JPH03503958A - カルシトニン遺伝子関連ペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 カルシトニン遺伝子関連ペプチドの製造方法発明の分野 本発明はカルシトニン遺伝子関連ペプチドの酵素による製造方法に関する。より 詳しくは、本発明は酵素の助けを借りた逆蛋白分解によるカルシトニン遺伝子関 連ペプチドの製造方法に関する。

発明の背景 カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）は多くの種類が同定されている［ たとえば、Ａｌｕｔ　ｅ（ｍ！　。

（１９８２）ＮＮｕｒｅ　　２９８．２４０−２４４及び英国特許明細書第２１ ４１４３０号参照］。それらは数多くの、とりわけ血管系及び神経系への生理学 的作用を有する一部の密接に関連したペプチドホルモン類を構成する。

これらのホルモンと、化学的に合成された誘導体（たとえば欧州特許明細書第２ １２４３２号参照）は、薬剤としての使用、たとえば高血圧、心不全あるいは他 の心臓循環系疾患の治療における使用のために提案されている。

現行のＣ０ＲＰの製造方法は、二つの一般的なカテゴリーに分けられる。たとえ ば、このペプチドは化学的に（たとえば、適当なアミノ酸の連続的カップリング により）合成してもよく、あるいはまた、組替えＤＮＡ技術を用いて酵母もしく はバクテリア中で製造してもよい。

一般に、化学的な技術は小規模にＣＧＲＰを生産するにはよい゛が、主として操 作に費用がかかるという理由から、商業的にはそれほど魅力的なものとはいえな い。組替えＣＧＲＰ遺伝子を含んだ酵母またはバクテリアによるＣ０ＲＰの製造 は、組替え遺伝子アプローチが一般に、より安価でスケールアップがし易く、よ り純粋な生産物を製造するという点で、化学法にまさる利点を有している。

しかし、組替え遺伝子アプローチに伴う主な問題は、酵母やバクテリアに、活性 に必要と思われるＣ末端α−アミド基をもったＣＧＲＰを産生させることができ ないということである。それ故、一度ペプチドを単離したら、望ましいアミド機 能を導入すべく、付加的で費用のかかる処理段階を踏まねばならない。これに対 する先に提案された一つの解決策は、有機体に、付加的なＣ末端グリシン残基を もったＣＧＲＰを産生させ、次の段階でそのグリシン残基を、アミド化酵素を使 用して望ましいアミド基に変換することである（欧州特許明細書第１８８４００ 号参照）。

本発明者らは酵素によるＣＧＲＰの新しい製造方法を見出した。これはアミド化 されたペプチドもしくはアミノ酸、又はアンモニアの、ペプチドのＣ末端カルボ ン酸又はエステルへの結合に対する触媒作用を示す加水分解の酵素を本質的に利 用するものである。この方法は特に、微生物に基いたＣＧＲＰ合成の一部として 、組替えＤＮＡ技術とともに使用することに適している。この方法は、Ｃ０ＲＰ を収率良く、高純度に、有利に製造するものであり、低コストで商業的規模で運 用することができる。

発明の要旨 かくして、本発明の一つの態様によれば、本発明者らは、Ｃ末端が切断されたカ ルシトニン遺伝子関連ペプチド又はその保護された誘導体を、加水分解酵素の存 在下で、Ｃ末端がアミド化されたペプチドもしくはアミノ酸、′　又はアンモニ アと反応させて、該カルシトニン遺伝子関連ペプチド又はその保護された誘導体 を蓄積させ、その蓄積したカルシトニン遺伝子関連ペプチド又は保護された誘導 体を回収し、必要に応じて、その保護された誘導体を脱保護化することを含むカ ルシトニン遺伝子関連ペプチドの製造方法を、提供するものである。

本発明により生産されたカルシトニン遺伝子関連ペプえば、ＣＧＲＰ生産物は、 動物、たとえばヒト、ラット、ニワトリのような哺乳類のα−またはβ−ＣＧＲ Ｐのアミノ酸配列を有していてもよい。あるいは、ＣＧＲＰ生産物は、天然ＣＧ ＲＰのアナログ、たとえば、少なくとも一つのアミノ酸が異なるアミノ酸で置換 された天然ＣＧＲＰ、一種又はそれ以上の付加的なアミノ酸を含む天然ＣＧＲＰ 、又は少なくとも一種のアミノ酸が欠損した天然ＣＧＲＰであってもよい。

