FR2642086A1 - Gene recombinant codant pour un facteur basique de croissance des fibroblastes et ledit facteur - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne un gène recombinant comportant une séquence d'ADN codant pour un facteur basique de croissance des fibroblastes. Ce gène code pour une protéine dont la séquence comprend une première sous-séquence : (CF DESSIN DANS BOPI) (CF DESSIN DANS BOPI) dans laquelle X représente l'un quelconque des vingt acides aminés du code génétique,en amont de cette sous-séquence une deuxième sous-séquence constituée de l'ensemble ou d'une partie tronquée dans sa partie amont et comportant plus de deux acides aminés de la suite : (CF DESSIN DANS BOPI) et en amont de cette deuxième sous-séquence éventuellement une méthionine.
Description
Gène recombinant codant oour un facteur basique de croissance des fibroblastes et ledit facteur.
La présente invention concerne un nouveau gène recombinant comportant une séquence d'ADN codant pour un facteur basique de croissance des fibroblastes, un vecteur d'expression portant ce gène, des cellules euraryotes et des microorganismes procaryotes contenant ce vecteur, un nouveau facteur basique de croissance des fibroblastes d'origine humaine obtenu à l'aide de ce gène ainsi qu'un nouveau médicament contenant ce facteur.
Le facteur basique de croissance des fibroblastes (ci-apres parfois abrégé (bFGF) est un puissant mitogène qui stimule La croissance de nombreux types de cellules dérivées du mésoderme et du neuroectoderme, en particulier celle des cellules endothéliales provenant soit de vaisseaux importants soit de capillaires. (D. Gospcdarovicz et al. (1986), 46, 187-204). Son activité angiogénique en fait une protéine intéressante en tant que principe actif de médicaments, en particulier ceux destinés à stimuler la régénération des tissus endommagés à la suite de blessures ou de brulures. (J.M. DAVIDSON et al., J.C.B. (1985), 100, 1219-1227).Ce facteur présente probablement également un intérêt dans le traitement de l infarctus du myocarde (Cf. les brevets américains 4 296 100 et 4 378 347) et dans celui des désordres neurologiques dégénératifs tels que la maladie de Parkinson ou d'Alzeimer (P. WALICKE et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A. > , 83, 3012-3016).
Pour ces applications, il parait souhaitable de disposer d'une quantité importante de facteur basique de croissance des fibroblastes d'origine humaine (c-aprés parfois abrégé hbFGF).
Celui-ci est présent dans de nombreuses sortes de cellules humaines, notamment celles d'organes tels que le cerveau, l'hypophyse, L'hypothalamus, les reins, les glandes surrénales, te thymus, la prostate, de phagocytes tels que les macrophages, de tissus tels que le placenta et le cartilage et de tissus malins tels les chondrosarcomes, les mélanomes et les hépatomes. Ce facteur est - semble-t-il d'après les caractérisations effectuées après isolement de ce dernier à partir de diverses sources - une protéine existant sous plusieurs formes d'activité biologique semblable, qui présentent la même séquence du coté carboxyterminal mais différent par leur nombre total d'acides aminés. Des formes de 146, 154 et 157 acides aminés ont ainsi été isolées à partir respectivement du cerveau, de la prostate et du placenta.
(D. Gospodarowicz et al. (1986) Mol. Cell. Endocrinal 46, 187-204 et D. MOSCATELLI (1988) Biochimie, 70, 83-87).
Devant Les quantités insuffisantes de facteur basique de croissance des fibroblastes isolées à partir de cellules humaines et les risques de contamination, notamment par les virus du sida ou de l'hepat,te, il existe un besoin pour des outils et des techniques de génie génétique permettant de s'affranchir de ces inconvénients. Certains de ceux-lå sont déjà connus : des plasmides reccmbinants codant pour les formes de 146 et 154 acides aminés ont ainsi déjà été exprimés dans Escherichia coli et dans d'autres cellules animales (Cf., en particulier, les demandes de brevet
EP-A0237966 et WO-87 01728).
EP-A0237966 et WO-87 01728).
La de anderesse a construit une bibliothèque d'ADNc à partir des ARN messagers de la lignée cellulaire d'hépatome SK-HEP1, de laquelle elle a isolé, à l'aide de sondes nucléotidiques construites sur la base des séquences du hbFGF déjà connues, puis séquence un ADNc codant pour le hbFGF. Par mutagenèse et utilisation de plasmides recombinants, elle a mis en évidence in vitro et in vivo l'existence de hbFGF comportant plus de 157 acides amines. Cette mise en évidence n'aurait pas été réalisable sur La base des deux autres séquences non strictement identiques déjà publiécs de l'ADNc du hbFGF (J. ABRAHAM et al. (1986) EMBO J., -5, 2523-2528 et T.KUROKAWA et al. (1987) Febs, 213, 1., 189-194).
Cette mise en évidence a permis de construire un nouveau gène recombinant codant pour un nouveau facteur basique de croissance des fibroblastes d'origine humaine hbFGF de séquence plus Longue dans sa partie amino terminale que celles des hbFGF déjà connues et présentant une activité biologique intéressante.
L'invention concerne donc un gène recombinant comportant une séquences d'ADN codant pour un facteur basique de croissance des fibroblastes, caractérisé en ce que celle-ci code pour une proteine dont la séquence comprend une premiere sous-séquence
X AlaAlaGlySer
IleThrThrLeuProAlaLeuProGluAspGlyGlySerGlyAlaPheproProGlyHis
PheLysAspProLysArgLeuTyrCysLysAsnGlyGlyphePheLeuArgileHisPro
AspGlyArgValAspGlyValArgGluLysSerAspProHislleLysLeuGlnLeuGln
AlaGluGluArgGlyValValSerILeLysGlyValCysAlaAsnArgTyrLeuAlaMet
LysGluAspGlyArgLeuLeuAlaSerLysCysValThrAspGluCysPhePhePheGlu ArgLeuGluSerAsnAsnTyrAsnThrTyrArgserArgLysTyrThrserTrpTyrval
AlaLeuLysArgThrGlyGlnTyrLysLeuGlySerLysThrGlyProGlyGlnLysAla
IleLeuPheLeuProMetSerAlaLysSer dans laauelle X représente l'un quelconque des vingt acides aminés du code génétique, en amont de cette sous-séquence, une deuxième sous-séquence cons tituée de l'ensemble ou d'une partie tronquée dans sa partie amont et comportant plus de deux acides aminés de la suite
LeuGlyAspArgGlyArgGlyArgAlaLeuProGlyGlyArgLeuGtyGlyArgGlyArg
GlyArgAlaPrcGLuArgValGlyGlyArgGlyArgGlyArgGlyThrAlaAlaProArg
AlaAlaProAlaAlaArgGlySerArgProGlyProAlaGlyThr et en amont de cette deuxième sous-séquence éventuellement une méthionine.
X AlaAlaGlySer
IleThrThrLeuProAlaLeuProGluAspGlyGlySerGlyAlaPheproProGlyHis
PheLysAspProLysArgLeuTyrCysLysAsnGlyGlyphePheLeuArgileHisPro
AspGlyArgValAspGlyValArgGluLysSerAspProHislleLysLeuGlnLeuGln
AlaGluGluArgGlyValValSerILeLysGlyValCysAlaAsnArgTyrLeuAlaMet
LysGluAspGlyArgLeuLeuAlaSerLysCysValThrAspGluCysPhePhePheGlu ArgLeuGluSerAsnAsnTyrAsnThrTyrArgserArgLysTyrThrserTrpTyrval
AlaLeuLysArgThrGlyGlnTyrLysLeuGlySerLysThrGlyProGlyGlnLysAla
IleLeuPheLeuProMetSerAlaLysSer dans laauelle X représente l'un quelconque des vingt acides aminés du code génétique, en amont de cette sous-séquence, une deuxième sous-séquence cons tituée de l'ensemble ou d'une partie tronquée dans sa partie amont et comportant plus de deux acides aminés de la suite
LeuGlyAspArgGlyArgGlyArgAlaLeuProGlyGlyArgLeuGtyGlyArgGlyArg
GlyArgAlaPrcGLuArgValGlyGlyArgGlyArgGlyArgGlyThrAlaAlaProArg
AlaAlaProAlaAlaArgGlySerArgProGlyProAlaGlyThr et en amont de cette deuxième sous-séquence éventuellement une méthionine.
De préférence X est un acide aminé connu pour ne pas modifier radicalement ta fonction d'une protéine lorsqutil est substitué à la méthionine. De tels acides aminés sont en particulier la méthionine, la valine, la leucine et l'isoleucine.
A cause de la dégénérescence du code génétique, il existe un grand nombre de séquences d'ADN codant pour des protéines dont les séquences répondent aux formules données ci-dessus. Pour diminuer le travail de construction du gène, on choisira de préférence une séquence d'ADN ne différant de celle du gne sauvage que par quelques nucléotides.Une telle séquence, particulièrement appréciée pour une expression du gène dans les cellules eucaryotes, est celle qui comprend une première sous-séquence
W1W2W3GCAGCCGGGAGC
ATCACCACGCTGCCCGCCTTGCCCGAGGATGGCGGCAGCGGCGCCTTCCCGCCCGGCCAC
TTCAAGGACCCCAAGCGGCTGTACTCCAAAAACGGGGGCTTCTTCCTGCGCATCCACCCC GACGGCCGAGTTGACGGGGTCCGGGAGAAGAGCGACCCTCACATCAAGCTACAACTTCAA
GCAGAAGAGAGAGGAGTTGTGTCTATCAAAGGAGTGTGTGCTAACCGTTACCTGGCTATG
AAGGAAGATGGAAGATTACTGGCTTCTAAATGTGTTACGGATGAGTGTTTCTTTTTTGAA
CGATTGGAATCTAATAACTACAATACTTACCGGTCAAGGAAATACACCAGTTGGTATGTG
GCACTGAAACGAACTGGGCAGTATAAACTTGGATCCAAAACAGGACCTGGGCAGAAAGCT
ATACTTTTTCTTCCAATGTCTGCTAAGAGCTGA dans laquelle W1, W2, W3 représentent un codon susceptible d'etre traduit en méthionine, valine, leucine ou isoleucine, une deuxième sous-séquence, en amont de la première, constituée de l'ensemble ou d'une partie tronquée dans sa partie amont d'un nombre entier de codons et comportant plus de deux codons de la suite CTGGGGGACCGCGGGCGCGGCCGCGCGCTGCCGGGCGGGAGGCTGGGGGGCCGGGGCCGG
GGCCGTGCCCCGGAGCGGGTCGGAGGCCGGGGCCGGGGCCGGGGGACGGCGGCTCCCCGC
GCGGCTCCAGCGGCTCGGGGATCCCGGCCGGGCCCCGCAGGGACC et en armt de cette deuxièmr sous-séquence éventuellement un codon ATG.
