WO1994019469A1 - Proteine de fusion multi-vip et procede de preparation de vip recombinant - Google Patents

Proteine de fusion multi-vip et procede de preparation de vip recombinant Download PDF

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WO1994019469A1
WO1994019469A1 PCT/FR1994/000111 FR9400111W WO9419469A1 WO 1994019469 A1 WO1994019469 A1 WO 1994019469A1 FR 9400111 W FR9400111 W FR 9400111W WO 9419469 A1 WO9419469 A1 WO 9419469A1
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WO
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vip
arg
ser
gly
ile
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PCT/FR1994/000111
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English (en)
Inventor
Fabienne Lavergne
Jean-Marc Muller
Annie-Claire Marie Hélène MEUNIER
Yves Cenatiempo
Raymond Alphonse Julien
Joël RAINGEAUD
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Universite De Limoges
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C12N9/1088—Glutathione transferase (2.5.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/57563—Vasoactive intestinal peptide [VIP]; Related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/23—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a GST-tag

Definitions

  • the present invention relates to the production of a recombinant VIP (Vasoactive Intestinal Peptide) neuropeptide, in particular a VIP of which the amino acid in the C-terminal position is not amidated.
  • VIP Vasoactive Intestinal Peptide
  • Sx VIP is a neuropeptide with 28 amino acids and a molecular weight of 3326, generally extracted from intestinal cells, nervous tissue and endocrine cells.
  • VIP is a known mediator of vasodilation of the blood vessels of the brain, stimulation of prolactin production or endocrine, pancreatic secretion.
  • 10 VIP is mainly obtained by tissue extraction or by chemical synthesis.
  • the human VIP precursor gene was isolated and characterized, in particular by Bodener et al. (Proc. Nat. Acad Sci., USA, 1985, 252, 3548-3551), as well as its transformation, its integration into a plasmid and its expression in a host microorganism (WO-A-89/05857).
  • the present invention therefore relates to a fused polypeptide of formula ⁇ _T- (A-VIP-B-C) n -A-VIP-B-Y in which
  • VIP substantially represents the peptide sequence His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gin-Met- Ala-Val-Lys-Lys-Tyr -Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn,
  • X represents a marker protein, or the Met-His- -Gly-Cys-Arg-Ser-Ile-Asp-Ser peptide sequence
  • T represents the peptide sequence Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser in the case where X represents a marker protein, or the peptide sequence Arg-Gly-Ser in the other case.
  • A represents the peptide sequence Ile-Glu-Gly-Arg
  • 5 B represents the peptide sequence Gly-Ser-Thr-Pro-Arg
  • C represents the amino acid Ser
  • Y represents the Gly-Ile-His-Arg-Asp peptide sequence
  • n represents an integer between 0 and 31.
  • n is between 1 and 31.
  • i O The presence of a marker protein may be of interest during the purification of the fused polypeptide according to the invention.
  • X is chosen from glutathione S-transferase (GST) (Smith & al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83 (1986) S703- & 707, and 8 (1987), 6541) . 1 -5
  • GST glutathione S-transferase
  • n is preferably chosen from the integers 0, 1, 3, 7, 15 or 31.
  • the present invention also relates to the gene encoding the above fused polypeptide. It also relates to an expression plasmid comprising the gene according to the invention, under the dependence of DNA sequence ensuring its expression in a host microorganism, and the transformed microorganism comprising at least one of these plasmids.
  • this microorganism is E. coli JM 25 105 (ATCC No. 47016).
  • the present invention relates to a process for the preparation of recombinant VIP comprising the following steps:
  • the fused polypeptide is preferably extracted by sonication and centrifugation of the sonicated bacteria.
  • the A-VIP site cleavage agent is preferably factor Xa or thrombin, while hydroxylamine is used as the VIP-B site cleavage agent.
  • the present invention also relates to a recombinant VIP neuropeptide obtained by the above method.
  • the present invention finally relates to an intermediate polypeptide for the preparation of recombinant VIP, corresponding to one of the following formulas:
  • VIP-B-C-A (B-C-A-VIP) (B-C-A-VIP) ( VIP-B
  • Figure 1 shows the construction scheme of the plasmids.
  • FIG. 2 represents an autoradiography of the sequence gel of the plasmid pUC18 into which the VIP oligonucleotide of sequence (antisense strand) has been inserted:
  • FIG. 3 represents a 2% agarose gel showing the sequential insertion of the VIP units into the plasmid pUC deltaS-FXa. All the plasmids were digested with Pvull.
  • FIG. 4 relating to the expression and the purification of the GIV hybrid protein, represents a 12.5% SDS polyacrylamide gel stained with Coomassie blue showing:
  • FIG. 5 relating to the expression and the purification of the hybrid protein G16V, represents a 12.5% SDS polyacrylamide gel stained with Coomassie blue showing:
  • FIG. 6, relating to the cleavage of the GIV hybrid protein by factor Xa represents a 16.5% polyacrylamide-SDS gel glycerol stained with Coomassie blue showing: lane a) the hybrid protein purified by affinity chromatography, lane b), c), d) and e) incubation with factor Xa for 1, 2, 3 and 5 hours respectively, at 25 ° C., in a enzyme / substrate ratio of
  • FIG. 7 relating to the cleavage of the hybrid protein G16V by factor Xa, represents a denaturing gel in gradient of polyacrylamide 10 12% to 20% stained with Coomassie blue showing:
  • lane a the soluble hybrid protein lanes b), c), d) and e) incubation with factor Xa for 15, 30, 45 minutes and 3 hours respectively at 25 ° C, in a ratio l - 5 enzyme / 1/50 substrate.
  • lane f VIP monomer (4.4 Da) purified on an HPLC column (characteristics: legend Fig. 8).
  • FIG. 8 represents the purification diagram of the monomer and of the VIP dimer on an HPLC analytical column of the Vydac type, C 18.5 ⁇ m, 300A end capped:
  • FIG. 9 represents the diagram of analysis by capillary electrophoresis of the purified fraction of the VIP monomer.
  • FIG. 10 represents the Western blot analysis of the purification of the G16V protein and its digestion with factor Xa:
  • FIG. 11 represents the displacement curves of the binding of the radioiodic VIP by the GIV protein to the receptors of human colon adenocarcinoma cells (line HT29):
  • FIG. 12 represents the displacement curves of the binding of the radioiodic VIP by the purified VIP monomer (4.4 kDa) (FIG. 7 lane f) to the receptors of human colon adenocarcinoma cells (HT29 line): VIP control ( 1) and VIP monomer (2).
