CN104419689B - 玻璃酸酶的仿生亲和纯化方法 - Google Patents

玻璃酸酶的仿生亲和纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种玻璃酸酶仿生亲和纯化方法，包括下列步骤：(1)基础层析介质与三氯三氮嗪反应活化后，分别与2‑氨基对苯二甲酸以及二盐酸组胺反应，合成仿生亲和分离材料；(2)用制备的仿生亲和分离材料纯化玻璃酸酶，将含有玻璃酸酶的样品流过该亲和层析柱，玻璃酸酶吸附在亲和层析柱上，冲洗亲和层析柱，不吸附在亲和层析柱上的杂蛋白被除去，然后变换缓冲液条件，将结合的玻璃酸酶洗脱下来。本发明能够高效率、低成本的大规模生产高酶活的玻璃酸酶。

Description

玻璃酸酶的仿生亲和纯化方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及的是一种生物医药技术领域的纯化方法。特别是一种玻璃酸酶的仿生亲和纯化方法。
背景技术
玻璃酸酶(EC3.3.1.35)，又称透明质酸酶，是一种碱性糖蛋白，属内切糖苷酶。能催化玻璃酸、硫酸软骨素A、硫酸软骨素C的β-N-乙酰氨基己糖糖苷键水解。它在哺乳动物的睾丸里含量很丰富，能水解透明质酸，使其粘滞性明显下降，有利于受精时精子进入卵子。也存在于精子、颌下腺、蜂毒、蛇毒、皮肤、脾脏、水蛭及细胞的溶酶体中。临床用于局部注射，可加速皮下、肌内注射药液的吸收，促进局麻药的浸润，促进手术及创伤后局部水肿或血肿的扩散，也用于肠粘连。我国1965年正式投入生产，从羊睾丸中提取，收入1977版中国药典。
玻璃酸酶的稳定性较好，42℃加热60min活力不损失；100℃加热5min，活力可保留80％。受热失活后进行冷却可恢复部分活力。在pH5以下或pH8以上酶仍较稳定。在低浓度水溶液中轻易失活，但可加入0.2％或0.5％阿拉伯胶或0.2％明胶保护。
目前玻璃酸酶大多是从哺乳动物睾丸中提取的，通用工艺为睾丸绞成糜浆后，用冰醋酸溶液浸取，然后通过盐析、吊滤得到粗制品，再经硫酸铵盐析、透析、去热源、干燥等得到玻璃酸酶精品。该工艺步骤繁琐，周期长，收率低，酶活不高。
经对现有技术文献的检索发现，从动物胰脏中制备玻璃酸酶的方法有多种，多为硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶层析、切向流超滤等，如中国专利103060291A一种玻璃酸酶的提取方法；中国专利103060288A一种从猪睾丸中提取玻璃酸酶的方法；中国专利102851265A一种牛睾丸制备玻璃酸酶的方法；由于采用多步提取纯化，导致玻璃酸酶的回收率低，酶活性不高，周期长，尚未有专利报道采用仿生亲和层析技术进行玻璃酸酶的纯化，因此，有必要开发效率高、成本低、生产步骤更简便的玻璃酸酶分离材料和和生产工艺。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种玻璃酸酶的仿生亲和纯化方法，使其克服玻璃酸酶大规模纯化中的缺点，在大规模分离纯化时步骤少、成本低、效率高，利用玻璃酸酶专一的亲和配位体，可快速、简便、低成本、大批量纯化玻璃酸酶。
因此本发明的目的在于提供玻璃酸酶特异性的亲和配基；
本发明的另一个目的在于建立玻璃酸酶层析纯化方法，保证在大规模分离纯化时，高效的提取玻璃酸酶。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明以基础层析介质为原料制备仿生亲和分离材料，用制备的仿生亲和分离材料纯化玻璃酸酶。
本发明包括以下步骤
(1)在基础层析介质上进行固相合成，制备仿生亲和分离材料；
合成玻璃酸酶专一的亲和分离材料，首先以带氨基的基础层析介质，或用常规化学方法对基础层析介质进行衍生化，带上氨基，与三氯三氮嗪反应活化，然后与2-氨基对苯二甲酸和二盐酸组胺反应，合成亲和分离材料。
(2)用制备的仿生亲和分离材料纯化玻璃酸酶；
用上述合成的亲和层析介质制备成亲和层析柱，将睾丸提取液上清流过该亲和层析柱，玻璃酸酶吸附在亲和层析柱上，未结合的其它蛋白被洗去，改变换缓冲液条件将结合的玻璃酸酶洗脱下来，得到玻璃酸酶。
在步骤(1)中，基础层析介质是葡聚糖凝胶、交联的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚物、琼脂糖凝胶、琼脂糖与葡聚糖的交联共聚物、聚丙烯酰胺／琼脂糖复合物珠、纤维素珠和涂有化学活性基团的硅胶中的一种。
在步骤(2)中，亲和介质吸附玻璃酸酶的条件为为pH6-7，离子强度为0.0-0.15M的缓冲液；洗脱条件为pH3，离子强度为0.1M的缓冲液。
所述的仿生亲和分离材料，其结构是通过三氮嗪结构骨架作为间臂固定2-氨基对苯二甲酸及组胺基团。
所述的玻璃酸酶，其原料为哺乳动物睾丸。
本发明克服了玻璃酸酶生产技术中的缺点，使玻璃酸酶生产分离达到纯化时步骤少，生产成本低，生产效率高的目的。利用玻璃酸酶专一的亲和分离材料，可快速、简便、低成本、大批量纯化玻璃酸酶。玻璃酸酶回收率>10％，酶活高达1800U／mg。
附图说明
图1：1-氨基-Sepharose-3-氨基对苯二甲酸-5-组胺-2，4，6-三氮嗪纯化玻璃酸酶10％SDS—PAGE检测结果
具体实施方式
下面结合具体实例做进一步的阐述：
实施例一
一分离材料制备
取NH2-Sepharose(50mL)，依次用5倍体积的1M NaC1，10倍体积蒸馏水充分洗涤后，抽干转移至反应器皿中，加入一定量的冰水，在冰水浴中搅拌下加入冷丙酮溶解的三氯三氮嗪(1～5g)，用饱和NaHCO3调节反应系统的pH在6～7之间，反应3小时后取出，依次用3×10倍体积的水／丙酮(0：1，1：3，1：1，3：1，1：0)洗涤，得到1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪。
称取2-氨基对苯二甲酸(3～10g)用去离子水溶解，与1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪混匀，用饱和NaHCO3调节pH在6～7之间，置于温度50℃中搅拌反应24小时。反应结束后，依次用3倍体积的1M NaCl，10倍体积蒸馏水充分洗涤，得到1-氨基-Sepharose-3-氨基对苯二甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪，用20％乙醇储存待用。