ＣＧＲＰ生産物の保護された誘導体としては、Ｎ末端アミノ酸及び／又は一つも しくはそれ以上の側鎖基が保護された誘導体が挙げられる。特に、Ｎ末端アミノ 基が、アルカノイル基（たとえばアセチル基）、アロイル基（たとえばベンゾイ ル基）、アルコキシカルボニル基（たとえばｔ−ブトキシカルボニル基）、アラ ルコキシカルボニル基（たとえばベンジロキシカルボニル基）のようなアシル基 又はアラルキル基（たとえばベンジル基）はエーテル化により適宜保護され、か つ、システィン基がアシル化もしくはアルキル化により保護されたＣＧＲＰ誘導 体が挙げられる。

本発明の方法において出発物質として使用されるＣ末端が切断されたＣＧＲＰ　 （以下ｔ−ＣＧＲＰという）又は保護されたｔ−ＣＧＲＰ誘導体は、一般には、 Ｃ末端アミノ酸アミドもしくはＣ末端アミノ酸アミドを含むＣ末端ペプチドのい ずれかが欠損しているか、または、Ｃ末端カルボキサミド機能がカルボン酸基も しくはエステル基で置換された、先に定義したＣＧＲＰ又は保護された誘導体で あってもよい。ｔ−Ｃ０ＲＰ又は保護された誘導体は、Ｃ末端としてカルボン酸 基（−ＣＯ２Ｈ）又はエステル基−ＣＯ２Ｒを有していてもよい（但し、Ｒはた とえば、メチル基のようなアルキル基、フェニル基ル基から選ばれた基である） 。

特に、本発明で用いられるｔ−ＣＧＲＰとしては、ｄｅｓ−Ｐｈｅ　　ＮＨ２− ＣＧＲＰ、ｄｅｓ−ＡｈａＰ　ｈ　ｅ　　ＮＨ２ＣＧＲＰ　（但し、ＣＧＲＰは 上述の通りである）Ｐｈｅ”ＣＯＨ−ＣＧＲＰ又はそれらの保護された誘導体が 挙げられる。

出発物質であるＣ末端がアミド化されたペプチド又はアミノ酸は、一般に、式Ｈ ［Ｙ］　　ＮＨ２を有するものである［ここで、ｎは０又は、１．２．３もしく はそれ以上の整数であり、Ｙはアミノ酸の残基［たとえば、式−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ ）Ｃｏ−４）基、但しＲ】は水ｊＫ原子又は天然アミノ酸のα炭素原子に付いて いるタイプの有機基である］を表す。ただし、二つ又はそれ以上のＹ基が存在す るときは、それらは同一であっても異なっていてもよい］。特に−ＮＨ、Ａ　Ｉ 　ａ−Ｐ　ｈ　ｅ　　ＮＨ２又はＰ　ｈ　ｅ　−Ｎ　Ｈ２が挙げられる。

一般に、上述のアミノ酸（単独であってもペプチド構造の一部としても）はＬ体 である。

本発明の方法で使用される加水分解酵素は、を−ＣＧＲＰのＣ末端カルボキシル 基と、出発物質であるアミド化されたペプチド又はアミノ酸のＮ末端アミノ基と の間で、ペプチド結合の形成に触媒として作用し得る加水分解の酵素のいずれで あってもよい。加水分解酵素は哺乳類のような動物、菌類、バクテリアに由来す るものであってもよく、また、エンドペプチダーゼもしくはエキソペプチダーゼ であってもよい。特に、キモトリプシン、トリプシン、トロンビン、プラスミン 、エラスターゼ　エンドプロテイナーゼ　Ｌｙｓ　　Ｃ，エンドプロテイナーゼ 　Ｇｌｕ　　Ｃｓエンドプロティナーゼ　ＡｒｇＣのようなセリンプロテアーゼ 類、ペプシンのような酸プロテアーゼ類、金属プロティナーゼ類、たとえばテル モリシンのようなカルシウム依存性金属ブロティナーゼ類及びパパイン、クロス トリパインのようなスルフィドリルプロテイナーゼ類が挙げられる。