  • FIG. 13 represents the displacement curve of the radioiodic VIP binding by the recombinant VIP, obtained after treatment with hydroxylamine: control VIP (1) and recombinant VIP (2).
  • FIG. 14 represents the stimulation curves for the production of cAMP by the recombinant VIP and a mixture of poly (VIP) comprising from 2 to 9 VIP sequences: VIP control (*), recombinant VIP (*), and polyVIP ( AT ).
  • VIP control (*)
  • recombinant VIP (*)
  • polyVIP AT .
  • EXAMPLE GSTVIP and GSTpolyVIP FUSION
  • a synthetic oligonucleotide encoding the factor Xa cleavage site (peptide sequence Ile-Glu-Gly-Arg) is inserted into the commercially available plasmid pGEX-2T, 3 ′ and in phase with the Glutathione S gene -transferase in the BamHI and EcoRI sites.
  • GST glutathione S-transferase
  • pGEX 2T a sequence of nucleotides coding for the thrombin cleavage site (peptide sequence Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser). This site makes it possible to consider, using thrombin, the subsequent separation of the GST and a VIP or polyVIP containing supernumerary amino acids.
  • the VIP gene (see sequence, FIG. 2) or polyVIP is inserted into the filled SalI site, 3 ′ of the nucleotide sequence coding for factor Xa and in phase with the latter.
  • the sequential insertion of VIP genes can make it possible to better control the addition of VIP units and to obtain a larger concatamer.
  • factor Xa releases the poly (VIP) without residual amino acid at the N-terminus.
  • factor Xa also cleaves a secondary cleavage site of factor Xa in the binding peptide B-C-A (cleavage after the 5th amino acid in the sequence).
  • the sequence (Ser-Thr-Pro-Arg ⁇ Ser) does not have
  • a glycine makes it possible, when cut by the hydroxylamine, to eliminate the supernumerary amino acids.
  • plasmid pUC18 is digested with SalI, filled with the fragment of Klenow and closed on itself by T4 DNA ligase, which allows the elimination of the SalI site.
  • the plasmid obtained is called pUCl ⁇ deltaS.
  • the synthetic oligonucleotide, coding for the factor Xa cleavage site, is inserted into the BamHI / EcoRI sites of the plasmid
  • pUC18deltaS-FXa This plasmid, called pUC18deltaS-FXa, is digested with SalI and the site is filled with the Klenow fragment and then ligated with the oligonucleotide VIP (cf. fig. 1).
  • a recombinant clone comprising the VIP oligonucleotide in the correct direction is sequenced in order to precisely verify the sequences of the oligonucleotides encoding the VIP and the cleavage site by factor Xa, the maintenance of the phase and of the restriction sites (cf. fig. 2).
  • the filled BamHI / EcoRI fragment can be recovered and reinserted into this same plasmid opened by Smal / EcoRI (cf. fig. 1).
  • the hybrid protein is soluble and can be purified by affinity chromatography on an agarose glutathione column from a bacterial cytoplasmic extract (FIG. 5, lane c). This purification, based on the ability of the marker protein (GST) to bind reversibly to reduced glutathione, gives a yield of hybrid protein of the order of 90%.
  • GST marker protein
  • the hybrid protein consists of the following sequences:
  • GST GST sequence a: factor Xa cleavage site
  • VIP VIP b sequence: hydroxylamine cleavage site
  • the next step therefore consists in cleaving this protein by factor Xa (in order to separate the VIP from the marker protein).
  • the action of hydroxylamine subsequently releases the VIP from the supernumerary amino acids, resulting from the chosen construction.
  • Figure 6 shows the electrophoretic analysis of digestion performed with factor Xa.
  • the hybrid protein consists of the following sequences:
  • a series of intermediate bands are obtained. They correspond to intermediates in the digestion of the fusion protein by factor Xa, in particular peptides comprising 2, 3, 4 ... VIP.
  • the bands corresponding to the VIP monomer and dimer are purified on an HPLC column (FIG. 8).
  • the monomer fraction is analyzed by capillary electrophoresis in order to confirm the purity of the sample (fig. 9).
  • the analysis of the sequence of the first 10 amino acids on the N-terminal side is in all respects that of the natural VIP.
  • the use of anti-VIP polyclonal antibodies revealed that these intermediates mentioned above did indeed contain VIP (fig. 10).
  • the mass of the peptide was determined by LSIMS mass spectroscopy.
  • the theoretical mass of the recombinant VIP added to the 10 amino acid binding peptide (VIP-B-C-A) is 4367 Da.
  • Factor Xa prioritizes the cleavage at its main site. It was also possible under analytical conditions to separate the two forms of VIP extended by 5 amino acids (VIP-B) and 10 amino acids (VIP-B-C-A) by HPLC.
  • polyVIP gene is inserted downstream of a nucleotide sequence coding for the thrombin recognition site Leu-Val-Pro-Arg Gly-Ser, already present in the expression vector pGEX 2T downstream of the GST gene. This site is used here in an attempt to release the polyVIP from the marker protein.
  • Thrombin is one of the coagulation factors (factor Ha) which activates fibrinogen to fibrin by a single C-terminal cut of the sequence Arg-Gly-Pro-Arg (Knott et al. 1988).
  • the fraction has a majority peak at 3825.5 Da with two satellites at 3809.5 and 3841.5.
  • thrombin To generate a peptide of this size, which is precisely that of VIP-B, thrombin must systematically cleave at the two sites recognized by factor Xa. In addition, no mass peptide 4367 is detected, which indicates that the thrombin recognizes the two sites with the same efficiency. It therefore seems that this enzyme can a priori be used to generate peptides of 3825 (VIP-B) predominantly.
  • the enzyme needs calcium chloride at a concentration higher than that required by factor Xa, promoting reprecipitation. of the fusion protein G16V.
  • the final step in the production of VIP consists in eliminating the binding peptide by cutting the Asn-Gly bond in the presence of hydroxylamine.
  • the VIP-B and VIP-BCA peptiHes released from their binding peptide must have a mass of 3343 Da. However, at 20 min the peptide did not undergo cleavage, whereas after 1 h, a majority peak at 3328 is observed, the peak at 3343 being only moderately represented.
  • peaks 3826, 3843 and 3326 can be assigned to known VIP forms.
  • GI V protein does not displace radioiodine VIP binding
  • a control carried out in the presence of factor Xa alone shows that the displacement is indeed due to the digested hybrid protein (FIG. 11 b) and shows that there is indeed release of an active peptide.
  • FIG. 12 An experiment in displacement of the radioiodine VIP binding by the purified VIP monomer (FIG. 12) shows that the latter binds to the HT 29 receptor with a dissociation constant similar to that of the control VIP.
