JPH04187095A

JPH04187095A - 生理活性ジペプチドの製造法

Info

Publication number: JPH04187095A
Application number: JP31582190A
Authority: JP
Inventors: Hiroki Ri; 李　浩喜; Hideaki Fukushi; 英明福士
Original assignee: Chisso Corp
Current assignee: JNC Corp
Priority date: 1990-11-22
Filing date: 1990-11-22
Publication date: 1992-07-03

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、ペプチドの製造法に関し、特に酵素を触媒と
する鎮痛活性を有する生理活性ジペプチドの製造法に関
する。

（従来の技術）近年、ペプチドに種々の生理活性を有するものが見出さ
れるようになり、これらの治療、診断等の医薬品としで
あるいは呈味勧賞としての重要性がますます増大してい
る。生体内にも生理活性を有する各種のペプチドが存在
することが知られており、キョートルフィンとして知ら
れるし一チロシルーし一アルギニンも鎮痛活性を指標と
してウシ脳より単離された生理活性ジペプチドの一つで
ある。これらのペプチドは医薬品あるいはその前駆体と
しての価値を有しており、それらの効率的製造法を確立
することは重要である。

ペプチドの合成法の主なものとしては、たとえば、ファ
ルマシアレビュー、３号、２７　（１９８０）にまとめ
られているように、化学法と酵素法の二つに大別される
。

その化学合成法としては、アジド法、混合酸無水物法、
活性エステル法、カルボジイミド法などが代表的なもの
である。しかしながら、これらどの化学法においても、
ラセミ化や副反応が起きやす（、温度制御、溶媒の選択
をはじめ、アミン保護基、カルボキシル保護基の性質あ
るいはアミノ酸側鎖の反応に及ぼす影響などを考慮しな
ければならず、工業的製造法としては解決すべき種々の
問題がある。これらの問題のなかでペプチド結合形成に
かかわる一方または両方のアミノ酸の側鎖に反応性の官
能基が存在する場合には、それらの保護、脱保護が反応
前後で必要となり、操作が煩雑になり、目的のペプチド
の純度の低下をもたらす。化学法のうち、アジド法はラ
セミ化を起こしにくい唯一の方法であり、利用価値が高
いが、他の方法に比べ操作が煩雑であること、ヒドラジ
ド生成工程において副反応が生起することなどのため、
収率は必ずしも優れているとは言えない。

一方、酵素を用いたペプチド合成法では、−ｉにその反
応条件が温和であること、及び生体触媒である酵素は基
質としてのアミノ酸及びその誘導体の種類、立体化学に
対する選択性が高いことから、反応性官能基の保護を必
要とせず反応生成物のラセミ化は起こらないとされてい
る。この例としては、キモトリプシンやパパインなどの
プロテアーゼを触媒として利用したペプチド合成法があ
る（たとえば、Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

ｖｏｌ、　　５＋　　八ｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ
　　Ｉｎｃ、、　　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ（１９４９））
。

この方法を反応式で示すと次の通りである。

Ｘ−ＡＡ＋−ＯＨ＋　Ｈ−＾Ａ２−ＮＨ−Ｃ６Ｈ５酵素Ｘ−ＡＡ＋−ＡＡｚ−ＮＨ−ＣＪｓただし、Ｘはヘンジイル基（Ｂｚ）やベンジルオキシカ
ルボニル基（Ｚ）などの末端アミノ基の保護基、ＡＡ、
、ＡＡ２は、グリシン（Ｇｌｙ）　、フェニルアラニン
（Ｐｈｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、チロシン（Ｔｙｒ）
などのアミノ酸残基である。

これらの反応では、ジペプチドを合成するために、いわ
ゆるアミン成分にフェニルアミノ基で保護したアミノ酸
を用いている。この保護基は、通常の保護基のように容
易に脱離しえない基であり、−旦住成したペプチドから
脱離するには激しい条件下での加水分解が要求され、ペ
プチド結合の開裂を生起するという重大な欠陥がある。

また、プロテアーゼを触媒として用い、加水分解の逆反
応を利用しているため、緩衝液中では酵素本来の加水分
解活性のためペプチド合成と平行して、加水分解反応も
進行し、しばしば目的のペプチドが得られないという重
大な欠点を有している。

（発明が解決しようとする課Ｂ）キョートルフィンの化学合成法については、すでにアジ
ド法を用いて行っている（Ｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍ。

