JP2619232B2

JP2619232B2 - ヒト免疫グロブリンｅ結合因子活性ポリペプチドをコードする遺伝子系

Info

Publication number: JP2619232B2
Application number: JP7313369A
Authority: JP
Inventors: ホフシュテターハンス; キルヒヘルエーリヒ
Original assignee: チバ−ガイギーアクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 1986-07-22
Filing date: 1995-11-30
Publication date: 1997-06-11
Anticipated expiration: 2012-06-11
Also published as: EP0254249B1; GR3006306T3; US5081028A; JP2713912B2; IE871967L; DE3781217D1; DE3781217T2; JPS6368097A; PT85364B; DK381287D0; DK172259B1; ES2033747T3; EP0254249A1; IE60393B1; DK381287A; PT85364A; AU602907B2; JPH08242865A; AU7594787A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、ヒト免疫グロブ
リンＥ結合因子（ＩｇＥ−ＢＦ）ポリペプチドをコード
するＤＮＡ及びハイブリドベクター、このハイブリドベ
クターを含有する宿主、並びに宿主の製造方法に関す
る。このポリペプチドはアレルギー疾患の予防及び／又
は治療のために使用することができ、そしてそれ故にこ
の発明はまた前記ポリペプチドを含有する医薬に関す
る。

【０００２】

【発明の背景】アレルギー疾患は、その高い発生率（人
工の２０〜３０％）のため及び治療手段の欠如のためな
お主要な健康問題である。これに対する療法は通常抗ヒ
スタミン剤の使用又は幾分有効な免疫化法に限定されて
いる。古典的な抗アレルギー剤は、これらが特に治療さ
れた患者において種々の副作用を生じさせるために、幾
つかの欠点を有する。免疫化法は１又は２種類のアレル
ゲンに限定されるが、ほとんどの患者は多数のアレルゲ
ンに感受性である。さらに、除感作処置は治癒的でもな
く保護的でもない。

【０００３】大多数のアレルギー疾患が、多数の風媒ア
レルゲン、例えば花粉、動物のフケ、ホコリダニ、食品
抗原、医薬製剤、例えばペニシリン、又は膜翅目の毒に
より媒介される。ＩｇＥの生産を制御する機構は実験室
動物において広範に研究されている〔Ｋ．Ｉｓｈｉｚａ
ｋａ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，１５９
（１９８４）〕。これらの研究は、動物モデルにおいて
ＩｇＥの生産を制御する抗原特異的でないがしかしＩｇ
Ｅアイソタイプ特異的な機構を明瞭に示した。

【０００４】これらの制御機構のエフェクター分子は、
ＩｇＥに対するそれらの親和性に基いてＩｇＥ−結合因
子（ＩｇＥ−ＢＦ）と命名された。ＩｇＥ−ＢＦはＩｇ
Ｅ−抑制因子（ＩｇＥ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅｆａ
ｃｔｏｒ；ＩｇＥ−ＳＦ）とＩｇＥ−増強因子（ＩｇＥ
−ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ；ＩｇＥ−
ＰＦ）とに分けられ、これらの分子はその炭水化物含量
によってのみ異る。ＩｇＥ−ＳＦはグリコシル化されて
いないか、又は対応するＩｇＥ−ＰＦよりも少なくグリ
コシル化されている。動物モデルにおけるＩｇＥの実際
の生産はこれら２種類のＩｇＥ−ＢＦ間の比率によって
決定される。同じ細胞が、異るＴリンパ球亜集団により
分泌されるグリコシル化阻害因子又は増強因子の影響に
従ってＩｇＥ−ＳＦ又はＩｇＥ−ＰＥのいずれかを生産
することができる。

【０００５】Ｍ．Ｓａｒｆａｔｉ等〔Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ，５３，１９７，２０７，７８３（１９８４）〕は
齧歯動物において記載されているものと類似する生物学
的活性を有するＩｇＥ−ＢＦを分泌するヒトＢセルライ
ンの存在を報告している。他の研究者はヒトＴ細胞によ
る〔Ｔ．Ｆ．Ｈｕｆｆ及びＫ．Ｉｓｈｉｚａｋａ，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１，
１５１４（１９８４）〕又は遺伝子工学的技法による
〔ヨーロッパ特許出願No．１５５，１９２〕ＩｇＥ−Ｂ
Ｆの生産を記載している。Ｔ−細胞由来のＩｇＥ−ＢＦ
とＢ−細胞由来のそれとの関係は今まで知られていな
い。本発明から明らかになる様に、Ｂ−細胞由来のＩｇ
Ｅ−ＢＦはＴ−細胞由来のＩｇＥ−ＢＦと統計的な類似
性を有しない。

