CN1250718C - 蝰蛇蛇毒血凝酶的层析纯化方法 - Google Patents
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Abstract
注射用蛇毒血凝酶的纯化工艺包括：蛇毒的溶解，亲和层析分离得到类凝血酶和类凝血激酶的粗溶液，超滤浓缩，离子交换层析纯化得到类凝血酶和类凝血激酶的纯溶液，超滤浓缩，凝胶层析获得类凝血酶和类凝血激酶的精纯溶液，最后将上述类凝血酶和类凝血激酶的精纯溶液按一定比例混合后，加入适量的赋形剂、稳定剂，经过滤、灌装、冷冻干燥、轧盖，最终获得注射用蛇毒血凝酶成品等工艺。本工艺采用专一性吸附剂，可以一次性地快速完成大量酶溶液的粗提制备工作，并能最大程度地收集到粗品中的有效成份，且生物活性高。所得注射用蛇毒血凝酶经动物药效学实验，全血凝血时间明显缩短，肝脏切口的失血量明显减少，多种毒素测定结果均为阴性。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用生化手段制备药物的方法，尤其涉及到一种采用层析法分离纯化一种具有止血功能的酶溶液——蛇毒血凝酶的生产工艺。
背景技术
立止血(Reptilase)又名巴特罗酶(Batroxobin)，1936年由奥地利学者Klobusitzky第一个成功地从巴西矛头蝮蛇(Bothopsatrox)的毒液中分离纯化精制而得，是一种以止血作用为主的酶制剂，经数十年的临床应用，证明了该药具有显著的止血功能。目前世界上生产该药的国家有瑞士、法国、瑞典、日本等，他们所用的原料均从巴西进口，同时引进相应的酶纯化技术。我国用的立止血(Reptilase)粉针是于1989年从瑞士Solco Basle Ltd公司进口的，仅此一项每年需花费几百万美元。
Walter Kisiel，Mark A.Hermodson和Earl W.Davie等于1976年用凝胶(Sephadex G-150)过滤及强阴离子交换剂(QAE-Sephadex A-50)柱层析，从蝰蛇蛇毒(Russell’s Viper Venom)中分离纯化得到类凝血激酶(Xa因子激活物)，在未添加β巯基乙醇情况下采用7.5％的凝胶电泳，测得其全分子量约为90000道尔顿，采用10％的凝胶电泳，测得其全分子量为79000道尔顿；在添加β巯基乙醇情况下，采用7.5％的凝胶电泳，测得其重链分子量约为67000道尔顿，轻链分子量约为19000道尔顿，采用10％的凝胶电泳，测得其重链分子量约为59000道尔顿，轻链分子量约为20000和18000道尔顿，该产品一直未见上市。此工艺中采用的凝胶及强阴离子交换剂均为80年代的产品，由于其局限性(软胶、流速慢、周期长、处理繁琐、载样量小)，逐渐被新一代Bioprocess凝胶所替代。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的使用层析法纯化注射用蛇毒血凝酶的生产工艺，原料是广东、广西、福建等地产的蝰蛇蛇毒。该产品由两种组份组成：一种是蝰蛇类凝血酶，一种是蝰蛇类凝血激酶，两种酶按一定比例混合后所得到的混合液，每毫升含有一个克氏单位的血凝酶活性，同进口的立止血药品成份一致，具有同等功效。经动物药效学实验证明，该产品具有缩短流血时间、减少失血量、加速止血的作用。
本发明提供了一种具有高分辨率、高载量、专一性吸附的层析纯化方法，纯化工艺如下：
(1)将蝰蛇蛇毒用pH7.0～9.0的0.01～0.1mol/L的tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液溶解，离心去除沉淀。
(2)用两种不同配体的高分辨率、高载量、专一性的吸附剂进行亲和层析，再用pH7.0～9.0的0.0l～0.05mol/L的tris-HCl缓冲液和NaCl溶液线性梯度洗脱，纯化得到类凝血酶和类凝血激酶的粗溶液。
(3)超滤浓缩类凝血酶和类凝血激酶的粗溶液，置冰箱中保存。
(4)将所得类凝血酶和类凝血激酶的粗溶液分别经过阴离子交换柱层析，用pH7.0～9.0的tris-HCl缓冲液和NaCl溶液线性梯度洗脱，纯化得到类凝血酶和类凝血激酶的纯溶液。
(5)超滤浓缩类凝血酶和类凝血激酶的粗溶液，置冰箱中保存。
(6)将所得类凝血酶和类凝血激酶的纯溶液分别经过凝胶过滤柱层析，用pH7.0～9.0的tris-HCl缓冲液(含0.15mol/L的NaCl溶液)洗脱，得到类凝血酶和类凝血激酶的精纯溶液。
