CN100355885C - 一种从蛇毒中提取单一成份降纤酶的方法 - Google Patents
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Abstract
一种从蛇毒中提取具有降纤溶栓作用的降纤酶的方法，属于医药技术领域。步骤包括如下：蛇毒经浸泡溶解、离心；上清液经亲和柱层析；洗脱液直接流经葡聚糖凝胶G25脱盐层析；含有效成分的洗脱液经包埋、浓缩；浓缩样品再经分子筛层析，即可得到单一成分的降纤酶。本方法具有适合规模化生产、操作简便、生产周期短、产品纯度高等特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种从蛇毒中提取具有降纤溶栓作用的降纤酶的方法，属于医药技术领域。
背景技术
蛇毒中含有丰富的蛋白水解酶，主要有两类，一类是蛇毒类凝血酶，在体外引起血液的凝固，在体内却是去纤抗凝的成分；另一类是蛇毒纤溶酶，可直接降解血纤维，大部分也能降解纤维蛋白原。蛇毒类凝血酶是研究较早、并已在临床上广泛应用的一类酶。
蛇毒类凝血酶作为药物用于治疗血栓性疾病已有30多年的历史，在临床上主要用于脑梗塞、血栓闭塞性脉管炎、股动脉栓塞、肺栓塞等血管栓塞性疾病。
天然蛇毒中提取的类凝血酶绝大多数为酸性蛋白质，多采用阴离子交换柱进行分离，并结合凝胶过滤、亲和层析和反相液相色谱等方法纯化。常用的阴离子交换剂有：DEAE-葡聚糖凝胶、DEAE-纤维素、肝素-葡聚糖凝胶等。但离子交换法特异性不高，产品纯度低。而亲和层析具有专一性高，操作简便，工艺周期短，收率高，纯度好等特点，对分离某些不稳定的高分子物质，更具优越性。亲和层析用于从天然蛇毒中分离纯化类凝血酶，主要运用的是酶与竞争剂特异性相互作用的原理。国内外虽有利用胰蛋白酶的抑制剂苯甲脒作为类凝血酶的抑制剂，进行亲和分离蛇毒类凝血酶的报道，但其分离柱条件、分离过程以及工艺技术参数或无具体描述，或描述较笼统，因而无法实施，从而很难达到理想的分离制备要求，取得单一成份产品，实现规模化的生产目的。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种从蛇毒中提取具有降纤溶栓作用的降纤酶的方法。取得比活力较高的单一成分产品降纤酶，使降纤酶的生产实现规模化。
本发明的从蛇毒中提取单一成份降纤酶的方法，步骤包括：
(1)蛇毒用缓冲液浸泡、溶解过夜，离心去除沉淀，得上清液；
(2)蛇毒上清液经亲和柱层析，上样结束后，用pH8.5～9.5含2.0～2.5M NaCL的Tris-HCL缓冲液I进行洗脱，至核酸蛋白检测仪读数达到基线后，再用pH8.5～9.5含0.1～0.5M NaCL和0.1～0.2M苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL缓冲液II洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得降纤酶粗提液；
(3)降纤酶粗提液直接流经脱盐柱，去除苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)；
(4)去除苯甲脒酸盐的降纤酶粗提液用聚乙二醇20000(PEG20000)包埋、浓缩，得降纤酶粗提液的浓缩液；
(5)降纤酶粗提液的浓缩液经分子筛柱层析，即得单一组份降纤酶；
上述提取分离的全过程均在3～6℃的低温层析冷柜或冷室中进行。
上述步骤(1)中所述的缓冲液是pH8.5～9.5含0.1～0.5M NaCL的Tris-HCL缓冲液。
上述步骤(2)中所述亲和柱是苯甲脒琼脂糖凝胶6B(Benzamidine Sepharose 6B)或苯甲脒琼脂糖凝胶4B(Benzamidine Sepharose 4B)亲和柱；
上述步骤(2)中在缓冲液II洗脱前还需用pH8.5～9.5含0.1～0.5M NaCL的Tris-HCL缓冲液进行过渡洗脱。
上述步骤(3)中所述的脱盐柱是葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)脱盐柱；
上述步骤(2)中的亲和层析柱和步骤(3)中的脱盐柱在样品洗脱过程中是串联在一起的。
上述步骤(4)中PEG2000包埋浓缩前的降纤酶粗提液还需用超纯水透析至少三次，以进一步除去残存的苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)。
