JPH08269094A - タイマイの甲羅からのタンパク質の分離法並びにその分離法で得られたタンパク質を用いた抗体及びｄｎａ - Google Patents
タイマイの甲羅からのタンパク質の分離法並びにその分離法で得られたタンパク質を用いた抗体及びｄｎａInfo
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- JPH08269094A JPH08269094A JP7097763A JP9776395A JPH08269094A JP H08269094 A JPH08269094 A JP H08269094A JP 7097763 A JP7097763 A JP 7097763A JP 9776395 A JP9776395 A JP 9776395A JP H08269094 A JPH08269094 A JP H08269094A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 希少動物の一つであるタイマイの甲羅を構成
するタンパク質の分離法の確立を行い、そのタンパク質
の物理化学的性質を明らかにし、入手が難しいタイマイ
の生物学的知見の入手、ならびに素材としての甲羅の開
発などを目的としている。 【構成】 タイマイの甲羅から、タンパク質を抽出、分
離し精製を行う。得た二種類のタンパク質の物理化学的
性質により、一つのタンパク質は新規なもので、一方の
タンパク質は鳥類のケラチンに似た新規なタンパク質で
あることを明らかにした。
するタンパク質の分離法の確立を行い、そのタンパク質
の物理化学的性質を明らかにし、入手が難しいタイマイ
の生物学的知見の入手、ならびに素材としての甲羅の開
発などを目的としている。 【構成】 タイマイの甲羅から、タンパク質を抽出、分
離し精製を行う。得た二種類のタンパク質の物理化学的
性質により、一つのタンパク質は新規なもので、一方の
タンパク質は鳥類のケラチンに似た新規なタンパク質で
あることを明らかにした。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、タンパク質の中でもタ
イマイという海ガメの甲羅を構成するタンパク質の分離
法並びにその分離法で得られたタンパク質を用いた抗体
及びＤＮＡに関する。
イマイという海ガメの甲羅を構成するタンパク質の分離
法並びにその分離法で得られたタンパク質を用いた抗体
及びＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】水溶液に溶けるタンパク質の分離は、従
来よりカラムクロマトグラフィーおよび高速液体クロマ
トグラフィー（以下ＨＰＬＣ）を用いて行われるのが一
般的である。最近、疎水性（水に溶けない）の膜タンパ
ク質などのタンパク質の分離、精製が界面活性剤あるい
は変性剤を用いることにより可能となってきている。
来よりカラムクロマトグラフィーおよび高速液体クロマ
トグラフィー（以下ＨＰＬＣ）を用いて行われるのが一
般的である。最近、疎水性（水に溶けない）の膜タンパ
ク質などのタンパク質の分離、精製が界面活性剤あるい
は変性剤を用いることにより可能となってきている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、疎水性
タンパク質の中でも、ツメ、毛髪、カメの甲羅などの硬
タンパク質からタンパク質の分離が難しく、その性質に
ついて詳しく解明されていなかった。タンパク質には、
数多くの種類があり、その分離法もさまざまな条件が必
要とされている。したがって、これまでほとんど報告が
ないような硬タンパク質の分離法の確立が望まれている
ところであった。これらの硬タンパク質の１つとしてカ
メ類の甲羅が挙げられる。特に海ガメの中でもタイマイ
の甲羅は、鼈甲細工に４００年も前から用いられてきた
動物性宝石である。しかしながら、ワシントン条約によ
り平成４年末をもって、タイマイ及びその甲羅の輸入は
禁止され、鼈甲細工従事者ならびに海ガメの研究者にと
っては大きな問題となっていた。
タンパク質の中でも、ツメ、毛髪、カメの甲羅などの硬
タンパク質からタンパク質の分離が難しく、その性質に
ついて詳しく解明されていなかった。タンパク質には、
