JPH0775581A

JPH0775581A - バチルス・ズブチリスの発現及び分泌組換えベクター

Info

Publication number: JPH0775581A
Application number: JP6066642A
Authority: JP
Inventors: Guido Grandi; グィード・グランディ; Ferra Francesca De; フランチェスカ・デフェーラ; Claudio Tosi; クラウディオ・トージ; Ornella Tortora; オルネーラ・トルトーラ; Anna Cuzzoni; アンナ・クッゾーニ
Original assignee: Eniricerche SpA
Current assignee: Eni Tecnologie SpA
Priority date: 1993-03-10
Filing date: 1994-03-10
Publication date: 1995-03-20
Also published as: ATE196317T1; IT1270866B; EP0614982A1; EP0614982B1; GR3034704T3; US20020016446A1; ITMI930456A0; DE69425843D1; DK0614982T3; PT614982E; DE69425843T2; US5674712A; ES2149837T3; ITMI930456A1

Abstract

(57)【要約】【目的】バチルス・ズブチリスにおいて単一分子形抗
体を細胞外生産する手段を提供する。【構成】中性プロテアーゼの遺伝子のプロモーター、
新しい分泌配列（Ｉ）及び所望の抗体scFvをコードする
DNA配列を包含してなる組換えを使用する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、バチルス・ズブチリス（Bacill
us subtilis）から単一分子形抗体（scFv）を細胞外生
産する方法に係る。

【０００２】さらに詳述すれば、本発明は、中性プロテ
アーゼの遺伝子のプロモーター、新規な分泌配列及び所
望の抗体scFvをコードするDNA配列を包含してなる組換
えベクター、この組換えベクターによって形質転換した
Ｂ．ズブチリスの菌株及びＢ．ズブチリスの菌株の培養
によってscFv抗体を細胞外生産する方法に係る。

【０００３】細菌内での発現によって抗体フラグメント
（ミニ抗体）を得る可能性が新たに開発され、注目を集
めている。

【０００４】実際のところ、サイズが減少することによ
って診断及び治療での使用に関して薬物動力学的特性の
改善が可能になる。さらに、微生物におけるミニ抗体の
生産は、生産の再現性が高く、発癌ウイルス性DNAから
汚染物が完全に存在しないことが保証されるため、哺乳
動物細胞内でのモノクロナール抗体（mAbs）の生産より
も経済的により好適である。

【０００５】抗体は２つの長鎖（Ｈ）及び２つの短鎖
（Ｋ又はλ）から形成された四量体性タンパク質であ
る。Ｈ鎖中には、可変領域（VH）及び３つの定常領域が
観察され、一方、短鎖中には、可変領域（VK）に加えて
ただ１つの定常領域が存在する。各鎖のアミノ末端にあ
る可変部は、定常部が免疫系の他の成分と相互作用する
（エフェクター作用）のに対して、抗原への結合に関与
する。抗原への結合に関与する領域及びエフェクター作
用を有する領域は、その官能性を変化することなく、酵
素的消化によって分離される。事実、IgGの酵素的消化
によって単離された抗体のFv部（すなわちVH＋VK）は、
抗原に結合する能力を完全に保持することが知られてい
る。

【０００６】抗体の前記部分（完全な結合部位を形成す
る）の使用は、２つの鎖（共有結合されない）が分離す
る傾向にあるとのFvに関するいくつかの安定性の問題を
呈する。

【０００７】最近では、２つの鎖の分離に関する欠点を
低減するようにいくつかの方法が提案されている。

【０００８】中でも、BirdらによりScience，242，423
〜426（1988）に開示された方法（好適なペプチド（リ
ンカー）によって２つの鎖の可変領域を結合させること
により形成された分子を、Ｅ．コリにおいて発現させる
ことでなる）が興味深い。これによれば、リンカーによ
ってVK領域のカルボキシル末端をVHのアミノ末端に結合
して（又はその逆）、２つの領域VH及びVKを１つの単一
分子（scFv）に合成する。

【０００９】しかしながら、この方法を使用する場合、
Birdらは細胞内において非官能性の不溶性凝集物形のsc
Fvの発現を達成している。これらの分子の機能は、有効
ではある（Birdらは復元収率５〜30％を報告している）
が、複雑な方法（抗体が可溶性及び機能性形で生産され
る系と比較する場合には有利ではない）によってのみ回
収される。

【００１０】公知技術には、Ｅ．コリの周辺質で機能性
scFvを分泌させる系（その系の環境から抗体分子を回収
し、つづいて細菌を制御して溶菌処理する）が開示され
ている。

【００１１】現在の注目は、組換え分子の合成及びＢ．
ズブチリスにおける分泌用の系の開発にある。

【００１２】事実、Ｂ．ズブチリスは生物工学的見地か
ら興味深い微生物である。すなわち、該細菌は完全に非
病原性であり、培地内に遺伝子発現生成物を分泌する能
力を有し、大規模での培養が容易である。