  • this assay is carried out from a mixture of VIP-B and VIP-B-C-A forms (called recombinant VIP).
  • VIP analogues described in the literature although having an affinity for the receptor, behave like VIP antagonists (Pandol et al. 1986). The purpose of this manipulation therefore lies in verifying the agonist effect of the VIP.
  • the results obtained with the mixture of the VIP-B and VIP-BCA forms show a stimulation of the production of cAMP by the recombinant VIP compared to the control VIP.
  • the EC 5Q being defined as the concentration of peptide necessary to produce 50% of the maximum amount of cAMP, the recombinant VIP stimulates the production of cAMP with an EC - 0 500 times greater than the control VIP.
  • the last type of analysis used to test biological activity consisted in observing the effect of recombinant VIP (VIP-B and VIP-B-C-A mixture), from the same stock as before, on an isolated organ.
  • the model used to test VIP activity consists of guinea pig tracheal discs.
  • the attachment of several discs in a chain ensures an accumulation of the signal of each disc and leads to an amplification of the response.
  • the isotonic sensor then records the variations in the length of the chain of rings.
  • the VIP has no effect on the organ under normal conditions.
  • the phenomenon of relaxation of the tracheal discs is only demonstrated after a pre-contraction of the smooth muscles in hyperpotassic Krebs medium (40 mM).
  • Disc relaxation was observed in the presence of natural VIP with a 5n EC of 16 nM as well as in the presence of recombinant VIP where the EC 5n is 800 nM or only 50 times more.
  • the recombinant VIP extended by 5 or 10 amino acids (B or BCA) thus exhibits relaxation activity on the tracheal discs.

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Abstract

La présente invention concerne un polypeptide fusionné de formule: X-T-(A-VIP-B-C)n-A-VIP-B-Y pour laquelle VIP représente substantiellement la séquence His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn, X représente une protéine marqueur où la séquence peptidique Met-His-Gly-Cys-Arg-Ser-Ile-Asp-Ser, T représente la séquence peptidique Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser, dans le cas où X représente une protéine marqueur ou la séquence Arg-Gly-Ser dans l'autre cas, A représente la séquence peptidique Ile-Glu-Gly-Arg, B représente la séquence peptidique Gly-Ser-Thr-Pro-Arg, C représente l'acide aminé Ser, Y représente la séquence peptidique Gly-Ile-His-Arg-Asp, et n représente un entier compris entre 0 et 31. La présente invention concerne également un procédé de préparation de VIP recombinant.

Description

"Protéine de fusion ulti-VIP et procédé de préparation de
VIP recombinant"
La présente invention concerne la production d'un neuropeptide VIP (Vasoactif Intestinal Peptide) recombinant, en particulier un VIP dont iι l'acide aminé en position C-terminale n'est pas amidé.
Sx Le VIP est un neuropeptide de 28 acides aminés et de masse molaire 3326, généralement extrait des cellules intestinales, des tissus nerveux et des cellules endocrines.
Le VIP est un médiateur connu de la vasodilation des vaisseaux sanguins du cerveau, de la stimulation de la production de prolactine ou encore de la sécrétion endocrine, pancréatique.
10 Le VIP est principalement obtenu par extraction tissulaire ou encore par voie de synthèse chimique.
Compte-tenu de la taille du peptide et des rendements de la synthèse chimique, l'intérêt d'employer les techniques du génie génétique s'est rapidement fait sentir.
Le gène précurseur du VIP humain a été isolé et caractérisé, notamment par Bodener et al. (Proc. Nat. Acad Sci., USA, 1985, 252, 3548-3551 ), ainsi que sa transformation, son intégration dans un plasmide et son expression dans un microorganisme hôte (WO-A-89/05857).
Toutefois, si le VIP a une taille trop importante pour que sa
20 synthèse chimique soit rentable, le fait qu'il ne contienne que 28 acides aminés est également un inconvénient pour sa production par les techniques de génie génétique.
Il a été trouvé que , l'utilisation de la technique dite des protéines fusionnées permettait d'obtenir le VIP dans de bonnes conditions.
25
La présente invention concerne donc un polypeptide fusionné de formule χ_T-(A-VIP-B-C) n -A-VIP-B-Y dans laquelle
30 VIP représente substantiellement la séquence peptidique His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gin-Met- Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn,
X représente une protéine marqueur, ou la séquence peptidique Met-His- -Gly-Cys-Arg-Ser-Ile-Asp-Ser,
35 T représente la séquence peptidique Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser dans le cas où X représente une protéine marqueur, ou la séquence peptidique Arg-Gly-Ser dans l'autre cas. A représente la séquence peptidique Ile-Glu-Gly-Arg, 5 B représente la séquence peptidique Gly-Ser-Thr-Pro-Arg, C représente l'acide aminé Ser,
Y représente la séquence peptidique Gly-Ile-His-Arg-Asp, et n représente un entier compris entre 0 et 31.
De préférence, n est compris entre 1 et 31. i O La présence d'une protéine marqueur peut présenter un intérêt lors de la purification du polypeptide fusionné selon l'invention.
D'une manière préférentielle, X est choisi parmi la glutathion S-transférase (GST) (Smith & al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 83 (1986) S703-&707, et 8 (1987), 6541 ). 1 -5 De même, compte tenu du mode de préparation du polypeptide selon l'invention par les techniques de génie génétique, n est de préférence choisi parmi les entiers 0, 1, 3, 7, 15 ou 31.
La présente invention concerne également le gène codant pour le polypeptide fusionné ci-dessus. 20 Elle concerne également un plasmide d'expression comprenant le gène selon l'invention, sous la dépendance de séquence d'ADN assurant son expression dans un microorganisme hôte, et le microorganisme transformé comprenant au moins un de ces plasmides.
D'une manière avantageuse, ce microorganisme est E. coli JM 25 105 (ATCC n° 47016).
Enfin, la présente invention concerne un procédé de préparation de VIP recombinant comprenant les étapes suivantes :
- de culture du microorganisme selon l'invention dans des conditions d'expression du polypeptide fusionné,
30 _ d'extraction et de purification du polypeptide fusionné,
- de clivage, séquentiel ou combiné des sites A-VIP et VIP-B par un agent de clivage approprié, et
- de purification du VIP.
35 Le polypeptide fusionné est de préférence extrait par sonication et centrifugation des bactéries soniquées.
L'agent de clivage du site A-VIP est de préférence la facteur Xa ou la thrombine, alors que l'on emploie l'hydroxylamine comme agent de clivage du site VIP-B.