W1W2W3GCAGCCGGGAGC
ATCACCACGCTGCCCGCCTTGCCCGAGGATGGCGGCAGCGGCGCCTTCCCGCCCGGCCAC
TTCAAGGACCCCAAGCGGCTGTACTCCAAAAACGGGGGCTTCTTCCTGCGCATCCACCCC GACGGCCGAGTTGACGGGGTCCGGGAGAAGAGCGACCCTCACATCAAGCTACAACTTCAA
GCAGAAGAGAGAGGAGTTGTGTCTATCAAAGGAGTGTGTGCTAACCGTTACCTGGCTATG
AAGGAAGATGGAAGATTACTGGCTTCTAAATGTGTTACGGATGAGTGTTTCTTTTTTGAA
CGATTGGAATCTAATAACTACAATACTTACCGGTCAAGGAAATACACCAGTTGGTATGTG
GCACTGAAACGAACTGGGCAGTATAAACTTGGATCCAAAACAGGACCTGGGCAGAAAGCT
ATACTTTTTCTTCCAATGTCTGCTAAGAGCTGA dans laquelle W1, W2, W3 représentent un codon susceptible d'etre traduit en méthionine, valine, leucine ou isoleucine, une deuxième sous-séquence, en amont de la première, constituée de l'ensemble ou d'une partie tronquée dans sa partie amont d'un nombre entier de codons et comportant plus de deux codons de la suite CTGGGGGACCGCGGGCGCGGCCGCGCGCTGCCGGGCGGGAGGCTGGGGGGCCGGGGCCGG
GGCCGTGCCCCGGAGCGGGTCGGAGGCCGGGGCCGGGGCCGGGGGACGGCGGCTCCCCGC
GCGGCTCCAGCGGCTCGGGGATCCCGGCCGGGCCCCGCAGGGACC et en armt de cette deuxièmr sous-séquence éventuellement un codon ATG.
Une séquence de ce type particulièrement appréciée est celle dans laquelle la deuxième sous-séquence est l'une des sous-séquences ci-apres
GGGGACCGCGGGCGCGGCCGCGCGCTGCCGGGCGGGAGGCTGGGGGGCCGGGGCCGG
GGCCGTGCCCCGGAGCGGGTCGGAGGCCGGGGCCGGGGCCGGGGGACGGCGGCTCCCCGC
GCGGCTCCAGCGGCTCGGGGATCCCGGCCGGGCCCCGCAGGGACC et
GGGGGCCGGGGCCGG
GGCCGTGCCCCGGAGCGGGTCGGAGGCCGGGGCCGGGGCCGGGGGACGGCGGCTCCCCGC
GCGGCTCCAGCGGCTCGGGGATCCCGGCCGGGCCCCGCAGGGACC
Pour une expression du gène dans les microorganismes procaryotes, il est souhaitable de modifier par rapport au gène sauvage certains codons environnant le codon d'initiation ATG.Une séquence appréciée pour une expression dans Escherichia coli est par exemple la suivante ATGGGTGACCGTGGTCGTGGTCGCGCGCTGCCGGGCGGGAGGCTGGGGGGCCGGGGCCGG
GGCCGTGCCCCGGAGCGGGTCGGAGGCCGGGGCCGGGGCCGGGGGACGGCGGCTCCCCGC GCGGCTCCAGCGGCTCGGGGAtCCCGGCCGGGCCCCGCAGGGACCATGGCAGCCGGGAGC
ATCACCACGCTGCCCGCCTTGCCCGAGGATGGCGGCAGCGGCGCCTTCCCGCCCGGCCAC TTCAAGGACCCCAAGCGGCTGTACTGCAAAAACGGGGGCTTCTTCCTGCGCATCCACCCC
GACGGCCGAGTTGACGGGGTCCGGGAGAAGAGCGACCCTCACATCAAGCTACAACTTCAA
GCAGAAGAGAGAGGAGTTGTGTCTATCAAAGGAGTGTGTGCTAACCGTTACCTGGCTATG
AAGGAAGATGGAAGATTACTGGCTTCTAAATGTGTTACGGATGAGTGTTTCTTTTTTGAA
CGATTGGAATCTAATAACTACAATACTTACCGGTC AAGGAAATACACCAGTTGGTATGTG
GCA CTGAAACGAACTGGGCAGTATAAACTTGGATC CAAAACAGGACCTGGG CAGAAAGCT
ATACTTTTTCTTCCAATGTCTGCTAAGAGCTGA
L'invention concerne également un vecteur d'expression qui porte, avec les moyens nécessaires à son expression, le gêne reccobin nt défini précédemment.
GGGGACCGCGGGCGCGGCCGCGCGCTGCCGGGCGGGAGGCTGGGGGGCCGGGGCCGG
GGCCGTGCCCCGGAGCGGGTCGGAGGCCGGGGCCGGGGCCGGGGGACGGCGGCTCCCCGC
GCGGCTCCAGCGGCTCGGGGATCCCGGCCGGGCCCCGCAGGGACC et
GGGGGCCGGGGCCGG
GGCCGTGCCCCGGAGCGGGTCGGAGGCCGGGGCCGGGGCCGGGGGACGGCGGCTCCCCGC
GCGGCTCCAGCGGCTCGGGGATCCCGGCCGGGCCCCGCAGGGACC
Pour une expression du gène dans les microorganismes procaryotes, il est souhaitable de modifier par rapport au gène sauvage certains codons environnant le codon d'initiation ATG.Une séquence appréciée pour une expression dans Escherichia coli est par exemple la suivante ATGGGTGACCGTGGTCGTGGTCGCGCGCTGCCGGGCGGGAGGCTGGGGGGCCGGGGCCGG
GGCCGTGCCCCGGAGCGGGTCGGAGGCCGGGGCCGGGGCCGGGGGACGGCGGCTCCCCGC GCGGCTCCAGCGGCTCGGGGAtCCCGGCCGGGCCCCGCAGGGACCATGGCAGCCGGGAGC
ATCACCACGCTGCCCGCCTTGCCCGAGGATGGCGGCAGCGGCGCCTTCCCGCCCGGCCAC TTCAAGGACCCCAAGCGGCTGTACTGCAAAAACGGGGGCTTCTTCCTGCGCATCCACCCC
GACGGCCGAGTTGACGGGGTCCGGGAGAAGAGCGACCCTCACATCAAGCTACAACTTCAA
GCAGAAGAGAGAGGAGTTGTGTCTATCAAAGGAGTGTGTGCTAACCGTTACCTGGCTATG
AAGGAAGATGGAAGATTACTGGCTTCTAAATGTGTTACGGATGAGTGTTTCTTTTTTGAA
CGATTGGAATCTAATAACTACAATACTTACCGGTC AAGGAAATACACCAGTTGGTATGTG
GCA CTGAAACGAACTGGGCAGTATAAACTTGGATC CAAAACAGGACCTGGG CAGAAAGCT
ATACTTTTTCTTCCAATGTCTGCTAAGAGCTGA
L'invention concerne également un vecteur d'expression qui porte, avec les moyens nécessaires à son expression, le gêne reccobin nt défini précédemment.
Pour une expression dans les microorganismes procaryotes, en particulier dans Escherichia coli, La séquence codante doit. être inseree dans un vecteur d'expression comportant notamment un promoteur efficace, suivi d'un site de fixation des ribosomes en amont du gène à exprimer, ainsi qu'une séquence d'arrêt de transcription efficace en aval du gène à exprimer. Ce plasmide doit également comporter une origine de réplication et un marqueur de sélection. Toutes ces séquences doivent être choisies-en fonction de la cellule hâte.
Pour une expression dans les cellules eucaryotes, notamment dans les cellules d'ovaires de hamster chinois CHO, la séquence codante est insérée dans un plasmide (par exemple dérivé du pBR 322) comportant notamment deux unités d'expression. Une première unité dans laquelle est inséré le gêne d'intérêt devant un promoteur efficace (par exemple Le promoteur précoce de SV40). La séquence autou@ de l'ATG d'initiation est de préférence choisie en fonce con de la séquence consensus décrite par KOZAK (M. KOZAK (1978; Cell., 15, 1109-1123).Une séquence intronique, par exemple l'intron de l'a-globîne de souris, peut être insérée en amont du gène d'intérêt ainsi qu'une séquence comportant un site de polyadénylation, par exemple une séquence de polyadénylation du
SV40, en aval du gène dtintérêt. La deuxième unité d'expression comporte un marqueur de sélection (par exemple une séquence d'ADN) codant pour La dihydrofolate réductase (enzyme ci-apres abrégée
DHFR). Le plaide est transfecté dans des cellules eucaryotes, par exemple les cellules CHO DHFR (incapables d'exprimer la
DHFR). Une lignée est sélectionnée pour sa résistance au mèthotrèxate et exprime a un niveau suffisant le gène d'intérêt.
SV40, en aval du gène dtintérêt. La deuxième unité d'expression comporte un marqueur de sélection (par exemple une séquence d'ADN) codant pour La dihydrofolate réductase (enzyme ci-apres abrégée
DHFR). Le plaide est transfecté dans des cellules eucaryotes, par exemple les cellules CHO DHFR (incapables d'exprimer la
DHFR). Une lignée est sélectionnée pour sa résistance au mèthotrèxate et exprime a un niveau suffisant le gène d'intérêt.
L'inventicn concerne aussi un nouveau facteur basique de croissance des fibroblastes caractérisé en ce que sa séquence cc-prenf une première sous-séquence :
X AlaAlaGlySer I leTrThrLeuProAlaLeuProG luAspGlyGlySerGlyAlaPheProProGlyHis
PheLysAspProLysArgLeuTyrCysLysAsnGlyGlyPhePheLeuArgIleHisPro
AspGlyArgValAspGlyValArgGluLysSerAspProHisIleLysLeuGlnLeuGln
AlaGluGluArgGlyValValSerIleLysGlyValCysAlaAsnArgTyrLeuAlaMet LysGluAspGlyArgLeuLeuAlaSerLysCysValThrAspGluCysPhePhepheGlu
ArgLeuGluSerAsnAsnTyrAsnThrTyrArgSerArgLysTyrThrSerTrpTyrVal
AlaLeuLysArgThrGlyGlyTyrLysLeuGlySerLysThrGlyProGlyGlnLysAla I leLeuPheLeuProMetSerAlaLysSer dans laquelle X représente l'un quelconque des vingt acides aminés du coce génétique, en amont de celle-ci une deuxième sous-séquence constituée de l'ensemble ou d'une partie tronquée dans sa partie amont et comportant plus de deux acides aminés de la suite :
LeuGlyAspArgGlyArgGlyArgAlaLeuProGlyGlyArgLeuGlyGlyArgGlyArg GlyArgAlaProGluArgValGlyGlyArgGlyArgGlyArgGlyThrAlaAlaProArg
AlaAlaProAlaAlaArgGlySerArgProGlyProAlaGlyThr et en amont ae cette sous-séquence éventuellement une méthionine.
