CN1439718A - 一种从蛇毒中分离纯化类凝血酶的制备方法 - Google Patents
一种从蛇毒中分离纯化类凝血酶的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1439718A CN1439718A CN 03114511 CN03114511A CN1439718A CN 1439718 A CN1439718 A CN 1439718A CN 03114511 CN03114511 CN 03114511 CN 03114511 A CN03114511 A CN 03114511A CN 1439718 A CN1439718 A CN 1439718A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- thrombin
- enzyme
- liquid
- medium
- snake venom
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 7
- 108010027612 Batroxobin Proteins 0.000 title description 2
- 229960002210 batroxobin Drugs 0.000 title 1
- 101000772006 Bombus ignitus Venom serine protease Bi-VSP Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims abstract description 4
- YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N ethyl (2s)-2-benzamido-5-(diaminomethylideneamino)pentanoate Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(=O)OCC)NC(=O)C1=CC=CC=C1 YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 35
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 14
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 14
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 9
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 7
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 claims description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 claims description 5
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 claims description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims description 3
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000005611 electricity Effects 0.000 claims description 3
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 3
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical class OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 abstract description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 abstract 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 abstract 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 abstract 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract 1
- 230000020509 sex determination Effects 0.000 abstract 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 abstract 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 4
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 4
- 241001474977 Palla Species 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 4
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 4
- 241000271897 Viperidae Species 0.000 description 4
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 4
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 3
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 3
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 3