Ｂｕｌｌ、、　２８．１９３５（１９８０））が、上記
のごとく化学合成によるペプチドの合成は、その操作が
煩雑であり、かつ反応条件が過激であるため目的とする
ペプチドの収率が低く、また光学純度の高いものを得る
ことが困難である。

また、酵素法によるペプチドの合成法については、キモ
トリプシンやトリプシンなどのセリンプロテアーゼを用
いた合成法が報告されている（Ｂｉｏｔｅｃｈ、　Ｂｉ
ｏｅｎｇ、、　３３．１４００（１９８９））。しかし
、目的のチロシルアルギニン以外に二次加水分解や目的
ペプチド以外のペプチド生成のため、収率は必ずしも良
くない。

本発明は、ペプチドの医薬品あるいはその合成中間体と
しての重要性に鑑み、蛋白質加水分解酵素の一種である
システインプロテイナーゼを触媒として用い、反応条件
を制御することにより、生理活性ジペプチドを簡便に、
かつ高収率で製造することを目的とする。

（課題を解決するための手段）本発明は、アミノ酸誘導体のカルボキシ成分とアミン成
分の２種類の基質を含む溶液中に蛋白質加水分解酵素を
存在させ、一定時間反応させることにより、該基質間に
ペプチド結合を形成させることを特徴とする生理活性ジ
ペプチドの製造方法である。

本発明は下記（１）ないしく４）の構成を有する。

（１）　　アミノ酸誘導体のカルボキシ成分とアミン成
分の２種類の基質を含む溶液中に蛋白質加水分解酵素を
存在させ、該酵素の触媒作用により該溶液から生理活性
ペプチドを得る。

（２）蛋白質加水分解酵素としてシステインプロテイナ
ーゼを用いる。

（３）　　システインプロテイナーゼをそのまま、ある
いはポリエチレングリコールで代表される両親媒性合成
高分子で化学修飾した修飾酵素、あるいは適当な担体に
固定化した固定化酵素を用いる。

（４）溶液として緩衝液、有機溶媒あるいは緩衝液に適
当な濃度の有機溶媒、例えばアルコールを添加したもの
を用いる。

本発明において用いられる酵素は、パパインを例示する
ことができるが、その他にシステインプロテイナーゼに
属する加水分解酵素であれば、プロメレイン、フィシン
、カテプシンＢ、キモパパインなど動物、植物由来の酵
素を用いることができる。

本発明において用いられるアミノ酸誘導体のカルボキシ
成分の基質としては、そのアミノ基を例えばベンジルオ
キシカルボニル基、ベンゾイル基、第三ブトキシカルボ
ニル基で保護する必要があるが、そのカルボキシル基は
、遊離であってもあるいはメチル、エチル、プロピル、
あるいはベンジルなどのエステルであってもよい。また
アミン成分の基質としてはアミノ酸のメチル、エチル、
プロピル、ベンジルなどのエステルを用いることができ
る。

酵素の使用量は、その種類、活性によって異なるが、通
常１〜１０００μ門の濃度のものを用いる。

酵素の使用形態としては、前述の酵素をそのまま、ある
いはポリエチレングリコールで代表される両親媒性合成
高分子で化学修飾したもの、あるいは上記酵素を適当な
担体に固定化して用いることができる。

反応溶媒としては、緩衝液または反応促進のために適当
な有機溶媒を添加した緩衝液、あるいは有機溶媒を用い
ることができる。本発明で合成するペプチドのように酵
素に対する基質特異性が良い場合、水溶液中での反応で
は生成したペプチドが二次加水分解を受は収率が低下し
不利である。

この加水分解を防ぐには反応系の水の含量を抑えると良
く、反応系である水溶液に適当量の有機溶媒を添加する
。

一方、天然の酵素は一般に有機溶媒に対して不溶でかつ
酵素の変性、失活が起こりやすいという欠点がある。こ
のような酵素の有機溶媒に対する欠点を克服する目的で
種々の担体に固定化した酵素が提案されているが、固定
化酵素においても有機溶媒に対する溶解性、安定性を得
たわけではなく、固定化担体内に酵素を包括することに
より有機溶媒による変性、失活を抑制しているに過ぎな
い。これを防ぐには、修飾酵素を用いると良く、天然酵
素のアミノ基またはカルボキシル基を両親媒性合成高分
子であるポリエチレングリコールで化学修飾することに
より、ベンゼン、クロロホルム、トリクロロエタンなど
の有機溶媒に対して可溶かつ安定化させることができる
。

