CN1189559C - 一种从蛇毒中分离纯化类凝血酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从蛇毒中分离纯化类凝血酶的方法，采用阳离子交换层析、阴离子交换层析和凝胶排阻层析三步法从蛇毒中分离纯化类凝血酶，在带有梯度洗脱并能同时显示紫外和电导参数装置的高、中、低压层析仪上进行；活性测定参照胰蛋白酶测定法，用BAEE作底物。本发明可以方便、快速地从蛇毒中提取类凝血酶，其纯度和生物活性均可达到药用标准。与传统方法相比较，本发明生产工艺简单，回收率高，活性损失小，并可几乎线性放大到工业化规模生产。
Description
技术领域
本发明属于生物、医药提取技术，涉及一种从蛇毒中分离纯化类凝血酶的方法，具体地说，是一种采用阳离子交换层析、阴离子交换层析和凝胶排阻层析三步法从蛇毒中提取类凝血酶的方法。
背景技术
一些蛇毒中含有丰富的蛋白水解酶，这些蛋白水解酶按其底物专一性可分为两类，一类为含金属的蛋白酶，它们往往与蛇伤后组织的出血、坏死等有关；另一类为丝氨酸蛋白酶，其底物专一性强，不作用于一般蛋白，只作用于体内特定蛋白底物中的特定肽键。据报道，在我国浙江产蝮蛇蛇毒中含有三种具有丝氨蛋白酶活性的蛋白水解酶，它们分别是激肽释放酶、类溶血纤维酶和类凝血酶[1]。其中的类凝血酶特别引起人们的重视，这不仅因为它的丝氨酸蛋白酶活性高(类凝血酶在这三种酶中活性最高，约占总酶活性的60％)，更重要的是它与凝血系统关系非常密切。类凝血酶在体外起凝血作用，可不通过体内各种凝血因子，直接作用于纤维蛋白原使之凝聚，但在体内由于不断降解纤维蛋白原，造成低凝状态。由它水解而成的纤维蛋白凝块，由于没有侧链交联，易被纤维蛋白溶酶降解，因而表现为抗凝作用[2]。又因它不凝集血小板，故机体仍能维持正常的止血功能，因而在临床上被用作防治血栓性疾病的有效抗凝药物[3]。目前国外已有商品生产，例如Ancrod(Arvin)，Reptilase，Crotalase等。
类凝血酶的主要生理功能是使纤维蛋白原转变为凝聚的纤维蛋白。但它又不同于血浆凝血酶，类凝血酶作用于纤维蛋白原时只释放出血纤肽A，同时去A肽纤维蛋白原迅速聚合形成凝块。但这种去血纤肽A的纤维蛋白单体只能首尾聚合。又由于类凝血酶不激活凝血因子XIII，生成的纤维蛋白多聚体之间不产生交联，因而形成一种较脆弱的可溶性微凝块，后者很容易被体内纤溶系统所清除[2]。类凝血酶的这一作用特点已被临床上作为抗凝剂而用于治疗血管栓塞性疾病，如脑血栓、周围血管阻塞性疾病、心血管疾病等。
1965年，Suzuki实验室分离了蝮蛇日本亚种中的丝氨酸蛋白酶，并将其分为三类，即激肽释放酶、类溶血纤维酶和毛细管通透性因子[4]，并测定了它们在32种蛇毒中的分布况[5]；1979年Viljoen等分离测定了加蓬丝蝰中的三种丝氨酸蛋白酶组分，它们分别具有凝血、激肽释放和纤维蛋白溶解的活性[6]，1982年，管利丰和戚正武研究了浙江蝮蛇(Agkistrodonhalyspallas)蛇毒中的类凝血酶。
在我国浙江蝮蛇类凝血酶纯化工艺方面，管利丰和戚正武应用了SephadexG-25、DE-11、DE-52和SephadexG-75的四步方法[1]，徐光寿等应用DEAE-SephadexA-50，CM-SephadexC-50和SE-SephadexC-25三步法[7]，蒋芝萍等用DE-32和Sephadex G-75二步法对其进行了分离[8]，李凤阁等用DEAE-葡聚糖A-50和TEMZ二步法对其进行了分离。
由于类凝血酶在蛇毒中含量低，结构特殊，提纯较为困难，故长期以来研究进展缓慢。上述纯化工艺也仅限于实验室研究和少量样品的制备，难以在线放大到中试以至生产规模。
以下是申请人检索的与本发明相关的参考文献：
1.管利丰，戚正武，生物化学与生物物理进展，14(1988)303。
2.F.S.Markland，H.Pirkle，Chemistry and Biology ofThrombin，1977，71，Lundblad，R.L.et al.(eds.)，Ann ArborScience，Michigan.
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4.T.，Sato，et al，J.Biochem.(Tokyo)，1965，57，380.
5.G.，Oshima，et al，Toxicon，1969，7，229.
6.C.C.，Viljoen，et al，Toxicon，1979，17，145.
