.
하나의 예에서, 재생 완충액은 1M 염화나트륨 및 100mM 인산이수소나트륨, pH 6.2를 포함한다.
하나의 예에서, 재생 완충액은 1M 염화나트륨 및 100mM Na2HPO4, pH 6.2를 포함한다.
하나의 예에서, 재생 완충액은 1M 염화나트륨 및 100mM H3PO4, pH 6.2를 포함한다.
하나의 예에서, 재생 완충액은 1M 염화나트륨 및 100mM Na2HPO4 및 NaH2PO4, pH 6.2를 포함한다.
하나의 예에서, 재생 완충액은 0.5 M 수산화나트륨을 포함한다.
하나의 예에서, 재생 완충액은 1M 아세트산을 포함한다.
하나의 예에서, 재생 완충액의 용적은 1 내지 10 CV 사이이다. 예를 들어, 재생 완충액의 용적은 1 CV, 또는 2 CV, 또는 3 CV, 또는 4 CV, 또는 5 CV, 또는 6 CV, 또는 7 CV, 또는 8 CV, 또는 9 CV, 또는 10 CV이다. 하나의 예에서, 재생 완충액의 용적은 5 CV이다.
적합한 재생 방법은 당업자에게 자명할 것이고/이거나 본원에 기재되어 있다.
하나의 예에서, IgG의 적어도 75%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 또 다른 예에서, IgG의 적어도 75%는 연속 크로마토그래피 방법 후 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 예를 들어, IgG의 적어도 75%는 추가의 정제 단계 없이 연속 크로마토그래피 방법 후 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 예를 들어, IgG의 적어도 75%는 추가의 정제 단계와 함께 연속 크로마토그래피 방법 후 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 예를 들어, IgG의 적어도 75%는 이온 교환 크로마토그래피 단계 후 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 하나의 예에서, IgG의 적어도 75%는 음이온 교환 크로마토그래피 단계 후 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 하나의 예에서, IgG의 적어도 75%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수되고, 여기서 IgG는 적어도 500kg의 혈장 또는 이의 분획으로부터 유래된다. 예를 들어, IgG의 적어도 75%는 혈장 또는 이의 분획의 대규모 정제로부터 회수된다. 예를 들어, 75%, 또는 76%, 또는 77%, 또는 78%, 또는 79%의 IgG는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 하나의 예에서, IgG의 75%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 하나의 예에서, IgG의 76%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 하나의 예에서, IgG의 77%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 하나의 예에서, IgG의 78%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 또 다른 예에서, IgG의 79%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다.
하나의 예에서, IgG의 적어도 80%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 또 다른 예에서, IgG의 적어도 80%는 연속 크로마토그래피 방법 후 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 예를 들어, IgG의 적어도 80%는 추가의 정제 단계 없이 연속 크로마토그래피 방법 후 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 예를 들어, IgG의 적어도 80%는 추가의 정제 단계와 함께 연속 크로마토그래피 방법 후 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 예를 들어, IgG의 적어도 80%는 이온 교환 크로마토그래피 단계 후 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 하나의 예에서, IgG의 적어도 80%는 음이온 교환 크로마토그래피 단계 후 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 하나의 예에서, IgG의 적어도 80%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수되고, 여기서 IgG는 적어도 500kg의 혈장 또는 이의 분획으로부터 유래된다. 예를 들어, IgG의 적어도 80%는 혈장 또는 이의 분획의 대규모 정제로부터 회수된다. 예를 들어, 80%, 또는 81%, 또는 82%, 또는 83%, 또는 84%의 IgG는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 하나의 예에서, IgG의 80%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 하나의 예에서, IgG의 81%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 하나의 예에서, IgG의 82%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 하나의 예에서, IgG의 83%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 또 다른 예에서, IgG의 84%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다.
하나의 예에서, IgG의 적어도 85%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 또 다른 예에서, IgG의 적어도 85%는 연속 크로마토그래피 방법 후 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 예를 들어, IgG의 적어도 85%는 추가의 정제 단계 없이 연속 크로마토그래피 방법 후 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 예를 들어, IgG의 적어도 85%는 추가의 정제 단계와 함께 연속 크로마토그래피 방법 후 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 예를 들어, IgG의 적어도 85%는 이온 교환 크로마토그래피 단계 후 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 하나의 예에서, IgG의 적어도 85%는 음이온 교환 크로마토그래피 단계 후 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 하나의 예에서, IgG의 적어도 85%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수되고, 여기서 IgG는 적어도 500kg의 혈장 또는 이의 분획으로부터 유래된다. 예를 들어, IgG의 적어도 85%는 혈장 또는 이의 분획의 대규모 정제로부터 회수된다. 예를 들어, 85%, 또는 86%, 또는 87%, 또는 88%, 또는 89%의 IgG는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 하나의 예에서, IgG의 85%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 하나의 예에서, IgG의 86%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 하나의 예에서, IgG의 87%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 하나의 예에서, IgG의 88%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 또 다른 예에서, IgG의 89%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다.
하나의 예에서, IgG의 적어도 90%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 또 다른 예에서, IgG의 적어도 90%는 연속 크로마토그래피 방법 후 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 예를 들어, IgG의 적어도 90%는 추가의 정제 단계 없이 연속 크로마토그래피 방법 후 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 예를 들어, IgG의 적어도 90%는 추가의 정제 단계와 함께 연속 크로마토그래피 방법 후 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 예를 들어, IgG의 적어도 90%는 이온 교환 크로마토그래피 단계 후 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 하나의 예에서, IgG의 적어도 90%는 음이온 교환 크로마토그래피 단계 후 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 하나의 예에서, IgG의 적어도 90%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수되고, 여기서 IgG는 적어도 500kg의 혈장 또는 이의 분획으로부터 유래된다. 예를 들어, IgG의 적어도 90%는 혈장 또는 이의 분획의 대규모 정제로부터 회수된다. 예를 들어, 90%, 또는 91%, 또는 92%, 또는 93%, 또는 94%의 IgG는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 하나의 예에서, IgG의 90%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 하나의 예에서, IgG의 91%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 하나의 예에서, IgG의 92%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 하나의 예에서, IgG의 93%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 또 다른 예에서, IgG의 94%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다.
하나의 예에서, IgG의 적어도 95%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 또 다른 예에서, IgG의 적어도 95%는 연속 크로마토그래피 방법 후 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 예를 들어, IgG의 적어도 95%는 추가의 정제 단계 없이 연속 크로마토그래피 방법 후 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 예를 들어, IgG의 적어도 95%는 추가의 정제 단계와 함께 연속 크로마토그래피 방법 후 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 예를 들어, IgG의 적어도 95%는 이온 교환 크로마토그래피 단계 후 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 하나의 예에서, IgG의 적어도 95%는 음이온 교환 크로마토그래피 단계 후 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 하나의 예에서, IgG의 적어도 95%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수되고, 여기서 IgG는 적어도 500kg의 혈장 또는 이의 분획으로부터 유래된다. 예를 들어, IgG의 적어도 95%는 혈장 또는 이의 분획의 대규모 정제로부터 회수된다. 예를 들어, 95%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%의 IgG는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 하나의 예에서, IgG의 95%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 하나의 예에서, IgG의 96%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 하나의 예에서, IgG의 97%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 하나의 예에서, IgG의 98%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다. 또 다른 예에서, IgG의 99%는 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수된다.
하나의 예에서, 용출된 IgG는 적어도 95%의 순도를 갖는다. 또 다른 예에서, 용출된 IgG는 연속 크로마토그래피 방법 후 적어도 95%의 순도를 갖는다. 또 다른 예에서, 용출된 IgG는 추가의 정제 단계 없이 연속 크로마토그래피 방법 후 적어도 95%의 순도를 갖는다. 또 다른 예에서, 용출된 IgG는 추가의 정제 단계와 함께 연속 크로마토그래피 방법 후 적어도 95%의 순도를 갖는다. 하나의 예에서, 적어도 95%의 순도를 갖는 용출된 IgG는 적어도 500kg의 혈장 또는 이의 분획으로부터 유래한다. 예를 들어, 적어도 95%의 순도를 갖는 용출된 IgG는 혈장 또는 이의 분획의 대규모 정제로부터 회수된다. 예를 들어, 용출된 IgG는 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 순도를 갖는다. 하나의 예에서, 용출된 IgG는 95%의 순도를 갖는다. 하나의 예에서, 용출된 IgG는 96%의 순도를 갖는다. 하나의 예에서, 용출된 IgG는 97%의 순도를 갖는다.
하나의 예에서, 용출된 IgG는 적어도 98%의 순도를 갖는다. 또 다른 예에서, 용출된 IgG는 연속 크로마토그래피 방법 후 적어도 98%의 순도를 갖는다. 하나의 예에서, 용출된 IgG는 추가의 정제 단계 없이 연속 크로마토그래피 방법 후 적어도 98%의 순도를 갖는다. 하나의 예에서, 용출된 IgG는 추가의 정제 단계와 함께 연속 크로마토그래피 방법 후 적어도 98%의 순도를 갖는다. 하나의 예에서, 적어도 98%의 순도를 갖는 용출된 IgG는 적어도 500kg의 혈장 또는 이의 분획으로부터 유래한다. 예를 들어, 적어도 98%의 순도를 갖는 용출된 IgG는 혈장 또는 이의 분획의 대규모 정제로부터 회수된다. 예를 들어, 용출된 IgG는 98% 또는 99%의 순도를 갖는다.
하나의 예에서, 방법은 대규모로 수행된다. 예를 들어, 방법은 산업적 또는 상업적 규모로 수행된다. 산업적 또는 상업적 규모로 수행하는 방법은 당업자에게 자명할 것이고/이거나 본원에 기재된다. 예를 들어, 산업적 규모로 수행되는 방법은 혈장 또는 이의 분획으로부터 IgG를 대규모로 정제하는 것을 포함한다.
하나의 예에서, IgG의 대규모 정제는 적어도 500kg의 혈장 또는 이의 분획을 사용하여 수행한다. 예를 들어, 500kg 내지 1000kg, 또는 1000kg 내지 2500kg, 또는 2500kg 내지 5000kg, 또는 5000kg 내지 7500kg, 또는 7500kg, 또는 10000kg, 또는 10000kg 내지 12500kg, 또는 12500kg 내지 15000kg의 혈장 또는 이의 분획을 사용하여 대규모 IgG 정제를 수행한다. 하나의 예에서, 적어도 1000kg, 또는 2500kg, 또는 5000kg, 또는 7500kg, 또는 10000kg, 또는 12500kg 또는 15000kg의 혈장 또는 이의 분획을 사용하여 대규모로 IgG 정제를 수행한다. 하나의 예에서, IgG의 대규모 정제는 적어도 1000kg의 혈장 또는 이의 분획을 사용하여 수행한다. 하나의 예에서, IgG의 대규모 정제는 적어도 2500kg의 혈장 또는 이의 분획을 사용하여 수행한다. 하나의 예에서, IgG의 대규모 정제는 적어도 5000kg의 혈장 또는 이의 분획을 사용하여 수행한다. 하나의 예에서, IgG의 대규모 정제는 적어도 7500kg의 혈장 또는 이의 분획을 사용하여 수행한다. 하나의 예에서, IgG의 대규모 정제는 적어도 10000kg의 혈장 또는 이의 분획을 사용하여 수행한다. 하나의 예에서, IgG의 대규모 정제는 적어도 12500kg의 혈장 또는 이의 분획을 사용하여 수행한다. 하나의 예에서, IgG의 대규모 정제는 적어도 15000kg의 혈장 또는 이의 분획을 사용하여 수행한다.
하나의 예에서, 방법은 정제된 IgG를 약제학적 조성물로 제형화하는 것을 추가로 포함한다.
본원 개시내용은 추가로 SMB 크로마토그래피를 사용하여 혈장 또는 이의 분획으로부터 IgG를 정제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은:
a) 가교 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 매트릭스와 사람 IgG의 CH3 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 친화성 크로마토그래피 수지를 7 내지 8 사이의 pH를 갖는 20mM 포스페이트 평형화 완충액으로 평형화시키는 단계;
b) 혈장 또는 이의 분획으로부터의 IgG를 수지에 결합시키는 단계;
c) 7 내지 8 사이의 pH를 갖는 20mM 포스페이트 세척 완충액으로 수지를 세척하는 단계; 및
d) 3 내지 5 사이의 pH를 갖는 20mM 아세테이트 용출 완충액으로 결합된 IgG를 용출시키는 단계를 포함하고;
여기서, 친화성 크로마토그래피 수지에 대해 단계 a) 내지 d)가 반복될 수 있고, 여기서, 친화성 크로마토그래피 수지는 입구 및 출구 밸브를 포함하는 유체 도관에 의해 분리된 일련의 2개 이상의 유동적으로 연결된 컬럼에 팩킹되고, 임의로, 상기 방법은 2 내지 3 사이의 pH를 갖는 20 mM 포스페이트 세척 완충액으로 수지를 스트립핑하는 것을 추가로 포함한다.
본원 개시내용은 추가로 SMB 크로마토그래피를 사용하여 혈장 또는 이의 분획으로부터 IgG를 정제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은:
a) 가교 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 매트릭스와 사람 IgG의 CH3 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 친화성 크로마토그래피 수지를 20mM 인산이수소나트륨 완충액, 145mM 염화나트륨을 포함하고 7 내지 8 사이의 pH를 갖는 평형화 완충액으로 평형화시키는 단계;
b) 혈장 또는 이의 분획으로부터의 IgG를 수지에 결합시키는 단계;
c) 20 mM 인산이수소나트륨 완충액, 145 mM 염화나트륨을 포함하고 7 내지 8 사이의 pH를 갖는 세척 완충액으로 수지를 세척하는 단계; 및
d) 3 내지 5 사이의 pH를 갖는 20mM 아세테이트 용출 완충액으로 결합된 IgG를 용출시키는 단계를 포함하고;
여기서, 친화성 크로마토그래피 수지에 대해 단계 a) 내지 d)가 반복될 수 있고, 여기서, 친화성 크로마토그래피 수지는 입구 및 출구 밸브를 포함하는 유체 도관에 의해 분리된 일련의 2개 이상의 유동적으로 연결된 컬럼에 팩킹되고, 임의로, 상기 방법은 2 내지 3 사이의 pH를 갖는 20 mM 포스페이트 세척 완충액으로 수지를 스트립핑하는 것을 추가로 포함한다.
본원 개시내용은 추가로 SMB 크로마토그래피를 사용하여 혈장 또는 이의 분획으로부터 IgG를 정제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은:
a) 가교 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 매트릭스와 사람 IgG의 CH3 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 친화성 크로마토그래피 수지를 20mM 인산이수소나트륨 완충액, 500mM 염화나트륨을 포함하고 7 내지 8 사이의 pH를 갖는 평형화 완충액으로 평형화시키는 단계;
b) 혈장 또는 이의 분획으로부터의 IgG를 수지에 결합시키는 단계;
c) 20 mM 인산이수소나트륨 완충액, 500 mM 염화나트륨을 포함하고 7 내지 8 사이의 pH를 갖는 세척 완충액으로 수지를 세척하는 단계; 및
d) 3 내지 5 사이의 pH를 갖는 20mM 아세테이트 용출 완충액으로 결합된 IgG를 용출시키는 단계를 포함하고;
여기서, 친화성 크로마토그래피 수지에 대해 단계 a) 내지 d)가 반복될 수 있고, 여기서, 친화성 크로마토그래피 수지는 입구 및 출구 밸브를 포함하는 유체 도관에 의해 분리된 일련의 2개 이상의 유동적으로 연결된 컬럼에 팩킹되고, 임의로, 상기 방법은 2 내지 3 사이의 pH를 갖는 20 mM 포스페이트 세척 완충액으로 수지를 스트립핑하는 것을 추가로 포함한다.
하나의 예에서, 상기 방법은 수지를 스트립핑하는 것을 포함하지 않는다.
본원 개시내용은 추가로 SMB 크로마토그래피를 사용하여 혈장 또는 이의 분획으로부터 IgG를 정제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은:
a) 가교 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 매트릭스와 사람 IgG의 CH3 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 친화성 크로마토그래피 수지를 7 내지 8 사이의 pH를 갖는 20mM 포스페이트 평형화 완충액으로 평형화시키는 단계;
b) 혈장 또는 이의 분획으로부터의 IgG를 수지에 결합시키는 단계;
c) 7 내지 8 사이의 pH를 갖는 20mM 포스페이트 세척 완충액으로 수지를 세척하는 단계; 및
d) 3 내지 5 사이의 pH를 갖는 20mM 아세테이트 용출 완충액으로 결합된 IgG를 용출시키는 단계를 포함하고;
여기서, 친화성 크로마토그래피 수지에 대해 단계 a) 내지 d)가 반복될 수 있고, 여기서, 친화성 크로마토그래피 수지는 입구 및 출구 밸브를 포함하는 유체 도관에 의해 분리된 일련의 2개 이상의 유동적으로 연결된 컬럼에 팩킹되고, 상기 방법은 수지를 스트립핑하는 것을 포함하지 않는다.