本発明では、種々の緩衝液または適当な濃度の有機溶媒
を添加した緩衝液、あるいは有機溶媒中で反応を行う。

緩衝液としては、リン酸、酢酸、クエン酸、炭酸、トリ
ス、マレイン酸、マクイルパイン緩衝液などが用いられ
る。緩衝液のｐＨは、それぞれの酵素に通常用いられる
ｐＨであれば良く、特に限定されるものではない。緩衝
液に添加される有機溶媒としては水溶性のもの、例えば
、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、メタノール
、エタノールなどがあり、反応系として水を含まない有
機溶媒を用いる場合には、各種の非水系の有機溶媒を用
いることができるが、好ましくは、ベンゼン、クロロホ
ルム、１，１．１−）リクロロエタンなどを例示するこ
とができる。

反応温度は、１０〜７０℃で特に２５〜４０℃が好適で
ある。

（実施例）以下、本発明を実施例に基づき説明する。

合成例１　ポリエチレングリコール誘導体によるパパイ
ンの化学修飾パパイヤの果実乳液より得、二回再結晶した精製パパイ
ン（シグマ社製、タイプｍ　）４００ｍｇヲ０．０５Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，２）８０ｍｌに溶かし、これに
アブコウスキイ（Ａｂｕｃｈｏｉｍｓｋｉ）らの方法（
Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏ−ｃｈｅｗａ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ
、、　７．１７５　（１９８４））により合成したメト
キシポリエチレングリコールコハク酸Ｎ−サクシイミジ
ル（ポリエチレングリコール部分の分子量は、５０００
）　９．６ｇを撹拌しながら、室温で４０分間反応させ
た。反応液にイオン交換水７００−を加え、不溶物を濾
過後、濾液の透析、限外′ａ、過を数回繰り返し、凍結
乾燥により、ポリエチレングリコール修飾パパイン（以
下、ＰＥＧ−パパインと略記する）　３．６ｇを得た。

得られた修飾パパインは、遊離のアミノ基の７４％が修
飾されており、非修飾パパインの加水分解活性の５０％
を保持していた。

実施例１　ベンジルオキシカルボニルチロシルアルギニ
ンの合成合成例１で得たＰＥＧ−パパイン３０ｍｇを４．エタノ
ール２０％を含むマクイルバイン緩衝液（ｐＨ６，２゜
０．５％のメルカプトエタノールを含む）Ｉｄに溶解さ
せ、その溶液にカルボキシ成分としてヘンシルオキシカ
ルボニルチロシン（Ｚ−Ｔｙｒ−ＯＨ）３．２ｍｇ。

アミン成分としてアルギニンメチルエステル塩酸塩（Ａ
ｒｇ−ＯＭｅ　−２ＨＣＩ）２７ａ＋ｇを溶解させ、ト
リエチルアミン１１１Ｉ！を加え、３０℃にて２４時間
反応させた。

反応液２０ｔｔｌをサンプリングし１８０ａｆの冷水を
加え反応を停止し、そのうち２０ｔｔｌを高速液体クロ
マトグラフィーで分析した。その結果、ベンジルオキシ
カルボニルチロシルアルギニンの生成を確認した（収率
１０％）。

また、生成物をシリカゲル薄層クロマトグラフィーによ
り分離後、分取し、構造を核磁気共鳴スペクトルにより
確認した。

Ｔ　Ｌ　ＣＲｆ　＝０．６５　（ＣＯＣｌ２：ＣＨ３０
Ｈ３９／１）Ｎ　Ｍ　Ｒ（ＣＤ３０Ｄ−ＴＭＳ）　　δ
：１．１７〜１．２９（４８，ｍ）、　２．８４（ＩＨ
，ｍ）、　３．０１（１Ｂ、　ｍ）。

３．３４（ＩＨ，ｄｄ）、　４．１３（２Ｈ，ｍ）、　
４．３４（ＩＨ，ｍ）。

５．０４（２８，ｍ）、　６．６８（２Ｈ，ｄｄ）、　
７．００（２Ｈ，ｄｄ）。

７．２８〜７．３２（５Ｈ，ｍ）実施例２　ベンジルオキシカルボニルチロシルアルギニ
ンの合成に対するエタノールの添加効果実施例１においで、添加するエタノール濃度を１０％、
２０％、３０％、５０％、８０％とした以外は、同様の
条件で反応を行い反応液を実施例１と同様に分析した。

