JPS58500739A - インシユリン誘導体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インシュリン誘導体の製造法 技術分野 本発明はインシュリン誘導体の新規製造法に関する。

背景技術 長年にわたって糖尿病はインシュリンで治療されて来た。

ヒトインシュリンで人体を治療することが自然である；しかしながらこれは現実 の大きな要求量からみてこれは不可能である。従って実際的な理由から牛インシ ュリンおよび豚インシュリンが使用されている。しかしながら多かれ少なかれこ れらのインシュリンは人体中で抗体の形成を生ぜしめる、これは例えばそれ以上 のインシュリン治療の効果を減せしめることをもたらす。

この欠点は一部相容れない性質によって、牛／豚インシュリン中のいわゆる「不 純物」によって一部生せしめられるものと推量されている。後で他の動物インシ ュリン分子とは異なるヒトインシュリン分子量中でアミノ酸順序における一定の 小さな非類性を明らかにする。

極く最近の精製法の導入後インシュリン製剤について大きな改良が得られた、し かし人体中での抗体の形成はなお生じうる。これは他の動物インシュリンの代り にヒトインシュリンを使用することによっていやすことができると信ぜられてい る。

ボダンスッキー等の米国特許ｖＪ３２７６９６１号には、過剰のスレオニンの存 在下、酵素例えばカルボキシベプチ（２）　’、表昭５８−５００７３９（２） ダーゼＡまたはトリプシンの作用によって他の動物インシュリンからヒトインシ ュリンを製造する方法が記載されている。しかしながら、この先行技術の方法の 使用によってはヒトインシュリンは評価しうる程度で作ることはできない。これ は多分、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＡがりジル−アラニンペプチ ド結合（Ｂ２９−Ｂ３０）のみならずインシュリン中の他の位置も作用条件下に 加水分解するという事実によるものである。

トリプシンはりジル−アラニン結合（Ｂ２９−　”　３０　）よりもアルギニル −グリシンペプチド結合（８２２−８２３）をむしろ加水分解する、一方カルボ キシペブチダーゼＡはＡ鎖のＣ−末端でアスパラギンを分裂させることなくＢ鎖 のみのＣ−末端でアラニンを分裂させることができない。

アスパラギン放出を妨げるため特別の条件即ち重炭酸アンモニウムバッファ溶液 中での反応が必要であることが後に示された（ホップーセイラーの論文、ツァイ ッシュリフッ・上コア・フィジオロジッシェ・ヘミー第３５９巻第７９９頁〜第 ８０２頁、１９７８年参照）。更に作用条件下では加水分解反応速度がペプチド 合成の速度より大であるから、重要なペプチド形成は殆ど生じない。それが米国 特許第３２７６９６１号の各実施例においてボダンスッキーがヒトインシュリン としてでなく、変換された亜鉛インシュ・り現在まで一つの同じ工程で望ましか らぬアミノ酸（Ｂ−３Ｑ　Ａｌｍ　）をＢ−３０テｈｒで交換する方法は知られ てぃな（３） い。

しかしながらいくつかの別々の工程を含むヒトインシュリンの製造法は知られて いる、例えばルッターベルクの米国特許第３９０３０６８号（１９７５年）、お よびホップーセイＪラーの論文、ツアイツシュリフツ・上コア・フイジオロジツ シエ・ヘミ−第３５７巻第７５９頁〜第７６７頁（１９７６年）参照。

上記に関し、これらの方法はアルギニルーグリシンペプリン中のＢ−２３−３０ 位に相当する合成オクタペプチドとデスオクタペプチド−（Ｂ−３０）豚インシ ュリンの縮合を含んでいる。しかしながら第一工程でアルカリ性加水分解を行な っており、これは望ましからぬ副反応を伴う。

第二工程は多くの副反応を生せしめ、複雑な精製法を特徴とする特定反応を含ん でいる。従ってこれらの方法は工業的規模で使用するのには適していない。

最後にネイチャー第２８０巻、１９７９年８月２日号第４１２頁〜第４１３頁、 およびバイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーシ ョン１９８０年１月２９日号、第９２　（２１巻第３９６頁〜第４０２頁（何れ もモリハラ等による）には重炭酸アンモニウムバッファーの存在下２５℃で８時 間豚インシュリンをカルボキシペプチダーゼで処理するとデスアラニンインシュ リン（ＤＡＩ　）を生ぜしめこれを分離するようＢ−３０アミノ酸を交換する方 法か記載されている。次に約６０％の量で有機溶媒を（４） （Ｔｈｒ−ＯＢｕ　）の溶液にトリプシンを加えてカップリングを行ない、その 後反応を３７℃で２０時時間待させて（Ｂ　３　Ｑ　−Ｔｈｒ　−ＯＢｕ　）豚 インシュリンを形成し、分離している。最後に保護基（ブチルエステル）をアニ ソールノ存在下トリフルオロ酢酸で分裂させている。

