JPH06237784A - オリゴペプチドの合成法 - Google Patents
オリゴペプチドの合成法Info
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- JPH06237784A JPH06237784A JP5028769A JP2876993A JPH06237784A JP H06237784 A JPH06237784 A JP H06237784A JP 5028769 A JP5028769 A JP 5028769A JP 2876993 A JP2876993 A JP 2876993A JP H06237784 A JPH06237784 A JP H06237784A
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- tert
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- amyl alcohol
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】本発明は、Ｎ−置換アスパラギン酸とフェニル
アラニンの低級アルキルエステルもしくはアミドとの脱
水縮合反応を、tert−アミルアルコール中、固定化金属
プロテアーゼを用いて行なうオリゴペプチドの合成法を
提供する。 【効果】本発明によれば、使用酵素の失活を抑制して、
安定して高活性を保持し、もって目的オリゴペプチド
を、高反応速度で収率よく製造できる。
アラニンの低級アルキルエステルもしくはアミドとの脱
水縮合反応を、tert−アミルアルコール中、固定化金属
プロテアーゼを用いて行なうオリゴペプチドの合成法を
提供する。 【効果】本発明によれば、使用酵素の失活を抑制して、
安定して高活性を保持し、もって目的オリゴペプチド
を、高反応速度で収率よく製造できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はオリゴペプチドの合成
法、より詳しくはアスパルテーム前駆体であるオリゴペ
プチドを固定化金属プロテアーゼを用いて合成する改良
された方法に関する。
法、より詳しくはアスパルテーム前駆体であるオリゴペ
プチドを固定化金属プロテアーゼを用いて合成する改良
された方法に関する。
【０００２】
【従来技術とその課題】従来より、有用ペプチド類の合
成法としては、プロテアーゼによる加水分解反応の逆反
応を利用する方法（酵素法）が提案されている［J.S.Fr
uton, Adv.Enzymol., 53, 239 (1982)］。この酵素法は
化学合成法に比べて、常温常圧で反応が進行すること、
アミノ酸の側鎖官能基を必ずしも保護する必要がないこ
と、反応が立体選択的に進行し安価なラセミ体原料を使
用できること、反応中ラセミ化が起こらないこと等の幾
つかの長所を有するが、反面、酵素の基質特異性より目
的とするペプチド合成に使用できる酵素の選択が容易で
ないこと、一般に反応の平衡は基質側（分解反応）に片
寄っており、収率、反応速度等が低いこと等の不利があ
り、工業的実施は尚殆どなされておらず、化学合成法が
汎用されている現状にある。
成法としては、プロテアーゼによる加水分解反応の逆反
応を利用する方法（酵素法）が提案されている［J.S.Fr
uton, Adv.Enzymol., 53, 239 (1982)］。この酵素法は
化学合成法に比べて、常温常圧で反応が進行すること、
アミノ酸の側鎖官能基を必ずしも保護する必要がないこ
と、反応が立体選択的に進行し安価なラセミ体原料を使
用できること、反応中ラセミ化が起こらないこと等の幾
つかの長所を有するが、反面、酵素の基質特異性より目
的とするペプチド合成に使用できる酵素の選択が容易で
ないこと、一般に反応の平衡は基質側（分解反応）に片
寄っており、収率、反応速度等が低いこと等の不利があ
り、工業的実施は尚殆どなされておらず、化学合成法が
汎用されている現状にある。
【０００３】本発明者らは、以前より酵素法による有用
ペプチド類の製造につき鋭意研究を重ねてきたがその過
程で、Ｎ−置換アスパラギン酸とフェニルアラニン低級
アルキルエステルとの脱水縮合反応を、水と混和しない
有機溶媒、即ち酢酸エチル中、水分を含有する固定化金
属プロテアーゼの存在下で行なう方法（特開昭５５−１
３５５９５号公報）や上記方法の連続法（特開平２−３
９８９５号公報）等を開発した。