【００１３】この微生物の使用に関する部分的な制限
は、scFv抗体の効果的な細胞外での生産を可能にするベ
クターが欠けていることである。Birdらは、タンパク分
解酵素をコードする遺伝子から単離したプロモーター領
域及び分泌配列を包含してなるＢ．ズブチリスにおける
発現及び分泌系を使用してscFv １mg／リットルを得ている
（米国特許第4,946,778号）。

【００１４】最近、Ｂ．ズブチリスにおけるscFvの分泌
を改善する新しい系が提案されている（WuらBiotechnol
ogy，11，71〜76（1993)）。しかしながら、得られた値
（５mg／リットル）は工業的利用にはなお十分ではない。

【００１５】中性プロテアーゼをコードするプロモータ
ー及び新たな分泌ペプチドをコードするDNA配列を包含
してなる特別な組換えベクターを採用することによって
上述の技術の不都合が解消されることが新たに見出され
た。

【００１６】詳述すれば、前記組換えベクターは、Ｂ．
ズブチリスにおいて完全に可溶形のscFv抗体を発現さ
せ、高収率で分泌させることを可能にする。

【００１７】本発明の目的は、中性プロテアーゼをコー
ドする遺伝子のプロモーター、新しい分泌配列及び単一
分子形抗体をコードするDNA配列を包含してなるＢ．ズ
ブチリスにおける単一分子形抗体の発現及び分泌用組換
えベクターにある。

【００１８】本発明の他の目的は、前記組換えベクター
によって形質転換したＢ．ズブチリスの菌株にある。

【００１９】本発明のさらに他の目的は、前記組換えベ
クターによって形質転換したＢ．ズブチリスの菌株を培
養し、培養環境から単一分子形抗体を回収することから
なる前記抗体の細胞外生産法にある。

【００２０】さらに、本発明の目的は診断及び治療にお
ける該抗体の使用にある。

【００２１】本発明のさらに他の目的は、新しい分泌ペ
プチドシグナルをコードするDNA配列にある。

【００２２】本発明の他の目的は、ヒト繊毛性ゴナドト
ロピンのサブユニットαに対して特異的な抗体scFv5E8
にある。

【００２３】本発明の他の目的は以下の記載及び実施例
から明らかになるであろう。

【００２４】詳述すれば、本発明の組換えベクターは、
１）Ｂ．ズブチリス BGSC 1A341の中性プロテアーゼを
コードする遺伝子のプロモーター；２）分泌配列（Ｉ） 5'ATG AGA AGC AAA AAA ACG CGT ATC AGC TTG TTG TTT GCG TTA ACG TTA ATC TTT ACG ATG GCA TTC AGC GGC CGC TCT GCC ATG GCC 3' 及び３）配列 VH／VK−L−VK／VH−(TAG)_n （ここで、VH及びVKは所望の抗体の長鎖及び短鎖の可変
領域であり；Ｌ（リンカー）は２つの可変領域間のペプ
チドリンカー Val−Ser−Ser−(Gly₄−Ser)₃ であり；TAGは同じペプチドに対して作られたポリクロ
ナール抗体によって認識されるペプチドであり；及びｎ
は０又は１である）を有する単一分子形抗体をコードす
るDNA配列を包含してなる。

【００２５】分泌配列（Ｉ)(又はリーダー配列（LS)）
は、以下のアミノ酸配列を有する新しい分泌ペプチドを
コードする。 Met Arg Ser Lys Lys Thr Arg Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Gly Arg Ser Ala Met Ala

【００２６】本発明の組換えベクターは、ａ）前記分泌
配列（Ｉ）、ペプチドリンカーをコードする配列及び可
及的にペプチドTAGを包含するオリゴヌクレオチド（こ
こで、該ヌクレオチドは、分泌配列（Ｉ）の下流かつペ
プチドリンカーの上流への抗体の長鎖又は短鎖の可変領
域をコードする配列の挿入及びペプチドリンカーの下流
かつペプチドTAGの上流への抗体の短鎖又は長鎖の可変
領域をコードする配列の挿入を可能にする特殊な制限部
位を含有する）を合成し；ｂ）Ｂ．ズブチリスBGSC 1A3
41の中性プロテアーゼの遺伝子のプロモーターを包含す
るプラスミドベクター内で前記オリゴヌクレオチドをク
ローニングし；ｃ）このオリゴヌクレオチドの制限部位
において所望の抗体の長鎖及び短鎖の可変領域をコード
するDNA配列をクローニングし；及び最後にｄ）組換え
ベクターを単離することによって得られる。

