JPH06178689A - Ｉ型緑膿菌を抗原とするヒト抗体をコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 Ｉ型緑膿菌のリポポリサッカライドを抗原と
して認識するヒト抗体の可変部位をコードする遺伝子を
含有する遺伝子を提供する。 【構成】 Ｉ型緑膿菌の血清型特異リポポリサッカライ
ド分子上のＯ−多糖側鎖を認識するヒトモノクローナル
抗体生産細胞よりＩ型緑膿菌に対するヒトモノクローナ
ル抗体をコードする構造遺伝子のｍＲＮＡを抽出し、ｃ
ＤＮＡライブラリーを作製し、これを用いて既知の抗体
の情報に基づいて作製したプライマーを用いたＰＣＲ法
により重鎖及び軽鎖可変部位の構造遺伝子をクローニン
グしてそのＤＮＡ配列を決定し、更にそれからコードす
るアミノ酸配列を決定することによりＩ型緑膿菌のリポ
ポリサッカライドを抗原として認識するヒト抗体の可変
部位をコードする遺伝子を含有する遺伝子を作製する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は緑膿菌のリポポリサッカ
ライドを抗原とするヒト抗体遺伝子に関し、更に詳しく
は、血清型分類が日本緑膿菌研究会血清型別検討委員会
の分類でＩ型である緑膿菌と反応するヒト抗体の可変部
位のアミノ酸配列をコードする遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】緑膿菌は外膜上に存在するリポポリサッ
カライド（Lipopolysaccharide、以下ＬＰＳと略す）分
子のＯ−多糖側鎖を認識する抗体、すなわち緑膿菌の血
清型特異Ｏ−抗原に対する抗体を用いて血清型分類がな
されている。緑膿菌の血清型分類に関しては現在でも多
くの議論があるが、日本ではＡ型からＭ型までの１３種
の血清型に分類する緑膿菌研究会分類（Homma,Japan J.
Exp.Med.,329-336(1976)）が広く用いられている。臨床
現場で緑膿菌感染症患者より分離される緑膿菌の血清型
の割合はほぼ一定しており、１３種の血清型のうちＡ、
Ｂ、Ｅ、Ｇ、Ｉ型の５種の血清型の菌の占める率が高い
ことが知られている。

【０００３】緑膿菌感染症は、各種基礎疾患を有する患
者や免疫抑制作用を有する薬剤の投与を受けている患者
に多く発生する日和見感染症であり、現在最も治療の困
難な感染症と考えられている。何故なら、緑膿菌はこれ
まで常用されてきた抗生物質のほとんどすべてに対して
耐性を示すばかりでなく、近年開発された抗生物質に対
しても容易に耐性が誘導される傾向が強いからである。
そのため宿主側の緑膿菌処理能力の増強をめざした予
防、治療法の研究がなされている。

【０００４】近年、緑膿菌感染症の治療には健常人の血
清あるいは血漿から精製したヒト免疫グロブリンあるい
はその化学的修飾物を有効成分とするグロブリン製剤が
用いられるようになった。しかし、これらの製剤に含ま
れる抗体は緑膿菌に対する親和性に問題があり、治療に
有効な抗体の量が一定せず、またその製剤中の含量も少
ないため、これらの製剤の予防・治療効果を疑問視する
向きも多い。そのため、低用量で有効なヒトモノクロー
ナル抗体の開発が行われてきた。

【０００５】緑膿菌の血清型特異ＬＰＳ分子のＯ−多糖
側鎖を認識するヒトモノクローナル抗体が緑膿菌感染症
の治療において有効であることは、動物を用いたモデル
実験ですでに多くの報告がなされている（例えば、Sado
ffら、Abstracts of the 1982 Interscience Conferenc
e on Antimicroviral Agents and Chemotherapy, No.25
3(1982). Sawadaら、J.Infect.Dis.,150,570-576(198
4)）。更に本発明者の一部はすでに、緑膿菌の血清型特
異ＬＰＳ分子上のＯ−多糖側鎖を認識するヒトモノクロ
ーナル抗体を持続的に生産する細胞株を樹立し、該細胞
株を培養することにより、ヒト・モノクローナル抗体を
効果的に製造する方法を確立するとともに、該ヒト・モ
ノクローナル抗体が緑膿菌感染症に有効であることを示
した（WO90/11350）。

【０００６】ヒトモノクローナル抗体の作製は、一般的
にはヒトのＢ細胞にエプスタイン・バー・ウイルス（Ep
stein-Barr virus、以下ＥＢウイルスと略す）を感染さ
せてＥＢウイルス形質転換細胞とする方法（例えば、St
einitzら、Nature,269,420-422(1977)）或いはＢ細胞な
どのヒト抗体生産細胞と無限増殖能を有する親細胞株を
細胞融合してヒト−マウス・ヘテロハイブリドーマある
いはヒト−ヒト・ハイブリドーマとする（成書「Monocl
onal Antibodies」,p163,Plenum Press刊(1980)他）こ
とにより得られたモノクローナル抗体生産細胞を培養し
生成した該抗体を回収することにより行われる。