ペプチド類の製造につき鋭意研究を重ねてきたがその過
程で、Ｎ−置換アスパラギン酸とフェニルアラニン低級
アルキルエステルとの脱水縮合反応を、水と混和しない
有機溶媒、即ち酢酸エチル中、水分を含有する固定化金
属プロテアーゼの存在下で行なう方法（特開昭５５−１
３５５９５号公報）や上記方法の連続法（特開平２−３
９８９５号公報）等を開発した。
【０００４】しかるに、本発明者らは引続く研究の結
果、上記各方法において用いた水と混和しない有機溶媒
が反応速度、平衡収率、利用酵素の活性や安定性等に非
常に重要な役割を果すことを認めると共に、該酢酸エチ
ルに代わって、より酵素の活性及び安定性に優れ、しか
も反応速度、平衡収率等の点でも満足のいく新しい有機
溶媒としてtert−アミルアルコールが有効であるとの知
見を得た。即ち、上記tert−アミルアルコールの利用に
よれば、利用酵素の安定性が非常に優れ、活性低下も実
質的に起こらないことに基づいて、目的とするオリゴペ
プチドを高純度、高収率で容易にしかも効率よく製造で
きることを見出した。本発明はこの新しい知見により完
成されたものである。
果、上記各方法において用いた水と混和しない有機溶媒
が反応速度、平衡収率、利用酵素の活性や安定性等に非
常に重要な役割を果すことを認めると共に、該酢酸エチ
ルに代わって、より酵素の活性及び安定性に優れ、しか
も反応速度、平衡収率等の点でも満足のいく新しい有機
溶媒としてtert−アミルアルコールが有効であるとの知
見を得た。即ち、上記tert−アミルアルコールの利用に
よれば、利用酵素の安定性が非常に優れ、活性低下も実
質的に起こらないことに基づいて、目的とするオリゴペ
プチドを高純度、高収率で容易にしかも効率よく製造で
きることを見出した。本発明はこの新しい知見により完
成されたものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】即ち、本発明はＮ−置換
アスパラギン酸とフェニルアラニンの低級アルキルエス
テルもしくはアミドとの脱水縮合反応を、tert−アミル
アルコール中、固定化金属プロテアーゼを用いて行なう
ことを特徴とするオリゴペプチドの合成法に係わる。
アスパラギン酸とフェニルアラニンの低級アルキルエス
テルもしくはアミドとの脱水縮合反応を、tert−アミル
アルコール中、固定化金属プロテアーゼを用いて行なう
ことを特徴とするオリゴペプチドの合成法に係わる。
【０００６】本明細書においてアミノ酸、ペプチド、保
護基等の略号による表示は当該分野における慣用記号に
従うものとする。
護基等の略号による表示は当該分野における慣用記号に
従うものとする。
【０００７】本発明方法は、上記の通りＮ−置換アスパ
ラギン酸とフェニルアラニンの低級アルキルエステルも
しくはアミドとの固定化金属プロテアーゼによる脱水縮
合反応を、tert−アミルアルコール中で行なう点を特徴
とし、これにより、本発明所期の優れた効果を奏し得
る。即ち、上記tert−アミルアルコールの利用によれ
ば、酢酸エチルの利用に比して、所望の優れた酵素活性
を、広いｐＨ条件及び温度条件下に、長期に亘って安定
に保持でき、これによって反応速度、反応収率等を顕著
に向上させ得、かくして目的オリゴペプチドを効率よく
高純度、高収率で製造することができる。
ラギン酸とフェニルアラニンの低級アルキルエステルも
しくはアミドとの固定化金属プロテアーゼによる脱水縮
合反応を、tert−アミルアルコール中で行なう点を特徴
とし、これにより、本発明所期の優れた効果を奏し得
る。即ち、上記tert−アミルアルコールの利用によれ
ば、酢酸エチルの利用に比して、所望の優れた酵素活性
を、広いｐＨ条件及び温度条件下に、長期に亘って安定
に保持でき、これによって反応速度、反応収率等を顕著
に向上させ得、かくして目的オリゴペプチドを効率よく
高純度、高収率で製造することができる。
【０００８】本発明方法においては、tert−アミルアル
コールを用いることを必須として、その他は、前述した
本発明者らの先の出願に係わる方法と略々同様にして実
施することができ、利用する基質、酵素、脱水縮合反応
条件等も基本的には同様のものとすることができる。
コールを用いることを必須として、その他は、前述した
本発明者らの先の出願に係わる方法と略々同様にして実
施することができ、利用する基質、酵素、脱水縮合反応
条件等も基本的には同様のものとすることができる。
【０００９】例えば本発明方法において一方の基質とし
