CN1123639C - 人活性蛋白c及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基本不含凝血酶或相当的蛋白酶,和/或未经活化的蛋白C的高比活度人活性蛋白C制剂,及其制备方法。一种人活性蛋白C制剂,该制剂基本不含凝血酶或相当的蛋白酶,和/或未经活化的蛋白C,比活度为3500U/mg或更大,单位比活度定义为使正常人血浆中活性促凝血酶原激酶寿命(APTT)延长两倍的量。通过一种纯化人活性蛋白C的方法来制备上述制剂,包括:用凝血酶或相当的蛋白酶活化人蛋白C后,将含人活性蛋白C的溶液与阳离子交换剂接触,使凝血酶和活性蛋白C都被吸收到交换剂中,然后单独洗脱出人活性蛋白C。
Description
本发明技术领域
本发明涉及用凝血酶或相当的蛋白酶活化人蛋白C,来制备的一种高比活度的人活性蛋白C制剂,上述蛋白C从血浆中取得或通过遗传重组技术制得。本发明进一步涉及一种活化人蛋白C的方法和高纯度下纯化人活性蛋白C的方法。
技术背景
蛋白C(此后也缩写成“PC”)是一种在肝里合成的、维生素K依赖性蛋白,而且是一种酶前体,分子量为62,000,由两条链组成:L链(分子量21,000)和H链(分子量41,000)。在人体内,用凝血酶-thrombomodulin复合体使蛋白C部分降解,与thrombomodulin接合的凝血酶存在于血管内皮细胞的膜表面上,因此,由H链的氨基末端释放出包含12个氨基酸的肽,形成活性蛋白C(此后也缩写成“APC”)。 APC是一种丝氨酸蛋白酶,通过凝血因子V和VIII(主要活性形式是Va和VIIIa)的特殊降解作用和脱活化作用而显示出很强的抗凝结剂活性,并且促进血管壁释放胞浆素原活化质而加速纤维蛋白系统。因此,APC预期用作治疗剂。
APC在本领域中是众所周知的,并且包括那些在体外用凝血酶或凝血酶-thrombomodulin复合体活化蛋白C所得到的APC,所述蛋白C从血浆中取得或通过基因重组技术制得(Blood,63,p.115-121(1984);J.Clin.Invest.,
64,p.761-769(1979);J.Clin.Invest.,
79,p.918-925(1987));或者是由基因重组技术直接表达为APC的那些(日本专利首次公开号(Kokai)No.61-205487,日本专利首次公开号(Kokai)No.1-2338和日本专利首次公开号(Kokai)No.1-85084),以及诸如此类。
但是,为了制备APC,尤其在由血浆分馏制得蛋白C,然后使之活化以制得所需蛋白的情况下,为有效脱除物化性质与APC十分相似的杂质蛋白,得到所需高比活度的高纯APC,需要克服各种困难。例如,从蛋白C有效活化到APC,然后脱除活化剂,以及纯化APC时,还存在许多需要解决的问题。
活化蛋白C的已知方法包括:例如,用胰蛋白酶,RVV-X,凝血酶,凝血酶-thrombomodulin活化;用凝胶活化,其中RVV-X固定为琼脂糖;用凝胶活化,其中凝血酶-thrombomodulin复合体被固定,以及诸如此类(J.Biol.Chem.,
251,3052-3056(1976);Biochemistry,
15,4893-4900(1976);Biochemistry,
16,5824-5831(1977);J.Clin.Invest.,
64,761-769(1977);Biochem.Biophys.Res.Commun.,
94,340-347(1980);J.Clin.Invest.,
77,416-425(1986))。
但是,就工业规模制备APC而言,上述方法不尽如人意。因为活化大量的蛋白C,最好是用少量的活化剂活化高浓度的蛋白C。上述方法也不能满足此需要。