【０００７】またヒトモノクローナル抗体生産細胞の作
製法の今一つの方法としては、特定の化合物に親和活性
を有する分子、即ち抗体の遺伝子をクローニングして、
これを適当な発現ベクターに組み込み、さらにこれを大
腸菌または哺乳動物細胞を宿主として発現させ、抗体分
子を生産する方法があるがこれに関しては、大腸菌を宿
主とした例において始めに示され（Bossら、Nucleic Ac
ids Research.12,(1984)3791）、さらに哺乳動物細胞を
宿主とした例においても既に示されている（A.Ochiら、
Nature,302,340-342(1983),A.Ochiら、Proc.Natl.Acad.
Sci.USA,80,6351-6355(1983)）。更に近年になり Polym
erase chain reaction 技術（以下ＰＣＲ技術と略す：
R.K.Saikiら、Science,230,1350-1354,(1985)）の進展
により目的とする抗体遺伝子のＰＣＲ法を用いた単離が
行われるようになってきた（L.Sastryら Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,86,5728(1989)、W.D.Huseら、Science,246,1
275-1281(1990)）。

【０００８】更に、遺伝子工学の進歩により、微生物或
いは哺乳動物細胞での効率的な発現に適した様々なプロ
モーター、エンハンサー等の発現制御遺伝子がすでに知
られている。また、これらの遺伝子を抗体遺伝子と巧み
に組み合わせて発現ユニットとして発現ベクターに組換
えることにより、安定で高い生産性を期待できることが
知られている。また、この発現ユニットを適当に選択す
れば生産性が高く細胞を培養する上で取扱いの容易な発
現宿主を選択することも可能となる。更に今日ジヒドロ
葉酸還元酵素（DHFR：Dihydrofolate reductase）等の
遺伝子を用いて、染色体中の目的遺伝子のコピー数を増
幅させることにより、目的蛋白質の生産性を飛躍的に増
大させる方法も広く知られている（R.T.Schimke編"Gene
Amplification",Cold Spring Harbor Laboratory,(198
2)）。

【０００９】以上のような従来技術を考慮すると緑膿菌
に対するヒト・モノクローナル抗体生産株を得るために
は、まず目的の抗緑膿菌抗体を生産するＢ細胞をＥＢウ
イルスを用いて形質転換して細胞株を樹立するか、ある
いは、目的の抗緑膿菌抗体を生産するＢ細胞またはそれ
のＥＢウイルスによる形質転換株と無限増殖能を有する
親細胞株とで、細胞融合を行い抗体生産株を樹立すると
いう従来行われている方法が考えられる。しかしかよう
なヒト型抗体生産株では、しばしば抗体生産能が不安定
であったり、細胞増殖能が低下していることが指摘され
る。特に細胞融合により得られた細胞の場合、親株由来
の免疫グロブリン重鎖又は軽鎖或いはその両者が抗緑膿
菌抗体に混入することが時として起こり、これが治療上
の薬効の低下を招くことが予想される。そのため活性の
高い生産株を選抜するために限外希釈法を繰り返した
り、あるいは変異剤を使用して、突然変異株を誘導する
などにより、活性、生産量、安定性の何れも高い優良
株、変異株を選抜する必要がある。しかし、この様な確
率的な方法で飛躍的に優れた抗体生産細胞株を取得する
には限界がある。また遺伝子を単離しないこの様な細胞
レベルでの改良では、優良な宿主の選択、高効率なプロ
モーターを含む発現ユニットの選択、或いは該発現ユニ
ットのコピー数の増幅といった抗体遺伝子のクローニン
グによる生産量の向上、生産性の安定化は望めない。

【００１０】また、本来抗体（免疫グロブリン）には、
ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥの型があり、
それぞれ免疫応答を分担しているが、抗緑膿菌抗体の所
望のグロブリンの型の抗体を選択したり、グロブリンの
型を変更したりすることができれば、例えば本来ＩｇＭ
であった抗体の可変部位遺伝子配列を取り出し、ＩｇＧ
の可変部位遺伝子に繋ぐことにより、分子量が小さく、
構造が安定であるが故に物理化学的に取扱いが容易で、
体内半減期がより長い抗体を作製することが可能にな
る。更に、抗体の抗原認識部位だけ単離し、抗原に対す
る親和性（結合性）を利用してこれを、他の例えば緑膿
菌を攻撃する薬剤と結合する様な、複合的薬剤の一部と
して利用することも可能となる。しかし、このようなこ
とは抗体の細胞レベルでの改良では不可能である。