La présente invention concerne également un neuropeptide VIP recombinant obtenu par le procédé ci-dessus.
Compte tenu de son procédé de préparation, la présente invention concerne enfin un polypeptide intermédiaire pour la préparation de VIP recombinant, répondant à l'une des formules suivantes :
(VIP-B-C-A) (B-C-A-VIP) ou VIP-B
avec A, B, C et n tels que définis précédemment.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention appa¬ raîtront à la lecture de l'exemple et des figures ci-après.
La figure 1 (la et lb) représente le schéma de construction des plasmides.
La figure 2 représente une autoradiographie du gel de séquence du plasmide pUC18 dans lequel a été inséré l'oligonucleotide VIP de séquence (brin anti-sens) :
3'
CTTGTGAGGC TGCGACAAAA GTGGCTGTTG 30
ATGTGGGCTG ACGCATTTGT CTACCGACAA 60
TTTTTTATGG ACTTGAGGTA GGACTTGCCA 90
CTT 5* La figure 3 représente un gel d'agarose à 2% montrant l'insertion séquentielle des unités VIP dans le plasmide pUC deltaS-FXa. Tous les plasmides ont été digérés par Pvull.
a) et h) marqueur de poids moléculaire b) pUC deltaS-FXa c) pUC deltaS-FXal VIP d) pUC deltaS-FXa2VIP e) pUC deltaS-FXa4VIP f) pUC deltaS-FXaδVIP g) pUC delatS-FXa!6VIP
La figure 4, relative à l'expression et la purification de la protéine hybride GIV représente un gel de polyacrylamide SDS 12,5% coloré au bleu de Coomassie montrant :
a) les protéines totales de E. coli avant induction par l'IPTG b) les protéines totales de E. coli après induction par l'IPTG c) la protéine hybride purifiée après passage sur colonne sépharose glutathion.
La figure 5, relative à l'expression et la purification de la protéine hybride G16V, représente un gel de polyacrylamide SDS 12,5% coloré au bleu de Coomassie montrant :
a) les protéine totales de E. coli avant induction par l'IPTG b) les protéines totales de E. coli après induction par l'IPTG c) le surnageant de sonication d) le culot de sonication e) la protéine après lavage.
La figure 6, relative au clivage de la protéine hybride G I V par le facteur Xa, représente un gel de polyacrylamide-SDS 16,5% glycerol coloré au bleu de Coomassie montrant : piste a) la protéine hybride purifiée par chromatographie d'affinité, piste b), c), d) et e) l'incubation avec le facteur Xa pendant 1, 2, 3 et 5 heures respectivement, à 25°C, dans un rapport enzyme/substrat de
1/50. 5 piste V), VIP témoin piste M), marqueurs de poids moléculaire
La figure 7, relative au clivage de la protéine hybride G16V par le facteur Xa représente un gel dénaturant en gradient de polyacrylamide 10 12% à 20% coloré au bleu de Coomassie montrant :
piste a) la protéine hybride soluble pistes b), c), d) et e) l'incubation avec le facteur Xa pendant 15, 30, 45 minutes et 3 heures respectivement à 25°C, dans un rapport l -5 enzyme/substrat de 1/50. piste f) monomère VIP (4,4 Da) purifié sur colonne HPLC (caractéristiques: légende Fig.8). piste h) dimère VIP purifié sur colonne HPLC.
20 La figure 8 représente le diagramme de purification du monomère et du dimère VIP sur colonne analytique HPLC de type Vydac, C l 8, 5μm, 300A end capped :
1. monomère VIP (Fig.7 piste f)
2. dimère VIP (Fig.7 piste h)
25
La figure 9 représente le diagramme d'analyse par électro- phorèse capillaire de la fraction purifiée du monomère VIP.
a) VIP témoin
30 b) monomère VIP rallongé de 10 acides aminés après clivage de la protéine de fusion par le facteur Xa et séparation par HPLC. La figure 10 représente l'analyse par Western blot de la purification de la protéine G16V et sa digestion par le facteur Xa :
a) les protéines totales de E. coli avant induction par l'IPTG b) les protéines totales de E. coli après induction par l'IPTG c) le surnageant de sonication d) le culot de sonication e) la protéine G16V purifiée f) la protéine G16V clivée par le facteur Xa dans les conditions décrites précédemment g) monomère VIP purifié h) VIP témoin
La figure 1 1 représente les courbes de déplacement de la liaison du VIP radioiode par la protéine GIV aux récepteurs des cellules d'adénocarcinome de côlon humain (lignée HT29) :
l ia) VIP témoin ( • ) protéine GIV ( A. ) et GIV digéré par le facteur Xa ( • ) 3 heures à 25°C dans un rapport enzyme/substrat : 1/50.
1 1 b) Témoin Facteur Xa dans le tampon d'incubation.
La figure 12 représente les courbes de déplacement de la liaison du VIP radioiode par le VIP monomère (4,4 kDa) purifié (Fig. 7 piste f) aux récepteurs des cellules d'adénocarcinome de côlon humain (lignée HT29) : VIP témoin (1 ) et monomère VIP (2).
La figure 13 représente la courbe de déplacement de la liaison du VIP radioiode par le VIP recombinant, obtenu après traitement par l'hydroxylamine : VIP témoin ( 1 ) et VIP recombinant (2).
La figure 14 représente les courbes de stimulation de la production d'AMPc par le VIP recombinant et un mélange de poly(VIP) comprenant de 2 à 9 séquences de VIP : VIP témoin (*), VIP recombinant ( * ), et polyVIP ( A ). EXEMPLE : FUSION GSTVIP et GSTpolyVIP
I. Généralités
A) Synthèse du gène
Un oligonucléotide de synthèse codant pour le site de coupure du facteur Xa (séquence peptidique Ile-Glu-Gly-Arg) est inséré dans le plasmide pGEX-2T disponible dans le commerce, en 3' et en phase avec le gène de la Glutathion S-transférase dans les sites BamHI et EcoRI.
Ile Glu Gly Arg
5' GA TCC ATC GAA GGT CGA CAC CCC GGG G 3'
3' G TAG CTT CCA GCT GTG GGG CCC CTT AA 5' BamHI Sali Smal EcoRI
Entre l'extrémité 3' du gène de la glutathion S-transférase (GST) et l'extrémité 5' du gène de l'oligonucleotide codant pour site de coupure du facteur Xa, se trouve porté par le plasmide pGEX 2T un enchaînement de nucleotides codant pour le site de coupure de la thrombine (séquence peptidique Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser). Ce site permet d'envisager à l'aide de la thrombine la séparation ultérieure de la GST et d'un VIP ou polyVIP contenant des acides aminés surnuméraires.
