CN216285089U - 一种固定化酶膜层析纯化联用系统 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种固定化酶膜层析纯化联用系统，包括恒流输液泵、中空纤维柱、固定化酶、串联色谱柱、切换阀、检测器、收集器。本实用新型通过将固定化酶膜与连续色谱纯化系统联用，具有多个优点：1)蛋白酶解充分，原料利用率高；2)自动化程度高，多个操作步骤在线完成；3)产品污染少，回收率高的特点,在胶原蛋白肽、蚕丝蛋白肽等蛋白肽的生产中，具有广泛的用途。

Description

一种固定化酶膜层析纯化联用系统

【技术领域】

本实用新型属于固定化酶处理的技术领域，尤其涉及一种固定化酶膜层析纯化联用系统。

【背景技术】

胶原蛋白(或称胶原)由动物细胞合成的一种生物性高分子，是生物体重要的细胞外基质成份，主要存在于动物骨、腱、肌鞘、韧带、肌膜、软骨和皮肤中，是结缔组织中极其重要的一种蛋白质，起着支撑器官、保护机体的功能，目前主要应用于食品、化妆品中，具有促进创面愈合、保湿等功效。猪皮的蛋白质含量可高达33％，其中胶原蛋白含量为87.8％，因此工业上常用猪皮来提取胶原蛋白。

由于蛋白质属于生物大分子，为了可以使其更好被吸收、渗透，常采用酶解法将胶原蛋白酶解为分子量较小的胶原蛋白肽；使用游离酶进行催化酶解，投入的酶为一次性使用，且与产物混合，污染产物；固定化酶技术是20世纪60年代发展起来的一项生物工程技术，是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，进行其特有的催化反应，并可回收及重复利用的技术。与游离酶相比，在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，固定化酶稳定性显著提高，同一批酶可重复、长期使用并能够预测衰变速度，固定化后很容易与产物分开，不污染产物，有利于控制生产过程。

现代生产和科学技术的发展，对自动化技术提出越来越高的要求，同时也为自动化技术的革新提供了必要条件。70年代以后，自动化开始向复杂的系统控制和高级的智能控制发展，并广泛地应用到国防、科学研究和经济等各个领域，实现更大规模的自动化，工厂自动化、办公自动化、家庭自动化和农业自动化等将成为新技术革命的重要内容，并得到迅速发展。

因此，综合自动化技术、柱层析技术和固定化酶技术，设计一种在较少人的直接参与下，按照人的要求，经过自动检测、信息处理、分析判断、操纵控制，实现预期的目标的全自动胶原生产装置是有意义的，通过将酶固定化在中空纤维内部，催化酶解大分子胶原蛋白，分解为小分子胶原蛋白肽，利用中空纤维对不同分子量蛋白的截留能力差异，分离出小分子胶原蛋白肽，进入层析柱进一步分离、捕集，得到具有抗氧化性的胶原蛋白肽，提高胶原蛋白的效用；实现了胶原蛋白肽的全自动生产，具有重要的工业价值，具有节省能源与资源，减少污染的生态环境效应，符合可持续发展的战略要求。

【实用新型内容】

本实用新型的目的就是解决背景技术中的问题，提出一种固定化酶膜层析纯化联用系统。

为实现上述目的，本实用新型提出了一种固定化酶膜层析纯化联用系统，包括原料池、中空纤维柱、第一切换阀、第二切换阀、第一检测器、第二检测器、自动收集器、废液池和若干色谱柱，所述中空纤维柱用管路与原料池、第一切换阀和第一泵相连，所述第一泵和原料池相连，所述第一切换阀用管路与色谱柱、第二泵相连，所述第二切换阀用管路与色谱柱、第一检测器、第二检测器相连，所述自动收集器用管路与第二检测器相连，所述废液池用管路与第一检测器、自动收集器相连。

作为优选，所述中空纤维柱内部固定胰蛋白酶，原料进入中空纤维柱内部空腔进行酶解反应，所述中空纤维柱允许10kD以下物质渗出中空纤维，大于10kD则不能渗出。

作为优选，所述色谱柱为大孔树脂、凝胶渗透、离子交换色谱柱中的任意一种，色谱柱内填料的粒径为10um-200um，所述色谱柱为玻璃柱或不锈钢柱，色谱柱的直径为20-800mm，色谱柱的运行压力0.1-10MPa。

作为优选，所述第一切换阀、第二切换阀为六通阀、十通阀、四位选择阀、六位选择阀中的任意一种。

作为优选，所述第一检测器、第二检测器为紫外-可见光检测器、示差检测器、蒸发光检测器、荧光检测器中的任意一种。

本实用新型的有益效果：1)蛋白酶解充分，原料利用率高；2)自动化程度高，多个操作步骤在线完成；3)产品污染少，回收率高的特点，在胶原蛋白肽、蚕丝蛋白肽等蛋白肽的生产中，具有广泛的用途。

