JPH1052267A - プロトロンビンの活性化方法および該方法に基づくトロンビンの製造方法 - Google Patents
プロトロンビンの活性化方法および該方法に基づくトロンビンの製造方法Info
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- JPH1052267A JPH1052267A JP8227695A JP22769596A JPH1052267A JP H1052267 A JPH1052267 A JP H1052267A JP 8227695 A JP8227695 A JP 8227695A JP 22769596 A JP22769596 A JP 22769596A JP H1052267 A JPH1052267 A JP H1052267A
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
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- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 プロトロンビンをトロンビンに活性化する反
応において、プロトロンビン含有水溶液として「プロト
ロンビン複合体」または「プロトロンビンおよび血液凝
固第Ｘ因子を主成分とする水溶液」という入手が容易な
原材料を用い、トロンボプラスチンの非存在下にてもト
ロンビンへの変換を達成する手段に基づく工業的規模で
のトロンビンの効率的製造方法を提供する。 【構成】 プロトロンビン含有水溶液を、ポリエチレン
グリコールまたはポリエチレングリコールおよびカルシ
ウム塩で処理することを特徴とする。
応において、プロトロンビン含有水溶液として「プロト
ロンビン複合体」または「プロトロンビンおよび血液凝
固第Ｘ因子を主成分とする水溶液」という入手が容易な
原材料を用い、トロンボプラスチンの非存在下にてもト
ロンビンへの変換を達成する手段に基づく工業的規模で
のトロンビンの効率的製造方法を提供する。 【構成】 プロトロンビン含有水溶液を、ポリエチレン
グリコールまたはポリエチレングリコールおよびカルシ
ウム塩で処理することを特徴とする。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本願発明はトロンビンの製造方法
に関する。より詳細には、工業的規模でトロンビンを得
る際に、トロンボプラスチンの非存在下にてもポリエチ
レングリコールまたはポリエチレングリコールおよびカ
ルシウム塩による処理を施すことにより、プロトロンビ
ンをトロンビンに活性化し得る方法および該活性化工程
を含むトロンビンの製造方法に関する。
に関する。より詳細には、工業的規模でトロンビンを得
る際に、トロンボプラスチンの非存在下にてもポリエチ
レングリコールまたはポリエチレングリコールおよびカ
ルシウム塩による処理を施すことにより、プロトロンビ
ンをトロンビンに活性化し得る方法および該活性化工程
を含むトロンビンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】トロ
ンビンは、分子量約３７,０００のセリンプロテアーゼ
であり、血液凝固反応の最終段階で働くタンパク質分解
酵素である。トロンビンは、フィブリノゲンに作用して
フィブリンを生成することにより血液を凝固させる。従
って、トロンビンは、外科領域における局所止血剤とし
て、また、内科領域における上部消化管出血などの止血
剤として、臨床的に用いられている。また、さらに、フ
ィブリン接着剤の１成分としても応用されている。
ンビンは、分子量約３７,０００のセリンプロテアーゼ
であり、血液凝固反応の最終段階で働くタンパク質分解
酵素である。トロンビンは、フィブリノゲンに作用して
フィブリンを生成することにより血液を凝固させる。従
って、トロンビンは、外科領域における局所止血剤とし
て、また、内科領域における上部消化管出血などの止血
剤として、臨床的に用いられている。また、さらに、フ
ィブリン接着剤の１成分としても応用されている。
【０００３】トロンビンは、循環血液中では前駆物質で
あるプロトロンビンの形態で存在しており、活性化第Ｘ
因子によって限定分解を受けて生成される。従来、トロ
ンビンの製造は、ヒトおよびウシなどの血漿を原料とし
て、まず、プロトロンビンを抽出精製し、得られた精製
プロトロンビンにトロンボプラスチンなどを作用させて
トロンビンを得る方法が行なわれてきた。すなわち、ト
ロンビンへの転化は精製されたプロトロンビンを対象に
していた。得られたトロンビンは、さらに、各種の数工
程を経て精製される。また、この方法を基本とした改良
方法として、「血漿を低温エタノール処理後陰イオン交
換体処理し、得られた精製プロトロンビンをトロンビン
に転化し、さらに陽イオン交換体処理により精製する方
法（特開平３-１２８３９８号公報）」などが知られて
いる。
あるプロトロンビンの形態で存在しており、活性化第Ｘ
因子によって限定分解を受けて生成される。従来、トロ
ンビンの製造は、ヒトおよびウシなどの血漿を原料とし
て、まず、プロトロンビンを抽出精製し、得られた精製
プロトロンビンにトロンボプラスチンなどを作用させて
トロンビンを得る方法が行なわれてきた。すなわち、ト
ロンビンへの転化は精製されたプロトロンビンを対象に
していた。得られたトロンビンは、さらに、各種の数工
程を経て精製される。また、この方法を基本とした改良
方法として、「血漿を低温エタノール処理後陰イオン交
換体処理し、得られた精製プロトロンビンをトロンビン
に転化し、さらに陽イオン交換体処理により精製する方
法（特開平３-１２８３９８号公報）」などが知られて
いる。
【０００４】トロンボプラスチンは、主にヒト胎盤から
調製されたものが用いられているが、原料の調達が困難
であり必ずしも充分量が入手できるとは言えない。ま
た、製造工程で完全に除去することができず、最終製品
に混入する可能性もある。トロンビンへの転化方法とし
ては、上記のトロンボプラスチンを用いる方法以外に、
ヘビ毒を用いる方法、高濃度クエン酸塩を用いる方法
（特開平４-３６５４８１号公報、特開平５-１９４２６
１号公報）等が知られている。しかし、ヘビ毒を用いる
場合も、トロンボプラスチン同様、原料の調達が困難で