본원 개시내용은 추가로 SMB 크로마토그래피를 사용하여 혈장 또는 이의 분획으로부터 IgG를 정제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은:
a) 가교 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 매트릭스와 사람 IgG의 CH3 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 친화성 크로마토그래피 수지를 7 내지 8 사이의 pH를 갖는 20mM 포스페이트 평형화 완충액으로 평형화시키는 단계;
b) 혈장 또는 이의 분획으로부터의 IgG를 수지에 결합시키는 단계;
c) 7 내지 8 사이의 pH를 갖는 20mM 포스페이트 세척 완충액으로 수지를 세척하는 단계; 및
d) 3 내지 5 사이의 pH를 갖는 20mM 아세테이트 또는 포스페이트 용출 완충액으로 결합된 IgG를 용출시키는 단계를 포함하고;
여기서, 친화성 크로마토그래피 수지에 대해 단계 a) 내지 d)가 반복될 수 있고, 여기서, 친화성 크로마토그래피 수지는 입구 및 출구 밸브를 포함하는 유체 도관에 의해 분리된 일련의 2개 이상의 유동적으로 연결된 컬럼에 팩킹되고, 임의로 상기 방법은 수지를 스트립핑하는 것을 포함하지 않는다.
본원 개시내용은 추가로 SMB 크로마토그래피를 사용하여 혈장 또는 이의 분획으로부터 IgG를 정제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은:
a) 가교 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 매트릭스와 사람 IgG의 CH3 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 친화성 크로마토그래피 수지를 20mM 인산이수소나트륨 완충액, 145mM 염화나트륨을 포함하고 7 내지 8 사이의 pH를 갖는 평형화 완충액으로 평형화시키는 단계;
b) 혈장 또는 이의 분획으로부터의 IgG를 수지에 결합시키는 단계;
c) 20 mM 인산이수소나트륨 완충액, 145 mM 염화나트륨을 포함하고 7 내지 8 사이의 pH를 갖는 세척 완충액으로 수지를 세척하는 단계; 및
d) 3 내지 5 사이의 pH를 갖는 20mM 아세테이트 용출 완충액으로 결합된 IgG를 용출시키는 단계를 포함하고;
여기서, 친화성 크로마토그래피 수지에 대해 단계 a) 내지 d)가 반복될 수 있고, 여기서, 친화성 크로마토그래피 수지는 입구 및 출구 밸브를 포함하는 유체 도관에 의해 분리된 일련의 2개 이상의 유동적으로 연결된 컬럼에 팩킹되고, 상기 방법은 수지를 스트립핑하는 것을 포함하지 않는다.
본원 개시내용은 추가로 SMB 크로마토그래피를 사용하여 혈장 또는 이의 분획으로부터 IgG를 정제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은:
a) 가교 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 매트릭스와 사람 IgG의 CH3 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 친화성 크로마토그래피 수지를 20mM 인산이수소나트륨 완충액, 500mM 염화나트륨을 포함하고 7 내지 8 사이의 pH를 갖는 평형화 완충액으로 평형화시키는 단계;
b) 혈장 또는 이의 분획으로부터의 IgG를 수지에 결합시키는 단계;
c) 20 mM 인산이수소나트륨 완충액, 500 mM 염화나트륨을 포함하고 7 내지 8 사이의 pH를 갖는 세척 완충액으로 수지를 세척하는 단계; 및
d) 3 내지 5 사이의 pH를 갖는 20mM 아세테이트 용출 완충액으로 결합된 IgG를 용출시키는 단계를 포함하고;
여기서, 친화성 크로마토그래피 수지에 대해 단계 a) 내지 d)가 반복될 수 있고, 여기서, 친화성 크로마토그래피 수지는 입구 및 출구 밸브를 포함하는 유체 도관에 의해 분리된 일련의 2개 이상의 유동적으로 연결된 컬럼에 팩킹되고, 상기 방법은 수지를 스트립핑하는 것을 포함하지 않는다.
하나의 예에서 상기 방법은 수지에서 적어도 50주기 동안 반복된다. 예를 들어, 상기 방법은 혈장 또는 이의 분획의 배치당 적어도 50주기 동안 수지에서 반복된다. 하나의 예에서, 상기 방법은 혈장 또는 이의 분획 배치 당 50 내지 80 사이 주기, 60 내지 80 사이 주기, 70 내지 80주기 동안 레진에서 반복된다. 예를 들어, 상기 방법은 혈장 또는 이의 분획의 배치당 적어도 60, 또는 65, 또는 70, 또는 75 또는 80주기 동안 수지에서 반복된다.
하나의 예에서, 상기 방법은 혈장 또는 이의 분획의 배치당 50주기 동안 수지에서 반복된다.
하나의 예에서, 상기 방법은 혈장 또는 이의 분획의 배치당 60주기 동안 수지에서 반복된다.
하나의 예에서, 상기 방법은 혈장 또는 이의 분획의 배치당 70주기 동안 수지에서 반복된다.
하나의 예에서, 상기 방법은 혈장 또는 이의 분획의 배치당 80주기 동안 수지에서 반복된다.
하나의 예에서, 상기 방법은 혈장 또는 이의 분획의 다수의 배치와 힘께 수지에서 반복된다. 예를 들어, 상기 방법은 혈장 또는 이의 분획의 적어도 2개의 배치와 함께 수지에서 반복된다. 하나의 예에서, 상기 방법은 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9 또는 10 배치의 혈장 또는 이의 분획과 함께 수지에서 반복된다. 하나의 예에서, 상기 방법은 혈장 또는 이의 분획의 4 내지 10개의 배치와 힘께 수지에서 반복된다.
하나의 예에서 상기 방법은 수지에서 최대 총 800주기 동안 반복된다. 예를 들어, 수지는 최대 총 800 주기 횟수동안 재사용한다. 하나의 예에서, 상기 방법은 수지에서 최대 총 100, 또는 200, 또는 300, 또는 400, 또는 500, 또는 600, 또는 700 주기 동안 반복된다. 예를 들어, 상기 방법은 최대 총 100 주기 동안 수지에서 반복된다. 예를 들어, 상기 방법은 최대 총 200 주기 동안 수지에서 반복된다. 예를 들어, 상기 방법은 최대 총 300 주기 동안 수지에서 반복된다. 예를 들어, 상기 방법은 최대 총 400 주기 동안 수지에서 반복된다. 예를 들어, 상기 방법은 최대 총 500 주기 동안 수지에서 반복된다. 예를 들어, 상기 방법은 최대 총 600 주기 동안 수지에서 반복된다. 예를 들어, 상기 방법은 최대 총 700 주기 동안 수지에서 반복된다.
하나의 예에서, 상기 방법은 100 내지 200 사이 주기, 또는 200 내지 300 사이 주기, 또는 200 내지 500 사이 주기 또는 500 내지 800 사이 주기동안 수지에서 반복된다.
하나의 예에서 상기 방법은 수지에서 200주기 동안 반복된다.
하나의 예에서 상기 방법은 수지에서 300주기 동안 반복된다.
하나의 예에서 상기 방법은 수지에서 400주기 동안 반복된다.
하나의 예에서 상기 방법은 수지에서 500주기 동안 반복된다.
하나의 예에서 상기 방법은 수지에서 600주기 동안 반복된다.
하나의 예에서 상기 방법은 수지에서 700주기 동안 반복된다.
하나의 예에서 상기 방법은 수지에서 800주기 동안 반복된다.
하나의 예에서 상기 방법은 수지에서 200 내지 500 사이 주기 동안 반복된다. 예를 들어, 수지는 최대 총 200 내지 500 주기 횟수동안 재사용한다. 하나의 예에서, 수지는 최대 10배치의 혈장 또는 이의 분획으로 총 최대 500주기까지 재사용한다.
하나의 예에서, 각 개별 주기 후에 수지에 살균 단계를 수행한다. 또 다른 예에서 다수의 주기 후에 수지에 살균 단계를 수행한다. 예를 들어, 살균 단계는 수지에서 적어도 50주기후에 수행된다. 하나의 예에서, 적어도 100주기 후 에 수지에서 살균 단계를 수행한다. 또 다른 예에서 적어도 150 주기 후에 수지에 살균 단계를 수행한다. 추가의 예에서, 살균 단계는 수지에서 적어도 200주기 후에 수행된다. 하나의 예에서, 살균 단계는 혈장 또는 이의 분획의 각각의 배치 후에 수지에서 수행된다. 예를 들어, 살균 단계는 각 배치의 혈장 또는 이의 분획 사이에, 즉 각 배치의 혈장 또는 이의 분획을 수지상에 부하하기 전에 수지에 대해 수행된다.
적합한 살균 방법은 당업자에게 공지되어 있고/있거나 본원에 기재되어 있다.
하나의 예에서, 상기 방법은 수지의 DBC를 감소시킨다. 예를 들어, 수지의 재사용은 수지의 DBC를 감소시킨다. 하나의 예에서, 수지의 DBC는 최대 80%까지 감소된다. 예를 들어, 수지의 DBC는 최대 75%, 또는 70%, 또는 65%, 또는 60%, 또는 55%, 또는 40%, 또는 45%, 또는 40%, 또는 35%, 또는 30%, 또는 25%, 또는 20%, 또는 15%, 또는 10%, 또는 5%까지 감소된다.
하나의 예에서, 수지는 수지의 DBC가 최대 80%까지 감소될때까지 재사용한다.
하나의 예에서, 방법은 수지의 DBC를 80%까지 감소시킨다. 예를 들어, 수지는 수지의 DBC가 80%까지 감소될때까지 재사용한다.
하나의 예에서, 상기 방법은 수지의 DBC를 70%까지 감소시킨다. 예를 들어, 수지는 수지의 DBC가 70%까지 감소될때까지 재사용한다.
하나의 예에서, 방법은 수지의 DBC를 60%까지 감소시킨다. 예를 들어, 수지는 수지의 DBC가 60%까지 감소될때까지 재사용한다.
하나의 예에서, 방법은 수지의 DBC를 50%까지 감소시킨다. 예를 들어, 수지는 수지의 DBC가 50%까지 감소될때까지 재사용한다.
하나의 예에서, 방법은 수지의 DBC를 40%까지 감소시킨다. 예를 들어, 수지는 수지의 DBC가 40%까지 감소될때까지 재사용한다.
하나의 예에서, 방법은 수지의 DBC를 30%까지 감소시킨다. 예를 들어, 수지는 수지의 DBC가 30%까지 감소될때까지 재사용한다.
하나의 예에서, 방법은 수지의 DBC를 20%까지 감소시킨다. 예를 들어, 수지는 수지의 DBC가 20%까지 감소될때까지 재사용한다.
하나의 예에서, 방법은 수지의 DBC를 10%까지 감소시킨다. 예를 들어, 수지는 수지의 DBC가 10%까지 감소될때까지 재사용한다.
본원 개시내용은 또한 본원에 기재된 방법에 의해 정제 또는 생산된 IgG를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 본원에 기재된 방법에 의해 정제 또는 생산된 IgG와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
하나의 예에서, 약제학적 조성물은 적어도 1% (w/v) 정제된 IgG를 포함한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 1% (w/v) 정제된 IgG를 포함한다. 또 다른 예에서, 약제학적 조성물은 5% (w/v) 정제된 IgG를 포함한다. 하나의 예에서, 약제학적 조성물은 10 내지 30% (w/v) 사이의 정제된 IgG를 포함한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 10% (w/v) 정제된 IgG를 포함한다. 하나의 예에서, 약제학적 조성물은 16.5% (w/v) 정제된 IgG를 포함한다. 또 다른 예에서, 약제학적 조성물은 20% (w/v) 정제된 IgG를 포함한다. 하나의 예에서, 약제학적 조성물은 25% (w/v) 정제된 IgG를 포함한다. 또 다른 예에서, 약제학적 조성물은 30% (w/v) 정제된 IgG를 포함한다.
하나의 예에서, 약제학적 조성물 중의 IgG 함량은 조성물 내 단백질 총량의 적어도 95%(w/w)이다. 예를 들어, 약제학적 조성물 중의 IgG 함량은 조성물 내 단백질 총량의 95%(w/w)이다. 또 다른 예에서, 약제학적 조성물 중의 IgG 함량은 조성물 내 단백질 총량의 96%(w/w)이다. 추가의 예에서, 약제학적 조성물 중의 IgG 함량은 조성물 내 단백질 총량의 97%(w/w)이다. 하나의 예에서, 약제학적 조성물 중의 IgG 함량은 조성물 내 단백질 총량의 98%(w/w)이다. 추가의 예에서, 약제학적 조성물 중의 IgG 함량은 조성물 내 단백질 총량의 99%(w/w)이다.
하나의 예에서, 약제학적 조성물은 100 mg/mL의 총 사람 혈장 단백질을 포함한다. 하나의 예에서, 약제학적 조성물은 20 g/100 mL의 총 사람 혈장 단백질을 포함한다.
하나의 예에서, 약제학적 조성물은 적어도 95% 순도의 면역글로불린 G(IgG)를 포함한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 적어도 96% 순도의 면역글로불린 G(IgG)를 포함한다. 또 다른 예에서, 약제학적 조성물은 적어도 97% 순도의 면역글로불린 G(IgG)를 포함한다. 또 다른 예에서, 약제학적 조성물은 적어도 98% 순도의 면역글로불린 G(IgG)를 포함한다. 또 다른 예에서, 약제학적 조성물은 적어도 99% 순도의 면역글로불린 G(IgG)를 포함한다.
하나의 예에서, 약제학적 조성물은 적어도 60%의 IgG1 서브클래스 분포를 포함한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 적어도 65%의 IgG1 서브클래스 분포를 포함한다.
하나의 예에서, 약제학적 조성물은 30% 미만의 IgG2 서브클래스 분포를 포함한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 28% 미만의 IgG2 서브클래스 분포를 포함한다.
하나의 예에서, 약제학적 조성물은 5% 미만의 IgG3 서브클래스 분포를 포함한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 4% 미만의 IgG3 서브클래스 분포를 포함한다.
하나의 예에서, 약제학적 조성물은 5% 미만의 IgG4 서브클래스 분포를 포함한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 3% 미만의 IgG4 서브클래스 분포를 포함한다.
하나의 예에서, 약제학적 조성물은 정상적인 사람 혈장과 유사한 IgG 서브클래스 분포, 예를 들어, IgG1 69%, IgG2 26%, IgG3 3% 및 IgG4 2%를 포함한다.
하나의 예에서, 약제학적 조성물은 약 300 mOsm/kg 내지 약 400 mOsm/kg 사이의 공칭 삼투압을 포함한다. 하나의 예에서, 약제학적 조성물은 380 mOsm/kg의 공칭 삼투압을 포함한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 약 300 mOsm/kg 내지 약 350 mOsm/kg 사이의 공칭 삼투압을 포함한다. 하나의 예에서, 약제학적 조성물은 320 mOsm/kg의 공칭 삼투압을 포함한다.
하나의 예에서, 약제학적 조성물은 4 내지 5.5 사이의 pH를 포함한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 4.5 내지 5.0 사이의 pH를 포함한다. 하나의 예에서, 약제학적 조성물은 4.6 내지 5.0 사이의 pH를포함한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 4.6의 pH를 포함한다. 하나의 예에서, 약제학적 조성물은 4.7의 pH를 포함한다. 또 다른 예에서, 약제학적 조성물은 4.8의 pH를 포함한다. 추가의 예에서, 약제학적 조성물은 4.9의 pH를 포함한다. 하나의 예에서, 약제학적 조성물은 5.0의 pH를 포함한다.
하나의 예에서, 약제학적 조성물은 200mmol/L 내지 300mmol/L의 L-프롤린을 추가로 포함한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 225 mmol/L 내지 275mmol/L의 L-프롤린을 추가로 포함한다. 하나의 예에서, 약제학적 조성물은 240 mmol/L 내지 260mmol/L의 L-프롤린을 추가로 포함한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 250 mmol/L의 L-프롤린을 추가로 포함한다.
하나의 예에서, 약제학적 조성물은 ≤1 mmol/L의 나트륨 함량을 포함한다.
하나의 예에서, 약제학적 조성물은 ≤ 0.05 mg/mL의 IgA 함량을 포함한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 ≤ 0.04 mg/mL, 또는 ≤ 0.03 mg/mL의 IgA 함량을 포함한다. 하나의 예에서, 약제학적 조성물은 ≤ 0.025 mg/mL의 IgA 함량을 포함한다. 하나의 예에서, 약제학적 조성물은 ≤ 0.01 mg/mL의 IgA 함량을 포함한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 ≤ 0.009 mg/mL의 IgA 함량을 포함한다.
하나의 예에서, 약제학적 조성물은 ≤ 0.1 mg/g IgG의 IgA 함량을 포함한다. 하나의 예에서, 약제학적 조성물은 ≤ 0.09 mg/g IgG의 IgA 함량을 포함한다.
하나의 예에서, 약제학적 조성물은 ≤ 10 mg/L의 IgM 함량을 포함한다. 예를 들어, ≤ 10 mg/L, ≤ 9 mg/L, ≤ 8 mg/L, ≤ 7 mg/L, ≤ 6 mg/L, ≤ 5 mg/L, ≤ 4 mg/L, ≤ 3 mg/L, ≤ 2 mg/L의 IgM 함량을 포함한다. 하나의 예에서, 약제학적 조성물은 ≤ 2 mg/L의 IgM 함량을 포함한다. 하나의 예에서, 약제학적 조성물은 ≤ 1 mg/L의 IgM 함량을 포함한다. 하나의 예에서, 약제학적 조성물은 ≤ 0.5 mg/L의 IgM 함량을 포함한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 < 0.17 mg/L의 IgM 함량을 포함한다.
