NL1017258C2

NL1017258C2 - Werkwijze voor het maken van vernette enzymaggregaten.

Info

Publication number: NL1017258C2
Application number: NL1017258A
Authority: NL
Inventors: Paloma L Pez Serrano; Linqui Cao; Frederik Van Rantwijk; Roger Arthur Sheldon
Original assignee: Univ Delft Tech
Priority date: 2001-02-01
Filing date: 2001-02-01
Publication date: 2002-08-02
Also published as: CA2436087A1; WO2002061067A1; US20040235126A1; DE60231959D1; EP1360285B1; ATE428776T1; DK1360285T3; JP2004520050A; EP1360285A1; ES2323572T3; PT1360285E

Description

NL 44609-Al/ho

Werkwijze voor het maken van vernette enzymaggregaten

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bereiden van vernette enzymaggregaten welke de stappen omvat van a) het precipiteren van een opgelost enzym aanwezig in een 5 vloeibaar medium; b) het vernetten met een vernettingsmiddel, en c) optioneel, het wassen van het vernette enzymaggregaat.

Een dergelijke werkwijze is in het vak algemeen bekend. Deze wordt gebruikt om enzympreparaten te bereiden voor 10 het uitvoeren van verschillende enzym-gekatalyseerde reacties. Zo beschrijven bijvoorbeeld Cao, Cao L. et al. (Organic Letters vol. 2 (10) blz. 1361-1364, 2000) de bereiding van op penicillineacylase gebaseerde aggregaten. De beschreven vernette aggregaten zijn minder actief dan het natieve enzym.

15 Het doel van de onderhavige uitvinding is om een werkwijze te verschaffen die het mogelijk maakt aggregaten te verkrijgen met een verhoogde enzymactiviteit.

Hiertoe wordt de uitvinding gekenmerkt doordat ten minste één behandeling wordt uitgevoerd gekozen uit de groep 20 bestaande uit I) het uitvoeren van stap a) in aanwezigheid van een verbinding gekozen uit de groep bestaande uit i) een kroonether, en ii) een oppervlakte-actieve stof, en II) het uitvoeren van stap c) met een tweede vloeistof die voor wat betreft de organische samenstelling verschilt van de vloei-25 stof.

Aanvraagster heeft verrassenderwijs gevonden dat een dergelijke behandeling kan resulteren in een vernet enzymaggregaat (CLEA) met een verhoogde activiteit. Ofschoon de onderhavige uitvinding deze verhoogde activiteit voor een be-30 paald enzym dat wordt gebruikt om een bepaalde reactie te katalyseren noch garandeert, noch een voorspelling van een verbeterde activiteit mogelijk maakt, verschaft de uitvinding een extra parameter die kan worden gecontroleerd om een beter aggregaat te bereiken. Dat wil zeggen dat, voor een bepaald 35 enzym, met weinig moeite en onder gebruikmaking van eenvoudige en routinematige experimenten onderzocht kan worden of de 1017258 2 katalytische activiteit ervan onder gebruikmaking van de behandeling kan worden verbeterd. Uit een reeks van enzymen die in staat zijn de gewenste reactie te katalyseren, kan eenvoudig en met weinig moeite de beste CLEA worden geselecteerd.

5 Omdat de CLEA onoplosbaar is, kan deze met een tweede vloeistof die volledig waterig, organisch of een mengsel daarvan is, worden gewassen. Na de behandeling kan de CLEA worden gevriesdroogd of als een suspensie worden opgeslagen voor later gebruik.

10 Overbeeke P.L.A. et al. beschrijven in J. of Mol.

Cat. B: Enzymatic !£., blz. 385-393 (2000) een werkwijze waarin een lipase wordt gekristalliseerd onder invloed van PEG in aanwezigheid van 2-methyl-2,4-pentaandiol, en de gevormde kristallen worden vernet. Daarentegen maakt de onderhavige 15 uitvinding gebruik van een precipitatiemiddel om aggregaten te vormen, in plaats van kristallen.

Bij voorkeur worden stap a) en stap b) tegelijk uitgevoerd .