7.徐光寿等，动物学杂志，1985，6，293。
8.蒋芝萍等，动物学杂志，1985，6，361。
9.李凤阁等，中草药，1987，18，4。
发明内容
针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，提供一种从蛇毒中分离纯化类凝血酶的方法，采用阳离子交换层析、阴离子交换层析和凝胶排阻层析三步法从蛇毒中分离纯化类凝血酶，在带有梯度洗脱并能同时显示紫外和电导参数装置的高、中、低压层析仪上进行；活性测定参照胰蛋白酶测定法，用BAEE作底物；具体步骤如下：
1).江浙产蝮蛇抗栓酶的等电点在4～5左右，选择在它的等电点附近酸碱度的溶样液，首先使类凝血酶在溶样液中以阳离子蛋白质形式存在，然后选择一种可以与这样带电蛋白质特异性结合的阳离子交换介质进行梯度洗脱，收集活性峰；
2).阳离子交换收集的含有类凝血酶活性的馏分经稀释和调pH值后，上阴离子交换柱，稀释后含NaCl在0.05M以下，pH在8.5左右，阴离子交换层析的A液可选用pH在8.5左右的PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液，B液为在A液中加入0.6-1.0M的NaCl溶液，梯度方式为洗脱液从A液完全变到B液时，至少冲洗10个柱体积以上，介质选择商品化的阴离子交换介质，收集阴离子层析后含类凝血酶的活性峰；
3).将阴离子交换收集的含类凝血酶的活性馏分直接上凝胶层析，收集含类凝血酶的馏分，流动相选用pH5.0-9.0的HAC-NaAC或PBS缓冲液，浓度在10-50mM之间，用等度洗脱，介质选用商品化的凝胶介质；
4)对最后一步的峰作SDS-PAGE电泳和HPLC检测，其纯度分别约为98％和95％，脱盐冻干后可得纯类凝血酶。
上述溶样液可以使用阳离子交换层析的A液，而A液一般可用磷酸盐—柠檬酸盐组成的PH在3.0左右的缓冲液，B液为在A液中加入0.2M左右的NaCl溶液，梯度方式为洗脱从A完全到B时，至少冲洗10个柱体积以上，介质可选择商品化的阳离子交换介质。
本发明与传统方法比较，这种方法操作简单、提取时间短，而且可基本线性放大到中试乃至规模生产。
附图说明
图1是本发明实施例中的类凝血酶在CM Sepharose CL-6B阳离子交换柱上的分离图谱；
图2是本发明实施例中的类凝血酶在DEAE sepharose Fast Flow柱上的分离图谱；
图3是本发明实施例中的类凝血酶在CM Sepharose G-75上的分离图谱。
具体实施方式
为了更清楚的理解本发明，以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。
本发明是在前人工作的基础上研究的一种用阳离子交换、阴离子交换的凝胶排阻层析方法从蝮蛇毒中提取类凝血酶的方法。
本发明采用从蛇毒中提取类凝血酶的三步工艺-----阳离子交换层析+阴离子交换层析+凝胶排阻层析，从蛇毒中提取了类凝血酶；优化了从蛇毒中提取类凝血酶的各种中试工艺参数，以最大限度地缩短提取时间，增大批处理量，提高目标产品的收率，并建立了一套目标产品纯度和活性检测的标准方法。技术指标为：
1.稳定的从蛇毒提取类凝血酶的中试生产工艺，每次可上样量80克，可得符合药用活性和纯度的类凝血酶240毫克左右。
2.类凝血酶的纯度在95％以上，活性符合药用。
本发明可在一般带有梯度洗脱装置的高、中、低压层析仪上进行，要求能同时显示紫外和电导参数。活性测定参照胰蛋白酶测定法，用BAEE作底物。
其具体实施方法和步骤如下：
1.依据江浙产蝮蛇抗栓酶的等电点在4～5左右，可以选择在它的等电点附近酸碱度的溶样液，首先使类凝血酶在溶样液中以阳离子蛋白质形式存在，然后选择一种合适的可以与这样带电蛋白质特异性结合的阳离子交换介质进行梯度洗脱，收集活性峰。溶样液可以使用阳离子交换层析的A液，而A液一般可用磷酸盐—柠檬酸盐组成的PH在3.0左右的缓冲液，B液为在A液中加入合适浓度的NaCl溶液，梯度方式为洗脱从A完全到B时，要求至少冲洗10个柱体积以上，介质可选择商品化的阳离子交换介质，如：Pharmacia公司的CM、SP-Sepharose介质或Bio-Rad公司的Bio-Rex 70介质。
2.阳离子交换收集的含有类凝血酶活性的馏分经稀释和调pH值后，上阴离子交换柱，要求稀释后含NaCl一般在0.05M以下，pH在8.5左右，阴离子交换层析的A液可选用pH在8.5左右的PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液，B液为在A液中加入合适浓度有NaCl溶液，梯度方式为洗脱液从A完全变到B时，要求至少冲洗10个柱体积以上，介质可选择商品化的阴离子交换介质，如Pharmacia公司的DEAE、Q-Sepharose介质或Bio-rad公司生产的DEAE介质，收集阴离子层析后含类凝血酶的活性峰。