あると同時に最終製品への混入が危惧される。また、高
濃度クエン酸塩による自然転化法は、トロンボプラスチ
ン等の組織タンパク質が付加的に混入しないという利点
はあるものの、工業的製法としては十分な転化効率が保
証されているとは言えない。
調製されたものが用いられているが、原料の調達が困難
であり必ずしも充分量が入手できるとは言えない。ま
た、製造工程で完全に除去することができず、最終製品
に混入する可能性もある。トロンビンへの転化方法とし
ては、上記のトロンボプラスチンを用いる方法以外に、
ヘビ毒を用いる方法、高濃度クエン酸塩を用いる方法
（特開平４-３６５４８１号公報、特開平５-１９４２６
１号公報）等が知られている。しかし、ヘビ毒を用いる
場合も、トロンボプラスチン同様、原料の調達が困難で
あると同時に最終製品への混入が危惧される。また、高
濃度クエン酸塩による自然転化法は、トロンボプラスチ
ン等の組織タンパク質が付加的に混入しないという利点
はあるものの、工業的製法としては十分な転化効率が保
証されているとは言えない。
【０００５】また、特開平５-１８６３６９号公報、特
開平６-４６８５２号公報および国際特許公開ＷＯ９５/
３１５３６号公報には、塩化カルシウムにより、プロト
ロンビンをトロンビンに転化する方法が開示されてい
る。トロンビンへの変換処理に付されるプロトロンビン
として、精製されたプロトロンビンではなくプロトロン
ビン複合体を対象とする方法も、特開平７-３３７９９
号公報に開示されている。これらの方法は、限られた条
件下で有効な製造方法となり得るが、依然、簡便かつ有
効な方法とは言えない。
開平６-４６８５２号公報および国際特許公開ＷＯ９５/
３１５３６号公報には、塩化カルシウムにより、プロト
ロンビンをトロンビンに転化する方法が開示されてい
る。トロンビンへの変換処理に付されるプロトロンビン
として、精製されたプロトロンビンではなくプロトロン
ビン複合体を対象とする方法も、特開平７-３３７９９
号公報に開示されている。これらの方法は、限られた条
件下で有効な製造方法となり得るが、依然、簡便かつ有
効な方法とは言えない。
【０００６】このような状況下、本願発明の課題は、ト
ロンビンの工業的規模での効率的製造方法を確立するこ
とである。すなわち、本願発明の目的は、工業的規模で
トロンビンを得る際に原材料の入手が容易で、かつ効率
よくプロトロンビンからトロンビンへと転化する方法を
提供することにある。
ロンビンの工業的規模での効率的製造方法を確立するこ
とである。すなわち、本願発明の目的は、工業的規模で
トロンビンを得る際に原材料の入手が容易で、かつ効率
よくプロトロンビンからトロンビンへと転化する方法を
提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】そこで、本願発明者等は
上述の諸問題に鑑み鋭意検討した結果、効率的なトロン
ビンの製造方法をもたらす本願発明を完成した。以下、
本願発明をさらに詳細に説明する。本願発明は、トロン
ボプラスチンの非存在下にてもプロトロンビンからトロ
ンビンへの変換を達成し得る活性化方法および該活性化
工程を含むトロンビンの製造方法である。本願発明の方
法における好ましい態様として、トロンビンへの変換処
理に付される対象物は、「プロトロンビン複合体」また
は「プロトロンビンおよび血液凝固第Ｘ因子を主成分と
する水溶液」である。ここで用いられるプロトロンビン
複合体は、血液凝固因子の一つであるプロトロンビン
（血液凝固第II因子）とともに、その他の血液凝固に関
係する因子を含んだものである。プロトロンビンととも
に含まれる成分としては、血液凝固第VII因子、第IX因
子、第Ｘ因子などが挙げられる。上記のトロンビンへの
変換処理に付される対象物は高純度精製品である必要は
なく、粗製品であってもよい。「プロトロンビン複合
体」または「プロトロンビンおよび血液凝固第Ｘ因子を
主成分とする水溶液」の調製方法としては、血漿を陰イ
オン交換体で処理してプロトロンビン複合体を調製する
方法、血漿からクリオプレシピテートを除いた脱クリオ
血漿を用いてプロトロンビン複合体を調製する方法等が
挙げられる。原料となる血漿の由来も特に問わず、例え
ば、ウシ由来のものヒト由来のもの等が挙げられるが、
好ましくはヒト由来のものである。
上述の諸問題に鑑み鋭意検討した結果、効率的なトロン
ビンの製造方法をもたらす本願発明を完成した。以下、
本願発明をさらに詳細に説明する。本願発明は、トロン
ボプラスチンの非存在下にてもプロトロンビンからトロ
ンビンへの変換を達成し得る活性化方法および該活性化
工程を含むトロンビンの製造方法である。本願発明の方
法における好ましい態様として、トロンビンへの変換処
理に付される対象物は、「プロトロンビン複合体」また
は「プロトロンビンおよび血液凝固第Ｘ因子を主成分と
する水溶液」である。ここで用いられるプロトロンビン
複合体は、血液凝固因子の一つであるプロトロンビン
（血液凝固第II因子）とともに、その他の血液凝固に関
係する因子を含んだものである。プロトロンビンととも
に含まれる成分としては、血液凝固第VII因子、第IX因
子、第Ｘ因子などが挙げられる。上記のトロンビンへの
変換処理に付される対象物は高純度精製品である必要は
なく、粗製品であってもよい。「プロトロンビン複合
体」または「プロトロンビンおよび血液凝固第Ｘ因子を
主成分とする水溶液」の調製方法としては、血漿を陰イ
オン交換体で処理してプロトロンビン複合体を調製する
方法、血漿からクリオプレシピテートを除いた脱クリオ
血漿を用いてプロトロンビン複合体を調製する方法等が
挙げられる。原料となる血漿の由来も特に問わず、例え
ば、ウシ由来のものヒト由来のもの等が挙げられるが、
好ましくはヒト由来のものである。
【０００８】上述のようにして得た「プロトロンビン複
合体」または「プロトロンビンおよび血液凝固第Ｘ因子
を主成分とする水溶液」を、４〜３７℃、好ましくは１
０〜２５℃で、ポリエチレングリコールまたはポリエチ
レングリコールおよびカルシウム塩で処理することによ
り、プロトロンビンからトロンビンへの活性化反応を行
なう。反応液中のプロトロンビン濃度としては、２０〜
１２０単位/ｍｌ程度が例示される。本願発明で言及す
るポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコー
ルおよびカルシウム塩での処理とは、プロトロンビンお
よび血液凝固第Ｘ因子を主成分とする水溶液にポリエチ
レングリコールまたはポリエチレングリコールおよびカ
ルシウム塩を添加・混合してトロンビンへの活性化反応
を行なうものである。具体的には、ポリエチレングリコ
ール溶液またはポリエチレングリコール溶液およびカル
シウム塩溶液をプロトロンビンおよび血液凝固第Ｘ因子
を主成分とする水溶液に添加し、攪拌・混合後放置する
方法や、ポリエチレングリコール固形物またはポリエチ
レングリコール固形物およびカルシウム塩固形物を直接
プロトロンビンおよび血液凝固第Ｘ因子を主成分とする
水溶液に添加し、攪拌・混合後放置する方法が挙げられ
るが、溶液を添加する前者の方法が好ましい。
合体」または「プロトロンビンおよび血液凝固第Ｘ因子
を主成分とする水溶液」を、４〜３７℃、好ましくは１
０〜２５℃で、ポリエチレングリコールまたはポリエチ
レングリコールおよびカルシウム塩で処理することによ
り、プロトロンビンからトロンビンへの活性化反応を行
なう。反応液中のプロトロンビン濃度としては、２０〜
１２０単位/ｍｌ程度が例示される。本願発明で言及す
るポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコー
ルおよびカルシウム塩での処理とは、プロトロンビンお
よび血液凝固第Ｘ因子を主成分とする水溶液にポリエチ
レングリコールまたはポリエチレングリコールおよびカ
ルシウム塩を添加・混合してトロンビンへの活性化反応
を行なうものである。具体的には、ポリエチレングリコ
ール溶液またはポリエチレングリコール溶液およびカル
シウム塩溶液をプロトロンビンおよび血液凝固第Ｘ因子
を主成分とする水溶液に添加し、攪拌・混合後放置する
方法や、ポリエチレングリコール固形物またはポリエチ
レングリコール固形物およびカルシウム塩固形物を直接
プロトロンビンおよび血液凝固第Ｘ因子を主成分とする
水溶液に添加し、攪拌・混合後放置する方法が挙げられ
るが、溶液を添加する前者の方法が好ましい。
【０００９】ポリエチレングリコールは、分子量約２,
０００〜６,０００の製品が好適に用いられ、その処理
濃度は１〜３０％（ｗ/ｖ）程度である。本願発明にお
いて使用されるポリエチレングリコールは、タンパク質
の沈殿剤として広く使用されている高分子量の重合体で
ある。このポリエチレングリコールは無毒でなければな
らず、平均分子量約４,０００のＰＥＧ４,０００は、ポ
リエチレングリコール類の好ましい製品である。また、
カルシウム塩としては、塩化カルシウム、水酸化カルシ
ウム、酢酸カルシウム等が例示される。カルシウム塩の
処理濃度は１００ｍＭ以下であるが、２〜２０ｍＭ程度
が好ましい。処理時間は１〜７日程度が例示されるが、
反応溶液中の組成の変動により増減する。反応液は、好
ましい態様として付加的にグリセロールが添加される。
高濃度のグリセロールは、活性化反応で形成されたトロ
ンビンを安定化し自己分解による失活を抑制することに
より、トロンビンの収量増加に寄与する。
０００〜６,０００の製品が好適に用いられ、その処理
濃度は１〜３０％（ｗ/ｖ）程度である。本願発明にお
いて使用されるポリエチレングリコールは、タンパク質
の沈殿剤として広く使用されている高分子量の重合体で
ある。このポリエチレングリコールは無毒でなければな
らず、平均分子量約４,０００のＰＥＧ４,０００は、ポ
リエチレングリコール類の好ましい製品である。また、
カルシウム塩としては、塩化カルシウム、水酸化カルシ
ウム、酢酸カルシウム等が例示される。カルシウム塩の
処理濃度は１００ｍＭ以下であるが、２〜２０ｍＭ程度
が好ましい。処理時間は１〜７日程度が例示されるが、
反応溶液中の組成の変動により増減する。反応液は、好
ましい態様として付加的にグリセロールが添加される。
高濃度のグリセロールは、活性化反応で形成されたトロ
ンビンを安定化し自己分解による失活を抑制することに
より、トロンビンの収量増加に寄与する。
【００１０】カルシウム塩で処理しプロトロンビンをト
ロンビンに転化することを特徴とするトロンビンの製造
方法は、前述のごとく特開平５-１８６３６９号公報、
特開平６-４６８５２号公報および国際特許公開ＷＯ９
５/３１５３６号公報に開示されている。しかし、カル
シウム塩の存在下でポリエチレングリコール処理を行な
うことで、プロトロンビンからトロンビンへの活性化反
応が大きく促進されることを示唆する知見は全くなかっ
た。さらに、カルシウム塩の非存在下においても、ポリ
エチレングリコール処理によりプロトロンビンからトロ
ンビンへの活性化反応が進行することは、完全なる新規
な発明である。 従って、本願発明は、前述の先行技術
とは、方法および効果のいずれの観点についても異なる
新規な知見を与えていると言うことができる。また、本
願発明によれば、「工業的規模でトロンビンを得る際に
原材料の入手が容易で、かつ効率よくプロトロンビンか
らトロンビンへと転化する」という目的を達することが
できる。
ロンビンに転化することを特徴とするトロンビンの製造
方法は、前述のごとく特開平５-１８６３６９号公報、
特開平６-４６８５２号公報および国際特許公開ＷＯ９
５/３１５３６号公報に開示されている。しかし、カル
シウム塩の存在下でポリエチレングリコール処理を行な
うことで、プロトロンビンからトロンビンへの活性化反
応が大きく促進されることを示唆する知見は全くなかっ
た。さらに、カルシウム塩の非存在下においても、ポリ
エチレングリコール処理によりプロトロンビンからトロ
ンビンへの活性化反応が進行することは、完全なる新規
な発明である。 従って、本願発明は、前述の先行技術
とは、方法および効果のいずれの観点についても異なる
新規な知見を与えていると言うことができる。また、本
願発明によれば、「工業的規模でトロンビンを得る際に
原材料の入手が容易で、かつ効率よくプロトロンビンか
らトロンビンへと転化する」という目的を達することが
できる。
【００１１】活性化反応で得られたトロンビンは、公知
の方法により精製される。精製方法としては、陽イオン
交換体処理が例示されるが、他の公知の方法によりさら
に精製することもできる。当該トロンビンは、当業者に
おいて広く知られている手法により製剤化される。この
際、必要に応じて、医薬上許容される担体、添加剤など