特に有用な加水分解酵素は、金属プロティナーゼ類、とりわけテルモリシンであ る。

必要であれば、加水分解酵素は固定化されていてもよい。たとえば、従来の方法 を用いて、セルロース、ポリ着していてもよく、あるいは、ポリアクリルアミド もしくはアルギン酸エステル繊維のような適当なマトリックス中に取り込まれて いてもよい（たとえばＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｘ７ｍｏｌｏｇｙ　　４４、ｃ ｄ、　Ｋ、１Ｊｏｓｂｘｃｈ、　Ａｃｘｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｌｋ、　　１９７６参照）。

本発明の方法は特にヒトＣＧＲＰの製造に有用であり、好ましい態様として、本 発明者らは、加水分解酵素の存在下で、Ｃ末端が切断されたヒトＣ０ＲＰ又はそ の保護された誘導体を、Ｃ末端がアミド化されたペプチド、アミノ酸又はアンモ ニアと反応させて、該ＣＧＲＰ又は保護された誘導体を蓄積させ、その蓄積した ＣＧＲＰ又は保護された誘導体を回収し、必要に応じて、その保護さ発明の本態 様においては、ＣＧＲＰ生産物はたとえば、ヒトβ−ＣＧＲＰ又は特に、ヒトα −ＣＧＲＰ、又はそのアナログもしくは保護された誘導体であってもよい。

発明の本態様において用いられる出発物質は、ｄｅｓＰ　ｈ　ｅ　　Ｎ　Ｈ２Ｃ Ｇ　ＲＰ　（ここでＣＧＲＰはヒトＣＧＲＰの最初の３６個のアミノ酸を表す） 及びＰｈｅＮ　Ｈ２であり、加水分解酵素はテルモリシンであることが好ましい 。

本発明の方法において、用いられる正確な条件は酵素と出発物質の性質に依存し 、従来の慣例に従って、小規模で、あらかじめ実験的に決定する必要があろう。

一般的に、出発物質の酵素触媒型加水分解のような、望ましからざる副反応の出 現をできるだけ避けるべく　［たとえば以下に述べるように反応溶媒、ｐＨ９酵 素濃度のような変数を調整することによりコ条件が選ばれる。

本発明の方法は適当な溶媒、たとえば水混和性有機溶媒を含有する水性媒体中で 実施してもよい。適当な有機溶媒としては、たとえば、ブタン−１，４−ジオー ルのヨウナクリコール類、ジメチルホルムアミドやＮ、Ｎ−ジメチルアセトアミ ドのような置換型アミド類、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフランのよう なエーテル類、メタノールやエタノールのようなアルカノール類が挙げられる。

反応溶液のｐＨは、用いるために選ばれた酵素によるであろうが、一般にはｐＨ ３，５からｐＨ１０，５の範囲である［使用される反応溶媒との関係上、ｐｕは みかけのｐＨであるといえようつ。反応溶液の温度は０℃から８０℃たとえば１ ５℃から４５℃の範囲で変えてもよい。

出発物質であるｔ−ＣＧＲＰ及びＣ末端がアミド化されたペプチド又はアミノ酸 は、公知の、容易に入手できる化合物であるか、又は公知の方法を用いた化学的 な、もしくは組替えＤＮＡの技術により調製してもよい（たとえば欧州特許明細 書第１８８４００参照）。加水分解酵素は従来のソースから得たものでもよい。