(7)将所得类凝血酶和类凝血激酶的精纯溶液按一定比例混合后得到混合液，每毫升含有1个克氏单位的血凝酶活性，再加入适量的赋形剂、稳定剂进行过滤、灌装、冷冻干燥、轧盖，即获得注射用蛇毒血凝酶成品。
在上述工艺中，类凝血酶的纯化采用的亲和层析吸附剂较佳地是苯甲脒(Benzamidine Sepharose 6B)，所用缓冲液的浓度是0.01～0.05mol/L，NaCl溶液的梯度是0～0.6mol/L；类凝血激酶纯化采用的亲和层析吸附剂是肝素(Heparin Sepharose CL-6B)，所用缓冲液的浓度是0.03～0.08mol/L，NaCl溶液的梯度是0.1～1.0mol/L。
本工艺的优点是：
1)本工艺由于采用高分辨率、高载量、专一性吸附剂，所以在第一步粗分时，可以一次性快速地完成大量的酶溶液粗提制备工作，避免反复上样，为下一步层析节约了大量的时间。
2)本工艺由于采用专一性吸附剂，所以能最大程度地收集到粗品中的有效成份，且生物活性高。
3)所得蛇毒血凝酶经动物药效学实验，0.1～0.2单位/kg的剂量即能使家兔全血凝血时间与用药前相比缩短1/3～1/2，与阳性药品立止血相比，效果相当。
4)所得蛇毒血凝酶经动物药效学实验，0.1～0.2单位/kg的剂量即能使家兔肝脏切口失血量与用药前相比减少了53.84～58.33％，出血时间与用药前相比缩短了43.5～51.5％，与阳性药品立止血相比，效果相当。
5)所得蛇毒血凝酶经出血毒测定，100单位的剂量注射于小白鼠皮下，小白鼠无出血现象。
6)所得蛇毒血凝酶经其它几种毒素测定，如磷脂酶A2、碱性磷酸酶、L—氨基酸氧化酶等的活性测定均为阴性。由此证明，该产品完全可以替代进口立止血，且安全、高效、价格低廉。
7)本工艺采用的亲和层析吸附剂可反复使用，不需作特殊处理，每次在上新样品时，只需用上述缓冲液平衡即可。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明作进一步的解释，但是本发明并不仅仅局限于这些实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。本领域的技术人员在权利要求的范围内所作出的某些改变和调整也应认为属于本发明的范围。
实施例1
1.1类凝血酶工艺
(1)粗毒的溶解：称取蝰蛇毒5克，溶于30毫升浓度为0.02mol/L、pH8.0的tris-HCl缓冲液中，置4℃冰箱内过夜，自然溶解，次日离心。离心转速为4000rpm，离心时间为10分钟，收集上清液待用。
(2)装柱：取直径为5.0×30cm的玻璃柱一根，用0.02mol/L、pH8.0的tris-HCl缓冲液平衡好的苯甲脒(Benzamidine Sepharose 6B)亲和层析吸附剂装柱，再用0.02mol/L、pH8.0的tris-HCl缓冲液洗脱平衡。
(3)上样、洗脱：取步骤(1)中粗毒溶解后所得的上清液上样于步骤(2)中已平衡的柱内，进行线性梯度洗脱。洗脱液贮瓶内为8000毫升0.02mol/L、pH8.0的tris-HCl缓冲液(内含0.6mol/L的NaCl溶液)，梯度瓶内为8000毫升0.02mol/L、pH8.0的tris-HCl缓冲液。起始为慢流速，每小时60毫升，在280nm波长处检测吸收值。上样5小时后，改为每小时300毫升，洗脱液用自动部分收集器收集，每小时收集12管，每管25毫升，洗脱曲线含6个蛋白峰，其中第6峰为类凝血酶活性峰，收集类凝血酶粗品溶液600毫升，含蛋白量350毫克。
(4)超滤浓缩：将步骤(3)收集的类凝血酶粗品溶液用截留分子量为1万的滤膜进行超滤，浓缩至体积为100毫升左右，置4℃冰箱内保存。
(5)DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析：将步骤(4)浓缩的酶溶液上样于已用0.02mol/L、pH8.2的tris-HCl缓冲液平衡好的阴离子交换柱内(柱子直径为5.0×60cm)，进行双向梯度洗脱。洗脱液贮瓶内为10000毫升0.02mol/L、pH6.0的tris-HCl缓冲液(内含0.5mol/L的NaCl溶液)，梯度瓶内为10000毫升0.02mol/L、pH8.2的tris-HCl缓冲液。洗脱流速每小时为480毫升，在280nm波长处检测吸收值。上样5小时后，洗脱液用自动部分收集器收集，每小时收集20管，每管24毫升，经纯化获得类凝血酶纯品溶液800毫升，含蛋白量180毫克。
