CN1884507A - 降纤酶的亲和分离材料和降纤酶的亲和纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种降纤酶的亲和分离材料和降纤酶的亲和的纯化方法，包括下列步骤：(1)在基础层析介质上进行固相合成，制备仿生亲和分离材料；(2)用制备的仿生亲和分离材料纯化降纤酶粗品；(3)用离子交换层析制得降纤酶。本发明能够高效率、低成本的大规模生产高纯度的降纤酶。

Description

降纤酶的亲和分离材料和降纤酶的亲和纯化方法
技术领域
本发明涉及的是一种生物医药技术领域的纯化方法。特别是一种降纤酶的亲和分离材料和降纤酶的亲和的纯化方法。
背景技术
降纤酶是从长白山白眉蝮蛇[Agkistrodon halys(ussriensis Emelianor)]或尖吻蝮蛇[Agkistrodon acutus(Guenther)]蛇毒中提取的蛋白水解酶[《国家药品标准-降纤酶》(WS1-XG-031-2000)]。一种类凝血酶(TLE)类蛋白水解酶，是糖蛋白，同时具有精氨酸酯酶及类凝血酶的活性，在体内作用于底物纤维蛋白原，能使纤维蛋白原直接凝固变成非铰链的纤维蛋白，从而使纤维蛋白原降低，发挥明显的抗凝血作用。降纤酶的抗凝血作用主要是直接作用于血浆纤维蛋白原，对体内其他凝血因子如II、VII、VIII、X等无明显影响，因此降纤酶不容易引起出血。降纤酶有类似胰蛋白酶的纤容酶活性，促进组织纤溶酶原激活剂从血管内皮释放，提高人血浆中的组织型纤溶酶原激活剂(t-pA)和尿激酶(Urokinase)活性共同参与激活存在于血凝块和血浆中的纤溶酶原，使其变为纤溶酶。因此，降纤酶具有抵抗血凝、溶解血栓、去纤、降低血粘度和扩张血管改善微循环、清除自由基等功效(汤圣希等，蛇毒降纤酶的主要药理作用：蛇志，1999，11(3)：1-3)的作用，临床上主要用于治疗血管栓塞性等疾病具有较高的药用价值。
但由于蛇毒成分复杂，同功酶比较多，性质又存在差异，如中国专利01115570.1公开了一种尖吻蝮蛇毒凝血酶II具有A、B两个亚基组成，分别含122个和120个氨基酸残基，具有去纤维蛋白原作用，可抗凝血。而中国专利02158007.3公开了一种蛇毒蛋白酶，质谱分子量29000-29500Dalton，和两条肽链组成，具有促凝血、止血功能。因此从蛇毒中分离纯化单一组分降纤酶一直比较困难。
经对现有技术文献的检索发现，从蛇毒中制备降纤酶的方法有多步阳离子交换和阴离子交换层析，如中国专利92102645.5尖吻蝮蛇毒去纤酶纯化方法、95109884.5
一种尖吻蝮蛇毒纤溶酶及其纯化方法；由于仅用多步用阴离子交换层析制备降纤酶的回收率低，酶比活性不高，中国专利“200410021558.4从蛇毒中提取降纤酶及降纤酶水针制剂的制备方法”采用离子交换粗提，再用单克隆抗体亲和层析精制。该方法利用亲和分离技术的优点，使纯化步骤少，操作简单。但单克隆抗体制备成本高，性质不稳定，使得单克隆抗体亲和层析材料的使用寿命短，降纤酶的生产成本高。
因此，有必要开发效率高、成本低、生产步骤更简便的降纤酶分离材料和和生产工艺。
发明内容
本发明的目的在于克服降纤酶生产现有技术的缺点，提供一种降纤酶的亲和分离材料和降纤酶的亲和的纯化方法，使其能够可快速、简便、低成本、大批量纯化降纤酶。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明的纯化方法，即仿生亲和纯化技术，以专一性地识别降纤酶作为基础，其步骤如下：
(1)在基础层析介质上进行固相合成，制备仿生亲和分离材料；
合成降纤酶专一的亲和分离材料，首先以带氨基的基础层析介质，或用常规化学方法对基础层析介质进行衍生化，带上氨基，与三氯三氮嗪反应活化，再与精氨酸反应，合成亲和分离材料。
(2)用制备的仿生亲和分离材料纯化降纤酶粗品。
用上述合成的亲和层析介质制备成亲和层析柱，将蛇毒样品流过该亲和层析柱，降纤酶及其类似物吸附在亲和层析柱上，未结合的其它蛋白被洗去，改变换缓冲液条件将结合的降纤酶洗脱下来，得到降纤酶粗品。
(2)用离子交换层析制得降纤酶。
降纤酶粗品再用阴离子交换层析精制，得到单一组分的降纤酶精品。
步骤(1)中，基础层析介质是葡聚糖凝胶、交联的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚物、琼脂糖凝胶、琼脂糖与葡聚糖的交联共聚物、聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物珠、纤维素珠和涂有化学活性基团的硅胶中的一种。
在步骤(2)中，亲和介质吸附降纤酶的条件为为pH5-8，离子强度为0.0-0.5M的缓冲液；洗脱条件为pH1.0-4.0或pH10-12，离子强度为0-0.5M的缓冲液。
所述的仿生亲和分离材料，其结构是通过三氮嗪结构骨架作为间臂固定精氨酸基团。
所述的降纤酶，其原料为尖吻蝮蛇蛇毒或者长白山白眉蝮蛇蛇毒。
本发明克服了降纤酶生产技术中的缺点，使降纤酶生产分离纯化时步骤少，生产成本低，生产效率高，利用降纤酶专一的亲和分离材料，可快速、简便、低成本、大批量纯化降纤酶。
具体实施方式
下面结合具体实例做进一步的阐述：
实施例1：
一 分离材料制备
取NH2-Sepharose(500ml)，依次用5倍体积的1M NaCl，10倍体积蒸馏水充分洗涤后，抽干转移至反应器皿中，加入一定量的冰水，在冰水浴中搅拌下加入冷丙酮溶解的三氯三氮嗪(100g)，用饱和NaHCO3调节反应系统的pH在6～7之间，反应3小时后取出，依次用3×10倍体积的水/丙酮(0∶1，1∶3，1∶1，3∶1，1∶0)洗涤，得到1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(450ml)。
