JPH01296996A - 新規ペプチド - Google Patents
新規ペプチドInfo
- Publication number
- JPH01296996A JPH01296996A JP63126981A JP12698188A JPH01296996A JP H01296996 A JPH01296996 A JP H01296996A JP 63126981 A JP63126981 A JP 63126981A JP 12698188 A JP12698188 A JP 12698188A JP H01296996 A JPH01296996 A JP H01296996A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- present
- gene
- structural gene
- boc
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 abstract description 5
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 abstract description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 abstract description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 abstract description 5
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 4
- -1 4-(hydroxymethyl)phenylacetamidomethyl Chemical group 0.000 abstract description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 3
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 abstract 2
- FYYSQDHBALBGHX-YFKPBYRVSA-N N(alpha)-t-butoxycarbonyl-L-asparagine Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O FYYSQDHBALBGHX-YFKPBYRVSA-N 0.000 abstract 1
- MDXGYYOJGPFFJL-QMMMGPOBSA-N N(alpha)-t-butoxycarbonyl-L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OC(C)(C)C MDXGYYOJGPFFJL-QMMMGPOBSA-N 0.000 abstract 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 229940030600 antihypertensive agent Drugs 0.000 abstract 1
- 239000002220 antihypertensive agent Substances 0.000 abstract 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 abstract 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 abstract 1
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 36
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 23
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 16
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 15
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N N-bromosuccinimide Chemical compound BrN1C(=O)CCC1=O PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 4
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KDRNOBUWMVLVFH-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-n-(2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl)prop-2-enamide Chemical compound CC(=C)C(=O)NC1CC(C)(C)NC(C)(C)C1 KDRNOBUWMVLVFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 101000740112 Homo sapiens Membrane-associated transporter protein Proteins 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Natural products C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100037258 Membrane-associated transporter protein Human genes 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101500027956 Homo sapiens Vasoactive intestinal peptide Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- YTNGABPUXFEOGU-SRVKXCTJSA-N Val-Pro-Arg Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O YTNGABPUXFEOGU-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- USMNOWBWPHYOEA-XKSSXDPKSA-N (+)-beta-thujone Chemical compound O=C([C@H]1C)C[C@@]2(C(C)C)[C@@H]1C2 USMNOWBWPHYOEA-XKSSXDPKSA-N 0.000 description 1
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 1
- QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-[3-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]propanoic acid Chemical group OC(=O)C(N)CC1=CC=CC(N(CCCl)CCCl)=C1 QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 241000276457 Gadidae Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101000658545 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Type I restriction enyme HindI endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 125000002066 L-histidyl group Chemical group [H]N1C([H])=NC(C([H])([H])[C@](C(=O)[*])([H])N([H])[H])=C1[H] 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000000769 L-threonyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])[C@](O[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100109158 Mus musculus Asprv1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000920340 Pion Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101500022359 Sus scrofa Vasoactive intestinal peptide Proteins 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- SWLVFNYSXGMGBS-UHFFFAOYSA-N ammonium bromide Chemical group [NH4+].[Br-] SWLVFNYSXGMGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 210000001557 animal structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000004872 arterial blood pressure Effects 0.000 description 1