하나의 예에서, 약제학적 조성물은 ≤ 2 μg/g IgG의 IgM 함량을 포함한다. 하나의 예에서, 약제학적 조성물은 ≤ 1.9 μg/g IgG의 IgM 함량을 포함한다.
하나의 예에서, 약제학적 조성물은 ≤ 0.50 mg/mL의 알부민 함량을 포함한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 ≤ 0.40 mg/mL의 알부민 함량을 포함한다. 하나의 예에서, 약제학적 조성물은 ≤ 0.30 mg/mL의 알부민 함량을 포함한다. 하나의 예에서, 약제학적 조성물은 ≤ 0.20 mg/mL의 알부민 함량을 포함한다. 하나의 예에서, 약제학적 조성물은 ≤ 0.10 mg/mL의 알부민 함량을 포함한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 ≤ 0.09 mg/mL의 알부민 함량을 포함한다. 하나의 예에서, 약제학적 조성물은 ≤ 0.08 mg/mL의 알부민 함량을 포함한다. 하나의 예에서, 약제학적 조성물은 ≤ 0.07 mg/mL의 알부민 함량을 포함한다.
하나의 예에서, 약제학적 조성물은 ≤ 1 mg/g IgG의 알부민 함량을 포함한다. 하나의 예에서, 약제학적 조성물은 ≤ 0.80 mg/g IgG의 알부민 함량을 포함한다.
하나의 예에서, 약제학적 조성물은 ≤35 IU/mL의 프레칼리크레인 활성화제(PKA) 수준을 포함한다. 하나의 예에서, 약제학적 조성물은 ≤30 IU/mL의 프레칼리크레인 활성화제(PKA) 수준을 포함한다. 하나의 예에서, 약제학적 조성물은 ≤50 IU/mL의 프레칼리크레인 활성화제(PKA) 수준을 포함한다. 하나의 예에서, 약제학적 조성물은 ≤20 IU/mL의 프레칼리크레인 활성화제(PKA) 수준을 포함한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 ≤15 IU/mL의 프레칼리크레인 활성화제(PKA) 수준을 포함한다. 하나의 예에서, 약제학적 조성물은 ≤10 IU/mL의 프레칼리크레인 활성화제(PKA) 수준을 포함한다.
본원 개시내용은 또한 대상체에서 병태를 치료, 예방 및/또는 진행을 지연시키는 데 사용하기 위해 본원에 기재된 약제학적 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본원 개시내용은 대상체에서 병태를 치료하는 데 사용하기 위해 본원에 기재된 약제학적 조성물을 제공한다. 또 다른 예에서, 본원의 개시내용은 대상체에서 병태를 예방하는데 사용하기 위해 본원에 기재된 약제학적 조성물을 제공한다. 추가의 예에서, 본원 개시내용은 대상체에서 병태의 진행을 지연시키는 데 사용하기 위해 본원에 기재된 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 예에서, 약제학적 조성물은 바이알, 미리 충전된 주사기 또는 자동주사기 장치에 존재한다.
본원의 개시내용은 또한 본원에 기재된 약제학적 조성물을 포함하는 미리 충전된 주사기를 제공한다.
본원의 개시내용은 또한 본원에 기재된 약제학적 조성물을 포함하는 자동주사기 장치를 제공한다.
하나의 예에서, 본원 개시내용의 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 피하 투여된다. 또 다른 예에서, 본원 개시내용의 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 정맥내 투여된다.
하나의 예에서, 본원 개시내용의 조성물은 자가 투여된다.
하나의 예에서, 본원 개시내용의 조성물은 피하로 자가 투여된다.
하나의 예에서, 본원 개시내용의 조성물은 미리 충전된 주사기에 제공된다.
하나의 예에서, 본원 개시내용의 조성물은 미리 충전된 주사기로 피하 자가투여된다.
본원 개시내용은 추가로 대상체에서 병태를 치료, 예방 및/또는 진행을 지연시키기 위한 약물의 제조에 본원에 기재된 방법에 의해 정제 또는 생산된 IgG의 용도를 제공한다. 예를 들어, 본원의 개시내용은 대상체에서 병태를 치료하기 위한 약물의 제조에 본원에 기재된 방법에 의해 정제 또는 생산된 IgG의 용도를 제공한다. 또 다른 예에서, 본원의 개시내용은 대상체에서 병태를 예방하기 위한 약물의 제조에 본원에 기재된 방법에 의해 정제 또는 생산된 IgG의 용도를 제공한다. 추가의 예에서, 본원 개시내용은 대상체에서 병태의 진행을 지연시키기 위한 약물의 제조에 본원에 기재된 방법에 의해 정제 또는 생산된 IgG의 용도를 제공한다.
본원의 개시내용은 또한 대상체에서 병태를 치료, 예방 및/또는 진행을 지연시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체에게 본원 개시내용의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본원의 개시내용은 대상체에서 병태를 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 예에서, 본원의 개시내용은 대상체에서 병태를 예방하는 방법을 제공한다. 추가의 예에서, 본원 개시내용은 대상체에서 병태의 진행을 지연시키는 방법을 제공한다.
본원 개시내용은 또한 대상체에서 병태를 치료 또는 예방 또는 진행을 지연시키는 데 사용하기 위한 키트를 제공하고, 상기 키트는 다음을 포함한다:
(a) 본원에 기재된 적어도 하나의 약제학적 조성물;
(b) 대상체에서 병태를 치료하거나 예방하는데 키트를 사용하기 위한 지침서; 및
(c) 임의로 적어도 하나의 추가의 치료학적 활성 화합물 또는 약물.
하나의 예에서, 병태는 면역 결핍, 자가면역 질환 또는 급성 감염이다. 예를 들어, 병태는 동종 골수 이식, 만성 림프구성 백혈병, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), 소아 HIV, 원발성 면역 결핍, 가와사키 질환, 만성 염증성 탈수초성 다발 신경병증(CIDP), 항체가 높은 수용자 또는 ABO 부적합 공여자와의 콩팥 이식, 만성 피로 증후군, 클로스트리듐 디피실 대장염, 피부근염 및 다발성 근염, 그레이브스 안병증, 길랑-바레 증후군, 근이영양증, 봉입체 근염, 램버트-이튼 증후군, 홍반성 루푸스, 다초점 운동 신경병증, 다발성 경화증(MS), 중증 근무력증, 신생아 동종 면역 혈소판 감소증, 파보바이러스 B19 감염, 천포창, 수혈 후 자반증, 신장 이식 거부, 자연유산 유산, 강직성 사람 증후군, 간대성 근간대증, 중증 성인에서 중증 패혈증 및 패혈성 쇼크, 독성 표피 괴사, 만성 림프구성 백혈병, 다발성 골수종, X-연관된 무감마글로불린혈증, 저감마글로불린혈증, 원발성 면역 결핍, RRMS, 알츠하이머 질환 및 파킨슨 질환이다.
하나의 예에서, 원발성 면역결핍 질환(PI), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(CIDP), 및 만성 면역 혈소판감소성 자반증(ITP)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 예에서, 상기 병태는 1차 면역결핍 질환(PI)이다.
하나의 예에서, 병태는 만성 염증 탈수초 다발신경병증(CIDP)이다.
하나의 예에서, 병태는 만성 면역 혈소판감소성 자반증(ITP)이다.
본원에 기재된 임의의 방법의 하나의 예에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어, 영장류, 예를 들어, 사람이다.
도 1은 (A) 환원(좌측) 및 비환원(우측) 조건하에 정화된 저온 결핍 혈장 FcXP POROS® 용출물(FcXP)의 SDS-PAGE 겔 이미지와 (B) SDS-PAGE 겔 실행으로부터의 용출물에서 동정된 단백질 불순물의 표이다.
도 2는 용출물에서 단백질의 2D-DIGE의 겔 이미지이다.
도 3은 본원에 기재된 방법에서 사용하기 전의 저온 풍부 혈장(CRP) 및 저온 결핍 혈장(CPP)의 IgG 서브클래스 분포를 보여주는 그래픽으로, CRP 및 CPP 용출물(즉, FcXP 수지로부터의 용출물)이다.
도 4는 6cm(LTS1) 및 20cm(LTS2) 베드 높이에서 연속적으로 실행한 FcXP POROS® 수지의 정적 결합 능력을 그래픽으로 보여준다.
도 5는 시간 경과에 따른 온도 또는 여과에 따른 (A) 혈장 및 (B) 저온 결핍 혈장(CPP)의 응고제 촉진 활성을 NaPTT 검정으로 측정한 결과를 그래픽으로 보여준다. 응고 시간은 > 150s으로 설정하였다.
도 6은 (A) 혈장 및 (B) 저온 결핍 혈장(CPP)에서 시간 경과에 따른 온도의 결과로서 트롬빈(S-2238), 일반 세린 프로테아제(S-2288), 칼리크레인(S-2302), 플라스민(S-2251) 및 FXa(S-2765)의 단백질용해 활성을 그래픽으로 보여준다.
도 7은 N-옥틸-β-D-글루코피라노시드를 사용한 바이러스에 의한 CRP 비활성화를 그래픽으로 보여준다.
도 8은 (A) 상이한 온도에서 해동한 샘플의 온도 의존적 용적-정규화된 냉동침전물의 비율과 (B) 최적의 해동 및 유지 시간 온도를 각각 평가하기 위한 유지 시간 연구 도식을 그래픽으로 보여준다.
도 9는 SMB 공정 중 배압을 보여주는 일련의 그래픽 표현으로 스트립 단계가 있는 경우(A)와 스트립 단계가 없는 경우(B)이다.
도 10은 (A) 세척 완충액 전도도가 증가함에 따라 용출물(즉, FcXP 수지로부터의 용출물)의 단백질용해 활성 감소 및 (B) 세척 완충액 전도도를 145mM 염화나트륨에서 500mM 염화나트륨으로 증가시킨 결과로서 정상 및 저온 결핍 혈장(CPP)으로부터 용출물(즉, FcXP 수지로부터의 용출물)의 단백질용해 활성의 감소를 보여주는 일련의 그래픽 표현이다.
도 11은 145mM 또는 500mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액을 사용한 용출물(즉, FcXP 수지로부터의 용출물)에서 (A) IgG 수율, (B) Lapchip 검정을 사용한 생성물 순도 및 (C) 정상 혈장 및 저온 결핍 혈장(CPP)에서 알부민, IgA 및 IgM 수준을 보여주는 일련의 그래픽 표현이다.
서열 목록 정보
도 2는 용출물에서 단백질의 2D-DIGE의 겔 이미지이다.
도 3은 본원에 기재된 방법에서 사용하기 전의 저온 풍부 혈장(CRP) 및 저온 결핍 혈장(CPP)의 IgG 서브클래스 분포를 보여주는 그래픽으로, CRP 및 CPP 용출물(즉, FcXP 수지로부터의 용출물)이다.
도 4는 6cm(LTS1) 및 20cm(LTS2) 베드 높이에서 연속적으로 실행한 FcXP POROS® 수지의 정적 결합 능력을 그래픽으로 보여준다.
도 5는 시간 경과에 따른 온도 또는 여과에 따른 (A) 혈장 및 (B) 저온 결핍 혈장(CPP)의 응고제 촉진 활성을 NaPTT 검정으로 측정한 결과를 그래픽으로 보여준다. 응고 시간은 > 150s으로 설정하였다.
도 6은 (A) 혈장 및 (B) 저온 결핍 혈장(CPP)에서 시간 경과에 따른 온도의 결과로서 트롬빈(S-2238), 일반 세린 프로테아제(S-2288), 칼리크레인(S-2302), 플라스민(S-2251) 및 FXa(S-2765)의 단백질용해 활성을 그래픽으로 보여준다.
도 7은 N-옥틸-β-D-글루코피라노시드를 사용한 바이러스에 의한 CRP 비활성화를 그래픽으로 보여준다.
도 8은 (A) 상이한 온도에서 해동한 샘플의 온도 의존적 용적-정규화된 냉동침전물의 비율과 (B) 최적의 해동 및 유지 시간 온도를 각각 평가하기 위한 유지 시간 연구 도식을 그래픽으로 보여준다.
도 9는 SMB 공정 중 배압을 보여주는 일련의 그래픽 표현으로 스트립 단계가 있는 경우(A)와 스트립 단계가 없는 경우(B)이다.
도 10은 (A) 세척 완충액 전도도가 증가함에 따라 용출물(즉, FcXP 수지로부터의 용출물)의 단백질용해 활성 감소 및 (B) 세척 완충액 전도도를 145mM 염화나트륨에서 500mM 염화나트륨으로 증가시킨 결과로서 정상 및 저온 결핍 혈장(CPP)으로부터 용출물(즉, FcXP 수지로부터의 용출물)의 단백질용해 활성의 감소를 보여주는 일련의 그래픽 표현이다.
도 11은 145mM 또는 500mM 염화나트륨을 포함하는 세척 완충액을 사용한 용출물(즉, FcXP 수지로부터의 용출물)에서 (A) IgG 수율, (B) Lapchip 검정을 사용한 생성물 순도 및 (C) 정상 혈장 및 저온 결핍 혈장(CPP)에서 알부민, IgA 및 IgM 수준을 보여주는 일련의 그래픽 표현이다.
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일반사항
본 명세서 전반에 걸쳐, 특별히 달리 언급되거나 문맥에서 다르게 요구되지 않는한, 단일 단계, 물질의 조성물, 단계들의 그룹 또는 물질의 조성물들의 그룹에 대한 언급은 하나 및 복수 (즉, 하나 이상)의 상기 단계들, 물질의 조성물들, 상기 단계들의 그룹 또는 상기 물질 조성물들의 그룹을 망라하는 것으로 이해해야 할 것이다.
당업자라면 본 명세서가 구체적으로 기재된 것 이외의 변형 및 변경의 여지가 있다는 점을 알 수 있을 것이다. 본 개시내용에는 이러한 모든 변형 및 변경을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 개시내용에는 본 명세서 내에 개별적으로 또는 총괄적으로 언급되거나 나타낸 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물, 및 상기 단계 또는 특징들의 모든 조합과 임의의 2종 이상의 임의의 조합을 포함한다.
본 발명은 본원에 기재된 구체적인 예들에 의해 그 범위가 제한되지 않으며, 이러한 예들은 단지 예시의 목적을 위한 것이다. 기능적으로 균등한 생성물, 조성물 및 방법들도 분명히 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 임의의 예는 특별히 달리 언급하지 않는 한 본 발명의 다른 예에 필요한 변경을 가하는 것을 취할 것이다.
구체적으로 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업계 (예를 들어, 세포 배양학, 분자 유전학, 면역학, 면역조직화학, 단백질 화학 및 생화학)의 숙련자들에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가질 것이다.
"및/또는"이라는 용어, 예를 들어, "X 및/또는 Y"는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y"를 의미하는 것으로 이해해야 하며, 양자 모두의 의미 또는 둘 중 하나의 의미를 위해 명확한 근거를 제공하기 위하여 취하는 것이다.
본 명세서 전반에 걸쳐, “포함하다”라는 단어, 또는 “포함하는” 또는 “포함하고”와 같은 변형태는 언급된 구성요소, 또는 정수 또는 단계, 또는 상기 구성요소, 또는 정수 또는 단계들의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 구성요소, 또는 정수 또는 단계, 또는 상기 구성요소, 또는 정수 또는 단계들의 그룹을 배제하지는 않음을 의미하는 것으로 이해해야 할 것이다.
본 명세서에 사용되는 "~로부터 유래된"이라는 용어는 공급원으로부터 반드시 직접적으로 얻는 것이 반드시 필요한 것은 아니지만, 명시된 정수값이 특정 공급원으로부터 얻어질 수 있다는 것을 나타내기 위해 취하는 것이다.
추가로, 본원에 사용된 바와 같은 단수형 “a,” “and” 및 “the”는, 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수형의 해당 대상물도 포함한다.
선택된 정의
"정제한다" 또는 "정제하는" 또는 "정제"라는 용어는 혈장 또는 이의 분획에 존재하는 적어도 하나의 불순물을 완전히 또는 부분적으로 제거하여 용액 내 IgG의 순도 수준을 개선시키는 것을 의미하는 것으로 간주된다.
"불순물" 또는 "불순물들"이라는 용어는 혈장 또는 이의 분획에서 IgG 이외의 하나 이상의 성분을 포함하는 것으로 간주된다. 예를 들어, 불순물은 알부민(α-글로불린 및/또는 β-글로불린), 혈장 지질, 혈장 단백질, 프로테아제 (예를 들어, 세린 프로테아제, 칼리크레인, 플라스민 및 FXa), 세린 프로테아제 억제제(예를 들어, C1 억제제, 알파-1- 항트립신 및 항-트롬빈) IgA 및 IgM, 인자 VIII, 피브리노겐, 폰 빌레브란트 인자, 활성화된 응고 인자(예를 들어, FXa, FIXa, FVIIa 및 트롬빈), 인자 XIII, 접촉 시스템 인자 (예를 들어, FXIa, FXIIa 및 혈장 칼리크레인), PKA, 인자 IX, 프로트롬빈 복합체, C1 에스테라제 억제제, 단백질 C, 항-트롬빈 III, RhD 면역글로불린 및 혈소판 막 미세입자를 포함할 수 있다.