【０００６】精製されたＩｇＥ−ＢＦはアレルギー性疾
患及びこれと関連する免疫抑制疾患の診断及び療法のた
めに重要である。特に、ＩｇＥ−抑制活性を有するＩｇ
Ｅ−ＢＦはアレルギー疾患の治療において有用であり、
他方ＩｇＥ−増強活性を有するＩｇＥ−ＢＦは感染に対
する耐性、例えば寄性体感染に対する耐性を増強するで
あろう。Ｂ−細胞からのＩｇＥ−ＢＦの検出のためのア
ッセイはロゼット阻害試験に基き、この試験においては
ＩｇＥのリセプター（ＦｃεＲ）を発現するＲＰＭＩ８
８６６細胞（リンパ芽球様Ｂ−セルライン）がＩｇＥ−
コートウシ赤血球と共にロゼット形成される。後者が最
初にＩｇＥ−ＢＦと共にプレインキュベートされれば、
もはやＲＰＭＩ８８６６細胞に結合することができず、
そしてそれ故にロゼットを形成する細胞の比率が低下す
る。

【０００７】このアッセイは定量的ではなく、ウシ赤血
球へのＩｇＥのカップリングの可変性の故に技術的に微
妙であり、そしてロゼットを顕微鏡観察しなければなら
ないこと、セルラインが永久に生存しなければならない
こと、ＩｇＥ−コート赤血球を常に調製しなければなら
ないこと、等のために煩雑であり、そのため１日に１人
により少数の（２０〜４０）試験のみが合理的に実施可
能である。より便利で、定量的で且つ実施が容易なアッ
セイにおいては、ＩｇＥ−ＢＦと交差反応する、リンパ
球ＦｃεＲに対するモノクローナル抗体が使用される。

【０００８】この様なモノクローナル抗体はＧ．Ｄｅｌ
ｅｓｐｅｓｓｅ等、ＥＰ８６８１０２４４．３により調
製されており、そしてそのためのハイブリドーマセルラ
インはパリのパスツール研究所のＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ＮａｔｉｏｎａｌｅｄｅＣｕｌｔｕｒｅｓｄｅ
Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに寄託されており、そ
して受託番号No．Ｉ−４２５（クローン２０８．２５
Ａ．４，３／１３５），Ｉ−４２０（クローン２０８．
２５Ｄ．２，１／１７６），Ｉ−４５１（クローン２０
７．２５Ａ．４，４／３０），Ｉ−４５２（クローン
２０７．２５Ａ．４，４／４５）、及びＩ−４８６（ク
ローン２０８．２５Ｄ．２／９４）のもとで入手可能で
ある。対応するモノクローナル抗体がそれぞれＭａｂ−
１３５，Ｍａｂ−１７６，Ｍａｂ−３０，Ｍａｂ−４５
及びＭａｂ−９４と命名される。これらはまた、アフィ
ニティークロマトグラフィーによるＩｇＥ−ＢＦの効果
的な精製を可能にする。

【０００９】上記モノクローナル抗体の使用にもかかわ
らず、天然ヒトＢセルラインから単離された単一ＩｇＥ
−ＢＦのアミノ酸配列を決定することは不可能であっ
た。療法目的のため、所望のＩｇＥ−結合性を有し、定
義されたアミノ酸配列を有し、そして容易に多量に製造
することができる純粋な単一ポリペプチドを手にするこ
とが非常に望ましい。近年における組換ＤＮＡ法の急速
な進歩がこの目的を達成するための一般的な方法を提供
している。ポリペプチドの構造が未知の場合、組換ＤＮ
Ａ技法の成功は天然源からの目的ポリペプチドをコード
するｍＲＮＡ又はＤＮＡの同定に依存している。適当な
アッセイによるｍＲＮＡの同定の後、相補的ＤＮＡ（ｃ
ＤＮＡ）を調製することができる。