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 230000004531 blood pressure lowering effect Effects 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 230000003182 bronchodilatating effect Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012824 chemical production Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- RWYFURDDADFSHT-RBBHPAOJSA-N diane Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1.C1=C(Cl)C2=CC(=O)[C@@H]3CC3[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(C)=O)(OC(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RWYFURDDADFSHT-RBBHPAOJSA-N 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 150000002085 enols Chemical class 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000001077 hypotensive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IOPLHGOSNCJOOO-UHFFFAOYSA-N methyl 3,4-diaminobenzoate Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(N)C(N)=C1 IOPLHGOSNCJOOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002850 nasal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 1
- ZERULLAPCVRMCO-UHFFFAOYSA-N sulfure de di n-propyle Natural products CCCSCCC ZERULLAPCVRMCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 1
- 230000000304 vasodilatating effect Effects 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
を産業上の利用分野]
本発明は、新規な生理活性ペプチドに関するものである
。 [従来の技術おまひ問題点] 現在、腸管由来のベグタイドホルモンか数多く知られて
おり、中でもVIPは、血管拡張作用、血圧降下作用、
気管支拡張作用などの有用な薬理作用か知られている。 また、ヒトV I PとブタVIPが全く同一であるよ
うに、動物種によるペプチド配列の変異が少なく、消化
管以外にも多くの器官でその存在が確認され、最近では
、ある種の神経伝達物質として、認識されるようになっ
て来ている重要なペプタイドである。 しかし、天然のヒトVIPを、動物の臓器よりの抽出や
、有機化学合成により生産することは、コスト面より採
算が採れず、また、遺伝子組換えによる生産も、C末端
がアミドであることから、容易には生産出来ないため、
医薬品として市場に供されることのないまま今日に至っ
でいる。 E問題点を解決するための手段] 本発明者は、経済効率の高い遺伝子組換えによる生産が
可能なヒ1−VIP様活性を有するペプチドを得るべく
そのペプチド配列について、種々検J1を行った結果、
下記式 %式% Asn−5er−1le L eu−Asn−OHで
表される新、規ベグチドか、ヒ)VIPと同等の薬理作
用を有し、かつ遺伝子組換えにより容易に生産できるこ
とを見いだし、本発明を完成した。 即ち、本発明は、下記式 %式% で表される新規ペプチド(以下、本発明の化合物と称す
る)である。 上述した本発明の化合物の構造式、および以下の説明に
おいては、Hisは、L−ヒスチジン、Serは、L−
セリン、AspはL−アスパラギン酸、AlaはL−ア
ラニン、Valは、L−バリン、Pheは、L−フェニ
ルアラニン、T)irは、L−スレオニン、Asnは、
L−アスパラギン、Tyrは、し−チロシン、Argは
、L−アルギニン、Leuは、L−ロイ・6/ン、Ly
sは、L−リジン、Glnは、L−グルタミン、Ile
は、■、−インロイシンをそれぞれ意味する。 本発明の化合物は、液相法、同相法による一般的なペブ
タイドの有機化学合成法によっ°Cも製造できるが、大
腸菌等を用いた遺伝子組換え法により、容易に大量生産
できるという特徴を有しているので、遺伝子組換え法に
より生産するのが好ましい。 以下に、本発明の新規ペプチドの製造方法について、説
明する。 1)構造遺伝子 1)遺伝子の設計 本発明のペプチドは、新規ペプチドであり、天然には存
在
。 [従来の技術おまひ問題点] 現在、腸管由来のベグタイドホルモンか数多く知られて
おり、中でもVIPは、血管拡張作用、血圧降下作用、
気管支拡張作用などの有用な薬理作用か知られている。 また、ヒトV I PとブタVIPが全く同一であるよ
うに、動物種によるペプチド配列の変異が少なく、消化
管以外にも多くの器官でその存在が確認され、最近では
、ある種の神経伝達物質として、認識されるようになっ
て来ている重要なペプタイドである。 しかし、天然のヒトVIPを、動物の臓器よりの抽出や
、有機化学合成により生産することは、コスト面より採
算が採れず、また、遺伝子組換えによる生産も、C末端
がアミドであることから、容易には生産出来ないため、
医薬品として市場に供されることのないまま今日に至っ
でいる。 E問題点を解決するための手段] 本発明者は、経済効率の高い遺伝子組換えによる生産が
可能なヒ1−VIP様活性を有するペプチドを得るべく
そのペプチド配列について、種々検J1を行った結果、
下記式 %式% Asn−5er−1le L eu−Asn−OHで
表される新、規ベグチドか、ヒ)VIPと同等の薬理作
用を有し、かつ遺伝子組換えにより容易に生産できるこ
とを見いだし、本発明を完成した。 即ち、本発明は、下記式 %式% で表される新規ペプチド(以下、本発明の化合物と称す
る)である。 上述した本発明の化合物の構造式、および以下の説明に
おいては、Hisは、L−ヒスチジン、Serは、L−
セリン、AspはL−アスパラギン酸、AlaはL−ア
ラニン、Valは、L−バリン、Pheは、L−フェニ
ルアラニン、T)irは、L−スレオニン、Asnは、
L−アスパラギン、Tyrは、し−チロシン、Argは
、L−アルギニン、Leuは、L−ロイ・6/ン、Ly
sは、L−リジン、Glnは、L−グルタミン、Ile
は、■、−インロイシンをそれぞれ意味する。 本発明の化合物は、液相法、同相法による一般的なペブ
タイドの有機化学合成法によっ°Cも製造できるが、大
腸菌等を用いた遺伝子組換え法により、容易に大量生産
できるという特徴を有しているので、遺伝子組換え法に
より生産するのが好ましい。 以下に、本発明の新規ペプチドの製造方法について、説
明する。 1)構造遺伝子 1)遺伝子の設計 本発明のペプチドは、新規ペプチドであり、天然には存
在
【7ないため、その構造遺伝子を合成しなけれはなら
ないが、本発明の新規ペプチドを構成するアミノ酸をコ
ー ドするDNA配列のらち、大腸菌での利用度の高い
配列を選び、また、A−T塩基対に富む領域が連続しな
いこと、また、この構造遺伝子を合成するための部品と
なる合成フラグメントが分子内自己相補性塩基配列を有
しないこと、繰り返し配列を有しないこと、30塩基程
度の大きさになること、3゛末端がAでないことに留意
して設計する。 従って、本発明で筐用する新規ペプチドの構造遺伝子の
好ましい具体例は、後記の実験例および遺伝子設計図に
示した塩基配列のものである(図中、この構造遺伝子は
、Hi s Iこ対応するCΔCからA s nに対応
するAACの部分までである)。 この構造遺伝子を発現させる方法は、例えば、大腸菌の
ラクトースオペロンのβ−ガラクトンダーゼの構造遺伝
子中にこの遺伝子を挿入して、融合蛋白として発現させ
ることができる。すなわち、まず、構造遺伝子の5′末
端側には、臭化ジアン分解のためのMet(L−メチオ
ニン)のコドンを、3′末端側には、終止コドンを設け
る。この際、終止コドンは、2つ以上つなげることが好
ましい。 また、構造遺伝子の5′末端側には、臭化ンアン分解の
ためのMetのコドンのATGの代わりlこ化学的分解
方法の一種であるN−ブロモコハク酸イミドによろうす
解のための1”rp(I−l−リプ]・ファン)のコド
ンを設けてもよく、また、蛋白分解酵素の一種である血
液凝固因子Xaの認識Vるr l e−G I u−G
I y−Ar gに相当するコドンあるいは、トロン