数多くの種類があり、その分離法もさまざまな条件が必
要とされている。したがって、これまでほとんど報告が
ないような硬タンパク質の分離法の確立が望まれている
ところであった。これらの硬タンパク質の１つとしてカ
メ類の甲羅が挙げられる。特に海ガメの中でもタイマイ
の甲羅は、鼈甲細工に４００年も前から用いられてきた
動物性宝石である。しかしながら、ワシントン条約によ
り平成４年末をもって、タイマイ及びその甲羅の輸入は
禁止され、鼈甲細工従事者ならびに海ガメの研究者にと
っては大きな問題となっていた。
【０００４】本発明は、これまでよく使用されていた
が、その性質がよく知られていないタイマイの甲羅を構
成するタンパク質の分離法と、その分離法で得られたタ
ンパク質を用いた抗体及びＤＮＡを提供することを目的
としている。
が、その性質がよく知られていないタイマイの甲羅を構
成するタンパク質の分離法と、その分離法で得られたタ
ンパク質を用いた抗体及びＤＮＡを提供することを目的
としている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、請求項１の発明は、タイマイの甲羅に変性剤及び還
元剤を含む溶液を混合して、タイマイの甲羅からタンパ
ク質を抽出し、これを変形剤及び還元剤存在下でタンパ
ク質を精製する方法よりなる。
に、請求項１の発明は、タイマイの甲羅に変性剤及び還
元剤を含む溶液を混合して、タイマイの甲羅からタンパ
ク質を抽出し、これを変形剤及び還元剤存在下でタンパ
ク質を精製する方法よりなる。
【０００６】また、請求項２の発明は、請求項１の分離
法で得られたタンパク質、あるいはその一部のアミノ酸
配列を用いた抗体よりなる。
法で得られたタンパク質、あるいはその一部のアミノ酸
配列を用いた抗体よりなる。
【０００７】また、請求項３の発明は、請求項１の分離
法で得られたタンパク質、あるいはその一部のアミノ酸
配列から予測されるＤＮＡよりなる。
法で得られたタンパク質、あるいはその一部のアミノ酸
配列から予測されるＤＮＡよりなる。
【０００８】
【作用】分離、精製したタンパク質のアミノ酸組成分析
を行うことによりタンパク量の定量、ならびにアミノ酸
の割合がわかる。
を行うことによりタンパク量の定量、ならびにアミノ酸
の割合がわかる。
【０００９】タンパク質のアミノ酸配列を調べることに
より、現在登録してあるタンパク質とホモロジー検索が
出来る。
より、現在登録してあるタンパク質とホモロジー検索が
出来る。
【００１０】上記の検索を行うことにより、既存か未知
タンパク質かを知ることができる。
タンパク質かを知ることができる。
【００１１】アミノ酸配列を基に親水性・疎水性度をコ
ンピューターで計算できる。
ンピューターで計算できる。
【００１２】タンパク質をウサギなどの動物に免疫する
ことにより抗体を得、それを用いて反応するタンパク
質、ならびに組織を調べることが出来る。
ことにより抗体を得、それを用いて反応するタンパク
質、ならびに組織を調べることが出来る。
【００１３】タンパク質のアミノ酸配列から予想される
ＤＮＡをプローブあるいはプライマーとして、核酸の解
析に用いることが出来る。
ＤＮＡをプローブあるいはプライマーとして、核酸の解
析に用いることが出来る。
【００１４】
【実施例】実施例について図面を参照して説明すると、
図１において、タイマイの甲羅を粉細機などによって粉
末状にする。この実施例では、１００ミクロン以下のパ
ウダーとしたものを用いた。
図１において、タイマイの甲羅を粉細機などによって粉
末状にする。この実施例では、１００ミクロン以下のパ
ウダーとしたものを用いた。
【００１５】これを、変性剤として例えば８Ｍ尿素、及
び還元剤としての例えば４０ｍＭジチオスレイトール
（以下ＤＴＴ）、を含む２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ
６．８溶液中で４℃、一昼夜、スターラーをゆっくり攪
拌してタンパク質を抽出する。次いで、１８０００ｒｐ
ｍ、３０分遠心して上清を得る。
び還元剤としての例えば４０ｍＭジチオスレイトール
（以下ＤＴＴ）、を含む２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ
６．８溶液中で４℃、一昼夜、スターラーをゆっくり攪
拌してタンパク質を抽出する。次いで、１８０００ｒｐ
ｍ、３０分遠心して上清を得る。
【００１６】この場合、変性剤のみの使用ではタイマイ
の甲羅からタンパク質を抽出分離することは困難である
が、変性剤と共に還元剤を使用することによって、これ
まで困難であったタイマイの甲羅からタンパク質を抽出
分離することが可能となったのである。
の甲羅からタンパク質を抽出分離することは困難である
が、変性剤と共に還元剤を使用することによって、これ
まで困難であったタイマイの甲羅からタンパク質を抽出
分離することが可能となったのである。
【００１７】なお、上記変性剤としては、以降の操作を
考えてイオン性のない尿素を使用する方が望ましいが、
上記の尿素の他に例えばグアニジン塩酸を使用してもよ
い。また、還元剤には、上記のジチオスレイトール他に
例えばメルカプトエノール、ジチオエリトリトールなど
を使用してもよい。
考えてイオン性のない尿素を使用する方が望ましいが、
上記の尿素の他に例えばグアニジン塩酸を使用してもよ
い。また、還元剤には、上記のジチオスレイトール他に
例えばメルカプトエノール、ジチオエリトリトールなど
を使用してもよい。
【００１８】上清を、変形剤及び還元剤存在下で例えば
カラムクロマトグラフィー或いは電気泳動法などの手法
を用いてタンパク質を精製する。例えば、上清を、ＤＴ
Ｔ濃度５ｍＭにした前述の抽出液で平衡化したＣＭイオ
ン交換クロマトグラフィーに供し、未吸着画分と吸着画
分に分ける。抽出したタンパク質を分離するために、Ｈ
ＰＬＣなどのカラムクロマトグラフィーを用いることが
効果的である。また、カラムにつめる樹脂は、イオン交
換用樹脂、逆相用樹脂などを組み合わせて使用する方が
よい。
カラムクロマトグラフィー或いは電気泳動法などの手法
を用いてタンパク質を精製する。例えば、上清を、ＤＴ
Ｔ濃度５ｍＭにした前述の抽出液で平衡化したＣＭイオ
ン交換クロマトグラフィーに供し、未吸着画分と吸着画
分に分ける。抽出したタンパク質を分離するために、Ｈ
ＰＬＣなどのカラムクロマトグラフィーを用いることが
効果的である。また、カラムにつめる樹脂は、イオン交
換用樹脂、逆相用樹脂などを組み合わせて使用する方が
よい。
【００１９】吸着画分は、上記緩衝液に塩化ナトリウム
濃度を上げ、０．５Ｍ濃度付近で溶出される分子量５０
００（以下５Ｋ）タンパク質が回収された。この画分を
逆相Ｃ１８カラムを用いたＨＰＬＣにて、単一ピークに
まで精製した（図２）。
濃度を上げ、０．５Ｍ濃度付近で溶出される分子量５０
００（以下５Ｋ）タンパク質が回収された。この画分を
逆相Ｃ１８カラムを用いたＨＰＬＣにて、単一ピークに
まで精製した（図２）。
【００２０】一方、未吸着画分は透析することにより沈
澱したタンパク質を、８Ｍ尿素、５ｍＭＤＴＴを含むト
リス緩衝液、ｐＨ９．１に溶解する。
澱したタンパク質を、８Ｍ尿素、５ｍＭＤＴＴを含むト
リス緩衝液、ｐＨ９．１に溶解する。
【００２１】上記溶液を同一緩衝液で平衡化したＤＥＡ
Ｅ陰イオンカラムを用いたＨＰＬＣに供した。塩化ナト
リウム濃度を上げていったら、約０．１付近で分子量１
５０００（以下１５Ｋ）タンパク質が溶出された。この
画分を逆相Ｃ１８カラムを用いたＨＰＬＣに供し、１５
Ｋタンパク質を単一ピークにまで精製した（図３，
４）。
Ｅ陰イオンカラムを用いたＨＰＬＣに供した。塩化ナト
リウム濃度を上げていったら、約０．１付近で分子量１
５０００（以下１５Ｋ）タンパク質が溶出された。この
画分を逆相Ｃ１８カラムを用いたＨＰＬＣに供し、１５
Ｋタンパク質を単一ピークにまで精製した（図３，
４）。
【００２２】５Ｋと１５Ｋの両タンパク質のアミノ酸組
成は１％フェノールを含む６Ｎ塩酸、１１０°Ｃ、２２
時間反応することにより行った。なおトリプトファンは
３％チオグリコール酸を含む５．８Ｎ塩酸、１１０°
Ｃ、２２時間加水分解し、システインは過ギ酸酸化後シ
ステイン酸として定量した。いずれもアミノ酸は、日立
高速アミノ酸分析計Ｌ−８５００により測定したのが表
１である。
成は１％フェノールを含む６Ｎ塩酸、１１０°Ｃ、２２
時間反応することにより行った。なおトリプトファンは
３％チオグリコール酸を含む５．８Ｎ塩酸、１１０°