Le gène VIP (cf séquence, fig. 2) ou polyVIP est inséré dans le site Sali rempli, en 3' de la séquence nucleotidique codant pour le facteur Xa et en phase avec ce dernier.
L'insertion séquentielle de gènes VIP peut permettre de mieux maîtriser l'addition d'unités VIP et d'obtenir un concatémère plus grand.
B) Caractéristiques de la protéine
- Elle est puπfiable par chromatographie d'affinité sur colonne CH Sépharose 4B-Glutathιon (un seul VIP) ou à partir de corps d'inclusion (polyVIP). - Les différentes unités VIP rajoutées seront séparées par un peptide de 10 acides aminés contenant à l'extrémité N-terminale le site de coupure de l'hydroxylamine et à l'extrémité C-terminale le site de coupure du facteur Xa soit:
VIP-Gly-Ser-Thr-Pro-Arg-Ser-Ile-Glu-Gly-Arg-VIP f T
NH2OH Facteur Xa
10 - L'action du facteur Xa libère le poly(VIP) sans acide aminé résiduel à l'extrémité N terminale.
- le facteur Xa clive également un site secondaire de clivage du facteur Xa dans le peptide de liaison B-C-A (clivage après le 5e acide aminé de la séquence). La séquence (Ser-Thr-Pro-Arg^Ser) ne présente pas
-• -> d'homologie, à l'exception de l'arginine, avec des sites potentiels connus du Facteur Xa.
- A l'extrémité C terminale de chaque VIP, une glycine permet lors de la coupure par l'hydroxylamine l'élimination des acides aminés surnuméraires. 20
H* Construction de la fusion (fig. 1)
a) Le plasmide pUC18 est digéré par Sali, rempli par le ^ fragment de Klenow et refermé sur lui-même par la T4 DNA ligase, ce qui permet l'élimination du site Sali. Le plasmide obtenu est dénommé pUClδdeltaS. b) L'oligonucleotide de synthèse, codant pour le site de coupure du facteur Xa, est inséré dans les sites BamHI/EcoRI du plasmide
30 pUC18deltaS. c) Ce plasmide, appelé pUC18deltaS-FXa, est digéré par Sali et le site est rempli par le fragment de Klenow puis ligaturé avec l'oligonucleotide VIP (cf fig. 1 ).
35 d) Un clone recombinant comportant l'oligonucleotide VIP dans le sens correct (le sens d'insertion est véπfiable par analyse des fragments de restriction) est séquence afin de vérifier de manière précise les séquences des oligonucléotides codant pour le VIP et le site de clivage par le facteur Xa, le maintien de la phase et des sites de restriction (cf fig. 2). e) A partir de ce plasmide, on peut récupérer le fragment BamHI rempli/EcoRI et le réinsérer dans ce même plasmide ouvert par Smal/EcoRI (cf fig. 1).
On obtient alors 2 unités VIP fusionnées avec maintien de la phase de lecture. Cette opération peut être répétée de façon à réaliser des fusions comportant 2, 4, 8, 16 et 32 gènes VIP. L'insertion de ces derniers peut être visualisée par l'augmentation de la taille du plasmide ou de celle d'un fragment issu de la digestion du plasmide par PvuII. Deux sites PvuII sont présents dans le pUC18 de part et d'autre de la fusion de gènes. En conséquence, le pUC lδdelta S-FXa digéré par PvuII donne une bande à 2360 bp environ et une bande à 350 bp (fig. 3, piste b).
L'insertion d'une unité du gène VIP dans ce plasmide entraîne un accroissement de taille de 87 bp et l'apparition d'une bande vers 440 bp après digestion (piste c) ; la présence de deux unités VIP l'augmente d'environ 200 bp soit 540 bp (piste d) et ainsi de suite jusqu'à 16 VIP (respectivement, piste e, f et g). f) Après insertion d'un nombre donné de gènes VIP, on peut récupérer le concatémère, par digestion EcoRI/BamHI, et le fusionner au gène de la GST dans le plasmide pGEX-2T ouvert par BamHI/EcoRI.
III. Synthèse et purification des protéines de fusion
Après transformation de bactéries compétentes (souche JM 105 d'E. coli) par le plasmide pGEX-FXaVIP (ne comportant qu'un seul gène VIP) les clones recombinants produisent une protéine de fusion après induction de la synthèse par l'IPTG en phase exponentielle de croissance (D05 5 = 0,65). La figure 4 montre la migration des protéines totales d'E. coli après électrophorèse dans des conditions dénaturantes. On observe bien, après induction, l'apparition d'une bande vers 30 kDa correspondant à la masse théorique de la protéine hybride avec un seul VIP (GI V) (fig. 4, piste b). Les résultats sont confirmés par dosage de l'activité glutathion S-transferase à partir de la culture. Dans ce cas précis, la protéine hybride est soluble et peut être purifiée par chromatographie d'affinité sur une colonne glutathion agarose à partir d'un extrait cytoplasmique bactérien (figure 5, piste c). Cette purification, basée sur l'aptitude de la protéine marqueur (la GST) à se lier de manière réversible au glutathion réduit, donne un rendement en protéine hybride de l'ordre de 90%.
Le même protocole a été suivi pour la fusion de la GST avec 8 VIP (G8V) ou 16 VIP (G16V) (fig. 5). Dans ce dernier cas, il y a apparition d'une bande vers 100 kDa qui correspond à la protéine hybride (fig. 5, piste b) (masse moléculaire théorique 96,5 KDa). Cependant des corps d'inclusion se forment, agrégats insolubles composés pour une grande part de la protéine de fusion. Dans ce cas la protéine d'intérêt se retrouve dans le culot de sonication (figure 5, piste d). Sous cette forme agrégée, la protéine marqueur est dénaturée. Elle perd son activité et ne peut plus servir à la purification de la protéine de fusion par chromatographie d'affinité.