て利用するＮ−置換アスパラギン酸のＮ−置換基は、慣
用されるアミノ基保護基のいずれでもよく、代表的には
ベンジルオキシカルボニル基（通常Ｚと略記される）、
ｐ−メトキシベンジルベンジルオキシカルボニル基、ｔ
−ブトキシカルボニル基等を例示できる。また他方の基
質であるフェニルアラニンの低級アルキルエステルもし
くはアミドも慣用のカルボキシル保護基、例えばメチ
ル、エチル、プロピル、tert−ブチル基等の炭素数１〜
４のアルキル基又はアミノ基を有するもののいずれでも
よい。之等原料基質はまた通常Ｌ−体であるのが好まし
いが、特にこれに限定されずＤＬ−体をも使用できる。
て利用するＮ−置換アスパラギン酸のＮ−置換基は、慣
用されるアミノ基保護基のいずれでもよく、代表的には
ベンジルオキシカルボニル基（通常Ｚと略記される）、
ｐ−メトキシベンジルベンジルオキシカルボニル基、ｔ
−ブトキシカルボニル基等を例示できる。また他方の基
質であるフェニルアラニンの低級アルキルエステルもし
くはアミドも慣用のカルボキシル保護基、例えばメチ
ル、エチル、プロピル、tert−ブチル基等の炭素数１〜
４のアルキル基又はアミノ基を有するもののいずれでも
よい。之等原料基質はまた通常Ｌ−体であるのが好まし
いが、特にこれに限定されずＤＬ−体をも使用できる。
【００１０】また、本発明方法において用いられる固定
化金属プロテアーゼとしては、代表的にはサーモライシ
ン等の金属プロテアーゼを、常法に従い適当な支持体
（樹脂担体）に固定した各種のものをいずれも使用でき
る。上記適当な支持体としては市販の各種のもの、例え
ばアンバーライトＸＡＤ−２、アンバーライトＸＡＤ−
７、アンバーライトＸＡＤ−８、アンバーライトＩＲＣ
−５０、アンバーライト２００Ｃ［以上ローム アンド
ハース(Rohm and Haas Co.)社製］、ダウエックスＭ
ＳＣ−１［ダウケミカル(Dow Chemical Co.)社製］、メ
ルコゲル［Merckogel SI 1000 Ａ、メルク（Merck)社
製］等の多孔性樹脂担体を使用できる。之等の内ではア
ンバーライトＸＡＤ−７が高収率を奏し得るため好まし
い。上記支持体への酵素の固定は、当分野でよく知られ
ている各種方法に従い得、例えばグルタールアルデヒド
架橋法によるのがよい。該方法におけるグルタールアル
デヒド濃度は一般に採用されているそれより高濃度、通
常８〜２０％程度、好ましくは１２．５％前後とするの
がよく、酵素はＮａＢｒ等の適当な溶液に溶解後支持体
に吸着固定させるのがよく、かくして、通常支持体１ｇ
（湿潤重量）当り約２〜５０重量％の酵素が固定され、
活性及び安定性の高い所望の固定化酵素を収得できる。
化金属プロテアーゼとしては、代表的にはサーモライシ
ン等の金属プロテアーゼを、常法に従い適当な支持体
（樹脂担体）に固定した各種のものをいずれも使用でき
る。上記適当な支持体としては市販の各種のもの、例え
ばアンバーライトＸＡＤ−２、アンバーライトＸＡＤ−
７、アンバーライトＸＡＤ−８、アンバーライトＩＲＣ
−５０、アンバーライト２００Ｃ［以上ローム アンド
ハース(Rohm and Haas Co.)社製］、ダウエックスＭ
ＳＣ−１［ダウケミカル(Dow Chemical Co.)社製］、メ
ルコゲル［Merckogel SI 1000 Ａ、メルク（Merck)社
製］等の多孔性樹脂担体を使用できる。之等の内ではア
ンバーライトＸＡＤ−７が高収率を奏し得るため好まし
い。上記支持体への酵素の固定は、当分野でよく知られ
ている各種方法に従い得、例えばグルタールアルデヒド
架橋法によるのがよい。該方法におけるグルタールアル
デヒド濃度は一般に採用されているそれより高濃度、通
常８〜２０％程度、好ましくは１２．５％前後とするの
がよく、酵素はＮａＢｒ等の適当な溶液に溶解後支持体
に吸着固定させるのがよく、かくして、通常支持体１ｇ
（湿潤重量）当り約２〜５０重量％の酵素が固定され、
活性及び安定性の高い所望の固定化酵素を収得できる。
【００１１】本発明方法に従う脱水縮合反応は、例えば
代表的には各原料基質のtert−アミルアルコール溶液を
調製し、これを固定化金属プロテアーゼを充填したカラ
ムに連続的に供給して反応させることにより実施でき
る。ここで各原料基質のtert−アミルアルコール溶液に
おける各基質濃度は、適宜決定でき、反応速度の面から
はできるだけ高濃度（飽和濃度まで）であるのが好まし
く、通常フェニルアラニン低級アルキルエステル又はア
ミドは、約４０〜２００ｍＭ程度、好ましくは約１００
