JPS621719B2

JPS621719B2 -

Info

Publication number: JPS621719B2
Application number: JP13247084A
Authority: JP
Inventors: Tadashi Kamikubo; Ryuichi Matsuno; Kazuhiro Nakanishi; Masahide Kondo
Original assignee: Daiwa Kasei KK
Current assignee: Daiwa Kasei KK
Priority date: 1984-06-26
Filing date: 1984-06-26
Publication date: 1987-01-14
Also published as: JPS6112298A

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明はＮ―置換フエニルアラニン又はＮ―置
換アスパラギン酸とフエニルアラニン低級アルキ
ルエステルとを反応させてジペプチド類を連続的
に収得する改良された方法に関する。

背景技術近年蛋白分解酵素の逆反応を利用して有用ペプ
チドを合成しようとする試みが活発になつてきて
いる。かかる蛋白分解酵素を利用する反応は、合
成反応と分解反応とが平衡する平衡反応であり、
平衡に関与している化合物を系外に除くことによ
り平衡を移動させることが可能である。都合のよ
いとにペプチドの合成反応系（平衡系）において
は、多くの場合合成される縮合物のほうが原料と
する基質よりも疎水的なので、水に対する溶解度
が低く、多くの酵素法ペプチド合成はこの事実を
利用して行なわれている。また最近水と２相をな
す有機溶媒を加えて生成物を抽出により系外に除
き、平衡を生成側に移動させて反応を行なう方法
が種々提案されている。

ところで酵素法ペプチド合成において、酵素は
くり返して再使用しなければコスト上問題があ
り、また安定性の面からも酵素を固定化し工業化
を可能にしようとする研究がなされて来た。しか
しながら生成物が沈澱として析出することを利用
した上記方法では、沈澱生成物と固定化酵素との
分離が困難なため実用上大きな障害となる。これ
に対し、系に有機溶媒を加えて生成物を溶解した
り、抽出したりすると固定化酵素の使用が可能に
なると考えられ、この着想からたとえばクール等
は固定化α―キモトリプシンを用いて、水とジク
ロロメタンとの２相系においてジペプチドの合成
を行なつている〔P.Kuhl，A.Konnecke，G.
Doring，H.Daumer，H.−D.Jakubke，
Tetrahedron Letters，Vol.21，pp893〜896
（1980）〕。

更に、Ｎ―置換アスパラギン酸とフエニルアラ
ニン低級アルキルエステルとからジペプチド類を
製造する方法において、両者を水と混和しない有
機溶媒中、水分を含有する固定化金属プロテアー
ゼ（サーモライシン等）の存在下で反応させる方
法も提案されている（特開昭55−135595）。この
方法は、酵素が有機溶媒中で活性が極めて低く、
かつ不安定であるため、固定化酵素の細孔内に水
を含ませ、そこで酵素反応を行なわせるものであ
る。これは見かけ上有機溶媒の単一相系反応であ
るが固定化酵素内部を水相と考えると、水の容量
が有機溶媒容量よりかなり少ない水―有機溶媒２
相系での反応とも考えられる。

本発明者らも上記水―有機溶媒２相系でのペプ
チド合成につき鋭意検討を重ねてきたが、かかる
合成反応では一般に酵素の種類は勿論のこと、原
料とする基質相互の関連、之等基質の保護基の種
類、用いる有機溶媒の種類とその濃度乃至使用量
（対水比）等の変化により、合成されるペプチド
の収率、反応速度等は大きく左右され、また上記
各因子の組み合せに依存して使用酵素の失活乃至
活性低下が甚しく、未だに各因子の最適な組み合
せは解明されておらず、従来提案された方法とい
えども、たまたは好結果が得られる場合はあつて
も、再現性に乏しく、また連続化反応を行なう時
には酵素の失活が著しく工業的実施のための連続
化は実際上不適当であることを確認した。本発明
者らは引き続く研究の結果、特に有機相に対する
水相の容積比を1/1前後とし、Ｎ―置換フエニル
アラニンを有機相に、Ｎ―置換アスパラギン酸を
水相に添加溶解させることにより、酵素の失活が
抑制（エマルジヨン調製時及び反応の進行を通じ
て基質の分配による系内PHの変動が好ましい範囲
に保持される）され、反応系内基質濃度の向上、
これによる反応速度、反応収率の向上を計り得、
しかも固定化酵素を繰返し使用して、非常に効率
よく目的とする所望のジペプチドを収得できると
いう新しい事実を発見し、この知見を基礎として
先に特願昭58−153425号（特公昭60−33840号）
に係る発明を完成した。