取1-氨基Sepharose-3-氨基苯二甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪，然后称取二盐酸组胺(3～10g)，用二甲亚砜和去离子水混合溶解，将溶液的pH调至5～8左右，较佳的pH7，倒入反应器与1-氨基Sepharose-3-氨基苯二甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪混合，放于温度为95℃的恒温环境下反应60h。反应结束后，取出反应物，用4倍体积的NaCl，3倍体积二甲亚砜洗涤，然后用10倍体积的去离子水洗涤。得到1-氨基Sepharose-3-氨基苯二甲酸-5-组胺-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料，用20％乙醇储存待用。
二用亲和分离材料纯化玻璃酸酶
将羊睾丸除内外皮层及副睾丸，绞碎成匀浆状，按固液比1：1的比例加入冷冻的盐酸与醋酸混合酸液，4℃搅拌提取4h。浸取结束后9800rpm，4℃离心10min，然后4℃静置1h，过滤除脂；得睾丸提取液上清液。离心后沉淀物中，加入一半体积的冷硫酸再提取一次，重复上述操作，合并两次上清液。将1-氨基Sepharose-3-氨基苯二甲酸-5-组胺-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料(1mL)，装入层析柱(1*2.5cm)中。用10mL磷酸盐缓冲液(10mM，pH7)平衡后，把5mL上述上清液(调pH和电导率与磷酸盐缓冲液相同)加到柱上。用10mL磷酸盐缓冲液(10mM，pH7)洗去未吸附的物质后，再用10mL甘氨酸缓冲液(0.1M，pH3)洗脱，收集洗脱组分。用10％的变性还原SDS-PAGE检测玻璃酸酶的纯度，然后根据2010版《中华人民共和国药典》第二部玻璃酸酶活性测定方法测定玻璃酸酶活性最高可达1800U／mg。
实验结果及附图说明
图1说明，1：Marker从上之下分子量依次为116KD，66.2KD，45KD，35KD；2：洗脱液(pH3，100mM Gly-HCl缓冲体系)；3-7：流穿液(pH7，10mM PB缓冲体系)；8：羊睾丸提取液上清
实施例二
一分离材料制备
取NH2-Sepharose(50mL)，依次用5倍体积的1M NaCl，10倍体积蒸馏水充分洗涤后，抽干转移至反应器皿中，加入一定量的冰水，在冰水浴中搅拌下加入冷丙酮溶解的三氯三氮嗪(1-5g)，用饱和NaHCO3调节反应系统的pH在6～7之间，反应3小时后取出，依次用3×10倍体积的水／丙酮(0：1，1：3，1：1，3：1，1：0)洗涤，得到1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪。
称取2-氨基对苯二甲酸(3-10g)用去离子水溶解，与1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪混匀，用饱和NaHCO3调节pH在6～7之间，置于温度50℃中搅拌反应24h。反应结束后，依次用3倍体积的1M NaCl，10倍体积蒸馏水充分洗涤，得到1-氨基-Sepharose-3-氨基对苯二甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪，用20％乙醇储存待用。
取1-氨基Sepharose-3-氨基苯二甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪，称取称取二盐酸组胺(3—10g)，用二甲亚砜和去离子水混合溶解，将溶液的pH调至5～8左右，较佳的pH7，倒入反应器与1-氨基Sepharose-3-氨基苯二甲酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪混合，放于温度为95℃的恒温环境下反应60h。反应结束后，取出反应物，用4倍体积的NaCl，3体积二甲亚砜洗涤，然后用10倍体积的去离子水洗涤。得到1-氨基Sepharose-3-氨基苯二甲酸-5-组胺-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料，用20％乙醇储存待用。
二用亲和分离材料纯化玻璃酸酶
将牛睾丸除内外皮层及副睾丸，绞碎成匀浆状，按固液比1：1的比例加入冷冻的盐酸与醋酸混合酸液，4℃搅拌提取4h。浸取结束后9800rpm，4℃离心10min，然后4℃静置1h，过滤除脂；得睾丸提取液上清液。离心后沉淀物中，加入一半体积的酸液再提取一次，重复上述操作，合并两次上清液。将1-氨基Sepharose-3-氨基苯二甲酸-5-组胺-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料(1mL)，装入层析柱(1*2.5cm)中。用10mL磷酸盐缓冲液(10mM，pH7)平衡后，把5mL上述上清液(调pH和电导率与磷酸盐缓冲液相同)加到柱上。用10mL磷酸盐缓冲液(10mM，pH7)洗去未吸附的物质后，再用10mL甘氨酸缓冲液(0.1M，pH3)洗脱，收集洗脱组分。用10％的变性还原SDS-PAGE检测玻璃酸酶的纯度，然后根据2010版《中华人民共和国药典》第二部玻璃酸酶活性测定方法测定玻璃酸酶活性最高可达1000U／mg。
实施例三
将羊睾丸除内外皮层及副睾丸，绞碎成匀浆状，按固液比1：1的比例加入冷冻的酸液，4℃搅拌提取4h。浸取结束后9800rpm，4℃离心10min，然后4℃静置1h，过滤除脂；得睾丸提取液上清液。离心后沉淀物中，加入一半体积的冷酸液再提取一次，重复上述操作，合并两次上清液。将1-氨基Sepharose-3-氨基苯二甲酸-5-组胺-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料(1mL)，装入层析柱(1*2.5em)中。用10mL磷酸盐缓冲液(10mM，pH6)平衡后，把5mL上述上清液(调pH和电导率与磷酸盐缓冲液相同)加到柱上。用10mL磷酸盐缓冲液(10mM，pH6)洗去未吸附的物质后，再用10mL甘氨酸缓冲液(0.1M，pH3)洗脱，收集洗脱组分。用10％的变性还原SDS-PAGE检测玻璃酸酶的纯度，然后根据2010版《中华人民共和国药典》第二部玻璃酸酶活性测定方法测定玻璃酸酶活性为1000U／mg。