【００１１】以上の点に鑑みれば飛躍的に優れた抗緑膿
菌抗体を生産するため或いは該抗体を生産する細胞株を
作製するためには、緑膿菌のＬＰＳを抗原として認識す
るヒト抗体の重鎖、軽鎖をコードする遺伝子、とりわけ
各鎖の可変部位のＤＮＡ塩基配列が不可欠であると考え
られるが、そのような物はこれまで知られていなかっ
た。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】即ち本発明の目的は、
上記問題点を解決するためＩ型緑膿菌のＬＰＳを抗原と
して認識するヒト抗体をコードする遺伝子を含有する遺
伝子を提供することにある。

【００１３】

【課題を解決するための手段】上記の状況で本発明者ら
は鋭意検討の結果、本発明者の一部が以前に作製した
（WO90/113501）Ｉ型緑膿菌の血清型特異ＬＰＳ分子上
のＯ−多糖側鎖を認識するヒトモノクローナル抗体生産
細胞MP-5156（微工研条寄第2339号）よりＩ型緑膿菌に
対するヒトモノクローナル抗体をコードする構造遺伝子
のｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡライブラリーを作製し、
これを用いて既に知られている多数の抗体の可変部位Ｎ
末端或いは可変部位Ｃ末端の情報（E.A.Kabatら、"Sequ
ences of Proteins of Immunological Interest Fifth
Ed.,U.S.Department of Health andHuman Services Pub
lic Health Service National Institutes of Health(1
991)）に基づいて作製したプライマーを用いたＰＣＲ法
により重鎖及び軽鎖可変部位の構造遺伝子をクローニン
グしてそのＤＮＡ配列を決定し、更にそれからコードす
るアミノ酸配列を決定することにより上記問題点を解決
することに成功し、本発明を完成したすなわち、本発明
はＩ型緑膿菌のリポポリサッカライドを抗原として認識
するヒト抗体の可変部位をコードする遺伝子を含有する
遺伝子を提供するものである。

【００１４】以下、Ｉ型緑膿菌のＬＰＳを抗原とするヒ
ト抗体の可変部位をコードする遺伝子を含有する遺伝子
の単離を細胞株MP-5156からの該遺伝子の単離を例に具
体的に説明する。

【００１５】免疫グロブリンＩｇＭの構造 本発明の遺伝子がもともとコードしている緑膿菌のＬＰ
Ｓを認識するヒト抗体はＩｇＭである。ＩｇＭは重鎖で
あるμ鎖と、軽鎖であるκ鎖またはλ鎖が対となったも
のの５量体と一分子のＪ鎖からなっている。更に、μ鎖
は可変部位（Ｖ）と４つの定常部位（Ｃμ1−Ｃμ4）の
モジュールより構成されている。また、軽鎖はκ鎖λ鎖
いずれも可変部位（ＶL）定常部位（ＣL）の二つのモジ
ュールからなる。

【００１６】緑膿菌のＬＰＳを認識するヒト抗体生産細
胞のｃＤＮＡ作製 抗Ｉ型緑膿菌ヒト抗体生産細胞MP-5156のｃＤＮＡは既
知の方法で作製することができる。（例えば、T.Maniat
is,et al "Molecular Cloning"(1982)Cold Spring Harb
or Laboratory）すなわち、該細胞をグアニジン塩で処
理後、この処理液をオリゴｄＴカラムにかけ、ｍＲＮＡ
を吸着させる。さらに、吸着したｍＲＮＡを低塩濃度の
バッファーを用いて溶出させることによって該細胞から
ｍＲＮＡを単離する。単離されたｍＲＮＡは Gubler,U.
and Hoffman,B.J.らの方法（Gene 25,263(1983)）を用
いてｃＤＮＡに変換する。次に上記で得られたｍＲＮＡ
混合物にオリゴｄＴプライマーを加え逆転写酵素を用い
てヘテロ二重鎖とする。さらにこのヘテロ二重鎖にＲＮ
ＡＳｅＨ及びＤＮＡポリメラーゼを同時に作用させるこ
とにより目的のｃＤＮＡを得ることが出来る。

【００１７】抗Ｉ型緑膿菌ヒト抗体の可変部位配列のク
ローニング 上記により得たｃＤＮＡを鋳型として、ヒト免疫グロブ
リン可変部位のＮ末端付近を５’側のプライマーとし、
重鎖或いは軽鎖の定常部位の一部を３’側のプライマー
とすることにより、可変部位を含む配列を得ることが出
来る。具体的に、まず重鎖側については、上記細胞MP-5
156の生産する抗Ｉ型緑膿菌ヒト抗体はＩｇＭなのでＩ
ｇＭの重鎖であるμ鎖定常部位のＮ末付近例えば配列表
の配列番号：５に示される配列を使用することが出来
る。また、５’側のプライマーとしては免疫グロブリン
可変部位のＮ末配列は上記 Kabat のData Base に多数
知ることができる。例えば配列表の配列番号：６から配
列番号：１０に示されるＤＮＡをプライマー混合物とし
て使用することにより、大半のμ鎖可変部位配列を包含
出来る。一方、抗Ｉ型緑膿菌ヒト抗体の軽鎖のタイプは
κなので、３’側のプライマーとして、κ鎖定常部位の
Ｎ末付近、例えば配列表の配列番号：１１に示される様
な配列が使用でき、κ鎖５’側としては既知の配列の中
から配列表の配列番号：１２から配列番号：１６に示さ
れる配列のＤＮＡの混合物をプライマーとして使用する
ことにより、大多数のκ鎖を包含することができる。こ
の様な組み合わせのプライマーを使用して、それぞれμ
鎖又はκ鎖プライマーのセットでＰＣＲ反応を行うこと
により、μ鎖可変部位及びκ鎖可変部位の増幅されたＤ
ＮＡ断片を得ることが出来る。

