JPS6246560B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はインシユリン誘導体に関するものであ
り、詳しくはＢ鎖22位のアルギニンが保護基で修
飾されているインシユリン誘導体に関する。

インシユリンは糖尿病の治療薬として代替品の
ない貴重な薬物であり、現在主として牛インシユ
リンおよび豚インシユリンが治療に用いられてい
る。しかし、これらのインシユリンは構成アミノ
酸の一部が人インシユリンと異なつているため、
体内で抗体が産生されることがあり、抗体が産生
されるとそれ以後のインシユリンの治療効果が著
しく低下するなどの問題を生じる。したがつて、
工業的規模で行いうる人インシユリンの合成方法
の確立が強く希まれている。

豚インシユリンは人インシユリンとＢ鎖の30位
のアミノ酸が異なつているが、本発明者はこの相
違するＢ鎖30位のアミノ酸を人インシユリンの30
位アミノ酸であるスレオニンに置換する方法を発
見し、本発明を確立した。

上記の方法によれば、人インシユリンとＢ鎖30
位のアミノ酸のみが異なる豚インシユリンを原料
に用いて人インシユリンを容易に合成することが
できる。このようにして得られる人インシユリン
が理想的な治療用インシユリンであることは論を
俟たない。

既に豚デスオクタペプチドインシユリンと人イ
ンシユリンオクタペプチドから人インシユリンを
得る試みはエム・エー・ルツテンベルグ（M.A.
Ruttenberg）によりサイエンス（Science）177
巻623頁（1972年）に、アール・オーベルマイヤ
ー（R.Obermeier）らによりサイツシユリフト・
フユア・ヒジオロジツシエ・ヘミー（Z.Physiol.
Chem。）357巻759頁（1976年）に示されている
が、何れも化学的手段によるものであり、前者に
おいては工程の最後にアルカリ処理を含み、これ
に伴う副反応がさけられない。また後者の場合は
反応が非特異的で多くの副反応を生じるため、精
製が複雑かつ困難となり収率も著しく低い。従つ
て、工業的規模では到底行い得ない。

本発明者らの方法は酵素によるインシユリン合
成法で、公知の化学的手段によるものと異なり、
反応が特異的で副反応を生ぜずラセミ化が起きず
未反応原料も損傷なしに回収できるなどの利点を
有する。

上記の方法は、トリプシンまたはトリプシン様
酵素の作用により、Ｂ鎖22位のアルギニンが保護
基で修飾されておりＢ鎖30位のアミノ酸が欠けて
いるインシユリン（下記の一般式で表わされ、
以下化合物と記す）に下記の一般式で表わさ
れるＬ−スレオニン誘導体（以下化合物と記
す）を縮合させ、得られた化合物（下記の一般式
で表わされ、以下化合物と記す）の保護基を
除去することよりなる。

（式中、R³はグアニジノ基の保護基を表わ
す。） （式中、R¹は水素、R²はカルボキシル基の保
護基を表わす。） （式中、R¹，R²およびR³はそれぞれ前記と同
意義を表わす。） なお、上式に用いられているアミノ酸はすべて
Ｌ型であり、下記の意味を有する。

Ala アラニン Arg アルギニン Asp アスパラギン酸 Asn アスパラギン Gln グルタミン Glu グルタミン酸 Gly グリシン His ヒスチジン Ile イソロイシン Leu ロイシン Lys リジン Pro プロリン Phe フエニルアラニン Ser セリン Thr スレオニン Tyr チロシン Val バリン Cys システイン 上記の化合物は、(1)先ず、豚より得たインシ
ユリンを用いてそのＢ鎖22位に位置するアルギニ
ンのグアニジノ基に保護基を導入したのち酵素を
作用させて30位のアミノ酸を切断する、または(2)
豚より得たインシユリンに酵素を作用させてデス
−B30−インシユリンとしたのち22位のアルギニ
ンのグアニジノ基を修飾することにより製造しう
る。