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011020 pilot scale process Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- JWICNZAGYSIBAR-LEEGLKINSA-N (4s)-4-[[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-aminopropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]acetyl]amino]-5-[[2-[[(2s)-3-carboxy-1-[[(2s)-1-[[1-[[(2s)-1-[[(2s)-4-carboxy-1-[[2-[[2-[[2-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-4-(diaminomethylideneamino Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N)CC1=CC=CC=C1 JWICNZAGYSIBAR-LEEGLKINSA-N 0.000 description 2
- 108010001779 Ancrod Proteins 0.000 description 2
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 2
- 206010008132 Cerebral thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 2
- 101800000974 Fibrinopeptide A Proteins 0.000 description 2
- 102400000525 Fibrinopeptide A Human genes 0.000 description 2
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 201000001429 Intracranial Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 2
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 2
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 2
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 2
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 2
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000002821 viper venom Substances 0.000 description 2
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000271039 Agkistrodon Species 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010080865 Factor XII Proteins 0.000 description 1
- 102000000429 Factor XII Human genes 0.000 description 1
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 1
- 241000271042 Gloydius halys Species 0.000 description 1
- 108010025252 Kassinin Proteins 0.000 description 1
- 244000207740 Lemna minor Species 0.000 description 1
- 235000006439 Lemna minor Nutrition 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 235000001855 Portulaca oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 208000006193 Pulmonary infarction Diseases 0.000 description 1
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 1
- 208000004078 Snake Bites Diseases 0.000 description 1
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 208000001435 Thromboembolism Diseases 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 229960004233 ancrod Drugs 0.000 description 1
- 230000001567 anti-fibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 239000000504 antifibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 229940082620 antifibrinolytics Drugs 0.000 description 1