【００２７】本発明の１具体例によれば、前記工程ａ）
のオリゴヌクレオチドは配列（Ｌ１）を有する。 EcoRI 5'GAA TTC TTA TGA GAA GCA AAA AAA CGC GTA 30 TCA GCT TGT TGT TTG CGT TAA CGT TAA TCT TTA 63 CGA TGG CAT TCA GCG GCC GCT CTG CCA TGG CCG 96 PstI BstEII CAC AGG TCC AAC TGC AGC CTA TGG TCA CCG TCT 129 CCT CAG GTG GCG GTG GCT CTG GCG GTG GTG GGT 162 KpnI CGG GTG GCG GCG GAT CTG ACA TTC AAG GTA CCC 195 BglII CCT GAG ATC TCA TGG AAG AAC TTA TGA TCG AGG 228 SalI HindIII GTA GGT AAG TCG ACA AGC TT 3' 248 Stop この配列において、分泌配列（Ｉ）の下流直後に、それ
ぞれ長鎖（VH）及び短鎖（VK）の可変領域をコードする
DNA配列を同じ解読順序でクローニングできるように位
置する４つの制限部位（PstI、BstEII、KpnI及びBglI
I）がある。BstEII部位（VHのＣ末端領域）とKpnI部位
（VKのＮ末端領域）との間の配列は、配列 Val−Ser−Ser−(Gly₄−Ser)₃ を有する２つの領域間のペプチドリンカーをコードす
る。さらに、BalII部位に続く配列は、タンパク質の発
現をモニターする（ウエスタンブロット法を使用する）
ため及び精製のための抗ペプチド抗体による認識の特異
的なターゲットとして有用な配列 Met−Glu−Glu−Leu−Met−Ile−Glu−Gly−Arg を有するノナペプチドをコードする。この配列につづい
て、翻訳のストップコドン及び制限部位SalI及びHindII
Iが存在する。

【００２８】好適な具体例では、工程ｂ）のプラスミド
ベクターは、Ｂ．ズブチリスにおける複製の開始点、ク
ロラムフェニコール耐性をコードするCAT遺伝子、Ｂ．
ズブチリスの菌株BGCS 1A341の中性プロテアーゼのプロ
モーター、プロモーター及びリボゾーム認識部位（RB
S）の下流直後に位置するEcoRI制限部位及びEcoRI部位
から上流のHindIII部位を包含するpSM308 ATCC 68047で
ある。

【００２９】オリゴヌクレオチドのクローニングは、常
法に従って、好適な制限酵素によって予め消化したプラ
スミドベクターを使用して行われる。つづいて、形質転
換及び分泌の技術によって得られた陽性のクローンか
ら、組換えベクターの構築に使用されるクローニングプ
ラスミドを単離する。

【００３０】好適な条件下で操作することによって、Ｌ
１がプロモーターnprから下流に正確に挿入された約４k
bのプラスミド（pSMAと表示する）が得られる。

【００３１】オリゴヌクレオチドＬ１の制限部位におけ
る抗体の長鎖及び短鎖の可変領域をコードする配列の導
入により組換えベクターを構築する。この組換えベクタ
ーは、本発明に従って、単一プロモーターを使用して、
以下の配列を有する完全に可溶性の前駆体の細胞内での
同時発現を可能にする。 LS−VH−L−VK−TAG （ここで、LSは新しい分泌ペプチドシグナルをコードす
るDNA配列（Ｉ）であり；VHは長鎖の可変領域であり；V
Kは短鎖の可変領域であり；Ｌはリンケージペプチド Val−Ser−Ser−(Gly₄−Ser)₃ であり；TGAはノナペプチド Met−Glu−Glu−Leu−Met−Ile−Glu−Gly−Arg である。）ついで、前記前駆体は膜レベルで正確にプロ
セッシングされ、抗体 VH−L−VK−TAG が培地中に高収率で分泌される。

【００３２】可変領域VH及びVKをコードする配列は、所
望の抗原に対して特異的なモノクロナール抗体の中から
選ばれる。

【００３３】各種の例によって、ヒト繊毛性ゴナドトロ
ピンのサブユニットαに特異的なモノクロナール抗体5E
8の長鎖及び短鎖の可変領域用のコード配列（遺伝子）
をクローニングする（A．Albertiniら、Human Tumor Ma
rkers，Walter de Gruyter＆ Co．発行，387〜401、198
7）。

【００３４】モノクロナール抗体5E8を生成するハブリ
ドーマ培養物からすべてのmRNAを抽出し、所望の抗体の
短鎖の可変領域（VK5E8）及び長鎖の可変領域（VH5E8）
をコードするDNAを増幅させる。プライマーとして２対
のオリゴヌクレオチド（それぞれ前記領域をコードする
遺伝子の５’及び３’末端でハイブリダイズする）を使
用する常法に従って操作を行う。

【００３５】増幅技術によって、５’末端においてPstI
部位によって及び３’末端においてBstEII部位によって
限定された遺伝子VH5E8及び５’末端においてKpnI部位
によって及び３’末端においてBglII部位によって限定
された遺伝子VK5E8を包含してなるDNAフラグメントが得
られる。