Dit maakt een vereenvoudigde werkwijze mogelijk, die 20 minder tijd en moeite vergt.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm wordt de verbinding na vernetten verwijderd.

Het is niet nodig dat de oppervlakte-actieve stof en/of de kroonether tijdens de katalytische reactie die door 25 de CLEA wordt uitgevoerd aanwezig is om de hoge activiteit te handhaven. Derhalve kan de verbinding worden verwijderd, in het geval deze de te katalyseren reactie stoort of om andere redenen. Verwijderen kan worden bewerkstelligd onder gebruikmaking van elke in het vak bekende werkwijze, in het bij zon-30 der door middel van dialyse of wassen onder gebruikmaking van cent rif uga t ie.

Volgens een belangrijke toepassing van de uitvinding is het enzym een lipase,

Bijgevolg heeft de uitvinding ook betrekking op een 35 werkwijze voor het uitvoeren van een lipase-gekatalyseerde reactie, waarbij de reactie is gekozen uit de groep bestaande uit i) transesterificatie; ii) interesterificatie; iii) hydrolyse; iv) esterificatie; v) ammoniolyse; vi) aminolyse; en 1017258 3 vii) perhydrolyse, welke werkwijze wordt gekenmerkt doordat een vernet lipase-aggregaat wordt bereid volgens de uitvinding, en het genoemde vernette lipase-aggregaat in contact wordt gebracht met een substraat.

5 De onderhavige uitvinding zal thans worden toege licht aan de hand van de volgende voorbeelden: VOORBEELD 1

Bereiding van vernette lipasen 10 - R. miehei lipase Lipozyme (Novo Nordisk)

Candida antarctica lipase B SP525 (Novo Nordisk) - P. alcaligenes lipase (Gist-brocades).

WERKWIJZE Ia) In aanwezigheid van (NH4) 2S04 (Water) 0,5 ml stockenzymoplossing (Lipozyme of SP525, Novo 15 Nordisk, Kopenhagen, Denemarken) of 50 mg PaL enzympoeder (PaL is P. alcaligenes lipase (Gist-Brocades, Delft, Nederland) ) , worden opgelost in 1 ml kaliumfosfaatbuffer, (100 itiM, pH 7) in een centrifugebuis van 10 ml. 550 g (NH4) 2S04 werd toegevoegd gevolgd door 1 ml van een precipiterende oplossing 20 A die bestaat uit 550 mg (NH4)2S04 (het precipitatiemiddel) in kaliumfosfaatbuffer (100 mM, pH 7), en 80 μΐ glutaardialdehy-de (25% oplossing in water). Het mengsel wordt gedurende 17 uur bij 4°C (kamertemperatuur voor SP525) geroerd. 3 ml H20 wordt aan het mengsel toegevoegd en vervolgens gecentrifu-25 geerd. De bovenvloeistof wordt gedecanteerd en het residu wordt gewassen, gecentrifugeerd en nog 3 keer gedecanteerd met H20 (5 ml per keer). Het uiteindelijke enzympreparaat wordt in 5 ml H20 bewaard. Indien nodig wordt de vaste stof door middel magneetroeren gedispergeerd.

30 WERKWIJZE Ib en Ic) In aanwezigheid van (NH4) 2S04 en oppervlakte-actieve stof

Werkwijze Ia) werd herhaald, met dit verschil dat de precipiterende oplossing A daarenboven 25 mg natriumdodecyl-sulfaat (SDS) (werkwijze Ib) of 25 mg Triton X-100 (TR) 35 (werkwijze Ic) bevatte.

’01 7258 4 WERKWIJZE ld) In aanwezigheid van dimethoxyethaan (DME) 0,5 ml stockenzymoplossing (Lipozyme of SP525) of 50 mg PaL enzympoeder wordt in een centrifugebuis van 10 ml ge-5 bracht, waarna 1 ml kaliumfosfaatbuffer (100 mM, pH 7), 3 ml DME en 80 μΐ glutaardialdehyde worden toegevoegd. Het mengsel wordt gedurende 17 uur bij 4°C geroerd (kamertemperatuur voor SP525).