关于蛋白C活化后,活性蛋白C的纯化,已知一种方法,其中,用SP-葡聚糖凝胶色谱法,在洗脱液中得到APC,因此,在蛋白C活化过程中添加的凝血酶则被吸收除去(biochemistry,16,5824-5831(1977);J.Clin.Invest.,
64,761-769(1979);J.Biol.Chem.,
251,3052-3056(1976);Biochemistry,
20,2156-2161(1981))。但是,用阳离子交换剂难于脱除蛋白C活化时添加的凝血酶到临床适用水平。实际上,阳离子交换处理后,APC的浓缩步骤是必不可少的,因此,在APC的浓缩过程中,APC的自溶作用是不可避免的。因而目前尚无法制备高纯度、高生物活性、又不含各种杂质蛋白的APC。
发明内容
本发明是为了解决上述问题。本发明者经过刻苦钻研,终于发现能用少量的凝血酶和高浓蛋白C,能有效地活化蛋白C;通过把活化后的含活性蛋白C的溶液与阳离子交换剂接触,因而凝血酶或相当的蛋白酶和活性蛋白C被该交换剂吸收,接着,在适当的盐浓度条件下,单独洗脱活性蛋白C;因此可以制得基本不含凝血酶或相当的蛋白酶和/或未经活化的蛋白C的人活性蛋白C制剂;令人惊奇的是,用此法制得的人活性蛋白C制剂与用传统方法得到的人活性蛋白C相比,具有极高的比活度,从而完成了本发明。换言之,本发明的目的是提供一种高比活度,基本不含凝血酶或相当的蛋白酶,和/或未经活化的蛋白C的人活性蛋白C制剂及其制备方法。
附图简述
图1显示了本发明和传统制备方法制备的APC制剂的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的结果。
实施本发明的最佳方案
本发明的人活性蛋白C制剂比活度为3500U/mg或更大,比活度的单位定义为使正常人血浆中活性促凝血酶原激酶寿命(APTT)延长两倍的量,并且基本不含凝血酶或相当的蛋白,和/或未经活化的蛋白C。按照本发明制剂的制备方法,用凝血酶或相当的蛋白酶活化人蛋白C后,在pH5.0-6.0,NaCl浓度为80mM或更低条件下,把含有人活性蛋白C的溶液与阳离子交换剂接触,以使凝血酶和活性蛋白C被交换剂吸收,然后在盐浓度为0.1-0.35M条件下,单独洗脱出人活性蛋白C,因而只回收高纯度的人活性蛋白C。
在上述含蛋白C的溶液中,用凝血酶或相当的蛋白酶活化蛋白C,往含蛋白C浓度为0.5-8.0mg/ml的溶液中,加入凝血酶,至凝血酶/蛋白C的比值为1-20U/mg,在pH为6.0-8.0条件下进行活化,以有效激活大量的蛋白C。然后,进行脱除活化剂和APC的纯化步骤,其中,在pH为5.0-6.0,NaCl浓度为80mM或更小的条件下,把活化后含APC的溶液与阳离子交换剂接触,使交换剂吸收凝血酶和APC,然后在盐浓度为0.1-0.35M条件下,单独洗脱出活性蛋白C。
按照本发明活化人蛋白C的方法,有可能用少量的凝血酶有效地活化高浓度的蛋白C。此法很有利,因为它减少了活化过程中蛋白C的降解作用,而且以后脱除凝血酶也变得更容易了。APC的后续纯化步骤使凝血酶在洗脱液中浓度为0.001U/ml或更小,因此,APC能被定量地回收。另外,因为APC是经吸收后被洗脱出来,所以可得到浓缩的APC。并且,用本发明方法得到的APC制剂与那些用传统方法得到的制剂相比,具有极高的比活度。
此处所用的人活性蛋白C制剂的“比活度”是指APC活度与蛋白总量(mg)的比值。1个单位APC活度定义为使正常人血浆中的活性促凝血酶原激酶寿命(APTT)延长两倍的量。因此,实际测量APC活度按下列步骤进行:把稀释了的样品加入正常人血浆中,测定其APTT(秒),当测得的APTT值是对照物(缓冲液)的两倍时,该稀释度即被确定为APC样品的活度。
本发明制剂的主要成分APC,以及本发明制备方法的起始原料蛋白C,可以从任何来源中取得,但最好取自于人血浆。