グアニジノ基の保護基導入は、２，３−ブタジ
オン、１，２−シクロヘキサンジオン、フエニル
グリオキサール、２，４−ペンタジオンなどを、
必要に応じてホウ酸イオンの存在下に反応させて
実施する。詳細は生化学実験講座１ タンパク質
の化学（日本生化学会編、東京化学同人）34−
41頁に記載されている。

(1)の方法を行う場合はトリプシンでＢ鎖30位の
アミノ酸を切断するとよい。グアニジノ基の修飾
法は、エム・ローゼンブラツト（M.
Rosenblatt）らによりバイオケミストリー
（Biochemistry）17巻3188頁（1978年）に示され
ている。すなわち、原料となるインシユリンの溶
液に１，２−シクロヘキサンジオンを加え、
0.2M硼酸塩（PH９）存在下40℃で１〜４時間ま
たは室温で一晩反応させた後クロマトグラフイ
ー、透析法などで精製し、得られた〔N⁷，N⁸−
（１，２−ジヒドロキシシクロヘキシレン−１，
２）（以下DHCHと略記）−アルギニン−B22〕−
インシユリンに0.2M硼酸塩（PH８）存在下でト
リプシンを加えて40℃で１〜３日作用させ、化合
物を得る。

また(2)の方法により、例えば、カルボキシペプ
チターゼＡを用いて豚インシユリンよりデス−
B30−インシユリン（豚型）が得られる。この方
法は、イー・ダブリユー・シユミツト（E.W。
Schmitt）らによりホツペーセイラーズ、サイト
シユリフト、フユア・ヒジオロジツシエ・ヘミー
（Hoppe−Seyler′s Zeitschrift f″ur
Physiologische Chemie）359巻799頁（1978年）
に記載されている。ついで、この豚由来のデス−
B30−インシユリンにおいて、Ｂ鎖22位のアルギ
ニン側鎖を修飾し、化合物を調製する。

一般式で示されるＬ−スレオニン誘導体（以
下化合物と記す）は通常の化学的方法で合成さ
れるが、その側鎖官能基であるヒドロキシ基は保
護されていても保護されていなくてもよい。保護
する場合にはペプチド合成反応で通常用いうる保
護基などを用いるとよい。化合物のカルボキシ
ル基は保護されていることが必須で、通常用いら
れるカルボキシル基保護基を使用する。例えば、
ｔ−ブチルやベンジルなどのアルキルやアラルキ
ルエステル、アミド、アニリノなどの置換アミ
ド、さらに塩などの形で修飾するとよい。

上記の保護基の選択においては、それらの保護
基の導入または脱離処理について、インシユリン
が変性したり失活したりしないものを選択するこ
とを考慮すべきである。ペプチド合成に用いられ
る保護基については、エム・ボタンスツキーら
（Ｍ。Bodanszky et al.）のペプチドシンセシス
（Peptide Synthesis）第２版（1976年）（ジヨ
ン・ウイリー・アンド・サンズ（John Wiley
＆ Sons））に詳しく記載されている。

なお、保護基の選択においては、一度の保護基
脱離処理によつて同時に除去できるものを選択す
ることが好ましいことは当然である。

化合物と化合物の縮合反応はトリプシンま
たはトリプシン様酵素のペプチド結合形成反応に
適した条件で行なわれる。PHは５〜８、特に６〜
７付近が好ましく、反応温度は０〜50℃、とくに
20〜40℃がよい。化合物と化合物の濃度は可
能なかぎり高いことがのぞましい。さらに化合物
と化合物は１：１〜100：１のモル比で反応
させるのがよく、とくに20：１〜100：１付近が
よい。反応液には水と混合しうる適当な有機溶媒
を加える。有機溶媒の添加は、反応液中の水の濃
度を下げて、逆反応である加水分解反応を抑える
だけでなく、化合物および化合物の溶解性を
著しく高める点で効果がある。有機溶媒として
は、例えば、メタノール、エタノール、ジメチル
ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、グリセリ
ンなどを単独でまたは組合せて用いる。とくに０
〜65％、とくに40〜60％の濃度で用いるとよい。
一般に有機溶媒を用いる場合は、原料の溶解度、
酵素の変性や加水分解反応などを考慮して水に対
する割合を決定する。反応液の緩衝剤としては
DHCH−アルギニン−B22の安定化の為に硼酸塩
が好適である。