〜２００ｍＭ程度であるのがよく、これと反応させるべ
きＮ−置換アスパラギン酸では、上記フェニルアラニン
低級アルキルエステル又はアミドの約１／３〜１／２倍
モル濃度程度の範囲から選択されるのが適当である。
代表的には各原料基質のtert−アミルアルコール溶液を
調製し、これを固定化金属プロテアーゼを充填したカラ
ムに連続的に供給して反応させることにより実施でき
る。ここで各原料基質のtert−アミルアルコール溶液に
おける各基質濃度は、適宜決定でき、反応速度の面から
はできるだけ高濃度（飽和濃度まで）であるのが好まし
く、通常フェニルアラニン低級アルキルエステル又はア
ミドは、約４０〜２００ｍＭ程度、好ましくは約１００
〜２００ｍＭ程度であるのがよく、これと反応させるべ
きＮ−置換アスパラギン酸では、上記フェニルアラニン
低級アルキルエステル又はアミドの約１／３〜１／２倍
モル濃度程度の範囲から選択されるのが適当である。
【００１２】上記反応はバッチ法でも連続法でも実施で
き、特に連続法を採用する場合は、例えば原料液の供給
速度約０．５〜２ｍｌ／時間、滞留時間約５〜２０時
間、使用カラム大きさ約１０〜２０×１００〜３００ｍ
ｍ、カラム内固定化酵素充填量約１ｇ（湿潤重量）等と
するのが適当である。反応温度としては約２０〜５０℃
程度を採用でき、原料液は予めｐＨ５〜７．５程度の適
当な緩衝液等で飽和させて用いられるのがよい。
き、特に連続法を採用する場合は、例えば原料液の供給
速度約０．５〜２ｍｌ／時間、滞留時間約５〜２０時
間、使用カラム大きさ約１０〜２０×１００〜３００ｍ
ｍ、カラム内固定化酵素充填量約１ｇ（湿潤重量）等と
するのが適当である。反応温度としては約２０〜５０℃
程度を採用でき、原料液は予めｐＨ５〜７．５程度の適
当な緩衝液等で飽和させて用いられるのがよい。
【００１３】上記反応により目的とするオリゴペプチド
をtert−アミルアルコール溶液として得ることができ
る。目的物質は上記のごとくして得られる反応液より通
常の分取操作、濃縮操作、抽出操作等に従い分離でき、
必要に応じて常法に従い精製することができる。
をtert−アミルアルコール溶液として得ることができ
る。目的物質は上記のごとくして得られる反応液より通
常の分取操作、濃縮操作、抽出操作等に従い分離でき、
必要に応じて常法に従い精製することができる。
【００１４】かくして得られるオリゴペプチドは、その
有するＣ−保護基、Ｎ−保護基を常法に従い脱離させる
ことによって目的の合成甘味剤であるアスパルテームの
前駆体とすることができ、また生理活性を有する各種ペ
プチド類の合成反応試薬して利用できる。
有するＣ−保護基、Ｎ−保護基を常法に従い脱離させる
ことによって目的の合成甘味剤であるアスパルテームの
前駆体とすることができ、また生理活性を有する各種ペ
プチド類の合成反応試薬して利用できる。
【００１５】
【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため実施
例を挙げる。
例を挙げる。
【００１６】
【実施例１】固定化酵素の調製 サーモライシン〔EC3.4.24.4, 大和化成社製、力価９４
７０ＰＵ／ｍｇ〕７．５ｇを５Ｍ−ＮａＢｒ及び１６．
６ｍＭ−ＣａＣｌ2 を含む１／４０Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）１２０ｍｌに氷冷下に溶解し、この液に
固定化担体であるアンバーライトＸＡＤ−７（オルガノ
社製）３０ｇ（湿潤重量）を加え、４℃で１７時間静か
に振盪しながら酵素を担体に吸着させた。上澄液の残存
酵素蛋白量をビューレット法により定量した結果、初発
酵素量の約７０％が担体に吸着された。
７０ＰＵ／ｍｇ〕７．５ｇを５Ｍ−ＮａＢｒ及び１６．
６ｍＭ−ＣａＣｌ2 を含む１／４０Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）１２０ｍｌに氷冷下に溶解し、この液に
固定化担体であるアンバーライトＸＡＤ−７（オルガノ
社製）３０ｇ（湿潤重量）を加え、４℃で１７時間静か
に振盪しながら酵素を担体に吸着させた。上澄液の残存
酵素蛋白量をビューレット法により定量した結果、初発
酵素量の約７０％が担体に吸着された。
【００１７】上記上澄液７５ｍｌを除去した残りの固定
化酵素懸濁液に２５％グルタールアルデヒド溶液（ナカ
ライテスク社製）７５ｍｌを加え、４℃で約３時間振盪