【００１８】抗Ｉ型緑膿菌ヒト抗体の可変部位配列の確
認 上記の方法で得られたＤＮＡ断片は、通常の組換えＤＮ
Ａの技術（T.Maniatis,et al "Molecular Cloning"(198
2)Cold Spring Harbor Laboratory）をもちいて適当な
プラスミドにクローニングしその配列を確認することが
できる。例えば、市販のＰＣＲキット（例えば、GeneAm
p^TM PCR Reagent Kit:宝酒造社製・GeneAmpはPerkin-El
mer Cetus Instrument 社の登録商標）を使用して目的
の抗体可変部位配列を増幅したのち、ｐＵＣ系のプラス
ミドに連結し、これをジデオキシヌクレオチドチェーン
ターミネーター法（J.Messingら、"Methods in Enzymo
l.",101,20-78,(1983)）を用いて塩基配列の決定を行え
ば、挿入部分の配列を確認する事が出来る。但し、上記
抗体生産株MP-5156は抗Ｉ型緑膿菌ヒトモノクローナル
抗体を分泌する形質転換株MP-5035と本発明者の一部が
作製したハイブリドーマ作製用親細胞株MP-4109（微工
研条寄第2129号）（特開平2-242671）の細胞融合物であ
る（WO90/11350）。親細胞株MP-4109は本来軽鎖（κ鎖
・λ鎖）ともに発現しており、その細胞融合物である M
P-5156も親細胞株MP-4109由来のκ鎖及びλ鎖を発現し
ているが、予め上記と同様の方法を用いて親細胞株MP-4
109由来の軽鎖（κ鎖・λ鎖）の配列を確認しておけ
ば、目的のＩ型緑膿菌のＬＰＳを認識するヒト抗体の軽
鎖可変部位の配列を親細胞株由来の軽鎖と区別して検出
することができる。

【００１９】免疫グロブリン遺伝子の作製 上記により得られた、緑膿菌のＬＰＳを認識するヒト抗
体の軽鎖及び重鎖可変部位の配列は、免疫グロブリンの
型、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥのそれぞ
れに該当する定常部位の遺伝子を軽鎖及び重鎖ぞれぞれ
の可変部位と結合することにより、それぞれの軽鎖及び
重鎖をコードする完全な免疫グロブリン遺伝子として得
ることが出来る。更にこれらを発現させるにあたって、
ＩｇＧ，ＩｇＤ，ＩｇＥについてはそれらの軽鎖及び重
鎖を発現させれば良いし、Ｍ及びＡ型についてはそれぞ
れの軽鎖及び重鎖以外にＪ鎖を発現させる必要がある。
それぞれの型の遺伝子配列は上記免疫グロブリン配列デ
ータベース（E.A.Kabatら、"Sequences of Proteins of
Immunological Interest Fifth Ed.,U.S.Department o
f Health and Human Services Public Health Service
National Institutes of Health(1991)）より知られる
配列を利用し、ＰＣＲ反応を用いて単離取得することが
出来る。また、これをすでに取得された免疫グロブリン
の重鎖および軽鎖と結合し、発現可能な構造遺伝子とす
るのは、公知の組換え技術を用いて容易に行うことが出
来る（例えば、T.Maniatis,et al "Molecular Cloning"
(1982)Cold Spring Harbor Laboratory）。

