CN1072419A

CN1072419A - 径向色谱柱用离子交换介质的合成

Info

Publication number: CN1072419A
Application number: CN 91110952
Authority: CN
Inventors: 李彤; 张青; 张玉奎; 吴丽华; 孙爱民
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 1991-11-20
Filing date: 1991-11-20
Publication date: 1993-05-26

Abstract

一种径向色谱柱用DEAE、QAE及SP型离子交换介质的合成方法是采用以甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯进行自聚反应得到聚合物，再与纤维素进行接枝反应，最后以二乙胺、三乙胺和亚硫酸钠作开环反应物进行开环反应过程。该合成反应条件简单，易于控制，交换容量大，应用这些介质填充的径向色谱柱对人血浆、牛血清、人血白蛋白等生物大分子进行分离纯化处理，具有处理大、速度快，便于线性放大等优点。

Description

本发明涉及一种高分子有机聚合物的合成方法，具体地说是提供一种用作径向色谱柱填料的以短纤维与甲基丙烯酸环氧丙酯进行共聚接枝，再经开环反应制得DEAE、QAE及SP型混合凝胶离子交换介质的方法。

随着生物工程的日益发展，特别是对生物大分子的分离与纯化传统的色谱技术已远不能适应当今发展的需要，在80年代中期推出了径向色谱柱的新技术。它克服了传统色谱技术在大规模处理时不便放大、色谱填料易造成生物样品失活等缺点，采用了全新的概念一径向流动技术，它是膜分离技术与色谱分离原理的结合，可以在较小床层高度时获得较大处理容量，而且还可以达到较大流速，其最大优点还在当保持柱径不变，而只增加柱长时，可按比例增加样品处理量，即线性放大。因此径向色谱新技术是一种较理想的生物工程大规模初级分离纯化的工具。在径向色谱技术中除了在结构上作了某些革命性的改进以外，所用的填料介质也必须作相应的改进和发展，特别是适用于生物大分子分离纯化的色谱填料。其中一种分离蛋白质以及其它不稳定的生物活性物质的色谱介质是纤维素离子交换介质。纤维素的非特异性吸附较小，有合适的孔径结构，它通过酯化、醚化、氧化等方法，把交换基团引入纤维素骨架上而制备成纤维素离子交换介质。但这几种方法只能在不破坏纤维素结构的情况下得到很有限的交换容量，使得相应柱子的柱容量很小，给这类介质在径向色谱柱中应用带来困难。此外，又发展一种新的离子交换交联多糖凝胶作介质。它是一种葡聚糖改性物，交换基团通过醚链引入到葡聚糖链中的葡萄糖单元上。它表现为非常低的非特异性吸附，被认为是理想的生化分离介质。然而凝胶的孔径与它的溶涨性质有关，低交联高溶涨介质可以获得较高的交换容量但强度非常小，只能经受很小压力;高交联低溶涨的介质能获得强度提高，但容量和孔径会很快降低，所以不可能获得一种具有适当强度同时又有较高交换容量的多糖凝胶。将上述两种组份融合起来，其中一种是稳定结构的半钢性组份，另一种是带有离子交换基团的软聚合物组分，经合成可产生一代新的离子交换介质-混合型凝胶。例如美国专利USP 4，663，163号采用含离子交换基团（DEAE，QAE、SP等）的甲基丙烯酸衍生物与甲基丙烯酸环氧丙酯进行共聚，随后再与纤维素交联合成混合型凝胶离子交换介质。但是含离子交换基团的甲基丙烯酸衍生物合成困难，介格较贵，因此限制了该方法的应用。同时，这种合成方法反应条件不易控制，也影响了它在工业生产中采用。

本发明的目的是提供一种合成适于生物大分子的分离纯化采用的径向色谱柱填料，DEAE，QAE及SP型离子交换介质的方法，该合成方法利用的原料易得，反应条件简单，易控制，同时交换容量大。

本发明的DEAE、QAE及SP型离子交换介质的合成方法，是利用了上述混合型凝胶的合成原理，并同时考虑到合成介质的后期成膜工艺，以纤维素（短纤维）作为刚性组分，以甲基丙烯酸环氧丙酯作为聚合物组份合成离子交换介质。具体的合成方法按下步骤：

1、甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯进行自聚反应合成聚合物;

2、纤维素与聚合物进行接枝反应;