して架橋反応を行ない、その後冷却した０．１Ｍトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、５ｍＭ−ＣａＣｌ2 含有）約
１ｌ及び１Ｍ−ＮａＣｌを含む同緩衝液約１ｌで交互に
２回洗浄して、固定化サーモライシン（以下「ＩＭＴ」
という）を得た。該ＩＭＴを４℃で保存した。
化酵素懸濁液に２５％グルタールアルデヒド溶液（ナカ
ライテスク社製）７５ｍｌを加え、４℃で約３時間振盪
して架橋反応を行ない、その後冷却した０．１Ｍトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、５ｍＭ−ＣａＣｌ2 含有）約
１ｌ及び１Ｍ−ＮａＣｌを含む同緩衝液約１ｌで交互に
２回洗浄して、固定化サーモライシン（以下「ＩＭＴ」
という）を得た。該ＩＭＴを４℃で保存した。
【００１８】
【実施例２】バッチ法による目的オリゴペプチド（Z-L-
Asp-L-PheOMe）の製造 tert−アミルアルコールに、緩衝液として５ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ2 を含む５０ｍＭＭＥＳ（２−シアノモルホリノエ
タンスルホン酸、同仁化学研究所製）−ＮａＯＨ緩衝液
（ｐＨ６．０）を４％となる濃度で添加して反応溶媒を
調製した。
Asp-L-PheOMe）の製造 tert−アミルアルコールに、緩衝液として５ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ2 を含む５０ｍＭＭＥＳ（２−シアノモルホリノエ
タンスルホン酸、同仁化学研究所製）−ＮａＯＨ緩衝液
（ｐＨ６．０）を４％となる濃度で添加して反応溶媒を
調製した。
【００１９】バッチ法は、４０℃下、激しい攪拌下に、
基質としてのＬ−フェニルアラニンメチルエステル（L-
PheOMe、シグマ社製）及びＮ−ベンジルオキシカルボニ
ル−Ｌ−アスパラギン酸（Z-L-Asp ）をそれぞれ上記溶
媒溶液にて２００ｍＭの濃度になるように調整し、且つ
実施例１で得たＩＭＴを０．０６７ｇ（湿重量）／ｍｌ
となる量で利用して行ない、目的オリゴペプチドとして
のＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギル−
Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（Z-L-Asp-L-PheO
Me）を合成した。
基質としてのＬ−フェニルアラニンメチルエステル（L-
PheOMe、シグマ社製）及びＮ−ベンジルオキシカルボニ
ル−Ｌ−アスパラギン酸（Z-L-Asp ）をそれぞれ上記溶
媒溶液にて２００ｍＭの濃度になるように調整し、且つ
実施例１で得たＩＭＴを０．０６７ｇ（湿重量）／ｍｌ
となる量で利用して行ない、目的オリゴペプチドとして
のＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギル−
Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（Z-L-Asp-L-PheO
Me）を合成した。
【００２０】尚、比較のため、上記tert−アミルアルコ
ールに替えて酢酸エチルを用いて、同一操作を繰り返し
た。
ールに替えて酢酸エチルを用いて、同一操作を繰り返し
た。
【００２１】上記バッチ法に従う反応の初速度（ｍＭ／
ｈｒ）、４８時間後のZ-Asp-L-PheOMeの収率（％）及び
酵素の残存活性（％）を求めた結果を表１に示す。
ｈｒ）、４８時間後のZ-Asp-L-PheOMeの収率（％）及び
酵素の残存活性（％）を求めた結果を表１に示す。
【００２２】
【表１】
【００２３】表１中、反応の初速度（ｍＭ／ｈｒ）は、
上記反応の経時変化の初期勾配から求めた値であり、４
８時間後のZ-L-Asp-L-PheOMe収率（％）は、高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により求めたものであ
り、酵素の残存活性（％）は水／有機溶媒２相系におけ
るZ-PhePheOMe 合成活性（K.Nakanishi, et al., Bio/t
echnology, 3, 459 (1985)）を調べることにより測定し
た。
上記反応の経時変化の初期勾配から求めた値であり、４
８時間後のZ-L-Asp-L-PheOMe収率（％）は、高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により求めたものであ