の添加および除菌濾過、分注、凍結乾燥、加熱などが通
常の方法に準じて行われる。
の方法により精製される。精製方法としては、陽イオン
交換体処理が例示されるが、他の公知の方法によりさら
に精製することもできる。当該トロンビンは、当業者に
おいて広く知られている手法により製剤化される。この
際、必要に応じて、医薬上許容される担体、添加剤など
の添加および除菌濾過、分注、凍結乾燥、加熱などが通
常の方法に準じて行われる。
【００１２】
【発明の効果】本願発明により、入手が容易な原材料を
用い工業的規模で効率よくトロンビンを調製することが
可能となる。以下に、試験例並びに実施例を挙げて本願
発明を具体的に説明するが、本願発明はこれらの例に何
等限定されるものではない。
用い工業的規模で効率よくトロンビンを調製することが
可能となる。以下に、試験例並びに実施例を挙げて本願
発明を具体的に説明するが、本願発明はこれらの例に何
等限定されるものではない。
【００１３】
【実施例】調製例１ ヒト血漿から得たクリオ上清を、陰イオン交換樹脂に吸
着させた。プロトロンビンおよび第Ｘ因子を含有する画
分を、０.７Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液（ｐＨ７.
０）で溶出・回収し、１０％ポリエチレングリコール
４,０００（ＰＥＧ４,０００）に不溶な物質を除去する
ＰＥＧ分画によりプロトロンビンおよび凝固第Ｘ因子を
精製した。
着させた。プロトロンビンおよび第Ｘ因子を含有する画
分を、０.７Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液（ｐＨ７.
０）で溶出・回収し、１０％ポリエチレングリコール
４,０００（ＰＥＧ４,０００）に不溶な物質を除去する
ＰＥＧ分画によりプロトロンビンおよび凝固第Ｘ因子を
精製した。
【００１４】調製例２ 調製例１に従って調製したプロトロンビンおよび第Ｘ因
子を、Ｑ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーによ
り精製した。得られたプロトロンビンの純度は、約４血
漿単位/Ａ280であった。
子を、Ｑ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーによ
り精製した。得られたプロトロンビンの純度は、約４血
漿単位/Ａ280であった。
【００１５】調製例３ 調製例１に従って調製したプロトロンビンおよび第Ｘ因
子を、ＤＥＡＥ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ並びにｈｅｐａｒ
ｉｎ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いたクロマトグラフィー
によりさらに精製し、プロトロンビンと第Ｘ因子を分離
した。得られたプロトロンビンの純度は、約６.５血漿
単位/Ａ280であった。
子を、ＤＥＡＥ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ並びにｈｅｐａｒ
ｉｎ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いたクロマトグラフィー
によりさらに精製し、プロトロンビンと第Ｘ因子を分離
した。得られたプロトロンビンの純度は、約６.５血漿
単位/Ａ280であった。
【００１６】試験例１ 調製例３で得られたプロトロンビン２２.８血漿単位/ｍ
ｌに、第Ｘ因子（１２０.５μｇ/ｍｌ）、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ・２Ｎａおよび各種濃度のＰＥＧ４,０００を添加
し、２５℃、ｐＨ７.４で反応させた。生成したトロン
ビンの活性は、各処理時間において、テストチーム発色
基質Ｓ-２２３８（CHROMOGENIX AB, Sweden）を用いて
測定された。ここで用いられているトロンビン活性の単
位は、アメリカ標準品（U.S. Standard Thrombin、旧Ｎ
ＩＨ標準品）の単位に合わせたＮＩＨ単位で表わされて
いる。また、活性化率は、プロトロンビン１血漿単位
（正常人血漿１ｍｌ中に含まれるプロトロンビン活性）
当たり得られたトロンビン活性（ＮＩＨ単位）を表す。
結果は図１に示した通りであり、１５％以上のＰＥＧ濃
度でプロトロンビンの活性化反応が促進された。
ｌに、第Ｘ因子（１２０.５μｇ/ｍｌ）、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ・２Ｎａおよび各種濃度のＰＥＧ４,０００を添加
し、２５℃、ｐＨ７.４で反応させた。生成したトロン
ビンの活性は、各処理時間において、テストチーム発色
基質Ｓ-２２３８（CHROMOGENIX AB, Sweden）を用いて
測定された。ここで用いられているトロンビン活性の単
位は、アメリカ標準品（U.S. Standard Thrombin、旧Ｎ
ＩＨ標準品）の単位に合わせたＮＩＨ単位で表わされて
いる。また、活性化率は、プロトロンビン１血漿単位
（正常人血漿１ｍｌ中に含まれるプロトロンビン活性）
当たり得られたトロンビン活性（ＮＩＨ単位）を表す。
結果は図１に示した通りであり、１５％以上のＰＥＧ濃
度でプロトロンビンの活性化反応が促進された。
【００１７】試験例２ 調製例３で得られたプロトロンビン２２.８血漿単位/ｍ
ｌに、第Ｘ因子（１２０.５μｇ/ｍｌ）、５ｍＭ塩化カ
ルシウムおよび各種濃度のＰＥＧ４,０００を添加し、
２５℃、ｐＨ７.４で反応させた。各処理時間における
トロンビンへの活性化率は、図２に示した通りである。
ＰＥＧ処理濃度１％以上ではＰＥＧ非添加に対し活性化
反応の促進効果が確認され、さらに５％以上の濃度では
有意な促進効果が示された。処理時間１日では１２〜１
４％ＰＥＧ添加サンプルの活性上昇が高かったが、処理
時間４日では１８〜２０％ＰＥＧ添加サンプルの活性が
急激に上昇していた。
ｌに、第Ｘ因子（１２０.５μｇ/ｍｌ）、５ｍＭ塩化カ
ルシウムおよび各種濃度のＰＥＧ４,０００を添加し、
２５℃、ｐＨ７.４で反応させた。各処理時間における
トロンビンへの活性化率は、図２に示した通りである。
ＰＥＧ処理濃度１％以上ではＰＥＧ非添加に対し活性化
反応の促進効果が確認され、さらに５％以上の濃度では
有意な促進効果が示された。処理時間１日では１２〜１