ビンの認識するV a I −Pro−Argに相当す
るコドンを設けてもよい。 l】)合成 北記のように設計した遺伝子を合成するには、七−両鎖
のそれぞれについて、これをいくつかの7ラグメントに
分けてこれらを化学的に合成し、各々のフラグメントを
結合する方法によればよい。 各鎖は、18〜30塩基からなり、各々が10〜12塩
基ずつ重なるように、8程度度のフラグメントに分ける
のが好ましい。 各7ラグメントの合成法どしては、固相法、液相法lこ
よる合成方法があるが、ホスホルアミダイト法による固
相合成法によるのがもっとも好ましい。 i)精製 フラグメントを合成する際、鎖長が長くなると不純物か
多くなり、−船釣に精製が困難になるが、精製するには
、ホスホルアミダイ1−法によるオリゴヌクレオチド合
成の中間体である5′水酸基の保護基の付いたオリゴヌ
クレオチドを逆相高速液体クロマトグラフィー(逆相H
PLC)で分取し、保護基を除いた後、更に陰イオン交
換カラムクロマトグラフィーを用いて分取した後、脱塩
することで達成出来る。 ■)リン酸化および結合 5′末端7ラグメントを除く各フラグメントは、T4−
キナーゼでリン酸化し、それぞれの反応液において、酵
素を不活性化した後、混合し、脱塩した。脱塩したフラ
クションを濃縮し、5′末端フラグメントを加えて、9
0〜100 ’C!加熱したうえでゆっくり冷却して、
アニールさせ、さらにT、−DNAリガーゼを用いて反
応させることにより結合し、構造遺伝子断片として得る
ことができる。 ■)β−ガラク1−/ダービ発現系を有するベクターの
調製 本発明においては大腸菌染色体DNA由来のβ−ガ2タ
ト/ダーゼの構造遺伝子とその発現のためのプロモータ
ー等の発現システムを有し、大腸菌内で増殖可能なさま
ざまなプラスミドを用いることが可能であり、それらの
グラスミドを調製するにあたっては、公知の常法に従っ
て行うことができるが、既にβ−ガラクトシダーゼの構
造遺伝子が導入されたplBl (ATCC31449
)等のプラスミドより、β−ガラクトシダーゼの構造遺
伝子を得ることが好都合である。この遺伝子の適当な場
所に、目的とするベプタイドの構造遺伝子を組み込むこ
とで、β−ガラクトシダーゼとの融合蛋白が作られる。 3)プラスミド組換え分子 前記のβ−ガラクトシダーゼの構造遺伝子を本発明のペ
プチドの構造遺伝子を含むプラスミドに一般の遺伝子組
換えの操作によって組込むことにより、プラスミド組換
え5子を構築する。 本発明の具体例で1よ、ベクターとしてpBR322を
使用し、その制限酵素EeoRIとBamHlで切断さ
れた大きいほうのフラグメントに本発明のペプチドの構
造遺伝子を含む遺伝子を組込み、史にβ−ガラクトシダ
ーゼの構造遺伝子を組込むことによって、組換え分子と
している。本発明では、このプラスミド組換え分子をp
Y1005と命名した。 4)形質転換 i)宿主菌 が1記のような本発明のペプチドの構造遺伝子を組込ん
だプラスミド組換え分子、例えばpY1005を用いて
、形質転換させる宿主細胞としては、大腸菌株RRIΔ
M15(ATCC35102)、J M l 01、J
M105等の大腸菌に12株の誘導体であって、ラクト
ースオペロンのしプレツサー活性の高いIac i”
の宿主が望ましい。 ■)形質転換 常法により形質転換する。 山)形質転換体 形質転換体の具体例としては、宿主細胞としての大腸菌
株RRIΔM15を、例えばpY1005を用いて形質
転換さゼたRRIΔM15(pY1005)が挙げられ
る。 5)ペプチドの産生 1)形質転換体の培養 形質転換体の培養に当たっては、L−培地、M9培地、
M9−カザミノ酸培地、高リン酸培地、高リン酸−カザ
ミノ酸培地等を用いることができ、こねにイソプロピル
チオガラクトシド(IPTG)を添加し、更に培養する
ことにより、本発明のペプチドとβ−ガラクトシダーゼ
の融合蛋白(以下融合蛋白と省略する。)を量産するこ
とができる。 i)融合蛋白の精製 大腸菌で発現した融合蛋白は、大腸菌を超音波破砕後、
遠心分離することによって、水不溶性画分として得るこ
とができ、この操作により大腸菌中の多くの水可溶性蛋
白との分離が可能である。 この時点での水不溶性画分には、融合蛋白の他に、膜蛋
白が存在するため、トリトン−xio。 等の界面活性剤による膜蛋白の可溶化を行って、不溶性
の融合蛋白を得るかまたは、塩酸グアニ・ノン溶液を含
む緩衝液を用いたゲル濾過ならびにイオン交換ツノラム
を用いた精製等を行うことで分離可能である。 また、更に抗β−ガラクI−シダーゼ抗体、抗VIP抗
体を適当なカラム担体に保持させたイムノアフィニティ
ーカラムクロマトグラフィーにイ寸すごともできる。 1ii)融合蛋白の分解 融合上白を分解し、本発明のペプチド全切り出すために
は、上記のように精製した融合蛋白がMetを介して結
合している場合は、臭化シアンを用いて、β−ガラク[
・ンダーゼ七本発明のベブチドヲ連結しているメチオニ
ンを分解す−ることで得られるが、Trpを介しで結合
している場合においては、N−ブロモコハク酸イミドを
用いることで化学的に分解される。 また、I l c−G l u−G I y−Ar g
を介して結合している場合は、血液疑固因子Xaを用い
て、また、Val−Pro−Argをfして結合してい
る場かは、l−c+ンヒンを用いて酵素的に分解するこ
とかでさる。 1ν)本発明のペプチドのFi’を製 融合蛋白を上記のように分解して得られたペプチド混合
物より本発明の化合物を精製するには、逆相1(P L
CJダよび陽イオン交換高速液体クロ1トゲラフイー
(陽イオン交換!−I P L C)に付すことにより
なされるが、更に、抗VIP抗体を用いたイムノアフィ
ニティーカラムクロマトグラフィーに付すことにより、
効率的な精製を達成することかで謝る。 V)本発明のペプチドの確認 このようにしで、得られた本発明のペプチドは、アミノ
酸組成分析、エドマン分解によるアミノ酸配列分析およ
び抗V I り抗体よ6(ムノアノセイ!こより、確認
することができる。 F実施例1 実施例1゜ (C[
ないが、本発明の新規ペプチドを構成するアミノ酸をコ
ー ドするDNA配列のらち、大腸菌での利用度の高い
配列を選び、また、A−T塩基対に富む領域が連続しな
いこと、また、この構造遺伝子を合成するための部品と
なる合成フラグメントが分子内自己相補性塩基配列を有
しないこと、繰り返し配列を有しないこと、30塩基程
度の大きさになること、3゛末端がAでないことに留意
して設計する。 従って、本発明で筐用する新規ペプチドの構造遺伝子の
好ましい具体例は、後記の実験例および遺伝子設計図に
示した塩基配列のものである(図中、この構造遺伝子は
、Hi s Iこ対応するCΔCからA s nに対応
するAACの部分までである)。 この構造遺伝子を発現させる方法は、例えば、大腸菌の
ラクトースオペロンのβ−ガラクトンダーゼの構造遺伝
子中にこの遺伝子を挿入して、融合蛋白として発現させ
ることができる。すなわち、まず、構造遺伝子の5′末
端側には、臭化ジアン分解のためのMet(L−メチオ
ニン)のコドンを、3′末端側には、終止コドンを設け
る。この際、終止コドンは、2つ以上つなげることが好
ましい。 また、構造遺伝子の5′末端側には、臭化ンアン分解の
ためのMetのコドンのATGの代わりlこ化学的分解
方法の一種であるN−ブロモコハク酸イミドによろうす
解のための1”rp(I−l−リプ]・ファン)のコド
ンを設けてもよく、また、蛋白分解酵素の一種である血
液凝固因子Xaの認識Vるr l e−G I u−G
I y−Ar gに相当するコドンあるいは、トロン
ビンの認識するV a I −Pro−Argに相当す
るコドンを設けてもよい。 l】)合成 北記のように設計した遺伝子を合成するには、七−両鎖
のそれぞれについて、これをいくつかの7ラグメントに
分けてこれらを化学的に合成し、各々のフラグメントを
結合する方法によればよい。 各鎖は、18〜30塩基からなり、各々が10〜12塩
基ずつ重なるように、8程度度のフラグメントに分ける
のが好ましい。 各7ラグメントの合成法どしては、固相法、液相法lこ
よる合成方法があるが、ホスホルアミダイト法による固
相合成法によるのがもっとも好ましい。 i)精製 フラグメントを合成する際、鎖長が長くなると不純物か
多くなり、−船釣に精製が困難になるが、精製するには
、ホスホルアミダイ1−法によるオリゴヌクレオチド合
成の中間体である5′水酸基の保護基の付いたオリゴヌ
クレオチドを逆相高速液体クロマトグラフィー(逆相H
PLC)で分取し、保護基を除いた後、更に陰イオン交
換カラムクロマトグラフィーを用いて分取した後、脱塩
することで達成出来る。 ■)リン酸化および結合 5′末端7ラグメントを除く各フラグメントは、T4−
キナーゼでリン酸化し、それぞれの反応液において、酵
素を不活性化した後、混合し、脱塩した。脱塩したフラ
クションを濃縮し、5′末端フラグメントを加えて、9
0〜100 ’C!加熱したうえでゆっくり冷却して、
アニールさせ、さらにT、−DNAリガーゼを用いて反
応させることにより結合し、構造遺伝子断片として得る
ことができる。 ■)β−ガラク1−/ダービ発現系を有するベクターの
調製 本発明においては大腸菌染色体DNA由来のβ−ガ2タ
ト/ダーゼの構造遺伝子とその発現のためのプロモータ
ー等の発現システムを有し、大腸菌内で増殖可能なさま
ざまなプラスミドを用いることが可能であり、それらの
グラスミドを調製するにあたっては、公知の常法に従っ
て行うことができるが、既にβ−ガラクトシダーゼの構
造遺伝子が導入されたplBl (ATCC31449
)等のプラスミドより、β−ガラクトシダーゼの構造遺