り、酵素の残存活性（％）は水／有機溶媒２相系におけ
るZ-PhePheOMe 合成活性（K.Nakanishi, et al., Bio/t
echnology, 3, 459 (1985)）を調べることにより測定し
た。
【００２４】上記表１より、tert−アミルアルコールの
利用によれば、酢酸エチルの利用に比して、酵素の失活
を実質的に起こすことなく、高収率でZ-Asp-L-PheOMeを
合成できることが判る。
利用によれば、酢酸エチルの利用に比して、酵素の失活
を実質的に起こすことなく、高収率でZ-Asp-L-PheOMeを
合成できることが判る。
【００２５】また、上記バッチ法において、Z-Asp の濃
度を８０ｍＭ、１２０ｍＭ及び２００ｍＭのいずれかと
すると共に、ＩＭＴを０．２ｇ（湿重量）／ｍｌとなる
量で利用して、同様の反応を行ない、経時的に生成する
Z-L-Asp-L-PheOMeの収率を同様にして求めた。
度を８０ｍＭ、１２０ｍＭ及び２００ｍＭのいずれかと
すると共に、ＩＭＴを０．２ｇ（湿重量）／ｍｌとなる
量で利用して、同様の反応を行ない、経時的に生成する
Z-L-Asp-L-PheOMeの収率を同様にして求めた。
【００２６】５０時間迄の反応時間での結果（収率：Ye
ild ）を、図１に示す。
ild ）を、図１に示す。
【００２７】該図より、Z-Asp の濃度が８０ｍＭ、１２
０ｍＭ及び２００ｍＭの場合に、目的物収率は、それぞ
れ９９％、９８％及び８３％であった、また上記各基質
濃度条件下での残存酵素活性は、いずれもほぼ１００％
であり、いずれの場合も実質的に失活は認められず、非
常に安定であった。
０ｍＭ及び２００ｍＭの場合に、目的物収率は、それぞ
れ９９％、９８％及び８３％であった、また上記各基質
濃度条件下での残存酵素活性は、いずれもほぼ１００％
であり、いずれの場合も実質的に失活は認められず、非
常に安定であった。
【００２８】
【実施例３】酵素活性のｐＨ安定性 実施例２において、tert−アミルアルコールに予めｐＨ
４〜８の５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液４％を加え
て、４０℃下に７日間保温して反応を行なわせ、酵素の
残存活性を実施例２で示した２相系におけるZ-PhePheOM
e 合成活性から同様にして求めた。
４〜８の５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液４％を加え
て、４０℃下に７日間保温して反応を行なわせ、酵素の
残存活性を実施例２で示した２相系におけるZ-PhePheOM
e 合成活性から同様にして求めた。
【００２９】得られた各ｐＨ条件下での相対残存活性
（Relative remaining activity ）を図２に示す。
（Relative remaining activity ）を図２に示す。
【００３０】尚、図２には上記tert−アミルアルコール
に替えて酢酸エチルを用いて行なった同一試験の結果を
併記する。
に替えて酢酸エチルを用いて行なった同一試験の結果を
併記する。
【００３１】図２より、tert−アミルアルコールの利用
によれば、ｐＨ４〜８の範囲でいずれも酵素の失活は認
められないことが明らかである。
によれば、ｐＨ４〜８の範囲でいずれも酵素の失活は認
められないことが明らかである。
【００３２】
【実施例４】酵素活性の温度安定性 実施例２において、反応温度を４０〜８０℃に変化させ
る以外は同様として５時間保温し、各温度条件下での相
対残存活性を求めた。
る以外は同様として５時間保温し、各温度条件下での相
対残存活性を求めた。
【００３３】得られた結果を図３に示す。
【００３４】尚、図３には上記tert−アミルアルコール
に替えて、酢酸エチルを用いた場合及びＭＥＳ緩衝液を
用いた場合を併記する。
に替えて、酢酸エチルを用いた場合及びＭＥＳ緩衝液を
用いた場合を併記する。
【００３５】図３より、tert−アミルアルコールの利用
によれば、４０〜７０℃の温度範囲で酵素の失活は認め
られないことが明らかである。
によれば、４０〜７０℃の温度範囲で酵素の失活は認め
られないことが明らかである。
【００３６】
【実施例５】フロー法によるZ-L-Asp-L-PheOMeの製造 実施例１で得たＩＭＴの０．５ｇ（湿重量）／ｍｌをガ
ラスカラムに充填し、該カラムにL-PheOMe及びZ-L-Asp