称取精氨酸(100g)用去离子水(300ml)溶解，与1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(300ml)混匀，用饱和NaHCO3调节pH在6～7之间，置于温度50℃中搅拌反应24小时。反应结束后，依次用3倍体积的1MNaCl，10倍体积蒸馏水充分洗涤，得到1-氨基-Sepharose-3-精氨酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪(260ml)，用20％乙醇储存待用。
二 分离材料结构测定
取1-氨基-Sepharose-3-精氨酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪4ml用循环水真空泵抽去水份，装于水解管中，加入等量6M盐酸溶液，100℃恒温水解过夜，然后取出水解液15000rpm离心15min，取上清减压旋转蒸发至于，再加入50ml去离子水蒸干，重复蒸干3次，去处多余的盐酸；将干燥的样品溶解于50ml去离子水，上至用0.1M盐酸平衡的Toyopearl SP-650M(5ml)柱，用254nm光吸收检测流出过程。用盐酸溶液(0.01M)冲洗至基线平稳后，用氢氧化钠溶液(0.1M)洗脱，收集吸收峰；再将收集的吸收峰组分上至氢氧化钠溶液(0.1M)Toyopearl Q-650M(5ml)柱，用254nm光吸收检测流出过程。用氢氧化钠溶液(0.001M)冲洗至基线平稳，再用盐酸溶液(0.1M)洗脱，收集吸收峰，减压旋转蒸发除去盐酸得分离材料上合成得配基分子(8mg)，进行HPLC-ESI-MS联用分析。在C18柱，用水：甲醇流动相，检测波长为254nm条件下，在HPLC图谱上主要出现1个主峰(占90％)，70伏电压下进行ESI-MS分析，结果m+/z＝343.1，m+-CO2/z＝299.1；m++CH3/z＝343.1358.2；m++Na/z＝365.1；
三.降纤酶粗品亲和纯化
称取尖吻蝮蛇[Agkistrodon acutus(Guenther)]蛇毒粗品(0.1g)，溶解于10ml磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH 5)，过滤去除不溶物，上样至预先用10倍体积磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH 6)平衡好的装1-氨基Sepharose-3-精氨酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料的层析柱(1×5cm)中，依次用磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH5)洗至280nm光吸收至基线，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(10mM，pH9)洗脱结合的降纤酶，收集后用纤维蛋白原初凝法测定各组分的初凝活性总活性1000单位。
实施例2：
称取尖吻蝮蛇[Agkistrodon acutus(Guenther)]蛇毒粗品(0.1g)，溶解于10ml磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH8)，过滤去除不溶物，上样至预先用10倍体积磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH8)平衡好的装有实施例1步骤一制备的1-氨基Sepharose-3-精氨酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料的层析柱(1×5cm)中，依次用磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH8)洗至280nm光吸收至基线，醋酸钠缓冲液(100mM，pH3)洗脱结合的降纤酶，收集后用纤维蛋白原初凝法测定各组分的初凝活性总活性1200单位。
实施例3：
称取长白山白眉蝮蛇[Agkistrodon halys(ussriensis Emelianor)]蛇毒粗品(0.1g)，溶解于10ml磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH7)，过滤去除不溶物，上样至预先用10倍体积磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH7)平衡好的装有实施例1步骤-制备的1-氨基Sepharose-3-精氨酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料的层析柱(1×5cm)中，依次用磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH7)洗至280nm光吸收至基线，醋酸钠缓冲液(100mM，pH5)洗脱结合的降纤酶，收集后用纤维蛋白原初凝法测定各组分的初凝活性总活性800单位。
实施例4：