【００２０】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００２１】実施例１．ハイブリドーマ作製用親細胞株
MP-4109のｃＤＮＡ作製 1)ｍＲＮＡの抽出 ｍＲＮＡの抽出はファルマシア社 ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ^TM :
ＱｕｉｃｋＰｒｅｐは Pharmacia 社の登録商標)を使用
した。すなわち、培養し培養液を除いたハイブリドーマ
作製用親細胞MP-4109（１×１０⁷個）を１．５ｍｌの抽
出バッファー（ｇｕａｎｉｄｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎ
ａｔｅ及び Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌ ｓａｒｃｏｓｉｎｅ
を含む）を加え、２１ゲージの注射針を通過させて均一
化させた。これに３ｍｌのＴＥバッファー（１０ｍＭト
リス塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ４．７）を加えて希
釈し攪拌し、更にこれを遠心して不溶物を除いた。得ら
れた上清４ｍｌをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに加
え１０分間懸濁させることによりｍＲＮＡを吸着せし
め、その後余分な液を除いた。このカラムを更に高塩濃
度バッファー（１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．４、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＣｌ）３ｍｌで３回、低
塩濃度バッファー（１０ｍＭトリス塩酸ｐＨ７．４、１
ｍＭＥＤＴＡ、０．１Ｍ ＮａＣｌ）３mlで２回洗浄し
た。更に、このカラムに６５℃に予熱した溶出バッファ
ー（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ４．
７）０．２５ｍｌを３回加え、目的のｍＲＮＡを溶出さ
せた。得られた０．７５ｍｌの溶出液の吸光度を測定す
ることによりｍＲＮＡを定量したところ４０μｇのｍＲ
ＮＡが含まれていることが分かった。さらにこれをエタ
ノール沈澱により回収した。 2)ｃＤＮＡの作製 ｃＤＮＡの作製はファルマシア社のｃＤＮＡ作製キット
を用いて行った。すなわち、上記実施例１−1)で抽出し
た３μｇのｍＲＮＡ水溶液を６５℃で１０分間加熱後氷
冷し、これに１２μｌの逆転写酵素反応液（Ｍｕｒｉｎ
ｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｂ
ＳＡ、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）ｐｒｉｍｅｒ、ｄＡＴＰ、ｄ
ＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを含む水溶液）と１μｌの
ＤＴＴ水溶液を加えて３７℃で１時間加温することによ
りＲＮＡ・ＤＮＡ二重鎖を作製した。更にこれにＲＮＡ
ＳｅＨを含むポリメラーゼ溶液（ＲＮＡＳｅＨ、Ｅ．Ｃ
ｏｌｉ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ ｄＮＴＰ
ｓを含む水溶液）６７μｌ加え、１２℃で１時間、２２
℃で更に１時間反応させた。反応液はフェノール、クロ
ロホルム抽出及びエタノール沈澱を行い、作製した２本
鎖ＤＮＡを単離した。

【００２２】実施例２．ハイブリドーマ作製用親細胞
株、MP-4109のκ鎖可変部位のクローニング 1)ＰＣＲ反応 実施例１−2)で作製したｃＤＮＡ、０．２μｇを鋳型と
して用い、κ鎖Ｃ末（３’）側プライマーとして配列表
の配列番号：１１を、κ鎖Ｎ末（５’）側プライマーと
して配列表の配列番号：１２から配列番号：１６に示さ
れる配列のＤＮＡをそれぞれ５０ｐＭずつ含む混合物を
用いてＰＣＲ反応を行った。反応はＧｅｎｅＡｍｐ^TM
ＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（宝酒造社製・Ｇｅｎ
ｅＡｍｐはPerkin-Elmer Cetus Instrument 社の登録商
標）を用いて行った。すなわち、上記鋳型、プライマー
ＤＮＡ 及びｄＮＴＰｓ各２００μＭ、０．０１％ＢＳ
Ａ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０
ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ８．３、ＡｍｐｌｉＴａｑ
^TM（Perkin-Elmer Cetus Instrument社の登録商標）Ｄ
ＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２．５ユニットを含有す
る溶液１００μｌ を作製し、９３℃で７分加熱した
後、５０℃にて２分間、７２℃にて２分間、９３℃にて
２分間のサイクルで３０回反応させた。得られた反応混
合物に更にＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（Ｋ
ｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ宝酒造社製）１０ユニッ
ト加え３７℃で３０分間反応させた。反応混合物はポリ
アクリルアミドゲル電気泳動し、該ゲルから約３３０塩
基長のバンドのＤＮＡを抽出単離精製した。 2)プラスミドへのクローニング 以下の組換え実験は公知の方法（T.Maniatis,et al "Mo
lecular Cloning"(1982)Cold Spring Harbor Laborator
y）に従って行った。すなわち、１０μｇのプラスミド
ｐＵＣ１８（東洋紡績社）は、３０μｌのトリスバッフ
ァー（１０ｍＭトリス塩酸 ｐＨ７．５、２０ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、７ｍＭ ＭｇＣｌ₂）に溶解し、制限酵素Ｓｍａ
Ｉ １００単位を加えて３０℃で３時間保温することに
より切断した。さらに該切断溶液を６５℃で５分間加熱
して反応を停止させたのち、エタノール沈澱でＤＮＡを
回収した。回収されたＤＮＡを２０μｌＴＥバッファー
（１０ｍＭ トリス塩酸、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）中に溶解し、３単位の牛小腸アルカリフォスファタ
ーゼで３７℃、３０分間処理し、反応混合物をアガロー
ス電気泳動上で精製しクローニングベクターとして単離
した。次に、上記クローニングベクターの０．１μｇと
実施例２−1)で得られたｃＤＮＡ断片の半量をＤＮＡ
Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）のＡ液８μｌ
に溶解しＢ液２μｌ加えて１２℃で４時間反応させた。
得られた反応混合物の一部を大腸菌、ＤＨ５α株（BRL
社製）に形質転換し、得られたアンピシリン耐性株より
プラスミドＤＮＡを抽出し、目的のｃＤＮＡがクローニ
ングベクターのＳｍａＩサイトに組み込まれたプラスミ
ドＡＰ−２を得た。 3)κ鎖可変部位の塩基配列決定 上記、実施例２−2)で得たプラスミドＡＰ−２のＳｍａ
Ｉ挿入部分の塩基配列をジデオキシヌクレオチドチェー
ンターミネーター法（J.Messingら、"Methodsin Enzymo
l.",101,20-78,(1983)）を用いて決定した。実験は７−
Ｄｅａｚａ−Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ^TM ｆｏｒ ｌａｂｅ
ｌｅｄ ｄＣＴＰキット（東洋紡績社製、Ｓｅｑｕｅｎ
ａｓｅ^TM はUnited states Biochemical Corporationの
登録商標）を用いて行った。結果として得られた配列は
配列表の配列番号：１７に示した。