X AlaAlaGlySer I leTrThrLeuProAlaLeuProG luAspGlyGlySerGlyAlaPheProProGlyHis
PheLysAspProLysArgLeuTyrCysLysAsnGlyGlyPhePheLeuArgIleHisPro
AspGlyArgValAspGlyValArgGluLysSerAspProHisIleLysLeuGlnLeuGln
AlaGluGluArgGlyValValSerIleLysGlyValCysAlaAsnArgTyrLeuAlaMet LysGluAspGlyArgLeuLeuAlaSerLysCysValThrAspGluCysPhePhepheGlu
ArgLeuGluSerAsnAsnTyrAsnThrTyrArgSerArgLysTyrThrSerTrpTyrVal
AlaLeuLysArgThrGlyGlyTyrLysLeuGlySerLysThrGlyProGlyGlnLysAla I leLeuPheLeuProMetSerAlaLysSer dans laquelle X représente l'un quelconque des vingt acides aminés du coce génétique, en amont de celle-ci une deuxième sous-séquence constituée de l'ensemble ou d'une partie tronquée dans sa partie amont et comportant plus de deux acides aminés de la suite :
LeuGlyAspArgGlyArgGlyArgAlaLeuProGlyGlyArgLeuGlyGlyArgGlyArg GlyArgAlaProGluArgValGlyGlyArgGlyArgGlyArgGlyThrAlaAlaProArg
AlaAlaProAlaAlaArgGlySerArgProGlyProAlaGlyThr et en amont ae cette sous-séquence éventuellement une méthionine.
De préférence ce facteur a une séquence constituée de l'une ou l'autre des séquences ci-apres
GlyAspArgGlyArgGlyArgAlaLeuProGlyGlyArgLeuGlyGLyArgGlyArg
GlyArgAlaProGluArgValGlyGlyArgGlyArgGlyArgGlyThrAlaAlaProArg
AlaAlaProAlaAlaArgGlySerArgProGlyProAlaGlyThrMetAlaAlaGlySer IleThrThrLeuproAlaLeuProGluAsoGlyGlySerGlyAlaPheProProGlyHis
PheLysAspProLysArgLeuTyrCysLysAsnGlyGlyPhePheLeuArgIleHisPro
AspGlyArgValAspGlyValArgGluLysSerAspProHisIleLysLeuGlnLeuGln AlaGLuGluArgGlÇValValSerIleLysGlyValCysAlaAsnArgTyrLeuAlaMet
LysGluAspGlyArgLeuLeuAlaSerLysCysValThrAspGluCysPhePhePheGlu
ArgLeuGluSerAsnAsnTyrAsnThrTyrArgSerArgLysTyrThrSerTrpTyrVal
AlaLeuLysArgThrGlyGlnTyrLysLeuGlySerLysThrGlyProGlyGlnLysAla i leLeuPheLeuProetSerAlaLysSer et GlyGlyArgGlyArg
GlyArgAlaProGluArgValGlyGlyArgGlyArgGlyArgGlyThrAlaAlaProArg AlaAlaProAlaAlaArgGlySerArgProGLyProAIaGlyThrNetAlaAlaGlySer
IleThrThrLeuProAlaLeuProGluAspGlyGlySerGlyAlaPheProProGlyHis
PheLysAspProLysArgLeuTyrCysLysAsnGlyGlyPhePheLeuArgIleHisPro
AspGlyArgValAspGlyValArgGluLysSerAspProHîsileLysLeuGlnLeuGln
AlaGluGluArgGlyValVISer1leLysGlyVaICysAlaAsnArgTyrLeuAlaMet
LysGluAspGlyArgLeuLeuAlaSerLysCysValThrAspGluCysPhePhePheGlu
ArgLeuGluSerAsnAsnTyrAsnThrTyrArgSerArgLysTyrThrSerTrpTyrVal AlaLeuLysArgThrGlyGlnTyrLysLeuG lySerLysThrGIyProGlyGlnLysAla
IleLeuPheLeuProMetSerAlaLysSer précédée éventuellement d'une méthionine.
GlyAspArgGlyArgGlyArgAlaLeuProGlyGlyArgLeuGlyGLyArgGlyArg
GlyArgAlaProGluArgValGlyGlyArgGlyArgGlyArgGlyThrAlaAlaProArg
AlaAlaProAlaAlaArgGlySerArgProGlyProAlaGlyThrMetAlaAlaGlySer IleThrThrLeuproAlaLeuProGluAsoGlyGlySerGlyAlaPheProProGlyHis
PheLysAspProLysArgLeuTyrCysLysAsnGlyGlyPhePheLeuArgIleHisPro
AspGlyArgValAspGlyValArgGluLysSerAspProHisIleLysLeuGlnLeuGln AlaGLuGluArgGlÇValValSerIleLysGlyValCysAlaAsnArgTyrLeuAlaMet
LysGluAspGlyArgLeuLeuAlaSerLysCysValThrAspGluCysPhePhePheGlu
ArgLeuGluSerAsnAsnTyrAsnThrTyrArgSerArgLysTyrThrSerTrpTyrVal
AlaLeuLysArgThrGlyGlnTyrLysLeuGlySerLysThrGlyProGlyGlnLysAla i leLeuPheLeuProetSerAlaLysSer et GlyGlyArgGlyArg
GlyArgAlaProGluArgValGlyGlyArgGlyArgGlyArgGlyThrAlaAlaProArg AlaAlaProAlaAlaArgGlySerArgProGLyProAIaGlyThrNetAlaAlaGlySer
IleThrThrLeuProAlaLeuProGluAspGlyGlySerGlyAlaPheProProGlyHis
PheLysAspProLysArgLeuTyrCysLysAsnGlyGlyPhePheLeuArgIleHisPro
AspGlyArgValAspGlyValArgGluLysSerAspProHîsileLysLeuGlnLeuGln
AlaGluGluArgGlyValVISer1leLysGlyVaICysAlaAsnArgTyrLeuAlaMet
LysGluAspGlyArgLeuLeuAlaSerLysCysValThrAspGluCysPhePhePheGlu
ArgLeuGluSerAsnAsnTyrAsnThrTyrArgSerArgLysTyrThrSerTrpTyrVal AlaLeuLysArgThrGlyGlnTyrLysLeuG lySerLysThrGIyProGlyGlnLysAla
IleLeuPheLeuProMetSerAlaLysSer précédée éventuellement d'une méthionine.
L'invention a également trait au médicament contenant le facteur basique de croissance des fibroblastes défini ci-dessus.
L'invention sera mieux comprise à L'aide des exemples ci-après
EXEMPLE 1 : Caractérisation de formes de haut poids moléculaire d hbFGF 1) Isolation de L'ADNc
Une banque d'ADNc a été produite dans Escherichia coli MC 1061 par insertion de l'ADNc synthétisé à partir de l'ARNm extrait des cellules SK-HEP1 dans le vecteur pUC 9 (Pharmacia). La préparation de l'ARJ a été effectuée comme l'a décrit Cathala et al. (1). La construction des molécules d'ADN recombinant a été réalisee suivant la technique de l'"amorce-adaptateur" (2). Cette stratégie de clonage utilise deux oligonucléotides synthétiques partiellement complémentaires.Le premier appelé "amorce" permet la synthèse de l1ADNc. Le deuxième oligonuct6otide appelé "adaptateur", en présence de l'ADNc simple brin polycytidinylé à son extrémité 3', s'apparie à L'"amonce" générant à l'extrémité 5' de L'ADNc un site de restriction "ouvert' (voir Fig 1). De telles molécules d'ADNc simple brin peuvent être inse-ees directement dans un vecteur plasmidique @igéré par deux enzymes de restriction dont l'une a été polyquaninylée.
EXEMPLE 1 : Caractérisation de formes de haut poids moléculaire d hbFGF 1) Isolation de L'ADNc
Une banque d'ADNc a été produite dans Escherichia coli MC 1061 par insertion de l'ADNc synthétisé à partir de l'ARNm extrait des cellules SK-HEP1 dans le vecteur pUC 9 (Pharmacia). La préparation de l'ARJ a été effectuée comme l'a décrit Cathala et al. (1). La construction des molécules d'ADN recombinant a été réalisee suivant la technique de l'"amorce-adaptateur" (2). Cette stratégie de clonage utilise deux oligonucléotides synthétiques partiellement complémentaires.Le premier appelé "amorce" permet la synthèse de l1ADNc. Le deuxième oligonuct6otide appelé "adaptateur", en présence de l'ADNc simple brin polycytidinylé à son extrémité 3', s'apparie à L'"amonce" générant à l'extrémité 5' de L'ADNc un site de restriction "ouvert' (voir Fig 1). De telles molécules d'ADNc simple brin peuvent être inse-ees directement dans un vecteur plasmidique @igéré par deux enzymes de restriction dont l'une a été polyquaninylée.
La banque ainsi établie et comprenant 1 x 106 clones a été étalée sur filtres de nitrocellulose à raison de 2 x clones par filtre. Les filtres et des répliques de ces filtres ont été préparés comme le décrivent Grunstein et Hogness (3).
On a ensuite préparé en se basant sur la séquence nucléctidique d hbFGF récemment publiée (T. KUROKAWA et al.
(1987), 213, 189-194) deux oligonucléotides synthétiques qui ont servi à cribler la banque. Les conditions de marquage des oligcnucleotides ainsi que d'hybridation et de lavage des filtres ont été celles décrites dans "Molecular Clonîng, a laboratory nanual" de Maniatis et al. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1984).
(1) CATHALA et al. (1983 DNA, 2, 329-335 (2) CAPUT et al. (1986) PNAS USA, 83, 1670-1674 (3) GRUNDSTEIN et al. (1975) PNAS USA, 72, 3961
Les clones capables de s'hybrider simultanément avec les deux sondes synthétiques ont été recherches. La fréquence relative de ces deux derniers était inférieure à 2 x 10 5. On a ainsi pu isoler le clone pUC-SK1 contenant l'ADNc du hbFGF.
Les clones capables de s'hybrider simultanément avec les deux sondes synthétiques ont été recherches. La fréquence relative de ces deux derniers était inférieure à 2 x 10 5. On a ainsi pu isoler le clone pUC-SK1 contenant l'ADNc du hbFGF.
2) Determination et analyse de la séquence de llADNc
L'ADN plasmidique du clone pUC-SK1 obtenu en 1) a été purifié par la méthode d'extraction alcaline. L'ADN plasmidique a été digéré par les enzymes de restriction HindIII, PstI, ECORI et
BamHI par simple et double digestion. Les fragments de restriction obtenus sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose 1 %. Une carte d'enzymes de restriction de I'ADNc contenu dans le plasmide a été déduite (Cf. Fig.2).
L'ADN plasmidique du clone pUC-SK1 obtenu en 1) a été purifié par la méthode d'extraction alcaline. L'ADN plasmidique a été digéré par les enzymes de restriction HindIII, PstI, ECORI et
BamHI par simple et double digestion. Les fragments de restriction obtenus sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose 1 %. Une carte d'enzymes de restriction de I'ADNc contenu dans le plasmide a été déduite (Cf. Fig.2).