【００３６】制限酵素のペアーPstI及びBstEII、KpnI及
びBglIIで消化したDNAフラグメントをベクターpSMA内で
クローン化し、組換えベクターpsM507を得る。

【００３７】本発明によれば、npr／(LSI）とは異なる
プロモーター／分泌配列の組合せによって特徴づけられ
る組換えベクターが構築される。

【００３８】この目的のため、構成プロモーター（P
c）、Ｂ．ズブチリスにおける複製開始点、クロラムフ
ェニコール耐性をコードする遺伝子及びＢ．ズブチリス
用のリボゾーム（RBS）付着配列の下流直後に位置するE
coRI制限部位及びEcoRI部位の下流に位置するHindIII部
位を包含してなるプラスミドpSM268を使用する。該プラ
スミドは、pSM ATCC 67320から、領域AvaII−XbaI
（Ｅ．コリにおける複製開始点及び配列Km^rを包含す
る）の欠点及びつづくT₄DNAリガーゼによる環化によっ
て得られる。

【００３９】ついで、エルビニア・カロトボラ（Erwini
a carotovora）の遺伝子のリーダーペプチドをコードす
る22個のトリプレットの配列（Lei，S．P．ら、J．Bact
eriol.，169，4379（1987)）を包含し、下記の配列を有
するオリゴヌクレオチド（Ｌ２）を合成する。 EcoRI 5' GAA TTC ATA TGA AAT ACC TAT TGC CTA CGG 30 CCG CCG CTG GAT TGT TAT TAC TCG CTG CCC AAC 63 PstI CAG CCA TGG CCG CAC AGG TCC AAC TGC AGC CTA 96 BstEII TGG TCA CCG TCT CCT CAG GTG GCG GTG GCT CTG 129 GCG GTG GTG GGT CGG GTG GCG GCG GAT CTG ACA 162 KpnI BglII TTC AAG GTA CCC CCT GAG ATC TCA TGG AAG AAC 195 SalI HindIII TTA TGA TCG AGG GTA GGT AAG TCG ACA AGC TT 3' 227 Stop

【００４０】最後に、下記のクローニングプラスミドの
構築を行った。 −nprプロモーター及びオリゴヌクレオチドＬ２（pelB
の分泌配列シグナル）を包含するpSMB −構成プロモーターPc及びオリゴヌクレオチドＬ１（分
泌配列シグナル（Ｉ)）を包含するpSMC −構成プロモーターPc及びオリゴヌクレオチドＬ２（pe
lBの分泌配列シグナル）を包含するpSMD

【００４１】遺伝子VH5EB及び遺伝子VK5EBを包含するDN
Aフラグメントの前記プラスミドにおけるクローニング
を行って、組換えベクターpSM438（npr／pelB）、pSM44
3（Pc／配列（Ｉ)）及びpSM442（Pc／pelB）を単離す
る。

【００４２】つづいて、好適な培地において前記ベクタ
ーで形質転換したＢ．ズブチリスの細胞を培養した。該
培地の細胞内及び細胞外タンパク質の分析から下記の点
が示された。 −プラスミドpSM507は上清中に可溶性抗体を少なくとも
30mg／リットルで蓄積する。 −プラスミドpSM442は高レベルの抗体の発現（総タンパ
ク質の10％）を達成する（ほとんど細胞内及び不溶形を
含まない）。 −プラスミドpSM438はプラスミドpSM507よりも３倍少な
い量のscFvを分泌し、不溶形の前駆体を蓄積する。 −プラスミドpSM443は前駆体を蓄積しないが、プラスミ
ドpSM507で見られるよりも分泌レベルは低い。

【００４３】これらの結果は、中性プロテアーゼの遺伝
子のプロモーター／分泌配列シグナル（Ｉ）の組合せは
抗体の最適な発現及び分泌には基本であることを示し
た。従って、本発明による組換えベクターは、該ベクタ
ーによって形質転換したＢ．ズブチリスの菌株を使用す
る発酵法による抗体scFvの細胞外生産に有効である。

【００４４】代表的には、操作は、本発明の組換えベク
ターによって形質転換したＢ．ズブチリスの菌株を、炭
素源、窒素源及び微少元素を含有する培地で培養し、つ
いでその中に分泌された抗体scFvを単離することによっ
て行われる。得られた抗体を、この分野で通常使用され
ている技術の１つを使用して精製する。

【００４５】Ｂ．ズブチリスの細胞（pSM507）の培地か
ら得られた未精製細胞抽出物について行った結合及び親
和テストは、元のモノクロナール抗体に匹敵するscFv5E
8の結合部位における相互反応特性が維持されることを
示す。