４％ＰＥＧ添加サンプルの活性上昇が高かったが、処理
時間４日では１８〜２０％ＰＥＧ添加サンプルの活性が
急激に上昇していた。
【００１８】試験例３ ＰＥＧ処理時の塩化カルシウム濃度とトロンビン転化効
率の関係を調べた。ＰＥＧ４,０００の処理濃度として
１４％および２０％を選び、調製例３で得られたプロト
ロンビン２２.８血漿単位/ｍｌ、第Ｘ因子（１２０.５
μｇ/ｍｌ）および各種濃度の塩化カルシウムを混合
し、２５℃、ｐＨ７.４で反応させた。各処理時間にお
けるトロンビンへの活性化率は、図３および図４に示し
た通りである。ＰＥＧ処理濃度１４％では有意なカルシ
ウム濃度依存性が認められ、至適濃度は２〜２０ｍＭで
あった。ＰＥＧ処理濃度２０％でもカルシウム濃度依存
性が弱いものの認められ、至適濃度は２〜２０ｍＭであ
った。
率の関係を調べた。ＰＥＧ４,０００の処理濃度として
１４％および２０％を選び、調製例３で得られたプロト
ロンビン２２.８血漿単位/ｍｌ、第Ｘ因子（１２０.５
μｇ/ｍｌ）および各種濃度の塩化カルシウムを混合
し、２５℃、ｐＨ７.４で反応させた。各処理時間にお
けるトロンビンへの活性化率は、図３および図４に示し
た通りである。ＰＥＧ処理濃度１４％では有意なカルシ
ウム濃度依存性が認められ、至適濃度は２〜２０ｍＭで
あった。ＰＥＧ処理濃度２０％でもカルシウム濃度依存
性が弱いものの認められ、至適濃度は２〜２０ｍＭであ
った。
【００１９】試験例４ ＰＥＧ処理時の温度条件とトロンビン転化効率の関係を
調べた。ＰＥＧ４,０００の処理濃度として１４％およ
び２０％を選び、調製例３で得られたプロトロンビン２
２.８血漿単位/ｍｌ、第Ｘ因子（１２０.５μｇ/ｍｌ）
および５ｍＭ塩化カルシウムを混合し、４、１０、２５
および３７℃の反応温度を設定し、ｐＨ７.４で反応さ
せた。各処理時間におけるトロンビンへの活性化率は、
図５〜図８に示した通りである。ＰＥＧ処理濃度１４％
では、２５℃および１０℃で速やかなトロンビン生成が
認められた。ＰＥＧ処理濃度２０％でも２５℃および１
０℃におけるトロンビン生成が認められたが、その速度
はＰＥＧ処理濃度１４％に比べて遅延していた。
調べた。ＰＥＧ４,０００の処理濃度として１４％およ
び２０％を選び、調製例３で得られたプロトロンビン２
２.８血漿単位/ｍｌ、第Ｘ因子（１２０.５μｇ/ｍｌ）
および５ｍＭ塩化カルシウムを混合し、４、１０、２５
および３７℃の反応温度を設定し、ｐＨ７.４で反応さ
せた。各処理時間におけるトロンビンへの活性化率は、
図５〜図８に示した通りである。ＰＥＧ処理濃度１４％
では、２５℃および１０℃で速やかなトロンビン生成が
認められた。ＰＥＧ処理濃度２０％でも２５℃および１
０℃におけるトロンビン生成が認められたが、その速度
はＰＥＧ処理濃度１４％に比べて遅延していた。
【００２０】試験例５ ＰＥＧ処理の効果を他のポリオールの添加効果と比較し
た。ポリオールの処理濃度として０、５、１０、２０お
よび３０％を選び、調製例３で得られたプロトロンビン
２２.８血漿単位/ｍｌ、第Ｘ因子（１２０.５μｇ/ｍ
ｌ）および５ｍＭ塩化カルシウムを混合し、２５℃、ｐ
Ｈ７.４で反応させた。処理時間７日におけるトロンビ
ンへの活性化率は、図９に示した通りである。ＰＥＧ以
外のポリオールでは活性化反応の促進効果は認められ
ず、高濃度ではむしろ阻害していた。
た。ポリオールの処理濃度として０、５、１０、２０お
よび３０％を選び、調製例３で得られたプロトロンビン
２２.８血漿単位/ｍｌ、第Ｘ因子（１２０.５μｇ/ｍ
ｌ）および５ｍＭ塩化カルシウムを混合し、２５℃、ｐ
Ｈ７.４で反応させた。処理時間７日におけるトロンビ
ンへの活性化率は、図９に示した通りである。ＰＥＧ以
外のポリオールでは活性化反応の促進効果は認められ
ず、高濃度ではむしろ阻害していた。
【００２１】試験例６ ＰＥＧ処理に用いるＰＥＧの分子量とトロンビン転化効
率の関係を調べた。分子量の異なるＰＥＧ（ＰＥＧ１,
０００、ＰＥＧ２,０００、ＰＥＧ４,０００およびＰＥ
Ｇ６,０００）について、それぞれＰＥＧの処理濃度と
して１０、１５、および２０％を選び、調製例３で得ら
れたプロトロンビン２２.８血漿単位/ｍｌ、第Ｘ因子
（１２０.５μｇ/ｍｌ）および５ｍＭ塩化カルシウムを
混合し、２５℃、ｐＨ７.４で反応させた。各処理時間
におけるトロンビンへの活性化率は、図１０〜図１２に
示した通りである。ＰＥＧ１,０００を添加したサンプ
ルは、いずれのＰＥＧ濃度においてもプロトロンビン活
性化反応に対する有意な促進効果は認められなかった。
ＰＥＧ２,０００を添加したサンプルは、ＰＥＧ処理濃
度１０％ではトロンビン活性の上昇がＰＥＧ４,０００
およびＰＥＧ６,０００に比べ遅れていたが、ＰＥＧ処
理濃度１５％および２０％ではＰＥＧ４,０００および
ＰＥＧ６,０００と同等の活性化速度を示した。ＰＥＧ
４,０００およびＰＥＧ６,０００では、両者に有意な効
果の差は認められなかった。
率の関係を調べた。分子量の異なるＰＥＧ（ＰＥＧ１,
０００、ＰＥＧ２,０００、ＰＥＧ４,０００およびＰＥ
Ｇ６,０００）について、それぞれＰＥＧの処理濃度と
して１０、１５、および２０％を選び、調製例３で得ら
れたプロトロンビン２２.８血漿単位/ｍｌ、第Ｘ因子
（１２０.５μｇ/ｍｌ）および５ｍＭ塩化カルシウムを
混合し、２５℃、ｐＨ７.４で反応させた。各処理時間
におけるトロンビンへの活性化率は、図１０〜図１２に
示した通りである。ＰＥＧ１,０００を添加したサンプ
ルは、いずれのＰＥＧ濃度においてもプロトロンビン活
性化反応に対する有意な促進効果は認められなかった。
ＰＥＧ２,０００を添加したサンプルは、ＰＥＧ処理濃
度１０％ではトロンビン活性の上昇がＰＥＧ４,０００
およびＰＥＧ６,０００に比べ遅れていたが、ＰＥＧ処
理濃度１５％および２０％ではＰＥＧ４,０００および
ＰＥＧ６,０００と同等の活性化速度を示した。ＰＥＧ
４,０００およびＰＥＧ６,０００では、両者に有意な効
果の差は認められなかった。
【００２２】試験例７ ＰＥＧ処理によるトロンビン転化時のグリセロールの添
加とトロンビン安定化効果の関係を調べた。ＰＥＧ４,
０００の処理濃度として１４％および２０％を選び、調
製例３で得られたプロトロンビン２２.８血漿単位/ｍ
ｌ、第Ｘ因子（１２０.５μｇ/ｍｌ）、５ｍＭ塩化カル
シウムおよび各種濃度のグリセロールを混合し、２５