Aan het mengsel wordt 1 ml DME toegevoegd en het 10 wordt vervolgens gecentrifugeerd. De bovenvloeistof wordt gedecanteerd en het residu wordt gewassen, gecentrifugeerd en nog 3 keer gedecanteerd met DME (elke keer 5 ml). Het uiteindelijke enzympreparaat wordt bewaard in 5 ml DME. Indien nodig wordt de vaste stof gedispergeerd door middel van mag-15 neetroeren.

WERKWIJZE Ie) In aanwezigheid van DME en een kroon- ether

Werkwijze ld) werd herhaald, met het verschil dat een hoeveelheid van 6,9 mg van de kroonether dibenzo-18-20 crown-6 werd toegevoegd te zamen met 3 ml DME.

Vernette lipase preparaten werden in suspensie bewaard, hetzij in water of DME, als preparaten Ia-e.

VOORBEELD 2 25 Activiteitsexperimenten

De activiteit van de met behulp van de bereidingen la-e) bereide CLEA's werden getest middels drie reacties. Deze reacties werden hetzij uitgevoerd in een waterige oplossing, of in een organische oplossing.

30 Voor de testen Ilb en IIc werd voorafgaande aan het uitvoeren van de assay de volgende algemene procedure gevolgd: - Van waterige suspensies werd 0,5 ml monster aan CLEA suspensie gevriesdroogd in een 2 ml Eppendorf cup elk.

35 - Van organische suspensies werd telkens 0,5 ml monster aan CLEA suspensie gecentrifugeerd in een 2 ml Eppendorf cupje, en de bovenvloeistof werd gedecanteerd.

- Natief enzym, gebruikt als controle, werd direct van de 1017258 5 stockoplossing (50 μΐ) genomen, of als een poeder (5 mg), zonder verdere behandeling.

Voor de experimenten Ilb en IIc werden de analyses uitgevoerd onder gebruikmaking van een GC Varian Star 3600 5 gaschromatograaf (Varian). Kolom: CP WAX 52 CB 50 m x 0,53 mm. Dragergas: stikstof.

Test Ha) Hydrolyse van p-nitrofenylpropionaat (uitgevoerd in water)

Het enzympreparaat (50 μΐ) werd gesuspendeerd in 0,5 10 ml water (1,5 ml in het geval van SP525) en 200 μΐ (50 μΐ in geval van SP525) van de suspensie werd toegevoegd aan 2,5 ml esteroplossing (0,4 mM p-nitrofenylpropionaat in water bij 25°C). Meting van de absorptietoename bij 348 nm (verschijnen van p-nitrofenol) bij de hydrolyse van p-nitrofenylpropionaat 15 werd gevolgd ondér gebruikmaking van een Cary 3-Bio UV spec-trofotometer van Varian. De waarden zijn gegeven als percentage van de activiteit van het natieve enzym.

Het resultaat is samengevat in Tabel 1.

20 Tabel 1

Hydrolyse van p-nitrofenylpropionaat in water

Enz__Ia__Ib__Ic__ld__Ie Natief

Lipozyme 152__218__44__0__0__100 SP525__93__40__129 151 177 100 25 % activiteit van actief enzym

Test Ilh) Transes terifi ca tie van ethyloctanoaat met octanol (uitgevoerd in di isopropyl ether) 0,5 ml diisopropylether wordt toegevoegd aan het Ep-30 pendorf cupje dat het enzym bevat. 50 mg geactiveerde zeoliet NaA (Aldrich) wordt toegevoegd. 0,5 ml van een oplossing van 86 mM ethyloctanoaat, 400 mM octanol, en 50 mM decaan in diisopropylether wordt toegevoegd en bij kamertemperatuur geroerd. Op het aangegeven tijdstip wordt het reactiemengsel 35 gecentrifugeerd, en een monster (100 μΐ) , opgelost in 0,5 ml DME, genomen en met behulp van GC geanalyseerd.

101 7258 6

Het resultaat is samengevat in Tabel 2.