【００４６】従って、単一分子形抗体（本発明の他の目
的である）は、分泌性腫瘍及び一般に栄養膜性の腫瘍の
決定のための診断に使用される。

【００４７】プラスミドpSM507については、Ｂ．ズブチ
リスSMS300（pSM507）としてアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションに寄託されている（ATCC 6917
3）。

【００４８】以下の実施例は本発明を説明するためのも
のであるが、これに限定されない。

【００４９】

【実施例１】クローニングベクターpSMAの構築プラスミドpSM308 ATCC 68047（10μｇ）を酵素EcoRI及
びHindIII（Boehringer）によって37℃で１時間消化し
た。反応を直ちにEDTA 20ml（最終濃度）でブロックし
た。

【００５０】消化混合物の一定量と、オリゴヌクレオチ
ドＬ１（自動合成装置System plus（Beckman）によって
合成）とを、T₄DNAリガーゼ２Ｕを含有するリガーゼ混
合物（１mM ATP、20mM Tris−HCl pH7.6、10mM MgCl₂及
び10mM DTT）中でリガーゼ処理した。反応を14℃で１夜
続けた。最後にリガーゼ混合物を使用して、Contente及
びDubnauによって開示された方法（Mol．Gen．Genet.，
167，251〜258，1979）に従ってコンピネントとした
Ｂ．ズブチリスSMS330（rec⁺、npr^-、apr^-）の菌株を形
質転換させた。

【００５１】クロラムフェニコール（Cm）５μ／mlを含
有するTBAB（DIFCO）のプレート上で組換えクローンを
選別した。陽性のクローン（Cm^R）からプラスミドベク
ターpSMAを単離した。

【００５２】

【実施例２】クローニングベクターpSMB、pSMC及びpSMDの構築プラスミドpSM308 ATCC 68047及びpSM268（10μｇ）を
制限酵素EcoRI及びHindIIIによって消化し、別々にオリ
ゴヌクレオチドＬ１又はオリゴヌクレオチドＬ２とリガ
ーゼ処理した。ついで、リガーゼ混合物を使用して好適
なＢ．ズブチリスSMS330の細胞を形質転換させた。最後
に、Cmを含有する培地上で選別した陽性のクローンから
下記のクローニングベクターを単離した。 −プロモーターnpr及びオリゴヌクレオチドＬ２（pelB
の分泌配列シグナル）を含有するpSMB −構成プロモーターPc及びオリゴヌクレオチドＬ１（分
泌配列シグナル（Ｉ)）を含有するpSMC −構成プロモーターPc及びオリゴヌクレオチドＬ２（pe
lBの分泌配列シグナル）を含有するpSMD

【００５３】

【実施例３】ヒトゴナドトロピンのサブユニットαに対して特異的な
MAb5E8の長鎖及び短鎖の可変領域のクローニングクローニングのため下記のプライマーを使用した。１）配列を有するVH₁FOR（長鎖の可変領域をコードする配列のヘ
リックスの３’末端へのアニーリングに使用）２）配列を有するVK₁FOR（短鎖の可変領域をコードする配列のヘ
リックスの３’末端へのアニーリングに使用）３）配列を有するVH₁BACK（長鎖の可変領域をコードする配列の
反時計回りのヘリックスの３’末端へのアニーリングに
使用）４）配列を有するVKBACK（短鎖の可変領域をコードする配列の反
時計回りのヘリックスの３’末端へのアニーリングに使
用）Ａ）cDNAの調製ヒトゴナドトロピンのサブユニットαに対して特異的な
モノクロナール抗体5E8を生産するハイブリドーマを、
ウシ胎仔血清10％、Ｌ−グルタミン200mM、ペニシリン
及びストレプトマイシンを追加した培地RPMI 1640で培
養し、細胞約４×10⁷個を使用してすべてのRNAを単離し
た。残部から、グアニジン−イソチオシアネートを使用
する抽出技術（Stratageneによって供給されたRNA抽出
キット）及び続くオリゴdTセルロース（Boehringer）で
の親和クロマトグラフィーによってmRNAポリＡ＋を分離
した。

【００５４】長鎖の可変領域をコードする配列をクロー
ニングするために、mRNA ５μｇ、プライマー VH₁FOR 2
0pモル、各dATP、dTTP、dCTP及びdGTP 250μＭ、ジチオト
レイトール（DTT）10mM、Tris−HCl 100mM、MgCl₂ 10mM
及びKCl 140mMを含有する反応溶液（pH8.3）を調製し
た。

【００５５】反応溶液を65℃に10分間加熱し、ついで室
温に冷却して、mRNAの可変領域をコードする配列の３’
末端へプライマーをアニーリングさせた。

【００５６】反応溶液にマウスモロニーウイルス逆トラ
ンスクリプターゼ２μｌ（21Ｕ／μｌ、Boehringer）を
添加した後、得られた溶液を42℃に１時間維持してcDNA
の合成を行った。