3.将阴离子交换收集的含类凝血酶的活性馏分直接上凝胶层析，收集含类凝血酶的馏分，流动相选用pH5.0-9.0的HAC-NaAC或PBS缓冲液，浓度在10mM-50mM之间，用等度洗脱，介质可选用商品化的凝胶介质，如Pharmacia公司的Sephadex G-75，G-50等。
4.对最后一步的峰作SDS-PAGE电泳和HPLC检测，其纯度分别约为98％和95％，脱盐冻干后可得纯类凝血酶。
用溶栓治疗法溶解动脉与静脉中的血栓或肺栓塞，现已成为一种很成熟的医疗技术。目前常用的药物有链激酶、尿激酶及重组组织纤维蛋白酶原激活剂，它们虽对血栓有一定疗效，但均伴有较高的出血并发症发生率。而本发明所提取的类凝血酶不但对脑血栓有很好疗效，且无明显不良反应。
下面是发明人给出的一个用阳离子交换层析、阴离子交换层析和凝胶排阻层析三步法从蛇毒中分离纯化类凝血酶的实例。本发明不限于该实施例。
取10g粗蛇毒(江浙蝮蛇蛇毒)，溶于30ml pH＝3.05的20mM Na2HPO4—柠檬酸的缓冲液中，上样到3.0×40cm的CM Sepharose CL-6B阳离子交换柱上，流速为1.5ml/min，A液为20mM Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，B液为A液中加0.6MNaCl，梯度方式为：
0min-30min A液
30min-330min B液0-100％
330min-360min B液
洗出层析图见附图1，共出来6个峰，收集相对最大活性的第IV峰。
将收集到的CM柱上的IV峰用10mMPBS(PH＝8.5)的缓冲液稀释5倍，使其盐浓度在0.05M以下，pH转化成8.5。再取稀释后溶液上DEAE-Spharose Fast Flow柱，柱大小为3.0×40cm，流速为1.7ml/min，A液为10mMPBS，PH＝8.5，B液为A液中加0.2MNaCl，梯度方式为：
0min-30min A液
30min-330min， B液0-100％
330min-600min B液
洗出层析图见附图2，共出来5个峰，收集相对最大活性的第I峰。
将收集到的DEAE峰后的I峰直接上Sephadex G-75柱，柱大小为5.0×100cm，，流动相为10mMPBS(PH＝8.0)，流速为1.0ml/min，用等度洗脱，洗出层析图见附图3，共出来4个峰，收集相对最大活性的第III峰。
对最后一步的峰III作SDS-PAGE电泳和HPLC检测，其纯度分别为98％和95％，脱盐冻干后可得30mg纯类凝血酶。
Claims (2)
1.一种从蛇毒中分离纯化类凝血酶的方法，其特征在于，采用阳离子交换层析、阴离子交换层析和凝胶排阻层析三步法从蛇毒中分离纯化类凝血酶，在带有梯度洗脱并能同时显示紫外和电导参数装置的高、中、低压层析仪上进行；活性测定参照胰蛋白酶测定法，用BAEE作底物；具体步骤如下：
1).江浙产蝮蛇抗栓酶的等电点在4～5左右，选择在它的等电点附近酸碱度的溶样液，首先使类凝血酶在溶样液中以阳离子蛋白质形式存在，然后选择一种可以与这样带电蛋白质特异性结合的阳离子交换介质进行梯度洗脱，收集活性峰；
2).阳离子交换收集的含有类凝血酶活性的馏分经稀释和调pH值后，上阴离子交换柱，稀释后含NaCl在0.05M以下，pH在8.5左右，阴离子交换层析的A液可选用pH在8.5左右的PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液，B液为在A液中加入0.6-1.0M左右的NaCl溶液，梯度方式为洗脱液从A液完全变到B液时，至少冲洗10个柱体积以上，介质选择商品化的阴离子交换介质，收集阴离子层析后含类凝血酶的活性峰；
3).将阴离子交换收集的含类凝血酶的活性馏分直接上凝胶层析，收集含类凝血酶的馏分，流动相选用pH5.0-9.0的HAC-NaAC或PBS缓冲液，浓度在10mM-50mM之间，用等度洗脱，介质选用商品化的凝胶介质；
4)对最后一步的最大活性峰作SDS-PAGE电泳和HPLC检测，其纯度分别约为98％和95％，脱盐冻干后可得纯类凝血酶。
2.如权利要求1所述的从蛇毒中分离纯化类凝血酶的方法，其特征在于，所述步骤1)中的溶样液使用阳离子交换层析的A液，而A液为磷酸盐-柠檬酸盐组成的PH在3.0左右的缓冲液，B液为在A液中加入0.2M左右的NaCl溶液，梯度方式为洗脱从A完全到B时，至少冲洗10个柱体积以上，介质可选择商品化的阳离子交换介质。
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