有機溶媒の存在下および保護されたカルボキシル基を有する過剰のアミノ酸の存 在下に、蛋白分解酵素でインシュリンを処理し、その後場合によってはカルボキ シル保護基を分裂させることによって、デスーＢ３０インシュリンの前もっての 分離することなく一工程で別のアミノ酸をＢ−３０アミノ酸と交換することが、 短い反応時間を用い工業的規模でできることをここに見出した。

従って本発明方法は、有機溶媒の存在下および保護されたカルボキシル基を有す る過剰のアミノ酸の存在下蛋白分解酵素でインシュリンを処理し、高純度および 許容しうる収率でＢ−３Ｑ−Ｔｈｒ−インシュリン誘導体を形成することを特徴 とする。反応は長い反応時間を使用することもできるが約１時間内で完成できる 。

本発明の方法における蛋白分解酵素としてトリプシンまたはそれに関連した酵素 を使用できる。

本発明方法が一工程で直接的に実施できること、形成されたインシュリン誘導体 が未反応インシュリンから容易に分離できること、それらのみならず蛋白分解酵 素としてト（５） リプシンを用いたときインシュリンのかなりの８２２−アルギニンでの分解が生 ずることがないこと（ホツプーセイラーのツアイツシュリフツ・ヒュア・フイジ オロジツシエ・ヘミ−第３５７巻第７５９頁〜第７６７頁、１９７６年参照）は 驚くべきことである。

本発明の目的は豚インシュリンからヒトインシュリンを製造するのに好適である 。本発明方法における原料として精製していないインシュリンさえも使用できる 。治療用インシュリン製剤に使用できる純粋な形で未反応インシュリン出発生成 物が得られる。勿論未反応インシュリン出発生成物は原料として再使用すること もできる。更に製造されたヒトインシュリンは、未精製豚インシュリン生成物か ら一工程でかなりの収率でかつ高純度で得られる。従って本発明方法は工業的規 模でインシュリンを製造するのに好適である。

本発明方法においては、保護されたカルボキシル基を有する変換されたインシュ リンが形成され、この変換されたインシュリンは反応混合物から分離でき、良く 知られたクロマトグラフ法で未反応インシュリンから分離できる。続いてカルボ キシル保護基を分裂させることによって純粋な形で変換されたインシュリンが得 られる。

Ｂ−３０位で導入されたアミノ酸のカルボキシル基は別のエステルおよびアミド の形で保護してもよい、しかしながらこれを選択するときは、保護基を除去する に当って使用すべき条件でインシュリンの安定性に注意を払うべきで（６）　特 表昭５８−５００７３９（３）ある。ｔ−ブチルエステルが特に好適である、何 故なら分裂がトリフルオロ酢酸によって行なうことができるからである、しかし 他のエステルおよびアミド基は注意深く、所望によっては酵素的接触加水分解に よって除去することもで灸る。

本発明方法で使用する酵素はリジンカルボニルペプチド結合を分裂しつるもので なければな、らない、従って、トリプシンまたはそれに関連した酵素、例えばア クロモバクタ−プロテアーゼ■を使用できる、上記酵素の製造および性質はマサ キ等によってアグリカルチラル・アンド・バイオロジカル・ケミス°トリー第４ ２巻（１９７８年）、第１４４３頁〜第１４４５頁に記載されている。所望によ っては、酵素は、キモトリプシン様酵素で生じることのある汚染ヲ除＜ため、ト シル−Ｉｔ−フェニルアラニンクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ　）で処理しても よい。酵素は溶解した形で使用してもよい、しかし不溶性マトリックス例えばア ガロースまたはポリアクリルアミドまたは同様の重合体物質に結合させてもよい 。

反応は進行すべきペプチド形成反応のため、酵素接触加水分解を充分に抑制する 条件の下で実施する。ｐＨは５〜１゜の間でなければならず、好ましくは６〜９ である。温度は４〜５０℃の範囲とすべきであり、好ましくは２ｏ〜４０℃とす べきである。

反応成分の濃度、即ち出発インシュリンおよびアミノ酸（７）　′ ２００　：　１まで、好ましくは５０：ｌ〜１５０：１の範囲で大過剰で使用す べきである。

反応は水混和性有機溶媒の存在下に行なう、これによって加水分解反応が妨害さ れ、反応成分の溶解度が改良される。。有機溶媒はジメチルホルムアミド、アセ トアミド、ジメチルスルホキサイド、エタノール、グリセリンおよび同様溶媒で あることができ、所望によってそれらの混合物の形であることができる。有機溶 媒の濃度は、反応混合物の全容量を基にして１０〜８０％、好ましくは３０〜７ ０％の範囲で選択すべきである。