L'ADN plasmi di que a ensuite été digéré par différentes combinaisons des enzymes de restriction ci-dessus. Les fragments de restriction obtenus ont été fractionnés sur gel d'agarose 1 %.
Certains de ceux-ci ont été extraits du gel (par la méthode "Gene ctean" (AZYME)) puis sous-clonés dans le polylinker (polysite de clonage) de l'ADN du phage M13mp18 ou M13mp19 (Pharmacia). Les sous-clones M13 ainsi obtenus ont été séquences par la méthode de
Sanger. Les séquences d'ADN ainsi obtenues pour chacun des sousclones ont été assembles de façon à obtenir la séquence complète de l'ADF!c du plasmide pUC-SK1 (Cf. Fig. 3).
Sanger. Les séquences d'ADN ainsi obtenues pour chacun des sousclones ont été assembles de façon à obtenir la séquence complète de l'ADF!c du plasmide pUC-SK1 (Cf. Fig. 3).
Sur la base de la séquence de l'ADNc, la séquence complète d'acides aminés du hbFGF peut être déduite. La séquence de l'ADNc fait apparaitre un seul site d'initiation potentiel usueL de la traduction du hbFGF : llATG en position 467, ci-apres appelé
ATG 467. La séquence d'acides aminés déduite à partir de ce codon d'initiation correspond à la séquence du hbFGF de 155 acides aminés déjà connue (T. KUROKAWA et al. (1987), 213, 189-194).
ATG 467. La séquence d'acides aminés déduite à partir de ce codon d'initiation correspond à la séquence du hbFGF de 155 acides aminés déjà connue (T. KUROKAWA et al. (1987), 213, 189-194).
Cependant, la phase de lecture reste ouverte (pas de codon de terminaison de traduction) en amont de l'ATG bien qu'aucun autre ATG n'apparaisse en phase. Quatre sites d'initiation potentiels inusuels sont à relever : le CTG en position 302, 329 et 344 ; l'ACG en position 407, en phase avec l'ATG 467. Ces deux codons ont déjà été décrits comme initiateurs potentiels de trad@ction (S.R. HANN et al. (1988) Cell, 52, 185-195 et A.C. PRATS (1989), J. Mol. Biol. (1989), 205, D-10). La séquence de L'ADNc fait done aparaitre quatre formes longues potentielles de hbFGF.La plus longue comporte 210 acides aminés dont la séquence est déduite de l'ADNc, depuis le codon CTG en position 302 au codon de terminaison de traduction TGA en position 932. La séquence de l'ADNc est différente, en amont de l'ATG des deux autres séquences d'ADNc du hbFGF déjà publiées (J. ABRAHAM et al. (1986) EMBO J. (5 2523-2528 et T. KUROKAWA et al. (1987) Febs, 213, 1, 189-194). Elle comporte en effet un nucléotide supplémentaire, à la position 463 par rapport à la séquence publiée par KUROKAWA et à la -position 369 par rapport à celle publiée par ABRAHAM.L'absence de l'un ou l'autre de ces nucléotides phase ces codons d'initiation @@usuets (å l'exception de l'ACG pour la séquence publiée par
ABRAHAM) par rapport à l'ATG en position 467.
ABRAHAM) par rapport à l'ATG en position 467.
3) Transcription et traduction in vitro
Le fragment de restriction d'ADNc compris entre le site
HindIII présent en amont de l'ADNc (Cf. Fig. 1) et le site ECORI en position 1711 a été purifié sur gel d'agarose 1 % par la méthode de "Gene Clean" (OZYME). Ce fragment qui contient toute la séquence codant du hbFGF a été sous-cloné entre les sites HindIII et ECORI d polylinker du plasmide de transcription in vitro pSP64 (Promega
Biotec). Le plasmide obtenu appelé pSP54hbFGF est linéarisé par l'enzyme de restriction ECORI puis transcrit en ARNhbFGF à l'aide de l'ARN polymérase SP6.
Le fragment de restriction d'ADNc compris entre le site
HindIII présent en amont de l'ADNc (Cf. Fig. 1) et le site ECORI en position 1711 a été purifié sur gel d'agarose 1 % par la méthode de "Gene Clean" (OZYME). Ce fragment qui contient toute la séquence codant du hbFGF a été sous-cloné entre les sites HindIII et ECORI d polylinker du plasmide de transcription in vitro pSP64 (Promega
Biotec). Le plasmide obtenu appelé pSP54hbFGF est linéarisé par l'enzyme de restriction ECORI puis transcrit en ARNhbFGF à l'aide de l'ARN polymérase SP6.
De manière similaire, différents ARN hbFGF ont été obtenus à partir de constructions ou L'ADNc hbFGF sauvage a été muté ponctuellement (Cf. Fig. 4). Un premier mutant ou le codon à la position 440 (codon GGA) a été changé en codon TGA (codon de terminaison), un second mutant où le codon à la position 467 (codon
ATG) a été changé en codon GTC. Les deux premiers mutants ont été obtenus par la technique de mutagénèse dirigée par un oligonucléotide synthétique (4) avec utilisation de la T4 ADN polymérase (4) (ZOLLER M.G. 1982 Nucl. Ac. Res. , 10, 6487-6500) (Pharmacia). Un troisième et un quatrième mutant ont été obtenus où le codon CTG à la position 302 a été changé respectivement en codon TTG ou ATG.Ces deux dernières mutations ont été introduites par remplacement du fragment de restriction Xhol/NotI (position 295-319) par un oligonucléotîde synthétique double brin, dans lequel la mutation à réaliser a été introduite.
ATG) a été changé en codon GTC. Les deux premiers mutants ont été obtenus par la technique de mutagénèse dirigée par un oligonucléotide synthétique (4) avec utilisation de la T4 ADN polymérase (4) (ZOLLER M.G. 1982 Nucl. Ac. Res. , 10, 6487-6500) (Pharmacia). Un troisième et un quatrième mutant ont été obtenus où le codon CTG à la position 302 a été changé respectivement en codon TTG ou ATG.Ces deux dernières mutations ont été introduites par remplacement du fragment de restriction Xhol/NotI (position 295-319) par un oligonucléotîde synthétique double brin, dans lequel la mutation à réaliser a été introduite.
Chacun des ARN hbFGF obtenus in vitro a été traduit in vitro dans un extrait de lysat de réticulocyte comme décrit ci-apres. Après un traitement à la DNASEI, les ARN transcrits sont extraits deux fois avec du phénol/chloroforme, précipités avec de l'étnanol et resuspendus dans de l'eau. Les ARN, à la concentration de 10 à 20 g/ml. ont été traduits à une température de 37 C pendant une heure par utilisation d'un système de lysat de réticulo- cyte a laoin (Promega Biotec) dilué cieux fois en présence de 0,5 à 1 @Ci/ml de méthionine (355) (Amershem).Les protéines marquées obtenues ont été analysées par électrochorése sur gel de pclyacrylanide en présence de SDS suivie d'une autoradiographie.
L'autoradiogramme obtenu est représenté sur la figure 5.
La construction avec l'ADNc hbFGF non muté fait ecoaraitre, après transcription et traduction in vitro, 3 bandes de protéines hbFGF de poids moléculaires approximatifs de 18, 21 et 22,5 kDa (piste 2). Le remplacement de l'ATG 467 par le codon GTG abolit la synthèse de la protéine de 18 kDa mais pas celle des protéines 21 et 22,5 kDa (piste 3). L'introduction d'un codon de terminaison TGA à la position 440 en amont de L'ATG 467 abolit Les protéines de 21 kDa et 22,5 kDa mais pas celle de 18 kDa (piste 4).
Ces résultats montrent que, d'une part, la protéine de 18 kDa est initiée sur L'ATG 467 et, d'autre part, que les protéines de 21 et 22,5 kDa sont initiées en amont de L'ATG probablement sur deux codons d'initiation non usuels du fait qu'il n'existe pas d'autre
ATG en phase ouverte en amont de t'ATG 467.
ATG en phase ouverte en amont de t'ATG 467.
Les codons, décrits ci-dessus en 2), CTG 302, CTG 329,
CTG 344 et ACG 407 sont des codons potentiels pour initier La synthèse des protéines de 21 et 22,5 kDa. L'environnement nucléotidique d'un site d'initiation de traduction décrit pas KOZAK (M. KOZAK (1978) Cell., 15 1109-1123) et la taille des protéines obtenues in vitro suggèrent que le CTG 302 et le CTG 344 sont partioulièrement de bons candidats. Le remplacement du CTG 302 par TTG réduit sévèrement la synthèse de la protéine de 22,5 kDa (piste 5).
CTG 344 et ACG 407 sont des codons potentiels pour initier La synthèse des protéines de 21 et 22,5 kDa. L'environnement nucléotidique d'un site d'initiation de traduction décrit pas KOZAK (M. KOZAK (1978) Cell., 15 1109-1123) et la taille des protéines obtenues in vitro suggèrent que le CTG 302 et le CTG 344 sont partioulièrement de bons candidats. Le remplacement du CTG 302 par TTG réduit sévèrement la synthèse de la protéine de 22,5 kDa (piste 5).
D'autre part, le remplacement de CTG 302 par ATG entraine une augmentation importante de La synthèse de la protéine de 22,5 kDa. Ces résultats montrent que la protéine de haut poids moléculaire de 22,5 kDa du hbFGF synthétisé in vitro est initiée sur le CTG en position 302. Le CTG 344 présente le même environnement nucléotioique que le CTG 302 (GAGG/CTG/GGGG), ce qui suggère fortement que le CTG 344 initie la synthèse de la protéine de 21 kDs synthétisée n vitro.
Cette étude fait donc apparaître l'existence et la caractérisatior de formes du hbFGF de plus hauts poids moléculaires que celles déjà décrites et caractérisées : une première protéine primaire de 210 acides aminés initiée sur le CTG 302 et élongée
Jusqu'au codon de terminaison TGA 932. Une seconde protéine primaire de 196 acides aminés initiée sur le CTG 344 et élonge jusqu'à même codon de terminaison.
Jusqu'au codon de terminaison TGA 932. Une seconde protéine primaire de 196 acides aminés initiée sur le CTG 344 et élonge jusqu'à même codon de terminaison.