のそれぞれをtert−アミルアルコールを用いて調整した
溶媒溶液（但しＣａＣｌ2 を含まない）にてそれぞれ２
００ｍＭ及び８０ｍＭの濃度に調整した基質溶液を、４
０℃にて、空間容積（ＳＶ）が４３／ｈｒの一定流速で
連続的に５時間供給した。その後、固定化酵素をカラム
から取り出して、残存活性を調べた。
ラスカラムに充填し、該カラムにL-PheOMe及びZ-L-Asp
のそれぞれをtert−アミルアルコールを用いて調整した
溶媒溶液（但しＣａＣｌ2 を含まない）にてそれぞれ２
００ｍＭ及び８０ｍＭの濃度に調整した基質溶液を、４
０℃にて、空間容積（ＳＶ）が４３／ｈｒの一定流速で
連続的に５時間供給した。その後、固定化酵素をカラム
から取り出して、残存活性を調べた。
【００３７】尚、比較のため、上記tert−アミルアルコ
ールに替えて酢酸エチルを用いて、同一操作を繰り返し
た。
ールに替えて酢酸エチルを用いて、同一操作を繰り返し
た。
【００３８】上記フロー法による反応５時間後の使用酵
素の相対残存活性（いずれの場合も冷蔵庫に保存してあ
った固定化酵素の活性を１００％とする）を表２に示
す。
素の相対残存活性（いずれの場合も冷蔵庫に保存してあ
った固定化酵素の活性を１００％とする）を表２に示
す。
【００３９】
【表２】
【００４０】表２からも、本発明方法に従うtert−アミ
ルアルコールの利用が、酢酸エチルの利用に比して、非
常に有利であることが明らかである。
ルアルコールの利用が、酢酸エチルの利用に比して、非
常に有利であることが明らかである。
【００４１】
【実施例６】連続法によるZ-L-Asp-L-PheOMeの製造 実施例１で得たＩＭＴの８ｇ（湿重量）／ｍｌをガラス
カラムに充填し、該カラムにL-PheOMe及びZ-L-Asp のそ
れぞれを、実施例１に従いtert−アミルアルコールを用
いて調整した溶媒溶液にて、それぞれ２００ｍＭ及び１
２０ｍＭの濃度に調整した基質溶液を、空間容積（Ｓ
Ｖ）が１／ｈｒの一定流速で連続的に供給しつつ、４５
℃下に連続反応させて、Z-L-Asp-L-PheOMeを合成した。
カラムに充填し、該カラムにL-PheOMe及びZ-L-Asp のそ
れぞれを、実施例１に従いtert−アミルアルコールを用
いて調整した溶媒溶液にて、それぞれ２００ｍＭ及び１
２０ｍＭの濃度に調整した基質溶液を、空間容積（Ｓ
Ｖ）が１／ｈｒの一定流速で連続的に供給しつつ、４５
℃下に連続反応させて、Z-L-Asp-L-PheOMeを合成した。
【００４２】上記連続法による３００時間反応の経時的
目的Z-L-Asp-L-PheOMeの収率（Yield:％）を求めた結果
を図４に示す。
目的Z-L-Asp-L-PheOMeの収率（Yield:％）を求めた結果
を図４に示す。
【００４３】該図４より、本発明のtert−アミルアルコ
ールの利用によれば、３００時間経過後もほぼ一定収率
で目的物を合成できることが明らかである。
ールの利用によれば、３００時間経過後もほぼ一定収率
で目的物を合成できることが明らかである。
【００４４】
【実施例７】バッチ法による目的オリゴペプチド(Z-L-A
sp-L-PheNH2 ）の製造 tert−アミルアルコールに５ｍＭ ＣａＣｌ2 を含む５
０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．８）を４
％、またホルムアルデヒドを１０％となる濃度でそれぞ
れ添加して反応溶媒を調製した。これに基質であるZ-L-
Asp と L-PheNH2とをそれぞれ１００ｍＭになるように
溶解させて基質溶液を調製した。
sp-L-PheNH2 ）の製造 tert−アミルアルコールに５ｍＭ ＣａＣｌ2 を含む５
０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．８）を４
％、またホルムアルデヒドを１０％となる濃度でそれぞ
れ添加して反応溶媒を調製した。これに基質であるZ-L-
Asp と L-PheNH2とをそれぞれ１００ｍＭになるように
溶解させて基質溶液を調製した。
【００４５】実施例１で得たＩＭＴを基質溶液１０ｍｌ
当り２ｇ（湿重量）となる割合で上記基質溶液に添加
し、４０℃にて激しく攪拌しながら反応を行なわせた。
当り２ｇ（湿重量）となる割合で上記基質溶液に添加
し、４０℃にて激しく攪拌しながら反応を行なわせた。
【００４６】２４時間反応後の生成 Z-L-Asp-L-PheNH2
のＨＰＬＣのピーク面積から求められる収率は９０％で