反応時間は反応条件によって選択する、しかし通常は２４時間を越えない、通常 それは約１〜４時間である。

発明を実施するための形態 本発明方法を下記実施例によって更に説明する。

実施例　１ ２００岬の豚インシュリン詔よび４００ＱのＬ−スレオニンｔ−ブチルエステル アセテートを、２．２−のエタノールおよび１．４−の０．５　Ｍ　）リス−ア セテートバッファー（ｐＨ＝７．５）の混合物に溶解した。この溶液に２０■の ’Ｉ’ＰＣＩ処理トリプシンを加え、混合物を３７℃で２時間保った。

次いでＩＯＮ酢酸を添加することによってｐＨを３に規制して反応を停止させた 。

反応混合物の高圧液体クロマトグラフ分析は１８％の変換を示した。

反応混合物を１Ｍ酢酸でセファデックス（登録商標）Ｇ−（８） 遇した。

次いで反応生成物を、０．０２Ｍ）！Ｉスおよび７Ｍの尿素からなり、塩酸でｐ Ｈを８．１に調整したバツ、ファーで７５１１／ｈｒで平衡させたＤＢＡＩセル ロース（ワットマンＤｉ！−３２）のカラムで４℃でイオン交換した。生成物の 仕込が完了したとき、カラムを上述したバッファー溶液を用いて２．５＃！間、 その後１１について０．００４５モルの塩化ナトリウムとの混合物の形の上述し たバッファーを用いて２時間、および最後に１１について０．０１１モルの縦孔 ナトリウムとの混合物の形での前者のバッファーを用いて１２時間溶離した。

溶出液は二つの蛋白質主画分を含有していた。最初溶出した両分を高圧液体クロ マトグラフィでヒトインシュリンエステルであると同定され、その後溶離した両 分＆妹反応豚インシュリンであると同定された。

集めた両分をセファデックス（登録商標）Ｇ−２５のカラムで０．１Ｍ酢酸で脱 塩し、凍結乾燥して２８■のヒトインシュリンｔ−ブチルエステルおよび１２０ Ｆの未反応豚インシュリンを得た。

形成されたインシュリンｔ−ブチルエステル（２８１Ｆ）を０．２−のアニゾー ルとの混合物の形の２−のトリフルオロ酢酸に溶解し、混合物を常温で２５分間 保った。トリフルオロ酢酸をロータリー蒸発機で減圧上除去し、残渣を１０−の エーテルで３回抽出し、アニゾールを除去した。減圧下（９） 乾燥したとき、２５■の純粋ヒトインシュリンを得た、そしてアミノ酸分析およ び高圧液体クロマトグラフィで同定２００■の豚インシュリンおよび４００■の Ｌ−スレオニンｔ−ブチルエステルアセテートを２．２−のジメチルホルムアミ ド中に懸濁し、次いで２０■のＴＰＣＩ処理したトリプシンを含有する１、４− の０．５Ｍ）リス−アセテートバッファー（ｐＨ７，０）を加えた。反応混合３ ７℃で３時間保ち、次いでＩＯＨの酢酸を加えてｐＨを３に調整して反応を停止 させた。反応混合物の高圧液体クロマトグラフ分析は６％の変換を示した。生成 物混合物を実施例１の方法を用いて分離し、分別し、１０■のヒトインシュリン ｔ−ブチルエステルおよび１４０■の未反応豚インシュリンを得た。

分離したヒトインシュリンｔ−ブチルエステル（１０■）をトリフルオロ酢酸お よびアニゾールで実施例１に述べたのと同じ方法で処理し、８．０■の純粋なヒ トインシュリン１００■の豚インシュリンおよび２００ｓｖのＬ−スレオニンメ チル、エステルに、１．４−の９６％エタノールおよび０４−の０．２５Ｍ）リ ス−アセテートバッファー（ｐＨ＝６．５）を加えた。次いで１５（ｌｆの５Ｎ 塩酸詔よび２００μｌの０．２５　Ｍのトリス−アセテートバッファー（ｐＨ＝ ６．５）に溶解した５■の豚インシュリンを加えた。