上述步骤(5)中所述的分子筛是丙烯葡聚糖凝胶S200(Sephacryl S200)或丙烯葡聚糖凝胶S100(Sephacryl S100)层析用分子筛。
上述步骤(5)中层析用的缓冲液为pH6.5～7.5含0.05～0.15M NaCL的Tris-HCL缓冲液。
本发明的方法是以苯甲脒为配基的琼脂糖凝胶亲和介质联合葡聚糖凝胶G25脱盐、丙烯葡聚糖凝胶S200或丙烯葡聚糖凝胶S100分子筛层析进行单一成份降纤酶的纯化提取方法。与现有技术相比本发明的优良效果如下：
1.本发明工艺设计合理，亲和层析介质易得，可重复使用100次以上；
2.操作过程简单，分离周期短，分离效果好，样品纯度高；
3.一次处理蛇毒量大，适合规模化工业生产。
本发明降纤酶提取方法与其它亲和层析提取方法的比较如下：
| 苯甲脒亲和层析(本发明) | 多糖配基亲和层析 | 单克隆抗体亲和层析 | |
| 蛇毒处理量 | 30g～50g | 5g | 20g |
| 提取周期 | 7天 | 15天 | 7天 |
| 原料收率 | 40％ | 30％ | - |
| 原料纯度 | ＞95％ | ＞90％ | ＞95％ |
| 比活力 | ＞2800U/mg蛋白 | ＞1200U/mg蛋白 | ＞1800U/mg蛋白 |
具体实施方式
实施例1：
从蛇毒中提取降纤酶的方法包括下述步骤：
1、取白眉蝮蛇毒30g，溶于200ml pH8.6含0.2M NaCL的Tris-HCL缓冲液中，于4℃冰箱中浸泡溶解，过夜，8000rpm离心10min，去除沉淀，收集蛇毒上清液；
2、苯甲脒琼脂糖凝胶6B(Benzamidine Sepharose 6B)亲和层析柱(2.6cm×30cm)用pH8.6含0.2M NaCL的Tris-HCL缓冲液至少平衡5个柱体积，将上述蛇毒上清液上柱，控制流速0.3ml/min，上样结束后柱子用200ml缓冲液平衡；
3、用pH8.6含2.0M NaCL的Tris-HCL缓冲液进行洗脱，至核酸蛋白检测仪读数达到基线，改用200ml pH8.6含0.2M NaCL的Tris-HCL缓冲液进行过渡洗脱；
4、将亲和层析柱与葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)脱盐柱(1.6cm×100cm)连接，用pH8.6含0.2M NaCL和0.12M苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得降纤酶粗提液；
5、降纤酶粗提液用超纯水透析三次后，经PEG20000包埋、浓缩至约3ml，上丙烯葡聚糖凝胶S200(Sephacryl S200)分子筛层析柱(1.6cm×100cm)，用pH6.8含0.1M NaCL的Tris-HCL缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得到单一成份的降纤酶。检测纯度为98％，比活力为2860U/mg蛋白。
实施例2：
从蛇毒中提取降纤酶的方法包括下述步骤：
1、取尖吻蝮蛇毒50g，溶于300ml pH9.0含0.1M NaCL的Tris-HCL缓冲液中，于4℃冰箱中浸泡溶解，过夜，8000rpm离心10min，去除沉淀，收集蛇毒上清液；
2、苯甲脒琼脂糖凝胶6B(Benzamidine Sepharose 6B)亲和层析柱(2.6cm×30cm)用pH9.0含0.1M NaCL的Tris-HCL缓冲液至少平衡5个柱体积，将上述蛇毒上清液上柱，控制流速0.3ml/min，上样结束后柱子用200ml缓冲液平衡；
3、用pH9.0含2.25M NaCL的Tris-HCL缓冲液进行洗脱，至核酸蛋白检测仪读数达到基线，改用200ml pH9.0含0.1M NaCL的Tris-HCL缓冲液进行过渡洗脱；
4、将亲和层析柱与葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)脱盐柱(1.6cm×100cm)连接，用pH9.0含0.1M NaCL和0.15M苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得降纤酶粗提液；