伝子を得ることが好都合である。この遺伝子の適当な場
所に、目的とするベプタイドの構造遺伝子を組み込むこ
とで、β−ガラクトシダーゼとの融合蛋白が作られる。 3)プラスミド組換え分子 前記のβ−ガラクトシダーゼの構造遺伝子を本発明のペ
プチドの構造遺伝子を含むプラスミドに一般の遺伝子組
換えの操作によって組込むことにより、プラスミド組換
え5子を構築する。 本発明の具体例で1よ、ベクターとしてpBR322を
使用し、その制限酵素EeoRIとBamHlで切断さ
れた大きいほうのフラグメントに本発明のペプチドの構
造遺伝子を含む遺伝子を組込み、史にβ−ガラクトシダ
ーゼの構造遺伝子を組込むことによって、組換え分子と
している。本発明では、このプラスミド組換え分子をp
Y1005と命名した。 4)形質転換 i)宿主菌 が1記のような本発明のペプチドの構造遺伝子を組込ん
だプラスミド組換え分子、例えばpY1005を用いて
、形質転換させる宿主細胞としては、大腸菌株RRIΔ
M15(ATCC35102)、J M l 01、J
M105等の大腸菌に12株の誘導体であって、ラクト
ースオペロンのしプレツサー活性の高いIac i”
の宿主が望ましい。 ■)形質転換 常法により形質転換する。 山)形質転換体 形質転換体の具体例としては、宿主細胞としての大腸菌
株RRIΔM15を、例えばpY1005を用いて形質
転換さゼたRRIΔM15(pY1005)が挙げられ
る。 5)ペプチドの産生 1)形質転換体の培養 形質転換体の培養に当たっては、L−培地、M9培地、
M9−カザミノ酸培地、高リン酸培地、高リン酸−カザ
ミノ酸培地等を用いることができ、こねにイソプロピル
チオガラクトシド(IPTG)を添加し、更に培養する
ことにより、本発明のペプチドとβ−ガラクトシダーゼ
の融合蛋白(以下融合蛋白と省略する。)を量産するこ
とができる。 i)融合蛋白の精製 大腸菌で発現した融合蛋白は、大腸菌を超音波破砕後、
遠心分離することによって、水不溶性画分として得るこ
とができ、この操作により大腸菌中の多くの水可溶性蛋
白との分離が可能である。 この時点での水不溶性画分には、融合蛋白の他に、膜蛋
白が存在するため、トリトン−xio。 等の界面活性剤による膜蛋白の可溶化を行って、不溶性
の融合蛋白を得るかまたは、塩酸グアニ・ノン溶液を含
む緩衝液を用いたゲル濾過ならびにイオン交換ツノラム
を用いた精製等を行うことで分離可能である。 また、更に抗β−ガラクI−シダーゼ抗体、抗VIP抗
体を適当なカラム担体に保持させたイムノアフィニティ
ーカラムクロマトグラフィーにイ寸すごともできる。 1ii)融合蛋白の分解 融合上白を分解し、本発明のペプチド全切り出すために
は、上記のように精製した融合蛋白がMetを介して結
合している場合は、臭化シアンを用いて、β−ガラク[
・ンダーゼ七本発明のベブチドヲ連結しているメチオニ
ンを分解す−ることで得られるが、Trpを介しで結合
している場合においては、N−ブロモコハク酸イミドを
用いることで化学的に分解される。 また、I l c−G l u−G I y−Ar g
を介して結合している場合は、血液疑固因子Xaを用い
て、また、Val−Pro−Argをfして結合してい
る場かは、l−c+ンヒンを用いて酵素的に分解するこ
とかでさる。 1ν)本発明のペプチドのFi’を製 融合蛋白を上記のように分解して得られたペプチド混合
物より本発明の化合物を精製するには、逆相1(P L
CJダよび陽イオン交換高速液体クロ1トゲラフイー
(陽イオン交換!−I P L C)に付すことにより
なされるが、更に、抗VIP抗体を用いたイムノアフィ
ニティーカラムクロマトグラフィーに付すことにより、
効率的な精製を達成することかで謝る。 V)本発明のペプチドの確認 このようにしで、得られた本発明のペプチドは、アミノ
酸組成分析、エドマン分解によるアミノ酸配列分析およ
び抗V I り抗体よ6(ムノアノセイ!こより、確認
することができる。 F実施例1 実施例1゜ (C[
【−)゛1ヘキンカルポニル−1,−アスパラギ
ンの結罰した4−(オキシメイル)フLニルアセトアミ
ドメチル樹脂(アプライドバイオシステム社製)0 、
51amoffを塩化メチレン中、50%i−リフロロ
酢酸で処理しr、1ert−ブトキンカルボニルM ヲ
はずし、tert−ブI・キシカルボニル−し−ロイシ
ン(アプライドバイオシステム社製)2mmolをジシ
クロへキシルカルボジイミドを用いて結合させた。 以下、B o c−アミノ酸を、Ile、Ser、As
n1Leu、Tyrs Lys、Lys。 Vals Ala、Leu、G1n5 Lys。 Arg、Leu、Arg、Thr、Tyr。 Asn、Asp、Thr% Phe、Va l、Ala
SAsp、Ser、Hisの順で結合させ反応液を得た
。 以上の反応は、アプライドバイオシステム社製のペプチ
ドシンセサイザ・−モデル430AにJ:り行った。 結合反応終了後、この樹脂をアニソールBよびエチルメ
チルスルフィドの存在下、フッ化水素酸を加え、−20
°Cで30分、ついで0℃で10分間反応させて、脱保
護および樹脂からの脱離を行い、2N−酢酸を用いて溶
解し、凍結乾燥後、逆相HP L Cにより精製し、白
色粉末120!9を碍た。 以上のようにして生産され!−ペプチドの構造は、アミ
ノ酸配列をペプチド/−タエンサ= (アプライドバイ
オシステム社製・モデル477A)により、エドマン分
解して得られl−フェニルチオヒダントイン(P T
1−()アミノ酸を逆相HP I−Cで分析することI
こより所望のアミノ酸配列を何することを確認した。 実施例2゜ 1)本発明のペプチドの構造遺伝子を含む遺伝子の製造 りフラグメントのα成 本発明のペプチドの構造遺伝子を含む遺伝子(後記第1
図参照、以下遺伝子lとする。)の構成は、以下に示す
8フラグメントからなるかこのフラグメントの合或は、
D N A合成機(アプライドパイオンステム社W、3
80A)を用いて、ホスホルアミダイト法により固相合
成した。 ■5’−AATTCATGCACTCTGACG■5″
−CAGTGAATACAGCGTCAGAGTGCA
TG ■5’−CTGTATTCACTGACAACTACA
CTCGTC ■5’−TGTTTACGCAGACGAGTGTGT
TGT ■5’−TGCGTAAACAGCTGGCAGTAA
G ■5’−TCAGGTATTTCTTAACTGCAG
C ■5’−AAATACCTGAACTCTATCCTG
AACTGATAG ■5°−GATCCTATCAGTTCAGGATGA
GT 以上の7ラグメントの精製に当たっては、それぞれ、D
NA合成機による固相合成終了後、得られた塩基及び5
′水酸基の保護基の付いたオリゴヌクレオチドを含むア
ンモ、−ア溶液を55°C,5時間加熱して、塩基の保
護基を外し、反応後アン七ニアを減圧留去した後、逆相
HPLCに付して、5′水酸基の保護基のみ付いたオリ
ゴヌクレオチドを分取した。得られたフラクションを8
0%酢酸で室温15〜30分処理して、5′水酸基の保
護基を除去し、減圧留去俊、陰イオン交換カラム(DE
AE−2sw)に付し、オリゴヌクレオチド画分を得た
。これをゲル濾過カラム(セファデックスG25)で脱
塩しで、それぞれのフラグメ ン ト をt与l二。 11)リン酸化 上記■〜■のフラグメント各800 pmolをそれぞ
れ60鰭 トリス塩酸緩衝液(pH7,5)、10xM
Mg Cl 2.15RM2−メルカプトエタノール
、0.08.MATPからなる混合液に加え、更に、T
4−キナーゼ 25単位(BRL社製)を加えて、37
°C,2時間反応させた。反応後、65”C,15分加
熱して、酵素を不活化した後、各反応液を合し、ゲル濾
過カラム(セファデックスG50)でまとめて、脱塩し
た。 iii )フラグメントの結合 脱塩後のフラクションを遠心濃縮機で濃縮後、更に、■
、■のオリゴヌクレオチド7ラグメント各1600pm
olを、50 IN トリス塩酸緩衝液(pH7,6
)、lO關MgCl□からなる上記■〜■のリン酸化し
たオリゴヌクレオチドフラグメントの混合液に加え、9
0°C13分加熱後、ゆっくり冷却して、アニールさせ
た。冷却後、反応液を201@の濃度となるようジチオ
スレイ]・−ルを加え、更に、l xMの濃度となるよ
うにATPを加えて、T、DNAリガーゼ2000単位
(NEB社装)を用いて、16°0,19.5時間反応
させた。 1v)v4製 反応液を厚さ2II1mの10%ポリアクリルアミド電
気泳動(PAGE)に付し、目的の長さ(98bp)の
バンドを切り出した。切り出したゲルから電気的にNA
−45ペーパー(Scbleicber & 5chu
elf社製)にDNAを吸着させl−後、ペーパーを1
MNacl、20i1i11−リス塩酸緩衝液(p H
8,0) 、0.1.14 EDTAからなる高塩濃度
緩tj液中65°C,1時間加熱することにより溶出し
た。この溶液を7エノール及びエーテルで不純物を除い
た後、2.5倍量のエタノールを加え、エタノール沈澱
を行′つた。 V)リン酸化 このようにして得た遺伝子は、それぞれ、5′末端がリ
ン酸化されていないため、これを603I8トリス塩酸
緩衝液(pI−17,5) 、l O鰭MgC1゜、1
5鰭 2−メルカプトエタノール、0.081MATP
からなる混合液に加え、更に、T4−キサーゼ 25単
位(BRL社製)を加えて、37°C12時間反応させ
た。反応後、65°C115分加熱して、酵素を不活化
した後、ゲル濾過カラノ、(セファデックスG50)で
脱塩し、遺伝子フラグメント(VIP98)(後記第1
図参照)として精製した。 vi)ベクターの調整 プラスミドI)BR322(7アルマシア社製)81!