（１０）　特表昭５８−ｓｏｏ７３９（４）混合物を３５℃で１時間保ち、その 後反応をＩＯＮの塩酸を加えてｐＨを約３として停止させた。

反応混合物の高圧液体クロマトグラフ分析は４５％のヒトインシュリンメチルエ ステルの収率を示した。

反応混合物を実施例１に記載したのと同じ方法で精製した。その後高圧液体クロ マトグラフィで同定した、形成されたヒトインシュリンメチル手ステルを含有す るイオン交換からの溶出液をセファデックス（登録商標）Ｇ−２５のカラムで脱 塩した。カラムを０．０５Ｍの重炭酸アンモニウム水溶液を用いて溶離し、形成 された溶出液を稀薄アンモニア水でｐＨを９，５に調整し、その後混合物をエス テルの完全分解のため２５℃で４８時間保った。

加水分解混合物の凍結乾燥して３７ｑ）の純粋なヒトインシュリンを得た、これ はアミノ酸分析および高圧液体クロマトグラフィで測定した。

１００ｖの豚インシュリンおよび２００■のＬ−スレオニンメチルエステルに、 １−のジオキサンおよび０．５ＩＩＩＩ！！の０．２Ｍ）リス−アセテートバッ ファ＝（ｐＨ＝７．５）を加えた。次いで５μｌの５Ｎ塩酸のみならず０．５− の０．２Ｍ）リス−アセテートバッファー（ｐＨ＝７．５）に溶解した１０■の 牛トリプシンを加えた。

混合物を３５℃で４５分間保ち、その後反応をＩＯＮの塩酸を加えてｐＨを約３ として停止させた。

（１１） トインシュリンメチルエステルの収率を示した。

反応混合物の精製およびインシュリンメチルエステルの分析は実施例１に記載し た方法と同じ方法で実施した。加水分解混合物の凍結乾燥して、３０ｑの純粋な ヒトインシュリンを得た、これはアミノ酸分析および高圧液体クロマトグラフィ で測定した。

実施例　５ １００岬の豚インシュリンおよび２００ｑのＬ−スレオニンアミドを１．５−の ６５％エタノールに溶解し、その後５Ｎ塩酸を加えてｐＨを７．５に調整した。

その後０．５−の水中の１０■のトリプシンの溶液を加え、混合物を３５℃で１ 時間保った。次に５Ｎの塩酸を加えてｐＨを３に調整して反応を停止させた。反 応混合物の高圧液体クロマトグラフ分析は３７％の変換率を示した。

生成物混合物を実施例１に記載した方法を用いて分離し、分別した。収量＝３０ ■のヒトインシュリンアミド。

実施例　６ ２５０μｔ１ｇのＬ−スレオニンメチルエステルおよび１００μｔの氷酢酸を５ ００μｌのジメチルホルムアミドおよび４００μｌの水の混合物に溶解した。６ ０−の豚インシュリンをこの混合物に溶解し、その後撹拌しつつ７００μｌの水 中の３■のトリプシンの溶液を加えた。ｐＨ６，５であった透明溶液を３時間２ ０℃で保ち、その後１ＯＮ酢酸を用１．）てｐＨを約３に調整して反応を停止さ せた。

反応混合物の高圧液体クロマトグラフ分析は２３％の変（１２） 損率を示した。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、有機溶媒の存在下および保護されたカルボキシル基を有するアミノ酸の過剰 の存在下に蛋白分解酵素でインシュリンを処理することを特徴とする酵素作用の 下でＢ鎖のＣ−末端アミノ酸を交換してインシュリン誘導体を製造する方法。 ２、蛋白分解酵素としてトリプシンまたはその関連酵素を使用する請求の範囲第 １項記載の方法。 ３、蛋白分解酵・素としてトリプシンを用いる請求の範囲第２項記載の方法。 ４−蛋白分解酵素としてアクロモバクタ−プロテアーゼを用いる請求の範囲第２ 項記載の方法。 ５、約１〜約４時間、約り０℃〜約４０℃の温度で反応を行なう請求の範囲第１ 項記載の方法。 ６、約５〜約１０の範囲のｐＨで反応を行なう請求の範囲第１項記載の方法。 ７、有機溶媒として低級１価または多価アルコール、低級カルボン酸のアミドま たはジメチルスルホキサイドを用いる請求の範囲第１項記載の方法。 ８、　インシュリンとして豚インシュリンを用いる請求の範囲第１項〜第７項の 何れか一つに記載の方法。 ９、　保護されたカルボキシル基を有するアミノ酸としてＬ−スレオニンを用い る請求の範囲第１ＩＪＩ〜第８項の何れか一つに記載の方法。 １０、カルボキシル保護基としてｔ−ブチルエステル基、他の範囲第１項〜第９ 項の何れか一つに記載の方法。 （ｉ　）