【００１０】このｃＤＮＡを適当なベクターに導入する
ことができ、得られたハイブリドベクターによる適当な
宿主の形質転換の後、形質転換された宿主の選択及び培
養がポリペプチドの生産及び最終的に単離を可能にす
る。目的のポリペプチドをコードするｃＤＮＡの単離及
び配列決定がポリペプチドのアミノ酸配列の決定を可能
にする。ｃＤＮＡ又はその部分を用いて目的のポリペプ
チドをコードする他のヌクレオチド配列について天然の
ｍＲＮＡ又はＤＮＡゲノムをスクリーニングすることが
できる。

【００１１】従って、本発明においては、ＩｇＥ−ＢＦ
の構造が知られていないため、第一の目的はヒトＢ−細
胞の分画されたｍＲＮＡによりアフリカツメガエル〔キ
セノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓｌａｅｖｉ
ｓ）〕の卵を形質転換することにより目的ポリペプチド
をコードするヒトＢ−細胞のｍＲＮＡを同定し、そして
この目的ｍＲＮＡを含有するクローンを前記のモノクロ
ーナル抗体を用いるアッセイによって決定することであ
った。他の目的は、ｃＤＮＡ及びハイブリドベクターを
調製し、適当な宿主を形質転換し、そして最後に該宿主
を培養しそして目的ポリペプチドを単離することであっ
た。ポリペプチドの発現の後に翻訳後修飾が起こり得る
ため、単離されたポリペプチドは必ずしも天然ポリペプ
チドと同じではない。

【００１２】

【発明の目的】本発明の対象は、ヒトＢ−細胞のＩｇＥ
−ＢＦに関連するポリペプチドをコードする遺伝子系に
関する。

【００１３】

【発明の具体的な記載】本発明のポリペプチド本発明は、次の式（Ｉ）：

【００１４】

【化９】

【００１５】で表わされるアミノ酸配列を有するポリペ
プチド、並びに該ポリペプチドの断片、変異体及び誘導
体に関する。式（Ｉ）中の単一文字は次の天然Ｌ−アミ
ノ酸を示す：（Ａ）アラニン、（Ｃ）システイン、
（Ｄ）アスパラギン酸、（Ｅ）グルタミン酸、（Ｆ）フ
ェニルアラニン、（Ｇ）グリシン、（Ｈ）（ヒスチジ
ン）、（Ｉ）イソロイシン、（Ｋ）リジン、（Ｌ）ロイ
シン、（Ｍ）メチオニン、（Ｎ）アスパラギン、（Ｐ）
プロリン、（Ｑ）グルタミン、（Ｒ）アルギニン、
（Ｓ）セリン、（Ｔ）スレオニン、（Ｖ）バリン、
（Ｗ）トリプトファン、（Ｙ）チロシン。

【００１６】式（Ｉ）のポリペプチド、並びに該ポリペ
プチドの断片、変異体及び誘導体は“この発明のポリペ
プチド”なる単一表現のもとにグループ化される。これ
らはヒトＢ−細胞上のＩｇＥリセプターに関連し、そし
て膜係留配列（ｍｅｍｂｒａｎｅａｎｃｈｏｒｉｎｇ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が無い場合には前記のＳａｒｆａ
ｔｉ等のＩｇＥ−ＢＦに関連する。

【００１７】この発明のポリペプチドの断片は式（Ｉ）
の完全ポリペプチドの部分であって、式（Ｉ）の対応す
る配列中の１０個以上で３２０個以下の連続するアミノ
酸を有する。この様な断片は例えば、第一アミノ酸又は
Ｎ−末端から始まって約１３３個以下のアミノ酸が欠け
ている式（Ｉ）のポリペプチドである。この欠けたＮ−
末端はこのポリペプチドをＢ−細胞の細胞質膜に結合せ
しめる膜係留配列である。他の断片は、Ｎ−末端とＣ−
末端との間のアミノ酸、例えばおよそ１１０−１３０の
アミノ酸、又はＣ−末端のアミノ酸、例えばおよそ２５
０−３２１のアミノ酸が欠けている式（Ｉ）のポリペプ
チドである。