【００５７】プライマーとしてVK₁FORを使用して短鎖の
可変領域をコードする配列をクローン化するために同じ
手法を使用した。Ｂ）可変領域をコードするDNAの増幅長鎖可変領域をコードする配列の増幅のため、Ａ）で得
られた混合物10μｌを、各プライマー（１及び３）50pモ
ル、各dATP、dTTP、dCTP及びdGTP 250μＭ、Tris−HCl 6
7mM、MgCl₂ 10mM、硫酸アンモニウム 17mM、ゼラチン 2
00μｇ／ml及びTaqポリメラーゼ（Boehringer）４Ｕに
添加し、水で全量100μｌとした。反応溶液を粘稠なパ
ラフィン（液状）の層で被覆し、初めに45℃でアニーリ
ングしながら３増幅サイクル、ついで30サイクル（各サ
イクルは、95℃における核酸の変性１分、50℃における
プライマーのアニーリング１分、及び72℃における伸長
２分でなる）を行った。

【００５８】増幅後、反応溶液をフェノール−クロロホ
ルムで２回抽出した。ついで、ds cDNAをエタノールで
沈殿させ、遠心分離によって分離した後、水100μｌで
抽出し、４℃で保存した。

【００５９】プライマーVK₁FOR及びVK₁BACKを使用して
短鎖可変領域をコードする配列を増幅するため同じ手法
を使用した。

【００６０】前記可変領域をコードするcDNAをSanger法
（Sequenase キット version 2.0 USB）によって配列決
定し、ヌクレオチド及びアミノ酸配列を図１及び図２に
報告する。

【００６１】

【実施例４】組換えベクターの構築増幅工程からのDNA（10μｌ）を制限酵素ペアーPstI及
びBstEII，及びKpnI及びBalIIで消化し、つづいて消化
生成物を電気泳動によってポリアクリルアミドゲル（８
％）上で分別した。ついで、それぞれ５’末端において
PstI部位によって及び３’末端においてBstEIIによって
限定された遺伝子VH5E8を含有する約309bpのDNAフラグ
メント、及び５’末端においてKpnI部位によって及び
３’末端においてBalII部位によって限定された遺伝子V
K5E8を含有する塩基312個のDNAフラグメントを含有する
２つのバンドを溶出した。DNAフラグメントをゲルから
溶出し、実施例１及び２において得られたベクターpSMA
〜pSMDのPstI及びBstEII、及びKpnI及びBglII部位でク
ローン化した。

【００６２】陽性のクローンの形質転換及び分別によっ
て、表１に示す特性を有する組換えプラスミド（すなわ
ちpSM507、pSM438、pSM443及びpSM442）を単離した。

【００６３】

【実施例５】Ｂ．ズブチリスにおけるscFvの発現及び分泌Ｂ．ズブチリスSMS300の細胞を下記の如くしてコンピテ
ントとした。すなわち、VY培地（ウシ浸出ブロス 25ｇ
／リットル、酵母エキス５ｇ／リットル）での１夜培養物を最小
培地で希釈し（１：10）、MgSO₄ ５mM、0.5％グルコー
ス、0.02％カザミノ酸（casamino acid）及び必須アミ
ノ酸（MMG１）50μｇ／mlを添加し、37℃で4.5時間培養
し、ついで最小培地でさらに希釈し（１：５）、MgSO₄
５mM、0.5％グルコース、必須アミノ酸５μ／ml及びカ
ザミノ酸（MMG２）0.01％を添加した。

【００６４】この希釈物の一定量（１ml）を各組換えベ
クター１μｇで形質転換させ、激しく撹拌しながら37℃
で90分間インキュベートした。

【００６５】クロラムフェニコールを含有するVY培地上
で形質転換体を分別した後、単個コロニーを、クロラム
フェニコール５μ／mlを含むVY（DIFCO）10mlを収容す
るフラスコ（100ml）に接種し、37℃で１夜生育させ
た。

【００６６】ついで、各培養物６mlを15000rpm、４℃で
２分間遠心分離して、培養物から細胞のペレットを分離
し、細胞外タンパク質を単離した。実際のところ、培養
物40μｌを次の組成（125mM Tris−HCl pH6.8、３％ナ
トリウムドデシルスルフェート（SDS）、20％グリセリ
ン、３％β−メルカプトエタノール及び0.025％ブロモ
フェノールブルー）の負荷（loading）緩衝剤10μｌに
添加し、ついで加熱によって変性し、ポリアクリルアミ
ドゲル−SDSに15％で負荷した。

【００６７】並行してTE pH8.00中にショ糖25％を含有
する50mM緩衝剤460μｌ中に細胞のペレットを懸濁化さ
せた後、細胞内タンパク質を抽出した。混合物を40mg／
mlリゾチーム溶液12μｌ及びEDTA0.5M pH8 96μｌの存
在下において初めに37℃で30分間、ついで４℃で10分間
インキュベートした。１％Triton（商標名）500μｌ、T
ris−HCl pH6.8 50mM及びEDTA 63mMを添加した後、氷中
で２分間音波処理することによって溶菌を行った。