本发明上述步骤中的活化步骤按下列方法进行:往含浓度为0.5-0.8mg/ml的蛋白C溶液中加入凝血酶,至凝血酶/蛋白C的比值为1-20U/mg,在pH为6.0-8.0,盐浓度为0.1-0.15M的条件下进行反应,例如,在37℃下反应5-6小时。
上述步骤得到的反应溶液,按要求校准pH值或盐浓度后,经过阳离子交换剂处理,纯化APC。用阳离子交换剂处理后,脱除了凝血酶和另外的杂质蛋白,如未被活化的蛋白C。此处所用的阳离子交换剂,只要是含有阳离子交换基(如:磺酸基,羧基)的不溶性载体均可,并且包括在传统技术中应用的阳离子交换剂,例如,阳离子交换树脂如S-琼脂糖(商品名),SP-葡聚糖凝胶(商品名),均由Parmacia制造,SP-Toyopearl(商品名),TSK Gel SP-5PW(商品名),均由Toyo Soda K.K.制造。其中,SP-葡聚糖凝胶和SP-Toyopearl最好。此步骤可用柱方法或分批方法进行。就脱除杂质蛋白效率而言,最好选用柱方法。
根据本发明,APC的纯化过程特点是:把活化作用的反应液与阳离子交换树脂接触,凝血酶和APC都被交换剂吸收,然后,在盐浓度为0.1-0.35M条件下,单独洗脱出活性蛋白C。经过此纯化过程制备的APC制剂基本不含凝血酶或相当的蛋白酶和/或未经活化的蛋白C,并且比活度极高,为3500U/mg或更高。
另外,本发明者为了消除用传统方法由蛋白C制备高比活度APC的一系列步骤中的缺点,进行了研究,结果发现了许多有用的改进,进一步提高了本发明效率。
已知一种纯化蛋白C的方法,其中,蛋白C用柠檬酸钡吸收和沉淀,用硫酸铵和DEAE-琼脂糖柱色谱法分馏纯化后,再经过制备聚酰胺凝胶电泳,葡聚糖硫酸琼脂糖色谱法等纯化过程,或用使蛋白C的抗体固定的凝胶纯化蛋白C的方法等,(J.Biol.Chem.,
251,355-363(1976);J.Chin.Invest.,
64,761-769(1979);Blood,
54,1272-(1979);FEBS LETTERS,
191,75-81(1985);J.Biol.Chem.,
261,11097-11105(1986))。然而,考虑到产量,生产效率等。上述方法虽然适用于实验室,却不适用于工业上大规模的纯化。另外值得注意的是,虽然,在用使蛋白C的抗体固定的凝胶进行纯化中,用强的离液序列高的阴离子或酸性pH,或如EDTA等强螯合剂洗脱,但是从凝胶中仍释放有害的痕量蛋白C抗体,进入洗脱液中。
本发明者已经发现,用柠檬酸缓冲液代替强螯合剂EDTA洗脱蛋白C时,可去除由凝胶中释放出的蛋白C抗体。在pH为7.0-9.0条件下,把得到的含蛋白C的溶液与阴离子交换剂接触,可使交换剂吸收蛋白C,由此脱除痕量的蛋白C抗体,接着,在盐浓度为0.3-1.0M的条件下,洗脱蛋白C。此过程几乎能脱除全部的蛋白C抗体。
基于上述发现,本发明提供了一种工业规模制活性蛋白C的改进方法,包括下列步骤:
(1)把含人蛋白C的溶液与阴离子交换剂接触,使交换剂吸收蛋白C,此后洗脱蛋白C,制得具有Gla结构的人蛋白C;
(2)把含人蛋白C的溶液与吸收剂接触,该吸收剂即是一种与钙离子相连的特殊识别蛋白C抗体附着的不溶性载体,条件是有使吸收剂能吸收蛋白C的钙存在,然后用柠檬酸缓冲液洗脱出蛋白C;
(3)把含蛋白C的溶液与阴离子交换剂接触,使蛋白C被交换剂吸收,此后,从上述含蛋白C的溶液中洗脱出蛋白C,除去蛋白C抗体;
(4)用凝血酶或相当的蛋白酶活化人蛋白C,其中,在pH为6.0-8.0条件下,往含蛋白C的溶液中加入凝血酶,至凝血酶/蛋白C的比值为1-20U/mg;
(5)然后,在pH为5.0-6.0,盐浓度为80mm或更低条件下,把活化后含人活性蛋白C的溶液与阳离子交换剂接触,使凝血酶和活性蛋白C都被交换剂吸收,然后,在盐浓度为0.1-0.35M条件下,单独洗脱,回收人活性蛋白C。