"감마 글로불린" 또는 "면역 글로불린"으로도 알려진 "면역글로불린 G(IgG)"라는 용어는 이소타입 G의 항체를 의미하는 것으로 간주된다. IgG에는 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 여러 서브클래스가 있다.
"혈장"이라는 용어는 하나 이상의 혈액 공여자(들)로부터 수득된 혈액의 짚색(straw-coloured)/담황색 성분을 지칭한다. 공여자로부터 혈장을 수득하는 방법은 당업자에게 자명하고/하거나 본원에 기재되어 있다. 예를 들어, 혈장은 공여된 혈액으로부터 적혈구를 제거하여 수득한다. 예를 들어 혈장은 혈장 분리법으로 수득한다.
"혈장 분획" 또는 "이의 분획"이라는 용어는 혈장으로부터 하나 이상의 바람직한 단백질 성분을 분리하기 위해 분획화된 혈장을 지칭한다. 예를 들어, 혈장을 분획화하여 저온 침전물(신선한 동결된 혈장 유닛을 냉장에서 천천히 해동할 때 용액에서 침전되는 단백질)과 냉동 상등액(저온 결핍 혈장이로 공지된)을 단리할 수 있다. 예를 들어, 혈장은 에탄올 침전에 의해 분획화되어 미국 특허 제3,301,842호에 기재된 바와 같이 혈장으로부터 IgG 함유 Oncley 분획, Cohn 분획, 황산암모늄 침전물 또는 침전물 A(KN A), B(KN B) 및 상등액 B의 침전물(KN B+1)을 생성할 수 있다. 혈장 분획은 문헌(참조: Method 6, Cohn et. al. J. Am; Chem. Soc., 68 (3), 459-475 (1946), Method 9, Oncley et al. J. Am; Chem. Soc., 71, 541-550 (1946))에 기재된 것들과 같은 Cohn 방법에 따라 생성된 II+III 침전물, 또는 I+II+III 침전물(문헌참조: Method 10, Cohn et.al. J. Am; Chem. Soc., 72, 465-474 (1950); 및 문헌(참조: Deutsch et.al. J. Biol. Chem. 164, 109-118 (1946)) 또는 문헌(Nitschmann and Kistler Vox Sang. 7, 414-424 (1962); Helv. Chim. Acta 37, 866-873 (1954))의 침전물-A,B 및 상등액 B의 침전물을 포함한다. 예를 들어, 혈장은 유럽 출원 893450에 기재된 바와 같은 옥탄산 분획화로 분획될 수 있다. 전형적으로 Cohn 분획, 및 Kistler/Nitschmann 침전물 A(KN A), B(KN B) 및 상등액 B의 침전물(KN B+1)은 현탁 페이스트로 존재한다. 크로마토그래피를 포함한 다른 정제 기술을 사용할 수 있다.
"저온 침전물" 또는 "저온 침전물"이라는 용어는 신선한 동결된 혈장 유닛을 냉장에서 천천히 해동될 때 용액으로부터 침전되는 혈장 내 단백질을 지칭한다. 저온 침전물은 인자 VIII, 피브리노겐, 폰 빌레브란트 인자, 인자 XIII 및 혈소판 막 미세입자를 포함한다.
“저온 결핍 혈장"이라는 용어는 저온 침전물로부터 제거된 혈장을 의미하는 것으로 간주된다.
“저온 풍부 혈장"이라는 용어는 저온 침전물에서 전형적으로 발견되는 성분을 포함하는 혈장을 의미하는 것으로 간주된다.
"정화된" 또는 "정화하는"이라는 용어는 본원에 기재된 방법에서 사용하기 전에 하나 이상의 불순물을 제거하기 위해 혈장또는 이의 분획을 적합한 필터(예를 들어, 심층 필터 및/또는 1.2 및 0.45/0.22μm 막 필터)에 통과시키는 공정을 의미하는 것으로 간주된다.
"해리 상수"라는 용어는 완충액의 pKa를 지칭한다. pKa = -log10(Ka), 여기서 Ka는 완충액의 완충제의 산 해리 상수이다. 예를 들어, pH 7.4에서 20 mM의 인산이수소나트륨, 40 mM의 염화나트륨의 세척 완충액은 완충제로서 인산이수소나트륨을 포함한다. 인산은 3개의 해리 상수 (pKa1: 2.16, pKa2: 7.21, pKa3: 12.32)를 갖는다.
"친화성 크로마토그래피 수지"라는 용어는 예를 들어 본원 기재된 것들과 같은 매트릭스에 부착된 친화성 크로마토그래피 리간드(예를 들어, 낙타 유래된 단일 도메인 [VHH] 항체 단편)를 포함하는 수지를 의미하는 것으로 간주된다. 본원에 기재된 방법에 사용되는 예시적인 친화성 크로마토그래피 수지는 POROS® CaptureSelect® FcXP 친화성 수지(Thermo Fisher) 및 CaptureSelect® FcXP 아가로스 친화성 수지 (Thermo Fisher)를 포함한다. 추가의 예시적인 친화성 크로마토그래피 수지는 사람 IgG의 CH3 도메인에 특이적으로 결합하는 서열번호 1에 의해 암호화된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 갖는 수지를 포함한다. 예시적인 친화성 크로마토그래피 수지는 또한 Us10259886에 기재되어 있다.
"특이적으로 결합한다", "특이적으로 결합하는” 또는 “특이적으로 결합하는”이라는 용어는, 본원 개시내용의 단백질이 다른 항원 또는 세포와 반응하거나 결합하는 것보다 특정 항원 또는 이를 발현하는 세포와 더욱 빈번하게, 보다 신속하게, 보다 긴 지속기간 동안 및/또는 보다 큰 친화성으로 반응하거나 결합한다는 것을 의미하는 것으로 간주된다. 예를 들어, 다른 항원보다 훨씬 더 큰 친화성(예를 들어, 1.5 또는 2배 또는 5배 또는 10배 또는 20배 또는 40배 또는 60배 또는 80배 내지 100배 또는 150배 또는 200배)으로 사람 IgG의 CH3 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드이다. 반드시 그러한 것은 아니지만 일반적으로, 결합에 대한 언급은 특이적 결합을 의미하며, 각 용어는 다른 용어에 대한 분명한 근거를 제공하는 것으로 이해될 것이다.
"리간드"라는 용어는 사람 IgG의 CH3 도메인에 특이적으로 결합하는 친화성 크로마토그래피 수지의 매트릭스에 고정화된 분자를 의미하는 것으로 간주된다. 예를 들어, 리간드는 탁타 유래된 단일 도메인 [VHH] 항체 단편이다.
"집적된 제제"라는 용어는 본원에 기재된 용출물, 용액 또는 약제학적 조성물을 포함하는 것으로 간주된다. 본원 개시내용의 집적된 제제는 혈장 또는 이의 분획의 IgG에 비해 보다 높은 순도의 IgG를 포함한다.
"낙타 유래된 단일 도메인 [VHH] 항체 단편"이라는 용어는 낙타 계열 항체의 VHH 도메인을 의미하는 것으로 간주된다. 낙타과 항체는 낙타와 라마로부터 생산되는 항체이고, 사람 면역글로불린에 정상적으로 존재하는 CH1 도메인이 없고 VHH 도메인만 하나 있다. 낙타 유래 [VHH] 항체 단편을 포함하는 예시적인 친화성 크로마토그래피 수지는 CaptureSelect® 항체 친화성 크로마토그래피 수지(Thermo Fisher)를 포함한다. 예를 들어, CaptureSelect® FcXL 친화성 수지, POROS® CaptureSelect® FcXP 친화성 수지, CaptureSelect IgG-CH1 친화성 수지, 및 CaptureSelect FcXP 아가로스 친화성 수지. 추가의 예시적인 친화성 크로마토그래피 수지는 IgSelect® 친화성 수지 (Cytiva), HiTrap® IgSelect® 친화성 수지 (Cytiva), Pierce® 단백질 G 아가로스 친화성 수지(Thermo Fisher), 및 단백질 G 세파로스 4 신속 유동 친화성 수지 (Cytiva)를 포함한다.
"매트릭스"라는 용어는 리간드가 고정되어 있는 지지체를 의미하는 것으로 간주된다. 예시적인 매트릭스는 가교 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 매트릭스와 아가로스 기반 매트릭스이다.
크로마토그래피 수지의 "역학적 결합 용량" 또는 "DBC"라는 용어는 미결합 IgG의 현저한 돌파가 발생하기 전에 수지가 작동 조건에서 결합하는 최대 IgG 양을 지칭하는 것으로 간주된다.
'수지 ㎖당'이라는 용어는 습식 팩킹된 수지 용적 ㎖당을 지칭하는 것으로 간주된다.
"베드 높이"라는 용어는 친화성 크로마토그래피 수지가 컬럼에 팩킹되는 높이를 의미하는 것으로 간주된다. "총 베드 높이"에 대한 참조는 연속 크로마토그래피 설정에서 모든 컬럼의 베드 높이를 지칭한다는 것이 당업자에게 자명하다.
"비부하 단계"라는 용어는 연속 크로마토그래피 방법의 부하 단계 이외의 단계를 의미하는 것으로 간주된다. 예를 들어, 비부하 단계는 평형화 단계, 세척 단계, 용출 단계, 스트립 단계 및/또는 재평형화 단계를 지칭할 수 있다.
'주기'라는 용어는 수지에 대해 수행되는 평형화, IgG 부하, 결합, 용출, 스트립핑, 살균 및/또는 재생의 한 라운드를 의미하는 것으로 간주된다.
"순도"라는 용어는 정제된 IgG, IgG 집적된 제제 및 약제학적 조성물의 총 단백질 함량 대비 IgG 부분을 퍼센트로 지칭한다.
"산업적 또는 상업적 규모" 또는 "대규모" 또는 "제조 규모"라는 용어는 임상 시험, 제형화, 판매 및/또는 대중에게 분포하기 위해 디자인된 배치에서 생산되는 생성물의 양을 지칭한다. 예를 들어, 산업적 규모란 혈장 또는 이의 분획으로부터 IgG를 대규모로 정제하여 혈장 단백질 생성물을 생산하는 것을 지칭한다.
'혈장 단백질 생성물'이라는 용어는 혈장 또는 이의 분획의 정제로부터 유래된 혈장 단백질(예를 들어, IgG 또는 알부민과 같은 불순물)을 포함하는 제제, 조성물 및/또는 단백질 생성물을 지칭한다. 전형적으로 혈장 단백질은 혈장 단백질 생성물에서 우세한 단백질이다.
"약제학적 조성물"이라는 용어는 포유류에게 IgG를 전달하기 위해 당업계에서 일반적으로 인정되는 화합물을 갖는 IgG의 제형을 의미하는 것으로 간주된다. 예시적인 화합물은 약제학적으로 허용되는 모든 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다.
"치료한다" 또는 "치료" 또는 "치료하는"이라는 용어는 대상체에서 하나 이상의 증상 또는 병태의 특징이 감소하거나 대상체가 더 이상 임상적으로 상기 병태로 진단되지 않도록 치료학적 유효량의 IgG를 투여하는 것을 의미하는 것으로 간주된다.
용어 “예방하는”, “예방한다” 또는 “예방”은 대상체에서 특정 병태의 발생 또는 재발과 관련된 예방을 제공함을 포함한다. 대상체는 병태에 걸리기 쉽거나 걸릴 위험이 있지만 아직 병태로 진단되지 않았다.
본원에서 사용되는 "이의 진행을 지연하는"이라는 문구는 대상체에서 병태의 진행 및/또는 병태의 적어도 하나의 증상을 줄이거나 서행시킴을 포함한다.
'병태'라는 용어는 IgG 치료가 필요한 대상체의 존재 상태 또는 건강 상태를 의미하는 것으로 간주된다. 예시적인 병태는 원발성 면역결핍 질환(PI), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(CIDP), 및 만성 면역 혈소판감소성 자반증(ITP)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
“대상체”라는 용어는 사람을 포함한 임의의 동물, 예를 들어, 포유류를 의미하는 것으로 간주된다. 예시적인 대상체로는, 이에 제한되지는 않지만, 사람 및 사람이 아닌 영장류를 포함한다. 예를 들어, 상기 대상체는 사람이다.
연속 친화성 크로마토그래피
본원의 개시내용은 연속 친화성 크로마토그래피를 사용하여 혈장 또는 이의 분획으로부터 IgG를 정제하는 방법을 제공한다.
"연속 친화성 크로마토그래피"라는 용어는 동일한 친화성 수지로 팩킹된 하나 이상의 컬럼(들)을 포함하는 크로마토그래피 방법을 의미하는 것으로 간주되고, 각 컬럼은 하나 이상의 구역을 포함한다. 구역은 하나 이상의 크로마토그래피 단계가 수행될 수 있는 수지를 포함하는 컬럼 또는 컬럼의 영역이다. 예를 들어, 구역은 평형화 구역, 결합 구역, 세척 구역, 용출 구역, 스트립핑 구역 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 예에서, 구역은 평형화 구역, 결합 구역, 세척 구역, 용출 구역, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나 초과의 컬럼을 포함하는 연속 친화성 크로마토그래피는 컬럼이 직렬 및/또는 병렬로 작동될 수 있도록 하는 정열로 연결되는 컬럼을 포함한다. 원칙적으로, 다른 컬럼(또는 컬럼의 다른 구역)이 동시에 평형화, 세척, 용출 및/또는 재생을 거치는 동안 첫 번째 및/또는 후속 컬럼에 IgG를 부하할 수 있다. 연속 친화성 크로마토그래피의 예는 당업자에게 자명하고/하거나 본원에 기재되어 있다.
연속 크로마토그래피 방법을 수행하는 데 사용될 수 있는 컬럼의 예는 당업자에게 자명하거나 본원에 기재되어 있다. 예를 들어, 연속 크로마토그래피 방법은 Tricorn 5/100 (Cytiva)을 사용하여 수행될 수 있다. 또 다른 예에서, 연속 크로마토그래피 방법은 BioSMB PD 시스템(Sartorius)을 사용하여 수행할 수 있다.
모의 이동 베드(SMB) 크로마토그래피
하나의 예에서, 연속 친화성 크로마토그래피는 모의 이동 베드 (SMB) 크로마토그래피이다. "모의 이동 베드 크로마토그래피" 또는 "SMB 크로마토그래피"라는 용어는 미국 특허 제2,985,589호에 처음 기재된 크로마토그래피 방법을 지칭한다. SMB 크로마토그래피 셋업 및/또는 장치의 예는 당업자에게 자명하고/하거나 본원에 기재된다. 모의 이동 베드의 개념은 고체 흡수제(예를 들어, 친화성 수지)를 포함하는 여러 개의 작은 컬럼(하나의 큰 컬럼 대신)을 사용하고 하나 이상의 연속 크로마토그래피 단계(예를 들어, 평형화, 결합, 세척, 용출 또는 스트립핑)를 연속 루프에서 다른 컬럼에서 동시에 수행하는 것을 포함한다.
SMB 크로마토그래피 셋업의 예는 섹션 당 하나 이상의 컬럼을 갖는 4개의 섹션으로 정렬된 컬럼을 갖는다. 2개의 입구 스트림(공급물 및 용출물)과 2개의 출구 스트림(추출물 및 라피네이트)이 컬럼 링으로 번갈아 가며 이동한다. 입구와 출구 위치는 액체 흐름 방향으로 일정한 시간 간격으로 전환되어 컬럼의 역류 이동을 모의한다. 공급물(흡착 가능한 성분(추출물)을 포함하는)을 SMB 크로마토그래피 셋업의 하나 이상의 컬럼상에 부하하고 추출물은 컬럼 내에서 수지에 결합한다. 한편, 공급물에 흡착된 성분(라피네이트)은 컬럼을 덜 통과한다. 라피네이트는 하나 이상의 후속 컬럼(들)에 부하하거나 SMB 크로마토그래피 시스템으로부터 폐기물로서 제거할 수 있다. 용출물을 수거하기 위해 용출물을 컬럼상에 부하한다. 예를 들어, 첫 번째 컬럼으로부터 용출물을 수거하면서 하나 이상의 후속 컬럼(들)상에 보다 많은 공급물을 부하한다.
본원 개시내용의 특징을 갖는 적합한 세척 및 용출 완충액은 당업자에게 자명할 것이고/이거나 본원에 기재되어 있다. 하나의 예에서, 세척 완충액은 20mM 인산이수소나트륨, 145mM 염화나트륨을 포함하고 pH는 7.4이다. 하나의 예에서, 세척 완충액은 20mM 인산이수소나트륨, 500mM 염화나트륨을 포함하고 pH는 7.4이다.
SMB 크로마토그래피에서 수지는 사용된 혈장 또는 이의 분획의 배치당 여러 주기(예를 들어, 50 주기)의 수지 평형화, IgG 부하, 결합, 용출, 스트립핑, 살균 및/또는 재생을 거칠 수 있다. 다수의 배치 실행(예를 들어. 4 내지 10개 배치)은 SMB 크로마토그래피를 사용하여 수행될 수 있다. SMB 크로마토그래피에서 수지의 총 수명은 수지를 사용할 수 없게 되기 전에 200 내지 500주기 범위(그 이상은 아닐 경우)일 수 있다. 수지 재생은 일반적으로 수지를 다수의 사용할 수 있도록 수행된다.