Table 2

Transesterificatie van ethyloctanoaat met octanol in i-Pr20 5 _______

Enz__Ia__Ib__Ic__ld__Ie__Natief

Lipozyme 0,16 3,48 0,33 23,79 18,89__0,16

Pal__0,15 7,11 24.18 0,11 0,27 17,55

Activiteit uitgedrukt als μιηοΐ octyloctanoaat geproduceerd in 24 u.

10 Test lie) Hydrolyse van ethyloctanoaat (uitgevoerd in DME/wa ter.mengsel) 50 μΐ HjO en 0,95 ml oplossing van 43 mM ethyloctanoaat, en 25 mM decaan worden toegevoegd aan een Eppendorf cup die het enzym bevat en bij kamertemperatuur geroerd. Op 15 het opgegeven tijdstip wordt watervrij Na2S04 aan het reactie-mengsel toegevoegd, geschud en gecentrifugeerd. Vervolgens wordt een monster (100 μΐ) genomen, opgelost in 0,5 ml DME, met behulp van GC geanalyseerd.

Het resultaat is samengevat in tabel 3 20

Tabel 3

Hydrolyse van ethyloctanoaat in DME/water

Enz__Ia__Ib__Ic__ld__Ie__Natief

Lipozym 24,34 40.48 25,37 22,85 22,73 16,34 24u_______

Pal. 35,82 32,02 40.26 0,49 0,37 3,34 3u_______ 25

Activiteit uitgedrukt als μτηοΐ octaanzuur geproduceerd in 24 of 3 u.

Zoals blijkt uit de bovenstaande resultaten kan het toevoegen van een oppervlakte-actieve stof of een kroonether 30 volgens de onderhavige uitvinding een gunstig effect hebben lol 8 7 op de enzymactiviteit.

VOORBEELD 3 Wastest 5 Werkwijze Ia werd herhaald onder gebruikmaking van SP525. De bovenvloeistof werd gedecanteerd en de pellet gere-suspendeerd in 5 ml water, gecentrifugeerd en de bovenvloeistof wordt gedecanteerd.

De verkregen pellet wordt onderworpen aan dezelfde 10 wasprocedure met 3 x 5 ml water of DME. Na de laatste wasstap wordt de CLEA IN 5 ml van hetzelfde oplosmiddel bewaard.

De twee CLEA's werden getest onder gebruikmaking van de transesterificatie van ethyloctanoaat met octanol (zoals beschreven in test IIc).

15 0,5 ml DME werd toegevoegd aan 50 μΐ enzympreparaat in een 2 ml Eppendorf. Het met alleen water gewassen enzym was eerder gevriesdroogd in de Eppendorf cup. 50 mg geactiveerd zeoliet NaA wordt toegevoegd. 0.5 ml oplossing van 86 mM ethyloctanoaat, 400 mM octanol, en 50 mM decaan in DME 20 wordt toegevoegd en bij kamertemperatuur geroerd. Na 1 uur wordt het reactiemengsel gecentrifugeerd, een monster (100 μΐ) wordt genomen, opgelost in 0,5 ml DME, en met behulp van GC geanalyseerd.

Tabel 4 25

Transesterificatie van ethyloctanoaat met octanol (in DME)

Bewerkingsoplosmiddel__Activiteit _Water__5,41_ _DME_ 14,03

Activiteit uitgedrukt als /zmol octyloctanoaat geproduceerd in 30 1 u.

1017258

Claims

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, 15 dat stap a) en stap b) tegelijk worden uitgevoerd.
3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de verbinding na vernetting wordt verwijderd.
4. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het enzym een lipase is.
5. Werkwijze voor het uitvoeren van een lipase- gekatalyseerde reactie, waarbij de reactie is gekozen uit de groep bestaande uit i) transesterificatie; ii) hydrolyse; en iii) ammoniolyse, met het kenmerk, dat een vernet lipase-aggregaat wordt bereid volgens conclusie 4, en het genoemde 25 vernette lipase-aggregaat in contact wordt gebracht met een substraat. 'i. ei "y ·· : /- !·-, • r. > \ ....... ’<-»·