【００６８】４℃、6500rpmで10分間遠心分離してペレ
ット（不溶フラクション）から上清（可溶性フラクショ
ン）を分離した。２つのタンパク質フラクションを負荷
緩衝剤によって容量1.2mlとし、５分間沸騰させて変性
及び還元させたタンパク質を得た。つづいて、各タンパ
ク質フラクション10μｌを変性及び還元条件下、ポリア
クリルアミドゲル（15％）上で分析した。

【００６９】40mAで約３時間電気泳動させた後、クマシ
ーブルーでの染色によって２つのゲル上のタンパク質バ
ンドが観察され、並行してニトロセルロースフィルター
上に移し（Schleicher及びSchull 0.45μｍ）、ペルオ
キシダーゼに接合させた抗TAG抗体及びヒツジ抗ウサギI
gG抗体を生産するウサギ血清で処理した。クマシーブル
ーによって染色した後、以下の結果を得た。

【００７０】

【表１】Ｂ．ズブチリス内でのscFv5E8の生産プラスミドリーダープロモーター総収量可溶性分泌 pSM507 LS (I) npr 30 mg／l 100％ pSM438 pelB npr 39 mg／l 25％ pSM443 LS (I) Pc 10 mg／l 100％ pSM442 pelB Pc 200mg／l ０

【００７１】

【実施例６】抗体の特性決定溶離液としてPBS（注入容量２ml）を使用するカラムTSK
125＋TSK250上でのゲル濾過によってＢ．ズブチリスSMS
300（pSM507）の培地から抗体scFv5E8を単離した。フラ
クションを2.0ml／フラクションで２分間毎に集め、各
フラクションをBIAcore（商標名）上に注入し、センサ
ーに固定した抗原α hCGとの免疫活性を確認した。

【００７２】結果を次表に報告する。

【００７３】

【表２】表中、Kass及びKdissは運動力学的結合定数及び解離定
数であり；KDは平衡時の解離定数であり；KAは親和定数
である。

【００７４】結果は、scFv5E8に関する結合定数がMAb5E
8のものと同様であり、一方、Kdissが元のモノクロナー
ル抗体のものよりも約300倍大きいことを示す。これら
の値はBorrebaeckらによって得られたもの（Biotech，1
0，697〜698，1992)(モノクロナール抗体及びタンパク
分解によって調製されたそのモノ官能性誘導体（Fab）
を比較する）に匹敵するものであり、元のモノクロナー
ル抗体と比較して、Ｂ．ズブチリス内で生産されたscFv
の結合レベルでの相互作用を維持することを示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトゴナドトロピンのサブユニットαに対して
特異的なモノクロナール抗体5E8の長鎖（VH）の可変領
域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。

【図２】ヒトゴナドトロピンのサブユニットαに対して
特異的なモノクロナール抗体5E8の短鎖（VK）の可変領
域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。

【図３】組換えベクターpSM507の制限地図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｋ 7/08 8318−4Ｈ 14/00 8318−4ＨＣ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:125） 9050−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ｄ (72)発明者フランチェスカ・デフェーライタリー国ローディ市コルソ・マッジーニ 45 (72)発明者クラウディオ・トージイタリー国ブースト・アルジーツィオ市ビアーレ・ピランデーロ11 (72)発明者オルネーラ・トルトーライタリー国ミラノ市ビアーレ・ブレンタ８ (72)発明者アンナ・クッゾーニイタリー国パビア市ビアーレ・ウンディーチ・フェッブライオ14