本発明の方法においては、出発物質と加水分解酵素とは一般に反応溶媒にどうい う順序で添加してもよいが、酵素は最後に添加するのが好ましい。出発物質はＬ 体、必要であれば０体とＬ体との混合物であってもよい。出発物質の一方又は両 方を、反応溶媒への添加に先立ち、最小体積の水またはその他の、たとえば上述 の、適当な溶媒に溶かすことも必要であろう。使用する出発物質及び加水分解酵 素の正確な量は、基質と酵素の性質により、広い範囲内で変えてもよいが、たと えば約１：５から約１＝５０まで、たとえば約１：１０から約１：２５までの酵 素−基質比にわたってもよい。反応成分が溶媒中に混合されてしまうと、反応は 十分な量の所望の生産物が蓄積するまで進行し得る。過程中の生産物の生成は従 来の技術を用いて、たとえば逆相高速液体クロマトグラフィーによってモニター してもよい。十分な量の所望の生産物が蓄積すれば、それを混合物からポリペプ チド類を回収するための従来の技術を用いて回収してもよい。たとえば、高速液 体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマト グラフィーのようなりロマトグラフィーによって回収してもよい。

生産物が保護されたＣ０ＲＰである場合には、酸加水分解のような標準的な脱保 護化法を用いて脱保護化を施し、所望のＣ０ＲＰ生産物を得てもよい。

具体例の記載 以下の例は本発明を説明するものである。

例においてｒｐＨＪとは、ラジオメーター標準水溶液を用いてｐＨ４，０と７． ０で較正したガラス電極（Ｒｕｓｓｅｌｌ標準組合せ電標準上デルＣＭＡＷＬ） で示された値であり、他の補正は行わなかった。温度はすべて℃で表示されてい る。全部の例において、ヌクレオチドの溶解を容易にするため攪拌または超音波 照射が必要でヒトα−ＣＯＲＰのテルモリシン触媒による調製１体積部の水を９ 体積部のブタン−１，４−ジオールに完全に混合しながら加えて、９０％ブタン −１，４＝ジオールを調製した。このジオール溶液（２，Ｃ１ｅｌ）にＬ−Ｐｈ ｅ−Ｎｌ２　　（Ｓｉｇｍａ　　；　３２８．　４ｍｇ）を溶カルた。アミノ成 分のｐＨは氷酢酸（０，２５ｍ１）の添加によりｐＨ６，０に調整した。水（０ ，０４ｍ＋）にｄｅｓＰ　ｈ　ｅ　−Ｎ　Ｈ２−ヒト−ａ−ＣＧＲＰ　（１，０ ｍｇ）を溶かし、アミノ成分（０，２ｍ１）を継続的に攪拌しなからゆっ１くり と添加した。

テルモリシンの溶液は０．ＩＭ酢酸カルシウム中５０■／　ｍｌの濃度で調製し た。この溶液０．００２ｍ１を反応溶液に添加し、酵素が十分に分散するように した。混合物を２２°で２０時間反応させた。等体積の酢酸を添加して反応を停 止させ、次に２体積部の０．１％トリフロロ酢酸で混合物を希釈した。それから 混合物を下記の条件下で逆相ＨＰＬＣを行うことにより分析した。

カラム：　Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　５１１１Ｍ％　３００　Ａ、　Ｃ８（Ｍｍｃｈ ｅｒ７Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｔｅｎ、Ｗｅｓｔ　ＧｅｒｍｘｎＴ）　、２５０　ｘ　 ４ｍ、直線勾配置０〜６０％　Ｂ１５０分。

Ａ：水に溶かしたトリフロロ酢酸１．０ｇ　（ＨＰＬＣグレード） Ｂニトリフロロ酢酸ｉ、Ｏｇ、水１００ｍ１．アセトニトリル９００ｍ１０ ペプチド物質は２１５ｎｍでのＵＶ吸光度で決定した。

ヒトα−ＣＧＲＰに対応すると思われる物質を７０％の収率で集め、ＦＡＢ−Ｍ Ｓ　（質量ピーク：３７８９．２）でヒトａ−ＣＧＲＰであることを確認した。

α−ＣＧＲＰを用いたヒトα−ＣＧＲＰのテルモリシン触媒による調製 ブタン−１，４−ジオールの代わりに５０％ジメチルスルホキシド水溶液を用い 、反応時間を３３°で４時間に減少させたほかは例１に準じた過程を繰返した。