発明の目的本発明は上記発明に引き続く研究の結果完成さ
れたものであり、特に連続的実施に適した新しい
改良方法を提供するものである。

発明の構成即ち本発明はＮ―フエニルアラニン又はＮ―置
換アスパラギン酸とフエニルアラニン低級アルキ
ルエステルとを反応させてジペプチド類を製造す
るに当り、上記両基質を水と混和しない有機溶媒
に溶解した原料液中に、固定化金属プロテアーゼ
を懸濁させ、攪拌下に上記原料液を反応系内に供
給しつつ反応を行なわせ、反応液を連続的に回収
することを特徴とするジペプチド類の連続製造法
に係る。

本発明方法において一方の基質とするＮ―置換
フエニルアラニン又はＮ―置換アスパラギン酸に
おけるＮ―置換基は、ペプチド合成反応に慣用さ
れるアミノ基保護基であり、その例としては代表
的にはベンジルオキシカルボニル基を例示でき
る。他の代表的保護基としては例えばｐ―メトキ
シベンジルオキシカルボニル基、ｔ―ブトキシカ
ルボニル基等を例示できる。他方の基質とするフ
エニルアラニン低級アルキルエステルの低級アル
キル基も亦慣用されるアミノ酸のカルボキシル保
護基であり、その具体例としては炭素数１〜４の
アルキル基、特にメチル基を好ましく例示でき
る。之等原料基質は通常Ｌ体であるが、DL体で
あつてもよく、この場合Ｌ体のみが反応に関与す
る。また本発明に利用する水と混和しない有機溶
媒としては、具体的には酢酸エチルを挙げること
ができる。

本発明方法においては、まず上記両原料基質を
水と混合しない有機溶媒に溶解して原料液を調製
する。ここで両原料基質の使用量即ち原料液中の
濃度は適宜に決定され、反応速度の面からはでき
るだけ高濃度とするのが好ましいが、通常例えば
フエニルアラニン低級アルキルエステルでは約40
〜400mM濃度となる範囲とするのが好ままし
く、これと反応させるべき例えばＮ―置換アスパ
ラギン酸では上記フエニルアラニン低級アルキル
エステル濃度の約1/3〜2/3倍濃度となる範囲とす
るのが適当である。

本発明方法では、次いで上記の如くして調製さ
れる原料液中に固定化金属プロテアーゼを懸濁さ
せ、この懸濁液形態で原料液中の両基質と固定化
酵素とを接触反応させる。ここで用いられる固定
化酵素としては、例えば代表的にはサーモライシ
ン等の金属プロテアーゼを常法に従い適当な支持
体に固定した各種のものをいずれも使用できる。
上記適当な支持体としては例えばメルコーゲン
（Merckogel SI 1000Å、メルク（EMerck）社
製）、アンバーライト IRC 50（ロームアンド
ハース（Rohm and Haas Co.）社製）、ダウ
エツクス MWA（ダウケミカル（Dow
Chemical Co.）社製）、ダウエツクス MSC（同
上社製）、アンバーライトXAD2（ロームアン
ドハース社製）、アンバーライトXAD7（同上
社製）、アンバーライトXAD8（同上社製）等の
多孔性イオン交換樹脂担体を例示できる。これら
のうちではアンバーライトXAD7が最も好まし
い。上記支持体へのサーモライシン等の金属プロ
テアーゼの固定は、通常当分野でよく知られてい
る各種方法に従い行なうことができるが、特にグ
ルタルアルデヒド架橋法によるのが好ましい。該
グルタルアルデヒド架橋法におけるグルタルアル
デヒド濃度は、従来一般に採用されている２〜３
％に比して約４〜６倍の高濃度、特に約12.5％前
後とするのがよく、またサーモライシン等は例え
ばNaBr等の適当な溶液に溶解して支持体に吸着
後固定させるのが好ましい。この方法によれば同
酵素を水溶液として支持体に吸着させる場合に比
し溶液濃度を約50倍高くでき、支持体単位当りの
酵素吸着量を増加でき、通常の方法にくらべ活
性、安定性の高い固定化サーモライシンを得るこ
とができる。