Ｃ、２２時間加水分解し、システインは過ギ酸酸化後シ
ステイン酸として定量した。いずれもアミノ酸は、日立
高速アミノ酸分析計Ｌ−８５００により測定したのが表
１である。
【００２３】
【表１】
【００２４】５Ｋのタンパク質は、ピリジルエチル化
（ＰＥ）してそのアミノ酸配列を検討した。なおシステ
インのピリジルエチル化は、以下の方法で行った。ま
ず、タンパク質を０．５ｍｌの６Ｍ Guanidine-HCl、５
０ｍＭ Tris-HCl 、ｐＨ８．５、１ｍＭ EDTA 、５０ｍ
Ｍ DTTに溶解し（タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌ）、気相
を窒素置換後、３０°Ｃ、２時間反応させた。次に、４
−ビニルピリジンを加え、窒素置換し、３０°Ｃ、２時
間反応した。さらに、反応液をＨＰＬＣ（カラム；日本
分光 Biofine RPC-PO 、６×１５０ｍｍ）に供し、０．
１％ＴＦＡを含むアセトニトリルの濃度を直線的に上げ
ることによりＰＥタンパク質を溶出した。タンパク質
（ＰＥ化含む）のアミノ酸配列は、ＡＢＩ社の４７７Ａ
／１２０ＡプロテインシーケンサーによりＮ末端より４
９残基決定した。一方Ｃ末端はカルボキシペプチダーゼ
Ｙを作用することにより遊離するアミノ酸を５残基調
べ、５Ｋのタンパク質は、図５のような５１アミノ酸か
ら成ることがわかった。
（ＰＥ）してそのアミノ酸配列を検討した。なおシステ
インのピリジルエチル化は、以下の方法で行った。ま
ず、タンパク質を０．５ｍｌの６Ｍ Guanidine-HCl、５
０ｍＭ Tris-HCl 、ｐＨ８．５、１ｍＭ EDTA 、５０ｍ
Ｍ DTTに溶解し（タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌ）、気相
を窒素置換後、３０°Ｃ、２時間反応させた。次に、４
−ビニルピリジンを加え、窒素置換し、３０°Ｃ、２時
間反応した。さらに、反応液をＨＰＬＣ（カラム；日本
分光 Biofine RPC-PO 、６×１５０ｍｍ）に供し、０．
１％ＴＦＡを含むアセトニトリルの濃度を直線的に上げ
ることによりＰＥタンパク質を溶出した。タンパク質
（ＰＥ化含む）のアミノ酸配列は、ＡＢＩ社の４７７Ａ
／１２０ＡプロテインシーケンサーによりＮ末端より４
９残基決定した。一方Ｃ末端はカルボキシペプチダーゼ
Ｙを作用することにより遊離するアミノ酸を５残基調
べ、５Ｋのタンパク質は、図５のような５１アミノ酸か
ら成ることがわかった。
【００２５】１５Ｋのタンパク質は、Ｎ末端より１６残
基までを決定した。さらに詳しく調べるためにＶ８プロ
テアーゼ及びプロティネースＫにより酵素消化したタン
パク質を回収することにした。１５Ｋタンパク質のＶ８
プロテアーゼによる消化は、以下の条件で行った。１５
Ｋタンパク質（約８ｎmol)を、８Ｍ Urea に可溶化後、
５０ｍＭリン酸緩衝液水、Ｖ８プロテアーゼ（基質／酵
素＝３０／１、モル比）で加えた（Ureaの最終濃度５
Ｍ）。３５°Ｃ、１２時間反応後、２倍量の８ＭUrea
、DDT(最終２ｍＭ）を加えた。さらに反応物を２分間
加熱し、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えた後、ＨＰ
ＬＣに供し、２つのピークよりＮ末より重複する１０〜
３２残基と重複しない２２残基を決定した。一方、 Pro
teinase Ｋ消化は、ＰＥ１５Ｋタンパク質（前述の〔０
０２４〕方法）を用いた。約２０ｎ molのＰＥ１５Ｋタ
ンパク質を、６Ｍ Urea 、５０ｍＭTris-HCl 、ｐＨ８
に溶解し、 Proteinase Ｋ（基質／酵素＝１００／１、
モル比）を加え、３３°Ｃ、７５分反応させた。反応液
に粉末Urea及びDDT を加え、それぞれ最終８Ｍと２ｍＭ
とした。次いで熱処理後、ＴＦＡを加え酸性としＨＰＬ
Ｃに供した。これにより得た２０のピークＰＫ１〜２０
のアミノ酸配列を調べ、最終的にＮ末端より７６残基を
決定した（図６）。これ以外のピークＰＫ４、５、６、
７、１０、１１、１２、１４、１６、１７のアミノ酸配
列は図７に示す。
基までを決定した。さらに詳しく調べるためにＶ８プロ
テアーゼ及びプロティネースＫにより酵素消化したタン