称取尖吻蝮蛇[Agkistrodon acutus(Guenther)]蛇毒粗品(0.1g)，溶解于10ml磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH7.5)，过滤去除不溶物，上样至预先用10倍体积磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH7.5)平衡好的装有实施例1步骤一制备的1-氨基Sepharose-3-精氨酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料的层析柱(1×5cm)中，依次用磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH7.5)洗至280nm光吸收至基线，醋酸甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(10mM，pH12)洗脱结合的降纤酶，收集后用纤维蛋白原初凝法测定各组分的初凝活性总活性950单位。
实施例5：
一 亲和纯化
称取尖吻蝮蛇[Agkistrodon acutus(Guenther)]蛇毒粗品(5g)，溶解于10ml磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，1mM EDTA，pH6)，过滤去除不溶物，上样至预先用10倍体积磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，1mM EDTA，pH6)平衡好的装有实施例1步骤一制备的1-氨基Sepharose-3-精氨酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料的层析柱(2.5×20cm)中，依次用磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，1mM EDTA，pH6)洗至280nm光吸收至基线，醋酸甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(10mM，pH10.6)洗脱结合的降纤酶，得降纤酶粗品，收集后用纤维蛋白原初凝法测定各组分的初凝活性总活性70000单位。
二精制
降纤酶粗品，合并调pH至6.8，上至预先用5倍体积的磷酸钠缓冲液(10mM，pH6.8)平衡的Toyopearl DEAE-650M层析柱(2.5×20cm)，用以磷酸钠缓冲液(10mM，pH6.8)和含0.2M NaCl的磷酸钠缓冲液(10mM，pH6.8)梯度洗脱，分步收集洗脱组分，用SDS-PAGE电泳分析纯度和表观分子量，用纤维蛋白原初凝法测定各组分的初凝活性。合并表观分子量为为单一条带，分子量为；永含降纤酶活性的组分，则总活性5万单位。
实施例6：
一 分离材料制备
取Toyopearl NH2-650M(50ml)，依次用5倍体积的1M NaCl，5倍体积蒸馏水充分洗涤后，抽干转移至反应器皿中，加入一定量的冰水，在冰水浴中搅拌下加入冷丙酮溶解的三氯三氮嗪(10g)，用饱和NaHCO3调节反应系统的pH在6～7之间，反应3小时后取出，依次用3×10倍体积的水/丙酮(0∶1，1∶3，1∶1，3∶1，1∶0)洗涤，得到1-氨基-Toyopearl 650M-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(45ml)。
称取精氨酸(10g)用去离子水(30ml)溶解，与1-氨基-650M-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(30ml)混匀，用饱和NaHCO3调节pH在6～7之间，置于温度50℃中搅拌反应24小时。反应结束后，依次用3倍体积的1M NaCl，5倍体积蒸馏水充分洗涤，得到1-Toyopearl 650M-氨基-3-精氨酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪(28ml)，用20％乙醇储存待用。
二 亲和制备
称取长白山白眉蝮蛇[Agkistrodon halys(ussriensis Emelianor)]蛇毒粗品(0.1g)，溶解于10ml磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，0.2M NaCl，pH8)，过滤去除不溶物，上样至预先用10倍体积磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，0.2M NaCl，pH8)平衡好的装有实施例6步骤一制备的1-Toyopearl 650M-氨基-3-精氨酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料的层析柱(1×5cm)中，依次用磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，0.2MNaCl，pH8)洗至280nm光吸收至基线，醋酸钠缓冲液(100mM，pH3)洗脱结合的降纤酶，收集后用纤维蛋白原初凝法测定各组分的初凝活性总活性1200单位。
实施例7：