(6)超滤浓缩：将步骤(5)收集的类凝血酶纯品溶液用截留分子量为1万的滤膜进行超滤，浓缩至体积为50毫升左右，置4℃冰箱内保存。
(7)Sephacryl-100HR凝胶柱层析：将步骤(6)浓缩的酶溶液上样于已用0.02mol/L、pH7.6的tris-HCl缓冲液(内含0.15mol/L NaCl溶液)平衡好的凝胶柱内(柱子直径为3.0×80cm)，进行层析。流速为每小时60毫升，经进一步纯化，得精纯的类凝血酶溶液120毫升，含蛋白量150毫克。
(8)纯度测定：取精纯的类凝血酶溶液适量，经SDS-PAGE电泳，测得其分子量为36000±5000，纯度为单一组份。
1.2类凝血激酶工艺
(1)粗毒的溶解：称取蝰蛇毒5克，溶于0.05mol/L、pH9.0的tris-HCl的缓冲液30毫升中，置4℃冰箱内过夜，自然溶解，次日离心。离心时转速为4000rpm，离心时间为10分钟，收集上清液待用。
(2)装柱：取直径为5.0×30cm的玻璃柱一根，用0.05mol/L、pH9.0的tris-HCl缓冲液平衡好的肝素(Heparin Sepharose CL-6B)亲和层析吸附剂装柱，再用0.05mol/L、pH9.0的tris-HCl缓冲液洗脱平衡。
(3)Heparin Sepharose CL-6B亲和层析：取步骤(1)中粗毒溶解后所得的上清液上样于步骤(2)中已平衡好的亲和层析柱内，进行线性梯度洗脱。洗脱液贮瓶内为8000毫升0.05mol/L、pH9.0的tris-HCl缓冲液(内含0.45mol/L的NaCl溶液)；梯度瓶内为8000毫升0.05mol/L、pH9.0的tris-HCl缓冲液。起始流速为慢流速，每小时60毫升，在280nm波长处检测吸收值。上样5小时后，改为每小时300毫升。洗脱液用自动部分收集器收集，每小时收集12管，每管25毫升。洗脱曲线含7个蛋白峰，其中第3峰与第4峰之间的峰谷为活性组分。收集类凝血激酶粗品溶液550毫升，含蛋白量240毫克。
(4)超滤浓缩：将步骤(3)的类凝血激酶粗品溶液用截留分子量为1万的滤膜进行超滤，浓缩至体积为100毫升左右，置4℃冰箱内保存。
(5)DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析：将步骤(4)浓缩的酶溶液上样于已用0.05mol/L、pH8.4的tris-HCl的缓冲液平衡好的阴离子交换柱内(柱子直径为5.0×60cm)，进行线性梯度洗脱。洗脱液贮瓶内为10000毫升0.05mol/L、pH8.4的tris-HCl缓冲液(内含0.55mol/L的NaCl溶液)，梯度瓶内为10000毫升0.05mol/L、pH8.4的tris-HCl缓冲液。流速为每小时480毫升，在280nm波长处检测吸收值。上样5小时后，洗脱液用自动部分收集器收集，每小时收集20管，每管24毫升。经纯化获得类凝血激酶纯品溶液650毫升，含蛋白量为80毫克。
(6)超滤浓缩：将步骤(5)的类凝血激酶纯品溶液用截留分子量为1万的滤膜进行超滤，浓缩至体积为50毫升左右，置4℃冰箱内保存。
(7)Sephacryl-300HR凝胶柱层析：将(6)浓缩的酶溶液上样于已用0.02mol/L、pH7.6的tris-HCl缓冲液(内含0.15mol/L的NaCl溶液)平衡好的凝胶柱上进一步纯化。柱子直径为2.6×60cm，流速为每小时0.5毫升，获得精纯类凝血激酶溶液80毫升，含蛋白量50毫克。
1.3凝结活性的测定
注射用蛇毒血凝酶含有两种组份：类凝血酶和类凝血激酶。类凝血酶活性每毫克不得少于1500IU(国际单位)或1200BU凝血酶活性，类凝血激酶活性每毫克不得少于150IU(国际单位)或500KU。两种酶按一定比例混合后所得的溶液，每毫升含有1个克氏单位的血凝酶活性，然后加入适量的赋形剂、稳定剂，进行过滤、灌装、冷冻干燥、轧盖，即得注射用蛇毒血凝酶成品。
1.4药效学研究
为了研究注射用蛇毒血凝酶对动物体内、外血液凝血和纤溶功能的影响，进行了动物药效学试验。研究单位是1986年被国家卫生部确定的新药临床研究基地—安徽医科大学药理教研室。研究结果表明，注射用蛇毒血凝酶可以明显减少家兔肝脏切口失血量，缩短出血时间，并可明显缩短全血凝血时间(CT)，具体参数见表1：