パク質を回収することにした。１５Ｋタンパク質のＶ８
プロテアーゼによる消化は、以下の条件で行った。１５
Ｋタンパク質（約８ｎmol)を、８Ｍ Urea に可溶化後、
５０ｍＭリン酸緩衝液水、Ｖ８プロテアーゼ（基質／酵
素＝３０／１、モル比）で加えた（Ureaの最終濃度５
Ｍ）。３５°Ｃ、１２時間反応後、２倍量の８ＭUrea
、DDT(最終２ｍＭ）を加えた。さらに反応物を２分間
加熱し、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えた後、ＨＰ
ＬＣに供し、２つのピークよりＮ末より重複する１０〜
３２残基と重複しない２２残基を決定した。一方、 Pro
teinase Ｋ消化は、ＰＥ１５Ｋタンパク質（前述の〔０
０２４〕方法）を用いた。約２０ｎ molのＰＥ１５Ｋタ
ンパク質を、６Ｍ Urea 、５０ｍＭTris-HCl 、ｐＨ８
に溶解し、 Proteinase Ｋ（基質／酵素＝１００／１、
モル比）を加え、３３°Ｃ、７５分反応させた。反応液
に粉末Urea及びDDT を加え、それぞれ最終８Ｍと２ｍＭ
とした。次いで熱処理後、ＴＦＡを加え酸性としＨＰＬ
Ｃに供した。これにより得た２０のピークＰＫ１〜２０
のアミノ酸配列を調べ、最終的にＮ末端より７６残基を
決定した（図６）。これ以外のピークＰＫ４、５、６、
７、１０、１１、１２、１４、１６、１７のアミノ酸配
列は図７に示す。
【００２６】決定した５Ｋタンパク質のアミノ酸配列を
基に、国立遺伝学研究所のデータベースを用いてホモロ
ジー検索を行った。その結果、ホモロジーを示すタンパ
ク質はほとんどなかった。
基に、国立遺伝学研究所のデータベースを用いてホモロ
ジー検索を行った。その結果、ホモロジーを示すタンパ
ク質はほとんどなかった。
【００２７】このことより５Ｋタンパク質は、新規タン
パク質と考えられる。
パク質と考えられる。
【００２８】１５Ｋタンパク質のＮ末端より７６残基を
基にホモロジー検索を行ったところ、図８のようにニワ
トリ、ハト、アヒルなどの鳥類の羽毛、爪ケラチンと約
５０％のホモロジーを示すことが明らかになった。特
に、２５番目のＰｒｏから５１番目のＬｅｕにかけて
は、７８〜９３％と非常に似ている。さらに、立体構造
に関係があると考えられているシステインは、２２、２
６、３０番目のものは完全に、そして６、１０番目では
約７０％が一致している。一方、異なる点としては分子
量の大きさが違うことである。
基にホモロジー検索を行ったところ、図８のようにニワ
トリ、ハト、アヒルなどの鳥類の羽毛、爪ケラチンと約
５０％のホモロジーを示すことが明らかになった。特
に、２５番目のＰｒｏから５１番目のＬｅｕにかけて
は、７８〜９３％と非常に似ている。さらに、立体構造
に関係があると考えられているシステインは、２２、２
６、３０番目のものは完全に、そして６、１０番目では
約７０％が一致している。一方、異なる点としては分子
量の大きさが違うことである。
【００２９】よって１５Ｋタンパク質は、鳥類のケラチ
ンに似ているが新規のタンパク質と考えられる。
ンに似ているが新規のタンパク質と考えられる。
【００３０】図９は、５Ｋタンパク質の親水性、疎水性
度を示しており、このタンパク質は、非常に疏水性の高
い性質をもつことを明らかにした。
度を示しており、このタンパク質は、非常に疏水性の高
い性質をもつことを明らかにした。
【００３１】図１０は、１５Ｋタンパク質の親水性、疎
水性度を示しており、このタンパク質は疎水性の高い性
質を持つことを明らかにした。
水性度を示しており、このタンパク質は疎水性の高い性
質を持つことを明らかにした。
【００３２】１５Ｋタンパク質をウサギに免疫すること
により得た抗体を用いてタイマイの甲を含む組織を調べ
たのが図１１の上のものである。角化細胞（表皮細胞）
の上に抗体と反応するタンパク質の確認をすることがで
きる。
により得た抗体を用いてタイマイの甲を含む組織を調べ
たのが図１１の上のものである。角化細胞（表皮細胞）
の上に抗体と反応するタンパク質の確認をすることがで
きる。
【００３３】タイマイの甲付近の組織より得たＲＮＡを
ニトロセルロース膜に固定し、１５Ｋタンパク質の３９
〜４８アミノ酸に対応する以下のオリゴヌクレオチド
５’−ＣＣＣＴＣＴＣＣＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＣＣＣ
ＴＧＣＣＴＧＧ−３’と、５Ｋタンパク質の１〜１０ア
ミノ酸に対応する下記のオリゴヌクレオチド５’−ＴＡ
ＣＴＡＴＡＡＣＣＣＩＴＡＴＴＧＣＴＡＣＣＡＩＧＧＩ
ＴＧＧ−３’が両方ともハイブリダイズした（但し、Ｉ
はイノシンを意味する。）。ハイブリダイゼーション
は、村松正實編、ラボマニュアル遺伝子工学、ｐ７５〜
７６の方法と同様に行った。
ニトロセルロース膜に固定し、１５Ｋタンパク質の３９
〜４８アミノ酸に対応する以下のオリゴヌクレオチド
５’−ＣＣＣＴＣＴＣＣＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＣＣＣ
ＴＧＣＣＴＧＧ−３’と、５Ｋタンパク質の１〜１０ア
ミノ酸に対応する下記のオリゴヌクレオチド５’−ＴＡ
ＣＴＡＴＡＡＣＣＣＩＴＡＴＴＧＣＴＡＣＣＡＩＧＧＩ
ＴＧＧ−３’が両方ともハイブリダイズした（但し、Ｉ
はイノシンを意味する。）。ハイブリダイゼーション
は、村松正實編、ラボマニュアル遺伝子工学、ｐ７５〜
７６の方法と同様に行った。
【００３４】なお、本発明は上記実施例に限定されるも
のではなく、この発明の精神を逸脱しない範囲で種々の
改変をなし得ることは勿論である。
のではなく、この発明の精神を逸脱しない範囲で種々の
改変をなし得ることは勿論である。
【００３５】
【発明の効果】本発明は、以上説明したように構成され
ているので、以下に記載されるような効果を奏する。
ているので、以下に記載されるような効果を奏する。
【００３６】請求項１の発明によれば、これまで抽出分
離が困難であったタイマイの甲羅からタンパク質を抽出
分離することができる。
離が困難であったタイマイの甲羅からタンパク質を抽出
分離することができる。
【００３７】また、請求項１の発明の分離法で得られた
タンパク質は、タイマイの甲羅素材の開発に利用するこ
とができる。
タンパク質は、タイマイの甲羅素材の開発に利用するこ
とができる。
【００３８】請求項２の発明によれば、請求項１の発明
の分離法で得られたタンパク質、あるいはその一部のア
ミノ酸配列を含むタンパク質を用いて得た抗体により、
各種生物の組織の調査、角化や発生メカニズムの解明、
生理機能あるいは海ガメの分類などに利用できる。
の分離法で得られたタンパク質、あるいはその一部のア
ミノ酸配列を含むタンパク質を用いて得た抗体により、
各種生物の組織の調査、角化や発生メカニズムの解明、
生理機能あるいは海ガメの分類などに利用できる。
【００３９】請求項３の発明によれば、請求項１の発明
の分離法で得られたタンパク質、あるいはその一部のア
ミノ酸配列から予想されるＤＮＡを利用し、核酸の解
析、ＰＣＲ法による遺伝子増幅とクローニング手法など
を用い、各種生物の組織の調査、角化や発生メカニズム
の解明、生理機能あるいは海ガメの分類などに利用でき
る。
の分離法で得られたタンパク質、あるいはその一部のア
ミノ酸配列から予想されるＤＮＡを利用し、核酸の解
析、ＰＣＲ法による遺伝子増幅とクローニング手法など
を用い、各種生物の組織の調査、角化や発生メカニズム
の解明、生理機能あるいは海ガメの分類などに利用でき
る。
【図１】タイマイの甲羅よりタンパク質の抽出法と精製
法を示す図である。
法を示す図である。
【図２】精製した５Ｋタンパク質のＨＰＬＣパターンを
示す図である。
示す図である。
【図３】精製した１５Ｋタンパク質のＨＰＬＣパターン
を示す図である。
を示す図である。
【図４】精製した１５Ｋタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
の図である。
の図である。
【図５】５Ｋタンパク質の全アミノ酸配列を示す図であ
る。
る。
【図６】１５Ｋタンパク質のＮ末端より７６アミノ酸ま
での配列を示す図である。
での配列を示す図である。
【図７】１５Ｋタンパク質の中間部およびＣ末端フラグ
メントと推定されるアミノ酸配列を示す図である。
メントと推定されるアミノ酸配列を示す図である。
【図８】１５Ｋタンパク質とホモロジーを示すタンパク
質を示す図である。
質を示す図である。
【図９】５Ｋタンパク質の親水性、疎水性度を示す図で