【００２３】実施例３．Ｉ型緑膿菌のＬＰＳを認識する
ヒト抗体生産細胞、MP-5156 のｃＤＮＡ作製 ｍＲＮＡを取得する細胞として、上記緑膿菌のＬＰＳを
認識するヒト抗体生産細胞、MP-5156 を用いる他、実施
例１−1)と同一の方法を用いて実験を行い、緑膿菌のＬ
ＰＳを認識するヒト抗体生産細胞のｍＲＮＡ２５μｇを
取得した。さらに引き続き、実施例１−2)と同一の方法
を用いて相当するｃＤＮＡを作製した。

【００２４】実施例４．Ｉ型緑膿菌のＬＰＳを認識する
ヒト抗体のμ鎖可変部位遺伝子クローニングと塩基配列
の決定 1)ＰＣＲ反応 実施例３．で作製したｃＤＮＡ、０．２μｇを鋳型とし
て用い、プライマーとして、Ｃ末（３’）側プライマー
に配列表の配列番号：５の配列をＮ末（５’）側プライ
マーに配列表の配列番号：６から配列番号：１０の配列
のＤＮＡ、それぞれ５０ｐＭを用いた以外実施例２−1)
と同一の方法を使用してＰＣＲ反応を行った。得られた
反応混合物に更にＤＮＡポリメラーゼラージフラグメン
ト（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ：宝酒造社製）１
０ユニットを加え３７℃で３０分間反応させた。反応混
合物はポリアクリルアミドゲル電気泳動で約３５０塩基
長のバンドのＤＮＡを抽出単離精製した。 2)緑膿菌のＬＰＳを認識するヒト抗体μ鎖可変部位遺伝
子のプラスミドへのクローニングと挿入部塩基配列の決
定 実施例４−1)で得た緑膿菌のＬＰＳを認識するヒト抗体
μ鎖可変部位遺伝子のｃＤＮＡ断片を用い、実施例２−
2)、−3)と同一の方法を使用してプラスミドｐＵＣ１８
にクローニングして得たプラスミドＩＨ−１の挿入部遺
伝子をクローニングし配列を決定した。得られた配列を
配列表の配列番号：２に示した。

【００２５】実施例５．緑膿菌のＬＰＳを認識するヒト
抗体のκ鎖可変部位遺伝子クローニングと塩基配列の決
定 実施例３．で作製したｃＤＮＡを鋳型として用い、実施
例２．と同一の実験方法及びプライマーを使用して、κ
鎖可変部位ｃＤＮＡのクローニングを行い、そのＳｍａ
Ｉ挿入部分の塩基配列の検索を行い、プラスミドＡＰ−
２の ＳｍａＩ挿入部分と異なる塩基配列を有するプラ
スミドＩＬ−１を得た。プラスミドＩＬ−１配列検索の
結果として得られたκ鎖可変部位配列を配列表の配列番
号：４に示した。

【００２６】

【発明の効果】

1.Ｉ型緑膿菌のＬＰＳを認識するヒト抗体をコードする
遺伝子と高い発現量の制御遺伝子（プロモーター等）と
を結合させて抗体発現ユニット遺伝子を構築すれば、Ｉ
型緑膿菌のＬＰＳを認識するヒトモノクローナル抗体生
産細胞を作製するに際して、該抗体発現ユニット遺伝子
を公知の方法を用いてコピー数を増幅させること及び増
殖性及び培地選択性等が良好で蛋白質発現量が高い宿主
を選択することが可能となり、経済性が高く安定なＩ型
緑膿菌のＬＰＳを認識するヒトモノクローナル抗体生産
細胞の作製が出来る。 2.本発明の遺伝子の少なくとも抗原を認識する可変部位
を利用すれば別の特徴を持つ他の型への変換が可能とな
る。更に、本発明の遺伝子を利用すれば抗原認識部位だ
け単離し、抗原に対する親和性（結合性）を利用してこ
れを、他の例えば緑膿菌を攻撃する薬剤と結合する様な
複合的薬剤の一部として利用することも可能となる。 3.本発明の遺伝子を用いて抗体を生産するに際し本来抗
体を生産しない宿主を選択すれば、細胞融合による抗体
生産において見られるの親株由来の不必要な免疫グロブ
リン断片（重鎖又は／および軽鎖）が目的の抗体に混入
し抗体の活性低下の原因となること、また宿主由来抗体
様夾雑物による目的抗体の活性低下が防止できる。 4.本発明の遺伝子を用いて抗体を生産するに際して、本
来ウイルスを生産しない宿主を用いれば、ウイルスの混
入することの無い医薬として安全性の高い抗体が生産出
来る。