如果把纯化了的活性蛋白用于治疗,尤其当纯化的活性蛋白C是从人血浆中得到时,有感染存在于原材料中的病毒的危险(例如:肝炎病毒,HIV等),因此,有必要脱除和使病毒失活。在血制剂中,应进行下述步骤防止病毒性感染:通过原材料过筛,膜过滤,吸收,柱色谱,沉淀分馏脱除病毒,或用溶剂洗涤剂法,β-丙醇酸内酯,加热,电磁辐射等方法使病毒失活,或此两种方法结合使用。但是,很难实现既脱除和使病毒失活,而又不导致蛋白变性,生物活性降低,产量降低等。本发明者发现,对于活性蛋白C制剂,把脱除病毒膜和连合使用在0.5-10%(W/V)的清蛋白作稳定剂存在下升华干燥加热,可以有效进行病毒脱除和使之失活。用这个过程,可以有效脱除和失活病毒,而不导致活性蛋白C变性,生理活性和产量下降。
本发明者为了发展一种对蛋白C纯化和活化的有效方法, 以及进一步用于医疗时防止病毒感染,而进行了研究,结果发现:用蛋白C抗体的亲合色谱法纯化蛋白C时,利用柠檬酸盐缓冲溶液洗脱;在高浓度下活化蛋白C;通过阳离子交换剂的吸收作用纯化活性蛋白C是有效的。基于这些纯化步骤,以及通过脱除病毒膜除去病毒和通过升华干燥加热使病毒失活相结合,本发明者建立了生产大量高纯活性蛋白C,并且以高产率运用于医疗技术。
本发明的APC制剂,除杂质蛋白水平下降外,其特点是:与用传统方法制备的APC相比,本发明的APC制剂显示了更高的比活度(APC活度/蛋白总量(mg)),传统方法如,在Biochemistiry16,5824-5831(1977)公开的方法。实际上,本发明的APC制剂的比活度比传统制备的APC高1.5-2倍。观察到比活度增加的主要原因还不清楚,但是估计杂质蛋白(APC降解产品,未经活化的蛋白C,凝结蛋白等)的脱除可能是一个主要因素,而这是传统方法无法达到的。
通过下列实例详细描述本发明,但并不仅限于此。实例11.1高比活度活性蛋白C制剂的制备:
从血浆中得到蛋白C制剂的溶液(8.7mg/ml蛋白C,pH7.5,导电率为34.3ms/cm),经20mM柠檬酸/0.1M氯化钠缓冲液(pH6.0)渗析,然后稀释至蛋白C的浓度为4mg/ml。往此溶液中加入人凝血酶至最终浓度为60U/ml,在37℃下,加热此混合物5小时来活化蛋白C。
活化后,用20mM的柠檬酸缓冲液(pH6.0)稀释活化后的溶液两次,用于阳离子交换柱(SP-Toyopearl),脱除凝血酶。用含60mM氯化钠的20mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)充分洗涤交换剂,然后,用含0.3M氯化钠的20mM柠檬酸缓冲液洗脱出活性蛋白C。在此条件下,活性蛋白C被单独洗脱出来,而没有凝血酶洗脱液。残存的凝血酶浓度为0.001U/ml或更低。得到的APC制剂显示出4750.9U/mg的比活度1.2活化后,在阳离子色谱中吸收和洗脱APC条件的研究:(1)吸收条件:
用20mM柠檬酸缓冲液,在pH为6.0-7.0和盐浓度为0.0-0.15M范围内,检测APC的吸收条件,考虑到APC的稳定性,此范围能够适用。在pH为7.0和盐浓度为0.1M条件下,很难吸收APC。在pH为6.5和盐浓度为0.1M条件下,虽然部分APC被吸收,但大部分APC被洗脱。在pH为6.0和盐浓度为0.1M条件下,大部分APC被吸收到色谱载体上。
基于这些结果,固定pH为6.0,用不同盐浓度研究了APC吸收程度。当盐浓度为0.5M时,不仅APC,而且用于活化作用的部分凝血酶都被洗脱,然而,当盐浓度为0.1M时,大部分APC被吸收,但吸收并不充分,部分APC如上述情况那样被洗脱。因此,盐浓度调节为80mM,此时,可观察到APC被适当吸收到色谱载体上。(2)洗脱条件:
用含60mM NaCl的20mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)使色谱载体平衡后,在NaCl浓度为60mM-0.5M间进行梯度洗脱。当NaCl浓度为0.1M左右,渐渐开始洗脱APC,当NaCl浓度为0.35M或更高时,凝血酶也被部分洗脱。因此,最佳洗脱条件是NaCl浓度低于0.35M。参考实例1用传统方法制备活性蛋白C制剂:
将以上蛋白C制剂的溶液(8.7mg/ml蛋白C,pH7.5,导电率为34.3ms/cm),用50mM Tris-HCl/0.1M NaCl缓冲液(pH8.0)渗析后,稀释成蛋白C的浓度为0.7mg/ml。往此溶液中加入凝血酶至最终浓度为10U/ml,在37℃下,加热此混合物5小时来活化蛋白C。活化后,把反应液加入阳离子交换柱(SP-Toyopearl)中,交换柱预先经洗涤,并用50mM Tris-HCl/0.15MNaCl缓冲液(pH8.0)平衡,由此,凝血酶被吸收,活性蛋白C被回收到洗脱液中。此溶液中,活性蛋白C的比活度为3259.6U/mg。实例2本发明制备方法与传统制备方法的对比:
用电泳法等对比实例1和参考实例1制剂的比活度和纯度。2.1活性蛋白C活度的测定:
根据下列过程测定APC的活度。
1个单位APC活度定义为使活性促凝血酶原激酶寿命(APTT,秒)延长两倍,达到正常人血浆两倍时所需APC的数量。因此,测定APC活度的方法中,是把稀释样品加入到正常人血浆中,测定APTT(秒),当测得的APTT值是对照液(缓冲液)的两倍时,稀释情况被认为是样品的APC活度。(步骤)
样品用含1%HSA的veronal缓冲液稀释400倍、500倍、800倍或1000倍。在37℃下,往每100μl的标准液(缓冲液)或样品稀释液中相继加入100μl正常人血浆(如:Citrol I:BaxterDiagnostics Inc.)和100μl APTT试剂(如:Actin:Baxter DiagnosticsInc.),间隔时间为15秒,搅拌此混合物,2分钟后,加入100μl0.025M的氯化钙,测定凝结时间。(活度计算)
从每个对照样和样品的稀释(X)的APTT值(Y)中,得到如下的线性回归公式以及相关系数103/X和Y:
Y=A(103/X)+B
从下列公式中得到X1的值:
X1=103{(Y1-B)/A}其中,Y1的值是对照样APTT(秒)的两倍,被当作样品的APC活度(U/ml)。(蛋白测定)
在测定吸光度A280基础上,测定活性蛋白C的浓度,如由APC的氨基酸组合物估计值那样(J.Clin.Invest.,
64,761-769(1979)),以估计浓度为1%(W/N)(10mg/ml)APC的吸光度A280是14.5为基础。因此,由下列公式计算活性蛋白C的浓度:
活性蛋白C的浓度(mg/ml)=A280测定值/1.45
以上述测定的APC的活度和浓度为基础,计算出此处所用APC的比活度(U/mg)。2.2活化条件对APC比活度的影响:
利用刚活化后的样品,研究不同活化条件对比活度的影响。活化作用进行后,测定APC活度,其中,测定前,往1ml样品中分别加入1U和10U抗凝血酶和肝素,在37℃下,加热混合物30分钟,使凝血酶失活。结果显示在表1中。发现,与传统方法的活化条件(pH8.0,NaCl浓度为0.15M)相比,本发明的活化条件(pH6.0,NaCl浓度为0.1M)对比活度无影响。
表1
传统方法 本发明蛋白浓度(mg/ml) 0.72 1.38活度(U/ml) 2069.9 4133.4比活度(U/mg) 2885.9 3089.32.3用阳离子色谱处理前后比活度的比较:
利用不同样品,比较本发明中,用阳离子色谱处理前后,APC的比活度。结果总结在表2中。用传统制备方法几乎观察不到比活度增加。相反,本发明的制剂APC的比活度(U/mg)超过了4500,用色谱处理后,APC的比活度增加了约1.5倍。比活度增加的主要原因还不清楚,但估计脱除用传统方法无法除去的杂质蛋白(APC降解产品,未经活化的蛋白C,凝结蛋白等)可能是一个主要原因。
表2
比活度(U/mg) 增加率
样品
前
后
(倍数)
色 谱
发明1 3089.3 4750.9 1.54
发明2 3108.3 5750.5 1.85
发明3 3869.5 5107.8 1.32传统制备方法 2885.9 3259.6 1.132.4用电泳比较阳离子色谱处理前后:
在传统方法的阳离子色谱过程中,是在pH为8.0时洗脱APC,然而,在本发明方法中,首先在pH为6.0时吸收APC,然后洗脱。图1显示了在传统方法和本发明方法中,SDS-PAGE的结果。
按照本发明的方法,其中,当pH为6.0时,APC被吸收,未经活化的蛋白C被洗脱掉,那些分子量比APC或高或低的馏分区域被脱除。另外,与在pH为8.0时洗脱的馏分相比,经pH6.0时吸收,然后洗脱得到的馏分显示出更尖锐听对应APC的谱带,因此,有可能除去未经活化的蛋白C。另一方面,虽然用传统方法得到的洗脱馏分中,比APC分子量或高或低的馏分区域有一定数量的降低,但并未完全脱除这些馏分带。2.5APC制剂中未经活化的蛋白C含量:
未经活化的蛋白C含量降低被看做是导致本发明中高比度APC制剂比活度增加的一个原因。因此,测定了由本发明和传统方法制备的APC制剂中,未经活化的蛋白C的含量。根据通常的议定书,使用ELISA系统应用对蛋白C有特效的单克隆抗体进行测定。结果显示在表3。
表3
样品 APC的比活度 未经活化的蛋白C含
(U/mg)
量(%:W/W)本发明制剂1 5750.5 0.47本发明制剂2 5107.8 1.22本发明制剂3 4457.1 0.36传统的制剂1 2661.7 5.41传统的制剂2 3286.2 5.83传统的制剂3 2470.4 3.93
比活度低的传统制剂中,未经活化的蛋白C含量为4-6%,而比活度高的本发明制剂中,未经活化蛋白C的含量少至0.4-1.2%。虽然传统制剂中,未经活化的蛋白C含量高于本发明的制剂,但是,含量很小,因此,不易对制剂的比活度产生直接影响。为了证实这一点,往含有极少量未经活化蛋白C的本发明制剂3中,加入蛋白C,直到最后浓度为5%,测定了APC活度(APTT)。结果,与未加蛋白C的制剂相比,没有观察到APTT值的变化(参见表4)。因此,未经活化的蛋白C含量降低,并非是本发明APC制剂比活度增加的一个主要因素。
表4
APC的比活度(U/mg)
样品
没加蛋白C
加入5%的蛋白C
本发明制剂3 5077.9 5173.7
传统的制剂3 2726.0 2725.7实例3活性蛋白C制剂的制备:
不加热,熔化工业规模的新鲜冷冻的人血浆(100L),通过离心过滤法分离出产生的沉淀。把得到的上层清液加入到阴离子交换剂(DEAE-葡聚糖凝胶A-50)中。用含0.1M氯化钠的20mM的柠檬酸缓冲液(pH7.0)充分清洗交换剂,再用含0.5M氯化钠的20mM的柠檬酸缓冲液(pH7.0)洗脱具有Gla结构的人蛋白C馏分。
往此溶液中加入30mM氯化钙,然后,将此混合物加入到使用抗蛋白C抗体的亲合色谱柱中。用含0.15M氯化钠和2mM氯化钙的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)充分清洗柱子,此后,用含0.15M氯化钠的20mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)洗脱蛋白C。