Ainsi, des lavages successifs ont été réalisés dans des conditions dénaturantes faibles (Triton X100 0,5%, EDTA I mM) afin d'éliminer spécifiquement les débris cellulaires de manière à enrichir le culot en protéine hybride insoluble. Celle-ci est ensuite solubilisée dans de l'urée 10 M, DTT 10 mM, SDS 0,5% et dialysée contre une solution Tris HC1 10 mM pH 8,0, EDTA ImM, puis contre de l'eau en vue de la digestion par le facteur Xa (fig. 5, piste e). Cependant, dans ces conditions, la protéine de fusion redevient parfois insoluble, avec apparition de micro-agrégats, qui n'affecteront pas toutefois l'action ultérieure du facteur Xa. IV. Clivage des protéines hybrides
a) Clivage de la protéine GIV
La protéine hybride se compose des séquences suivantes :
GST -Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Ile-Glu-Gly-Arg-VIP-Gly-Ser-Thr-Pro-Arg- a b
Gly-Ile-His-Arg-Asp
GST : séquence de la GST a : site de clivage du facteur Xa
VIP : séquence du VIP b : site de clivage de l'hydroxylamine
L'étape suivante consiste donc à cliver cette protéine par le facteur Xa (afin de séparer le VIP de la protéine marqueur). L'action de l'hydroxylamine, libère ultérieurement le VIP des acides aminés surnumé¬ raires, résultant de la constrution choisie. La figure 6 montre l'analyse électrophorétique de la digestion opérée avec le facteur Xa.
On remarque une diminution de l'intensité de la bande vers 30 kDa au profit de celle correspondant à la GST (26 kDa) ce qui indique une coupure effective par le facteur Xa au niveau du site attendu.
b) Clivage de la protéine G(n+l)V
La protéine hybride se compose des séquences suivantes :
GST-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-(Ile-Glu-Gly-Arg-VIP-Gly-Ser-Thr-Pro-Arg- a D a
Ser) -Ile-Glu-Gly-ArgrVIP-Gly-Ser-Thr-Pro-Arg-Gly-Ile-His-Arg-Asp
avec n = 7, 15 ou 31.
La même digestion que précédemment est réalisée et analysée par électrophorèse pour n = 15 (fig. 7). On remarque l'apparition d'une bande qui migre au bas du gel dans la zone correspondant au VIP et dont l'intensité augmente rapidement avec le temps de digestion.
Selon les conditions expérimentales, une série de bandes intermédiaires sont obtenues. Elles correspondent à des intermédiaires de la digestion de la protéine de fusion par le facteur Xa, notamment des peptides comprenant 2, 3, 4 ... VIP. Les bandes correspondant au monomère et dimère de VIP sont purifiées sur colonne HPLC (fig. 8). La fraction monomère est analysée par électrophorèse capillaire afin de confirmer la pureté de l'échantillon (fig. 9). L'analyse de la séquence des 10 premiers acides aminés du côté N-terminal est en tous points conforme à celle du VIP naturel. L'utilisation d'anticorps polyclonaux anti-VIP a révélé que ces intermédiaires cités ci-dessus comportaient bien du VIP (fig. 10).
Par contre, la séparation des différents poIy(VIP) intermédiaires de dégradation par le facteur Xa s'est révélée plus délicate, les peptides comprenant plus de deux motifs VIP étant co-élués par HPLC.
V. Analyse du peptide monoVIP
Afin de vérifier précisément la masse du peptide monoVIP recombinant obtenu après clivage par le facteur Xa, ce dernier a été analysé au spectromètre de masse et soumis parallèlement à un séquençage de l'extrémité NH-.
La détermination de la masse du peptide a été effectuée par spectroscopie de masse LSIMS. La masse théorique du VIP recombinant additionné du peptide de liaison de 10 acides aminés (VIP-B-C-A) est de 4367 Da.
On observe bien un pic à cette valeur, mais également un second à 3825,8. Cette masse correspond exactement à celle du VIP rallongé des 5 premiers acides aminés du peptide de liaison (VIP-B). Un second clivage s'effectuerait par conséquent au niveau de la liaison Arg Ser. Ce double clivage du peptide de liaison générerait trois peptides : VIP-Gly-Ser-Thr-Pro-Arg^ Ser-Ile-Glu-Gly-Argi VIP-Gly-Ser-Thr-Pro-Arg4
Figure imgf000015_0001
4824,8
Deux formes de VIP avec une masse 4367,2 pourraient coexister. Cependant l'analyse de la séquence N-terminale établit bien que la nature des dix premiers acides aminés est bien celle du VIP : His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr.
Ce résultat lève la possible ambiguité résultant de l'hétéro¬ généité des peptides obtenus. Le facteur Xa effectue bien en priorité le clivage au niveau de son site principal. Il a par ailleurs été possible en conditions analytiques de séparer les deux formes de VIP rallongées de 5 acides aminés (VIP-B) et de 10 acides aminés (VIP-B-C-A) par HPLC.
Une détermination de la masse des deux fractions confirme ce résultat.
VI. Clivage de la protéine G16V par la thrombine
Lors de la fusion du polyVIP à la GST, le gène polyVIP est inséré en aval d'une séquence nucleotidique codant pour le site de reconnaissance de la thrombine Leu-Val-Pro-Arg Gly-Ser, déjà présent dans le vecteur d'expression pGEX 2T en aval du gène de la GST. Ce site est ici utilisé afin de tenter de libérer le polyVIP de la protéine marqueur.
La thrombine est un des facteurs de coagulation (le facteur Ha) qui active le fibrinogene en fibrine par une coupure unique en C-terminal de la séquence Arg-Gly-Pro-Arg (Knott et al. 1988).
De manière surprenante, un profil analogue à celui de l'incubation avec le facteur Xa est observé. Sachant que la spécificité de substrat de la thrombine chevauche en partie celle du facteur Xa (Reinach et al. 1986) il est possible qu'un clivage ait lieu au site Ile-Glu-Gly-Arg. On peut cependant remarquer par la présence d'une bande vers 70 KDa que la digestion a eu prioritairement au niveau du site spécifique présent en amont du polyVIP et que comparé au facteur Xa le clivage est en apparence plus lent. Parallèlement, le site secondaire de coupure du facteur Xa dans le décapeptide, présent entre chaque VIP, peut potentiellement être reconnu par la thrombine. Afin de vérifier cette hypothèse, le monoVIP issu d'un clivage prolongé de la protéine G16V par la thrombine est purifié par HPLC et analysé au spectromètre de masse.
La fraction possède un pic majoritaire à 3825,5 Da avec deux satellites à 3809,5 et 3841,5. Pour générer un peptide de cette taille, qui est précisément celle du VIP-B, la thrombine doit systématiquement cliver au niveau des deux sites reconnus par le facteur Xa. De plus, aucun peptide de masse 4367 n'est détecté ce qui indique que la thrombine reconnaît les deux sites avec la même efficacité. H semble donc que cette enzyme puisse a priori être employée pour générer des peptides de 3825 (VIP-B) de manière prépondérante. Il faut toutefois savoir qu'une digestion par la thrombine peut poser un problème de stabilité de la protéine hybride puisque pour être active, l'enzyme a besoin de chlorure de calcium à une concentration supérieure à celle exigée par le facteur Xa, favorisant la reprécipitation de la protéine de fusion G16V.