本实用新型的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。

【附图说明】

图1是本实用新型一种实施例的系统示意图；

图2是本实用新型一种实施例的标准蛋白肽和猪皮胶原蛋白肽SDS-PAGE图；

图3是本实用新型一种实施例的水解产物的Sephadex G-25柱层析洗脱曲线图。

【具体实施方式】

如图1至图3所示，本实施例提供了一种固定化酶膜层析纯化联用系统，包括第一切换阀、第二切换阀、中空纤维柱、第一色谱柱、第二色谱柱、第三色谱柱、第一泵、第二泵、第一检测器、第二检测器、废液池和自动收集器，所述中空纤维柱用管路与原料池、第一切换阀和第一泵相连，所述第一泵和原料池相连，所述第一切换阀用管路与第一色谱柱、第二色谱柱、第三色谱柱、第二泵相连，所述第二切换阀用管路与第一色谱柱、第二色谱柱、第三色谱柱、第一检测器、第二检测器相连，所述自动收集器用管路与第二检测器相连，所述废液池用管路与第一检测器、自动收集器相连。

其中，中空纤维柱截留分子量为10kD，第一维色谱柱、第二色谱柱和第三色谱柱均为A400强阴离子交换色谱柱，规格30*300mm；第一泵和第二泵均使用HT7100A恒流泵；第一检测器为HT7100A紫外-可见光检测器；第二检测器为HT7100A紫外-可见光检测器；自动收集器为HT7200S自动馏分收集器。

所述第一泵的出口端通过管路连接到所述中空纤维柱的进口端，所述中空纤维柱超滤液出口端通过管路连接到所述第一切换阀进口端，所述中空纤维柱浓缩液出口端通过管路连接到所述原料池，所述原料池通过管路连接到所述第一泵进口端。

所述第二泵的出口端通过管路与所述第一切换阀1号位连接，所述第一切换阀2号位通过管路与所述中空纤维柱超滤液出口端连接，所述第一切换阀3号位通过管路与所述第一色谱柱进口端连接，所述第一切换阀4号位通过管路与所述第二色谱柱进口端连接，所述第一切换阀5号位通过管路与所述第三色谱柱进口端连接。

所述第二切换阀5号位通过管路与所述第三色谱柱出口端连接，所述第二切换阀4号位通过管路与所述第二色谱柱出口端连接，所述第二切换阀3号位通过管路与所述第一色谱柱出口端连接，所述第二切换阀2号位通过管路与所述第二检测器进口端连接，所述第二切换阀1号位通过管路与所述第一检测器进口端连接。

所述第一检测器进口端通过管路与所述第二切换阀1号位连接，所述第一检测器出口端通过管路与所述废液池连接；所述第二检测器进口端通过管路与所述第二切换阀2号位连接，所述第二检测器出口端通过管路与所述自动收集器进口端连接，所述自动收集器废液出口端通过管路与所述废液池连接。

上述系统的运行方式如下：

第一切换阀和第二切换阀是一组关联的切换阀，通过自动化程序控制，有三个工作状态：

处于A工作状态时，中空纤维柱超滤液出口端通过管路与第一切换阀2号位连接，第一切换阀2号位与3号位连接，3号位通过管路与第一色谱柱进口端连接，第一色谱柱出口端通过管路与第二切换阀3号位连接，第二切换阀3号位与1号位连接，1号位通过管路与第一检测器进口端连接；第二泵通过管路与第一切换阀1号位连接，第一切换阀1号位与5号位连接，5号位通过管路与第三色谱柱进口端连接，第三色谱柱出口端通过管路与第二切换阀5号位连接，第二切换阀5号位与2号位连接，2号位通过管路与第二检测器进口端连接；

处于B工作状态时，中空纤维柱超滤液出口端通过管路与第一切换阀2号位连接，第一切换阀2号位与4号位连接，4号位通过管路与第二色谱柱进口端连接，第二色谱柱出口端通过管路与第二切换阀4号位连接，第二切换阀4号位与1号位连接，1号位通过管路与第一检测器进口端连接；第二泵通过管路与第一切换阀1号位连接，第一切换阀1号位与3号位连接，3号位通过管路与第一色谱柱进口端连接，第一色谱柱出口端通过管路与第二切换阀3号位连接，第二切换阀3号位与2号位连接，2号位通过管路与第二检测器进口端连接；