℃、ｐＨ７.４で反応させた。各処理時間におけるトロ
ンビンへの活性化率は、図１３および図１４に示した通
りである。ＰＥＧ処理濃度１４％では、グリセロール非
添加に比べグリセロール５〜１０％の添加で、活性化率
の最大到達値が高まり、処理時間の延長による活性低下
も抑制された。ＰＥＧ処理濃度２０％では、グリセロー
ル非添加に比べグリセロール５〜２０％の添加で活性化
率の最大到達値が高まった。
加とトロンビン安定化効果の関係を調べた。ＰＥＧ４,
０００の処理濃度として１４％および２０％を選び、調
製例３で得られたプロトロンビン２２.８血漿単位/ｍ
ｌ、第Ｘ因子（１２０.５μｇ/ｍｌ）、５ｍＭ塩化カル
シウムおよび各種濃度のグリセロールを混合し、２５
℃、ｐＨ７.４で反応させた。各処理時間におけるトロ
ンビンへの活性化率は、図１３および図１４に示した通
りである。ＰＥＧ処理濃度１４％では、グリセロール非
添加に比べグリセロール５〜１０％の添加で、活性化率
の最大到達値が高まり、処理時間の延長による活性低下
も抑制された。ＰＥＧ処理濃度２０％では、グリセロー
ル非添加に比べグリセロール５〜２０％の添加で活性化
率の最大到達値が高まった。
【００２３】実施例１ 調製例２に従って調製したプロトロンビンおよび第Ｘ因
子を限外濾過膜を用いて濃縮し、塩化カルシウムおよび
ＰＥＧをそれぞれ終濃度５ｍＭおよび１４％添加して、
２５℃において７日間処理した。得られたトロンビン
は、４８.４（NIH単位/プロトロンビン１血漿単位）の
活性化率を示した。
子を限外濾過膜を用いて濃縮し、塩化カルシウムおよび
ＰＥＧをそれぞれ終濃度５ｍＭおよび１４％添加して、
２５℃において７日間処理した。得られたトロンビン
は、４８.４（NIH単位/プロトロンビン１血漿単位）の
活性化率を示した。
【００２４】実施例２ 実施例１で得られたトロンビンに対し、限外濾過膜を用
いた限外濾過/透析濾過を行い溶媒を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ
-ＨＣｌ ０.１５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８.０に置換した。こ
の溶液を、同緩衝液で平衡化したＳＰ-TOYOPEARL（東ソ
ー社製）に吸着させた後洗浄し、非結合のタンパク質を
除去した。トロンビンを含有する画分を２０ｍＭ Ｎａ3
クエン酸塩 ０.５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ６.０で溶出させ、
濃縮し、透析濾過した後、凍結乾燥および乾燥加熱処理
を施した。
いた限外濾過/透析濾過を行い溶媒を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ
-ＨＣｌ ０.１５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８.０に置換した。こ
の溶液を、同緩衝液で平衡化したＳＰ-TOYOPEARL（東ソ
ー社製）に吸着させた後洗浄し、非結合のタンパク質を
除去した。トロンビンを含有する画分を２０ｍＭ Ｎａ3
クエン酸塩 ０.５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ６.０で溶出させ、
濃縮し、透析濾過した後、凍結乾燥および乾燥加熱処理
を施した。
【図１】 カルシウム塩非存在下でのプロトロンビンの
活性化に対するＰＥＧ４,０００の添加効果を示す図で
ある。
活性化に対するＰＥＧ４,０００の添加効果を示す図で
ある。
【図２】 塩化カルシウムが５ｍＭの濃度で存在する条
件下でのプロトロンビンの活性化に対するＰＥＧ４,０
００の添加効果を示す図である。
件下でのプロトロンビンの活性化に対するＰＥＧ４,０
００の添加効果を示す図である。
【図３】 ＰＥＧ４,０００が１４％の濃度で存在する
条件下でのプロトロンビンの活性化に対する塩化カルシ
ウムの濃度の影響を示す図である。
条件下でのプロトロンビンの活性化に対する塩化カルシ
ウムの濃度の影響を示す図である。
【図４】 ＰＥＧ４,０００が２０％の濃度で存在する
条件下でのプロトロンビンの活性化に対する塩化カルシ
ウムの濃度の影響を示す図である。
条件下でのプロトロンビンの活性化に対する塩化カルシ
ウムの濃度の影響を示す図である。
【図５】 ＰＥＧ４,０００が１４％の濃度で存在する
条件下でのプロトロンビンの活性化に対する処理温度の
影響を示す図であり、処理時間７日までの活性化率を示
す図である。
条件下でのプロトロンビンの活性化に対する処理温度の
影響を示す図であり、処理時間７日までの活性化率を示
す図である。
【図６】 ＰＥＧ４,０００が１４％の濃度で存在する
条件下でのプロトロンビンの活性化に対する処理温度の
影響を示す図であり、処理時間２８日までの活性化率を
示す図である。
条件下でのプロトロンビンの活性化に対する処理温度の
影響を示す図であり、処理時間２８日までの活性化率を
示す図である。
【図７】 ＰＥＧ４,０００が２０％の濃度で存在する
条件下でのプロトロンビンの活性化に対する処理温度の
影響を示す図であり、処理時間７日までの活性化率を示
す図である。
条件下でのプロトロンビンの活性化に対する処理温度の
影響を示す図であり、処理時間７日までの活性化率を示
す図である。
【図８】 ＰＥＧ４,０００が２０％の濃度で存在する
条件下でのプロトロンビンの活性化に対する処理温度の
影響を示す図であり、処理時間２８日までの活性化率を
示す図である。
条件下でのプロトロンビンの活性化に対する処理温度の
影響を示す図であり、処理時間２８日までの活性化率を
示す図である。
【図９】 プロトロンビンの活性化に対する各種ポリオ
ールの影響を処理時間７日における活性化率で示した図
である。
ールの影響を処理時間７日における活性化率で示した図
である。
【図１０】 各種分子量のＰＥＧが１０％の濃度で存在
する条件下でのプロトロンビンの活性化に対するＰＥＧ
の添加効果におけるＰＥＧ分子量の影響を示す図であ
る。
する条件下でのプロトロンビンの活性化に対するＰＥＧ
の添加効果におけるＰＥＧ分子量の影響を示す図であ
る。
【図１１】 各種分子量のＰＥＧが１５％の濃度で存在
する条件下でのプロトロンビンの活性化に対するＰＥＧ
の添加効果におけるＰＥＧ分子量の影響を示す図であ
る。