本発明で使用する酵素は、各種動物および微生
物起源のトリプシンおよびトリプシン様酵素を含
む。後者の例としては、ストレプトマイセス属菌
から抽出分離されたトリプシン様酵素がある。同
酵素については森原らがアーカイブス・オブ・バ
イオケミストリー・アンド・バイオヒジクス
（Arch.Biochem.Biophys.）126巻971頁（1968
年）に、吉田らがエフイービーエス・レター
（FEBS Lett.）15巻129頁（1971年）に記載して
いる。使用する酵素は混在するキモトリプシンま
たはキモトリプシン様の活性を除去する目的でト
シル−Ｌ−フエニルアラニンクロロメチルケトン
（以下TPCKと記す）などで処理することが望ま
しい。

反応液の酵素濃度は基質濃度や酵素の活性で異
なつてくるが、市販結晶トリプシンを用いる場合
は、１mg／ml〜10mg／ml付近がよい。酵素はその
まゝ用いてもよいし、適当な不溶性担体に結合又
は包含させた固定化酵素として用いてもよい。

反応時間は、反応条件により異なるが、通常は
酵素反応が平衡に達するに要する時間をとればよ
く、通常３〜72時間、多くの場合６〜24時間程度
である。

反応終了後反応液から目的の化合物を採取す
る方法は公知の種々の分離手段を用い行いうる。
例えば、反応液をゲル過にかけ未反応の化合物
および酵素を単離回収する。回収した化合物
および酵素はそのまゝ再使用できる。残部に化合
物とデス−B30−インシユリンが含まれる。化
合物は凍結乾燥により得ることができるが、最
終目的物質人インシユリンを得るためには、化合
物を単離せずに、残部にアルギニン保護基の脱
離処理を施したのち適当なクロマトグラフイーま
たはゲル過に付す。生成したＢ鎖末端スレオニ
ンのカルボキシル基が保護されたインシユリン誘
導体とＢ鎖30位のアミノ酸が欠けているインシユ
リン（以下デス−B30−インシユリンと記す）が
分離する。回収したデス−B30−インシユリンは
再びＢ鎖22位のアルギニンを修飾し、原料化合物
として使用することができる。最後にＢ鎖末端
スレオニンのカルボキシル基の保護基をはずし、
最終の目的化合物であるインシユリンを得る。

保護基の脱離方法は用いる保護基により異なる
が、通常の脱離方法に準じて行えばよく、例え
ば、グアニジノ基のDHCH基脱離は1Mヒドロキ
シルアミン（PH７）存在下37℃で１晩放置して行
う。また、ヒドロキシ基やカルボキシル基の保護
基として使用されるｔ−ブチル基はカチオン捕捉
剤（例えば、アニソール）の存在下トリフルオロ
酢酸で処理すると脱離する。前記のように単一の
脱離処理で除去できる保護基を側鎖官能基および
スレオニンのカルボキシル基の保護に用いると脱
離処理が簡単で収率も向上する。カルボキシル末
端がその他のエステル、アミド、置換アミド、塩
などになつている場合も、適当な加水分解処理や
脱塩操作により、保護基を除去できる。