【００２７】

【配列表】

【００２８】配列番号：１ 配列の長さ：１０８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：HOMO SAPIENS 分化の程度：組換え後 細胞の種類：B-CELL セルライン：MP-5156（微工研条寄第2339号） 配列の特徴 1-108 E peptide 配列： Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 1 5 10 15 Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr Cys Met His Trp Val 20 25 30 Arg His Thr Pro Gly Lys Gly Leu Val Ser Val Ser Phe Ile Thr Lys 35 40 45 Asp Asp Phe Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val 50 55 60 Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Lys Gln Ser 65 70 75 80 Glu Ser Arg Gly His Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asp Asp Gly 85 90 95 Phe Leu Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105

【００２９】配列番号：２ 配列の長さ：３２４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA アンチセンス：NO 起源 生物名：HOMO SAPIENS 分化の程度：組換え後 細胞の種類：B-CELL セルライン：MP-5156（微工研条寄第2339号） 配列の特徴 1-324 E CDS 配列： GAG TCG GGG GGA GAC TTA GTT CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TCC 48 Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 1 5 10 15 TGT ACA GTC TCT GGA TTC ACC TTC AGT TAC TAC TGT ATG CAC TGG GTC 96 Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr Cys Met His Trp Val 20 25 30 CGC CAT ACT CCA GGG AAG GGG CTG GTG TCG GTC TCA TTT ATT ACT AAA 144 Arg His Thr Pro Gly Lys Gly Leu Val Ser Val Ser Phe Ile Thr Lys 35 40 45 GAT GAC TTT ATA AGT TAT GCG GAC TCC GTG AAG GGC CGA TTC ACC GTC 192 Asp Asp Phe Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val 50 55 60 TCC AGA GAC AAC GCC AGG AAT ACA TTG TAT CTA CAA ATG AAG CAG TCT 240 Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Lys Gln Ser 65 70 75 80 GAG AGT CGA GGA CAC GGT GTA TAT TAC TGT GCG AGG GGT GAC GAC GGT 288 Glu Ser Arg Gly His Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asp Asp Gly 85 90 95 TTC TTG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA 324 Phe Leu Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105

【００３０】配列番号：３ 配列の長さ：１０８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：HOMO SAPIENS 分化の程度：組換え後 細胞の種類：B-CELL セルライン：MP-5156（微工研条寄第2339号） 配列の特徴 1-108 E peptide 配列： Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser 1 5 10 15 Ile Ser Cys Arg Ser Ser Leu Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Asn Thr 20 25 30 Tyr Leu Thr Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ile Gly Phe Tyr Phe Cys Met Gln Ala Ser His Trp Pro 85 90 95 Leu Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

【００３１】配列番号：４ 配列の長さ：３２４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA アンチセンス：NO 起源 生物名：HOMO SAPIENS 分化の程度：組換え後 細胞の種類：B-CELL セルライン：MP-5156（微工研条寄第2339号） 配列の特徴 1- 324 E CDS 配列： ACT CAG TCT CCA GTC TCC CTG CCC GTC ACC CTT GGC CAG CCG GCC TCC 48 Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser 1 5 10 15 ATC TCC TGC AGG TCT AGT CTA AGT CTC CTA CAC AGT GAT GGA AAC ACC 96 Ile Ser Cys Arg Ser Ser Leu Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Asn Thr 20 25 30 TAC TTG ACT TGG TTT CAG CAG AGG CCA GGC CAA TCT CCA AGG CGC CTA 144 Tyr Leu Thr Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu 35 40 45 ATT TAT AGG GTT TCT AAC CGG GAC TCT GGG GTC CCA GAC AGA TTC AGC 192 Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 GGC AGT GGG TCG GGC ACT GAT TTC ACA CTG AGA ATC AGC AGG GTG GAG 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu 65 70 75 80 GCT GAA GAT ATT GGA TTT TAT TTC TGC ATG CAA GCT TCA CAC TGG CCG 288 Ala Glu Asp Ile Gly Phe Tyr Phe Cys Met Gln Ala Ser His Trp Pro 85 90 95 CTC TCT TTC GGC GGA GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA 324 Leu Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

【００３２】配列番号：５ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA アンチセンス：YES 配列の特徴 1- 24 E CDS 配列 ACT AGT CTC ACA GGA GAC GAG GGG 24

【００３３】配列番号：６ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 1- 23 E CDS 配列 CAG GTG CAG CTC GAG CAG TCT GG 23 Gln Val Gln Leu Glu Gln Ser 1 5