EXEMPLE 2 : Expression d'un gêne recombinant hbFGF codant pour une
séquence de 210 acides aminés dans les microorganismes
procaryotes 1) Construction du vecteur d'expression
a) principe de fonctionnement
Le vecteur d'origine est le vecteur pET-3a décrit par
Rcsenberg (Rosenberg et al. (1987) Gene, 56, 125-135) qui permet l'expression sélective de gènes clonés après transcription de leurs séquences codantes par I'ARN polymérase du phage T7. Cette ARN polymérase est produite par la souche E. coli réceptrice BL21/DE3 décrite par Studier (Studier W.F. et al. (1986) J. Mol. Biol., 189 113-130). Cette souche contient dans son génome le gène du phage T7 codant pour l'ARN polymérase, introduit à l'aide d'un phage #. Le gene est sous le contrâle du promoteur la cUV5 de E. Coli permet la transc-ription après induction à L'IPTG (Isopropyl ss-D-thiogalactoside). L'ARN polymérase produite transcrit fortement et spécifiquement les gènes clonés aux sites appropriés du vecteur pET-3a, sous le contrôle d'un promoteur du nage T7. L'unité de transcription est complétés par la séquence d'un ter-inateur du phage T7 placée derrière Le gène et qui permet la régulation de la forte transcription.
séquence de 210 acides aminés dans les microorganismes
procaryotes 1) Construction du vecteur d'expression
a) principe de fonctionnement
Le vecteur d'origine est le vecteur pET-3a décrit par
Rcsenberg (Rosenberg et al. (1987) Gene, 56, 125-135) qui permet l'expression sélective de gènes clonés après transcription de leurs séquences codantes par I'ARN polymérase du phage T7. Cette ARN polymérase est produite par la souche E. coli réceptrice BL21/DE3 décrite par Studier (Studier W.F. et al. (1986) J. Mol. Biol., 189 113-130). Cette souche contient dans son génome le gène du phage T7 codant pour l'ARN polymérase, introduit à l'aide d'un phage #. Le gene est sous le contrâle du promoteur la cUV5 de E. Coli permet la transc-ription après induction à L'IPTG (Isopropyl ss-D-thiogalactoside). L'ARN polymérase produite transcrit fortement et spécifiquement les gènes clonés aux sites appropriés du vecteur pET-3a, sous le contrôle d'un promoteur du nage T7. L'unité de transcription est complétés par la séquence d'un ter-inateur du phage T7 placée derrière Le gène et qui permet la régulation de la forte transcription.
b) Construction du plasmide recombinant contenant le gène htFGF codant pour une séquence de 210 acides aminés.
Tous les produits de restriction des séquences décrites ici sont soumis à une séparation sur gel d'agarose à 1 % cu 2 X (Sigma) en tampon TAE (tris acétate EDTA), simultanément avec un standard de poids molécuLaires. Les fragments d'intérét sont purifiés à partir de l'agarose par la méthode de "Gene Clean" (OZYME) se Ion Les méthodes indiquées par le fournisseur. Les autres méthoses employées ainsi que Les compositions des tampons et des réactifs utilisés sont celles décrites dans "olecular Cloning, a labcratory manual" et celles indiquées par les fournisseurs.
La séouence codante du hbFGF est introduite dans le vecteur pET-3a, représenté sur la iigure 6, aux sites de restrictions uniques NdeI et BanHI. La séquence d'un terminateur du phage fd (BUJARD (1981) PNAS, 78/8, 4936-4940) est placée en aval de la séquence hbFGF à l'aide de ces sites de restriction BamHI et
HindIII. La séquence hbFGF est constituée en partie du fragment de restriction BssHII-HindIII dont les sites sont situés respectivement en position 325 et 1153 de l'ADNc. La séquence est complétée par un ADN synthétique constitué de deux oligpdésoxyribo- nucléotides complémentaires formant des extrémités cohésives BssHII et NdeI compatibles avec la séquence d'ADNc hbFGF et celle du promoteur du phage T7.Les séquences-de ces deux oligonucléotides sont les suivantes :
5' T ATG GGT GAC CGT GGT CGT GGT CG 3' et
5' CGCGCGACCACGACCACGGTCACCCA 3' (cet artifice permet de remplacer le codon initiateur naturel
CTG 302 en codon initiateur ATG et de créer un environnement nucléotidique de ce dernier plus favorable pour l'expression dans
E. coli). Les séquences synthétiques Sont chauffées à 1000C pendant une minute dans un volume réactionnel de 10 l à une concentration de 15 pg/mI en tampon Tris-HCl pH : 7,5 10 mM/NaCl 50 mM. On laisse refroidir graquellement jusqu'à température du laboratoire de façon à hybrider les deux oligonucléotides. On conserve dans La glace.
HindIII. La séquence hbFGF est constituée en partie du fragment de restriction BssHII-HindIII dont les sites sont situés respectivement en position 325 et 1153 de l'ADNc. La séquence est complétée par un ADN synthétique constitué de deux oligpdésoxyribo- nucléotides complémentaires formant des extrémités cohésives BssHII et NdeI compatibles avec la séquence d'ADNc hbFGF et celle du promoteur du phage T7.Les séquences-de ces deux oligonucléotides sont les suivantes :
5' T ATG GGT GAC CGT GGT CGT GGT CG 3' et
5' CGCGCGACCACGACCACGGTCACCCA 3' (cet artifice permet de remplacer le codon initiateur naturel
CTG 302 en codon initiateur ATG et de créer un environnement nucléotidique de ce dernier plus favorable pour l'expression dans
E. coli). Les séquences synthétiques Sont chauffées à 1000C pendant une minute dans un volume réactionnel de 10 l à une concentration de 15 pg/mI en tampon Tris-HCl pH : 7,5 10 mM/NaCl 50 mM. On laisse refroidir graquellement jusqu'à température du laboratoire de façon à hybrider les deux oligonucléotides. On conserve dans La glace.
Les quatres séquences ADN décrites ci-dessus sont assemblées in vitre dans un volume réactionnel de 30 L et 6 unités de l'enzyme T4 ADN ligase (Pharmacia). Les séquences sont mélangées dans un rapport molaire à l'ADN vecteur, de 2 pour la séquence hbFGF et celle du terminateur du phage fd et de 100 pour la séquence synthétique. La réaction a été réalisée à une température eu 150C pendant 16 heures.
Le produit de la réaction est mis en contact avec environ 108 cellules de La souche E. coli MC 1061 décrite par Casadaban
M.J. (Casacaban M.J. et al., J. of bact. 143/2-1980, 917-981), prétablement traitées au chlorure de calcium 50 mM. Les cellules transformées sont étalées sur boites de milieu L solide additionné de 100 g/ml d'ampicilline. On laisse incuber 16 heures à 37 C.
M.J. (Casacaban M.J. et al., J. of bact. 143/2-1980, 917-981), prétablement traitées au chlorure de calcium 50 mM. Les cellules transformées sont étalées sur boites de milieu L solide additionné de 100 g/ml d'ampicilline. On laisse incuber 16 heures à 37 C.
Douze colonies isoles sont mises en culture en milieu L additionné d'ampicilline à 100 g/ml final jusqu'à la phase stationnaire. Les plasmides Sont purifiés par la méthode de lyse alcaline décrite par
Birobcim H.C. et Doly J. (Nuc. Ac. Reas., 7-1979). Les plasmides sont analysés par les enzymes de restriction BssHII, NdeI, BamHI et BstEII et sélectionnés après analyse sur gel d'agarose d'après le profil théorique des fragments à obtenir.
Birobcim H.C. et Doly J. (Nuc. Ac. Reas., 7-1979). Les plasmides sont analysés par les enzymes de restriction BssHII, NdeI, BamHI et BstEII et sélectionnés après analyse sur gel d'agarose d'après le profil théorique des fragments à obtenir.
Le clone retenu est nommé 409.2. Il contient par construction le plasmide 409.2 représenté sur la figure 7 qui comprend la séquence codante du hbFGF 210 représentée sur la figure 8 (qui précise également la séquence d'acides aminés codée).
2) Expression dans E. coli de l'ADNc du gène recombinant hbFGF codant pour une séquence de 210 acides aminés
Le plasmide 409.2 est utiLisé pour transformer la souche
E. coli BL21/DE3 mentionnée ci-dessus, préalablement traitée au chlorure de calcium 50 mM. Les cellules sont étalées selon la procédure décrite précédemment.
Le plasmide 409.2 est utiLisé pour transformer la souche
E. coli BL21/DE3 mentionnée ci-dessus, préalablement traitée au chlorure de calcium 50 mM. Les cellules sont étalées selon la procédure décrite précédemment.
Une cclonie est mise en culture en milieu L additionné de 100 pglml d'ampicilline. La culture est effectuée à une température de 370C sous agitation à 180 tr/min jusqu a une densité optique de 1 mesurée à 600 nm. On centrifuge alors en tube de 1,5 ml un volume contenant Z.108-cellules qui constitue l'échantillon témoin avant induction.
On induit l'expression de l'ADNc codant pour le hbFGF 210, en rajoutant à La culture 1 mM d'IPTG. On incube pendant 2 heures à une température de 370C. On centrifuge un volume contenant 2.108 cellules qui constitue l'échantillon induit.
Les culots bactériens des différents échantillons sont repris dans 20 pl d'un tampon Tris-HCl pH : 6,8 ; 60 mM/SDS 2 %/
Glycérol 10 %/ss2 mercaptoéthanol 0,5 %/bleu de bromophénol 0,05 %.
Glycérol 10 %/ss2 mercaptoéthanol 0,5 %/bleu de bromophénol 0,05 %.
On fait bouillir 10 min et on conserve dans la glace. Les échantillons sont soumis à une électrophorèse sur un gel dénaturant de polyacrylamide à 12,5 % contenant du SDS d'après les procédures décrites par Laenmîi U.K. (Nature, 227, 1970, 680-685).
La séparation est effectuée pendant 5 heures à 150 volts en présence d'un standard de poids moléculaire et de FGF basique témoin (la forme 146 acides aminés). Les protéines sont transférées sur membrane de nitrocellulose (Biorad) par éîectrotransfert en tampon Tris 20 mM/Glycine 150 mM et Méthanol 20 % pendant 3 heures avec une intensité de 200 mA et à une température de 100C. La membrane est mise à saturer après transfert dans du tampon Al (Tris-HCl pH : 7,4/NaCl 0,9 %) et BSA 3 % (Bovine Serum ALbumine) pendant 16 heures à une température de 200C. La membrane est ensuite placée dans 30 ml de tampon AL/BSA 3 Z auquel on rajoute 60 l d'un sérum de tapin immunisé par le FGF basique purifié (forme 146 acides aminés). On incube pendant 90 min à une température de 370C. On lave la membrane 3 fois pendant 10 min avec 150 ml de tampon Al, 3 fois pendant 10 min avec 150 ml de tampon Al/NP40 0,05 % et de nouveau 3 fois pendant 10 min avec 150 ml de tampon Al. Les complexes antigènes-anticorps sont révélés par incubation de la membrane dans 30 ml de tampon Al/BSA 3 % avec 3 Ci(111 KBq) de protéine A-I125. (Réf. NEN) pendant 1 heure à 200C. On effectue ensuite tes lavages comme décrit précédemment.
La membrane est soumise à une autoradiographie : une bande supplémentaire d'environ 22 kDa apparat dans l'échantillon induit.
3) Purification du hbFGF par chrematographie d'affinité
Une culture de 1 litre de la souche d'E. coli
BL21/DE3 transformée par le plasmide 409.2 est effectuée dans des ccnditions identiques à celles décrites en 2). Après induction, les cultures sont centrifugées à 5 000 g pendant 10 min et les culots de bactéries lavés avec un même volume de tampon phosphate 0,1 M pH : 6 et à nouveau ceptrifugés à 5 000 g pendant 10 min. Les culots sont conservés à une température de -20 .