주기적 역류 크로마토그래피(PCC)
또 다른 예에서, 연속 친화성 크로마토그래피는 주기적 역류 크로마토그래피(PCC)이다. PCC 셋업 및/또는 장치의 예는 당업자에게 자명하고/하거나 본원에 기재된다. PCC의 개념은 고체 흡수제(예를 들어, 친화성 수지)를 포함하는 여러 컬럼을 사용하고 크로마토그래피 단계를 준연속적인 방식으로 병렬로 수행하는 것을 포함한다. 결합, 세척 및/또는 용출 단계에 사용되는 완충액은 친화성 수지와 역류로 흐른다.
PCC 셋업의 예는 2개의 컬럼의 사용을 포함한다. 첫 번째 단계에서 샘플은 수지의 DBC 위의 첫 번째 컬럼에 부하하여 결합되지 않은 생성물(예를 들어, IgG)이 첫 번째 컬럼을 통과하여 두 번째 컬럼에 포획되도록 한다. 두 번째 단계에서 첫 번째 컬럼은 세척, 용출, 정화되고/되거나 추가 샘플이 부하되는 두 번째 컬럼과 독립적으로 재평형화된다. 세 번째 단계에서 추가의 샘플은 수지의 DBC 위의 두 번째 컬럼에 부하하여 결합되지 않은 생성물이 두 번째 컬럼을 통과하여 첫 번째 컬럼에 포획되도록 한다. 네 번째 단계에서 두 번째 컬럼은 세척, 용출, 정화되고/되거나 추가 샘플이 부하되는 첫 번째 컬럼과 독립적으로 재평형화된다. 공정 단계는 2개의 컬럼 사이에서 지속적으로 반복된다.
PCC 셋업의 또 다른 예는 다수의 컬럼의 사용을 포함한다. 예를 들어, 상기 PCC 셋업의 변형에는 여러 컬럼을 사용하여 큰 컬럼의 사용을 모의하는 결합되지 않은 생성물을 포획하도록 하는 것을 포함할 수 있다.
연속 역류 접선 크로마토그래피(CCTC)
하나의 예에서, 연속 친화성 크로마토그래피는 연속 역류 접선 크로마토그래피(CCTC)이다. CCTC 셋업 및/또는 장치의 예는 당업자에게 자명하고/하거나 본원에 기재된다. CCTC의 개념은 친화성 수지를 슬러리 형태로 사용하는 것을 포함하고, 슬러리는 여러 개의 정적 혼합기와 중공 섬유 막을 통해 지속적으로 지시되고 유체 상과 수지를 분리한다. CCTC는 통상적으로 낮은 압력에서 수행된다.
CCTC 공정의 예는 결합, 1차 세척, 2차 세척, 용출, 스트립핑 및/또는 평형화 단계를 포함한다. CCTC 공정의 또 다른 예는 결합, 1차 세척, 2차 세척, 용출 및/또는 평형화 단계를 포함한다. 예를 들어 CCTC 공정은 스트립핑 단계를 포함하지 않는다. 샘플(예를 들어, 혈장 또는 이의 분획)과 친화성 수지는 결합 단계에서 정적 혼합기와 중공 섬유 막을 통과한다. 불순물은 세척 단계에서 중공 섬유 막의 통류를 통해 제거되는 반면, 수지 결합된 생성물(즉, IgG)은 막에 의해 체류된다. 중공 섬유는 수지를 체류시키고 용출 단계에서 생성물이 통류되도록 한다. 수지를 스트립핑하고하거나 평형화시키고 공정을 반복한다.
연속 역류 나선형 크로마토그래피(CCSC)
하나의 예에서, 연속 친화성 크로마토그래피는 연속 역류 나선형 크로마토그래피(CCSC)이다. CCSC 셋업 및/또는 장치의 예는 당업자에게 자명하고/하거나 본원에 기재된다. CCSC의 개념은 원심분리기 회전 프레임상에 탑재된 컴팩트 회전 코일 분리 컬럼을 사용함을 포함한다. 현재 사용 가능한 2개의 분리 컬럼 디자인이 있다: 나선형 디스크 어셈블리와 나선형 튜브 지지체 어셈블리.
예시적인 CCSC 공정은 원심분리기의 중심 축을 중심으로 회전하는 코일 분리 컬럼을 포함하고 이것은 자체 축을 중심으로 동기 회전(예를 들어, 1,000 내지 1,200rpm)한다. 이동상은 회전 씰(seal) 없이 원심분리기 로터를 통과할 수 있고, 2개의 상이 컬럼 길이를 따라 혼합되는 동안 다량의 고정상이 유지되어 매우 효율적인 용질 분리를 생성한다.
친화성 크로마토그래피 수지
본원 개시내용은 친화성 크로마토그래피 수지를 사용하여 혈장 또는 이의 분획으로부터 면역글로불린 G(IgG)를 정제하는 방법을 제공한다. 본원 개시내용의 친화성 수지는 사람 IgG의 CH3 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함한다.
적합한 친화성 크로마토그래피는 당업자에게 자명할 것이고/이거나 본원에 기재되어 있다. 하나의 예에서, 수지는 낙타 유래된 단일 도메인 [VHH] 항체 단편의 리간드를 포함한다. 당업자는 낙타 유래 단일 도메인 [VHH] 항체 단편을 기반으로 하는 리간드가 모든 서브클래스(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)에 특이적으로 결합할 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 예시적인 수지는 CaptureSelect® FcXP 친화성 크로마토그래피 수지(Thermo Fisher), CaptureSelect® FcXL 친화성 수지 (Thermo Fisher), CaptureSelect® IgG-CH1 친화성 수지 (Thermo Fisher), 및 CaptureSelect® FcXP 아가로스 친화성 수지(Thermo Fisher)이다. 추가의 예시적인 친화성 크로마토그래피 수지는 IgSelect® 친화성 수지 (Cytiva), HiTrap® IgSelect® 친화성 수지 (Cytiva), Pierce® 단백질 G 아가로스 친화성 수지(Thermo Fisher), 및 단백질 G 세파로스 4 신속 유동 친화성 수지 (Cytiva)를 포함한다.
하나의 예에서, 친화성 크로마토그래피 수지는 낙타 유래된 단일 도메인 [VHH] 항체 단편 및 가교 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 매트릭스를 포함한다. 예를 들어, 친화성 크로마토그래피 수지는 POROS® CaptureSelect® FcXP 친화성 수지(Thermo Fisher)이다. 가교 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 매트릭스는 수지가 최대 100bar의 압력을 견딜 수 있게 한다.
하나의 예에서, 친화성 크로마토그래피 수지는 낙타 유래된 단일 도메인 [VHH] 항체 단편 및 아가로스 기반 매트릭스를 포함한다. 예를 들어, 친화성 크로마토그래피 수지는 CaptureSelect FcXP 아가로스 친화성 수지(Thermo Fisher)이다.
하나의 예에서, 연속 친화성 크로마토그래피 공정은 약 2 내지 약 5bar 범위의 압력에서 수행된다. 하나의 예에서, 연속 친화성 크로마토그래피 공정은 약 3 내지 약 4bar 범위의 압력에서 수행된다. 하나의 예에서, 연속 친화성 크로마토그래피 공정은 약 3.25 내지 약 3.5bar 범위의 압력에서 수행된다.
완충액
본원 개시내용은 수지에 대한 효율적인 IgG 결합 및 이로부터의 수거를 가능하게 하는 완충액을 사용하는 연속 친화성 크로마토그래피 방법을 제공한다. 일반적으로, 혈장 또는 이의 분획은 중성 pH이다(약 7.4의 pH). 수지는 평형화 완충액으로 평형화시키고/시키거나 중성 pH를 커버하는 완충 범위를 갖는 세척 완충액으로 세척한다. 적합한 세척 완충액은 25°C에서 6.8 내지 8.5 사이의 해리 상수(pKa)를 갖는 완충제를 포함한다.
평형화 및/또는 세척 완충액의 예시적인 완충제는 인산이수소나트륨이고, 여기서 인산이수소나트륨의 인산 성분은 3개의 해리 상수(pKa: 2.16, 7.21 및 12.32)를 갖는다. 인산은 연속 친화성 크로마토그래피 방법에 사용되는 용출 및/또는 스트립핑 완충액의 약 pH에서 해리 상수를 갖는다. 그러나 인산은 연속 친화성 크로마토그래피 방법에 사용되는 평형화 및/또는 세척 완충액의 pH(보다 높은 pH)와 용출 및/또는 스트립핑 완충액(보다 낮은 pH) 사이에 해리 상수를 갖지 않는다. 이를 통해 세척 및 용출 단계와 스트립핑 및 평형화 단계 사이를 빠르게 전환할 수 있어 피크가 더 명확해지고 크로마토그래피 단계가 짧아진다. 이러한 평형화 및/또는 세척 완충액을 사용하면 더 적은 용적의 완충액을 사용할 수 있어 연속 친화성 크로마토그래피 방법의 효율을 증가시킬 수 있다는 이점이 있다.
평형화 및/또는 세척 완충액의 다른 적합한 완충제는 이미다졸 (pKa: 7.0), Tris (pKa: 8.30), 글리실글라이신 (pKa: 8.40), MOPS (pKa: 7.2), PIPES (pKa: 6.8), TES (pKa: 7.40), 비신 (pKa: 8.35), HEPES (pKa: 7.55), EPPS (pKa:8.00), HEPPSO (pKa: 7.85), MOBS (pKa: 7.60), POPSO (pKa: 7.78), TAPSO (pKa: 7.61), 트리신 (pKa: 8.05), TEA (pKa: 7.76)를 포함한다.
IgG 조성물의 분석
수율, 순도 및 IgG 서브클래스 분포를 결정하는 방법은 당업자에게 자명하거나 본원에 기재되어 있다.
하나의 예에서, 순도는 SDS-PAGE 및 MALDI-TOF-MS 펩타이드 핑거프린트 분석으로 결정한다. 간단히 설명하면, 정제된 IgG, 본원에 기재된 IgG 집적된 제제 또는 IgG 함유 약제학적 조성물을 환원 및 비환원 조건하에서 단백질 크기 마커 및 IgG에 대한 양성 대조군(예를 들어, Privigen)과 함께 적합한 SDS-PAGE 겔(예를 들어, 8-16% TRIS-글라이신)에 부하한다. 단백질은 크기에 따라 분리되고 관심 대상의 단백질 밴드는 단리, 처리 및 MALDI-TOF-MS로 분석한다.
또 다른 예에서, 불순물(예를 들어, IgA) 특이적 항체를 사용하여 효소결합 면역 흡착 검정(ELISA)에서 본원에 기재된 IgG 집적된 제제 또는 IgG 함유 약제학적 조성물 내의 불순물을 측정한다. 예를 들어, ELISA는 상업적으로 가용한 방법을 사용하여 수행한다. 하나의 예에서, IgG의 순도, 수율 및/또는 서브클래스 분포는 비탁분석법에 의해 결정된다. 하나의 예에서, IgG의 순도는 비탁분석법에 의해 결정된다. 하나의 예에서, IgG의 수율은 비탁분석법에 의해 결정된다. 하나의 예에서, IgG의 서브클래스 분포는 비탁분석법에 의해 결정된다. 예를 들어, 본원에 기재된 정제된 IgG, IgG 집적된 제제 또는 IgG 함유 약제학적 조성물의 광 산란 패턴을 비탁분석법으로 측정하고 공지된 IgG 서브클래스 분포를 갖는 조성물의 광 산란 프로필과 비교하였다.
혈장 및 이의 분획의 안정성
본원에 기재된 친화성 수지 상에 부하하기 위한 혈장 또는 이의 분획의 안정성은 혈장 또는 이의 분획의 응고 촉진 활성, 단백질용해 활성 및 입자 크기를 평가함으로써 결정될 수 있다. 응고 촉진 활성, 단백질용해 활성 및 입자 크기를 평가하는 방법은 당업자에게 자명하고/하거나 본원에 기재되어 있다. 간단히 말해, 혈장 또는 이의 분획을 하나 이상의 주기에서 동결/해동하고 2°C 내지 32°C (예를 들어 2°C, 10°C, 18°C, 21°C, 28°C 또는 32°C)에서 24시간 또는 최대 48시간 동안 저장하고 하기에 기재된 방법 중 하나 이상을 사용하여 분석한다. 하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획을 32°C의 온도에서 하나 이상의 주기로 해동하고, 24시간 또는 최대 48시간 동안 저장하고, 하기에 기재된 방법 중 하나 이상을 사용하여 분석한다. 또 다른 예에서, 혈장 또는 이의 분획을 32°C의 온도에서 하나 이상의 주기로 해동하고, 24시간 또는 최대 48시간 동안 저장하고, 하기에 기재된 방법 중 하나 이상을 사용하여 분석하고 이어서 21°C의 온도에서 냉각시키고 저장한다. 하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획은 연속 친화성 크로마토그래피 단계 전에 32°C의 온도에서 및 21°C의 온도에서 해동시킨다.
하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획의 응고 촉진 활성은 시험관내 응고 검정, 예를 들어 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(NaPTT) 검정을 사용하여 측정할 수 있다. NaPTT 검정은 응고 활성화제(예를 들어, 실리카, 카올린, 엘라그산)가 검정에 첨가될 때 하나 이상의 응고 인자(예를 들어, 피브리노겐, 프로트롬빈, 프로아셀레린, 항혈우병 인자, 스튜어트-프로워 인자, 혈장 트롬보플라스틴 전구체 및 헤그만 인자)가 활성화되거나 혈장 또는 이의 분획에서 형성되는 속도를 측정한다.
하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획의 단백질용해 활성은 트롬빈, 일반 세린 프로테아제, 칼리크레인, 플라스민 및 FXa의 활성을 측정하여 평가할 수 있고, 예를 들어, 트롬빈 활성 검정 키트(S-2238), 일반 세린 프로테아제 검정 키트(S-2288), 칼리크레인 활성 검정 키트(S-2302), 플라스민 활성 검정 키트(S-2251) 및 FXa 활성 키트(S-2765)와 같은 상업적으로 가용한 키트를 사용하여 평가할 수 있다.
하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획에 있는 임의의 입자의 크기는 미세 유동 이미지화(MFI)으로 평가하고 다분산 지수를 계산한다. 다분산 지수의 계산은 당업자에게 자명하다.
추가의 정제 단계
연속 크로마토그래피 단계 전이나 후에 추가 정제 단계를 수행할 수 있다. 하나의 예에서, 연속 크로마토그래피 단계 전에 추가 정제 단계를 수행할 수 있다. 하나의 예에서, 연속 크로마토그래피 단계 후에 추가 정제 단계를 수행할 수 있다.
하나의 예에서, 상기 방법은 에탄올 침전, 옥탄산 분획화, 이온 교환 크로마토그래피, 바이러스 비활성화, 바이러스 여과 및 한외 여과/정용여과로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 단계를 추가로 포함한다. 추가의 정제 단계는 당업자에게 자명할 것이고/이거나 본원에 기재되어 있다.
하나의 예에서, 상기 방법은 에탄올 침전을 추가로 포함한다. 예를 들어, 냉각 에탄올은 혈장 또는 이의 분획으로부터 알부민과 α- 및 β-글로불린을 제거하여 IgG를 단리하고 집적시키는 데 사용할 수 있다. 예를 들어, Wo2011/149472에 기재된 바와 같다.
하나의 예에서, 상기 방법은 면역친화성 크로마토그래피를 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 방법은 에슈뮤노(Eshmuno) 항-A 및 항-B 수지를 사용하는 이소아글루티닌 친화성 크로마토그래피를 추가로 포함한다. 예를 들어, 이소아글루티닌 친화성 크로마토그래피는 이소아글루티닌 A와 B를 제거하는 데 사용할 수 있다.
하나의 예에서, 상기 방법은 옥탄산 분획화를 추가로 포함한다. 옥탄산은 혈장 지질 및 혈장 단백질(IgG 이외의)을 제거하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, Wo2011/131787에 기재된 바와 같다.
하나의 예에서, 상기 방법은 이온 교환 크로마토그래피를 추가로 포함한다. 하나의 예에서, 이온 교환 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피이다. 예를 들어, 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 IgA, 잔여 IgM 및 기타 혈장 성분(IgG 이외의)을 제거할 수 있다.
음이온 교환기는 수지 기반 음이온 교환기, 음이온 교환 막 흡착기 또는 음으로 하전된 입자를 포획하기 위한 양으로 하전된 기질을 갖는 임의의 다른 형식의 음이온 교환기일 수 있다. 하나의 예에서, 음이온 교환기는 음이온 교환 막 흡착기이다. 또 다른 예에서, 음이온 교환기는 수지 기반 음이온 교환기이다. 추가의 예에서, 음이온 교환기는 모놀리식 음이온 교환기이다.