【００１８】この発明は特に、アミノ酸１０６−１２７
を含んで成るアミノ酸配列が欠けていること、あるいは
アミノ酸１２０，１２１，１２２，１２３，１２４，１
２５，１２６，１２７，１２８，１２９，１３０，１３
１，１３２，１３３，１３４，１３５，１３６，１３
７，１３８，１３９，１４０，１４１，１４２，１４
３，１４４，１４５，１４６，１４７，１４８，１４
９，１５０，１５１，１５２，１５３，１５４，１５
５，１５６，１５７，１５８，１５９又は１６０のいず
れかから始まりそして２８２と３２１の間のアミノ酸の
いずれか１つ、好ましくは３２１において終るポリペプ
チドから成る群から選択されることを特徴とする式
（Ｉ）のポリペプチドの断片に関する。

【００１９】式（Ｉ）のポリペプチドの好ましい断片は
アミノ酸１１９からアミノ酸３２１までのアミノ酸配列
から成ることを特徴とする。式（Ｉ）のポリペプチドの
他の好ましい断片はアミノ酸１３４からアミノ酸３２１
までのアミノ酸配列から成ることを特徴とする。式
（Ｉ）のポリペプチドの他の好ましい断片はアミノ酸１
４８又は１５０からアミノ酸３２１までのアミノ酸配列
から成ることを特徴とする。これら２種類の断片はＲＰ
ＭＩ８８６６細胞の上清に見出すことができ、そしてそ
れ故に天然のＩｇＥ−ＢＦに相当する。

【００２０】これらの断片は、特にＥ．コリでの発現に
よって得られる場合、Ｎ−末端に付加されたメチオニン
を有することができる。この発明のポリペプチドの変異
体は、その１個（点変異）又は複数個であっておよそ１
０個までのアミノ酸の１個又は複数個の他のアミノ酸に
対する交換により特徴付けられる。これらは異るコドン
を導くＤＮＡレベルでの対応する変異の結果である。

【００２１】この発明のポリペプチドの誘導体は、官能
基、例えばアミノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基又
はカルボキシル基が誘導体化、例えばそれぞれグリコシ
ル化、アシル化、アミド化又はエステル化されているも
のである。グリコシル化誘導体においては、オリゴサッ
カライドが通常、アスパラギン、セリン、スレオニン及
び／又はリジンに連結されている。アシル化誘導体は特
に、天然有機酸又は無機酸、例えば酢酸、リン酸又は硫
酸によりアシル化されており、このアシル化は通常、そ
れぞれ、Ｎ−末端アミノ基、又は特にチロシンもしくは
セリンのヒドロキシ基において生ずる。エステルは天然
アルコール、例えばメタノール又はエタノールのエステ
ルである。

【００２２】他の誘導体は塩、特に医薬として許容され
る塩、例えば金属塩、例えばアルカリ金属塩又はアルカ
リ土類金属塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩、マグ
ネシウム塩、カルシウム塩又は亜鉛塩、あるいはアンモ
ニア又は適当な有機アミン、例えば低級アルキルアミ
ン、例えばトリエチルアミン、ヒドロキシ低級アルキル
アミン、例えば２−ヒドロキシエチルアミン等により形
成されるアンモニウム塩である。

【００２３】式（Ｉ）のポリペプチドは、ロゼット阻害
アッセイ、及びＩｇＥ−ＢＦに特異的なモノクローナル
抗体、例えばＭａｂ−１３５及びＭａｂ−１７６への結
合によって証明することができるように、ＩｇＥ−結合
活性を有する。断片、変異体及び誘導体の内ＩｇＥ−結
合活性を有するものが好ましい。この発明のポリペプチ
ドは組換ＤＮＡ技法により製造され、この技法はこのよ
うなポリペプチドをコードするｍＲＮＡの特定、ＤＮＡ
又はｃＤＮＡの調製、ｃＤＮＡハイブリドベクターの造
成、該ベクターの発現を許容する宿主細胞の形質転換、
及び前記ポリペプチドの単離を含んで成る。

【００２４】従って、この発明はさらに式（Ｉ）のポリ
ペプチド、並びに該ポリペプチドの断片、変異体又は誘
導体の製造方法に関し、この方法は、ａ）式（Ｉ）のポリペプチド又は該ポリペプチドの断片
もしくは変異体をコードするＤＮＡ配列を含んで成るハ
イブリドベクターを含有する形質転換された宿主を培養
し；又はｂ）式（Ｉ）のポリペプチド又は該ポリペプチドの断片
もしくは変異体をコードするｍＲＮＡを適当な翻訳系に
おいて翻訳し；そして必要であれば、式（Ｉ）のポリペ
プチド又はその断片もしくは変異体をそれらの誘導体に
転換する；ことを特徴とする。