Une culture de 1 litre de la souche d'E. coli
BL21/DE3 transformée par le plasmide 409.2 est effectuée dans des ccnditions identiques à celles décrites en 2). Après induction, les cultures sont centrifugées à 5 000 g pendant 10 min et les culots de bactéries lavés avec un même volume de tampon phosphate 0,1 M pH : 6 et à nouveau ceptrifugés à 5 000 g pendant 10 min. Les culots sont conservés à une température de -20 .
Le culot cellulaire est resuspendu dans 50 ml d'une sclution Tris-HCl 10 mM oH : 7,4/NaCl 0,65M/0,25 % BSA/Leupeptine (peptide Institut) 1 mg par ml/Iniprol (Aprotinine) (Calbiochem) 1 %/Pesstatine A (Sigma) 150 pM/Soybean 0,1 mg par ml/EDTA 1 mM/Phénylméthylsulfonylfluoride (PMSF) 2 mM. La suspension a été soumise a une ultrasonication, puis centrifugée à 3 000 tr/min. Le surnaceant a été r6cupéré puis incubé 1 heure à la température de 370 C en présence de DNAse I à 6 mg/ml. Le surnageant a été additionné de 40 ml de la solution décrite ci-dessus, puis appliqué sur une colonne d'hécarine sépharose de 10 ml préalablement tamponnée avec une solution Tris HCl 10 mM pH : 7,4/NaC l 0,65 M/EDTA 1 mM.La colonne a été lavée avec cette même solution puis avec une solution TrisHCl 10 mM FH : 7,4/NaCl 1 M/EDTA 1 mM. L'hbFGF a été éluée avec 10 ml d'une solution Tris HCl 10 mM pH : 7,4/NaCl 2 M/EDTA 0,3 mM en fractions de 1 ml.
Un échantillon de chacune des fractions d'élution a été scumis à une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 14 X en présence de SDS. Les protéines du gel ont été révélées par ta technique de coloration à l'argent (Biorad). Les fractions contenant une bande de 22,5 kDa ont été rassemblées. Un échantillon du pool obtenu a été analysé sur un gel de polyacrylamide (Cf.
Fig. 13). La concentration d'hbFGF ainsi purifiée a été estimée à 20 g/ml (volume total 10 ml), par comparaison avec du bFGF de 146 acides aminés déjà quantifié.
4) Détermination de la séquence amino terminale du hbFGF
500 l du hbFGF purifié en 3) ont été injectés sur une colonne HPLC (2,1 x 100 mm) de phase inverse (Brownlee). Un gradient continu de 1 à 60 % d'acétonitrile, 0,1 % d'acide trifluoroacétique, a été appliqué pendant 10 min. La détection de l'éluat a été réalisée à 220 nm. Le profil d'solution présente cinq pics F1, F2, F3, F4, F5 (Cf. Fig. 14). La surface du pic
F2 (pic majoritaire) représente plus de 70 % de la somme des surfaces des cinq pics d'élution. La fraction protéique correspondant au pic d'élution F2 a été récoltée (4 à 8 pg de protéine) et séquencée à partir de l'extrémité amino terminale sur un séquenceur 470 A d'Applied Biosystems.La séquence protéique amno terminale suivante 55 acides aminés a ainsi été obtenue GlyAspArgGlyArgGlyArgAîaLeuProGlyGlyArgLeuG lyGlyArgGlyArg
GlyArgAlaProGluArgValGlyGlyArgGlyArgGlyArg X ThrAlaAlaProArg
A!aAlaProhlaALaArg X X ArgProGlyProAla X X Met (dans la séquence ci-dessus, X représente les acides aminés non déterminés).
500 l du hbFGF purifié en 3) ont été injectés sur une colonne HPLC (2,1 x 100 mm) de phase inverse (Brownlee). Un gradient continu de 1 à 60 % d'acétonitrile, 0,1 % d'acide trifluoroacétique, a été appliqué pendant 10 min. La détection de l'éluat a été réalisée à 220 nm. Le profil d'solution présente cinq pics F1, F2, F3, F4, F5 (Cf. Fig. 14). La surface du pic
F2 (pic majoritaire) représente plus de 70 % de la somme des surfaces des cinq pics d'élution. La fraction protéique correspondant au pic d'élution F2 a été récoltée (4 à 8 pg de protéine) et séquencée à partir de l'extrémité amino terminale sur un séquenceur 470 A d'Applied Biosystems.La séquence protéique amno terminale suivante 55 acides aminés a ainsi été obtenue GlyAspArgGlyArgGlyArgAîaLeuProGlyGlyArgLeuG lyGlyArgGlyArg
GlyArgAlaProGluArgValGlyGlyArgGlyArgGlyArg X ThrAlaAlaProArg
A!aAlaProhlaALaArg X X ArgProGlyProAla X X Met (dans la séquence ci-dessus, X représente les acides aminés non déterminés).
Cette séquence est identique, comme attendu, à celle déduite du gène recombinant hbFGF codant pour une séquence de 210 acides aminés (Cf. Fig. 8), à l'exception du premier acide aminé de cette dernière, la méthionine d'initiation, absente ici à l'extrémité amino terminale. Celle-ci a donc probablement été éliminée au cours d'un processus de maturation post-traductionnet.
5) Détermination de l'activité mitogène du hbFGF
L'activité mitogène du hbFGF purifié en 3) a été déterminée sur des cellules endothéliades aortiques de bovin (ABAE) comme suit : les cellules ont été étalées à 1,5 x 104 cellules par boite de 35 mm de diamètre dans du DMEM (milieu d'Eagle modifié par
Dulbecco) additionné de 10 % de sérum de veau (Seromed). Du hbFGF de 22,5 kDa a été ajouté dans le milieu tous les deux jours.
L'activité mitogène du hbFGF purifié en 3) a été déterminée sur des cellules endothéliades aortiques de bovin (ABAE) comme suit : les cellules ont été étalées à 1,5 x 104 cellules par boite de 35 mm de diamètre dans du DMEM (milieu d'Eagle modifié par
Dulbecco) additionné de 10 % de sérum de veau (Seromed). Du hbFGF de 22,5 kDa a été ajouté dans le milieu tous les deux jours.
L'activité mitogène a été déterminée par comptage des cellules
ABAE, à l'aide d'un compteur à cellules (Coultronic) cinq jours acres l'étalement. Un témoin positif a été réalisé avec du bFGF recombinant (E. coli) de 17 kDa (146 acides aminés).
ABAE, à l'aide d'un compteur à cellules (Coultronic) cinq jours acres l'étalement. Un témoin positif a été réalisé avec du bFGF recombinant (E. coli) de 17 kDa (146 acides aminés).
Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 9.
Celle-ci montre que la forme lourde du hbFGF de 22,5 kDa produite à partir du gène recombinant exprimé dans E; coli est biologiquement active.
EXEPLE 3 : Expression de génes recombinants hbFGF dans les cellu
les eucaryotes pour démontrer la réalité biologique
de l'initiation sur les codons non usuels mis en évi
dence dans exemple 1 1) Co@struction des vecteurs d'expression
Le fragment de restriction de l'ADNc hbFGF entre dans le site HindIII présent en amont de I'ADNc (Cf. Fig. 1) et le site EalI (pesition 9L3) a été purifié sur gel d'agarose 1 % par la méthode "Gene Ctean" (OZYtE). Le site cohésif HindIII a été partiettement rempli par action de l'ADN polymérase de T4 (Pharracia) en présence de nucléotides dATP et dGTP.Ce fragment a été sous-cloné dans le polylinker de L'ADN du vecteur d'expression de L'ADN polymérase de T4 en présence de nucléotides dCTP et dTTP, et le site SmaI. La construction obtenue est appelée pSVLhbFGF
ATG (C-;. Fig. 10?. Une seconde construction a été réalisée de manie-e identique mais avec un ADNc hbFGF muté, dans lequel le codon ATG 467 a été remplacé par le codon GTG par mutagenèse dirigée par un oligonucléotide synthétique, comme décrit dans l'exemple 1-3). La construction plasmidique obtenue est appelée pSVL hbFGF ATG . Une troisième construction similaire au plasmide pSVL hbFGF ATG+, mais dans laquelle la partie de l'ADNc hbFGF située en amont du site ApaI (position 455) a été délétée, a été réalisée. Elle est nommée pSVLhbFGF#.
les eucaryotes pour démontrer la réalité biologique
de l'initiation sur les codons non usuels mis en évi
dence dans exemple 1 1) Co@struction des vecteurs d'expression
Le fragment de restriction de l'ADNc hbFGF entre dans le site HindIII présent en amont de I'ADNc (Cf. Fig. 1) et le site EalI (pesition 9L3) a été purifié sur gel d'agarose 1 % par la méthode "Gene Ctean" (OZYtE). Le site cohésif HindIII a été partiettement rempli par action de l'ADN polymérase de T4 (Pharracia) en présence de nucléotides dATP et dGTP.Ce fragment a été sous-cloné dans le polylinker de L'ADN du vecteur d'expression de L'ADN polymérase de T4 en présence de nucléotides dCTP et dTTP, et le site SmaI. La construction obtenue est appelée pSVLhbFGF
ATG (C-;. Fig. 10?. Une seconde construction a été réalisée de manie-e identique mais avec un ADNc hbFGF muté, dans lequel le codon ATG 467 a été remplacé par le codon GTG par mutagenèse dirigée par un oligonucléotide synthétique, comme décrit dans l'exemple 1-3). La construction plasmidique obtenue est appelée pSVL hbFGF ATG . Une troisième construction similaire au plasmide pSVL hbFGF ATG+, mais dans laquelle la partie de l'ADNc hbFGF située en amont du site ApaI (position 455) a été délétée, a été réalisée. Elle est nommée pSVLhbFGF#.
2) Transfection dans les cellules COS-3
Les cellules de singe COS-3 ont été cultivées dans des boîtes de 100 mm de diamètre dans le milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), additionné de 10 x de sérum foetal de veau (Gibco
BRL) à une température de 370C et en présence de 5 % de gaz carbonique. 1,5 à 2 x 106 cellules COS ont été transfectées avec 20 pg d'ADN plasmidique (pSVL hbFGF ATG+, pSVL hbFGF ATG ou pSVL hbFGF#) dans 5 ml de DMEM/10 % de sérum foetal de veau/200 ug/ml de Di éthylaminoéthyl-dextran/100 pM en chloroquine. Après une incubation de 5 heures, à une température de 370C, le mélange de transfection est enlevé.Les cellules sont rincées avec une solution de tampon phosphate (PBS) et traitées-pendant une minute avec une solution de PBS à 10 % de diméthylsulfoxyde puis rincées à nouveau deux fois avec du PBS. Les cellules sont ensuite incubées pendant 65 heures dans du DMEM à 0,5 % de sérum foetal de veau.