3、加入开环反应物进行开环反应。

在上述1、2反应中，控制反应温度为50～100℃，为使自聚接枝反应充分进行反应时间应不小于0.5小时，以0.5～3小时为宜。反应在中性介质中进行。在反应中，为使环氧树脂反应完全，反应物纤维素用量应当过量以重量比为甲基丙烯酸环氧丙酯或丙烯酸环氧丙酯的5～15倍为宜。同时为加速反应可加入引发剂以诱发反应，如采用阴离子聚合反应的引发剂偶氮二异丁睛、正丁基锂或过硫酸铵与硫代硫酸钠、引发剂加入重量为反应物的1～5%。开环反应温度控制在40～80℃，反应时间应不小于1小时，以1～3小时为宜。开环物所加入的量应超过环氧树脂反应物的量，以保证引入必要的可提供离子交换用的官能团（DEAE、QAE、SP等），但开环物过多，不但造成反应物的损失，也增加后处理量，开环反应物的加入量为环氧树脂量的1.3～2.5倍为宜。同时开环反应需在一定的PH值范围内进行，所控制的PH范围同开环反应物相关，在酸性或碱性介质中进行，PH值可通过加入稀盐酸进行调解。下面通过实例对本发明的合成反应给予进一步地说明。

实例1，DEAE型离子交换介质的制备

DEAE型离子交换介质的合成过程按下述化学反应进行：

在上述开环反应3中，开环反应物为二乙胺（HNEt₂），反应中以稀盐酸（10%）控制P＝8～12，反应温度控制在40～80℃。实验过程为，于装有搅拌器，温度计及冷凝器的250ml三口烧瓶中加水100ml，升温至80℃加入2克短棉纤维，充分搅拌均匀，随之加入10ml甲基丙烯酸环氧丙酯，搅拌5分钟后，再加入含过硫酸铵和硫代硫酸钠各0.5克的混合溶液（约10ml）作引发剂，保温反应2小时，降温至50℃，加入二乙胺10ml进行胺解开环反应，时间约2小时，反应后降至室温再用大量水洗，然后用丙酮或乙醇洗去纤维素表面的残余物，在真空烘箱烘干制得成0℃，所得介质纤维素接枝率为35%（重量），按常规方法测试其离子交换当量＞3.0mmol/g。

实例2，QAE型离子交换介质的制备

QAE型离子交换介质的合成过程其自聚1，接枝2反应同实例1的相应反应，开环反应3所用开环反应物为三乙胺（NHt₃），反应温度50～80℃，控制P＝3～5。实验过程除胺解开环反应采用8ml三乙胺作开环物，利用稀盐酸将PH值调解到3～5范围，其它过程如实例1所述。所得离子交换介质的结构式如下（Ⅳ）。

其介质纤维素接枝率为36%（重量），离子交换当量＞3.1mmol/g。

实例3，SP型离子交换介质的制备

SP型离子交换介质的合成所用开环反应物为亚硫酸铵（Na₂SO₃），反应温度40～60℃，控制PH＝2～4。实验时用10gNa₂SO₃盐作开环反应物，其它过程如实例2所述条件进行。所得离子交换介质纤维素接枝率为40%（重量），按常规方法，测试其离子交换当量＞3.5mmol/g，

其结构式如下（Ⅴ）

上述（Ⅳ，Ⅴ）中的m，j为30～80。

实例4、填充DEAE型介质径向色谱柱应用

利用实例1所制备的DEAE型离子交换介质填充成径向色谱柱，用PH7.2Tris-HCl，20mM平衡，对经细胞破碎后重组A蛋白上清100ml上样进行上盐洗脱。纯化后A蛋白纯度提高4～6倍，回收率达75%，直接用Phenyl-sepharose4B疏水层析和SephacrylS-200分子筛层析，可得电泳纯A蛋白。

由上述实例，采用本发明提供的合方法可以方便的制备径向色谱柱用DEAE、QAE及SP型离子交换介质。其合成反应条件简单，易于控制，且交换容量大。应用这些介质填充的径向色谱柱，对生物大分子，例如人血浆、牛血清、人血、白蛋白等进行分离，初步结果表明，径向色谱柱具有处理容量大，速度快，便于线性放大等优点。例如可在数十分钟内完成几百毫升至数立升人血浆的分离，人血白蛋白转铁蛋白和球蛋白纯度在70～90%，蛋白回收率在70%以上，所分离得到的单一蛋白再经透析，盐析可以达到电泳纯。因此本发明提供的技术在生物工程产品的大规模分离和初纯化用具有广泛的工业应用前景。

Claims

1、一种径向色谱柱用DEAE、QAE及SP型离子交换介质的合成方法，其特征在于是采用以甲基丙烯酸环丙酯或丙烯酸环氧丙酯进行自聚反应得到聚合物，再与纤维素进行接枝反应，最后加入开环反应物进行开环反应制得；自聚和接枝反应在中性介质中进行，反应温度为50～100℃，开环反应控制反应温度于40～80℃下进行。

2、按照权利要求1所述的合成方法，其特征在于自聚和接枝反应可加入引发剂，例如偶氮二异丁腈，正丁基锂或过硫酸铵与硫代硫酸钠，引发剂加入量为反应物重的1～5%。

3、按照权利要求1所述的合成方法，其特征在于开环反应应控制在一定的PH值下进行，当开环反应物为二乙胺时PH值为8～12;开环反应物为三乙胺时PH值为3～5;开环反应物为亚硫酸铵时PH值为2～4。