する条件下でのプロトロンビンの活性化に対するＰＥＧ
の添加効果におけるＰＥＧ分子量の影響を示す図であ
る。
【図１２】 各種分子量のＰＥＧが２０％の濃度で存在
する条件下でのプロトロンビンの活性化に対するＰＥＧ
の添加効果におけるＰＥＧ分子量の影響を示す図であ
る。
する条件下でのプロトロンビンの活性化に対するＰＥＧ
の添加効果におけるＰＥＧ分子量の影響を示す図であ
る。
【図１３】 ＰＥＧ４,０００が１４％の濃度で存在す
る条件下でのＰＥＧ４,０００により促進されたプロト
ロンビンの活性化に対するグリセロールの添加効果を示
す図である。
る条件下でのＰＥＧ４,０００により促進されたプロト
ロンビンの活性化に対するグリセロールの添加効果を示
す図である。
【図１４】 ＰＥＧ４,０００が２０％の濃度で存在す
る条件下でのＰＥＧ４,０００により促進されたプロト
ロンビンの活性化に対するグリセロールの添加効果を示
す図である。
る条件下でのＰＥＧ４,０００により促進されたプロト
ロンビンの活性化に対するグリセロールの添加効果を示
す図である。
Claims (15)
- 【請求項１】 プロトロンビン含有水溶液をポリエチレ
ングリコールで処理することを特徴とする、プロトロン
ビンのトロンビンへの活性化方法。 - 【請求項２】 プロトロンビン含有水溶液をカルシウム
塩の共存下ポリエチレングリコールで処理することを特
徴とする請求項１記載のプロトロンビンのトロンビンへ
の活性化方法。 - 【請求項３】 ポリエチレングリコールまたはポリエチ
レングリコールおよびカルシウム塩での処理をトロンボ
プラスチンの非存在下に行なう請求項１または請求項２
に記載のプロトロンビンのトロンビンへの活性化方法。 - 【請求項４】 ポリエチレングリコールまたはポリエチ
レングリコールおよびカルシウム塩での処理の際に、反
応液が付加的にグリセロールを含有することを特徴とす
る請求項１から請求項３のずれかに記載のプロトロンビ
ンのトロンビンへの活性化方法。 - 【請求項５】 ポリエチレングリコールまたはポリエチ
レングリコールおよびカルシウム塩での処理温度が４〜
３７℃である請求項１から請求項４のいずれかに記載の
プロトロンビンのトロンビンへの活性化方法。 - 【請求項６】 ポリエチレングリコールまたはポリエチ
レングリコールおよびカルシウム塩での処理温度が１０
〜２５℃である請求項５に記載のプロトロンビンのトロ
ンビンへの活性化方法。 - 【請求項７】 使用するポリエチレングリコールの分子
量が約２,０００〜６,０００である請求項１から請求項
４のいずれかに記載のプロトロンビンのトロンビンへの
活性化方法。 - 【請求項８】 ポリエチレングリコールの濃度が終濃度
１〜３０％（ｗ/ｖ）である請求項１から請求項４のい
ずれかに記載のプロトロンビンのトロンビンへの活性化
方法。 - 【請求項９】 共存させるカルシウム塩が塩化カルシウ
ム、水酸化カルシウムおよび酢酸カルシウムより選択さ
れるものである請求項２から請求項４のいずれかに記載
のプロトロンビンのトロンビンへの活性化方法。 - 【請求項１０】 カルシウム塩の濃度が終濃度１００ｍ
Ｍ以下である請求項２から請求項４のいずれかに記載の
プロトロンビンのトロンビンへの活性化方法。 - 【請求項１１】 カルシウム塩の濃度が終濃度２〜２０
ｍＭである請求項１０に記載のプロトロンビンのトロン
ビンへの活性化方法。 - 【請求項１２】 プロトロンビン含有組成物がプロトロ
ンビン複合体である請求項１から請求項４のいずれかに
記載のプロトロンビンのトロンビンへの活性化方法。 - 【請求項１３】 プロトロンビン含有組成物が、プロト
ロンビンおよび血液凝固第Ｘ因子を主成分とする水溶液
である請求項１から請求項４のいずれかに記載のプロト
ロンビンのトロンビンへの活性化方法。 - 【請求項１４】 請求項１から請求項４のいずれかに記
載のプロトロンビンのトロンビンへの活性化工程を含む
ことを特徴とするトロンビンの製造方法。 - 【請求項１５】 請求項１から請求項４のいずれかに記
載のプロトロンビンのトロンビンへの活性化工程後に陽
イオン交換体処理を行なう請求項１４に記載のトロンビ
ンの製造方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22769596A JP3944267B2 (ja) | 1996-08-09 | 1996-08-09 | プロトロンビンの活性化方法および該方法に基づくトロンビンの製造方法 |
| US08/905,041 US5811279A (en) | 1996-08-09 | 1997-08-01 | Method for activating prothrombin with polyethylene glycol |
| EP97113588A EP0823476B1 (en) | 1996-08-09 | 1997-08-06 | Method for activating prothrombin to thrombin |
| AT97113588T ATE260336T1 (de) | 1996-08-09 | 1997-08-06 | Verfahren zur aktivierung von prothrombin zu thrombin |
| DE69727736T DE69727736T2 (de) | 1996-08-09 | 1997-08-06 | Verfahren zur Aktivierung von Prothrombin zu Thrombin |
| DK97113588T DK0823476T3 (da) | 1996-08-09 | 1997-08-06 | Fremgangsmåde til aktivering af prothrombin til thrombin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22769596A JP3944267B2 (ja) | 1996-08-09 | 1996-08-09 | プロトロンビンの活性化方法および該方法に基づくトロンビンの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1052267A true JPH1052267A (ja) | 1998-02-24 |