本発明で得られる化合物は上記の如く、人イ
ンシユリンに変換でき、得られた人インシユリン
は先に記載したように血糖降下作用を有する糖尿
病治療薬として有用である。

豚インシユリンより得た人インシユリンはマウ
スにおいて豚インシユリンと同等の血糖降下作用
を有することが認められる。

本発明の化合物より得た人インシユリンは、
市販の豚インシユリンや牛インシユリンと同様に
製剤化し、人に投与される。すなわち、塩化亜鉛
などを加えて安定な亜鉛複合体としたり、リン酸
水素ナトリウムや酢酸ナトリウム等の緩衝剤を加
えたり、等張液とするため塩化ナトリウムを加え
るなど、さらにクレゾール、フエノール、パラオ
キシ安息香酸アルキルエステル（例えば、メチ
ル、エチル、プロピル、ブチルエステルなど）な
どの防腐剤を加えるなどの市販のインシユリン製
剤に用いられる様々な調製法を利用して注射剤と
する。

かかる注射剤の投与量は患者の症状に応じて
種々異なるが、市販のインシユリン製剤の投与と
同様に行えばよく、成人１日約１〜100単位を投
与するとよい。

以下に実施例において、本発明化合物の製造例
を示すが、これら実施例は本発明を何ら限定する
ものではない。

なお、実施例で用いる略号は下記の意味を表わ
す。

OBu^t ｔ−ブチルエステル 実施例 １ (1) 豚由来デス−B30−インシユリン 豚インシユリン500mgを0.1M炭酸水素アンモ
ニウム水溶液（PH8.3）100mlに溶解し、結晶カ
ルボキシペプチターゼＡ（ワーシングトン社
製、ジイソプロピルフルオロホスフエート処
理、49u／mg）５mgを添加して室温で８時間反
応させる。アラニンの生成量は0.77M／1Mイ
ンシユリンである。

反応物を凍結乾燥した後0.5M酢酸に溶解
し、セフアデツクスG50（超微細粒）のカラム
（3.5×95cm）にかけ、0.5M酢酸で溶出する。
１フラクシヨンあたり11.5mlで、第40から60番
目のフラクシヨンを集め凍結乾燥して標記化合
物460mgを集める。収率92％。

6N塩酸で110℃、24時間加水分解したアミノ
酸分析値は下記のとおりである。括弧内の数値
は理論値を表わす。上記の加水分解条件および
表示方法は以下の実施例においても同様であ
る。

Lys1.00(1)，His1.91(2)，Arg0.95(1)，
Asp3.21(3)，Thr2.09(2)，Ser2.97(3)，Glu7.35
(7)，Pro1.25(1)，Gly4.29(4)，Ala1.26(1)，
Val3.86(4)，Ile1.55(2)，Leu6.53(6)，Tyr4.08
(4)，Phe3.22(3)， (2) 豚由来〔B22−Arg（DHCH）〕−デス−B30
−インシユリン 上記生成物200mgを0.25M硼酸塩緩衝液（PH
９）1.7mlに溶解し１，２−シクロヘキサンジ
オン45mgを加え室温で１晩保つ。氷酢酸で酸性
とした後、セフアデツクスG50（超微細粒）の
カラム（６×85cm）にかけ0.5M酢酸で溶出す
る。

280nmの吸収を測定し、対応部を集めて凍結
乾燥し標記化合物168mgを得る。収率84％。な
お、高速液体クロマトグラフイー、スラブ電気
泳動により、アルギニンがほヾ100％DHCH修
飾されていることが確認された。

アミノ酸分析値 Lys1.00(1)，His2.07(2)，Arg※0.27(1)，
Asp3.21(3)，Thr2.05(2)，Ser2.98(3)，Glu7.19
(7)，Pro1.23(1)，Gly3.91(4)，Ala1.29(1)，
Val3.99(4)，Ile1.57(2)，Leu6.57(6)，Tyr3.48
(4)，Phe3.16(3)。

※ 加水分解時にDHCH−Argのほヾ20％が
Argに分解されたと考えられる（パシイ
（Patthy）ら、ジヤーナル・オブ・バイオロ
ジイカル・ケミストリイ（J.Biol.Chem.）
250巻557頁（1975年））。

