RU2457248C2 - Способ промышленного получения тромбина - Google Patents
Способ промышленного получения тромбина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2457248C2 RU2457248C2 RU2010123625/10A RU2010123625A RU2457248C2 RU 2457248 C2 RU2457248 C2 RU 2457248C2 RU 2010123625/10 A RU2010123625/10 A RU 2010123625/10A RU 2010123625 A RU2010123625 A RU 2010123625A RU 2457248 C2 RU2457248 C2 RU 2457248C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- thrombin
- solution
- suspension
- raw material
- prothrombin
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Способ промышленного получения тромбина предусматривает подготовку сырья, получение комплекса белков, содержащих протромбин, активацию протромбина и превращение его в тромбин, очистку диализом и лиофильную сушку раствора тромбина. При этом в сырье вносят раствор гепарина из расчета 50-800 ME на 1 л сырья. При использовании в качестве сырья плазмы крови человека или фракции II+III по Кону плазмы крови человека после начала активации протромбина суспензию тромбина инкубируют при 14-18 ч, добавляют полиэтиленгликоль 6000 в количестве 0,75-1,25% от массы суспензии тромбина, доводят рН суспензии тромбина до величины 5,25-5,75 добавлением 10% или 20% раствора уксусной кислоты. При использовании в качестве сырья плазмы крови крупного рогатого скота после начала активации протромбина через 10 минут каждые 15 минут в течение 40-60 минут добавляют 200 мл дистиллированной воды, содержащей 2 мл 20%-раствора уксусной кислоты, добавляют 0,75-1,25% полиэтиленгликоля 6000 от массы суспензии, доводят рН суспензии тромбина до величины 5,25-5,75 добавлением 10% или 20% раствором уксусной кислоты. Изобретение обеспечивает повышение выхода тромбина и улучшение стабильности тромбина при хранении. Выход тромбина составляет 40-60 тыс. NIH единиц активности тромбина из 1 л плазмы крови. 2 н.з.п. ф-лы, 3 табл.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии, и может быть использовано для промышленного получения естественного компонента свертывающей системы крови фактора IIа фермента тромбина из плазмы крови человека или фракции II+III по Кону плазмы крови человека или плазмы крови крупного рогатого скота.
Конечный продукт технологии тромбин может использоваться в качестве компонента тест-систем для диагностики патологии системы гемостаза при гемофилии, дисфибриногенемии, тромбозах, тромбоэмболии, синдроме диссеминированного внутрисосудистого свертывания.
При дополнительной очистке известными способами тромбин может использоваться в качестве лекарственного препарата. В частности, как местное гемостатическое (кровоостанавливающее) средство при кровотечениях, а также в качестве компонента при производстве гемостатических губок.
Разработка эффективных способов получения тромбина является ключевой задачей в решении проблем промышленного получения недорогих тест-систем для диагностики нарушений системы гемостаза и эффективных средств для уменьшения кровопотери при хирургических вмешательствах, травмах, заболеваниях крови и ожогах.
Известен способ получения тромбина «Improved thrombin preparations» (патент № ЕР 0277096, World intellectual property organization, 07.08.1992) путем двухэтапной хроматографии плазмы крови человека. На первом этапе используют диэтиламиноэтилсефарозу, на втором этапе используют карбоксиметилсефарозу. Тромбин элюируют из колонки с использованием ацетатного буфера 0,05 М в 0,45М-растворе NaCl при рН 5,0; либо при использовании фосфатного буфера 0,05 М в 0,45М-растворе NaCl при рН 6,0. В продукт - тромбин добавляют ацетатный (рН 5,0) или фосфатный (рН 6,5) буфер, а также глицерин от 25 до 50% от массы.
Полученный тромбин отличается высокой стабильностью и при дальнейшей антивирусной обработке может использоваться в качестве местного кровоостанавливающего средства, однако недостатками известного способа являются:
1. использование двух видов сорбента сефарозы, что ведет к удорожанию продукта;
2. использование глицерина в качестве стабилизатора делает невозможным использование тромбина в диагностических целях;
3. невозможность лиофилизации тромбина для длительного хранения.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому техническому результату является «Способ крупномасштабного производства устойчивой при хранении композиции тромбина терапевтической степени чистоты» (патент №2144081).
По известному способу плазму крови (сырье) подготавливают разбавлением водой и фосфатным или композиционным буфером (рН 5,3), затем подготовленную плазму крови центрифугируют. Полученный центрифугат является промежуточным продуктом, а тромбин получают посредством катионообменной хроматографии на сульфопропилсферодексе. Превращение выделяемого протромбина в тромбин осуществляют путем растворения промежуточного продукта, содержащего протромбин в растворе натрия хлорида (рН 7,0), и инкубирования с раствором кальция хлорида в течение 2 ч. Реакционную смесь центрифугируют и получают суспензию тромбина. Тромбин проходит несколько ступеней очистки: обработка противовирусным средством, ионообменная очистка, мембранные противовирусные фильтры.