9を10次M トリス塩酸緩衝液(p H7、5)、1
0鰭MgCl2.1鰭ジチオスレイトール、10011
4Nac!からなる混合液に加え、これに、制限酵素E
coRI 160単位および制限酵素BamH115
0単位を加えて、37℃、2時間反応させた後、反応液
を0.6%アガロースゲル電気泳動で分離し、大きいほ
うのフラグメントをNA−45ペーパーに吸着させた後
、ペーパーを1MNac1.20x[l−リス塩酸緩衝
液(pH8、0) 、0 、1 mHE D T Aか
らなる高塩濃度緩衝液中65°0. 1時間加熱するこ
とにより溶出した。この溶液をフェノール及びエーテル
で不純物を除いた後、2.5倍量のエタノールを加え、
エタノール沈澱を行った。このうち、o、iu9を、遺
伝子フラグメンhVIF98 0.2膚とともに、50
、Ml−リス塩酸緩衝液(pH7,0) 、】、O鰭M
gC+□、10關ジチオイスレイトール、2531MN
aC1% ld ATPからなる混合液に加え、更に、
T4−リガーゼ 400単位を加えて、16°C118
時間反応させた。常法にしたがい、この反応液を用いて
、Ca CI x法により、大腸菌株RRIΔM15を
形質転換し、50Ali/dのアンピシリンを含有する
し一プレート上で、形質転換体を得た。更に、得られた
形質転換体を104/−のテトラサイクリンを含有する
し一プレートにレプリケーションし、テトラサイクリン
感受性であることを確認した後、形質転換体よりアルカ
リンリシス法により、プラスミドを抽出し、10mMト
リス塩酸緩衝液(pH7,5)、10x1.1Mgc+
2、I zM ジチオスレイト・−ル、100jlil
NaClからなる混合液に加え、これに、制限酵素E
c o RIおよび制限酵素BamH1を加えて、37
°C12時間反応させた後、反応液を3%アガロースゲ
ル電気泳動で遺伝子フラグメントvIP98を確認して
、組換え体RRIΔM15(pY1004)を得た。 上記のアルカリンリシス法により抽出したプラスミドp
Y1004 8膚を10.14 トリス塩酸緩衝液(
+) H7,5) 、10zM Mg Cl z、1
zMジチオスレイトール、1001MNaC1,10u
9/111!Q BSAからなる混合液に加え、これに
、制限酵素EcoRI 80単位を加えて、37°C
,2時間反応させた後、反応液を0.7%アガロースゲ
ル電気泳動で分離し、NA−45ペーパーに吸着させた
後、ペーパーをIM NaC+、20xM トリス塩
酸緩衝液(pH8,0) 、O,1,)l EDTAか
らなる高塩濃度緩衝液中65°C,1時間加熱すること
により溶出した。この溶液をフェノール及びエーテルで
不純物を除いた後、2.5倍量のエタノールを加え、エ
タノール沈澱を行った。この沈澱を50鰭 トリス塩酸
緩衝液(pH8,0)に溶解後、アルカリンホスファタ
ーゼ19単位を加えて、37°C,1時間反応させ、反
応液をフェノール、クロロホルムで抽出後、エタノール
沈澱して、プラスミド断片(pY1004−E)を回収
した。 ここで、ベクターplB1 20u9をlOjlM ト
リス塩酸緩衝液(pH7,5)、10鰭MgC+2、l
、iM ジチオスレイトール、100zM100zか
らなる混合液に加え、これに、制限酵素EcoRI
240単位を加えて、37°0.2時間反応させた後、
反応液を0.6%アガロースゲル電気泳動で分離し、大
きいほうの7ラグメントをNA−45ペーパーに吸着さ
せた後、ペーパーをLMNaC+、201M トリス
塩酸緩衝液(pH8,0)、0 、 I JIM E
D T Aからなる高塩濃度緩衝液中65°0.1時間
加熱することにより溶出した。この溶液をフェノール及
びエーテルで不純物を除いた1、2.5倍量のエタノー
ルを加え、エタノール沈澱を行った。沈澱として得られ
たプラスミド断片(pIBI−E)のうち、0.14を
、あらかじめ作成しておい?:pY1004−E o
、i膚とともに、5011M トリス塩酸緩衝液(pH
7,5)、lOd M g CI z、IOIM ジチ
オイスレイトール、25xMNaCI、J、、MATP
からなる液に加え、更に、T4−リガーゼ 400単位
を加えて、16℃、18.5時間反応させた。常法にし
たがい、この反応液を用いて、CaCl2法により、大
腸菌株RRIΔM15を形質転換し、50膚/−のアン
ピシリンを含有し、更に、2%X−g al 50成
および0.1+ll IPTG 20躍を塗布したL
〜プレート上で、青色コロニーとして検出される形質転
換体を得た。 この形質転換体におけるベクター上のβ−ガラクi・シ
ダーゼ遺伝子の挿入方向は、形質転換体より分離したベ
クターを制限酵素BamHIおよびHindI[[によ
って二重消化し、その7ラグメントパターンにより分析
し、所望のプラスミドにより形質転換された形質転換体
であることを確認し、組換え体RRIΔM15 (py
loos)を得た。 組換え体RRIΔM15 (pYlo05)を、L−培
地中で、37°Cで培養し、0.D−ss。= 0゜7
になったところで、最終濃度として2鱈のIPTGを加
え、更に5時間培養し、培養液より、遠心分離により、
菌体を回収し、回収した菌体に、5DS−PAGE用緩
衝液を加え、100°0.5分過熱し、10%5DS−
PAGEを行った。 このゲルをニトロセルロース紙にエレクトロブロッティ
ングし、ウサギ抗VIP抗血清(C18社製)およびア
ルカリ性ホスファターゼの結合した抗ウサギIgGを用
いウェスタン・ブロッティングしたところ、目的の分子
量のバンドのみが発色し、本発明のペプチドがβ−ガラ
クトンダーゼとの融合蛋白として発現していることが確
認されjこ。 vii)精製 組換え体RR1ΔM15 (pY1005)を、2.4
Qのし一培地中で、37°Cで培養し、0 、D 、s
s。−0,7になったところで、最終濃度として2繻の
I PTGを加え、更に5時間培養し、培養液より、遠
心分離により、菌体を回収し、回収した菌体を10m1
J トリス塩酸(pH8,0)、l mM M g C
I 2. L mMフェニルメチルスルホニルフルオ
ライド(PMSF) 、5mM 2−メルカプトエタノ
ールからなる緩衝液100111に懸濁し、超音波処理
により破砕し、これを27000gで遠心分離し、本発
明のペプチドとβ−ガラクトンターゼの融合蛋白を含む
沈澱を得た。 この沈澱を70%ギ酸溶液20dに溶解後、BrCN2
.1iiを加えて、室温で26時間反応させ、融合蛋白
を分解した後、水で10倍希釈して凍結乾燥し、得られ
た粉末から水可溶分を更に水で抽出して、逆相HPLC
(カラムMMC−pack、AM312)に付し、実施
例1で得たペプチドを標準として本発明のペプチドを含
む両分を分取した。 この画分を濃縮後、更に陽イオン交換HPLC(Asa
h 1pak ES−502C)により、精製し、更
に脱塩を兼ねて逆相HP L Cで、再度精製して目的
のペプチド500膚を得た。 viii)確認 以上のようにして生産されたペプチドの構造は、アミノ
酸配列をベプチドシークエンサー(アフライドバイオシ