表1：同等剂量注射用蛇毒血凝酶与立止血(Reptilase)动物药效学比较
注：与用药前相比，*P＜0.05 **P＜0.01
实施例2
2.1类凝血酶工艺
除了在步骤(1)中是取蝰蛇毒5克，溶于0.01mol/L、pH8.5的磷酸盐缓冲液中外，其它操作方法与实施例1相同，其中的亲和层析吸附剂苯甲脒(Benzamidine Sepharose 6B)、阴离子交换剂(DEAE-SepharoseFast Flow)及凝胶(Sephacryl-100HR)均为实例1所用的，经用磷酸盐缓冲液重新洗脱平衡，即可上样。经分离纯化得到类凝血酶溶液550毫升，含蛋白量275毫克。
2.2类凝血激酶工艺
除了在步骤(1)中是取蝰蛇毒5克，溶于0.07mol/L、pH8.8的磷酸盐缓冲液中外，其它操作方法与实施例1相同，其中亲和层析吸附剂肝素(Heparin Sepharose CL-6B)、阴离子交换剂(DEAE-Sepharose Fast Flow)及凝胶(Sephacl-300HR)均为实例1所用的，经用磷酸盐缓冲液重新洗脱平衡，即可上样。经分离纯化得到类凝血激酶溶液520毫升，含蛋白量200毫克。
2.3凝结活性测定与动物药效学实验
该批使用磷酸盐缓冲液纯化的酶溶液，经凝结活性测定及动物药效学实验均符合临床用药的质量标准。
Claims (9)
1.一种注射用蛇毒血凝酶的层析纯化方法，其步骤包括：
(1)将蝰蛇蛇毒用缓冲液溶解，离心去除沉淀；
(2)将(1)中所得上清液用苯甲脒进行亲和层析，再用pH 7.0～9.0的tris-HCl缓冲液和NaCl溶液线性梯度洗脱，得到类凝血酶的粗溶液；
(3)将(1)中所得上清液用肝素进行亲和层析，再用pH 7.0～9.0的tris-HCl缓冲液和NaCl溶液线性梯度洗脱，得到类凝血激酶的粗溶液；
(4)浓缩类凝血酶和类凝血激酶的粗溶液，将所得类凝血酶和类凝血激酶的粗溶液分别经过阴离子交换柱层析，用pH 7.0～9.0的tris-HCl缓冲液和NaCl溶液线性梯度洗脱，纯化得到类凝血酶和类凝血激酶的纯溶液；
(5)浓缩类凝血酶和类凝血激酶的纯溶液，将所得类凝血酶和类凝血激酶的纯溶液分别经过凝胶过滤柱层析，用pH 7.0～9.0的tris-HCl缓冲液洗脱，得到类凝血酶和类凝血激酶的精纯溶液；
(6)将所得类凝血酶和类凝血激酶的精纯溶液按一定比例混合后得到混合液，每毫升含有1个克氏单位的血凝酶活性，再加入适量的赋形剂、稳定剂进行过滤、灌装、冷冻干燥、轧盖，即获得注射用蛇毒血凝酶成品。
2.根据权利要求1所述的蛇毒血凝酶的层析纯化方法，其特征在于步骤(1)所述的缓冲液是pH 7.0～9.0、浓度为0.01～0.1mol/L的tris-HCl缓冲液或者磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1所述的蛇毒血凝酶的层析纯化方法，其特征在于步骤(2)中所述苯甲脒是Benzamidine Sepharose 6B，所用缓冲液是浓度为0.01～0.05mol/L的tris-HCl缓冲液，NaCl溶液的梯度是0～0.6mol/L。
4.根据权利要求l所述的蛇毒血凝酶的层析纯化方法，其特征在于步骤(3)中所述肝素是Heparin Sepharose CL-6B，所用缓冲液是0.03～0.08mol/L的tris-HCl缓冲液，NaCl溶液的梯度是0.1～1.0mol/L。
5.根据权利要求1所述的蛇毒血凝酶的层析纯化方法，其特征在于步骤(4)或者步骤(5)所采用的浓缩方法是超滤。
6.根据权利要求5所述的蛇毒血凝酶的层析纯化方法，其特征在于所述超滤使用的滤膜的截留分子量为1万。
7.根据权利要求1所述的蛇毒血凝酶的层析纯化方法，其特征在于步骤(4)所述的阴离子交换柱层析采用的交换剂是DEAE-Sepharose Fast Flow。
8.根据权利要求1所述的蛇毒血凝酶的层析纯化方法，其特征在于步骤(4)所述的类凝血酶洗脱工序采用的是双向梯度洗脱，即缓冲液pH梯度与NaCl线性梯度。
9.根据权利要求1所述的蛇毒血凝酶的层析纯化方法，其特征在于步骤(5)所述的tris-HCl缓冲液中含有浓度为0.15mol/L的NaCl。
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