- 229960004676 antithrombotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000004856 capillary permeability Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Substances OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010086755 crotalase Proteins 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 108010073651 fibrinmonomer Proteins 0.000 description 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- 241000411851 herbal medicine Species 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000007575 pulmonary infarction Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000002345 thrombinlike Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 1
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种从蛇毒中分离纯化类凝血酶的方法，采用阳离子交换层析、阴离子交换层析和凝胶排阻层析三步法从蛇毒中分离纯化类凝血酶，在带有梯度洗脱并能同时显示紫外和电导参数装置的高、中、低压层析仪上进行；性测定参照胰蛋白酶测定法，用BAEE作底物。本发明可以方便、快速地从蛇毒中提取类凝血酶，其纯度和生物活性均可达到药用标准。与传统方法相比较，本发明生产工艺简单，回收率高，活性损失小，并可几乎线性放大到工业规模化生产。
Description
一、所属技术领域
本发明属于生物、医药提取技术，涉及一种从蛇毒中分离纯化类凝血酶的方法，具体地说，是一种采用阳离子交换层析、阴离子交换层析和凝胶排阻层析三步法从蛇毒中提取类凝血酶的制备方法。
二、背景技术
一些蛇毒中含有丰富的蛋白水解酶，这些蛋白水解酶按其底物专一性可分为两类，一类为含金属的蛋白酶，它们往往与蛇伤后组织的出血、坏死等有关；另一类为丝氨酸蛋白酶，其底物专一性强，不作用于一般蛋白，只作用于体内特定蛋白底物中的特定肽键。据报道，在我国浙江产蝮蛇蛇毒中含有三种具有丝氨蛋白酶活性的蛋白水解酶，它们分别是激肽释放酶、类溶血纤维酶和类凝血酶[1]。其中的类凝血酶特别引起人们的重视，这不仅因为它的丝氨酸蛋白酶活性高(类凝血酶在这三种酶中活性最高，约占总酶活性的60％)，更重要的是它与凝血系统关系非常密切。类凝血酶在体外起凝血作用，可不通过体内各种凝血因子，直接作用于纤维蛋白原使之凝聚，但在体内由于不断降解纤维蛋白原，造成低凝状态。由它水解而成的纤维蛋白凝块，由于没有侧链交联，易被纤维蛋白溶酶降解，因而表现为抗凝作用[2]。又因它不凝集血小板，故机体仍能维持正常的止血功能，因而在临床上被用作防治血栓性疾病的有效抗凝药物[3]。目前国外已有商品生产，例如Ancrod(Arvin)，Reptilase，Crotalase等。
类凝血酶的主要生理功能是使纤维蛋白原转变为凝聚的纤维蛋白。但它又不同于血浆凝血酶，类凝血酶作用于纤维蛋白原时只释放出血纤肽A，同时去A肽纤维蛋白原迅速聚合形成凝块。但这种去血纤肽A的纤维蛋白单体只能首尾聚合。又由于类凝血酶不激活凝血因子XIII，生成的纤维蛋白多聚体之间不产生交联，因而形成一种较脆弱的可溶性微凝块，后者很容易被体内纤溶系统所清除[2]。类凝血酶的这一作用特点已被临床上作为抗凝剂而用于治疗血管栓塞性疾病，如脑血栓、周围血管阻塞性疾病、心血管疾病等。
1965年，Suzuki实验室分离了蝮蛇日本亚种中的丝氨酸蛋白酶，并将其分为三类，即激肽释放酶、类溶血纤维酶和毛细管通透性因子[4]，并测定了它们在32种蛇毒中的颁情况[5]；1979年Viljoen等分离测定了加蓬丝蝰中的三种丝氨酸蛋白酶组分，它们分别具有凝血、激肽释放和纤维蛋白溶解的活性[6]，1982年，管利丰和戚正武研究了浙江蝮蛇(Agkistrodon halyspallas)蛇毒中的类凝血酶。
在我国浙江蝮蛇类凝血酶纯化工艺方面，管利丰和戚正武应用了SephadexG-25、DE-11、DE-52和SephadexG-75的四步方法[1]，徐光寿等应用DEAE-SephadexA-50，CM-SephadexC-50和SE-SephadexC-25三步法[7]，蒋芝萍等用DE-32和Sephadex G-75二步法对其进行了分离[8]，李凤阁等用DEAE-葡聚糖A-50和TEMZ二步法对其进行了分离。
由于类凝血酶在蛇毒中含量低，结构特殊，提纯较为困难，故长期以来研究进展缓慢。上述纯化工艺也仅限于实验室规模研究和少量样品的制备，难以在线放大到中试以至生产规模。
三、发明内容
针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，提供一种从蛇毒中分离纯化类凝血酶的制备方法，采用阳离子交换层析、阴离子交换层析和凝胶排阻层析三步法从蛇毒中分离纯化类凝血酶，在带有梯度洗脱并能同时显示紫外和电导参数装置的高、中、低压层析仪上进行；性测定参照胰蛋白酶测定法，用BAEE作底物；具体步骤如下：
1).选用江浙产蝮蛇抗栓酶的等电点在4～5左右，并选择在它的等电点附近酸碱度的溶样液，首先使类凝血酶在溶样液中以阳离子蛋白质形式存在，然后选择一种可以与这样带电蛋白质特异性结合的阳离子交换介质进行梯度洗脱，收集活性峰；
2).阳离子交换收集的含有类凝血酶活性的馏分经稀释和调pH值后，上阴离子交换柱，稀释后含NaCl在0.05M以下，pH在8.5左右，阴离子交换层析的A液可选用pH在8.5左右的PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液，B液为在A液中加入0.6-1.0M的NaCl溶液，梯度方式为洗脱液从A液完全变到B液时，至少冲洗10个柱体积以上，介质选择商品化的阴离子交换介质，收集阴离子层析后含类凝血酶的活性峰；
3).将阴离子交换收集的含类凝血酶的活性馏分直接上凝胶层析，收集含类凝血酶的馏分，流动相选用pH5.0-9.0的HAC-NaAC或PBS缓冲液，浓度在10-50mM之间，用等度洗脱，介质选用商品化的凝胶介质；
