JPS6036498A - ペプチド類を溶解する方法 - Google Patents

ペプチド類を溶解する方法

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JPS6036498A JP59132157A JP13215784A JPS6036498A JP S6036498 A JPS6036498 A JP S6036498A JP 59132157 A JP59132157 A JP 59132157A JP 13215784 A JP13215784 A JP 13215784A JP S6036498 A JPS6036498 A JP S6036498A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は非水性溶剤および非水性／水性混合溶剤中にペ
グチド類を溶解する方法に関する。
Ｋグチド類は、力／ｌ／　ｇ　ニル基とアミ７基との結
合体であるペグチド結合によって互に連結した２個また
は２個よ）も多いアミノ酸からなる生物的または人工的
な化合物である。本特許出願において、ペゾチドという
用語は≠個またはそれよりも多いアミノ酸を含むオリゴ
９ペグチド、高級な月？１）ベゾチドおよび蛋白質を指
し、一方（ゾチド類という用語は、さらに酵素およびそ
れに関連する物質、すなわちオリがベゾチド鎖および／
またはポリにプチド鎖を含む化合物、のようなシフ０チ
ドの誘導体も包含している。
出願人はメタノールおよびエタノールのような非水性溶
剤にベゾチド類を溶解することを試みたが、多くの場合
有望な結果は得られなかった。ところが、ある濃度のク
ラウン−エーテル（ｅｒ（１’ｎ−ｅｔｈｅｒ　）が存
在する場合には、非水性溶剤および非水性／水性溶剤中
にそれらの被グチド類を首尾よく溶解できることがここ
に発見された。
本出願において、クラウン−エーテルという用語は、静
電的な相互作用を経てアルカリ陽イオンおよびアルカリ
土類陽イオンのような金属イオンと錯体を形成すること
ができる高度に選択的な錯化剤を意味している。環状ク
ラウン−エーテル、ジアザ−クラウン−エーテル、非環
状クラウン−エーテルおよびクリプタンド（ｃｒｙｐｔ
ａｎｄ　）のような幾つかの型のクラウン−エーテルは
Ｊ、　Ｃｈｅｍ。
Ｓｏｃ、　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｔｒａｎｓ、　Ｉ　＋　／　
９Ｉ２年第、２３ｊター、２３１，３頁から公知であシ
、そしてそれらはすべてポリエーテルであるか、または
酸素原子のうちの／個丑たは１個以上が窒素原子および
／または別のへテロ原子によって置換されているポリエ
ーテルである。
クラウン−エーテルが非水性溶剤および／または非水性
／水性混合溶剤からなる溶剤系において大きな蛋白質分
子でさえ溶液にすることができると思われる事実は、急
速に膨張しつつある生物工学の分野において広範囲に使
用できる可能性上句り開いている。
それゆえ、本発明は／　０−１００．０００の範囲にあ
るクラウン−エーテル／（プチドモル比または平均モル
比のクラウン−エーテルまたはクラウン−エーテル混合
物の存在下において非水性媒体および／または非水性／
水性混合媒体中にペゾチドを溶解する方法を提供する。
好ましくはクラウン−エーテル／ペゾチドのモル比また
は平均モル比はｊθ−３０，０００の範囲にある。
好ましくは非水性媒体は水素結合性の溶剤である。さら
に非水性媒体は好ましくは、２ｊ’Ｃにおいて２０−７
００の範囲にある誘電率を有する。適当な誘電率を有す
る好ましい溶剤はメタノール、エタノールおよびジメチ
ルスルホキシドからなる群から選ばれる。非水性媒体ま
たは非水性／水性混合媒体は、好適には上記の水素結合
性の溶剤に加えて、例えば酢酸エチル、アセトンおよび
クロロホルムのような水素結合性でない溶剤を含むこと
ができる。
好適なりラウン−エーテルおよびすべて本発明の範囲内
にらると考えられるクラウン−関連性の大環状化合物、
クリプタンドおよび非環式マルチデンテート（ａｃｙｃ
ｌｌｃ　ｍｕｌｔｌｄｅｎｔａｔｅ　）のようなりラウ
ン−エーテルに関連した化合物はＣｈｅｍｉｃａｌＲｅ
ｖｌｅｗ＋＋　／り７り年第７７巻、第５号、第３に９
−４’４５頁（／り７り年アメリカン　ケミカル　ソサ
イアテイ）に記載された高分子配位子の群および米国特
許第ｖ／ｊ乙乙と３号に記載された大環状化合物から選
ぶことができる。本方法におりて好ましく使用されるク
ラウン−エーテルは７．２＝クラウン−≠、／ｊ−クラ
ウン−ｊ１７ど−クラウンー乙、２／−クラウン−７、
ノペンゾー／ｇ−クラウンー乙およびクリプタンドＣ，
２，２，２”Ｊからなる群から選ばれる。クラウン−エ
ーテルの存在下におじで非水性の有機汚剤に容易に溶解
するゆえに好ましいペプチド類は、ミオグロビン（くじ
らの筋肉）、うし血清アルブミン、うしインシーリン、
チトクロームＣ（うまの心臓）、コレステロールエステ
ラーゼ（微生物）、パパイン、リパーゼ（リゾプスアル
ヒズスへアセチルエステ２〜ゼおよびヒストン類からな
る群から選ばれる。
ペプチド類が実質的に金属塩を含まないときに最良の結
果が得られるようである。したがってペプチド類が金属
塩を実質的に含まないのが好ましい。本発明はさらに本
方法を使用して製造された７種または２種以上のペプチ
ドクラウンーエーテル錯体を含む非水性溶液および非水
性／水性溶液に関する。
非水性媒体および非水性／水性媒体中への（プチド類の
溶解は、好ましくはペプチド類にクラウン−エーテルを
化学的に結合させることによって遂行することができ、
この方法もまた当然本発明の範囲内にあると考えられる
。本発明が、特に非水性溶液および非水性／水性溶液中
にペプチド類、殊に蛋白質が溶解できることが必須の利
用のための生物工学の分野において可能な利用の全範囲
を提供することが理解されるであろう。例えば分別沈澱
および／または分別結晶、クロマトグラフィー法および
電気泳動法を使用することができる有機溶剤または水と
有機溶剤との混合物中に蛋白質または酵素を溶解するこ
とができるならば、蛋白質と酵素の精製および分離は一
層首尾よく遂行することかできる。
その他の潜在的な利用は、例えば重合体のクラウンエー
テルおよび重合体と結合したクラウンエーテルの使用を
含む蛋白質および酵素の固定方法、有機溶剤および水を
有機溶剤との混合物中の酵素の活性の変性および最適化
、および酵素を含む溶剤混合物から酵素活性の回収にお
いて見出される。
さらに、酵素−クラウンエーテル錯体は好ましくは洗浄
剤として使用できる一方、ペプチド−クラウンエーテル
錯体は好ましくは薄膜材料として使用することができる
。
本発明はここに以下の実施例を参照してさらに詳細に説
明される。
実施例Ｉ　ペプチド類の溶解 次の表には或種のクラウンエーテルの存在下においてメ
タノール、エタノールまたは・ジメチルスルホキシドに
溶解する（プチド類が示されている。
（以下余白） 実施例■ α−キモトリプシンはメタノールに全く溶けないが、チ
トクロームＣは比較的低濃度のクラウンエーテルととも
にメタノールに容易に溶解する。
したがって、メタノール（２ｍｌ　）中でチトクローム
Ｃとα−キモトリプシン（各々７０■、それぞれ乙／×
／θ　および≠×１０　（リモル）との混合物を／ｆ−
クラウン−乙（２どダ、０．／／ミリモル）で処理した
。溶解しなかった蛋白質（α−キモ）　ＩＪプシン）か
ら赤色溶液を戸別し、そして水、ついで緩衝液（トリス
、ｐＨＺ−ダ、０．１０Ｍ）で透析した。分離したもの
の純度を確かめるために導電集中法（１ｓｏｅｌｏｃｔ
ｒｉａ　ｆｏｃｕｓｉｎｇ　）を使用してｐ液と濾過さ
れた蛋白質部分の両方を試験した（結果は第２表に示さ
れる）。
α−キモトリプシンはメタノールに不溶性であるか、チ
トクロームＣはＢＳＡよりも低濃度のクラウンエーテル
によってメタノール中に溶解する。
メタノール（，２ｄ）中でチトクロームＣ，ＢＳＡおよ
びα−キモトリプシン（各々１０キ、それぞれ乙／Ｘ＃
）　、／、≠×１０　および≠×／θ　之り１モル）の
混合物を／と一りラウンー乙（！０ｙｒｑ、０．７７４
９モル）で処理し、生成した赤色溶液を濾過してから水
、ついで緩衝液（トリス、ＰｌｌＺ、５″、θｒＯ／　
Ｍ　）で透析してクラウンエーテルと水を除去した。導
電集中法を使用して可溶性部分と不溶性部分の両方を試
験した（結果を第２表に示す）。
（以下余白） いずれの場合も涙液は一成分のチトクロームＣしか含ん
でいなかった。不溶性の部分は一層少ない可溶性蛋白質
を含み、０−７℃において添加剤として硫酸アンモニウ
ムを使用するとさらに高い収率が得られる。
実施例ＩＩＩ 使用 チトクロームＣのような蛋白質、およびクラウンエーテ
ルと安定剤としての硫酸アンモニウムを含むうじのイン
シュリンをメタノール溶液から結晶質複合物として各々
得ることができた。例えば、／♂−クラウンーｔ（３ｓ
〜、０．２７ミリモル）と硫酸アンモニウム（Ａ；Ｏｍ
ｙ、０．３１ミリモル）を含むメタノール（１０ｍｌ）
溶液でチトクロームＣ（２０〜、／、乙×７０＝　ミリ
モル）を処理した。
沈澱用の共溶剤として酢酸エチルを含む外側の管内に、
可溶化した蛋白質溶液を≠℃において貯蔵した。／週間
後に濾過できる結晶質物質が生成し、これは水溶性であ
ることがわかった。蛋白質の分析はその固体物質が２０
重量係の蛋白質を含むことを示していた。円偏光二色性
（ＣＤ　）および紫外線／可視光線の分光学はもとのま
まの蛋白質の存在を示しだ。うじのインシーリンを含む
結晶質物、質はメタノールＣｊｍｌ）中にうじのインシ
ュリン（ｊ■、と１ｒ×７０＝　ミリモル）、／に一り
ラウンー乙（３ｏｏｍｑ、ｉ、ｉ≠ミリモル）および硫
酸アンモニウム（３００■、２．３ミリモル）および沈
澱用溶剤として酢酸エチルを含む溶液から得ることがで
きた。ＤＣスペクトルは予め処理した蛋白質（２２！；
’−２００ｎｍにおいて負の縞）のそれと同様であった
。
実施例■ 蛋白質（例えばチトクロームＣ）と酵素（例えばα−キ
モトリプシン）のための固定化支持材料として％　Ｍｅ
ｒｃｋ−８ｃｈｕｃｈａｒｄｔから得られ、かつメリフ
ィールド（ＭＥＲＲＩＦＩＥＬＤ　）重合体と結合した
アリール−クリプタンド〔λ、、２．／）を含む、重合
体と結合したクリプタンドＫＲＹＰＴＯＦＩＸ　２２／
Ｂ重合体）を使用することができる。弘℃において緩衝
液の中に約０．グー≠Ｘ１０”−’ミｌＪモルの蛋白質
（酵素）を重合体物質と共に／　ｇ　−２００時間単に
野濁させることによって、蛋白質（酵素）を温和な条件
下（さらに別の化学的な変性を必要とし々い）で固定す
ることができた。固定化した酵素物質を戸別し、そして
評価に先立って徹底的に（約３０ｍ１の緩衝液）洗浄し
た。α−キモトリゾシンの場合、＋℃において０．００
　／　Ｎ塩酸（ｍｌ）の中にｔ、ｔｏ＝ｙの蛋白質と３
−００■の重合体を／乙時間懸濁させた。
チトクロームの場合、≠℃において／　ｍｌのトリス緩
衝液（（７，０／　Ｍ　−、ｐ１１Ｚ！；　）の中にｊ
η（０，４１！−×ｉｏ＝　ミリモル）の蛋白質と／ｊ
■の支持体を２００時間懸濁させた。クリプタンドを含
まないＭＥＲＲＩＦＩＥＬＤ重合体について得られた結
果とともに、酵素活性および蛋白質の負荷量を第３表に
一覧で示す。
（以下余白） 実施例■ こと 酵素の活性を有機媒体から水溶液に戻すことによってク
ラウンエーテル／蛋白質の錯体化現象の可逆性を示すこ
とができる。錯化剤と溶剤から酵素を分離する−ために
使用される透析およびｒル濾過のような簡単でしかも穏
かに操作できる方法を使用することによって酵素の活性
を回収することができる。必要ならば、クラウンエーテ
ルの錯化能力を邪魔しないで蛋白質を不可逆的な変性か
ら守る安定剤（例えば硫酸アンモニウム）を使用するこ
ともできる。温度が重要であって、操作中に≠℃よりも
低く保つべきものと考えられる。
下記の２種の酵素を試験した。
コレステロールエステラーゼ−こｈ　は有ｍ　溶剤／ク
ラウンエーテル混合物中に溶解する。
α−キモトリプシン−これはメタノールとクラウンエー
テルとの混合物に溶けないが、最初に酵素の濃厚水溶液
を調製すれば、その後蛋白質の沈澱を起こさずにクラウ
ンエーテルを含むメタノールを添加することができる（
メタノール：水の比、す♂！：／ｊ）。
典型的な実験において、硫酸アンモニウム溶液中の懸濁
物の形にある微生物のステロール−エステルアシルヒド
ロラーゼから得られた約０．１．１−０．４キ、１０−
／ｊＵ（Ｕ＝ｉ９１１Ａ年（７）−’＋−ＩＪ／ガー・
マンハイムのカタログで定義されたのと同じ基質である
オレイン酸コレステロールに対する酵素の比活性度の単
位）のコレステロールエステラーゼ（ペーリンガー・マ
ンハイムＨ）ｆｃ、０−≠℃において／♂−クラクンー
乙（０，／−０，３１−１０，４’−７，７ミリモル）
を含むメタノール溶液（２−乙ゴ）中に溶かした。その
混合物を水に対して透析してから（／乙時間）、短いセ
ファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ　）　Ｇ　２　Ｊ−カ
ラム（空隙容積ｆ　ｍｌ　）全通し、燐酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ乙、２．０．７Ｍ）で溶離させた。ラウリー
法（Ｈ，Ｏ，ＬｏｗｒｙＸＮ、Ｈ。
Ｒｏｓｅｎｂｒｏｕｇｈ　％　Ａ、Ｌ、　Ｆａｒｒおよ
びＲ，Ｊ、　Ｒａｎｄｅｌｌ著、Ｊ、　Ｂ［ｏｌ、　Ｃ
ｈｏｍ、　、第１り３号、７７５７年、第２乙！頁）に
よって蛋白質の評価を測定した。タウロコール酸ナトリ
ウムと３．３％のイソフ０ロバノールを含む燐酸塩緩衝
液（３７℃においてｐｌ（Ｊ、　ｊ　、　０．０！；Ｍ
）中の基質としてセチルアルコール（／、　７．２　ｍ
Ｍ　）とオレイン酸（，２，３７ｍＭ）を使用して、溶
離された試料を酵素活性について評価した。クロロホル
ム（２ｒｎｌ　）への抽出（酵素混合物５１′ｍｌから
分割したθ、ｊｍｆりおよび気液クロマトグラフィーに
よる検出（長さｌフィート、内径２ｆｉの３％ＳＥ充填
カラム、１００−２１ｒＯ℃の間で７０°／分の速さで
計画された、３Ｑｍｌ／分で導入される担体ガスの窒素
を使用して、水素炎イオン化検出器を有するＶａｒｉａ
ｎ　３７θ０型がスクロマトグラフにおいて実施）によ
って、エステラーゼ活性の生成物であるオレイン酸セチ
ルを監視した。
コレステロールエステラーゼ活性の／オレイン酸セチル
単位は、評価の条件下において毎分／μモルのオレイン
酸セチルを合成するのに必要な酵素の量（■）として定
義される。酵素活性の結果を第弘表に要約する。
（以下余白） 方法 ７ｇ−クラウン−２（θ、りＭ）を含み、そして場合に
よシ活性点を保護するために酵素抑制剤であるインドー
ル（０，０３４１Ｍ　）を含むメタノールｊｍｌの溶液
でα−キモトｖプシンの濃厚液（うしの）臂ンクレアー
ゼ、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社製、０．００／Ｍ
塩酸中〜／、　２　ｍＭ、　０．７りｍｌ）を≠ｏ℃に
おいて注意深く（ゆっくシと添加）処理することによっ
て手順を遂行する。ついで繰返し透析しくｏ、θ０／Ｎ
塩酸で約５回）てから溶離剤θｒ００／Ｎ塩酸および３
Ｘ４１Ｏｃｒｔｔの寸法の５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２ｊカ
ラムを使用するダルｐ過によって酵素混合物を精製した
。
０．７Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ＰＨ７，ｆ　、塩化
カルシウム０．７Ｍを含む）中で調製したＮ−ベンゾイ
ル−Ｌ−チロシンエチルエステル（ＢＴＦＩ：Ｅ）’ｉ
使用する分光光度法（／Ｌ？７θ年Ａｃａｄｅｍｉｃ　
Ｐｒｅａｓ発行、Ｇ、　Ｅ、　Ｐｅａｒｌｍａｎｎおよ
びり、　Ｌｏｒａｎｄ編、Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｓ第
ｘ■巻に記載された方法）を用いて、酵素試料および対
応する対照物を活性について評価した。活性点の滴定剤
として！−ヒドロキシーα−トルエンスルホン酸スルト
ンを使用して活性点のモル濃度を測定した。α−キモト
リプシン活性の／　ＢＴＥＥ単位は評価の条件下におい
て毎分ＢＴＢＥ／μモルを加水分解するのに必要な量に
基いて定義した。
メタノール水溶液中における溶解後のα−キモトリプシ
ン活性の結果を第５表に要約する。
（以下余白）

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）　１０−１００．０００の範囲にあるクラウン−
    エーテル／ベグチドモル比または平均モル比のクラウン
    −エーテルまたはクラウン−エーテル混合物の存在下に
    おいて、非水性媒体または非水性／水性媒体に一！ノチ
    ド類を溶解する方法。
  2. （２）クラクン−エーテル／ペプチドのモル比または平
    均モル比が夕θ−３０，０００の範囲にある、特許請求
    の範囲第（１）項記載の方法。
  3. （３）非水性媒体が水素結合性の溶剤である、特許請求
    の範囲第（１）項または第（２）項記載の方法。
  4. （４）非水性媒体が２に℃において、２ｏ−ｉｏ。 の範囲にある誘１率を有する、特許請求の範囲第（１）
    項ないし第（３）項のいずれか７つに記・戒の方法。
  5. （５）　溶剤がメタノール、エタノールおよびジメチル
    スルホキシドからなる群から選ばれる、特許請求の範囲
    第（１）項ないし第（４）項のいずれか７つに記載の方
    法。
  6. （６）　／種または２種以上のクラウン−エーテルが７
    ２−クラウン−≠、／ｊ−クラウン−ｊ１／ｆ−クラウ
    ン−乙、２／−クラウン−７、ジペンゾ−／ｆ−クラウ
    ン−乙およびクリプタンドＣ２，，２，２〕からなる群
    から選ばれる、特許請求の範囲第（１）項ないし第（５
    ）項のいずれか７つに記載の方法。
  7. （７）　−′！デチドがミオグロビン、うし血清アルジ
    ミン、ウシインシュリン、チトクロームＣ１コレステロ
    ールエステラーゼ、ｉ！ノ？イン、リノンーゼ、アセチ
    ルエステラーゼおよびヒストン類からなる群から選ばれ
    る、特許請求の範囲第（１）項ないし第（６）項のいず
    れか７つに記載の方法。
  8. （８）（ノチド（類）が金属塩を実質的に含まない、特
    許請求の範囲第（１）項ないし第（７）項のいずれか７
    つに記載の方法。
  9. （９）　クラウンエーテルがペプチド類と化学的に結合
    している、特許請求の範囲第（１）項ないし第（８）項
    のいずれか７つに記載の方法。 ０１　特許請求の範囲第（１）項ないし＠（９）項のい
    ずれか７つに記載の方法によって製造されたときの７種
    または２種以上のペグチドークラウンエーテル錯体を含
    む非水性溶液。 ◇心　特許請求の範囲第（１）項ないし第（９）項のい
    ずれか７つに記載の方法を使用して蛋白質および／また
    は酵素を精製および分離する方法。 α→　特許請求の範囲第（１）項ないし第（９）項のい
    ずれか７つに記載の方法を使用して酵素の活性を変性お
    よび最適化する方法。 θ埠　特許請求の範囲第（１）項ないし第（９）項のい
    ずれか７つに記載の方法を使用して酵素を含む溶剤混合
    物から酵素活性を回収する方法。 ０４　ペゾチドークラウンエーテル錯体と薄膜材料とし
    て使用する方法。 ｑ→　酵素−クラウンエーテル錯体を洗浄剤として使用
    する方法。
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