Известный способ позволяет обеспечить выход тромбина до 180 тыс. ед. из 5 л сырья (плазма крови человека), тромбин отличается высокой антивирусной чистотой (для использования в лечебных целях) и сохраняет активность до 6 месяцев при +4°С в лиофилизированном состоянии без существенной потери активности тромбина, однако недостатком известного способа является относительно невысокий выход получения тромбина.
Техническим результатом заявляемого способа являются повышение выхода получения тромбина до 40-60 тыс. NIH единиц активности тромбина из 1 л плазмы крови человека или фракции II+III по Кону плазмы крови человека или плазмы крови крупного рогатого скота и улучшение стабильности при хранении раствора тромбина до 12 месяцев при +4°С и лиофилизированного тромбина до 36 месяцев при +4°С без потери активности тромбина.
Технический результат достигается подготовкой сырья добавлением раствора гепарина из расчета 50-800 ME на 1 л сырья, добавлением полиэтиленгликоля 6000 в количестве 0,75-1,25% от массы суспензии тромбина и доведением рН суспензии тромбина до величины 5,25-5,75 добавлением 10% или 20% раствора уксусной кислоты.
Заявляемый способ осуществляют следующим образом. Результаты экспериментов представлены в таблицах 1-3. В таблице 1 представлено влияние добавления раствора гепарина разной активности в сырье на выход продукта при добавлении на этапе получения суспензии тромбина полиэтиленгликоля 6000 в количестве 1% от массы суспензии и доведении рН суспензии до величины 5,5.
В таблице 2 представлено влияние добавления различных концентраций полиэтиленгликоля 6000 в суспензию тромбина на выход продукта при добавлении в сырье раствора гепарина из расчета 400 ME на 1 л сырья и доведении рН суспензии тромбина до величины 5,5.
В таблице 3 представлено влияние различных величин рН суспензии тромбина на выход продукта при добавлении в сырье раствора гепарина из расчета 400 ME на 1 л сырья и добавлении в суспензию тромбина полиэтиленгликоля 6000 в количестве 1% от массы суспензии.
В заявляемом способе используют:
Оборудование
1. Центрифуга рефрижираторная ЦР-6 (Россия) - 1 шт.
2. Коагулометр Минилаб 701 (Юнимед, Россия) - 1 шт.
3. рН-метр WTW 315i (WTW, Германия) - 1 шт.
4. Термометр ртутный стеклянный (диапазон измерямых темератур: 0-100°С) - 1 шт.
5. Термостат типа ТР (Данфорсс, Германия) - 1 шт.
6. Штатив - 1 шт.
7. Емкость 1 л - 1 шт.
8. Емкость 3 л - 1 шт.
9. Емкость 5 л - 1 шт.
10. Емкость 10 л - 3 шт.
11. Емкость 50 л - 1 шт.
Вещества и материалы (на 30 л сырья)
1. Натрия хлорид х.ч. (Реахим, Россия) - 10 кг.
2. Гепарин 5000 МЕ/мл (Акционерное Курганское общество медицинских препаратов и изделий «Синтез», Россия) - 2,5 мл.
3. Бария сульфат х.ч. (Реахим, Россия) - 600 г.
4. Кальция хлорид 0,5 М (Технология-Стандарт, Россия) - 150 мл.
5. Трис-HCl буфер 1 М (Технология-Стандарт, Россия) - 500 мл.
6. Натрия цитрат (лимоннокислый) 5,5 водный х.ч. (Реахим, Россия) - 300 г.
7. Аммония сульфат х.ч. насыщенный раствор (Реахим, Россия) - 150 мл.
8. Полиэтиленгликоль 6000 (Panreac, Applichem, Германия) - 150 г.
9. Полиэтиленгликоль 10000 (Fluka, Merck, Германия) - 300 г.
10. Диэтиламиноэтилцеллюлоза (Sigma-Aldrich, Германия) - 500 г.
11. Альбумин бычий сухой (Biowest, Великобритания) - 15-20 г.
12. Альбумин человеческий (Россия) 10-20 г.
13. Уксусная кислота ледяная х.ч. (Реахим, Россия) - 1 мл.
14. Фиккол 400 х.ч. (Merck, Германия) - 50 г.
15. Сахароза ч.д.а. (Реахим, Россия) - 50 г.
16. Мертиолат х.ч. (Merck, Германия) - 4 г.
17. Гемодиализная колонка (Hemoflow, Германия) - 1 шт.
Контрольные материалы
1. Концентрат тромбопластина 5 мл, лиофилизированный (Технология-Стандарт, Россия) - 60 фл.
2. Нормальная плазма человека РНП 1 мл, лиофилизированная (Технология-Стандарт, Россия) - 2 фл.
Во время подготовки сырья в плазму крови человека или фракцию II+III по Кону плазмы крови человека или в плазму крови крупного рогатого скота добавляют раствор гепарина из расчета 400 ME на 1 л сырья. В подоготовленное сырье добавляют водный 20% раствор бария сульфата, из расчета 100 мл раствора бария сульфата на 1 л полупродукта. Перемешивают и центрифугируют при 2000g в течение 7 минут. Полученный осадок содержит белки протромбинового комплекса. Осадок ресуспензируют 0,9% раствором натрия хлорида из расчета 0,12 л раствора на количество осадка, полученного из 1 л сырья. Суспензию центрифугируют при 2000g в течение 15 минут. Надосадочную жидкость утилизируют, а осадок используют на дальнейших стадиях. Осадок ресуспензируют 0,05М-раствором трис-HCl буфера с температурой 40°С из расчета 0,12 л раствора на количество осадка, полученного из 1 л сырья. Суспензию инкубируют при температуре 37°С в течение 30 минут. В суспензию вносят 150 мл насыщенного раствора сульфата аммония, перемешивают и охлаждают до комнатной температуры. В суспензию добавляют 300 г полиэтиленгликоля 10000, перемешивают и инкубируют при комнатной темературе в течение 30 минут. Суспензию центрифугируют при 2000 g в течение 15 минут. Осадок утилизируют. Надосадочную жидкость, содержащую растворенные белки протромбинового комплекса, используют на следующих стадиях. Надосадочную жидкость переносят в раствор, содержащей 45 л дистиллированной воды и 1 кг геля, содержащего 500 г диэтиламиноэтилцеллюлозы в 500 мл дистиллированной воды. Полученную смесь перемешивают и инкубируют в течении 60 минут при комнатной температуре, перемешивая с интервалом 10-15 минут. Надгелевую жидкость утилизуют. Гель содержит компоненты протромбинового комплекса и используется на следующих стадиях.
Активацию протромбина (перевод протромбина в тромбин) осуществляют добавлением в гель 150 мл 0,5М-раствора кальция хлорида, 100 мл 1M-раствора трис-HCl буфера, 1 г тромбопластина в 150 мл дистиллированной воды. Гель перемешивают. Каждые 15 минут в надгелевой жидкости коагулометрически оценивают активность тромбина. Нарастание активности тромбина в растворе свидетельствует о начале фазы активации (превращение протромбина в тромбин). В варианте получения тромбина из плазмы крови человека или фракции II+III по Кону плазмы крови человека после начала активации реакционную смесь инкубируют 14-18 часов при комнатной температуре. В варианте получения тромбина из плазмы крупного рогатого скота через 10 минут после начала активации каждые 15 минут в течение 40-60 минут, пока активность тромбина в надгелевой жидкости перестанет возрастать в суспензию тромбина добавляют 200 мл дистиллированной воды, содержащей 2 мл 20% раствора уксусной кислоты. После завершения фазы активации коагулометрически оценивают конечную активность тромбина в 1 мл полупродукта в надгелевой жидкости и сливают в другую емкость.
В полученную на предыдущей стадии суспензию тромбина из расчета на 1 л вносят 20 мл 10% раствора альбумина человека или 5 г сухого бычьего альбумина. Добавляют 0,75-1,25% от массы суспензии сухой полиэтиленгликоль 6000 и доводят величину рН суспензии 10% или 20% раствором уксусной кислоты до рН 5,25-5,75.
Диализ суспензии тромбина осуществляют на гемодиализной колонке дистиллированной водой. Параметры диализа: расход дистиллированной воды 2,3 л/мин, расход суспензии тромбина 1,3 л/ч. В полученный после диализа раствор тромбина из расчета на 1 л добавляют 10 мл 1М трис-буфера, 10 г сахарозы, 20 г лактозы моногидрата, 10 г фиколла 400, 1 г мертиолата. В варианте получения тромбина из бычьей крови в полученный раствор тромбина из расчета на 1 л вносят 10 г полиэтиленгликоля 6000 и доводят рН раствора тромбина до величины 5,5 добавлением 10% или 20% раствора уксусной кислоты. Полученный на предыдущих стадиях раствор тромбина разливают в необходимом объеме во флаконы и осуществляют лиофильную сушку.
Величины активности добавляемого раствора гепарина в сырье, количество добавляемого в суспензию тромбина полиэтиленгликоля 6000 и величину рН суспензии тромбина установлены в процессе эксперимента. Результаты экспериментов представлены в таблицах 1-3. В таблице 1 представлены результаты экспериментов влияния добавления раствора гепарина различной активности в сырье на выход тромбина. В таблице 2 представлены результаты экспериментов влияния добавления поолиэтиленгликоля 6000 в суспензию тромбина на выход тромбина. В таблице 3 представлены результаты экспериментов влияния рН суспензии тромбина на выход тромбина.
Заявляемый способ позволяет повысить выход получения тромбина до 40-60 NIH ед./л активности из 1 л крови человека или крупного рогатого скота и повысить стабильность тромбина при хранении раствора тромбина до 12 месяцев при +4°С и лиофилизированного тромбина до 36 месяцев при +4°С без существенной потери активности тромбина.
Таблица 1 | |
Способ промышленного получения тромбина | |
Активность гепарина, добавляемого в 1 л сырья, ME | Активность тромбина из 1 л сырья, тыс. NIH ед./л |
50 | 45 |
100 | 49 |
200 | 54 |
300 | 56 |
400 | 60 |
500 | 57 |
600 | 52 |
700 | 49 |
800 | 46 |
Таблица 2 | |
Концентрация полиэтиленгликоля в суспензии тромбина, % | Активность тромбина из 1 л сырья, тыс. NIH ед./л |
0,75 | 49 |
0,85 | 51 |
0,95 | 56 |
1 | 60 |
1,05 | 55 |
1,15 | 51 |
1,25 | 44 |
Таблица 3 | |
Способ промышленного получения тромбина | |
Величина рН суспензии тромбина | Активность тромбина, тыс. NIH ед./л |
5,25 | 40 |
5,35 | 53 |
5,45 | 57 |
5,50 | 60 |
5,55 | 56 |
5,65 | 50 |
5,75 | 41 |
Claims (2)
1. Способ промышленного производства тромбина, заключающийся в подготовке сырья, получении комплекса белков, содержащих протромбин, активации протромбина и превращении его в тромбин, очистке и лиофильной сушке раствора тромбина, отличающийся тем, что в качестве сырья используют плазму крови человека или фракцию II+III по Кону плазмы крови человека, в которое добавляют раствор гепарина из расчета 50-800 ME на 1 л сырья, после начала активации протромбина суспензию тромбина инкубируют при 14-18 ч, добавляют полиэтиленгликоль 6000 в количестве 0,75-1,25% от массы суспензии тромбина, доводят рН суспензии тромбина до величины 5,25-5,75 добавлением 10%- или 20%-ного раствора уксусной кислоты, для очистки раствора тромбина используют диализ.
2. Способ промышленного производства тромбина, заключающийся в подготовке сырья, получении комплекса белков, содержащих протромбин, активации протромбина и превращении его в тромбин, очистке и лиофильной сушке раствора тромбина, отличающийся тем, что в качестве сырья используют плазму крови крупного рогатого скота, в которое добавляют раствор гепарина из расчета 50-800 ME на 1 л сырья, после начала активации протромбина через 10 мин каждые 15 мин в течение 40-60 мин добавляют 200 мл дистиллированной воды, содержащей 2 мл 20%-ного раствора уксусной кислоты, добавляют 0,75-1,25% полиэтиленгликоля 6000 от массы суспензии, доводят рН суспензии тромбина до величины 5,25-5,75 добавлением 10%- или 20%-ного раствора уксусной кислоты, для очистки раствора тромбина используют диализ.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2010123625/10A RU2457248C2 (ru) | 2010-06-09 | 2010-06-09 | Способ промышленного получения тромбина |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2010123625/10A RU2457248C2 (ru) | 2010-06-09 | 2010-06-09 | Способ промышленного получения тромбина |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2010123625A RU2010123625A (ru) | 2011-12-20 |
RU2457248C2 true RU2457248C2 (ru) | 2012-07-27 |
Family
ID=45403808
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2010123625/10A RU2457248C2 (ru) | 2010-06-09 | 2010-06-09 | Способ промышленного получения тромбина |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2457248C2 (ru) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2583931C2 (ru) * | 2014-06-11 | 2016-05-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение Гематологический научный центр Министерства здравоохранения РФ | Способ получения концентрата тромбина |
RU2589648C2 (ru) * | 2012-09-25 | 2016-07-10 | Стем Селл Партнерс Ллк | Способ и устройство для получения сыворотки с тромбином от одного донора |
RU2806598C1 (ru) * | 2022-12-29 | 2023-11-01 | Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования "Научно-технологический университет "Сириус" | Способ получения нетканого материала с помощью электроспиннинга |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU1527261A1 (ru) * | 1988-03-21 | 1989-12-07 | Институт Химической И Биологической Физики Ан Эсср | Способ получени тромбина |
EP0823476A2 (en) * | 1996-08-09 | 1998-02-11 | Juridical Foundation, The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Method for activating prothrombin to thrombin |
RU2144081C1 (ru) * | 1994-09-21 | 2000-01-10 | Эмакюр Корпорейшн | Способ крупномасштабного производства устойчивой при хранении композиции тромбина терапевтической степени чистоты |
-
2010
- 2010-06-09 RU RU2010123625/10A patent/RU2457248C2/ru active IP Right Revival
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU1527261A1 (ru) * | 1988-03-21 | 1989-12-07 | Институт Химической И Биологической Физики Ан Эсср | Способ получени тромбина |
RU2144081C1 (ru) * | 1994-09-21 | 2000-01-10 | Эмакюр Корпорейшн | Способ крупномасштабного производства устойчивой при хранении композиции тромбина терапевтической степени чистоты |
EP0823476A2 (en) * | 1996-08-09 | 1998-02-11 | Juridical Foundation, The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Method for activating prothrombin to thrombin |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Грачева И.М. и др. Технология ферментных препаратов. - М.: Элевар, 2000, с.107-108, 132-135. Березов Т.Т. и др. Биологическая химия. - М.: Медицина, 1982, с.639-644, 722. * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2589648C2 (ru) * | 2012-09-25 | 2016-07-10 | Стем Селл Партнерс Ллк | Способ и устройство для получения сыворотки с тромбином от одного донора |
RU2583931C2 (ru) * | 2014-06-11 | 2016-05-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение Гематологический научный центр Министерства здравоохранения РФ | Способ получения концентрата тромбина |
RU2806598C1 (ru) * | 2022-12-29 | 2023-11-01 | Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования "Научно-технологический университет "Сириус" | Способ получения нетканого материала с помощью электроспиннинга |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2010123625A (ru) | 2011-12-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5037331B2 (ja) | 出血性障害の処置のための第ixa因子 | |
ES2313912T3 (es) | Procedimiento para la produccion de una composicion de plasmina acidificada inactiva de manera reversible. | |
JP5577005B2 (ja) | トロンビン製剤およびその製造方法 | |
JPH01207239A (ja) | 高純度のヒト因子ix濃縮物および他の血漿蛋白質およびそれらの治療学的使用 | |
CN102580062B (zh) | 人凝血因子VIII与vWF复合物或人凝血因子VIII制剂的干热处理稳定剂 | |
JPS597693B2 (ja) | 抗トロンビン製剤及びその製法 | |
EP0782616B1 (en) | Therapeutic grade thrombin production and products | |
AU2003244850B2 (en) | Processes for the preparation of fibrinogen | |
RU2457248C2 (ru) | Способ промышленного получения тромбина | |
AU2019208251A1 (en) | Plasma-supplemented formulation | |
JPH06505494A (ja) | Ix因子の調製 | |
KR950010321B1 (ko) | 인간 트롬빈 제제의 가열처리방법 | |
JP3819935B2 (ja) | トロンビンの調製 | |
BR102013018882A2 (pt) | Desativação viral com caprilato | |
JP2715104B2 (ja) | トロンビン乾燥製剤 | |
US5945103A (en) | Process for producing thrombin | |
RU2648517C1 (ru) | Способ получения лиофилизированного препарата активированного протромбинового комплекса, обладающего фактор viii-шунтирующей активностью | |
CN111569143A (zh) | 一种蛇毒凝血酶原激活物及基于蛇毒凝血酶原激活物的快速止血材料 | |
JPH02218618A (ja) | トロンビン粉末製剤 | |
UA77596C2 (en) | Albumin containing fraction having a reduced prekallikrein activator content and fraction obtained | |
Obergan et al. | Effects of peptide Pro-Gly-Pro-Leu under conditions of normal hemostasis and thrombus formation in rats | |
JP5069661B2 (ja) | ヒト血液凝固第xiii因子の安定化された水性液製剤 | |
JPH0733799A (ja) | 高比活性トロンビンおよびその製造方法 | |
RU2559576C1 (ru) | Способ получения вирусбезопасного полного протромбинового комплекса | |
JPH04198196A (ja) | Cpb―iの安定化方法及びこの製剤組成物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20120610 |
|
NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20130720 |