逆相ＨＰＬＣとＦＡＢ−ＭＳ　（条件は例１参照）で分析したところ、ヒトα− ＣＯＲＰが３０％の収率で得られた。

例３ ブタン−１，４−ジオール中におけるＡｌａ−Ｐｈｅ　−ゼ触媒による調製 した（例１参照）。ｐｌは固体ＴＲｌ５を注意深く添加することにより５．５に 調整した。

ｄｅｓ　　Ａｌａ−ＰｈｅＮＨ２−ヒト−ａ−ＣＧＲＰ（１，０■）を０．１ｍ ｌのアミノ成分に溶かした。

０．４５■のりジルエンドペプチダーゼ（アクロモバクタ−プロテアーゼ■）を 水（０，０４５ｍ１）に溶かし、０．００４ｍ１を反応混合物に添加した。溶液 を完全に混合し、２２°で４時間放置した。次いで等体積の酢酸を添加して反応 を停止させ、−さらに２体積部の０．１％トリフロロ酢酸で希釈した。ＨＰＬＣ とＦＡＢ−ＭＳ　（条件については例１参照）で分析したところ、ヒトα−ＣＧ ＲＰが７０％の収率で得られた。

Ｌ−Ａｌａ−ＰｈｅＮＨ２（２７１，６ａ＋ｇ）をＮ、　Ｎ−ジメチルアセトア ミド（８０％；２．０ｍ１）に溶かし、固体ＴＲｌ５を添加してｐＢを５．５に 調整した。次に例３と同様に反応を行い、α−ＣＧＲＰを５０％の収率で得た（ ＨＰＬＣで集め、ＦＡＢ−ＭＳでキャラクタリゼーシジンを行った一例１参照） 。

国際調査報告 国際調査報告

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．加水分解酵素の存在下で、Ｃ末端が切断されたカルシトニン遺伝子ペプチド 又はその保護された誘導体を、Ｃ末端がアミド化されたペプチドもしくはアミノ 酸、またはアンモニアと反応させて該カルシトニン遺伝子関連ペプチドまたはそ の保護された誘媒体を蓄積させ、その蓄積したカルシトニン遺伝子関連ペプチド または保護された誘導体を回収し、必要な場合は、保護された誘導体を脱保護化 することを含むカルシトニン遺伝子関連ペプチドの製造方法。
2. ２．加水分解酵素がセリンプロテアーゼ、酸プロテアーゼ、金属プロテイナーゼ またはスルフィドリルプロテイナーゼである請求の範囲１記載の方法。
3. ３．加水分解酵素が金属プロテイナーゼである請求の範囲２記載の方法。
4. ４．加水分解酵素がテルモリシンである請求の範囲３記載の方法。
5. ５．カルシトニン遺伝子関連ペプチドが天然カルシトニン遺伝連ペプチドまたは そのアナログのアミノ酸配列を有している、上記請求の範囲のいずれかに記載の 方法。
6. ６．カルシトニン遺伝子関連ペプチドが哺乳類のカルシトニン遺伝子関連ペプチ ドまたはそのアナログである請求の範囲５記載の方法。
7. ７．カルシトニン遺伝子関連ペプチドがヒトα−もしくはβ−カルシトニン遺伝 子関連ペプチドまたはそのアナログである請求の範囲６記載の方法。
8. ８．カルシトニン遺伝子関連ペプチドがヒトα−カルシトニン遺伝子関連ペプチ ドである請求の範囲７記載の方法。
9. ９．テルモリシンの存在下で、ｄｅｓ−ＰｈｅＮＨ２−ヒトα−カルシトニン遺 伝関連ペプチドまたはその保護された誘導体をＰｈｅ−ＮＨ２と反応させて該ヒ トα−カルシトニン遺伝子関連ペプチドまたはその保護された誘導体を蓄積させ 、その蓄積したヒトα−カルシトニン遺伝子関連ペプチドまたは保護された誘導 体を回収し、必要な場合は、保護された誘導体を脱保護化することを含むヒトα −カルシトニン遺伝子関連ペプチドの製造方法。
10. １０．出発物質加水分解酵素とが水混和性有機溶媒を含有する水性媒体中で反応 する上記請求の範囲のいずれかに記載の方法。