处于C工作状态时，中空纤维柱超滤液出口端通过管路与第一切换阀2号位连接，第一切换阀2号位与5号位连接，5号位通过管路与第三色谱柱进口端连接，第三色谱柱出口端通过管路与第二切换阀5号位连接，第二切换阀5号位与1号位连接，1号位通过管路与第一检测器进口端连接；第二泵通过管路与第一切换阀1号位连接，第一切换阀1号位与4号位连接，4号位通过管路与第二色谱柱进口端连接，第二色谱柱出口端通过管路与第二切换阀4号位连接，第二切换阀4号位与2号位连接，2号位通过管路与第二检测器进口端连接；

步骤1.第一泵通过管路从原料池中抽取胶原蛋白原料，通过管路输送到中空纤维柱，胶原蛋白原料在中空纤维空腔内经过固定化酶催化酶解为胶原蛋白肽，低于10kD的胶原蛋白肽从中空纤维孔隙中渗出，作为超滤液通过管路进入第一切换阀；大于10kD的胶原蛋白，不能渗出中空纤维，作为浓缩液通过管路进入原料池，继续循环参与催化酶解。

步骤2.第一切换阀和第二切换阀在自动化程序控制下处于A工作状态，此时第一色谱柱处于上样状态。中空纤维柱流出的低于10kD的胶原蛋白肽超滤液通过管路流入第一色谱柱，其中胶原蛋白肽被色谱柱吸附，流动相通过管路流入第一检测器，最终流入废液池。

步骤3.当第一检测器检测到胶原蛋白信号，第一切换阀和第二切换阀在自动化程序控制下切换至B工作状态，此时第一色谱柱处于洗脱状态，第二色谱柱处于上样状态。中空纤维柱流出的低于10kD的胶原蛋白肽超滤液通过管路流入第二色谱柱，其中胶原蛋白肽被色谱柱吸附，流动相通过管路流入第一检测器，最终流入废液池。第二泵通过管路将洗脱流动相泵入第一色谱柱，洗脱色谱柱上的胶原蛋白肽，洗脱液通过管路流入第二检测器，再流入自动收集器，自动收集器在第二检测器信号控制下自动收集胶原蛋白肽馏分，其余废液流入废液池，其中，可通过自动化程序设置第一色谱柱上样的时间。

步骤4.当第一检测器检测到胶原蛋白信号，第一切换阀和第二切换阀在自动化程序控制下切换至C工作状态，此时第二色谱柱处于洗脱状态，第三色谱柱处于上样状态。中空纤维柱流出的低于10kD的胶原蛋白肽超滤液通过管路流入第三色谱柱，其中胶原蛋白肽被色谱柱吸附，流动相通过管路流入第一检测器，最终流入废液池。第二泵通过管路将洗脱流动相泵入第二色谱柱，洗脱色谱柱上的胶原蛋白肽，洗脱液通过管路流入第二检测器，再流入自动收集器，自动收集器在第二检测器信号控制下自动收集胶原蛋白肽馏分，其余废液流入废液池，其中，可通过自动化程序设置第二色谱柱上样的时间。

步骤5.当第一检测器检测到胶原蛋白信号，第一切换阀和第二切换阀在自动化程序控制下切换至A工作状态，此时第三色谱柱处于洗脱状态，第一色谱柱处于上样状态。中空纤维柱流出的低于10kD的胶原蛋白肽超滤液通过管路流入第一色谱柱，其中胶原蛋白肽被色谱柱吸附，流动相通过管路流入第一检测器，最终流入废液池。第二泵通过管路将洗脱流动相泵入第三色谱柱，洗脱色谱柱上的胶原蛋白肽，洗脱液通过管路流入第二检测器，再流入自动收集器，自动收集器在第二检测器信号控制下自动收集胶原蛋白肽馏分，其余废液流入废液池，其中，可通过自动化程序设置第三色谱柱上样的时间。

如此，完成了一个完整的酶解、超滤、富集、洗脱的过程，连续上样，重复步骤1-5。可照此操作循环往复，持续进行纯化生产。

具体固定化酶膜层析纯化联用系统使用方法实施步骤：

(1)胶原前处理：取猪皮适量，加入10倍量2％Na₂CO3溶液，室温放置，搅拌，脱脂6h。脱脂后的猪皮水洗至近中性，即得脱脂猪皮；取碎脱脂猪皮适量，加30倍量0.5M冰醋酸溶液，加3％胃蛋白酶，搅拌，10℃以下酶解48h；所得胶原酸液加氯化钠使含量达10％，低温放置盐析6h；将盐析出的胶原先以30％乙醇洗涤除去残留的氯化钠，至AgNO3检验无沉淀反应，再以无水乙醇脱水，20℃以下挥去乙醇，得固体胶原。