Claims (7)

1.一种玻璃酸酶的仿生亲和纯化方法，其特征在于，包括下列步骤：用制备的仿生亲和分离材料纯化睾丸提取液上清，从而获得经纯化的玻璃酸酶，
其中所述仿生亲和分离材料的结构是在基础层析介质上通过三氮嗪骨架作为间臂偶联2-氨基对苯二甲酸及二盐酸组胺而形成的。
2.根据权利要求1所述的玻璃酸酶的仿生亲和纯化方法，其特征是，所述的基础层析介质是葡聚糖凝胶、交联的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚物、琼脂糖凝胶、琼脂糖与葡聚糖的交联共聚物、聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物珠、纤维素珠和涂有化学活性基团的硅胶中的一种。
3.根据权利要求1所述的玻璃酸酶的仿生亲和纯化方法，其特征是，在所述的纯化步骤中，亲和介质吸附玻璃酸酶的条件为pH6—7，离子强度为0.0—0.15M的缓冲液；洗脱条件为pH3—4，离子强度为0.1M的缓冲液。
4.根据权利要求1所述的玻璃酸酶的仿生亲和纯化方法，其特征是，所述的仿生亲和分离材料，其合成的配体中含有三氮嗪；其合成的配体中含有氨基对苯二甲酸的结构；且其合成的配体中含有组胺的结构。
5.一种仿生亲和分离材料，其特征是所述仿生亲和分离材料的结构是在基础层析介质上通过三氮嗪骨架作为间臂偶联2-氨基对苯二甲酸及二盐酸组胺而形成的。
6.根据权利要求5所述的仿生亲和分离材料，其特征是，在所述的仿生亲和分离材料中，其合成的配体中含有三氮嗪；其合成的配体中含有氨基对苯二甲酸的结构和组胺的结构。
7.根据权利要求5所述的仿生亲和分离材料，其特征是，所述的仿生亲和分离材料为1-氨基-Sepharose-3-氨基苯二甲酸-5-组胺-2，4，6-三氮嗪。
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