ステム社製)により、エドマン分解して得られたフェニ
ルチオヒダントイン(PTH)アミノ酸を逆相HP L
Cで分析することにより所望のアミノ酸配列を有する
ことを確認した。 [発明の効果] 次に、本発明のペプチドが降圧作用を示すことを実験例
を挙げて説明する。 実験例 〈ラットの血圧に及ぼす影響〉 本発明のペプチドを、体重200gのSD系雄ラントの
頚静脈に400 ng/kg投与したところ、10mm
■gの頚動脈圧下降が観察され、本発明のペプチドの医
療応用上の有用性が示された。 本発明のペプチドは、注射剤として用いることができ、
注射剤を製造する場合には、希釈剤として、一般に注射
用蒸留水、生理食塩水、デキストロース水溶液、注射用
植物油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ル等を用いることができる。さらに、必要に応じて、適
宜、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤等を加えても
よい。 また、本発明のペプチドは、ネブライザー、吸入器等を
用いて、鼻粘膜、気管支に直接投与することもできる。 また、本発明のペプチドは、浸透補助剤等とどもに、外
用剤として用いることもできる。 更に、本発明の化合物は、薬理学上使用し得る酸または
塩基を用いた塩として使用することもできる。
ンの結罰した4−(オキシメイル)フLニルアセトアミ
ドメチル樹脂(アプライドバイオシステム社製)0 、
51amoffを塩化メチレン中、50%i−リフロロ
酢酸で処理しr、1ert−ブトキンカルボニルM ヲ
はずし、tert−ブI・キシカルボニル−し−ロイシ
ン(アプライドバイオシステム社製)2mmolをジシ
クロへキシルカルボジイミドを用いて結合させた。 以下、B o c−アミノ酸を、Ile、Ser、As
n1Leu、Tyrs Lys、Lys。 Vals Ala、Leu、G1n5 Lys。 Arg、Leu、Arg、Thr、Tyr。 Asn、Asp、Thr% Phe、Va l、Ala
SAsp、Ser、Hisの順で結合させ反応液を得た
。 以上の反応は、アプライドバイオシステム社製のペプチ
ドシンセサイザ・−モデル430AにJ:り行った。 結合反応終了後、この樹脂をアニソールBよびエチルメ
チルスルフィドの存在下、フッ化水素酸を加え、−20
°Cで30分、ついで0℃で10分間反応させて、脱保
護および樹脂からの脱離を行い、2N−酢酸を用いて溶
解し、凍結乾燥後、逆相HP L Cにより精製し、白
色粉末120!9を碍た。 以上のようにして生産され!−ペプチドの構造は、アミ
ノ酸配列をペプチド/−タエンサ= (アプライドバイ
オシステム社製・モデル477A)により、エドマン分
解して得られl−フェニルチオヒダントイン(P T
1−()アミノ酸を逆相HP I−Cで分析することI
こより所望のアミノ酸配列を何することを確認した。 実施例2゜ 1)本発明のペプチドの構造遺伝子を含む遺伝子の製造 りフラグメントのα成 本発明のペプチドの構造遺伝子を含む遺伝子(後記第1
図参照、以下遺伝子lとする。)の構成は、以下に示す
8フラグメントからなるかこのフラグメントの合或は、
D N A合成機(アプライドパイオンステム社W、3
80A)を用いて、ホスホルアミダイト法により固相合
成した。 ■5’−AATTCATGCACTCTGACG■5″
−CAGTGAATACAGCGTCAGAGTGCA
TG ■5’−CTGTATTCACTGACAACTACA
CTCGTC ■5’−TGTTTACGCAGACGAGTGTGT
TGT ■5’−TGCGTAAACAGCTGGCAGTAA
G ■5’−TCAGGTATTTCTTAACTGCAG
C ■5’−AAATACCTGAACTCTATCCTG
AACTGATAG ■5°−GATCCTATCAGTTCAGGATGA
GT 以上の7ラグメントの精製に当たっては、それぞれ、D
NA合成機による固相合成終了後、得られた塩基及び5
′水酸基の保護基の付いたオリゴヌクレオチドを含むア
ンモ、−ア溶液を55°C,5時間加熱して、塩基の保
護基を外し、反応後アン七ニアを減圧留去した後、逆相
HPLCに付して、5′水酸基の保護基のみ付いたオリ
ゴヌクレオチドを分取した。得られたフラクションを8
0%酢酸で室温15〜30分処理して、5′水酸基の保
護基を除去し、減圧留去俊、陰イオン交換カラム(DE
AE−2sw)に付し、オリゴヌクレオチド画分を得た
。これをゲル濾過カラム(セファデックスG25)で脱
塩しで、それぞれのフラグメ ン ト をt与l二。 11)リン酸化 上記■〜■のフラグメント各800 pmolをそれぞ
れ60鰭 トリス塩酸緩衝液(pH7,5)、10xM
Mg Cl 2.15RM2−メルカプトエタノール
、0.08.MATPからなる混合液に加え、更に、T
4−キナーゼ 25単位(BRL社製)を加えて、37
°C,2時間反応させた。反応後、65”C,15分加
熱して、酵素を不活化した後、各反応液を合し、ゲル濾
過カラム(セファデックスG50)でまとめて、脱塩し
た。 iii )フラグメントの結合 脱塩後のフラクションを遠心濃縮機で濃縮後、更に、■
、■のオリゴヌクレオチド7ラグメント各1600pm
olを、50 IN トリス塩酸緩衝液(pH7,6
)、lO關MgCl□からなる上記■〜■のリン酸化し
たオリゴヌクレオチドフラグメントの混合液に加え、9
0°C13分加熱後、ゆっくり冷却して、アニールさせ
た。冷却後、反応液を201@の濃度となるようジチオ
スレイ]・−ルを加え、更に、l xMの濃度となるよ
うにATPを加えて、T、DNAリガーゼ2000単位
(NEB社装)を用いて、16°0,19.5時間反応
させた。 1v)v4製 反応液を厚さ2II1mの10%ポリアクリルアミド電
気泳動(PAGE)に付し、目的の長さ(98bp)の
バンドを切り出した。切り出したゲルから電気的にNA
−45ペーパー(Scbleicber & 5chu
elf社製)にDNAを吸着させl−後、ペーパーを1
MNacl、20i1i11−リス塩酸緩衝液(p H
8,0) 、0.1.14 EDTAからなる高塩濃度
緩tj液中65°C,1時間加熱することにより溶出し
た。この溶液を7エノール及びエーテルで不純物を除い
た後、2.5倍量のエタノールを加え、エタノール沈澱
を行′つた。 V)リン酸化 このようにして得た遺伝子は、それぞれ、5′末端がリ
ン酸化されていないため、これを603I8トリス塩酸
緩衝液(pI−17,5) 、l O鰭MgC1゜、1
5鰭 2−メルカプトエタノール、0.081MATP
からなる混合液に加え、更に、T4−キサーゼ 25単
位(BRL社製)を加えて、37°C12時間反応させ
た。反応後、65°C115分加熱して、酵素を不活化
した後、ゲル濾過カラノ、(セファデックスG50)で
脱塩し、遺伝子フラグメント(VIP98)(後記第1
図参照)として精製した。 vi)ベクターの調整 プラスミドI)BR322(7アルマシア社製)81!