(3) 豚由来〔B22−Arg（DHCH）、B30−Thr−
OBu^t〕−インシユリン (2)の生産物97.8mg（10mM）とＬ−スレオニ
ンｔ−ブチルエステル酢酸塩211mg（500mM）
をエタノール／ジメチルホルムアミド混液
（１：１，ｖ／ｖ）1.08mlに溶解し、結晶トリ
プシン（ワーシングトン社製、３回再結晶）
4.2mgおよび最終濃度が0.01mMになるように
TPCKを含んだ0.5M硼酸塩緩衝液（PH7.5）
0.72mlと混合し37℃で１晩保つ。最後のPHは
6.5であつた。

氷酢酸で酸性とした後、セフアデツクスG50
（超微細粒）のカラムでゲル過を行い、酵素
活性、280nmの紫外線吸収度、ニンヒドリン反
応によりトリプシン部、インシユリン部、スレ
オニン誘導体部に分ける（第１図参照）。回収
したＬ−スレオニンｔ−ブチルエステルは約50
％であつた。インシユリン部を凍結乾燥し、標
記化合物87mgを得た。

参考例 (1) 豚由来〔B30−Thr−OBu^t〕−インシユリン 上記(3)の生成物85mgを1Mヒドロキシアミン
（PH７）7.5mlに溶解し、窒素ガス置換を行い28
℃で１晩保つたのち0.01Mトリス緩衝液（PH
7.4）に対して冷所で透析する。次いで7M尿素
含有の0.01Mトリス緩衝液（PH7.4）で緩衝化
したDEAE−セフアデツクスA25のカラム（1.9
×24.5cm）により４℃でクロマトグラフイを行
う。上記緩衝液800mlを流したのち食塩濃度を
0.3Mまで上げる濃度勾配溶出を行い、0.08〜
0.09M濃度付近の分画Ａと0.13〜0.14M濃度付
近の分画Ｂを得る。各分画を直ちに0.01M酢酸
アンモニウム溶液に対して冷所で透析し、３−
４日間続けたのち凍結乾燥する。分画Ａより30
mg、分画Ｂより25mgの粉末を得る。高速液体ク
ロマトグラフイ−、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動で前者が標記化合物であり、後者がデス
−B30−インシユリン（豚型）と豚インシユリ
ンの混合物であることが確認された。

(2) 人インシユリンの製造 (1)の生成物28mgにアニソール0.2mlを含むト
リフルオロ酢酸２mlを加え、室温で30分保つ。
窒素気流中でトリフルオロ酢酸を除去したのち
1N酢酸２mlを加えエーテル15mlでアニソール
を抽出する。酢酸部を凍結乾燥し標記化合物26
mgを得る。原料の豚由来デス−B30−インシユ
リンの純度を77％とすると収率38％である。

本品はアミノ酸分析値、スラブゲル電気泳
動、高速液体クロマトグラムより標記の化合物
と同定された。

アミノ酸分析値 Lys1.00(1)，His1.85(2)，Arg0.93(1)，
Asp3.21(3)，Thr2.94(3)，Ser2.96(3)，Glu7.23
(7)，Pro1.23(1)，Gly4.27(4)，Ala1.19(1)，
Val3.89(4)，Ile1.56(2)，Leu6.57(6)，Tyr3.78
(4)，Phe3.18(3)。

【図面の簡単な説明】

第１図は豚由来〔B22−Arg（DHCH）、B30−
Thr−OBu^t〕−インシユリンを分離する際のカラ
ムクロマトグラフイーによる流出パターンを示
す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の一般式で表わされるＢ鎖22位のアルギ
   ニンが保護基で修飾されているインシユリン誘導
   体。 （式中、R¹は水素、R²はカルボキシ基の保護
   基、R³はグアニジノ基の保護基をそれぞれ表わ
   す。）