하나의 예에서, 상기 방법은 수지 기반 음이온 교환기를 사용한 음이온 교환 크로마토그래피를 추가로 포함한다. 예를 들어, 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 강음이온 교환기이다. 하나의 예에서, 강음이온 교환 수지는 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 매트릭스로 이루어진 매트릭스를 포함한다. 하나의 예에서, 강음이온 교환기는 4급화 폴리에틸렌이민 작용성 그룹을 포함한다. 적합한 수지 기반 음이온 교환은 당업자에게 자명할 것이고 예를 들어, POROSTM HQ 50을 포함한다.
하나의 예에서 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 통류 방식에서 수행된다. 또 다른 예에서 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 결합-및-용출 방식으로 수행된다
하나의 예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 나트륨 시트레이트, 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES) 완충액, 인산이수소나트륨, Bis-Tris, 포스페이트, L-히스티딘 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 완충액을 포함한다. 하나의 예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 MES 완충액을 포함하는 완충액을 포함한다. 또 다른 예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 포스페이트 완충액을 포함한다.
하나의 예에서, 상기 방법은 바이러스 불활성화를 추가로 포함한다. 예를 들어, 용액을 낮은 pH로 조정함에 의해 바이러스 비활성화를 수행할 수 있다. 낮은 pH는 2 내지 4 사이의 pH일 수 있다. 하나의 예에서, 낮은 pH 바이러스 비활성화는 카프릴레이트의 존재하에 수행된다. 또 다른 예에서, 바이러스 비활성화는 혈장 또는 이의 분획, 또는 IgG 집적된 제제 또는 IgG 함유 약제학적 조성물을 n-옥틸-β-D-글루코피라노사이드(OG)와 접촉시킴으로써 OG-IgG 혼합물을 형성함에 의해 수행할 수 있다. 추가의 예에서, 낮은 pH 바이러스 비활성화는 N,N-디메틸미리스틸아민 N-옥사이드 (TDAO)의 존재하에 수행된다.
추가의 예에서, 바이러스 비활성화는 혈장 또는 이의 분획, 또는 IgG 집적된 제제 또는 IgG 함유 약제학적 조성물을 용매-세제 비활성화 단계에 노출시킴으로써 수행될 수 있다. 적합한 용매-세제 처리는 당업자에게 자명하고, 예를 들어 친환경 세제를 포함한다. 본원 개시내용에 사용하기에 적합하고 특히 지질 외피 바이러스를 비활성화하는 데 사용하기에 적합한 예시적인 친환경 세제는 N,N-디메틸미리스틸아민 N-옥사이드(TDAO), 폴리소르베이트 80(PS80), 폴리옥시에틸렌(10) 이소옥틸사이클로헥실 에테르(TRITON® X-100-환원된), 글루코스 및 알코올로부터 제조된 비이온성 계면활성제(예를 들어, SimulsolTM 제형)를 포함한다. 하나의 예에서, 세제는 N,N-디메틸미리스틸아민 N-옥사이드(TDAO)이다. 하나의 예에서, 세제는 폴리소르베이트 80이다. 또 다른 예에서, 세제는 폴리옥시에틸렌(10) 이소옥틸사이클로헥실 에테르(TRITON® X-100-환원된)이다. 추가의 예에서, 세제는 글루코스 및 알코올로부터 제조된 비-이온 계면활성제이다.
하나의 예에서, OG-IgG 혼합물 중의 OG 농도는 25mM 내지 80mM 범위이다. 예를 들어, OG-IgG 혼합물 중의 OG 농도는 25mM 내지 50mM, 또는 50mM 내지 80mM 또는 30mM 내지 60mM의 범위이다. 예를 들어, OG-IgG 혼합물 중의 OG 농도는 25mM, 또는 30mM, 또는 35mM, 또는 40mM, 또는 45mM, 또는 50mM, 또는 55mM, 또는 60mM, 또는 65mM, 또는 70mM, 또는 75mM, 또는 80mM이다.
하나의 예에서, OG-IgG 혼합물 중의 OG 농도는 30mM이다.
하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획 또는 IgG 집적된 제제 또는 IgG 함유 약제학적 조성물을 최대 15분 동안 OG와 접촉시킨다. 예를 들어, 혈장 또는 이의 분획 또는 IgG 집적된 제제 또는 IgG 함유 약제학적 조성물은 최대 0.5분, 또는 1분, 또는 1.5분, 또는 2분, 또는 2.5분, 또는 3분, 또는 3.5분, 또는 4분, 또는 4.5분, 또는 5분, 또는 5.5분, 또는 6분, 또는 6.5분, 또는 7분, 또는 7.5분, 또는 8분, 또는 8.5분, 또는 9분, 또는 9.5분, 또는 10분, 또는 10.5분, 또는 11분, 또는 11.5분, 또는 12분, 또는 12.5분, 또는 13분, 또는 13.5분, 또는 14분, 또는 14.5분, 또는 15분 동안 OG와 접촉시킨다.
하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획 또는 IgG 집적된 제제 또는 IgG 함유 약제학적 조성물은 2°C 내지 28°C 범위의 온도에서 OG와 접촉시킨다. 예를 들어, 혈장 또는 이의 분획 또는 IgG 집적된 제제 또는 IgG 함유 약제학적 조성물은 2°C 내지 8°C, 또는 2°C 내지 28°C, 또는 2°C 내지 25°C, 또는 2°C 내지 20°C, 또는 2°C 내지 18°C, 또는 2°C 내지 15°C 또는 2°C 내지 10°C 범위의 온도에서 OG와 접촉시킨다. 예를 들어, 혈장 또는 이의 분획 또는 IgG 집적된 제제 또는 IgG 함유 약제학적 조성물은 2°C, 또는 3°C, 또는 4°C, 또는 5°C, 또는 6°C, 또는 7°C, 또는 8°C, 또는 9°C, 또는 10°C, 또는 11°C, 또는 12°C, 또는 13°C, 또는 14°C, 15°C, 또는 16°C, 또는 17°C, 또는 18°C, 또는 19°C, 또는 20°C, 또는 21°C, 또는 22°C, 또는 23°C, 또는 24°C, 또는 25°C, 또는 26°C, 또는 27°C 또는 28°C의 온도에서 OG와 접촉시킨다.
하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획 또는 IgG 집적된 제제 또는 IgG 함유 약제학적 조성물은 2°C 의 온도에서 OG와 접촉시킨다.
하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획 또는 IgG 집적된 제제 또는 IgG 함유 약제학적 조성물은 8°C 의 온도에서 OG와 접촉시킨다.
하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획 또는 IgG 집적된 제제 또는 IgG 함유 약제학적 조성물은 10°C 의 온도에서 OG와 접촉시킨다.
하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획 또는 IgG 집적된 제제 또는 IgG 함유 약제학적 조성물은 18°C 의 온도에서 OG와 접촉시킨다.
하나의 예에서, 혈장 또는 이의 분획 또는 IgG 집적된 제제 또는 IgG 함유 약제학적 조성물은 28°C 의 온도에서 OG와 접촉시킨다.
하나의 예에서, 방법은 바이러스 여과를 추가로 포함한다. 예를 들어, 기공 크기가 15~20nm인 바이러스 여과막은 용액 또는 용출물 또는 약제학적 조성물로부터 미생물과 바이러스를 제거하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 나노필터는 Planova S20N (Asahi), Virosart HC (Sartorius) 및 Planova 20N (Asahi)을 포함한다.
하나의 예에서, 상기 방법은 한외여과/정용여과를 추가로 포함한다. 한외여과/정용여과 막의 예는 Pellicon 2 카세트(Millipore) 또는 폴리에테르설폰 또는 하이드로사트 카세트(Sartorius)이다.
약제학적 조성물
본원 개시내용의 정제된 IgG(동의어 활성 성분)는 치료학적 및 예방학적 치료를 위해 정맥 투여 또는 피하 투여와 같은 비경구용 약제학적 조성물로의 제형화를 위해 유용하다.
투여용 조성물은 통상적으로 수성 담체와 같은 약제학적으로 허용되는 담체에 용해된 본원 개시내용의 정제된 IgG 용액을 포함할 것이다. 예를 들어 완충 식염수 등 다양한 수성 담체를 사용할 수 있다. 조성물은 생리학적 조건에 근접하기 위해 요구되는 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들어, pH 조정제 및 완충제, 등장성 조정제 등, 예를 들어 나트륨 아세테이트, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 나트륨 락테이트 등을 포함할 수 있다.
이들 제형에서 본원 개시내용의 정제된 IgG의 농도는 매우 다양할 수 있고, 주로 선택된 특정 투여 방식 및 환자의 필요에 따라 유체 용적, 점도, 체중 등을 기준으로 선택될 것이다. 비히클은 등장성 및 화학적 안정성을 증진시키는 소량의 첨가제, 예를 들어, 완충제 및 방부제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 안정화제로서 프롤린을 포함한다.
본원 개시내용에 따른 적합한 약제학적 조성물은 일반적으로 의도된 용도에 따라 최종 농도 범위를 제공하기 위해 멸균 수용액과 같은 허용되는 약제학적 담체와 혼합된 본원 개시내용의 정제된 IgG의 양을 포함한다. 제조 기술은 일반적으로 문헌(참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed. Mack Publishing Company, 1980)에 의해 예시된 바와 같이 당업계에 공지되어 있다.
예를 들어, 약제학적 조성물의 IgG 농도는 1 내지 5% w/v, 5 내지 15% w/v, 또는 8 내지 12% w/v이다. 예를 들어, 약제학적 조성물의 IgG 농도는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 또는 6%, 또는 7%, 또는 8%, 또는 9%, 또는 10%, 또는 11%, 또는 12%, 또는 13%, 또는 14%, 또는 15% w/v이다. 정맥내 사용을 위해, 1% w/v (즉, 10g IgG/L)가 사용될 수 있다. 정맥내 사용을 위해, 10% w/v (즉, 100g IgG/L)가 사용될 수 있다.
피하 투여를 위해, 보다 높은 농도가 사용될 수 있다. 예를 들어, 15 내지 35% w/v, 또는 20 내지 30% w/v. 하나의 예에서, 약제학적 조성물의 IgG 농도는 16%, 또는 17%, 또는 18%, 또는 19%, 또는 20%, 또는 21%, 또는 22%, 또는 23%, 또는 24%, 또는 25%, 또는 26% w/v이다.
사용 방법
본원에서 논의된 바와 같이, 본원 개시내용은 대상체에서 병태를 치료, 예방 및/또는 진행을 지연시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체에 IgG 또는 약제학적 제제를 투여하는 것을 포함한다.
하나의 예에서, 원발성 면역결핍 질환(PI), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(CIDP), 및 만성 면역 혈소판감소성 자반증(ITP)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
실시예
실시예 1: 친화성 수지
친화성 크로마토그래피 수지 POROS® CaptureSelect® FcXP 친화성 수지 (Thermo Fisher) 및 CaptureSelect® FcXP 아가로스 친화성 수지 (Thermo Fisher)를 사용하여 혈장 또는 이의 분획으로부터 IgG를 포획하기 위해 적합한 수지를 평가하였다. 친화성 크로마토그래피 수지 둘다는 사람 IgG의 CH3 도메인, 구체적으로 낙타 유래된 단일 도메인 [VHH] 항체 단편에 결합할 수 있는 리간드와 가교 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 또는 아가로스의 매트릭스를 포함한다. 친화성 크로마토그래피 수지를 Cytiva의 Tricorn 컬럼(직경 5mm)에 팩킹하고 Akta avant 25 시스템(Cytiva)상에서 크로마토그래피를 수행하였다.
저온-풍부 혈장(CRP) 및 저온 결핍 혈장(CPP) (CSL Behring에 의해 제조된)은 37 °C로 가온시키고 0.22 μm 병-상부 필터에 여과하였다. 친화성 크로마토그래피 수지는 하기 표 1에 기재된 Thermo Fischer에서 제공되는 크로마토그래피 실행 조건과 완충액을 사용하여 평가하였다.
표 1: 사람 CCP 및 CPP로부터 IgG를 정제하기 위한 FcXP 수지를 평가하는 데 사용되는 친화성 크로마토그래피 완충액.
POROS® CaptureSelect® FcXP 친화성 수지를 사용한 CRP 및 CPP로부터 IgG의 정제로 CaptureSelect® FcXP 아가로스 친화성 수지의 사용과 비교하여 보다 높은 수율의 IgG를 회수하고 약간 보다 높은 순도의 용출물을 수득하였다. 이들 초기 결과를 기준으로 연속 친화성 크로마토그래피에 사용하기 위한 POROS® CaptureSelect® FcXP 친화성 수지의 적합성을 추가로 평가하였다.
실시예 2: 완충액 조성물
표 1의 세척 완충액의 단점은 완충제인 시트르산이 3개의 해리 상수(pKa1: 3.13, pKa2: 4.76, pKa3: 6.4)를 갖고 평형화에 필요한 pH 7.4에서 적합하게 완충되지 않는다는 것이다. 추가로 시트르산을 포함하는 완충액(표 1에 제공된 바와 같이)을 사용하여 세척과 용출, 스트립과 평형화 사이의 pH 전환은 크로마토그래피 동안에 비효율적인 pH 변화와 길어진 상을 초래한다.
연속 친화성 크로마토그래피 동안에 pH를 신속하게 조정할 수 있는 적합한 완충액 조성을 결정하기 위해, 표 1 대신 표 2의 크로마토그래피 완충액을 사용한 POROS® CaptureSelect® FcXP 친화성 수지를 사용하여 실시예 1에서 수행한 실험을 반복하였다.
표 2: 사람 CRP 및 CPP로부터 IgG를 정제하기 위한 POROS® CaptureSelect® FcXP 친화성 수지를 평가하는 데 사용되는 친화성 크로마토그래피 완충액.
세척 완충액에 존재하는 인산이수소나트륨은 수지의 평형화에 필요한 7.4의 pH를 커버하는 3개의 해리 상수(pKa1: 2.16, pKa2: 7.21, pKa3: 12.32)를 갖고 있다. 인산이수소나트륨의 완충액 농도를 20mM로 높이면 실험 동안에 완충작용이 불충분함으로 인한 효과를 배제하는 것으로 나타났다. 그러나 인산이수소나트륨의 보다 낮은 농도는 세척 완충액에 사용될 수 있다.
상기 결과는 인산이수소나트륨을 사용하면 용출 및 스트립핑 동안에 낮은 pH와 평형화 및 세척 동안에 높은 pH 사이를 신속하게 전환할 수 있어 연속 친화성 크로마토그래피 실행 시 피크가 더 뚜렷해지고 상이 보다 단축됨을 보여주었다.
pH 7.4와 7.8 사이에서는 IgG의 결합 거동에 차이가 관찰되지 않았고, 상기 범위의 pH를 가진 CRP와 CPP가 pH 조정 없이 수지에 적용될 수 있게 한다.
실시예 3: 베드 높이 및 유속
부하 및 비부하 단계를 줄일 수 있는 조건을 결정하기 위해 크로마토그래피 공정에 사용되는 베드 높이와 유속을 평가하였다. 실시예 2에 기재된 실험은 수지의 베드 높이를 상이하게 하고 혈장 또는 이의 분획의 유속 및 수지에 적용된 용출 완충액을 상이하게 하여 반복되었다.
20cm의 베드 높이는 보다 낮은 베드 높이에 비해 혈장 또는 이의 분획에서 IgG를 정제하는 효율이 훨씬 더 높아, 단축된 비부하 단계를 가능하게 함을 보여주었다. 용출 동안에 유속을 150cm/hr(5분 접촉 시간)로 줄이면 2400cm/h에서 용출할 때와 비교하여 유의적인 효과를 보여주지 않았다. 놀랍게도 혈장 또는 이의 분획이 수지에 적용되는 부하 유속이 2400cm/hr(접촉 시간 0.5분)로 증가되어도 IgG 결합이 크게 감소하지 않는 것으로 밝혀졌다.
광범위한 실험을 통해 결정된 혈장 또는 이의 분획으로부터 IgG를 정제하기 위한 최적화된 조건은 하기 표 3에 요약되어 있다. 선택한 완충액 조성, 수지, 베드 높이 및 유속의 조합은 각 비부하 단계(즉, 평형화, 세척, 용출, 스트립 및 재평형화) 동안 폐기물, 통류물 및 생성물의 양을 감소시켰다.
표3: POROS® CaptureSelect® FcXP 친화성 수지를 사용하여 사람 CRP 및 CPP로부터 IgG를 정제하는 데 최적화된 조건. 직경 5mm 컬럼의 컬럼 베드 높이는 대략 20cm였다. 접촉 시간은 0.5분이었고 이는 최대 2400cm/hr의 유속을 초래하였다.
20cm 베드 높이의 컬럼을 사용하여, 비부하 단계의 조합된 용적은 8.6 CV였고 정화된 CPP의 부하 용적은 4.3 CV였다. 비부하/부하 CV 비율은 2였고, 단 3개의 컬럼으로 SMB 셋업이 가능하였다. 대략 6cm의 컬럼 베드 높이를 사용하여 유사한 결과가 관찰되었다. 대략 6cm 베드 높이의 컬럼에서 수행된 실험에서 비부하 단계의 조합된 용적은 7 CV였고, 정화된 CPP의 부하 용적은 3.8이었다. 비부하/부하 CV 비율은 1.8이었고, 4개의 컬럼이 아닌 단지 3개의 컬럼의 SMB를 설정할 수 있었다. 결과는 베드 높이에 관계없이 비부하 단계의 용적을 줄이면 정제 방법에서 보다 적은 수의 컬럼을 사용할 수 있음을 입증한다.