用0.1M的氢氧化钠将此溶液的pH值调到8.0,然后加入到阴离子交换柱(Q-Sepharose Fast Flow)中。用含0.15M氯化钠的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)好好清洗交换剂,用含0.4M氯化钠的0.3M甘氨酸缓冲液(pH7.0)进行洗脱。此步骤得到的蛋白C已被证实,在SDS-PAGE中是单一谱带。
为了活化,用20mM柠檬酸缓冲液(pH6.0),将由上述过程得到的纯化了的蛋白C溶液稀释至蛋白C浓度为4mg/ml。往此溶液中加入凝血酶,至最终浓度为60U/ml,在37℃下,加热混合物5小时,来活化蛋白C。
活化后,为了脱除凝血酶,用20mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)把活化后的溶液稀释两倍,再加入到阳离子交换柱(SP-Toyopearl)中。用含60mM氯化钠的20mM柠檬酸缓冲液好好清洗交换剂,然后,用含0.35M氯化钠的20mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)洗脱活性蛋白C。在此条件下,活性蛋白C被单独洗脱,而不洗脱凝血酶,由此,除去了凝血酶。用脱除病毒膜将得到的活性蛋白C溶液进行过滤(Planova 35N manufactured byAsahi Chemical Industries,K.K.)。反应后的溶液中,活性蛋白C的比活度为5392.7U/mg,残余凝血酶的浓度为0.001U/ml或更低。
将滤液调到最终浓度时,含:NaCl 0.7%(W/V),甘氨酸0.5%(W/V),柠檬酸钠0.65%(W/V),人清蛋白2.5%(W/V),APC的活度600U/ml。这样制备的活性蛋白C溶液经无菌过渡,冷冻干燥后,在65℃下,干燥加热96小时,使病毒失活,最后得到适合医疗应用的活性蛋白C。
Claims (5)
1.一种人活性蛋白C制剂,该人活性蛋白C制剂的比活度为3500U/mg或更大,比活度的单位定义为使正常人血浆中活性促凝血酶原激酶寿命(APTT)延长两倍的APC的量,并且基本不含能将蛋白C转化为活性蛋白C的蛋白酶和/或用于活化的起始蛋白C酶原。
2.权利要求1的人活性蛋白C制剂,其中比活度为4000U/ml或更大。
3.权利要求1或2的人活性蛋白C制剂,其中,所述制剂是用凝血酶或相当的蛋白酶使未经活化的人蛋白C活化而制备的。
4.一种纯化人活性蛋白C的方法,该方法包括:用凝血酶或相当的蛋白酶活化人蛋白C后,在pH5.0-6.0,盐浓度为80mM或更低条件下,把含人活性蛋白C的溶液与阳离子交换剂接触,使交换剂吸收凝血酶和活性蛋白C,并且在盐浓度为0.1-0.35M条件下,单独洗脱出人活性蛋白C。
5.一种制备权利要求1的人活性蛋白C制剂的方法,所述方法包括下列步骤:
(1)将含人蛋白C的溶液与阴离子交换剂接触,使蛋白C被吸收到交换剂中,然后洗脱蛋白C,制备具有Gla结构的人蛋白C部分;
(2)在钙离子存在下,将含人蛋白C的溶液与吸收剂接触,该吸收剂即是一种与钙离子相连的特异识别蛋白C的抗体附着的不溶性载体,使吸收剂吸收蛋白C,然后用柠檬酸缓冲液洗脱蛋白C;
(3)将含蛋白C的溶液与阴离子交换剂接触,使蛋白C被交换剂吸收,然后从中洗脱蛋白C,由此从上述含蛋白C的溶液中除去蛋白C抗体;
(4)用凝血酶或相当的蛋白酶使人蛋白C活化,其中,在pH为6.0-8.0条件下,按凝血酶/蛋白C的比值为1-20U/mg往含蛋白C的溶液中加入凝血酶;
(5)在pH为5.0-6.0,盐浓度为80mM或更低条件下,将活化后含人活性蛋白C的溶液与阳离子交换剂接触,使凝血酶和人活性蛋白C都被交换剂吸收,然后,在盐浓度为0.1-0.35M条件下,单独洗脱回收人活性蛋白C。
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