5、降纤酶粗提液用超纯水透析三次后，经PEG20000包埋、浓缩至约5ml，上丙烯葡聚糖凝胶S200(Sephacryl S200)分子筛层析柱(1.6cm×100cm)，用pH7.2含0.1M NaCL的Tris-HCL缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得到单一成份的降纤酶。检测纯度为96％，比活力为2960U/mg蛋白。
实施例3：
从蛇毒中提取降纤酶的方法包括下述步骤：
1、取白眉蝮蛇毒或尖吻蝮蛇毒50g，溶于300ml pH9.0含0.3M NaCL的Tris-HCL缓冲液中，于4℃冰箱中浸泡溶解，过夜，8000rpm离心10min，去除沉淀，收集蛇毒上清液；
2、苯甲脒琼脂糖凝胶4B(Benzamidine Sepharose 4B)亲和层析柱(2.6cm×30cm)用pH9.0含0.1M NaCL的Tris-HCL缓冲液至少平衡5个柱体积，将上述蛇毒上清液上柱，控制流速0.3ml/min，上样结束后柱子用200ml缓冲液平衡；
3、用pH9.0含2.25M NaCL的Tris-HCL缓冲液进行洗脱，至核酸蛋白检测仪读数达到基线，改用200ml pH9.0含0.3M NaCL的Tris-HCL缓冲液进行过渡洗脱；
4、将亲和层析柱与葡聚糖凝胶G25(Sephadex G25)脱盐柱(1.6cm×100cm)连接，用pH9.0含0.3M NaCL和0.15M苯甲脒盐酸盐(Benzamidine·HCL)的Tris-HCL缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得降纤酶粗提液；
5、降纤酶粗提液用超纯水透析三次后，经PEG20000包埋、浓缩至约5ml，上丙烯葡聚糖凝胶S100(Sephacryl 100)分子筛层析柱(1.6cm×100cm)，用pH7.4含0.1MNaCL的Tris-HCL缓冲液洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得到单一成份的降纤酶。检测纯度为97％，比活力为2910U/mg蛋白。
Claims (8)
1、从蛇毒中提取单一成份降纤酶的方法，步骤包括：
(1)蛇毒用缓冲液浸泡、溶解过夜，离心去除沉淀，得上清液；
(2)蛇毒上清液经苯甲脒琼脂糖凝胶亲和柱层析，上样结束后，用pH8.5～9.5含2.0～2.5M NaCL的Tris-HCL缓冲液I进行洗脱，至核酸蛋白检测仪读数达到基线后，再用pH8.5～9.5含0.1～0.5M NaCL和0.1～0.2M苯甲脒盐酸盐的Tris-HCL缓冲液II洗脱，核酸蛋白检测仪检测样品峰，收集得降纤酶粗提液；
(3)降纤酶粗提液直接流经与亲和层析柱串联在一起的脱盐柱，去除苯甲脒盐酸盐；
(4)去除苯甲脒酸盐的降纤酶粗提液用聚乙二醇20000包埋、浓缩，得降纤酶粗提液的浓缩液；
(5)降纤酶粗提液的浓缩液经丙烯葡聚糖凝胶分子筛柱层析，即得单一组份降纤酶；
上述提取分离的全过程均在3～6℃的低温层析冷柜或冷室中进行。
2、根据权利要求1所述的从蛇毒中提取单一成份降纤酶的方法，其特征在于所述步骤(1)中所述的缓冲液是pH8.5～9.5含0.1～0.5M NaCL的Tris-HCL缓冲液。
3、根据权利要求1所述的从蛇毒中提取单一成份降纤酶的方法，其特征在于所述步骤(2)中所述苯甲脒琼脂糖凝胶亲和柱是苯甲脒琼脂糖凝胶6B或苯甲脒琼脂糖凝胶4B亲和柱。
4、根据权利要求1所述的从蛇毒中提取单一成份降纤酶的方法，其特征在于所述步骤(2)中在缓冲液II洗脱前还需用pH8.5～9.5含0.1～0.5M NaCL的Tris-HCL缓冲液进行过渡洗脱。
5、根据权利要求1所述的从蛇毒中提取单一成份降纤酶的方法，其特征在于所述步骤(3)中所述的脱盐柱是葡聚糖凝胶G25脱盐柱。
6、根据权利要求1所述的从蛇毒中提取单一成份降纤酶的方法，其特征在于所述(4)中聚乙二醇20000包埋浓缩前的降纤酶粗提液还需用超纯水透析至少三次，以进一步除去残存的苯甲脒盐酸盐。
7、根据权利要求1所述的从蛇毒中提取单一成份降纤酶的方法，其特征在于所述步骤(5)中所述的丙烯葡聚糖凝胶分子筛是丙烯葡聚糖凝胶S200或丙烯葡聚糖凝胶S100层析用分子筛。
8、根据权利要求1所述的从蛇毒中提取单一成份降纤酶的方法，其特征在于所述步骤(5)中层析用的缓冲液为pH6.5～7.5含0.05～0.15MNaCL的Tris-HCL缓冲液。
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