(2)酶的固定化：将胰蛋白酶固定到中空纤维内部空腔。

(3)催化酶解：将处理过的固体胶原加入100倍量的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠(pH＝8.0)缓冲溶液，通过第一泵输入到中空纤维柱，在胰蛋白酶催化下分解为胶原蛋白肽，低于10kD的胶原蛋白肽流出中空纤维柱，大于10kD的胶原则继续流入原料池循环进样，催化酶解。

(4)富集：第一切换阀和第二切换阀处于A工作状态，低于10kD的胶原蛋白肽通过第一切换阀进入第一色谱柱，胶原蛋白肽被色谱柱富集，流动相通过第二切换阀经过第一检测器进入废液池；当第一色谱柱上胶原蛋白肽富集满，第一检测器检测到胶原蛋白肽信号，自动化程序控制第一切换阀和第二切换阀切换至B工作状态，低于10kD的胶原蛋白肽通过第一切换阀进入第二色谱柱，胶原蛋白肽被色谱柱富集，流动相通过第二切换阀经过第一检测器进入废液池；当第二色谱柱上胶原蛋白肽富集满，第一检测器检测到胶原蛋白肽信号(或者达到预设色谱柱富集时间)，自动化程序控制第一切换阀和第二切换阀切换至B工作状态，低于10kD的胶原蛋白肽通过第一切换阀进入第三色谱柱，胶原蛋白肽被色谱柱富集，流动相通过第二切换阀经过第一检测器进入废液池，其中，也可通过自动化程序设定色谱柱富集时间来控制第一切换阀和第二切换阀切换至B工作状态；

(5)洗脱：当第一切换阀和第二切换阀处于A工作状态，第二泵输入含1M氯化钠的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠(pH＝8.0)缓冲溶液经过第一切换阀流入第三色谱柱，洗脱第三色谱柱上富集的胶原蛋白肽，同时除去其他杂质，洗脱液经过第二检测器进入自动收集器，自动收集器在第二检测器信号控制下自动收集胶原蛋白肽馏分，其余废液进入废液池；当第一切换阀和第二切换阀处于B工作状态，第二泵输入含1M氯化钠的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠(pH＝8.0)缓冲溶液经过第一切换阀流入第一色谱柱，洗脱第一色谱柱上富集的胶原蛋白肽，同时除去其他杂质，洗脱液经过第二检测器进入自动收集器，自动收集器在第二检测器信号控制下自动收集胶原蛋白肽馏分，其余废液进入废液池；当第一切换阀和第二切换阀处于A工作状态，第二泵输入含1M氯化钠的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠(pH＝8.0)缓冲溶液经过第一切换阀流入第二色谱柱，洗脱第二色谱柱上富集的胶原蛋白肽，同时除去其他杂质，洗脱液经过第二检测器进入自动收集器，自动收集器在第二检测器信号控制下自动收集胶原蛋白肽馏分，其余废液进入废液池；

(6)干燥：将收集的馏分脱盐、冻干，即得胶原蛋白肽粉末。

图2中，数字1为标准蛋白肽；2、3为猪皮胶原蛋白肽。

上述实施例是对本实用新型的说明，不是对本实用新型的限定，任何对本实用新型简单变换后的方案均属于本实用新型的保护范围。

Claims (5)

1.一种固定化酶膜层析纯化联用系统，其特征在于：包括原料池、中空纤维柱、第一切换阀、第二切换阀、第一检测器、第二检测器、自动收集器、废液池和若干色谱柱，所述中空纤维柱用管路与原料池、第一切换阀和第一泵相连，所述第一泵和原料池相连，所述第一切换阀用管路与色谱柱、第二泵相连，所述第二切换阀用管路与色谱柱、第一检测器、第二检测器相连，所述自动收集器用管路与第二检测器相连，所述废液池用管路与第一检测器、自动收集器相连。

2.如权利要求1所述的固定化酶膜层析纯化联用系统，其特征在于：所述中空纤维柱内部固定胰蛋白酶，原料进入中空纤维柱内部空腔进行酶解反应，所述中空纤维柱允许10kD以下物质渗出中空纤维，大于10kD则不能渗出。

3.如权利要求1所述的固定化酶膜层析纯化联用系统，其特征在于：所述色谱柱为大孔树脂、凝胶渗透、离子交换色谱柱中的任意一种，色谱柱内填料的粒径为10um-200um，所述色谱柱为玻璃柱或不锈钢柱，色谱柱的直径为20-800mm，色谱柱的运行压力0.1-10MPa。

4.如权利要求1所述的固定化酶膜层析纯化联用系统，其特征在于：所述第一切换阀、第二切换阀为六通阀、十通阀、四位选择阀、六位选择阀中的任意一种。

5.如权利要求1所述的固定化酶膜层析纯化联用系统，其特征在于：所述第一检测器、第二检测器为紫外-可见光检测器、示差检测器、蒸发光检测器、荧光检测器中的任意一种。

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