추가로, IgG는 1.8 CV에서 용출되어 2.4의 농도 인자를 제공한다. 주기 시간(펌프 램프업 및 펌프 세척 제외)은 대략 6.5분이었다.
세척 및 용출 단계의 경우 용출 단계와 스트립 단계를 중복시켜서 추가 농축이 가능하다. 재평형화 동안에 완충액 농도 또는 pH를 증가시키면 필요한 완충액을 추가로 감소시켜 수지 노화로 인해 부하되는 혈장 또는 이의 분획의 양이 감소하는 경우라도 영구적인 비부하/부하 CV 비율이 2 미만이 될 수 있다.
실시예 4: 용출물 프로필
순도
실시예 2와 3의 용출물의 순도를 정성적으로 결정하기 위해 SDS-PAGE 겔 전기영동을 수행하였다. 실시예 2 및 3(FcXP)에 따라 FcXP 수지를 사용하여 정화된 CPP로부터 정제된 IgG 샘플(8μg 및 16μg)을 환원 및 비환원 조건에서 8-16% TRIS-글라이신 SDS-PAGE 겔에서 실행하였다(도 1). 단백질 마커(M) 참조 블루 플러스 2 마커(Invitrogen)도 포함되었다. SDS-PAGE 겔은 쿠마시 염색하였다. SDS-PAGE로 측정한 결과, POROS® CaptureSelect® FcXP 친화성 수지를 사용하여 정화된 CPP로부터의 IgG의 순도는 98.7%였다.
실시예 2와 3의 용출물의 불순물 프로필을 결정하기 위해 MALDI-TOF-MS 펩타이드 질량 핑거프린트를 수행하였다. 가시적 밴드(도 1에서 화살표로 표시)를 단리하여 각 밴드에서 단백질의 정체를 결정하기 위해 MALDI-TOF-MS 펩타이드 질량 핑거프린트를 위해 사용하였다. 불순물은 MALDI-TOF-MS 펩타이드 질량 핑거프린트 (도 1에서 화살표 A-F로 표시)으로 확인되었고 표 4에 요약되어 있다. 나머지 밴드(도 1에서 지정된 문자가 없는 화살표)는 IgG로 확인되었다. FcXP 샘플에서 가장 풍부한 불순물은 IgM, 알부민 및 아포지단백질 A-1이었다(도 1의 화살표 B, C 및 F). 보체 시스템의 나머지 3개의 성분은 경미한 불순물이었다(도 1의 화살표 A, D, E와 표 4의 밴드 A, D, E).
표 4: MALDI-TOF-MS로 확인된 POROS® CaptureSelect FcXP 친화성 수지로부터 용출된 용출물에 존재하는 불순물
SE-HPLC는 용출물 내 IgG의 평균 단량체 및 이량체 함량이 98.1%, 중합체 함량이 0.9%, 단편 함량이 1.0%임을 보여주었다.
용출물 내 불순물의 등전점(pI)을 IgG와 비교하여 결정하기 위해 2D 차이 겔 전기영동(2D DIGE)을 수행하였다. 정화된 CPP로부터 정제된 IgG 샘플(FcXP POROS® 용출액)을 각각 Sci5 및 Sci3 염료와 함께 부하하고 2D-SDS-PAGE에 부하하였다. 등전점에 의한 샘플 분리는 pH 3과 10 사이에서 수행한 다음 환원 조건에서 SDS의 존재하에 크기별로 분리하였다(도 2). IgG는 FcXP POROS® 용출물 샘플에서 pH 7와 9 사이의 등전점을 갖는 것으로 확인되었다(도 2). 용출물에서 IgM과 알부민은 IgG의 등전점보다 낮은 대략 6.5(도 2의 원)의 pH를 갖는 것으로 확인되었다.
결과는 이온 교환 연마 단계를 사용하면 상당한 양의 IgG 손실 없이 용출물로부터 IgM과 알부민의 제거가 가능함을 시사한다.
IgG 서브클래스 분포
IgG의 정제에 사용되는 치환성 수지가 실시예 2 및 3의 용출물에서 IgG의 서브클래스 분포에 영향을 미치는지를 결정하기 위해, 면역비탁법을 수행하였다. POROS® CaptureSelect® FcXP를 사용하여 CRP, CPP, CRP 또는 CPP로부터 정제된 IgG에 대해 IgG 서브클래스 분포를 측정하였다(도 3). 서브클래스 분포는 모든 부류의 합(IgGx/(IgG1+ IgG2+ IgG3+ IgG4)에 상대적으로 IgG 부류의 상대적 부분에 의해 계산하였다.
수율
수율은 면역비탁법을 사용하여 결정하였다. IgG의 적어도 95%는 실시예 2 및 3의 혈장으로부터의 용출물에서 회수하였고 이는 96% 정도로 높았다.
실시예 5: 정제 사이클링
정제 사이클링이 POROS® CaptureSelect® FcXP 친화성 수지에 미치는 영향을 결정하기 위해 여러 정제 주기를 연속적으로 수행하고 수지의 결합 능력을 결정하였다. 여러 정제 주기 동안 다양한 시점에서 순수 IgG의 돌파 거동을 결정하고 이를 사용하여 수지의 나머지 결합 능력을 계산하였다. 결합 능력 손실은 수지의 노화로 인한 것일 수 있다.
각 단계에 대해 0.5분 동안 혈장이 수지와 접촉할 수 있도록 수지(베드 높이 6cm 또는 20cm)에 CRP 또는 CPP를 적용하고 시간 경과에 따른 수지의 결합 능력을 결정하였다. 도 4는 베드 높이가 6cm인 수지와 20cm인 수지로 수행한 SMB 크로마토그래피간에 수지 노화에 차이가 없음을 보여준다. 결합 능력의 감소는 100회 실행당 <5%의 평균 기울기로 선형 추세를 보여주었고, 100회 실행 후에도 수지 노화가 단지 작음을 입증한다. 결과는 실시예 2 및 3에 기재된 조건하에서 POROS® CaptureSelect FcXP® 친화성 수지가 SMB 크로마토그래피 셋업에 사용하기에 적합하다는 것을 입증한다.
실시예 6: 혈장 및 이의 분획의 안정성
본원에 기재된 방법에서 사용하기 위한 CRP 및 CPP의 안정성을 평가하였다. CRP와 CPP는 최대 2회까지 동결 해동시키거나 0.22μm 필터를 사용하여 여과하였다. 가공된 CRP와 CPP를 10°C, 18°C 또는 28°C에서 24시간 또는 48시간 동안 저장하였다. 샘플의 IgG 함량과 IgG 서브클래스 분포는 면역비탁법으로 결정하였다. 표 5와 6의 결과는 CRP와 CPP의 IgG 함량과 IgG 서브클래스 분포기 여과, 온도, 시간 및 동결/해동에 영향을 받지 않음을 보여준다.
표 5: 여과 유무, 동결/해동 및 설정된 시간 및 온도에서 저장한 CRP의 IgG 함량.
표 6: 여과 유무, 동결/해동 및 설정된 시간 및 온도에서 저장한 CPP의 IgG 함량.
혈장 및 CPP에서 단백질의 응고를 결정하기 위해 비활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(NaPTT) 검정을 사용하여 응고 촉진 활성을 결정하였다. 응고 시간은 NaPTT 검정에서 > 150s으로 설정하였다. 28°C에서 24시간 또는 48시간 동안 혈장 및 CPP에서 응고 촉진 활성을 관찰하였다(도 5). 여과되거나, 동결/해동되거나 10°C 또는 18°C의 온도에서 혈장 및 CPP에서 24시간 또는 48시간 동안 어떠한 응고 촉진 활성이 관찰되지 않았다.
혈장 및 CPP에서 단백질용해 활성을 결정하기 위해 발색 기질 검정을 사용하여 트롬빈, 일반 세린 프로테아제, 칼리크레인, 플라스민 및 FXa의 활성을 결정하였다(트롬빈: S-2238; 일반 세린 프로테아제: S-2288; 칼리크레인: S-2302; 플라스민: S-2251; 및 FXa: S-2765). 28°C에서 24시간 또는 48시간 동안 혈장 및 CPP에서 단백질용해 활성을 관찰하였다(도 6). 여과되거나, 동결/해동되거나 10°C 또는 18°C의 온도에서 혈장 및 CPP에서 24시간 또는 48시간 동안 어떠한 단백질용해 활성이 관찰되지 않았다.
또한 미세유동 이미지화(MFI)와 동적 광 산란(DLS)으로 결정한 샘플 내 입자 크기의 변화를 결정하여 CRP 및 CPP의 안정성을 평가하고 샘플의 다분산 지수도 계산하였다. 표 8과 9는 샘플이 광범위하게 다분산(>0.4)되어 있음을 보여준다. 표 7과 8은 10°C와 18°C에서 4시간 또는 24시간 동안 샘플의 다분산 지수에 차이가 없었지만 48시간에는 명백하게 증가했음을 보여준다. 혈장의 성향 지수는 온도와 시간에 따라 큰 차이가 없었고, 이는 혈장 샘플이 CPP에 비해 시간과 온도에 따라 보다 안정적이라는 것을 시사한다.
표 7: 여과 유무 및 설정된 시간과 온도에서 저장된 CPP의 입자 분석.
표 7: 여과 유무 및 설정된 시간과 온도에서 저장된 CPP의 입자 분석.
결과는 보다 높은 온도에서 및 보다 오랜 기간 저장할 경우 CRP와 CPP 내에서 입자 형성이 일어남을 보여준다. 혈장 또는 이의 분획을 저장하기에 적합한 온도는 10°C 내지 18°C 사이로 최대 48시간 동안 있을 수 있다.
실시예 7: n-옥틸-β-D-글루코피라노시드를 사용한 바이러스 비활성화의 평가
N-옥틸-β-D-글루코피라노시드(OG)는 IgG 정제 전에 CRP에서 바이러스 감소 능력을 결정하기 위해 평가하였다. 해동 및 균질화된 CRP(50mg/ml)와 EMEM 배지 (대조군)는 1:20 희석에서 수포성 구내염 바이러스(VSV)로 스파이킹하였다. OG를 첨가하기 전에 VSV 스파이킹된 CRP 및 VSV 스파이킹된 EMEM 배지의 분취액을 수거하였다. 혼합물 중의 최종 OG 농도가 30mM가 되도록 VSV 스파이킹된 CRP 및 VSV 스파이킹된 EMEM 배지에 OG를 첨가하고 대략 10초 동안 피펫팅하여 혼합하였다. 혼합물을 VSV 스파이킹된 EDEM 배지 및 OG가 없는 VSV로 오염된 혈장과 함께 5°C에서 항온처리하였다. 항온처리된 샘플은 15분, 30분, 60분 시점에 수거하였다. 샘플을 배지에 10배 희석하여 OG의 활성을 중화시켰다.
표준 96웰 마이크로플레이트(Nunc, 평저 웰)에 있는 아프리카 녹색 원숭이 콩팥 세포(Vero-PH)의 사전 배양 현탁액 150μL상에 OG 처리된 VSV 스파이킹된 CRP, OG 처리된 VSV 스파이킹된 EDEM 배지, VSV 스파킹된 CRP, VSV 스파이킹된 EDEM 배지 및 대조군 100μL의 분취액(10-6 희석으로 10배 직렬 희석)을 적정하였다. 사용된 음성 대조군은 CRP 및 EDEM 배지였다. 사용된 양성 대조군은 스파이킹을 위해사용된 VSV 스톡과 VSV 바이러스 스톡 특징 분석의 이전 결과를 바탕으로 성취된 허용되는 VSV 역가를 가진 대조군 바이러스 스톡이었다.
플레이트를 37°C, 3-5% CO2에서 항온처리하고 7일 동안 현미경을 사용하여 바이러스 특이적 세포병원성 효과(CPE)에 대해 조사하였다. 음성 대조군으로 적정된 세포 배양물은 CPE가 없어야 한다.
감염 역가는 스피어만-카버 방법에 따라 계산하여 log10 CCID50/mL(mL당 50% 세포 배양 감염 용량)로 나타냈다. 예를 들어, 1:10 희석으로 시작하는 미세적정으로 감염성 바이러스가 검출되지 않은 경우 바이러스 역가는 <1.5 log10 CCID50/mL로 나타낸다. 검출 한계를 저하시키기 위해 1:10으로 희석한 후 처리된 Vero-PH 세포 1mL를 4개의 T25 플라스크에 접종하였다. 4개의 T25 배양에서 모두 감염성 바이러스 음성이 유지되면, 수득한 감염 역가는 <0.5 log10 CCID50/mL로 기록한다.
5°C에서 항온처리된 OG 처리된 VSV 스파이킹된 CRP에서 최종 OG 농도가 30mM인 경우 VSV의 강력한 감소가 관찰되었다. 이들 조건(즉, 5°C에서 OG의 최종 농도 30mM)에서의 로그10 감소 인자(LRF)는 ≥5.3 이었다(도 7). LRF는 사전 처리된 출발 물질(예를 들어, CRP)의 바이러스 부하량과 처리 후 최종 물질(예를 들어, OG 처리된 CRP)의 바이러스 부하량의 비율이고, 처리 전후의 샘플 부피와 바이러스 역가 둘다를 고려한다.
실시예 8: 혈장 해동의 최적화
혈장 해동을 위한 최적의 온도를 평가하기 위해 동결 침전물이 관찰되는 온도를 결정하였다. 간단히 말해서, 저온 풍부 혈장(CRP)을 15°C에서 38°C로 해동한 후 점진적으로 가열하고 20°C, 25°C, 28°C, 30°C, 32°C 및 37°C에서 CRP의 분획을 원심분리하고 온도 의존성 펠릿의 무게를 측정하였다. ~30oC에서, 단지 비특이적 응집물이 존재하였고 어떠한 동결 침전물이 존재하지 않았다.
최적의 온도를 결정하기 위해 각 펠릿에서 동결 침전물의 주요 성분 중 하나인 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 활성을 결정하였다. 도 8a와 표 8에 나타낸 바와 같이, 32°C에서 해동하면 상등액에서 강력한 펠릿 형성과 vWF의 활성을 초래한다.
표 8: 상이한 온도에서 CRP 펠릿의 vWF 활성 검정
32°C에서 혈장 해동을 추가로 확인하기 위해 도 8b에 표시된 대로 유지 시간 연구를 수행하고 수득한 용출물에 대해 NaPTT 검정을 사용하여 단백질용해 활성을 결정하였다.
표 9에 나타낸 바와 같이, 용출물을 32°C에서 여과했을 때 최대 48시간까지 단백질용해 활성이 관찰되지 않았다.
표 9: 32°C와 14°C에서 CRP 해동 후 단백질용해 활성
동적 광 산란을 사용하여 샘플의 미립자 수준도 분석하였다. 모든 샘플에서 다분산 지수(PDI)가 PDI<0.6인 샘플 간에는 차이가 관찰되지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
탁도는 또한 시간 경과에 따라 평가되었고 48시간 후 모든 온도(즉, 14oC, 21oC 및 32oC)에서 가시적 분해가 관찰되었다. 24시간에 14oC에서는 어떠한 가시적 분해가 관찰되지 않았지만, 이에 비해 32oC에서는 대부분 가시적 분해가 관찰되었다. 32°C에서 유지된 혈장의 경우 크로마토그래피 동안에 주기 당 명백한 압력 증가가 14°C에 비해 48시간에서 뚜렷하게 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음).
가시적 분해에도 불구하고 IgG 함량에 미치는 영향은 관찰되지 않았다. 특히 샘플을 해동하여 더 높은 온도에서 저장했을 때 시간 경과에 따라 IgG 함량이 감소하지 않았다.
실시예 9: 연속 친화성 크로마토그래피 방법의 최적화
스트립 단계의 제거
SMB 공정 동안, 스트립 단계에서 가혹한 조건(즉, pH2.5)으로 인해 컬럼에 축적된 단백질이 변성되어 단일 컬럼의 역압이 증가하는 것이 관찰되었다. 따라서 스트립 단계를 제거하면 역압 증가가 감소하는지를 조사하기 위해 스트립 단계 없이 SMB 공정을 실행하였다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 스트립 단계를 제거한 결과 SMB 공정 중 역압 증가가 감소하고 압력이 안정화되었다.
세척 단계의 전도도 증가
세척 단계의 전도도를 스크리닝하여 용출물 중의 프로테아제 활성을 감소시킬 수 있는지를 조사하였다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 세척 완충액의 염화나트륨 농도를 145mM에서 500mM로 높이면 용출물의 프로테아제 활성을 검출 한계 이하로 검출하였다. 세척 완충액의 전도도를 높이면 추가 단백질(예를 들어, 보체 시스템 성분)의 용출이 증가했지만 전도도가 높은 세척 완충액에서는 IgG 수율 및/또는 전체 생성물 순도에 미치는 효과는 관찰되지 않았다(도 11). 순도 수준은 Labchip 검정 및 비탁법에 의해 상업적으로 가용한 Privigen과 유사하였다(도 11b 및 11c).
실시예 10: 음이온 교환 연마 단계
연마 단계로서 POROSTM-HQ 50 음이온 교환 수지의 사용을 평가하였다. 수지는 통류 방식으로 작동하였다.