あった。また固定化酵素の残存活性を実施例２と同様に
して求めた所、約９０％であった。
のＨＰＬＣのピーク面積から求められる収率は９０％で
あった。また固定化酵素の残存活性を実施例２と同様に
して求めた所、約９０％であった。
【図１】実施例２に従うバッチ法における目的オリゴペ
プチドの経時的収率を示すグラフである。
プチドの経時的収率を示すグラフである。
【図２】実施例３に従う酵素活性のｐＨ安定性を調べた
グラフである。
グラフである。
【図３】実施例４に従う酵素活性の温度安定性を調べた
グラフである。
グラフである。
【図４】実施例６に従う連続法による目的オリゴペプチ
ド経時的収率を示すグラフである。
ド経時的収率を示すグラフである。
Claims (1)
- 【請求項１】Ｎ−置換アスパラギン酸とフェニルアラニ
ンの低級アルキルエステルもしくはアミドとの脱水縮合
反応を、tert−アミルアルコール中、固定化金属プロテ
アーゼを用いて行なうことを特徴とするオリゴペプチド
の合成法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5028769A JPH06237784A (ja) | 1993-02-18 | 1993-02-18 | オリゴペプチドの合成法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5028769A JPH06237784A (ja) | 1993-02-18 | 1993-02-18 | オリゴペプチドの合成法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06237784A true JPH06237784A (ja) | 1994-08-30 |
Family
ID=12257618
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5028769A Pending JPH06237784A (ja) | 1993-02-18 | 1993-02-18 | オリゴペプチドの合成法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06237784A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004011652A1 (ja) * | 2002-07-26 | 2004-02-05 | Ajinomoto Co., Inc. | トリペプチド以上のペプチドの製造方法 |
| JP2012509089A (ja) * | 2008-11-19 | 2012-04-19 | ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． | 酵素的活性化およびカップリングを使用したペプチド合成 |
-
1993
- 1993-02-18 JP JP5028769A patent/JPH06237784A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004011652A1 (ja) * | 2002-07-26 | 2004-02-05 | Ajinomoto Co., Inc. | トリペプチド以上のペプチドの製造方法 |
| US7338780B2 (en) | 2002-07-26 | 2008-03-04 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing tripeptides and/or peptides longer than tripeptides |
| US7749742B2 (en) | 2002-07-26 | 2010-07-06 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing tripeptides and/or peptides longer than tripeptides |
| JP2012509089A (ja) * | 2008-11-19 | 2012-04-19 | ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． | 酵素的活性化およびカップリングを使用したペプチド合成 |
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