【００３４】配列番号：７ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 1- 23 E CDS 配列 CAG GTG AAC CTC GAG CAG TCT GG 23 Gln Val Asn Leu Glu Gln Ser 1 5

【００３５】配列番号：８ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 1- 23 E CDS 配列 GAG GTG CAG CTC GAG GAG TCT GG 23 Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser 1 5

【００３６】配列番号：９ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 1- 23 E CDS 配列 CAG GTG CAG CTC GAG GAG TCG GG 23 Gln Val Gln Leu Glu Glu Ser 1 5

【００３７】配列番号：１０ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 1- 23 E CDS 配列 CAG GTG CAG CTC GAG CAG TCG GG 23 Gln Val Gln Leu Glu Gln Ser 1 5

【００３８】配列番号：１１ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA アンチセンス：YES 配列の特徴 1- 24 E CDS 配列 TCTAGAGAAGACAGATGGTGCAGC 24

【００３９】配列番号：１２ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 1- 23 E CDS 配列 GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCT CC 23 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser 1 5

【００４０】配列番号：１３ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 1- 23 E CDS 配列 GAT ATT GAG CTC ACT CAG TCT CC 23 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser 1 5

【００４１】配列番号：１４ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 1- 23 E CDS 配列 GAA ATT GAG CTC ACG CAG TCT CC 23 Glu Ile Glu Leu Thr Gln Ser 1 5

【００４２】配列番号：１５ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 1- 23 E CDS 配列 GAA ACG GAG CTC ACG CAG TCT CC 23 Glu Thr Glu Leu Thr Gln Ser 1 5

【００４３】配列番号：１６ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列の特徴 1- 23 E CDS 配列 GAT ATT GAG CTC ACT CAG TCT CC 23 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser 1 5

【００４４】配列番号：１７ 配列の長さ：５１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA アンチセンス：NO 起源 生物名：HOMO SAPIENS 分化の程度：組換え後 細胞の種類：B-CELL セルライン：MP-4109（微工研条寄第2129号） 配列の特徴 1-51 E CDS 配列： ACC ATC ACT TGC CGG GCG AGT CAG GAC ATT AGA ATC TAT TTA ACT TGG 48 Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp ILe Arg Ile Tyr Leu Thr Trp 1 5 10 15 TAT Tyr

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 里澤 昇 千葉県茂原市東郷1144番地 三井東圧化学 株式会社内

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｉ型緑膿菌のリポポリサッカライドを抗
   原として認識する抗体の可変部位領域をコードする遺伝
   子を含有する遺伝子。
2. 【請求項２】 Ｉ型緑膿菌のリポポリサッカライドを抗
   原として認識する抗体の重鎖の可変部位領域が配列表の
   配列番号：１記載のアミノ酸配列であることを特徴とす
   る請求項１記載の遺伝子。
3. 【請求項３】 Ｉ型緑膿菌のリポポリサッカライドを抗
   原として認識する抗体の重鎖の可変部位領域のアミノ酸
   配列が、配列表の配列番号：２に記載の塩基配列でコー
   ドされることを特徴とする請求項２に記載の遺伝子。
4. 【請求項４】 Ｉ型緑膿菌のリポポリサッカライドを抗
   原として認識する抗体の軽鎖の可変部位領域が配列表の
   配列番号：３記載のアミノ酸配列であることを特徴とす
   る請求項１記載の遺伝子。
5. 【請求項５】 Ｉ型緑膿菌のリポポリサッカライドを抗
   原として認識する抗体の軽鎖の可変部位領域を表現して
   いるアミノ酸配列が、配列表の配列番号：４に記載の塩
   基配列でコードされることを特徴とする請求項４に記載
   の遺伝子。
6. 【請求項６】 Ｉ型緑膿菌のリポポリサッカライドを抗
   原として認識する抗体の重鎖の可変部位領域のアミノ酸
   配列が配列表の配列番号：１記載されるものであり、し
   かも該抗体の可変部位領域のアミノ酸配列が配列表の配
   列番号：３に記載される配列であることを特徴とする請
   求項１記載の遺伝子。
7. 【請求項７】 Ｉ型緑膿菌のリポポリサッカライドを抗
   原として認識する抗体の重鎖の可変部位領域のアミノ酸
   配列をコードする塩基配列が配列表の配列番号：２に記
   載されるものであり、しかも該抗体の軽鎖可変部位領域
   のアミノ酸配列をコードする塩基配列が、配列表の配列
   番号：４に記載される配列であることを特徴とする請求
   項６記載の遺伝子。
8. 【請求項８】 Ｉ型緑膿菌のリポポリサッカライドを抗
   原として認識する抗体の可変部位領域の少なくとも一部
   は、請求項６に記載の遺伝子で表されるヒト抗体をコー
   ドする遺伝子。
9. 【請求項９】 抗体可変部位領域の少なくとも一部は、
   請求項７に記載の遺伝子で表されるヒト抗体をコードす
   る遺伝子。