처음에는 수지는 불순물 고갈에 미치는 영향을 확인하기 위해 MES와 포스페이트 완충액을 사용하여 수지를 스크리닝하였다.
FcXP 용출물을 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 부하하기 전에 10mM MES 또는 포스페이트 완충액 pH 6.0, 0mM NaCl에서 UF/DF에 적용하였다. 통류물과 후 세척물을 별도로 수거하고 분석하였다.
표 10에 나타낸 바와 같이, MES 완충액과 포스페이트 완충액은 허용되는 IgG 수율과 허용되는 불순물 고갈을 초래하였다.
pH 6.0(낮은 전도도)의 포스페이트 완충액은 불순물 고갈의 개발 표적 측면에서 최상의 결과를 수득하였다.
표 10: 완충액 스크리닝
실시예 11: 음이온 교환 연마 단계 평형화 및 부하 완충액 최적화 연구 및 실험 설계(DoE) 연구
완충액 평형화 연구
평가된 완충액 및 조건:
상기 실시예 10에 따라 샘플을 부하하였다. 간략하게, FcXP 용출물을 재완충시키고 PorosTM HQ50 상으로 부하하였다. 통류물과 후 세척물을 별도로 수거하고 분석하였다.
시트레이트 완충액은 NaCl과 pH 둘다의 광범위한 범위에서 IgA를 잘 고갈시켰다. 허용되는 IgA 고갈은 낮은 염에서 포스페이트에서 달성되었다.
포스페이트 완충액은 NaCl과 pH 둘다의 광범위한 범위에서 IgM을 잘 고갈시켰다.
Bis-Tris 및 히스티딘은 NaCl과 pH 둘다의 광범위한 범위에서 알부민을 잘잘 고갈시켰다. 낮은 염에서 포스페이트 내 양호한 알부민 고갈.
실험 포스페이트 완충액의 디자인
하기의 조건을 평가하였다:
x: 0-40 mM
y: pH 5.8-6.6
평형화 및 부하를 위한 예비 권장 사항은 0mM NaCl 및 pH 6.2를 포함하고, 파일럿 스케일 실행의 부하 물질은 순도 ~93.5%를 갖고, 불순물 농도는 40.4-71.6 mg/g IgG이다. BioSMB 실행에서 부하 물질의 순도는 ~97%이었고, 불순물/IgG 농도는 12.0~20.4mg/g IgG이었고, 농도는 5~15g/L IgG로 최상의 불순물 고갈을 위해 사용하였다. 수지의 부하량은 mL 수지 당 25 - 42 mg 불순물이었다.
후 세척 조건을 위한 예비 권장 사항은 0 mM NaCl 및 pH 6.0을 포함한다.
실시예 12: 음이온 교환 연마 단계
MES와 포스페이트 완충액은 POROSTM HQ 50 음이온 교환 연마 단계에서 불순물 고갈에 미치는 영향을 추가로 스크리닝하였다. 상기 공정은 상기 실시예 10에 기재된 바와 같이 MES 완충액 pH 6.0과 20mM 또는 50mM NaCl, MES 완충액 pH 6.6과 25mM 또는 50mM NaCl, 포스페이트 완충액 pH 6.2와 0mM NaCl을 사용하여 수행하였다.
MES 완충액과 포스페이트 완충액은 허용되는 IgG 수율과 통류물(후 세척 없이)에서 허용되는 불순물 고갈을 초래하였다.
실시예 13: SMB FcXP 크로마토그래피 단계의 스케일업
내경 1cm 컬럼의 SMB 방식에서 4-컬럼 셋업은 하기의 조건을 사용하여 수지 스트립 단계 및 대안적 세척 단계 없이 수행하였다:
완충액 1: 20 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl, pH 7.4;
완충액 2: 20 mM 아세트산, pH 4.0
각 배치 후 모든 컬럼을 20% EtOH와 20mM NaOH를 사용하여 재생하고 다음 배치를 처리하는 데 사용하였다.
FcXP 용출물 중의 IgG 수율은 98.3-99.1%이었고, 모든 분획에서 총 IgG 회수율은 99.4-100.3%이었다. Labchip에 의해 FcXP 용출물의 순도를 평가한 결과, 생성물 순도는 96.4-96.9%로 나타났다.
정제 공정을 통해 9.55~10.4g/L의 IgG를 수득하였다.
FcXP 용출물 중의 불순물은 IgM(47.85-51.90 mg/L; 4.8-5.3 mg/gm IgG), IgA(68.8-76.55 mg/L; 7-8 mg/gm IgG) 및 알부민(55.3-78.05 mg/L; 5.8-7.6 mg/gm IgG)을 포함하여 결정하였다.
실시예 14: 저온 풍부 혈장을 사용하여 스케일 업 공정 실행
30명의 공여자로부터 풀링된 저온 풍부 혈장을 해동하고 1.2μm 및 0.45μm+0.2μm 필터로 연속적으로 정화하여 다운스트림 공정에 사용하였다.
해동되고 여과된 혈장을 다음 공정에 따라 정제 및 가공하였다:
1. FcXP SMB 크로마토그래피
2. UF/DF를 통한 농축 및 완충액 교환
3. pH 전환 및 여과
4. 음이온 교환 크로마토그래피 (POROSTM-HQ50을 사용하여)
5. 이소아글루티닌 친화성 크로마토그래피
6. 바이러스 비활성화
7. UF/DF
8. 100 g/L IgG로의 제형화
1~6단계의 IgG 회수율은 83~96%, 총 공정 회수율은 81~94% 사이에서 3번의 개별 실행이 수행되었다.
정제 공정을 통해 최종 제형화된 벌크 생성물 중의 IgG 서브클래스 분포는 67-69% IgG1, 24-27% IgG2, 3-4% IgG3, 2-3% IgG4로 나타났다.
이소아글루티닌 크로마토그래피 후 생성물의 순도는 또한 Labchip에서 평가하였고, 생성물 순도는 97-98.5%로 나타났다.
통류 및 세척 후 POROS 50HQ는 IgM(<1.86 - <2.55μg/gm IgG), IgA(0.109-0.111 mg/gm IgG), 알부민(0.59-0.74 mg/gm IgG)을 포함한 불순물에 대해 평가하였다. 수율은 또한 93-97%로서 결정하였다.
또한 제형화된 벌크 생성물은 IgM(< 0.17 mg/L; < 1.74-<1.86 μg/gm IgG), IgA(8.46-8.76 mg/L; 0.089-0.093 mg/gm IgG) 및 알부민(62.75-67.60 mg/L; 0.64-0.74 mg/gm IgG)을 포함한 불순물에 대해 평가하였다. FcXP 리간드는 <10 ppm (검출 한계치 미만)이었다.
이소아글루티닌 고갈은 또한 FcXP SMB 크로마토그래피 (Iso-A 역가 1:16; Iso-B 역가r 1:32) 후, POROS HQ50 크로마토그래피(Iso-A 역가 1:4; Iso-B 역가 1:8) 후, 및 이소아글루티닌 크로마토그래피 (Iso-A 역가 1:0; Iso-B 역가 1:0) 후 평가하였다.
서열
Claims (62)
- 연속 친화성 크로마토그래피를 사용하여 혈장 또는 이의 분획으로부터 면역글로불린 G(IgG)를 정제하는 방법으로서, 상기 방법이 사람 IgG의 CH3 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 친화성 크로마토그래피 수지에 IgG를 결합시키고, IgG를 수거하는 것을 포함하는, 방법.
- 연속 친화성 크로마토그래피를 사용하여 혈장 또는 이의 분획으로부터 면역글로불린 IgG(IgG) 집적된(enriched) 제제를 제조하는 방법으로서, 상기 방법이 사람 IgG의 CH3 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 친화성 크로마토그래피 수지에 IgG를 결합시키고, IgG를 수거하는 것을 포함하는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리간드가 낙타 유래된 단일 도메인[VHH] 항체 단편을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수지가 가교 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 매트릭스와 아가로스 기반 매트릭스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 매트릭스를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드가 가교 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 매트릭스와 접합된 VHH 항체 단편을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 25°C에서 5 내지 10의 pH 및 6.8 내지 8.5의 해리 상수 (pKa)를 갖는 세척 완충액으로 수지를 세척하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 3 내지 5의 pH를 갖는 용출 완충액을 사용하여 수지로부터 결합된 IgG를 용출시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈장 또는 이의 분획을 0.1 내지 5분동안 수지와 접촉시키는, 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈장 분획이 저온 풍부 혈장, 저온 결핍 혈장, 상등액 I(SNⅠ), Cohn 분획 II(Fr II), Cohn 분획 II+III(Fr II+III), Cohn 분획 I+II+III(FrI+II+III), Kistler/Nitschmann 침전물 A(KN A), Kistler/Nitschmann 침전물 B(KN B), 상등액 B의 Kistler/Nitschmann 침전물(KN B+1), 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈장 또는 이의 분획이 적어도 32oC의 온도에서 해동되는, 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈장 또는 이의 분획이 연속 친화성 크로마토그래피 전에 2°C 내지 28°C 범위의 온도에 있는, 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 혈장 또는 이의 분획이 연속 친화성 크로마토그래피 전에 21°C의 온도에 있는, 방법.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 혈장 또는 이의 분획이 최대 48시간동안 상기 온도에 있는, 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세척 완충액이 인산이수소나트륨, 이미다졸, Tris, 글리실글라이신, 3-모르폴리노프로판-1-설폰산(MOPS), 피페라진-N,N′-비스(2-에탄설폰산)(PIPES), 2-[(2-하이드록시-1,1-비스(하이드록시메틸)에틸)아미노]에탄설폰산(TES), 비스[(2-하이드록시에틸)아미노]아세트산(비신), 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES), 황산, 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진프로판설폰산(EPPS), N-(하이드록시에틸)피페라진-N'-2-하이드록시프로판설폰산(HEPPSO), 4-(N-모르폴리노)부탄설폰산(MOBS), 피페라진-N,N′-비스(2-하이드록시프로판설폰산)(POPSO), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-3-아미노-2-하이드록시프로판설폰산(TAPSO), 트리신, 트리에탄올아민(TEA) 및 이들의 조합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 완충제를 포함하는, 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 완충제가 5 mM 내지 200 mM의 농도로 있는, 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세척 완충액이 최대 1000mM 농도의 염화나트륨 및/또는 2가 염을 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세척 완충액이 20mM 인산이수소나트륨, 500mM 염화나트륨을 포함하고 pH가 7.4인, 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용출 완충액이 3 내지 5의 pH의 포스페이트 완충액 및/또는 아세테이트 완충액이거나 이를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용출 완충액이 최대 5분동안 수지와 접촉시키는, 방법.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 7 내지 8의 pH를 갖는 평형화 완충액을 사용하여 수지를 평형화시킴을 추가로 포함하는, 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 평형화 완충액이 20mM 인산이수소나트륨, 500mM 염화나트륨을 포함하고 pH가 7.4인, 방법.
- 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 수지가 i) 수지를 스트립핑한 후 또는 ii) 수지를 스트립핑하지 않고 평형화되는, 방법.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 7 내지 8의 pH를 갖는 평형화 완충액을 사용하여 수지를 스트립핑한 후 수지를 평형화시킴을 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연속 친화성 크로마토그래피가 모의(simulated) 이동 베드(SMB) 크로마토그래피, 주기적 역류 크로마토그래피(PCC), 연속 역류 접선 크로마토그래피(CCTC) 및 연속 역류 나선형 크로마토그래피(CCSC)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수지가 슬러리 형태로 있거나 상기 수지가 하나 이상의 컬럼(들)에 팩킹되고, 각각의 컬럼이 하나 이상의 구역을 포함하는, 방법.
- 제25항에 있어서, 구역이 평형화 구역, 결합 구역, 세척 구역, 용출 구역, 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
- 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 컬럼이 입구 및 출구 밸브를 포함하는 유체 도관에 의해 유동적으로 연결되고 분리되는, 방법.
- 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수지가 일련의 3개의 컬럼에 팩킹되고, 각각의 컬럼이 분리 구역인, 방법.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수지가 제1 컬럼과 하나 이상의 후속 컬럼(들)에 팩킹되는, 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 제1 컬럼에 수지의 동적 결합 용량(DBC) 이상의 농도로 IgG가 부하되는, 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 수지의 DBC가 수지 mL당 적어도 5mg IgG인, 방법.
- 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 후속 컬럼(들)에는 수지의 최대 DBC의 농도로 IgG가 부하되는, 방법.
- 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 후속 컬럼(들)에는 수지의 mL 당 최대 40 mg IgG 농도로 IgG가 부하되는, 방법.
- 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수지가 2 cm 내지 30 cm의 총 베드 높이를 갖는, 방법.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 수지를 재생시킴을 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 수지를 살균시킴을 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 에탄올 침전, 옥탄산 분획화, 이온 교환 크로마토그래피, 바이러스 비활성화, 바이러스 여과 및 한외여과/정용여과로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피 단계가 통류 모드에서 작동하는 강음이온 교환 수지를 사용하는 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하는, 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 강음이온 교환 수지가 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 매트릭스로 이루어진 매트릭스를 포함하는, 방법.
- 제38항 또는 제39항에 있어서, 상기 강음이온 교환 수지가 4급화된 폴리에틸렌이민 기능성 그룹을 포함하는, 방법.
- 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 단계가 포스페이트 완충액, 나트륨 시트레이트 완충액, 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 완충액, 아세트산 완충액, Bis-tris 완충액 및 L-히스티딘 완충액으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 부하 후 세척 완충액을 포함하는, 방법.
- 제41항에 있어서, 상기 부하 후 세척 완충액이 5.8 내지 6.6 범위의 pH의 포스페이트 완충액을 포함하는, 방법.
- 제41항 또는 제42항에 있어서, 상기 부하 후 세척 완충액이 0 mM 내지 50 mM의 농도로 염화나트륨을 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IgG의 적어도 75%가 혈장 또는 이의 분획으로부터 회수되는, 방법.
- 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용출된 IgG가 적어도 95%의 순도를 갖는, 방법.
- 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 IgG를 약제학적 조성물로 제형화함을 추가로 포함하는, 방법.
- 모의 이동 베드 (SBM) 크로마토그래피를 사용하여 혈장 또는 이의 분획으로부터 면역글로불린 G(IgG)를 정제하기 위한 방법으로서, 상기 방법이:
a) 가교 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 매트릭스와 사람 IgG의 CH3 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함하는 친화성 크로마토그래피 수지를 7 내지 8의 pH를 갖는 20mM 포스페이트 평형화 완충액으로 평형화시키는 단계;
b) 혈장 또는 이의 분획으로부터의 IgG를 수지에 결합시키는 단계;
c) 7 내지 8의 pH를 갖는 20mM 포스페이트 세척 완충액으로 수지를 세척하는 단계; 및
d) 3 내지 5의 pH를 갖는 20mM 아세테이트 또는 포스페이트 용출 완충액으로 결합된 IgG를 용출시키는 단계를 포함하고;
여기서, 상기 친화성 크로마토그래피 수지에 대해 단계 a) 내지 d)가 반복될 수 있고, 여기서, 상기 친화성 크로마토그래피 수지는 입구 및 출구 밸브를 포함하는 유체 도관에 의해 분리된 일련의 2개 이상의 유동적으로 연결된 컬럼에 팩킹되고, 임의로 상기 방법은 수지를 스트립핑하는 것을 포함하지 않는, 방법. - 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항의 방법에 의해 정제되거나 생성되는 IgG를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제48항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 100 mg/mL의 총 사람 혈장 단백질을 포함하는, 약제학적 조성물.
- 제48항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 20 g/100 mL의 총 사람 혈장 단백질을 포함하는, 약제학적 조성물.
- 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 적어도 98% 순도의 면역글로불린 G(IgG)를 포함하는, 약제학적 조성물.
- 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 320mOsm/kg의 공칭 삼투압을 포함하는, 약제학적 조성물.
- 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 4.6 내지 5.0의 pH를 포함하는, 약제학적 조성물.
- 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 4.8의 pH를 포함하는, 약제학적 조성물.
- 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 250 mmol/L의 L-프롤린을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
- 제48항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 ≤1 mmol/L의 나트륨 함량을 포함하는, 약제학적 조성물.
- 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 ≤ 0.05 mg/mL의 IgA 함량을 포함하는, 약제학적 조성물.
- 제48항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 ≤ 35 IU/mL의 프레칼리크레인 활성화제(PKA) 수준을 포함하는, 약제학적 조성물.
- 대상체에서 병태를 치료하고, 예방하고/하거나 이의 진행을 지연시키기 위한 약물의 제조에 있어서 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항의 방법에 의해 정제되거나 생성된 IgG의 용도.
- 제48항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 병태를 치료하고, 예방하고/하거나 이의 진행을 지연시키는 데 사용하기 위한 약제학적 조성물.
- 대상체에서 병태를 치료하고, 예방하고/하거나 이의 진행을 지연시키는 방법으로서, 상기 방법이 제48항 내지 제58항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
- 제59항, 제60항 또는 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 병태가 원발성 면역결핍 질환(PI), 만성 염증 탈수초 다발 신경병증(CIDP), 및 만성 면역 혈소판 감소성 자반증(ITP)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 용도, 약제학적 조성물 또는 방법.
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