9を10次M トリス塩酸緩衝液(p H7、5)、1
0鰭MgCl2.1鰭ジチオスレイトール、10011
4Nac!からなる混合液に加え、これに、制限酵素E
coRI 160単位および制限酵素BamH115
0単位を加えて、37℃、2時間反応させた後、反応液
を0.6%アガロースゲル電気泳動で分離し、大きいほ
うのフラグメントをNA−45ペーパーに吸着させた後
、ペーパーを1MNac1.20x[l−リス塩酸緩衝
液(pH8、0) 、0 、1 mHE D T Aか
らなる高塩濃度緩衝液中65°0. 1時間加熱するこ
とにより溶出した。この溶液をフェノール及びエーテル
で不純物を除いた後、2.5倍量のエタノールを加え、
エタノール沈澱を行った。このうち、o、iu9を、遺
伝子フラグメンhVIF98 0.2膚とともに、50
、Ml−リス塩酸緩衝液(pH7,0) 、】、O鰭M
gC+□、10關ジチオイスレイトール、2531MN
aC1% ld ATPからなる混合液に加え、更に、
T4−リガーゼ 400単位を加えて、16°C118
時間反応させた。常法にしたがい、この反応液を用いて
、Ca CI x法により、大腸菌株RRIΔM15を
形質転換し、50Ali/dのアンピシリンを含有する
し一プレート上で、形質転換体を得た。更に、得られた
形質転換体を104/−のテトラサイクリンを含有する
し一プレートにレプリケーションし、テトラサイクリン
感受性であることを確認した後、形質転換体よりアルカ
リンリシス法により、プラスミドを抽出し、10mMト
リス塩酸緩衝液(pH7,5)、10x1.1Mgc+
2、I zM ジチオスレイト・−ル、100jlil
NaClからなる混合液に加え、これに、制限酵素E
c o RIおよび制限酵素BamH1を加えて、37
°C12時間反応させた後、反応液を3%アガロースゲ
ル電気泳動で遺伝子フラグメントvIP98を確認して
、組換え体RRIΔM15(pY1004)を得た。 上記のアルカリンリシス法により抽出したプラスミドp
Y1004 8膚を10.14 トリス塩酸緩衝液(
+) H7,5) 、10zM Mg Cl z、1
zMジチオスレイトール、1001MNaC1,10u
9/111!Q BSAからなる混合液に加え、これに
、制限酵素EcoRI 80単位を加えて、37°C
,2時間反応させた後、反応液を0.7%アガロースゲ
ル電気泳動で分離し、NA−45ペーパーに吸着させた
後、ペーパーをIM NaC+、20xM トリス塩
酸緩衝液(pH8,0) 、O,1,)l EDTAか
らなる高塩濃度緩衝液中65°C,1時間加熱すること
により溶出した。この溶液をフェノール及びエーテルで
不純物を除いた後、2.5倍量のエタノールを加え、エ
タノール沈澱を行った。この沈澱を50鰭 トリス塩酸
緩衝液(pH8,0)に溶解後、アルカリンホスファタ
ーゼ19単位を加えて、37°C,1時間反応させ、反
応液をフェノール、クロロホルムで抽出後、エタノール
沈澱して、プラスミド断片(pY1004−E)を回収
した。 ここで、ベクターplB1 20u9をlOjlM ト
リス塩酸緩衝液(pH7,5)、10鰭MgC+2、l
、iM ジチオスレイトール、100zM100zか
らなる混合液に加え、これに、制限酵素EcoRI
240単位を加えて、37°0.2時間反応させた後、
反応液を0.6%アガロースゲル電気泳動で分離し、大
きいほうの7ラグメントをNA−45ペーパーに吸着さ
せた後、ペーパーをLMNaC+、201M トリス
塩酸緩衝液(pH8,0)、0 、 I JIM E
D T Aからなる高塩濃度緩衝液中65°0.1時間
加熱することにより溶出した。この溶液をフェノール及
びエーテルで不純物を除いた1、2.5倍量のエタノー
ルを加え、エタノール沈澱を行った。沈澱として得られ
たプラスミド断片(pIBI−E)のうち、0.14を
、あらかじめ作成しておい?:pY1004−E o
、i膚とともに、5011M トリス塩酸緩衝液(pH
7,5)、lOd M g CI z、IOIM ジチ
オイスレイトール、25xMNaCI、J、、MATP
からなる液に加え、更に、T4−リガーゼ 400単位
を加えて、16℃、18.5時間反応させた。常法にし
たがい、この反応液を用いて、CaCl2法により、大
腸菌株RRIΔM15を形質転換し、50膚/−のアン
ピシリンを含有し、更に、2%X−g al 50成
および0.1+ll IPTG 20躍を塗布したL
〜プレート上で、青色コロニーとして検出される形質転
換体を得た。 この形質転換体におけるベクター上のβ−ガラクi・シ
ダーゼ遺伝子の挿入方向は、形質転換体より分離したベ
クターを制限酵素BamHIおよびHindI[[によ
って二重消化し、その7ラグメントパターンにより分析
し、所望のプラスミドにより形質転換された形質転換体
であることを確認し、組換え体RRIΔM15 (py
loos)を得た。 組換え体RRIΔM15 (pYlo05)を、L−培
地中で、37°Cで培養し、0.D−ss。= 0゜7
になったところで、最終濃度として2鱈のIPTGを加
え、更に5時間培養し、培養液より、遠心分離により、
菌体を回収し、回収した菌体に、5DS−PAGE用緩
衝液を加え、100°0.5分過熱し、10%5DS−
PAGEを行った。 このゲルをニトロセルロース紙にエレクトロブロッティ
ングし、ウサギ抗VIP抗血清(C18社製)およびア
ルカリ性ホスファターゼの結合した抗ウサギIgGを用
いウェスタン・ブロッティングしたところ、目的の分子
量のバンドのみが発色し、本発明のペプチドがβ−ガラ
クトンダーゼとの融合蛋白として発現していることが確
認されjこ。 vii)精製 組換え体RR1ΔM15 (pY1005)を、2.4
Qのし一培地中で、37°Cで培養し、0 、D 、s
s。−0,7になったところで、最終濃度として2繻の
I PTGを加え、更に5時間培養し、培養液より、遠
心分離により、菌体を回収し、回収した菌体を10m1
J トリス塩酸(pH8,0)、l mM M g C
I 2. L mMフェニルメチルスルホニルフルオ
ライド(PMSF) 、5mM 2−メルカプトエタノ
ールからなる緩衝液100111に懸濁し、超音波処理
により破砕し、これを27000gで遠心分離し、本発
明のペプチドとβ−ガラクトンターゼの融合蛋白を含む
沈澱を得た。 この沈澱を70%ギ酸溶液20dに溶解後、BrCN2
.1iiを加えて、室温で26時間反応させ、融合蛋白
を分解した後、水で10倍希釈して凍結乾燥し、得られ
た粉末から水可溶分を更に水で抽出して、逆相HPLC
(カラムMMC−pack、AM312)に付し、実施
例1で得たペプチドを標準として本発明のペプチドを含
む両分を分取した。 この画分を濃縮後、更に陽イオン交換HPLC(Asa
h 1pak ES−502C)により、精製し、更
に脱塩を兼ねて逆相HP L Cで、再度精製して目的
のペプチド500膚を得た。 viii)確認 以上のようにして生産されたペプチドの構造は、アミノ
酸配列をベプチドシークエンサー(アフライドバイオシ
ステム社製)により、エドマン分解して得られたフェニ
ルチオヒダントイン(PTH)アミノ酸を逆相HP L
Cで分析することにより所望のアミノ酸配列を有する
ことを確認した。 [発明の効果] 次に、本発明のペプチドが降圧作用を示すことを実験例
を挙げて説明する。 実験例 〈ラットの血圧に及ぼす影響〉 本発明のペプチドを、体重200gのSD系雄ラントの
頚静脈に400 ng/kg投与したところ、10mm
■gの頚動脈圧下降が観察され、本発明のペプチドの医
療応用上の有用性が示された。 本発明のペプチドは、注射剤として用いることができ、
注射剤を製造する場合には、希釈剤として、一般に注射
用蒸留水、生理食塩水、デキストロース水溶液、注射用
植物油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ル等を用いることができる。さらに、必要に応じて、適
宜、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤等を加えても
よい。 また、本発明のペプチドは、ネブライザー、吸入器等を
用いて、鼻粘膜、気管支に直接投与することもできる。 また、本発明のペプチドは、浸透補助剤等とどもに、外
用剤として用いることもできる。 更に、本発明の化合物は、薬理学上使用し得る酸または
塩基を用いた塩として使用することもできる。
第1図は、本発明のペプチドの構造遺伝子を含む合成遺
伝子(VIP9B)の全D N i’、ンークエンスを
示す。 ■〜■は、化学合成りNAの7ラグメントおよびその配
列様式と示す。
伝子(VIP9B)の全D N i’、ンークエンスを
示す。 ■〜■は、化学合成りNAの7ラグメントおよびその配