4)对最后一步的峰作SDS-PAGE电泳和HPLC检测，其纯度分别约为98％和95％，脱盐冻干后可得纯类凝血酶。
所述溶样液可以使用阳离子交换层析的A液，而A液一般可用磷酸盐-柠檬酸盐组成的PH在3.0左右的缓冲液，B液为在A液中加入0.2M左右的NaCl溶液，梯度方式为洗脱从A完全到B时，至少冲洗10个柱体积以上，介质可选择商品化的阳离子交换介质。
本发明与传统方法比较，这种方法操作简单、提取时间短，而且可基本线性放大到中试乃至规模生产。
四、附图说明
图1是本发明实施例中的类凝血酶在CM Sepharose CL-6B阳离子交换柱上的分离图谱；
图2是本发明实施例中的类凝血酶在DEAE sepharose Fast Flow柱上的分离图谱；
图3是本发明实施例中的类凝血酶在CM Sepharose G-75上的分离图谱。
五、具体实施方式
为了更清楚的理解本发明，以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。
本发明是在前人工作的基础上研究的一种用阳离子交换、阴离子交换的凝胶排阻层析方法从蝮蛇毒中提取类凝血酶的方法。
本发明的从蛇毒中提取类凝血酶的三步提取工艺是-----阳离子交换层析+阴离子交换层析+凝胶排阻层析，从蛇毒中提取了类凝血酶；优化了从蛇毒中提取类凝血酶的各种中试工艺参数，以最大限度地缩短提取时间，增大批处理量，提高目标产品的收率，并建立了一套目标产品纯度和活性检测的标准方法。技术指标为：
1.稳定的从蛇毒提取类凝血酶的中试生产工艺，每次可上样量80克，可得符合药用活性和纯度的类凝血酶240毫克左右。
2.血酶的纯度在95％以上，活性符合药用。
本发明可在一般在带有梯度洗脱装置的高、中、低压层析仪上进行，要求能同时显示紫外和电导参数。活性测定参照胰蛋白酶测定法，用BAEE作底物。
其具体实施方法和步骤如下：
1.依据江浙产蝮蛇抗栓酶的等电点在4～5左右，可以选择在它的等电点附近酸碱度的溶样液，首先使类凝血酶在溶样液中以阳离子蛋白质形式存在，然后选择一种合适的可以与这样带电蛋白质特异性结合的阳离子交换介质进行梯度洗脱，收集活性峰。溶样液可以使用阳离子交换层析的A液，而A液一般可用磷酸盐-柠檬酸盐组成的PH在3.0左右的缓冲液，B液为在A液中加入合适浓度的NaCl溶液，梯度方式为洗脱从A完全到B时，要求至少冲洗10个柱体积以上，介质可选择商品化的阳离子交换介质，如：Phamacia公司的CM、SP-Sepharose介质或Bio-rad公司的Bio-rex 70介质。
2.阳离子交换收集的含有类凝血酶活性的馏分经稀释和调pH值后，上阴离子交换柱，要求稀释后含NaCl一般在0.05M以下，pH在8.5左右，阴离子交换层析的A液可选用pH在8.5左右的PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液，B液为在A液中加入合适浓度有NaCl溶液，梯度方式为洗脱液从A完全变到B时，要求至少冲洗10个柱体积以上，介质可选择商品化的阴离子交换介质，如Phamaicia公司的DEAE、Q-Sepharose介质或Bio-rad公司生产的DEAE介质，收集阴离子层析后含类凝血酶的活性峰。
3.将阴离子交换收集的含类凝血酶的活性馏分直接上凝胶层析，收集含类凝血酶的馏分，流动相选用pH5.0-9.0的HAC-NaAC或PBS缓冲液，浓度在10mM-50mM之间，用等度洗脱，介质可选用商品化的凝胶介质，如Phamaicia公司的Sephadex G-75，G-50等。
4.对最后一步的峰作SDS-PAGE电泳和HPLC检测，其纯度分别约为98％和95％，脱盐冻干后可得纯类凝血酶。
用溶栓治疗法溶解动脉与静脉中的血栓或肺栓塞，现已成为一种很成熟的医疗技术。目前常用的药物有链激酶、尿激酶及重组组织纤维蛋白酶原激活剂，它们加对血栓有一定疗效，但均伴有较高的出血并发症发生率。而本发明所提取的类凝血酶将对脑血栓有很好疗效，且无明显不良反应。
下面是发明人给出的一个用阳离子交换层析、阴离子交换层析和凝胶排阻层析三步法从蛇毒中分离纯化类凝血酶的实例。本发明不限于该实施例。
取10g粗蛇毒(江浙蝮蛇蛇毒)，溶于30ml pH＝3.05的20mM Na2HPO4-柠檬酸的缓冲液中，上样到3.0×40cm的CM Sepharose CL-6B阳离子交换柱上，流速为1.5mol/min，A液为20mM Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，B液为A液中加0.6MNaCl，梯度方式为：
30min A液
30min-33min B液0-100％
330min-360min B液
洗出层析图见附图1，共出来6个峰，其中同时标明了各峰的相对活性，收集相对最大活性的第IV峰。
将收集到的CM柱上的IV峰用01mMPBS(PH＝8.5)的缓冲液稀释5倍，使其盐浓度在0.05M以下，pH转化成8.5。再取稀释后溶液上DEAE-Spharose Fast Flow柱，柱大小为3.0×40cm，流速为1.7mol/min，A液为10mMPBS，PH＝8.5，B液为A液中加0.2MNaCl，梯度方式为：
0min-30min A液
30min-330min， B液0-100
330min-600min B液
洗出层析图见附图2，共出来5个峰，其中同时标明了各峰的相对活性，收集相对最大活性的第I峰。
将收集到的DEAE峰后的峰I直接上Sephadex G-75柱，柱大小为5.0×100cm，，流动相为10mMPBS(PH＝8.0)，流速为1.0ml/min，用等度洗脱，洗出层析图见附图3，共出来4个峰，其中同时标明了各峰的相对活性，收集相对最大活性的第III峰。
对最后一步的峰III作SDS-PAGE电泳和HPLC检测，其纯度分别为98％和95％，脱盐冻干后可得30mg纯类凝血酶。
六、参考文献
1.管利丰，戚正武，生物化学与生物物理进展，14(1988)303。
2.F.S.Markland，H.Pirkle，Chemistry and Biology ofThrombin，1977，71，Lundblad，R.L.et al.(eds.)，Ann ArborScience，Michigan.