| JP3944267B2 JP3944267B2 (ja) | 2007-07-11 |
Family
ID=16864906
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22769596A Expired - Lifetime JP3944267B2 (ja) | 1996-08-09 | 1996-08-09 | プロトロンビンの活性化方法および該方法に基づくトロンビンの製造方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5811279A (ja) |
| EP (1) | EP0823476B1 (ja) |
| JP (1) | JP3944267B2 (ja) |
| AT (1) | ATE260336T1 (ja) |
| DE (1) | DE69727736T2 (ja) |
| DK (1) | DK0823476T3 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003517272A (ja) * | 1998-08-05 | 2003-05-27 | サーモジェネシス コーポレーション | 血漿から安定で、長期型のトロンビンを調製するための装置および方法、並びにこれにより形成されたトロンビン |
| JP2004500026A (ja) * | 1999-06-04 | 2004-01-08 | サーモジェネシス コーポレーション | 自己由来トロンビン |
| JP2022516229A (ja) * | 2018-12-07 | 2022-02-25 | バイオセラピー サービシーズ リミテッド | 多血小板血漿を自己由来トロンビンと組み合わせることにより得ることが可能な創傷処置ゲル |
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|---|---|---|---|---|
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| US20070011752A1 (en) * | 2005-05-06 | 2007-01-11 | American Integrated Biologics, Inc. | Production of human proteins in transgenic animal saliva |
| RU2457248C2 (ru) * | 2010-06-09 | 2012-07-27 | Общество с ограниченной ответственностью фирма "Технология-Стандарт" | Способ промышленного получения тромбина |
| EA028016B1 (ru) * | 2013-06-06 | 2017-09-29 | Общество с ограниченной ответственностью "Гематологическая Корпорация" (ООО "ГемаКор") | Набор для измерения параметров системы гемостаза в образце крови или ее компонентов |
| RU2698206C1 (ru) * | 2018-07-02 | 2019-08-23 | Общество с ограниченной ответственностью "Гематологическая Корпорация" (ООО "ГемаКор") | Набор реагентов для диагностики степени нейровоспаления |
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|---|---|---|---|---|
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| US3682881A (en) * | 1970-10-02 | 1972-08-08 | Baxter Laboratories Inc | Fractionation of plasma using glycine and polyethylene glycol |
| US5138034A (en) * | 1989-07-12 | 1992-08-11 | The Green Cross Corporation | Method of fractionating plasma proteins |
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| JPH04365481A (ja) * | 1991-06-11 | 1992-12-17 | Green Cross Corp:The | トロンビンの製造法 |
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| DE4137996A1 (de) * | 1991-11-19 | 1993-05-27 | Behringwerke Ag | Verfahren zur herstellung eines virussicheren thrombinkonzentrates |
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| JPH07308190A (ja) * | 1994-05-18 | 1995-11-28 | Green Cross Corp:The | トロンビンの製造方法 |
| US5677162A (en) * | 1995-05-01 | 1997-10-14 | New York Blood Center, Inc. | Method for activating prothrombin to thrombin |
-
1996
- 1996-08-09 JP JP22769596A patent/JP3944267B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1997
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