結果を表１に示す。ベンジルオキシチロシルアルギニン
の収率は、５０％エタノール添加時に最高値を示した。

実施例３　ベンジルオキシカルボニルチロシルアルギニ
ンの混合有機溶媒中での合成実施例１において、溶媒にエタノールと１．１゜１−ト
リクロロエタンの混合有機溶媒（１：９、ジチオスレイ
トール７ｍＭを含む）を用いた以外は、同様の反応条件
で反応を行い、反応液を減圧濃縮して溶媒を留去し、残
渣を高速液体クロマトグラフィーで分析した。その結果
、ベンジルオキシカルボニルチロシルアルギニンメチル
エステルの生成を確認した（収率１８％）。

実施例４　ベンジルオキシカルボニルチロシルアルギニ
ンの混合有機溶媒中での合成収率に対するエタノール添加効果実施例３において、添加するエタノール濃度を１０％、
２０％、３０％、５０％、８０％とした以外は、同様の
条件で反応を行い反応液を減圧Ｓ縮して溶媒を留去し、
残渣を高速クロマトグラフィーで分析した。結果を表２
に示す。エタノール１０％添加時に最大収率（１８％）
を示した。

表２実施例５　ベンゾイルチロシルアルギニンの合成エタノ
ール４０％を含むマクイルバイン緩衝液（ｐＨ６，２，
０，５％メルカプトエタノールを含む）１〇−にベンゾ
イルチロシンエチルエステル（Ｂｚ−Ｔｙｒ−ＯＥｔ）
　１５７ｍｇ１アルギニンメチルエステル（Ａｒｇ−Ｏ
Ｍｅ−２）１ｃＩ）２６１ｍｇ、トリエチルアミン１４
０ａｆを加え、更にＰＥＧ−パパイン１００ｍｇを加え
３０℃にて２４時間反応させた。この反応液を酢酸エチ
ルで抽出し、水層を酢酸エチルで数回洗浄後、４℃にて
一晩放置し、析出した白色沈澱を濾過、少量の水で洗浄
し、デシケータ−内で乾燥した（収率６０％）。

Ｎ　Ｍ　Ｒ（ＣＤ３０Ｄ−ＴＭＳ）　　δ：１．３５〜
１．５０（２Ｈ，ｍＬ　１．５５〜１．７（２Ｈ，ｍ）
＋２．８５（１Ｂ、　ｖ）、　３．０３（３Ｈ，ｍＬ　
３．９０（ＩＨ，ｄｄ）。

４．５４（ＩＨ，ｍ）、　６．６１（２Ｈ，ｄＬ　７．
１０（２Ｈ，ｄ）。

７．４２〜７．６０（３）１．　ｍ）、　７．７４（２
Ｂ、　ｍ）実施例６　固定化ＰＥＧ−パパインによるベ
ンゾイルチロシルアルギニンの合成アンバーライトＸＡＤ−４（アルドリッチ社製）に固定
化した固定化ＰＥＧ−パパイン０．６ｇ　（湿重量１ｇ
に対して合成例１で得たＰＥＧ−パパイン２５ｍｇが固
定化されている）をエタノール４０％を含むマタイルパ
イン緩衝液（ｐＨ６，２，０，５％メルカプトエタノー
ルを含む）　１０ｍ１に加え、ここにアルギニンメチル
エステル（Ａｒｇ−ＯＭｅ・２ＨＣ１）２６１ｍｇ、　
　）リエチルアミン１４０　ｔｔｌを加えて、３７℃で
２４時間振盪撹拌を行った。２４時間後、反応液２Ｃｈ
ｔｌを採取し、実施例１と同様に高速液体クロマトグラ
フィーにて分析した。その結果、ベンゾイルチロシルア
ルギニンの生成を確認した（収率４３％）。

（発明の効果）本発明によれば、ジペプチドを好収率で合成することが
でき、鎮痛活性を有する生理活性ジペプチド、キョート
ルフイン等を従来の方法よりも簡便な方法を用いて製造
することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）アミノ酸誘導体のカルボキシ成分とアミン成分の
２種類の基質を用い、システインプロテイナーゼに属す
る酵素の存在下、溶媒中で前記２種類の基質間にペプチ
ド結合を形成させることを特徴とする生理活性ジペプチ
ドの製造法。
（２）システインプロテイナーゼに属する酵素は、その
まま、あるいはその酵素をポリエチレングリコールに代
表される両親媒性合成高分子により化学修飾した修飾酵
素、あるいは担体に固定化した固定化酵素として用いる
請求項１記載の製造法。
（３）溶媒が、緩衝液、有機溶媒、あるいは有機溶媒を
添加した緩衝液である請求項１または２記載の製造法。