ある。
ある。
【図１０】１５Ｋタンパク質の親水性、疎水性度を示す
図である。
図である。
【図１１】酵素抗体反応によりタイマイの組織を調べた
図である。
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Claims (3)
- 【請求項１】 タイマイの甲羅に変性剤及び還元剤を含
む溶液を混合して、タイマイの甲羅からタンパク質を抽
出し、これを変形剤及び還元剤存在下でタンパク質を精
製することを特徴とするタイマイの甲羅からのタンパク
質の分離法。 - 【請求項２】 請求項１の分離法で得られたタンパク
質、あるいはその一部のアミノ酸配列を用いた抗体。 - 【請求項３】 請求項１の分離法で得られたタンパク
質、あるいはその一部のアミノ酸配列から予測されるＤ
ＮＡ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7097763A JP2946021B2 (ja) | 1995-03-29 | 1995-03-29 | タイマイの甲羅からのタンパク質の分離法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7097763A JP2946021B2 (ja) | 1995-03-29 | 1995-03-29 | タイマイの甲羅からのタンパク質の分離法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08269094A true JPH08269094A (ja) | 1996-10-15 |
| JP2946021B2 JP2946021B2 (ja) | 1999-09-06 |
Family
ID=14200916
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7097763A Expired - Lifetime JP2946021B2 (ja) | 1995-03-29 | 1995-03-29 | タイマイの甲羅からのタンパク質の分離法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2946021B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013023442A1 (zh) * | 2011-08-18 | 2013-02-21 | 江中药业股份有限公司 | 甲鱼肽在制药中的应用 |
| CN103630646A (zh) * | 2013-10-30 | 2014-03-12 | 山东东阿阿胶股份有限公司 | 一种胶类中药及其制品中龟源性成分的检测方法 |
| CN109142563A (zh) * | 2018-07-25 | 2019-01-04 | 山西广誉远国药有限公司 | 一种龟龄集uplc指纹图谱的构建方法及其应用 |
-
1995
- 1995-03-29 JP JP7097763A patent/JP2946021B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013023442A1 (zh) * | 2011-08-18 | 2013-02-21 | 江中药业股份有限公司 | 甲鱼肽在制药中的应用 |
| CN103630646A (zh) * | 2013-10-30 | 2014-03-12 | 山东东阿阿胶股份有限公司 | 一种胶类中药及其制品中龟源性成分的检测方法 |
| CN109142563A (zh) * | 2018-07-25 | 2019-01-04 | 山西广誉远国药有限公司 | 一种龟龄集uplc指纹图谱的构建方法及其应用 |
| CN109142563B (zh) * | 2018-07-25 | 2021-03-02 | 山西广誉远国药有限公司 | 一种龟龄集uplc指纹图谱的构建方法及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2946021B2 (ja) | 1999-09-06 |
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