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】バチルス・ズブチリス（B．subtilis）の
発現及び分泌組換えベクターにおいて、１）Ｂ．ズブチ
リスBGSC 1A341の中性プロテアーゼをコードする遺伝子
のプロモーター；２）分泌配列（Ｉ） 5'ATG AGA AGC AAA AAA ACG CGT ATC AGC TTG TTG TTT GCG TTA ACG TTA ATC TTT ACG ATG GCA TTC AGC GGC CGC TCT GCC ATG GCC 3' 及び３）配列 VH／VK−L−VK／VH−(TAG)_n （ここで、VH及びVKは所望の抗体の長鎖及び短鎖の可変
領域であり；Ｌはペプチドリンカー Val−Ser−Ser−(Gly₄−Ser)₃ であり；TAGは抗ペプチド抗体によって認識されるペプ
チドであり；及びｎは０又は１である）を有する単一分
子形抗体をコードするDNA配列を包含してなる、バチル
ス・ズブチリスの発現及び分泌組換えベクター。
【請求項２】請求項１記載のものにおいて、前記ペプチ
ドがアミノ酸配列 Met−Glu−Glu−Leu−Met−Ile−Glu−Gly−Arg を有するものである、バチルス・ズブチリスの発現及び
分泌組換えベクター。
【請求項３】請求項１記載のものにおいて、VH及びVK
が、ヒト繊毛性ゴナドトロピンのサブユニットαに対し
て特異的なモノクロナール抗体MAb5E8の長鎖及び短鎖の
可変領域である、バチルス・ズブチリスの発現及び分泌
組換えベクター。
【請求項４】ATCC 69173として寄託されている請求項１
記載のバチルス・ズブチリスの発現及び分泌組換えベク
ター。
【請求項５】ａ）前記分泌配列（Ｉ）、ペプチドリンカ
ーをコードする配列及び可及的にペプチドTAGを包含す
るオリゴヌクレオチド（ここで、該ヌクレオチドは、分
泌配列（Ｉ）の下流かつペプチドリンカーの上流への抗
体の長鎖又は短鎖の可変領域をコードする配列の挿入及
びペプチドリンカーの下流かつペプチドTAGの上流への
抗体の短鎖又は長鎖の可変領域をコードする配列の挿入
を可能にする特殊な制限部位を含有する）を合成し；
ｂ）Ｂ．ズブチリスBGSC 1A341の中性プロテアーゼの遺
伝子のプロモーターを包含するプラスミドベクター内で
前記オリゴヌクレオチドをクローニングし；ｃ）このオ
リゴヌクレオチドの制限部位において所望の抗体の長鎖
及び短鎖の可変領域をコードするDNA配列をクローニン
グし；及び最後にｄ）組換えベクターを単離することに
よって得られた請求項１記載のバチルス・ズブチリスの
発現及び分泌組換えベクター。
【請求項６】請求項５記載のものにおいて、前記工程
ａ）のオリゴヌクレオチドが配列 5'GAA TTC TTA TGA GAA GCA AAA AAA CGC GTA TCA GCT TGT TGT TTG CGT TAA CGT TAA TCT TTA CGA TGG CAT TCA GCG GCC GCT CTG CCA TGG CCG CAC AGG TCC AAC TGC AGC CTA TGG TCA CCG TCT CCT CAG GTG GCG GTG GCT CTG GCG GTG GTG GGT CGG GTG GCG GCG GAT CTG ACA TTC AAG GTA CCC CCT GAG ATC TCA TGG AAG AAC TTA TGA TCG AGG GTA GGT AAG TCG ACA AGC TT 3' を有するものである、バチルス・ズブチリスの発現及び
分泌組換えベクター。
【請求項７】請求項５記載のものにおいて、前記工程
ｂ）のプラスミドベクターがpSM308 ATCC 68047であ
る、バチルス・ズブチリスの発現及び分泌組換えベクタ
ー。
【請求項８】請求項５記載のものにおいて、前記工程
ｃ）のDNA配列が、ヒト繊毛性ゴナドトロピンのサブユ
ニットαに対して特異的なモノクロナール抗体MAb5E8の
長鎖又は短鎖の可変領域をコードする、バチルス・ズブ
チリスの発現及び分泌組換えベクター。
【請求項９】請求項１記載の組換えベクターによって形
質転換した宿主微生物において、前記微生物がＢ．ズブ
チリスの群から選ばれるものである、宿主微生物。
【請求項１０】Ｂ．ズブチリスSMS300（pSM507）ATCC 6
9173である、請求項６記載の宿主微生物。
【請求項１１】Ｂ．ズブチリスから単一分子形抗体を細
胞外生産する方法において、ａ）好適な培養環境中で、
請求項１記載の組換えベクターで形質転換したＢ．ズブ
チリスの菌株を培養し、ｂ）得られた抗体を培地から分
離及び精製することを特徴とする、単一分子形抗体の細
胞外生産法。
【請求項１２】請求項11記載の製法において、Ｂ．ズブ
チリスがＢ．ズブチリスSMS300（pSM507）ATCC 69173で
あり、分泌される抗体がヒト繊毛性ゴナドトロピンのサ
ブユニットαに対する特異的なscFv5E8である、単一分
子形抗体の細胞外生産法。
【請求項１３】請求項７記載の製法によって得られた診
断用及び治療用の単一分子形抗体。
【請求項１４】図１及び図２に示すアミノ酸配列を有す
る領域VH及びVKを包含することを特徴とする内分泌性腫
瘍及び栄養膜性腫瘍の決定用試薬として使用される単一
分子形抗体scFv5E8。
【請求項１５】請求項１の分泌配列（Ｉ）。 5'ATG AGA AGC AAA AAA ACG CGT ATC AGC TTG TTG TTT GCG TTA ACG TTA ATC TTT ACG ATG GCA TTC AGC GGC CGC TCT GCC ATG GCC 3'
【請求項１６】分泌ペプチドをコードする請求項15のDN
A配列。 Met Arg Ser Lys Lys Thr Arg Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Gly Arg Ser Ala Met Ala