称取尖吻蝮蛇[Agkistrodon acutus(Guenther)]蛇毒粗品(0.1g)，溶解于10ml磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH7)，过滤去除不溶物，上样至预先用10倍体积磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH7)平衡好的装有实施例6步骤一制备的1-Toyopearl 650M-氨基-3-精氨酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料的层析柱(1×5cm)中，依次用磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH7)洗至280nm光吸收至基线，缓冲液(100mM醋酸钠，0.2M NaC，pH5，)洗脱结合的降纤酶，收集后用纤维蛋白原初凝法测定各组分的初凝活性总活性850单位。
实施例8：
称取尖吻蝮蛇[Agkistrodon acutus(Guenther)]蛇毒粗品(0.1g)，溶解于10ml磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH7.5)，过滤去除不溶物，上样至预先用10倍体积磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH7.5)平衡好的装有1-Toyopear1 650M-氨基-3-精氨酸-5-氯-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料的层析柱(1×5cm)中，依次用磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，pH7.5)洗至280nm光吸收至基线，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(10mM，甘氨酸，pH12)洗脱结合的降纤酶，收集后用纤维蛋白原初凝法测定各组分的初凝活性总活性1050单位。
实施例9：
一亲和制备降纤酶粗品
称取长白山白眉蝮蛇[Agkistrodon halys(ussriensis Emelianor)]蛇毒粗品(6g)，溶解于100ml磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，1mM EDTA，pH6)，过滤去除不溶物，上样至预先用5倍体积磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，1mM EDTA，pH6)平衡好的装1-Toyopearl 650M-氨基--3，5二氯-2，4，6-三氮嗪亲和分离材料的层析柱(2.5×15cm)中，依次用磷酸钠缓冲液(10mM磷酸钠，1mM EDTA，pH6)洗至280nm光吸收至基线，甘氨酸-氢氧化钠钠缓冲液(10mM甘氨酸，0.5M NaCl，pH10.6)洗脱结合的降纤酶，分步收集280nm各吸收组分，用纤维蛋白原初凝法测定各组分的初凝活性，合并具有初凝活性的各组分(总活性7万单位)。
二用弱阴离子交换层析精制降纤酶
降纤酶粗品，合并调pH至6.8，上至预先用5倍体积的磷酸钠缓冲液(10mM，pH6.8)平衡的DEAE-Sepharose FF层析柱(2.5×20cm)，用以磷酸钠缓冲液(10mM，pH6.8)和含0.2M NaCl的磷酸钠缓冲液(10mM，pH6.8)梯度洗脱，分步收集洗脱组分，用SDS-PAGE电泳分析纯度和表观分子量，用纤维蛋白原初凝法测定各组分的初凝活性。合并表观分子量为为单一条带，分子量为；降纤酶总活性5万单位，
应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，如起始材料NH2-Sepharose可以更换成葡聚糖凝胶、交联的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚物、琼脂糖凝胶、琼脂糖与葡聚糖的交联共聚物、聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物珠、纤维素珠和涂有化学活性基团的硅胶等，这些等价形式同样落于本发明的范围。

Claims (5)

1、一种降纤酶的亲和分离材料和降纤酶的亲和的纯化方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1)仿生亲和分离材料结构是在基础层析介质上通过三氮嗪骨架作为间臂固定精氨酸；
(2)用制备的仿生亲和分离材料纯化降纤酶粗品；
(3)用离子交换层析精制得降纤酶精品。
2、根据权利要求1所述的降纤酶的亲和分离材料和降纤酶的亲和的纯化方法，其特征是，步骤(1)中，基础层析介质是葡聚糖凝胶、交联的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚物、琼脂糖凝胶、琼脂糖与葡聚糖的交联共聚物、聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物珠、纤维素珠和涂有化学活性基团的硅胶中的一种。
3、根据权利要求1所述的降纤酶的亲和分离材料和降纤酶的亲和的纯化方法，其特征是，在步骤(2)中，亲和介质吸附降纤酶的条件为为pH5-8，离子强度为0.0-0.5M的缓冲液；洗脱条件为pH1.0-4.0或pH10-12，离子强度为0-0.5M的缓冲液。
4、根据权利要求1所述的降纤酶的亲和分离材料和降纤酶的亲和的纯化方法，其特征是，所述的仿生亲和分离材料，其合成的配体中含有三氮嗪；其合成的配体中含有精氨酸的结构。
5、根据权利要求1所述的降纤酶的亲和分离材料和降纤酶的亲和的纯化方法，其特征是，所述的降纤酶，其原料为尖吻蝮蛇蛇毒或者长白山白眉蝮蛇蛇毒。
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