かくして調製される固定化サーモライシンは、
通常支持体１ｇ（湿潤重量）当り、サーモライシ
ン0.02〜0.5ｇを固定されており、そのｇ当りの
力価（合成活性）は約0.15〜3.0単位／湿潤ｇで
ある。尚この合成活性は、後記実施例１と同一操
作により酵素反応させて生成するジペプチド量を
高速液体クロマトグラフイーにより測定すること
により求められるものであり、その１単位とは40
℃下に１分間に１μモルのジペプチドを生成する
固定化酵素量（湿潤重量）を言う。

本発明では特に上記固定化サーモライシン等の
固定化酵素を用いた両基質の反応を、反応容器中
の両基質濃度、固定化酵素内のPH、反応生成物濃
度及び固定化酵素が夫々、反応系内で実質的に均
一乃至一定となる条件下に実施することが重要で
ある。これは反応系を攪拌しつつ原料液を連続的
（又は間歇的）に供給し、反応液を連続的に回収
することにより行われ、これによりはじめて酵素
の失活を確実に防止して、迅速に且つ高収率で目
的とするペプチドを連続的に合成、収得できる。
しかるに上記固定化酵素を用いるといえども、こ
れを通常のカラムに充填し、これに原料液を流す
時には、比較的速やかに酵素が失活し、経時的に
目的ペプチドの収量が低下し、工業的実施が不適
となる。即ち上記カラム反応器を利用する場合、
本発明者の研究によれば、カラム入口と出口とで
反応系内液の濃度および固定化酵素内部のPHが異
なり不均一であり、更にＮ―置換アスパラギン酸
の濃度は入口付近で高く出口付近では低く、また
生成物と固定化酵素内部のPHは逆に出口付近で高
くなつている。このためカラム入口近傍では固定
化酵素に対する液中基質量が多く、酵素内PHが低
く、これにより該酵素の安定化因子であるCa²⁺
が上記基質により容易に取り去られ、かくして酵
素の失活が比較的速やかに惹起されるものと考え
られる。

上記反応時の温度は通常20〜40℃とされるのが
よい。攪拌は固定化酵素が系内に均一に分散さ
れ、沈澱せずしかも崩壊等を生じないことを前提
として、通常比較的ゆるやかな条件で行なうか又
は振盪しながら行なうことができ、反応時間中常
に連続する必要はなく、断続的に行なうこともで
きる。また固定化金属プロテアーゼの使用量は特
に制限されず、支持体に固定化された酵素の量、
その活性等に応じて適宜決定され、これが多いと
反応時間が短縮され、また少ないとそれだけ反応
時間が長くなる。

本発明の好ましい一実施態様によれば、例えば
フエニルアラニン低級アルキルエステルと、Ｎ―
置換アスパラギン酸とを反応させる場合、後者に
対し前者を約1.5〜３倍モル量含有する原料液を
調整し、その１に対して固定化サーモライシン
約100〜500ｇを用い、約100〜300rpmの攪拌下
に、20〜40℃の温度で、固定化酵素容積基準の
SVが約0.3〜2.0／時間となる条件下に連続反応を
行なう。

また他の好ましい実施態様では、上記と同様の
の原料液を単位時間当り１容積宛供給しつつ、生
成物１容積宛回収しつつ、反応系内液を約10容積
宛系内に循環させ、この循環によつて系内を強制
攪拌し、SV約0.6〜4.0／時間で反応させる。

上記各反応により得られるジペプチドは、有機
溶媒溶液として得られ、これを分取し、濃縮晶析
させるか又は抽出等の操作を行なうことにより容
易に分離することができ、これは更に通常の単離
精製手段により精製することもできる。