VII. Clivage de l'analogue du VIP par l'hydroxylamine
L'ultime étape de la production du VIP consiste en l'élimination du peptide de liaison par coupure de la liaison Asn-Gly en présence d'hydroxylamine.
Une hydrolyse du peptide a été réalisée pendant 20 min et 1 h.
On a remarqué un dédoublement du pic correspondant au VIP et un affaissement de chaque pic en fonction du temps d'hydrolyse. Une incubation prolongée accentue le phénomène qui résulterait peut-être d'une dégradation du peptide. Parallèlement un échantillon de VIP a été incubé
1 h. en présence d'hydroxylamine, afin de vérifier dans les mêmes conditions, l'inactivité de l'agent chimique sur le VIP. D'après le schéma réactionnel théorique, les peptiHes VIP-B et VIP-B-C-A libérés de leur peptide de liaison doivent avoir une masse de 3343 Da. Or à 20 min le peptide n'a pas subi de clivage, alors qu'après lh, on observe un pic majoritaire à 3328, le pic à 3343 n'étant que moyennement représenté.
Ces pics sont collectés et la masse de la ou des formes présentes est estimée par spectrométπe de masse.
De la même manière que sur l'analyse des pics du clivage par le facteur Xa, plusieurs pics sont observés. Seuls les pics 3826, 3843 et 3326 peuvent être assignés à des formes de VIP connues. Le VIP témoin incubé avec l'hydroxylamine, analysé en parallèle, subit aussi des modifications comme en témoigne la présence de pics à 3310,8 et 3341,5.
VIII. Dosage de l'activité du VIP
VIII.1 Déplacement de la liaison du VIP radioiode
Dans le but de vérifier si le VIP produit sous la forme fusionnée ou libérée après le clivage garde son activité, des tests de déplacement de la liaison du VIP radioiode à son récepteur sont réalisés (lignée cellulaire
HT 29).
La protéine GI V ne déplace pas la liaison du VIP radioiode
(figure 9a). Cependant après une incubation de cette protéine pendant 3 heures en présence de facteur Xa, on observe un déplacement mais avec une constante de dissociation (Kn) 500 fois plus forte qu'avec du VIP froid.
Un témoin réalisé en présence de facteur Xa seul montre que le déplacement est bien dû à la protéine hybride digérée (figure 1 1 b) et montre qu'il y a bien libération d'un peptide actif.
Une expérience de déplacement de la liaison du VIP radioiode par le monomère VIP purifié (fig. 12) montre que ce dernier se lie au récepteur des cellules HT 29 avec une constante de dissociation similaire à celle du VIP témoin.
La même expérience que ci-dessus effectuée avec une forme diVIP purifiée montre que cette dernière possède une activité de liaison au récepteur du VIP avec une constante de dissociation 1000 fois plus importante. Dans ce cas, l'inaptitude de l'analogue à retrouver la conformation naturelle du VIP peut expliquer la faible activité de cette forme.
Enfin, un mélange de formes multimétπques de 2 à 16 VIP provoque un déplacement de la liaison avec une constante de dissociation analogue à celle du VIP témoin. Ce résultat est surprenant dans la mesure où, seule, la forme diméπque est peu active.
On pourrait interpréter cette observation comme étant le résultat de la liaison d'une forme multiVIP à plusieurs récepteurs simultanément, alors qu'un oligomère plus court ne pourrait y parvenir.
VIII.2 Dosage de la production d'AMPc
Tout comme dans l'expérience précédente, ce dosage est effectué à partir d'un mélange de formes VIP-B et VIP-B-C-A (appelé VIP recombinant). Certains analogues de VIP décrits dans la littérature, bien que possédant une affinité pour le récepteur, se comportent comme des antagonistes du VIP (Pandol et al. 1986). Le but de cette manipulation réside par conséquent dans la vérification de l'effet agoniste du VIP.
Ainsi, une stimulation de la production d'AMPc par des cellules en culture est réalisée comparativement avec le VIP naturel et le VIP recombinant. Cette stimulation s'effectue en présence d'IBMX (3-IsoButyl- l- Méthyl-Xanthine), un inhibiteur de phosphodiestérase, enzyme qui dégrade l'AMPc. L'AMPC produit est estimé par dosage radioimmunologique.
Les résultats obtenus avec le mélange des formes VIP-B et VIP-B-C-A montrent une stimulation de la production d'AMPc par le VIP recombinant par rapport au VIP témoin. L'EC5Q étant défini comme la concentration en peptide nécessaire pour produire 50% de la quantité maximale d'AMPc, le VIP recombinant stimule la production d'AMPc avec un EC -0 500 fois plus important que le VIP témoin.
On observe surtout une production d'AMPc accrue de 1,6 fois qui résulterait de la conjonction de deux phénomènes. D'une part, le peptide recombinant serait plus stable dans le milieu d'incubation et/ou les complexes VIP recombinant-récepteur pourraient être plus stables, ce qui conduirait dans les deux cas à une stimulation pendant un temps plus long de l'activité adénylate cyclase.
VIII.3 Activité biologique sur un organe isolé
Le dernier type d'analyse utilisé pour tester l'activité biologique a consisté à observer l'effet du VIP recombinant (mélange VIP-B et VIP-B-C-A), issu du même stock que précédemment, sur un organe isolé.
Le modèle employé pour tester l'activité du VIP est constitué de disques trachéaux de cobayes.
L'attachement de plusieurs disques en chaîne assure un cumul du signal de chaque disque et conduit à une amplification de la réponse. Le capteur isotonique enregistre alors les variations de la longueur de la chaîne d'anneaux.
Le VIP n'a en fait, dans le système utilisé, pas d'effet sur l'organe en conditions normales. Le phénomène de relaxation des disques trachéaux n'est mis en évidence qu'après une précontraction des muscles lisses en milieu Krebs hyperpotassiques (40 mM). On a observé une relaxation des disques en présence de VIP naturel avec un EC5n de 16 nM tout comme en présence de VIP recombinant où i'EC 5n est de 800 nM soit seulement 50 fois plus. Le VIP recombinant rallongé de 5 ou 10 acides aminés (B ou B-C-A) présente ainsi une activité de relaxation sur les disques trachéaux.