Les cellules de singe COS-3 ont été cultivées dans des boîtes de 100 mm de diamètre dans le milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), additionné de 10 x de sérum foetal de veau (Gibco
BRL) à une température de 370C et en présence de 5 % de gaz carbonique. 1,5 à 2 x 106 cellules COS ont été transfectées avec 20 pg d'ADN plasmidique (pSVL hbFGF ATG+, pSVL hbFGF ATG ou pSVL hbFGF#) dans 5 ml de DMEM/10 % de sérum foetal de veau/200 ug/ml de Di éthylaminoéthyl-dextran/100 pM en chloroquine. Après une incubation de 5 heures, à une température de 370C, le mélange de transfection est enlevé.Les cellules sont rincées avec une solution de tampon phosphate (PBS) et traitées-pendant une minute avec une solution de PBS à 10 % de diméthylsulfoxyde puis rincées à nouveau deux fois avec du PBS. Les cellules sont ensuite incubées pendant 65 heures dans du DMEM à 0,5 % de sérum foetal de veau.
Les cellules COS transfectées ont été décollées mécaniquement et soumises à une centrifugation. Les culots cellulaires ont été lavés deux fois avec du PBS, resuspendus à la concentration du 107 cellules/ml dans du PBS additionné de 0,2 % d'albumine de sérum bovin (BSA). Après lyse par ultrasons, les extraits ont été centrifugés à 12 000 g et les culots éliminés.
3) Analyse des extraits de cellules COS par électrophorèse et révélation à L'aide du sérum de lapin immunisé contre du bFGF (Cf.
exemple 2.2)) : 25 PI des extraits de cellules COS préparées en 2) ont été fractionnés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 10 % en présence de SDS. Les protéines du gel sont transférées sur membrane de nitrocellulose par la technique d'électrotransfert. La membrane est incubée avec le sérum. Les complexes anticorps-antigènes sont révélés par de la protéine A radiomarquée à l'iode 125 (NEN). Une autoradiographie de la membrane a été réalisée.
L'autoradiogramme est reproduit sur la figure 11.
Pour l'extrait de cellules COS transfectées par le plasmide pSVL hbFGF ATG (piste 3), on observe une bande dominante de 18 kDa approximativement et plusieurs bandes mineures de plus haut poids moléculaire. Ces mêmes bandes mineures sont retrouvées, avec la même intensité, pour l'extrait de cellules COS transfectées par le plasmide pSVL hbFGF ATG (piste 4). Du fait du remplacement du codon ATG à la position 467 par un codon GTG, la bande de 18 kDa est fortement diminuée, dans cet extra t. Seule la bande de 18 kDa (oédoublée) est présente pour l'extrait de cellules COS trans fectées par le plasmide pSVL hbFGF# (piste 5).
L'autoradiogramme révèle d'autre part que l'extrait de cellules COS transfectées par le plamisde pSVL hbFGF ATG+ renferme une quantité globale d'hbFGF beaucoup plus importante que extrait des cellules COS tranfectées par le plasmide pSVL hbFGF ATG 4) Détermination de l'activité mitogène des extraits de cellutes
COS transfectées.
COS transfectées.
L'activité mitogéne des extraits obtenus en 2) a été déterminée sur des cellules endothéliales aortiques de bovin (ABAE) ccn-e suit . les cellules ont été étalées à 2 x 104 cellules par bote de 35 mn de diamètre dans du milieu DMEM additionné de 10 X de sé@@@ de veau (Seromed). 2,5 pt de chaque extrait COS ont été ajoutés tous les deux jours. L'activité mitogène a été détermine par comptage de cellules ABAE cinq jours après l'étalement. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau 1 ci-après.
TABLE 1 : Activité mitogène des extraits des cellules COS transfectées
<tb> <SEP> Echantillon <SEP> ajouté <SEP> au <SEP> milieu <SEP> # <SEP> Nombres <SEP> de <SEP> cellules <SEP> par <SEP> - <SEP>
<tb> <SEP> de <SEP> cellules <SEP> ABAE <SEP> # <SEP> boîte <SEP> après <SEP> 5 <SEP> Jours
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<tb> <SEP> (ténoin <SEP> positif) <SEP> 8,7 <SEP> x <SEP> 105
<tb> <SEP> Pas <SEP> d'adjonction <SEP> 1,2 <SEP> x <SEP> 105
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Le tableau 1 montre que l'extrait de cellules transfectées par pSVL hbFGF ATG est capable de stimuler la division cellulaire des cellules endothéliales ABAE. L'ATG à la position 467 n'est donc pas indispensable à la synthèse de hbFGF biologiquement actif.Ce résultat, dans les cellules eucaryotes, corrobore ceux développés dans l'exemple 1, dans lequel il est démontré in vitro l'existence de cotons initiateurs de traduction non usuels en amont de L'ATG 467.
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Le tableau 1 montre que l'extrait de cellules transfectées par pSVL hbFGF ATG est capable de stimuler la division cellulaire des cellules endothéliales ABAE. L'ATG à la position 467 n'est donc pas indispensable à la synthèse de hbFGF biologiquement actif.Ce résultat, dans les cellules eucaryotes, corrobore ceux développés dans l'exemple 1, dans lequel il est démontré in vitro l'existence de cotons initiateurs de traduction non usuels en amont de L'ATG 467.
D'autre part, il apparaît que l'activité mise en évidence dans l'extrait de cellules COS transfectées par le plasmide pSVL hbFGF ATG est voisine, voire meilleure, que celle décelée dans l'extrait de cellules COS transfectées par le plasmide pSVL hbFGF
ATG+. Or le premier extrait contient une quantité globale d'hbFGF très inférieure à celle du deuxième extrait (Cf. 3) ci-dessus). Ces résultats montrent une activité mitogène des formes de hbFGF de haut poids moléculaire mises en évidence par les bandes mineures de l'autoradiogramme présenté en 3) ci-dessus.
ATG+. Or le premier extrait contient une quantité globale d'hbFGF très inférieure à celle du deuxième extrait (Cf. 3) ci-dessus). Ces résultats montrent une activité mitogène des formes de hbFGF de haut poids moléculaire mises en évidence par les bandes mineures de l'autoradiogramme présenté en 3) ci-dessus.
5) Capacité des extraits à stimuler la synthèse d'ADN dans les cel
lules BALB/C 3T3.
lules BALB/C 3T3.
Les cellules BABL/C 3T3 ont été cultivées dans des plaques de microtitration de 96 puits dans du milieu DMEM additionné de 10 % de sérum foetal de veau. Après 7 jours de culture, le milieu de culture des cellules BALB/C 3T3 en phase stationnaire a été additionné de thymidine tritiée (H3) (Amershar) et de dunes variables d'extraits de cellules COS préparées en 2).
Après 48 heures d'incubation, les cellules BALB/C 3T3 ont été collectées par action de la trypsine et la quantité de thymidine (H3) incorporée a été mesurée.
Les résultats obtenus sont répertoriés dans la figure 12.
IL apparaît que l'extrait de cellules COS transfectées par le plasmide pSVL hbFGF ATG est capable de stimuler la synthèse d'ADN des cellules EALS/C 3T3, résultat qui corrobore ceux développés en 4) ci-cessus ou il est établi que cet extrait est capable de stimuter la division cellulaire des cellules endothéliales ABAE.
Cette étuve (exemple 3) a été réalisée en maintenant les codons d'initiation non usuels peu efficaces, notamment les CTG 302 et CTG 34, affin e mettre en évidence la réalité biologique de l'initiation de la traduction sur ces codons, déjà démontrée in vitrc oans l'exemple 1. Il est évident pour lthomme du métier que dans un t t supproduction d'une forme lourde du hbFGF le codon d'initiation usuel ATG (plus efficace) sera utilisé dans le gène recombinant, comme cela a été fait pour produire la forme de 209 acides aminés dans Escherichia coli (Cf. exemple 2 ci-dessus).
Claims (15)
1. Gène recombinant comportant une séquence d'ADN codant pour un facteur basque de croissance des fibroblastes, caractérisé en ce que celle-ci code pour une protéine dont la séquence comprend une premier sous-séquence
X AlaAlaGlySer
IleTnrThrLeuProAlaLeuProGluAspGlyGlyserGîyAlaPheproProGîyHis
PheLysAspProLysArgLeuTyrCysLysAsnGîyGlyPhePheLeuArglîeHisPro
AspGlyArgValAspGlyValArgGluLysSerAspProHisIleLysLeuGlnLeuGln
AlaGluGluArgGlyValValSerIleLysGlyValCysAlaAsnArgTyrLeuAlaMet
LysGluAspGlyArgLeuLeuAlaSerLysCysValThrAspGluCysPhePhePheGlu
ArgLeuGluSerAsnAsnTyrAsnThrTyrArgSerArgLysTyrThrSerTrpTyrVal AlaLeuLysArgTnrGlyGlnTyrLysLeuG lySerLysThrGîyproG lyGînLysAla
IleLeuPheLeuProMetSerAlaLysSer dans laqueIe X @eprésente l'un quelconque des vingt acides aminés du code génétique, en amont de cette sous-séquence une deuxième sous-séquence constituée de L'ensemble ou d'une partie tronquée dans sa partie amont et comportant plus de deux acides aminés de la suite
LeuGlyAspArgGlyArgGlyArgAlaLeuProGlyGlyArgLeuGlyGlyArgGlyArg GlyArgAlaPrcGLuArgVaIGIyGlyArgGIyArgGlyArgGIyThrAlaAIaProArg
AlaAlaProAlaAlaArgGlySerArgProGlyProalaGlyThr et en amont de cette deuxième sous-séquence éventuellement une méthionine.
2. Gène selon la revendication 1, caractérisé en ce que X est choisi parmi la méthionine, la valine, la Leucine et l'isoleucine.
3. Géne selon la revendication 2, caractérisé en ce que sa séquence d'ADN code pour une protéine dont la séquence est constituée de la séquence ci-après GlyAspArgGlyArgGiyArgAlaLeuProGlyGlyArgLeuGlyGlyArgGlyArg
GlyrgAlaProGluArgValGlyGIyArgGlyArgGlyArgGlyThrAlaAlaProArg
AlaAlaProAlaAlaArgGlySerArgProGlyProAlaGlyThrMetAlaAlaGlySer
IleThrThrLeuProAlaLeuProGluAspGlyGlySerGlyAlaPheProProGlyHis
PheLysAspProLysArgLeuTyrCysLysAnsGlyGlyPhePheLeuArgIleHisPro
AspGlyArgValAspGlyValArgGluLysSerAspProHisIleLysLeuGlnLeuGln
AlaGluGluArgGlyValValSerIleLysGlyValCysAlaAsnArgTyrLeuAlaMet
LysGluAspGlyArgLeuLeuAlaSerLysCysValThrAspGluCysPhePhePheGlu
ArgLeuGluSerAsnAsnTyrAsnThrTyrArgSerArgLysTyrThrSerTrpTyrVal AlaLeuLysArgThrGlyGlnTyrLysLeuGlyserLysThrGlyProGlyGlnLysAla
IleLeuPheLeuProMetSerAlaLysSer, précédée éventuellement d'une méthionine.