かくして本発明方法によれば、Ｎ―置換フエニ
ルアラニンとフエニルアラニン低級アルキルエス
テルとの反応によりＮ―置換フエニルアラニン―
フエニルアラニン低級アルキルエステルを、また
Ｎ―置換アスパラギン酸とフエニルアラニン低級
アルキルエステルとの反応によりＮ―置換アスパ
ラギン酸―フエニルアラニン低級アルキルエステ
ルを夫々効率よく収得でき、之等は生理活性を有
する種々のペプチドの合成反応試薬として、また
特に後者は砂糖の約200倍の甘さを持つ合成甘味
剤であるＬ―アスパルチル―Ｌ―フエニルアラニ
ンメチルエステル（アスパルテーム）の前駆体と
して有用なものである。

実施例以下本発明を更に詳しく説明するため実施例を
挙げる。尚実施例においては、以下の方法により
調製した固定化サーモライシンを用いた。

＜固定化サーモライシンの調製＞ 7.5ｇのサーモライシン（大和化成株式会社
製、力価9470PU／mg）を、5M―NaBr及び
16.6mM―CaCl₂を含む1/40Ｍトリス塩酸塩緩衝
液（PH7.5）120mlに氷冷下に溶解し、この液に固
定化担体であるアンバーライトXAD―７（ロー
ム・アンド・ハース社製）30ｇ（湿潤重量）を加
え、４℃で17時間静かに振盪を行ないながら酵素
を担体に吸着させた。上澄液の残存酵素蛋白量を
ビユーレツト法で定量した所、初発酵素量の約70
％の酵素が担体に吸着されていた。

上記上澄液75mlを除去した残りの固定酵素懸濁
液に25％グルタールアルデヒド溶液75mlを加え、
４℃で約３時間振盪して架橋反応を行ない、その
後冷却した0.1Mトリス塩酸塩緩衝液（PH7.5、
5mM―CaCl₂を含む）約１及び1M―NaClを含
む同緩衝液約１で交互に２回洗浄して、固定化
サーモライシンを得た。得られた固定化酵素は４
℃で保存した。

実施例１ 5mM―CaCl₂を含む0.05M―MES（２―シアノ
モルホリノ）エタンスルホン酸・モノ水和物、同
仁化学研究所製）溶液と、等容積の酢酸エチルと
を分液漏斗を用いて平衡化（40℃）させ、酢酸エ
チルで飽和されたMES溶液と、同MES溶液で飽
和された酢酸エチル溶液とを調製した。

上記で得たMES溶液飽和の酢酸エチル溶液50
mlに、Ｌ―フエニルアラニンメチルエステル（Ｌ
―PheOMe）1.432ｇ（160mM）又は2.148ｇ
（240mM）と、Ｎ―ベンジルオキシカルボニル―
Ｌ―アスパラギン酸（Ｚ―Ｌ―Asp）1.069ｇ
（80mM）とを溶解して基質溶液を調製した。

一方、上記で得た酢酸エチル飽和のMES溶液
のPHを4N―NaOHで6.0に調整し、この液100mlに
固定化酵素３ｇ（湿潤重量）を約１時間浸漬し、
固定化酵素担体内部の水相を同液で平衡化させ、
ガラスフイルターで付着水を充分除去した。

この固定化酵素全量を、上記で調製した基質溶
液（Ｌ―PheOMe240mM＋Ｚ―Ｌ―Asp80mM）
が満されている供給口と取出口のついた円筒フラ
スコ状反応器（容量25ml、ウイートン社製、ダブ
ルアーム付セルスター）に懸濁させる。反応器を
40℃に保持した恒温槽内に固定し、回転子を回し
て反応器内液を攪拌しながら反応を開始させた。
反応開始４時間後、基質の一方を供給口より以下
のように供給しつつ、取出口より供給量と等量の
反応液を扱き出した。即ち、ポンプにより30秒間
0.4ml／分の流量で基質を供給し、その後３分間
回転子で攪拌を行ない、更に次の３分間別のポン
プで反応液を所定容量（８ml）に減るまで吸出す
操作を繰返した。上記各操作の切換えはタイマー
により自動的に行なつた。この方法における平均
流量は２ml／時間、固定化酵素容積基準のSVは
約0.7hr^-1であつた。