3.K.，Stocker，Fibrinolytic and Antifibrinolytics，Hand.Exp.Pharmacol.，1978，46，451.Markwardt，F.(ed.)，Springer，Berlin.
4.T.，Oshima，et al，J.Biochem.(Tokyo)，1965，57，380.
5.G.，Oshima，et al，Toxicon，1979，17，145.
6.C.C.，Viljoen，et al，Toxicon，1979，17，145.
7.徐光寿等，动物学杂志，1985，6，293。
8.蒋芝萍等，动物学杂志，1985，6，361。
9.李凤阁等，中草药，1987，18，4。
Claims (2)
1.一种从蛇毒中分离纯化类凝血酶的制备方法，其特征在于，采用阳离子交换层析、阴离子交换层析和凝胶排阻层析三步法从蛇毒中分离纯化类凝血酶，在带有梯度洗脱并能同时显示紫外和电导参数装置的高、中、低压层析仪上进行；性测定参照胰蛋白酶测定法，用BAEE作底物；具体步骤如下：
1).选用江浙产蝮蛇抗栓酶的等电点在4～5左右，并选择在它的等电点附近酸碱度的溶样液，首先使类凝血酶在溶样液中以阳离子蛋白质形式存在，然后选择一种可以与这样带电蛋白质特异性结合的阳离子交换介质进行梯度洗脱，收集活性峰；
2).阳离子交换收集的含有类凝血酶活性的馏分经稀释和调pH值后，上阴离子交换柱，稀释后含NaCl在0.05M以下，pH在8.5左右，阴离子交换层析的A液可选用pH在8.5左右的PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液，B液为在A液中加入0.6-1.0M左右的NaCl溶液，梯度方式为洗脱液从A液完全变到B液时，至少冲洗10个柱体积以上，介质选择商品化的阴离子交换介质，收集阴离子层析后含类凝血酶的活性峰；
3).将阴离子交换收集的含类凝血酶的活性馏分直接上凝胶层析，收集含类凝血酶的馏分，流动相选用pH5.0-9.0的HAC-NaAC或PBS缓冲液，浓度在10mM-50mM之间，用等度洗脱，介质选用商品化的凝胶介质；
4)对最后一步的最大活性峰作SDS-PAGE电泳和HPLC检测，其纯度分别约为98％和95％，脱盐冻干后可得纯类凝血酶。
2.如权利1所述的从蛇毒中分离纯化类凝血酶的制备方法，其特征在于，所述溶样液可以使用阳离子交换层析的A液，而A液用磷酸盐-柠檬酸盐组成的PH在3.0左右的缓冲液，B液为在A液中加入0.2M左右的NaCl溶液，梯度方式为洗脱从A完全到B时，至少冲洗10个柱体积以上，介质可选择商品化的阳离子交换介质。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB031145116A CN1189559C (zh) | 2003-02-28 | 2003-02-28 | 一种从蛇毒中分离纯化类凝血酶的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB031145116A CN1189559C (zh) | 2003-02-28 | 2003-02-28 | 一种从蛇毒中分离纯化类凝血酶的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1439718A true CN1439718A (zh) | 2003-09-03 |
| CN1189559C CN1189559C (zh) | 2005-02-16 |
Family
ID=27797025
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB031145116A Expired - Fee Related CN1189559C (zh) | 2003-02-28 | 2003-02-28 | 一种从蛇毒中分离纯化类凝血酶的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1189559C (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100351381C (zh) * | 2005-09-02 | 2007-11-28 | 中山大学 | 一种新的类凝血酶基因及其应用 |
| CN100584944C (zh) * | 2008-05-28 | 2010-01-27 | 重庆师范大学 | 白唇竹叶青蛇毒降纤酶的制备方法 |
| CN110016471A (zh) * | 2019-04-10 | 2019-07-16 | 北京博康宁生物医药科技有限公司 | 重组安克洛酶及工业规模制备和纯化方法及其组合物 |
| CN110791491A (zh) * | 2019-12-11 | 2020-02-14 | 昆明龙津药业股份有限公司 | 从蛇毒中提取降纤酶的方法 |
-
2003
- 2003-02-28 CN CNB031145116A patent/CN1189559C/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100351381C (zh) * | 2005-09-02 | 2007-11-28 | 中山大学 | 一种新的类凝血酶基因及其应用 |