列様式と示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 下記式 H−His−Ser−Asp−Ala−Val−Phe
−Thr−Asp−Asn−Tyr−Thr−Arg−
Leu−Arg−Lys−Gln−Leu−Ala−V
al−Lys−Lys−Tyr−Leu−Asn−Se
r−Ile−Leu−Asn−OHで表される新規ペプ
チド。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63126981A JPH01296996A (ja) | 1988-05-26 | 1988-05-26 | 新規ペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63126981A JPH01296996A (ja) | 1988-05-26 | 1988-05-26 | 新規ペプチド |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01296996A true JPH01296996A (ja) | 1989-11-30 |
Family
ID=14948693
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63126981A Pending JPH01296996A (ja) | 1988-05-26 | 1988-05-26 | 新規ペプチド |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH01296996A (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0517931A1 (en) * | 1989-12-11 | 1992-12-16 | KAJI, Akira | Physiologically active peptides, use thereof and a method of producing said peptides |
WO1994019469A1 (fr) * | 1993-02-22 | 1994-09-01 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Proteine de fusion multi-vip et procede de preparation de vip recombinant |
US5376637A (en) * | 1991-04-22 | 1994-12-27 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd. | Pharmaceutical preparation containing vasoactive intestinal polypeptide or its analogue |
US5428015A (en) * | 1990-06-26 | 1995-06-27 | Sana Kagaku Kenkyusho Co., Ltd. | Vasoactive intestinal polypeptide analogues and use thereof |
-
1988
- 1988-05-26 JP JP63126981A patent/JPH01296996A/ja active Pending
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0517931A1 (en) * | 1989-12-11 | 1992-12-16 | KAJI, Akira | Physiologically active peptides, use thereof and a method of producing said peptides |
US5316919A (en) * | 1989-12-11 | 1994-05-31 | Akira Kaji | Method of producing 2 KD to 10 KD peptides having no L-methionine residue |
EP0763598A1 (en) | 1989-12-11 | 1997-03-19 | KAJI, Akira | Method of preparing a fusion protein |
US5428015A (en) * | 1990-06-26 | 1995-06-27 | Sana Kagaku Kenkyusho Co., Ltd. | Vasoactive intestinal polypeptide analogues and use thereof |
US5376637A (en) * | 1991-04-22 | 1994-12-27 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd. | Pharmaceutical preparation containing vasoactive intestinal polypeptide or its analogue |
WO1994019469A1 (fr) * | 1993-02-22 | 1994-09-01 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Proteine de fusion multi-vip et procede de preparation de vip recombinant |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CA2070503C (en) | A-c-b proinsulin, method of manufacturing and using same, and intermediates in insulin production | |
JPS6248699A (ja) | 融合抗原ポリペプチド | |
JPH0432838B2 (ja) | ||
GB2172890A (en) | Epidermal growth factor production | |
JPH025869A (ja) | Dna配列、組換えdna分子及びリポコルチン類3、4、5並びに6の製造方法 | |
JP2862870B2 (ja) | 新規ペプチド | |
JPH01296996A (ja) | 新規ペプチド | |
JPS63304987A (ja) | アンギオゲニン類の遺伝子工学産生方法 | |
EP0095351B1 (en) | A precursor of a c-terminal amidated peptide and production thereof | |
KR100213662B1 (ko) | 엘라스타제 저해활성을 갖는 신규 펩티드 및 그의 제조방법 | |
US5620923A (en) | Synthesis of peptides as cloned ubiquitin extensions | |
US4711847A (en) | Preparation of secretin | |
JPH0257192A (ja) | モチリン様ポリペプチドの製法並びにそのための組換えdna及び発現用プラスミド | |
JP2845558B2 (ja) | メチオニンアミノペプチダーゼのdna配列 | |
JP2829397B2 (ja) | フィブリン結合活性ポリペプチド | |
JP2515975B2 (ja) | 抗腫瘍作用を有するポリペプチド | |
JPH02219588A (ja) | ストレプトミセスにおけるインシュリン前駆体の製造 | |
JPH07501529A (ja) | 陸蛭からの新規トロンビン阻害性蛋白質 | |
JPH0774235B2 (ja) | 血小板のコラーゲンとの付着を阻止するためのタンパク質 | |
US5316919A (en) | Method of producing 2 KD to 10 KD peptides having no L-methionine residue | |
JP2698976B2 (ja) | 新規ポリペプチド及びそれをコードするdna | |
JPS62226998A (ja) | ヒトカルシトニン前駆体ペプチド及びその製造方法 | |
JP2793216B2 (ja) | 粘膜による吸収を高める、ソルビン及び誘導ペプチド | |
JPH04500156A (ja) | 活性型ヒト好中球走化因子ポリペプチドの製造方法 | |
JPS61291598A (ja) | 魚類カルシトニン誘導体及びその製造方法 |