IleLeuPheLeuProMetSErAlaLysSer, précédée éventuellement d'une méthionine.
AlaLeuLysArgThrGlyGlnTyrLysLeuGlySerLysThrGlyProGlyGlnLysAla
ArgLeuG IuSerAsnAsnTyrAsnThrTyrArgserArgLysTyrThrserTrpTyrVal
LysLuAspGlyArgLeuLeuAlaSerLysCysVaLThrAspGluCysPhePhePheGlu
AlaSluGluArgGlyValValSerIleLysGlyValCysAlaAsnArgTyrLeuAlaMet
AspGlyArgValAspGlyValArgGluLysSerAspProHisIleLysLeuGlnLeuGln
PheLysAspProLysArgLeuTyrCysLysAsnGlyGlyPhePheLeuArgIleHisPro
AlaAlaProAlaAlaArgGlySerArgProGlyProAlaGlyThrMetAlaAlaGlySer I leThrTnrLeuProAlaLeuProGîuAspGlyGlyserGlyAlaPheProProGlyHis
GluArgAlaProGluArgValGlyGlyArgGlyArgGlyArgGlyThrAlaAlaProArg
GlyGlyArgGlyAra
4 Gene selon la revendication 2, caractérisé en ce que sa sequen-. d'AD code pour une protéine dont la séquence est const@t@ée de la séquence ci-après :
5. Gêne selon la revendication 2, caractérisé en ce que sa séquence d'AG, comprend une première sous-séquence :
W1W2 W3GCAGCCGGGAGC
ATCACCACGCTGCCCGCCTTGCCCGAGGATGGCGGCAGCGGCGCCTTCCCGCCCGGCCAC
TTCAAGGACCCCAAGCGGCTGTACTGCAAAAACGGGGGCTTCTTCCTGCGCATCCACCCC GACGGCCGAGTTGACGGGGTCCGGGAGAAGAGCGACCCTCACATCAAGCTACAACTTCAA
GCAGAAGAGAGAGGAGTTGTGTCTATCAAAGGAGTGTGTGCTAACCGTTACCTGGCTATG AAGGAAGATGGAAGATTACTGGCTTCTAAATGTGTTACGGATGAGTGTTTCTTTTTTGAA
CGATTGGAATCTAATAACTACAATACTTACCGGTCAAGGAAATACACCAGTTGGTATGTG
GCACTGAAACGAACTGGGCAGTATAAACTTGGATCCAAAACAGGACCTGGGCAGAAAGCT
ATACTTTTTCTTCCAATGTCTGCTAAGAGCTGA dans laquelle W1, W2, W3 représentent un codon susceptible d'être traduit en méthionine, valine, leucine ou isoleucine, en amont de cette sous-séquence une deuxième sous-séquence constituée de l'ensemble ou d'une partie tronquée dans sa partie amont d'un nombre entier de codons et comportant plus de deux codons de la suite : CTGGGGGACCGCGGGCGCGGCCGCGCGCTGCCGGGCGGGAGGCTGGGGGGCCGGGGCCGG
GGCCGTGCCCCGGAGCGGGTCGGAGGCCGGGGCCGGGGCCGGGGGACGGCGGCTCCCCGC
GCGGCTCCAGCGGCTCGGGGATCCCGGCCGGGCCCCGCAGGGACC et en amont de cette deuxième sous-séquence un codon ATG.
6. Gène selon ta revendication 5 caractérisé en ce que la deuxième sous-séquence est l'une des sous-séquences ci-apres GGGGACCGCGGGCGCGGCCGCGCGCTGCCGGGCGGGAGGCTGGGGGGCCGGGGCCGG
GGCCGTGCCCCGGAGCGGGTCGGAGGCCGGGGCCGGGGCCGGGGGACGGCGGCTCCCCGC
GCGGCTCCAGCGGCTCGGGGATCCCGGCCGGGCCCCGCAGGGACC et GGGGGCCGGGGCCGG
GGCCGTGCCCCGGAGCGGGTCGGAGGCCGGGGCCGGGGCCGGGGGACGGCGGCTCCCCGC
GCGGCTCCAGCGGCTCGGGGATCCCGGCCGGGCCCCGCAGGGACC
7.Gène selon la revendication 3,-caractérisé en ce que sa séquence d'ADN est la suivante ATGGGTGACCGTGGTCGTGGTCGCGCGCTGCCGGGCGGGAGGCTGGGGGGCCGGGGCCGG
GGCCGTGCCCCGGAGCGGGTCGGAGGCCGGGGCCGGGGCCGGGGGACGGCGGCTCCCCGC
GCGGCTCCAGCGGCTCGGGGATCCCGGCCGGGCCCCGCAGGGACCATGGCAGCCGGGAGC
ATCACCACCcTGCCCGCCTTGCCCGAGGATGGCGGCAGCGGCGCCTTCCCGCCCGGCCAC TTCAAGGACCCCAAGCGGCTGTACTGCAAAAACGGGGGCTTCTTCCTGCGCATCCACCCC
GACGGCCGAGTTGACGGGGTCCGGGAGAAGAGCGACCCTCACATCAAGCTACAACTTCAA
GCAGAAGAGAGAGGAGTTGTGTCTATCAAAGGAGTGTGTGCTAACCGTTACCTGGCTATG
AAGGAAGATGGAAGATTACTGGCTTCTAAATGTGTTACGGATGAGTGTTTCTTTTTTGAA
CGATTGGAATCTAATAACTACAATACTTACCGGTCAAGGAAATACACCAGTTGGTATGTG
GCACTGAAACGAACTGGGCAGTATAAACTTGGATC CAAAACAGGACCTGGGCAGAAAGCT
ATACTTTTTCTTCCAATGTCTGCTAAGAGCTGA
8.Vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il porte, avec les moyens necessaires à son expression, une séquence selon l'une ces revendications 1 à 7.
9. CeLuLes eucaryotes, caractérisées en ce qu elles sont trans@ectées par un vecteur d'expression selon la revendication 8.
10. Microorganismes procaryotes, caractérisés en ce qu'ils contiennent un vecteur d'expression selon la revendication 8.
11. Micrcorganismes procaryotes selon la revendication 10, caract6risés en ce qu'ils appartiennent à l'espèce Escherichia coli.
12. Facteur basique de croissance des fibroblastes, caractérise en ce que sa séquence comprend une première sous-séquence
X AlaAlaGlySer ILeThrThrLeuproAlaLeuProGluAspGlyGlyserGlyAlaPheProProGlyHis
PheLysAspProLysArgLeutyrCysLysAsnGlyGlyPhePheleuArgIleHisPro
AspGlyArgValAspGlyValArgGluLysSerAspProHisIleLysLeuGlnLeuGln
AlaGluGluArgGlyValValSerIleLysGlyValCysAlaAsnArgTyrLeuAlaMet
LysGluAspGlyArgLeuLeuAlaSerLysCysValThrAspGluCysPhePhePheGlu
ArgLeuGluSerAsnAsnTyrAsnThrTyrArgSerArgLysTyrThrSerTrpTyrVal
AlaLeuLysArgThrGlyGlnTyrLysLeuGlySerLysThrGlyProGlyGlnLysAla
IleLeuPheLeuProMetSerAlaLysSer dans Laquelle X représente l'un quelconque des vingt acides aminés du code génétique, en amont de cette sous-séquence une seconde sous-séquence constituée de l'ensemple ou d'une partie tronquée dans sa partie amont et comportant plus de deux acides aminés de la suite
LeuGlyAspArgGlyArgGlyArgAlaLeuProGlyGlyArgLeuGlyGlyArgGlyArg GlyArgAlaProGIuArgValGIyG lyArgG IyArgGlyArgGlyThrAlaAlaProArg
AlaAlaProAlaAlaArgGlySerArgProGlyProAlaGlyThr et en amont de cette sous-séquence éventuellement une méthionine.
13. Facteur selon la revendication 12, caractérisé en ce que sa séquence est constituée de la séquence suivante GîyAspArgGlyArgGlyArgAlaLeuProGîyGlyArgLeuGlyGlyArgGlyArg
GlyArgAlaProGluArgValGlyGlyArgGlyArgGlyArgGlyThrAlaAlaProArg ALaAIaProALaA laArgG IyserArgProG lyProAlaGlyThretAlaAlaGlySer
IleThrThrLeuProAlaLeuProGluAspGlyGlySerGlyAlaPheProProGlyHis
PheLysAspProLysArgLeuTyrCysLysAsnGlyGlyPhePheLeuArgIleHisPro AspGlyArgValAsoGlyValArgGluLysserAspProHisîleLysLeuGlnLeuGln
AlaGluGluArgGlyValValSerIleLysGlyValCysAlaAsnArgTyrLeuAlaMet
LysGluAspGlyAroLeuLeuAlaserLysCysValThrAspGluCysPhePhePheGlu
ArgLeuG IuSerAsnAsnTyrAsnThrTyrArgSe rArgLysTyrThrSerTrpTyrVal
AlaLeuLysArgThrGlyGlnTyrLysLeuGlySerLysThrGlyProGlyGlnLysAla
IleLeuPheLeuProMetSerAlaLysSer, précédée éventuellenent d'une méthionine.
14. Facteur selon la revendication 12, caractérisé en ce que sa séquence est constituée de la séquence suivante :
GlyGlyArgGlyArg
GlyArgAlaProGluArgValGlyGlyArgGlyArgGlyArgGlyThrAlaAl-aProArg
AlaAlaProAlaAlaArgGlySerArgProGlyProAlalyThrMetAlaAlaGlySer
IleThrThrLewproAlaLeuProGluAspGlyGlySerGlyAlaPheProProGlyHis
PheLysApproLysArgLeuTyrCyslysAsnGlyGlyPhePheLeuArgi leHisPro
AspGlyArgvalAspGlyValArgGluLysSerAspProHisîleLysLeuGînLeuGln
AlaGluGluArgGlyValValSerIleLysGlyValCysAlaAsnArgTyrLeuAlaMet
LysGluAspGLyArgLeuLeuAlaSerLysCysValThrAspGluCysPhePhepheGlu
ArgLeuGluSerAsnAsnTyrAsnThrTyrArgSerArgLysTyrThrSerTrpTyrVal
AlaLeuLysArgThrGlyGlnTyrLysLeuGlySerLysThrGlyProGlyGlnLysAla IleLeuPheLeuPrcRetSerAlaLysSer précédée éventuellement d'une méthionine.
15. Médicament, caractérise en ce s'il contient un facteur basique de croissance selon l'une des revendications 12 à 14.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| FR8900973A FR2642086B1 (fr) | 1989-01-26 | 1989-01-26 | Gene recombinant codant pour un facteur basique de croissance des fibroblastes et ledit facteur |
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|---|---|
| FR2642086A1 true FR2642086A1 (fr) | 1990-07-27 |
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| FR2642086B1 (fr) | 1992-09-04 |
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