18
LISTE DE SEQUENCES
( 1 ) NOMBRE DE SEQUENCES: 8
(2) INFORMATION POUR LA SEO D NO: 1:
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 44 acides aminés (B) SEQUENCE: X-T-(A-VIP-B-C)n-A-VIP-B-Y
(ii) TYPE DE MOLECULE peptide
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE EMPLACEMENT: l,Xaa
SEQUENCE ID:2 OU ID:3
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: EMPLACEMENT: 2,Xaa LIAISON COVALENTE OU SEQUENCE ID:4 REPETEE DE 1 A 31 FOIS
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQID NO: 1:
Xaa Xaa Ile Glu Gly Arg His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr 1 5 10 15
Thr Arg Leu Arg Lys Gin Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile 20 25 30
Leu Asn Gly Ser Thr Pro Arg Gly Ile His Arg Asp
35 40
(2) INFORMATION POUR LA SEQID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE
(A) LONGUEUR: 12 acides aminés
(B) SEQUENCE X-T (ii) TYPE DE MOLECULE peptide
( xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQID NO: 2:
Met His Gly Cys Arg Ser Ile Asp Ser Arg Gly Ser
1 5 10
(2) INFORMATION POUR LA SEQID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE
(A)LONGUEUR: 7 acides aminés (B) SEQUENCE X-T
(ii) TYPE DE MOLECULE peptide
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE EMPLACEMENT: l,Xaa CORRESPOND A UNE PROTEINE MARQUEUR
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQID NO: 3:
Xaa Leu Val Pro Arg Gly Ser
1 5
(2) INFORMATION POUR LA SEQID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 38 acides aminés
( ϋ ) TYPE DE MOLECULE protéine
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE Peptide A-VIP-B-C
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQID NO: 4: Ile Glu Gly Arg His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg 1 5 10 15
Leu Arg Lys Gin Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn 20 25 30
Gly Ser Thr Pro Arg Ser 35
(2) INFORMATION POUR LA SEQID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 38 acides aminés
(ii) TYPE DE MOLECULE peptide
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE Peptide VIP-B-C-A
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQID NO: 5:
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gin 1 5 10 15
Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn Gly Ser Thr Pro
20 25 . 30
Arg Ser Ile Glu Gly Arg 35
(2) INFORMATION POUR LA SEQID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 38 acides aminés
(ii) TYPE DE MOLECULE peptide (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE
Peptide B-C-A-VIP (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQID NO: 6:
Gly Ser Thr Pro Arg Ser Ile Glu Gly Arg His Ser Asp Ala Val Phe 1 5 10 15
Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gin Met Ala Val Lys Lys Tyr 20 25 30
Leu Asn Ser Ile Leu Asn 35
(2) INFORMATION POUR LA SEQID NO: 7:
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A) LONGUEUR: 33 acides aminés
(ii) TYPE DE MOLECULE peptide
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE Peptide VIP-B
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQID NO: 7:
His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gin 1 5 10 15
Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn Gly Ser Thr Pro Arg 20 25 30
(2) INFORMATION POUR LA SEQID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE (A)LONGUEUR: 50 acides aminés
(B) SEQUENCE G (n+l)V (ii) TYPE DE MOLECULE peptide
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE: EMPLACEMENT: l,Xaa SEQUENCE PEPTIDIQUE DE LA GST PROTEINE MARQUEUR
(ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE EMPLACEMENT: 8,Xaa LIAISON COVALENTE OU SEQUENCE ID:4 REPETEE DE 1 A 31 FOIS
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE SEQID NO: 8:
Xaa Leu Val Pro Arg Gly Ser Xaa Ile Glu Gly Arg His Ser Asp Ala 5 10 15
Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gin Met Ala Val Lys 20 25 30
Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn Gly Ser Thr Pro Arg Gly Ile His Arg Asp 35 40 45 50

Claims

REVENDICATIONS
1. Polypeptide fusionné de formule :
χ_T-(A-VIP-B-C)n-A-VIP-B-Y pour laquelle
VIP représente substantiellement la séquence
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met- Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn,
X représente une protéine marqueur, ou la séquence peptidique Met-His- ° Gly-Cys-Arg-Ser-Ile-Asp-Ser
T représente la séquence peptidique Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser dans le cas ou X représente une protéine maqueur ou la séquence peptidique Arg-Gly-Ser dans l'autre cas. A représente la séquence peptidique Ile-Glu-Gly-Arg, 5 B représente la séquence peptidique Gly-Ser-Thr-Pro-Arg, C représente l'acide aminé Ser,
Y représente la séquence peptidique Gly-Ile-His-Arg-Asp, et n représente un entier compris entre 0 et 31.
2. Polypeptide fusionné selon la revendication 1, caractérisé en ce que n est un entier compris entre 1 et 31.
3. Polypeptide fusionné selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la protéine marqueur est la glutathion S-transférase (GST).
4. Polypeptide fusionné selon l'une des revendications I à 3, caractérisé en ce que n représente 0, 1, 3, 7, 15 ou 31.
5. Polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que
X représente la glutathion S-transférase,
T représente Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser, A représente Ile-Glu-Gly-Arg,
B représente Gly-Ser-Thr-Pro-Arg,
C représente Ser
Y représente Gly-Ile-His-Arg-Asp, et n est égal à 7, 15 ou 31.
6. Gène codant pour un polypeptide fusionné selon l'une des revendications 1 à 5.
7. Plasmide d'expression comprenant le gène selon la revendi¬ cation 6, sous la dépendance de séquence d'ADN assurant son expression dans un microorganisme hôte.
8. Microorganisme transformé comprenant au moins un plasmide selon la revendication 7.
9. Microorganisme selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'agit de E. coli JM 105.
10. Procécé de préparation de VIP recombinant, caractérisé en ce que l'on effectue les étapes suivantes de :
- culture du microorganisme selon l'une des revendications 8 ou 9 dans des conditions d'expression du gène codant pour le polypeptide fusionné selon l'une des revendications 1 à 5,
- extraction et purification du polypeptide fusionné.
- clivage séquentiel ou combiné des sites A-VIP et VIP-B, par un agent de clivage approprié, et
- extraction et purification du VIP.
1 1. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le polypeptide fusionné est extrait par sonication et centrifugation des bactéries soniquées.
12. Procédé selon l'une des revendications 10 ou 1 1, caractérisé en ce que l'agent de clivage approprié du site A-VIP est le facteur Xa ou la thrombine.
13. Procède selon l'une des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que l'agent de clivage du site VIP-B est l'hydroxylamine.
14. Polypeptide intermédiaire pour la préparation de VIP recombinant, caractérisé en ce qu'il répond à l'une des formules suivantes :
(B-C-A-VIP), n (VIP-B-C-A)p ou
VIP-B avec VIP, A, B, C et n tels que définis dans l'une des revendications 1 à 4.
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