SU1527261A1

SU1527261A1 - Способ получени тромбина

Info

Publication number: SU1527261A1
Application number: SU884395204A
Authority: SU
Inventors: Мати Эвальдович Хага; Ааво Артурович Аавиксаар; Мари Мейнхардовна Раба; Светлана Алексеевна Пояркова; Людмила Павловна Швачко; Владимир Константинович Кибирев
Original assignee: Институт Химической И Биологической Физики Ан Эсср; Институт Биоорганической Химии Ан Усср
Priority date: 1988-03-21
Filing date: 1988-03-21
Publication date: 1989-12-07

Abstract

Изобретение относитс к производству ферментных препаратов, а именно к способу получени тромбина, примен емого в биоорганической химии. Цель изобретени - увеличение выхода и активности целевого продукта. Согласно предлагаемому способу получение тромбина из активированной протромбиновой сыворотки крови провод т методом аффинной хроматографии на аминогексилагарозе, модифицированной карбобензоксипроизводными дипептидов D-фенилаланил-D-аргинина или D-аргинил-D-фенилаланина, осуществл адсорбцию белков из 0,05 М трис-буфера в присутствии 0,1 М NACL при PH 7,9-8,1, промыва колонку 0,5 М раствором NACL и вымыва адсорбированный тромбин из колонки совместными линейными градиентами хлористого натри от 0,5 до 1,0 М и изопропилового спирта от 0 до 50% при PH 7,9-8,1. 2 табл., 1 ил.

Description

иэводных дипептидов,полученных из D-фенилаланина и D- аргинина. На аффинном сорбенте., синтезированном из аминогексилагарозы и названных пеп- тидов, тромбин адсорбируетс существенно сильнее примесей, которые можно вымывать из колонки до десорбции тромбина. Тромбин вымываетс в совместных градиентах хлористого натри и изопропилового спирта.

Пример 1. Синтез аффинных колонок 20 г аминогексилагарозы (приблизительно 65 мл гел ) промьшют на стекл нном фипьтре последовательно водой (400 мл), 0,1 М раствором , (200мл), водой (200 мл), перевод т в динетипсульфоксид (ДМСО). Дл этого гель промьгеают последовательно 26-, 50-, 75- и 100%-ными раст ворами ДМСО по 200 мл. Примен ют ДОСО который вьщерживают в течение суток над гранулами КОН и перегон ют под уменьшенным давлением над гранулами КОН, 4 г карбобензоксипроизводного дипептидов В-фенилаланил-В-аргинина или В-аргинил-В-фенилаланина раствор ют в 60 мл ДМСО. В полученном растворе суспендируют аминогексилагарозу и прибавл ют 4 г дициклогексилкарбо- диимида. Продолжительность проведени реакции при посто нном перемешивании на качалке при комнатной температуре 15 ч. Полученный сорбент промывают на стекл нном фильтре последе- вательно ДМСО, этанолом, 50%-ным этанолом и водой (каждого по 300 мл).

Пример 2. Соответственно примеру 1 синтезируют аффинные сорбенты со следующими лигандами:карбобензокси -В-фенилаланил-В-аргинии и карбобен- зокси-В-аргинип-О-фенилаланин. Полученными сорбентами заполн ют колонки размерами 1, см, которые уравновешивают 0,05 М и трис-НС с 0,1 М NaCl.

Протромбин получают из плазмы донорской крови исходным из III фракций по Кону. Протромбин активируют добавлением суспензии тромопластина в при- сутствии CaClj при 37 С в течение 30 мин, рН 7,4. Затем нерастворимую часть отдел ют иа ультрацентрифуге УАС-25 при 15000 об/мин в течение 20 мии. Полученный раствор диализуют против 0,05 М и трис-НС с 0,1 М NaC рН 8,0 и нанос т на колонку. После нанесени пробы колонки промьшают 0,05 М и трис-НС буфером, содержащим 0,5 М NaCl, рН 8,0. Адсорбированный тромбин вымьшают из колонок с совместными градиентами хлористого натри (0,5-1,0 М) и изопропилового спирта (0-50%) на 100 мл 0,05 М трис-НС с 0,5 М NaC, рН 8,0 и 100 мл 0,05 М трис-НС с 1 ,0 1 NaC в 50%-ном изопропиловом спирте, рН 8,0. Собирают фракции по 6 мл. Ак/ тивность тромбина в первоначальном растворе и во фракци х определ ют по скорости свертывани 0,1%-ного раствора фибриногена под действием фермента. В 1 мл раствора фибриногена в 0,001 М трис-НС буфере с 0,15 М NaC, рН 7,4 добавл ют 20 мкл исследуемого раствора тромбина и определ ют врем свертывани .

На чертеже показана калибровочна крива активности тромбина, котора построена по данным, полученным тромбином с известной активностью .

Фракции, содержащие тромбин, объедин ют и определ ют оптическую плотность при 280 нм и ферментативную активность. Полученные результаты представлены в табл.1(объем наносимой пробы 50 мл). При расчете содержани тромбина в миллиграмма учитывают, что его 1%-ный раствор имеет при 280 нм оптическую плотность 18,7.

Из табл. 1 видно, что при проведении аффинной хроматографии при комнатной температуре происходит некоторое уменьшение выхода по активности и получаемые препараты тромбина менее активны. Однако их активность превышает активность известных препаратов .

Пример 3. Колонку с размерами 1, см заполн ют аффинным сорбентом, синтезированным по примеру 1 и имеющим в качестве пептидного лиганда карбобензокси-В-аргинил-В-фе нилаланин. Колонку уравновешивают 0,05 М и трис-НС буфером с 0,1 М NaC. рН растворов уравновешивани , нанесени пробы и вымывани адсорбированных веществ измен ют в пределах 7,2-8.5. Все операции провод т при комнатной температуре. Перед нанесением пробы из раствора удал ют осадок центрифугированием. Пор док нанесени пробы и элюирование не отличаютс от приведенного в примере 2. Объем пика тромбина 24 мл. Результаты разделени представлены в табл.2 (очистка тромбина на аффинной колонк с карбобензокси-В-аргинип-В-апанни- агарозой, объем наносимой пробы 15 мл, исходна активность 2600 N.J.H ед./мл, 9,00).

Из приведенных в табл.2 данных видно, что предлагаема аффинна колонка позвол ет получить высокоактивный препарат тромбина с хорошим выходом лишь в узком интервале рН.

Предлагаемый способ позвол ет получать в одну стадию с выходом 90- 99% препарат тромбина с удельной активностью до 6000 N. 1.Н ед./мг.

Сорбенты, используемые при предлагаемом способе, обеспечивают достаточно высокий выход фермента. Ранее дл получени тромбина эти сорбенты не использовались.

Предлагаемый способ технологичен, сорбенты можно использовать многократно . Их сорбционные свойства восстанавливаютс после промывани колонки градиентом изопропипового спирта от 50 до 0%.

Claims

Формула изобретени

Способ получени тромбина из активированной протромбиновой фракции сыворотки крови путем аффинной хроматографии , провод нанесение пробы в 0,05 М трис-НС1 буфере, содержащем 0,1 М NaCl, с последующей злюцией тромбина, о тличающий- с тем, что, с целью увеличени выхода и активности целевого продукта , аффинную хроматографию осуществл ют при рН 7,9-8,1 на аминогексипагарозе , модифицированной карбобен- зоксипроизводными дипептидов D-феннп- аланил-В-аргинина или. В-аргинил-В- -фенилаланина, проведением после нанесени пробы отмывки сорбента с одновременным удалением балластных белков 0,05 М трис-НС1 буфером, содержащем 0,5 М NaCl, осуществлением элюции тромбина тем же буфером с совместными линейными градиентами хлористого натри 0,5-1,0 М и изопропи- лового спирта 0-50%.

Таблица 1

Таблица 2

Редактор О, Юрковецка

О ГгоCsj

Составитель А. Кар кин Техред М.Двдык

Корректор М. Васильева