| CN100584944C (zh) * | 2008-05-28 | 2010-01-27 | 重庆师范大学 | 白唇竹叶青蛇毒降纤酶的制备方法 |
| CN110016471A (zh) * | 2019-04-10 | 2019-07-16 | 北京博康宁生物医药科技有限公司 | 重组安克洛酶及工业规模制备和纯化方法及其组合物 |
| CN110016471B (zh) * | 2019-04-10 | 2020-10-02 | 北京博康宁生物医药科技有限公司 | 重组安克洛酶及工业规模制备和纯化方法及其组合物 |
| CN110791491A (zh) * | 2019-12-11 | 2020-02-14 | 昆明龙津药业股份有限公司 | 从蛇毒中提取降纤酶的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1189559C (zh) | 2005-02-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5143838A (en) | Method of producing thrombin from factor ii using calcium ions for the conversion on an anion exchanger | |
| US4748156A (en) | Thrombin-binding substance and process for preparing the same | |
| DK181080B1 (en) | PREVIOUSLY UNKNOWN TRYPSIN ISOFORMS AND USE THEREOF | |
| US4137127A (en) | Process for the preparation of thrombin-like enzymes from snake venoms | |
| da-Silva-Freitas et al. | PEGylation: A successful approach to improve the biopharmaceutical potential of snake venom thrombin-like serine protease | |
| CN1189559C (zh) | 一种从蛇毒中分离纯化类凝血酶的方法 | |
| CN100506983C (zh) | 一种从矛头蝮蛇毒中提取单一成份巴曲酶的方法 | |
| CN1123639C (zh) | 人活性蛋白c及其制备方法 | |
| CN101063117A (zh) | 白眉蛇毒血凝酶及其提取方法与应用 | |
| CN1159438C (zh) | 一种尖吻蝮蛇毒凝血酶及其生产方法 | |
| CN104498464A (zh) | 一种从白眉蝮蛇蛇毒中提取白眉蛇毒血凝酶的方法 | |
| CN102021160B (zh) | 一种蛇毒丝氨酸蛋白酶、其编码基因及应用 | |
| CN100582227C (zh) | 降纤酶的亲和分离材料和降纤酶的亲和纯化方法 | |
| EP1026172A1 (en) | Method for purifying thrombin substrates and/or inhibitors or method for eliminating the same | |
| CN101693748B (zh) | 一种特异性纯化高分子尿激酶层析介质及制备方法和应用 | |
| CN1793350A (zh) | 猪凝血酶的制备方法 | |
| CN101074437A (zh) | 一种蛇毒血凝酶ⅰ级酶制品及其生产方法 | |
| CN1159437C (zh) | 尖吻蝮蛇毒凝血酶及其生产方法 | |
| CN106929497B (zh) | 一种尿激酶的分离纯化方法 | |
| CN102146134B (zh) | 一种高效提取纯化凝血因子ix和凝血因子x的方法 | |
| CN102212513B (zh) | 由冬虫夏草菌中分离得到的蛋白水解酶及其纯化方法 | |
| CN1102173C (zh) | 蕲蛇酶及其生产工艺 | |
| CN109652398A (zh) | 凝血因子ⅹ激活剂rvv-ⅹ的制备方法及制得的rvv-ⅹ | |
| CN1126758C (zh) | 凝血因子ⅸ复合物的制备方法 | |
| EP1482969A2 (en) | Purifying process of soluble proteins of the l. obliqua bristles through prothrombin activation; process for a partial determination of the amino acids sequence of the prothrombin activator; process for determining the prothrombin activation of fraction ii, n-terminal and internal fragments sequence |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C19 | Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |