DK165411B - Fremgangsmaade til oploesning af peptider, anvendelse deraf og ikke-vandige oploesninger indeholdende peptid/crown-ether complexer - Google Patents

Fremgangsmaade til oploesning af peptider, anvendelse deraf og ikke-vandige oploesninger indeholdende peptid/crown-ether complexer Download PDF

Info

Publication number
DK165411B
DK165411B DK316984A DK316984A DK165411B DK 165411 B DK165411 B DK 165411B DK 316984 A DK316984 A DK 316984A DK 316984 A DK316984 A DK 316984A DK 165411 B DK165411 B DK 165411B
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
crown
aqueous
ether
peptides
process according
Prior art date
Application number
DK316984A
Other languages
English (en)
Other versions
DK316984D0 (da
DK165411C (da
DK316984A (da
Inventor
Barbara Odell
Original Assignee
Shell Int Research
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shell Int Research filed Critical Shell Int Research
Publication of DK316984D0 publication Critical patent/DK316984D0/da
Publication of DK316984A publication Critical patent/DK316984A/da
Publication of DK165411B publication Critical patent/DK165411B/da
Application granted granted Critical
Publication of DK165411C publication Critical patent/DK165411C/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D71/00—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by the material; Manufacturing processes specially adapted therefor
    • B01D71/06—Organic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
    • C07K1/32—Extraction; Separation; Purification by precipitation as complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38618—Protease or amylase in liquid compositions only
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6427—Chymotrypsins (3.4.21.1; 3.4.21.2); Trypsin (3.4.21.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
    • Y10S530/816—Attached to the carrier via a bridging agent

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

i
DK 165411 B
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til opløsning af peptider i ikke-vandige eller blandede ikke-vandige/vandige opløsningsmidler, anvendelse deraf og ikke-vandige opløsninger indeholdende peptid/crow-ether complexer.
5 Peptider er biologiske eller syntetiske forbindelser, som består af to eller flere aminosyrer, som er bundet sammen med peptidbindinger, som er kombinationer af en carbonyl- og en aminogruppe. I nærværende beskrivelse og krav betegner udtrykket "peptid" oligopeptider indeholdende fire eller flere aminosyrer, højere polypeptider og prote-10 iner, medens udtrykket "peptider" endvidere omfatter derivater af peptider såsom enzymer og beslægtede substrater, dvs. forbindelser, som indeholder oligopeptid- og/eller polypeptidkæder.
Nærværende ansøgere har forsøgt at opløse peptider i ikke-vandige opløsningsmidler såsom methanol og ethanol, men i de fleste tilfælde 15 blev der ikke opnået noget positivt resultat. Det har imidlertid nu vist sig, at disse peptider med held kan opløses i ikke-vandige og blandede ikke-vandige/vandige opløsningsmidler, hvis der er crown-ethere til stede i visse koncentrationer.
I nærværende beskrivelse og krav betegner udtrykket "crown-ether" et 20 i høj grad selektivt complext middel, som kan danne complexer med metalioner såsom alkali- og jordalkalikationer via elektrostatiske samvirkninger. Fra J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 1982, s. 2359-2363 kendes flere typer crown-ethere såsom den cycliske crown-ether, diaza-crown-etheren, den ikke-cycliske crown-ether og cryptanden, som 25 alle er polyethere eller polyethere, i hvilke ét eller flere af oxygenatomerne er blevet erstattet med et nitrogenatom og/eller et andet heteroatom.
Crown-etheres tilsyneladende evne til at bringe endog store proteinmolekyler i opløsning i et opløsningsmiddelsystem omfattende ikke-30 vandige og/eller blandede ikke-vandige/vandige opløsningsmidler åbner mulighed for en lang række anvendelser inden for det hurtigt udviklende bioteknologi-område.
2
DK 165411 B
Den foreliggende opfindelse angår således en fremgangsmåde til opløsning af peptider i et ikke-vandigt eller blandet ikke-vandigt/van-digt medium, ved hvilken fremgangsmåde peptider opløses i et ikke-vandigt eller blandet ikke-vandigt/vandigt medium i narværelse af en 5 crown-ether eller en blanding af crown-ethere i et molært eller gennemsnitligt molært crown-ether/peptid-forhold, som er i området 10-100.000. Fortrinsvis ligger det molære eller gennemsnitlige molære crown-ether/peptid-forhold i området 50-30.000.
Det ikke-vandige medium er fortrinsvis et hydrogenbindende opløs-10 ningsmiddel. Endvidere har det ikke-vandige medium fortrinsvis en dielektricitetskonstant, som er i området 20-100 ved 25°C. Foretrukne opløsningsmidler med en hensigtsmæssig dielektricitetskonstant er valgt blandt methanol, ethanol og dimethylsulfoxid. Det ikke-vandige eller blandede ikke-vandige/vandige medium kan ud over de ovenfor 15 nævnte hydrogenbindende opløsningsmidler hensigtsmæssigt indeholde ikke-hydrogenbindende opløsningsmidler såsom fx ethylacetat, acetone og chloroform.
Hensigtsmæssige crown-ethere og beslægtede forbindelser såsom crown-relaterede makrocycler, cryptander og acycliske multidentater, kan 20 vælges blandt gruppen af makromolekylære ligander, som er blevet beskrevet i Chemical Reviews, bind 79, nr. 5, s. 389-445, 1979, (1979 American Chemical Society), og blandt de makrocycliske forbindelser, som er blevet beskrevet i USA-patentskrift nr. 4.156.683. Crown-ethere, som fortrinsvis anvendes i nærværende fremgangsmåde, er valgt 25 blandt gruppen bestående af 12-crown-4, 15-crown-5, 18-crown-6, 21-crown-7, dibenzo-18-crown-6 og cryptand [2.2.2]. Peptider, som let opløses i ikke-vandige organiske opløsningsmidler i nærværelse af crown-ethere, og som derfor foretrækkes, vælges blandt gruppen bestående af myoglobin (hvalmuskel), bovint serumalbumin, bovint insu-30 lin, cytochrom C (hestehjerte), cholesterol esterase (mikrobielt), papain, lipase (Rhizopus arrhizus), acetylesterase og histoner.
De bedste resultater opnås tilsyneladende, når peptiderne i det væsentlige er frie for metalsalt. Derfor foretrækkes det, at peptiderne i det væsentlige er frie for metalsalt. Den foreliggende opfindelse 35 angår endvidere ikke-vandige opløsninger som indeholder et eller 3
DK 165411 B
flere peptid/crown-ether-complexer kendetegnet ved, at de er fremstillet ved fremgangsmåde ifølge opfindelsen.
Opløsning af peptider i ikke-vandige og blandede ikke-vandige/vandige medier kan fortrinsvis udføres ved kemisk binding af crown-etherne 5 til peptiderne. Det er klart, at den foreliggende opfindelse frembyder en lang række mulige anvendelsesområder inden for bioteknologiområdet, især de anvendelsesområder, for hvilke det er vigtigt, at peptider og især proteiner kan opløses i ikke-vandige og blandede ikke-vandige/vandige opløsninger. Fx kan protein- og enzymrensning og 10 -adskillelse udføres med større held, hvis proteinet eller enzymet kan opløses i organiske opløsningsmidler eller i vandige organiske opløsningsmiddelblandinger, som muliggør anvendelse af fraktioneret udfældning og/eller krystallisation, chromatografiske og elektroforetiske teknikker. Den foreliggende opfindelse omfatter ligeledes 15 anvendelse af en fremgangsmåde ifølge opfindelsen til rensning og adskillelse af proteiner og/eller enzymer.
Andre mulige anvendelsesområder af fremgangsmåder ifølge den foreliggende opfindelse foreligger, fx fremgangsmåder til immobilisering af proteiner og enzymer, som omfatter anvendelsen af polymerer og 20 polymer-bundne crown-ethere, modifikation og optimering af enzymaktiviteterne i organiske opløsningsmidler og i vandige organiske opløsningsmiddelblandinger samt isolering af enzymaktivitet ud fra opløsningsmiddelblandinger indeholdende enzymer. Endvidere angår den foreliggende opfindelse anvendelse af peptid/crown-ethercomplexer 25 som membranmaterialer, medens enzym/crown-ethercomplexer fortrinsvis kan anvendes som detergenter.
Den foreliggende opfindelse belyses nærmere ved nedenstående eksempler.
EKSEMPEL 1 30 Opløsning af peptider 4
DK 165411 B
I tabellen er anført eksempler på peptider, som opløses i methanol, ethanol eller dimethylsulfoxid i nærværelse af visse crown-ethere.
Tabel 1 (a)
Små peptider og proteiner, som opløses i organiske opløsningsmidler 5 under anvendelse af crown-ethere og cryptander
Op- løsnings-
Peptid/protein Antal aminosyrerester middel 10
Bovint insulin (A) 21 MeOH
(B) 30 MeOH
(A-B) 51 MeOH
15 Cytochrom c 104 MeOH
Hestehj erte EtOH
DMSO
Bovint serum-
20 albumin (BSA) 513 MeOH
Myoglobin 153 MeOH
Hvalskeletmuskel
25 a-chymotrypsin 245 MeOH
(bovin pancreas)
Papain 198 MeOH
30 Cholesterol-esterase 646 MeOH
Lysozym (æggehvide) 129 MeOH
Histon III-S >100 MeOH
3 5 (kalve thymus )
His ton VIII-S >100 MeOH
(kalve thymus) 5
DK 165411 B
Peptid/protein Molforhold mellem peptid/protein og crown-ether 12-crown-4 15-crown-5 18-crown-6 21-crown-7 Cryptand 5 [2.2.2.]
Bovint insulin (A) 1:75 (B) 1:102 10 (A-B) in* 1:1207 1:120
Cytochrom c 1:1220 1:1200 1:127-300 1:798 1:120
Hestehjerte 1:2000 1:1900 15 _
Bovint serum- albumin (BSA) in* 1:426 1:6130 1:309
Myoglobin in* 1:2109 1:212 20 (Hvalskelet-muskel) a -chymotryp- in* in* sin (bovin 25 pancreas)
Papain 1:1x10^
Cholesterol- 1:1x10^ 30 esterase
Lysozym 1:150 (æggehvide) 35 Histon III-S l:l,75b (kalvethymus)
Histon VIII-S in* (kalvethymus) 40 _ in* = uopløseligt (uafhængigt af crown-ether) b = vægtforhold mellem protein og crown-ether 6
DK 165411 B
(a) = proteinkoncentrationen var i området 0,05-0,8 millimol afhæn gig af protein (dvs. cytochrom c-koncentrationen var 0,8 millimol, hvorimod myoglobinkoncentrationen var 0,1 millimol).
I et typisk forsøg sattes små portioner af CE (ca. 2,0 mg, 7,6 5 x 10“^ millimol) til en suspension af protein/peptid (5 mg) i methanol (2 ml) ved 4-25°C under omrøring, indtil suspensionen opløstes.
EKSEMPEL 2
Anvendelse af crown-ethere/cryptander ved proteinadskillelse og 10 -rensning a) Adskillelse af cytochrom c fra a-chymotrypsin
Cytochrom c opløstes nemt i methanol med relativt lave koncentrationer af crown-ether, medens α-chymotrypsin er fuldstændig uopløseligt. Blandinger af cytochrom c og a-chymotrypsin (10 mg hver, henholdsvis 15 8,1 x 10"^ og 4 x 10"^ millimol) blev således behandlet med 28 mg 18- crown-6 (0,11 millimol) i 2 ml methanol. Uopløst protein (a-chymotrypsin) blev filtreret fra den røde opløsning, som blev dialyseret mod vand og derefter puffer (tris, pH-værdi 7,5, 0,10 mol). Både filtratet og filtrerede proteinfraktioner blev undersøgt under an-20 vendelse af isoelektrisk fokusering for at bestemme renheden af de adskilte materialer (resultaterne er vist i tabel 2).
b) Adskillelse af cytochrom c fra en blanding af cytochrom c, BSA og a-chymotrypsin
Cytochrom c opløses i methanol ved en lavere crown-etherkoncentration 25 end BSA, medens α-chymotrypsin er uopløseligt. Blandinger af cytochrom c, BSA og a-chymotrypsin (10 mg hver, henholdsvis 8,1 x 10"^, 1,4 x 10’^ og 4 x 10"^ millimol) blev behandlet med 50 mg 18-crown-6 (0,19 millimol) i 2 ml methanol, og den resulterende røde opløsning blev filtreret og derefter dialyseret mod vand og derefter puffer 30 (tris, pH-værdi 7,5, 0,01 mol) for at fjerne crown-ether og methanol.
Både opløselige og uopløselige fraktioner blev undersøgt under anvendelse af isoelektrisk fokusering (resultaterne er vist i tabel 2).
Tabel 2 7
DK 165411 B
Proteinseparationer under anvendelse af crown-ether/methanol-opløsninger 5 Protein- Isoelektriske Proteinbestemmelse* blandinger fokuseringsresultater (Lowry) (a) opløselig (b) uopløse- a) opløselig b) uopløse-fraktion lig fraktion fraktion lig fraktion 10 _ (cytochrom c cytochrom c a-chymotryp-( sin ( 55% 32% a- ( a-chymotrypsin (pHj 9,35) (pHj 8,7-7,4) cytochrom c chymo-15 trypsin
( cytochrom c cytochrom c BSA
( (pH! 5,5-6,0)
( BSA (pHx 9,35) a-chymotryp- 51% 28% BSA
20 ( sin (spor, cytochrom c ( a-chymotrypsin pHj 8,7-7,4) * Proteinbestemmelser baseret på 10 mg af hvert protein, der var til stede ved starten af forsøget - eventuelle proteintab kunne 25 skyl des denaturering og det forhold, at proteinbestemmelserne var unøjagtige på grund af spor af crown-ether, som forstyrrede absor-bans-målingerne (Lowry-metoden).
Filtraterne indeholdt i begge tilfælde kun én bestanddel, cytochrom c. De uopløselige fraktioner indeholdt de mindre opløselige prote-30 iner, hvoraf der kunne opnås højere udbytter, hvis anvendes som additiv ved 0-4°C.
EKSEMPEL 3 2) Anvendelse af crown-ethere ved proteinkrystallisation
Proteiner såsom cytochrom c og bovint insulin indeholdende crown-35 ether og (NH^^SO^ som stabiliseringsmiddel kan begge vindes som krystallinske blandingsprodukter ud fra methanolopløsninger. Fx blev
DK 165411 B
s 20 mg cytochrom c (1,6 x 10" ^ millimol) behandlet med 10 ml methanol-opløsning indeholdende 55 mg 18-crown-6 (0,21 millimol) og 50 mg (NH4>2S04 (0,38 millimol). De opløste proteinopløsninger blev lagret ved 4°C i ydre rør indeholdende ethylacetat som udfældende co-opløs-5 ningsmiddel. Efter 1 uge dannedes krystallinsk materiale, som kunne filtreres, og som viste sig at være vandopløseligt. Proteinanalyse indikerede, at det faste materiale indeholdt 20 vægtprocent protein. Cirkulær dikroisme-(CD) og UV/synligt lys-spektroskopi indikerede tilstedeværelsen af intakt protein. Der kunne opnås krystallinsk 10 materiale indeholdende bovint insulin ud fra en opløsning omfattende 5 mg bovint insulin (8,6 x 10"^ millimol), 300 mg 18-crown-6 (1,14 millimol) og 300 mg (^4)2804 (2,3 millimol) i 5 ml methanol og ethylacetat som udfældende opløsningsmiddel. CD-Spektret lignede spektret for forbehandlet protein (negativt bånd ved 225-200 nm).
15 EKSEMPEL 4
Anvendelse af polymerbundne crown-ethere til protein- og enzymimmobilisering
Et cryptand-bundet polymert materiale (Kryptofix® 221B-polymer) fra Merck-Schuchardt og omfattende en aryl-cryptand [2.2.1] bundet til en 20 Merrifield-polymer kan anvendes som immobiliseringsstøttemateriale til proteiner (fx cytochrom c) og enzymer (fx α-chymotrypsin). Proteiner (enzymer) kunne immobiliseres under milde betingelser (krævede ikke yderligere kemisk modifikation) ved simpelthen at suspendere proteinet (enzymet) ca. 0,4-4 x 10"·* millimol med 500 mg af det 25 polymere materiale i en puffer i 16-200 timer ved 4°C. Det immobili-serede enzymmateriale blev filtreret fra og vasket grundigt (ca. 30 ml puffer) før assay. I tilfælde med α-chymotrypsin blev 40 mg protein og 500 mg polymer suspenderet i 0,001 N HC1 (ml) i 16 timer ved 4°C. I tilfælde med cytochrom c blev 5 mg 0,4 x 10"-* millimol protein 30 og 15 mg støttemateriale suspenderet i 1 ml tris-puffer (0,01M, pH-værdi 7,5) i 200 timer ved 4°C. Enzymaktiviteterne og proteinladninger er vist i tabel 3 sammen med resultaterne, som er opnået med Merrifield-polymer uden cryptand.
9
DK 165411 B
Tabel 3
Data for immobiliseringen af α-chymotrypsin og cytochrom c på Kryptofix® 221B-polymer 5 Enzym* begyndel- Specifik* mg protein seshastig- aktivitet
Polymert på under- Lad- hed milli- pmol/min./
Protein/enzym materiale lag ning1 mol/min. mg 10 _ α-Chymotrypsin Kryptofix® 17,7 3,5 30 1,7
221B
40 mg 1,6 xlO"3 500 mg millimol 15 _ α-Chymotrypsin Kryptofix® 5,4 4,1 30 5,6
221B
100 mg 4 x 10"3 132 mg millimol 20 _ α-Chymotrypsin frit enzym 0,05 - 15 300 0,05 mg 2 x 10'3 μιηοΐ 25 α-Chymotrypsin Merrifield- 24 4,8 7,5 0,3 polymer 40 mg 1,6 x 10'3 (umodificeret) millimol 500 mg 30 Cytochrom c Kryptofix® 1,58 10,5 - ikke 221B målt 5 mg 0,4 xl0‘3 15 mg millimol 35 * Enzymassay blev udført under anvendelse af pH-stat-titrimetriske metoder omfattende N-acetyl-tyrosinethylester (ATEE) med en start koncentration på 0,01 M som substrat ved 26°C i tris/CaCl2 puffer (pH-værdi 7,75, 0,01 M), i henhold til Methods in Enzymo-logy XIX, 73, 1970. Redigeret af G.E. Perlmann og L. Lorand, 40 Academic Press.
Ladningen er lig med gram protein absorberet på underlaget divideret med gram underlag x 100.
10
DK 165411 B
α-Chymotrypsin fra bovin pancreas, 3 gange krystalliseret (Sigma Chemical Co.)· Cytochrom c fra hestehjerte (type III, fra Sigma Chemical Co.). Det cryptand/polymer-immobiliserede enzym (a-chymotrypsin) havde en operativ halveringstid på 56 dage ved 5 20°C.
EKSEMPEL 5
Isoleringen af enzymaktivitet ud fra ikke-vandige pg blandede ikke-vandige/vandige medier under anvendelse af crown-ethere
Reversibilitet af crown-ether/protein-complexfænomenet kan påvises 10 ved at isolere enzymaktiviteten fra organiske medier ind i en vandig opløsning. Ved at anvende simple og milde manipulationsteknikker såsom dialyse og gelfiltrering, som anvendes for at adskille enzymet fra comp lexer ingsmidlet og opløsningsmidlet, kan enzymaktiviteten generhverves. Det kan være nødvendigt også at anvende et stabilise-15 ringsmiddel (fx (NH^^SO^.), som ikke griber ind i crown-ethernes complexeringsevne, men beskytter proteinet mod irreversibel denaturering. Det menes, at temperaturen er vigtig og bør holdes under 4°C under manipulation.
To enzymer er blevet undersøgt: 20 Cholesterolesterase - som er opløseligt i organiske opløsningsmid-del/crown-ether-blandinger.
α-Chymotrypsin - som er uopløseligt i methanol crown-etherblanding, men hvis en koncentreret opløsning af enzymet først fremstilles i vand, kan methanolholdig crown-ether derefter tilsættes uden protein-25 udfældning (omtrentlig forhold mellem methanol og vand 85:15).
a) Fremgangsmåde til generhvervelse af cholesterolesterase-aktivite-ten ud fra en organisk opløsningsmiddel/methanolblanding under anvendelse af crown-ethere
Ved et typisk forsøg blev cholesterolesterase (Boehringer Mannheim) 30 fra mikrobiel sterolester-acylhydrolase, en suspension i (NH^^SO^, ca. 0,4-0,6 mg, 10-15U (U = enhed for specifik aktivitet af enzymet 11
DK 165411 B
på cholesterololeat som substrat som defineret i Boehringer Mannheims katalog 1984) opløst i en methanolopløsning (2-6 ml) indeholdende 0,1-0,3 g 18-crown-6 (0,4-1,1 millimol) ved 0-4°C. Blandingen blev dialyseret i 16 timer mod vand og derefter elueret gennem en kort 5 Sephadex® G25-søjle (tomt volumen 8 ml) med natriumphosphatpuffer (pH-værdi 6,2, 0,1 M). Proteiribestemmelserne blev foretaget ved Lowry-metoden (H.O. Lowry, N.H. Rosenbrough, A.L. Farr og R.J.
Rande11, J. Biol. Chem. 193, s. 265, 1951). Eluerede prøver blev testet for enzymaktivitet under anvendelse af cetylalkohol (1,72 10 millimol) og oliesyre (2,37 millimol) som substrater i phosphatpuffer (pH- værdi 6,5, 0,05 M, ved 37°C) indeholdende natriumtaurocholat og 3,3% isopropanol. Produktet fra esteraseaktiviteten, cetyloleat, blev overvåget ved ekstraktion (0,5 ml's alikvoter fra 9 ml's enzymblandinger) i chloroform (2 ml) og detektion ved gas/væskechromatografi 15 (udført på en Varian 3700 gaschromatograf med flammeioniseringsdetektor under anvendelse af en 61 cm's, 3% SE 30 pakket søjle med en indre diameter på 2 mm; bærergas nitrogen ved 30 ml/min. , programmeret til 100-260eC ved 10eC/min.).
Én cetyloleatenhed af cholesterolesteraseaktivitet blev defineret som 20 mængden af enzym (i mg), som krævedes for at syntetisere 1 μπιοί cetyloleat/min. under forsøgsbetingelserne. Resultaterne af enzymak-tiviteterne er vist i tabel 4.
Tabel 4 12
DK 165411 B
Isolering af cholesterolesterasevirkning fra methanol/crown-etheropløsninger i vandig fase 5 Specifik ak tivitet af til- % Protein Starthastig- bageværende Isolerings- genvun- hed protein μταοί/
Enzymsystem metode det μπιοΐ/min. min./mg 10 _____
Vandig
Kontrol-chole- gel- 85,8 1,32 6,4 sterolesterase filtrering 15 i puffer
Vandig
Kontrol-chole- dialyse + 75 1,0 8,89 20 sterolester i gelfiltrering puffer
Ikke-vandig 25 Cholesterol- gelfiltrering* 36 - esterase op- dialyse + løst i MeOH/- gelfiltrering 39 0,43 7,25 18-crown-6 30 * Starthastigheden ikke optegnet, men 65,4%'s esterificering blev opnået efter 16 timer.
b) Fremgangsmåde til isolering af α-chymotrypsinaktivitet fra blandet ikke-vandigt/vandigt opløsningsmiddelsystem under anvendelse af crown-ethere
Der udføres en fremgangsmåde, hvorved koncentrerede opløsninger af a-chy-35 motrypsin (bovin pancreas, Sigma Chemical Company, ca. 1,2 millimol i 0,001 MHC1, 0,75 ml) forsigtigt (ved langsom tilsætning) behandles ved 40°C med opløsninger af 5 ml methanol indeholdende 18-crown-6 (0,9 M) og i nogle 13
DK 165411 B
tilfælde enzyminhibitor, indol (0,034 M), for at beskytte det aktive sted. Enzymblandingerne renses derefter ved gentagen dialyse (ca. 5 gange mod 0,001 MHC1) efterfulgt af gelfiltrering under anvendelse af 0,001 NHC1 som elu-eringsmiddel og Sephadex® G25-søjlen med dimensionerne 3 x 40 cm).
5 Enzymprøver og tilsvarende kontrolprøver testes for aktivitet under anvendelse af en spektrofotometrisk fremgangsmåde, som anvender N-benzoyl-L-tyrosi-nethylester (BTEE) (Methods in Enzymology, bind XIX, 1970, red. G.E. Pearl-mann og L. Lorand, Academic Press) fremstillet i 0,1 H tris-HC1-puffer (pH-værdi 7,8, indeholdende CaCl2 0,1 M). Molariteten af de aktive steder be-10 stemmes under anvendelse af et titreringsmiddel for det aktive sted, 2-hy-droxy-α-toluensulfonsyresulton (Methods in Enzymology, bind XIX, 1970, redigeret af G.E. Pearlmann og L. Lorand, Academic Press). Én BTEE-enhed af a-chymo t ryp s inakt iv i te t blev defineret som den mængde, der var nødvendig for at hydrolysere én μταοί BTEE pr. minut under forsøgsbetingelserne.
15 Resultaterne af α-chymotrypsinaktivitet efter opløsning i vandig methanol er vist i tabel 5.
Tabel 5 14
DK 165411 B
Resultater for α-chymotrypsinaktivitet fra vandigmethanoliske opløsninger indeholdende 18-crown-6 under anvendelse af BTEE-substrat ved 30°C
5 ______
Specifik aktivitet af til-
Opløs- % Protein Molaritet bageværende
Enzym- ningsmid- Inhibitor genvun- af aktive protein μπιοί/ 10 system delsystem indol det steder min./mg
Kontrol 0,001 M HCl 0,034 M 98% 85% 62 (a-chymo- 5,75 ml trypsin 15 ingen crown-ether)
Kontrol MeOH 0,001 0,034 M 20-30% - 20-28 M HCl 20 (a-chymo- 5 ml 0,75 ml trypsin ingen crown-ether, ppt) 25_____ a-chymo- MeOH 0,001 0,034 M 50-95% 50-70% 30-56 trypsin + M HCl
18-crown-6 5 ml 0,75 ml 0,9 M
30 __ a-chymo- EtOH 0,001 0,034 M 80-100% 47% 35 trypsin + M HCl
18-crown-6 1,6 ml 0,5 ml 0,9 M
35 ____ a-chymo- MeOH 0,001 - 57% 57% 63 trypsin + M HCl
18-crown-6 5 ml 0,75 ml 0,9 M
40 ____

Claims (15)

1. Fremgangsmåde til opløsning af peptider i et ikke-vandigt eller blandet ikke-vandigt/vandigt medium, kendetegnet ved, at peptider opløses i et ikke-vandigt 5 eller blandet ikke-vandigt/vandigt medium i nærværelse af en crown -ether eller en blanding af crown-ethere i et molært eller gennemsnitligt molært crown-ether/peptidforhold, som er i området 10-100.000.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det molære eller gennemsnitlige molære 10 crown-ether/peptidforhold er i området 50-30.000.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det ikke-vandige medium er et hydrogenbindende opløsningsmiddel.
4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, 15 kendetegnet ved, at det ikke-vandige medium har en dielektricitetskonstant, som er i området 20-100 ved 25°C.
5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, kendetegnet ved, at opløsningsmidlet er valgt blandt gruppen bestående af methanol, ethanol og dimethylsulfoxid.
6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet ved, at crown-etheren eller crown-etherne er valgt blandt gruppen bestående af 12-crown-4, 15-crown-5, 18-crown- 6. 21-crown-7, dibenzo-18-crown-6 og cryptand [2.2.2].
7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, 25 kendetegnet ved, at peptidet er valgt blandt gruppen bestående af myoglobin, bovint serumalbumin, bovint insulin, cytochrome c, cholesterolesterase, papain, lipase, acetylesterase og histoner. DK 165411 B
8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7, kendetegnet ved, at peptidet eller peptiderne i det væsentlige er fri for metalsalt.
9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-8, 5 kendetegnet ved, at crown-etheme er blevet kemisk bundet til peptiderne.
10. Ikke-vandige opløsninger som indeholder ét eller flere peptid/-crown-ether-complexer, kendetegnet ved, at de er fremstillet ved en fremgangsmåde 10 ifølge et hvilket som helst af kravene 1-9.
11. Anvendelse af en fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-9 til rensning og adskillelse af proteiner og/eller enzymer .
12. Anvendelse af en fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af 15 kravene 1-9 til modifikation og optimering af enzymaktiviteten.
13. Anvendelse af en fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-9 til isolering af enzymaktivitet for opløsningsmiddelblandinger indeholdende enzymer.
14. Anvendelse af peptid/crown-ethercomplexer som ovenfor defineret 20 som membranmaterialer.
15. Anvendelse af enzym/crown-ethercomplexer som ovenfor defineret som detergenter.
DK316984A 1983-06-29 1984-06-28 Fremgangsmaade til oploesning af peptider, anvendelse deraf og ikke-vandige oploesninger indeholdende peptid/crown-ether complexer DK165411C (da)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB838317697A GB8317697D0 (en) 1983-06-29 1983-06-29 Dissolution of peptides in non-aqueous and mixed non-aqueous/aqueous solvents
GB8317697 1983-06-29

Publications (4)

Publication Number Publication Date
DK316984D0 DK316984D0 (da) 1984-06-28
DK316984A DK316984A (da) 1984-12-30
DK165411B true DK165411B (da) 1992-11-23
DK165411C DK165411C (da) 1993-04-13

Family

ID=10545005

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK316984A DK165411C (da) 1983-06-29 1984-06-28 Fremgangsmaade til oploesning af peptider, anvendelse deraf og ikke-vandige oploesninger indeholdende peptid/crown-ether complexer

Country Status (10)

Country Link
US (1) US4532212A (da)
EP (1) EP0136728B1 (da)
JP (1) JPS6036498A (da)
AT (1) ATE26986T1 (da)
AU (1) AU569896B2 (da)
CA (1) CA1228041A (da)
DE (1) DE3463509D1 (da)
DK (1) DK165411C (da)
GB (1) GB8317697D0 (da)
NZ (1) NZ208701A (da)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3440988A1 (de) * 1984-11-09 1986-07-10 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Verfahren zur spaltung von peptiden und proteinen an der methionyl-bindung
FR2652581B1 (fr) * 1989-10-02 1991-12-13 Rhone Poulenc Chimie Procede de solubilisation de peptides et procede de synthese de peptides.
WO1997024421A2 (en) * 1995-12-29 1997-07-10 The Procter & Gamble Company Detergent compositions comprising immobilized enzymes
BR9510680A (pt) * 1995-12-29 1999-03-30 Procter & Gamble Composições detergentes compreendendo enzimas imobilizadas
WO1998028394A1 (en) * 1996-12-20 1998-07-02 The Procter & Gamble Company Detergent compositions comprising cholesterol esterase
WO1999002641A1 (en) * 1997-07-09 1999-01-21 The Procter & Gamble Company Cleaning compositions comprising a cytochrome
US6492316B1 (en) 1997-07-09 2002-12-10 The Procter & Gamble Company Cleaning compositions comprising a cytochrome
NL1017258C2 (nl) * 2001-02-01 2002-08-02 Univ Delft Tech Werkwijze voor het maken van vernette enzymaggregaten.
SE0104462D0 (sv) * 2001-12-29 2001-12-29 Carlbiotech Ltd As Peptide purifcation (Peptidrening)
US7060478B2 (en) * 2004-03-12 2006-06-13 Min-Hsiung Lee Process for preparing lysozyme
CN102770152B (zh) * 2009-11-25 2016-07-06 阿瑞斯根股份有限公司 肽类的粘膜递送
CN107427589A (zh) * 2015-02-10 2017-12-01 卡内基梅隆大学 酶‑聚合物缀合物的非水溶液和相关方法
US11472894B2 (en) 2018-07-23 2022-10-18 Carnegie Mellon University Enzyme-assisted ATRP procedures
US12053529B2 (en) 2018-08-01 2024-08-06 Carnegie Mellon University Amino-reactive positively charged ATRP initiators that maintain their positive charge during synthesis of biomacro-initiators

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4156683A (en) * 1973-03-26 1979-05-29 Schering Corporation Complexes of macrocyclic compounds

Also Published As

Publication number Publication date
NZ208701A (en) 1987-10-30
CA1228041A (en) 1987-10-13
DK316984D0 (da) 1984-06-28
JPH0585559B2 (da) 1993-12-07
AU2997684A (en) 1985-01-03
DE3463509D1 (en) 1987-06-11
EP0136728A3 (en) 1985-09-25
DK165411C (da) 1993-04-13
EP0136728A2 (en) 1985-04-10
AU569896B2 (en) 1988-02-25
ATE26986T1 (de) 1987-05-15
JPS6036498A (ja) 1985-02-25
US4532212A (en) 1985-07-30
EP0136728B1 (en) 1987-05-06
GB8317697D0 (en) 1983-08-03
DK316984A (da) 1984-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK165411B (da) Fremgangsmaade til oploesning af peptider, anvendelse deraf og ikke-vandige oploesninger indeholdende peptid/crown-ether complexer
Inman [3] Covalent linkage of functional groups, ligands, and proteins to polyacrylamide beads
Carraway et al. [56] Carbodiimide modification of proteins
US3836433A (en) Fixation of nitrogenous materials
Jacq et al. Cytochrome b2 from Bakers' Yeast (L‐Lactate Dehydrogenase) A Double‐Headed Enzyme
RU2124052C1 (ru) Кристалл белка, сшитого многофункциональным сшивающим агентом (варианты), устройство, содержащее этот кристалл, и способ получения аспартама
SK288005B6 (sk) In vitro method for specifically removing or isolating plasminogen or plasmin and support used in this method
CA2282842C (en) A method of recovering highly purified vwf or factor viii/vwf-complex
JPS5839513B2 (ja) 精製したトリプシンおよびトリプシン様酵素の貯蔵法
EP0128885A1 (en) A method for splitting di-sulphide bonds
Meuth et al. Stepwise sequence determination from the carboxyl terminus of peptides
Metrione et al. Subunit structure of dipeptidyl transferase
Huang et al. Calcium-binding protein of bovine intestine. The complete amino acid sequence.
Horton et al. [35] Immobilization as a means of investigating the acquisition of tertiary structure in chymotrypsinogen
Goldberger [34] Trifluoroacetylation of ϵ-amino groups
JP3353278B2 (ja) ペプチドｎ末端フラグメントの分取方法
Cuatrecasas Functional purification of proteins and peptides by affinity chromatography
PT89019B (pt) Processo para a cisao selectiva de proteinas de fusao
Fujiwara et al. Affinity Chromatography of α-Chymotrypsin, Subtilisin, and Metalloendopeptidases on Carbobenzoxy-L-phenylalanyl-triethylenetetraminyl-Sepharose
Adams et al. Kinetics of heme octapeptide (microperoxidase-8; MP-8) formation studied by high-pressure liquid chromotography (HPLC) monitoring of the peptic and tryptic hydrolysis of horse heart cytochrome-c
Royer et al. [4] Complete hydrolysis of polypeptides with insolubilized enzymes
Grover et al. Affinity chromatography of β-hydroxybutyrate dehydrogenase on NAD and hydrophobic chain derivatives of sepharose
JPH0767692A (ja) 光学異性体用分離剤
Manjula et al. Bissulfosuccinimidyl Esters of Aliphatic Dicarboxylic Acids: A New Class of ‘Affinity Directed’ββ Crosslinkers of HbA
SU810815A1 (ru) Способ иммобилизации транскортина

Legal Events

Date Code Title Description
PBP Patent lapsed