反応器出口の反応液を経時的にサンプリング
し、下記に示す条件で高速液体クロマトグラフイ
ーを行ない、生成物量を定量した。

＜高速液体クロマトグラフイー＞装置：高速流体クロマトグラフ（島津製作所
製 LC―3A型）カラム：内径10mm×長さ300mm 充填剤：TSK―GEL LS―410K（ODS―シリ
カ東洋曹達社製）溶媒：アセトニトリル―水（55：45、リン酸
でPHを2.5に調整）検出：紫外吸収（254nm）結果を第１図に示す。第１図において横軸は連
続反応時間（時間）を、縦軸は生成物収率（％）
を示す。

上記第１図より明らかな通り、上記本発明方法
によれば約７日間の連続反応期間中、Ｚ―Ｌ―
Asp基準で約95％の収率が常に安定して維持され
た（図中○―○で示す）。

また８日目に基質溶液のＬ―PheOMeとＺ―Ｌ
―Aspの比を２：１（160mM：80mM）に減ら
し、SVを0.5hr^-1として反応を継続したところ、
前記と同様に10日目まで95％の収率が安定して維
持された（図中□―□で示す）。

比較例１実施例１と同様にして酢酸エチル飽和のMES
―NaOH溶液（PH6.0）で平衡化した固定化酵素
３ｇ（湿潤重量）を、40℃に調節された恒温槽に
浸漬された有機溶媒用カラム（内径1.1cm、山善
株式会社製）に充填し、これに実施例１と同様に
して調製した基質溶液Ｌ―PheOMe240mM＋Ｚ
―Ｌ―Asp80mM）を、カラム出口から有機溶媒
用ポンプ（協和精密社製）で吸引することによ
り、以下のように送入して反応を行なわせた。即
ち基質溶液を先づ30秒間0.4ml／分の速度で流
し、その後６分間停止という操作を交互に繰返し
た。この方法における平均流量は４ml／時間であ
り、固定化酵素容積基準のSVは約1.4h^-1であつ
た。

カラム出口で反応液を経時的にサンプリング
し、実施例１と同一条件で高速液体クロマトグラ
フイーを行ない、生成物量を定量した。

結果を第２図に示す。該第２図より、反応初期
ではＺ―Ｌ―Asp基準による生成物（Ｎ―ベンゼ
ンオキシカルボニル―Ｌ―アスパラチル―Ｌ―フ
エニルアラニン（Ｚ―Ｌ―Asp―Ｌ―
PheOMe）、アスパルテームの前駆体）の収率
は、約98％であつたが、反応時間の経過と共に収
率は低下し、48時間後には22％に低下した。この
時点で基質の供給を停止し、室温で0.1M―トリ
ス塩酸塩緩衝液（PH7.5、5mM―CaCl₂を含む）
で洗浄し、カラム入口と出口での固定化酵素の残
存活性を測定した所、それぞれ0.5％及び47.3％
であり、失活の著しいものであつた。

実施例２実施例１において、Ｌ―PheOMe200mM及び
Ｚ―Ｌ―Asp80mMの基質溶液を用い、その10ml
当り固定化酵素３ｇを利用し、40℃下、SV約
1hr^-1（2.8ml／hr）の条件下に反応を行なつた。

その結果反応開始280時間後も、90％以上の高
収率が維持された。

これに対し、上記と同条件下に、比較例１のカ
ラムを用いる方法を実施した場合、反応開始80時
間での目的物収率は約30％に低下した。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１示す方法における反応時間と
収率の関係を示すグラフであり、第２図は比較例
１に示す方法における同グラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

１Ｎ―置換フエニルアラニン又はＮ―置換アス
パラギン酸とフエニルアラニン低級アルキルエス
テルとを反応させてジペプチド類を製造するに当
り、上記両基質を水と混和しない有機溶媒に溶解
した原料液中に、固定化金属プロテアーゼを懸濁
させ、攪拌下に上記原料液を反応系内に供給しつ
つ反応を行なわせ、反応液を連続的に回収するこ
とを特徴とするジペプチド類の連続製造法。