【００２５】ａ）形質転換細胞は原核細胞又は真核細
胞、例えば細菌、真菌、例えば酵母、又は高等細胞、例
えばヒト−セルラインから選択される。Ｅ．コリの菌
株、例えばＥ．コリＨＢ１０１，ＢＺ２３４又はＢ１
４７２、使用可能なＳ．セレビシエー（Ｓ．ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）の株、例えばＲＨ９７１であって、この発
明のポリペプチドをコードしそして適当なプロモータ
ー、エンハンサー、マーカー、シグナル配列等を含有す
るハイブリドベクターにより形質転換されるものであ
る。形質転換された宿主細胞は、当業界において知られ
ている方法により、通常は資化性炭素源及び窒素源並び
に所望により適当な増殖因子を含有する液体培地中で培
養される。

【００２６】形質転換された原核微生物及び真核微生物
の増殖のため種々の炭素源を使用することができる。好
ましい炭素源の例として資化性炭水化物、例えばグルコ
ース、マルトース、マンニトールもしくはラクトース又
は酢酸塩が挙げられ、これらはそれ自体として又は適当
な混合物として使用することができる。好ましい窒素源
の例としてアミノ酸、蛋白質、例えばトリプトン、ペプ
トン又は肉エキス、酵母エキス、マルトエキス、そして
さらにアンモニウム塩、例えば塩化アンモニウム又は硝
酸アンモニウムが挙げられ、これらはそれ自体として、
又は適当な混合物として使用することができる。

【００２７】培地はさらに微量要素、例えばＫ⁺，Ｃａ
⁺⁺，Ｍｇ⁺⁺，Ｆｅ⁺⁺，Ｍｇ⁺⁺，Ｚｎ ⁺⁺，Ｃｕ⁺⁺，ＮＯ₃
^-，ＳＯ₄ ^--，ＨＰＯ₄ ^--，Ｈ₂ＰＯ₄ ^-，Ｃｌ^-，Ｂ
Ｏ₃ ^---及びＭｏＯ₄ ^--を含有する。さらに、選択圧を
提供しそして発現ベクターを失った宿主の増殖を防止す
る物質を添加するのが好ましい。すなわち、例えば、ハ
イブリド発現ベクターがａｍｐ^R遺伝子を含有する場合
にはアンピシリンが培地に添加される。抗生物質の添加
はまた、抗生物質感受性の汚染微生物が生存できないと
いう効果を有する。宿主生物として例えば必須アミノ酸
について栄養要求性の酵母株が使用される場合、プラス
ミドは好ましくは宿主の欠損を補完する酵素をコードす
る遺伝子を含有する。酵母株の培養は前記アミノ酸を欠
く最少培地において行われる。

【００２８】動物細胞は、ほとんどの場合哺乳類の血清
が補充された市販の培地（例えばギブコ、フローラボラ
トリーズ）を用いて組織培養条件下で増殖する。細胞は
固体支持体、例えばローラーボトル、ミクロキャリャ
ー、又は多孔性ガラスフィルターに付着した状態で、あ
るいは適当な容器中での自由浮遊細胞として大量に増殖
する。培養は当業界において知られている方法により行
われる。培養条件、例えば温度、培地のpH及び発酵時間
は、この発明のポリペプチドの最高力価が得られる様に
選択される。すなわち、Ｅ．コリ又は酵母株は、好気的
条件下で、振とう又は攪拌を伴う液中培養として、約２
０℃〜４０℃、好ましくは約３０℃の温度において、そ
して４〜６、好ましくは約７のpHにおいて、約４〜３０
時間、好ましくはこの発明のポリペプチドの最大収量が
達成されるまで培養される。

【００２９】ｂ）この発明のポリペプチドをコードする
ｍＲＮＡは、適当な翻訳系、例えばアフリカツメガエル
（Ｘｅｎｏｐｕｓｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞中で翻訳
されそして発現され得る。この発明のポリペプチドをコ
ードするｍＲＮＡを雌性カエル（Ｘｅｎｏｐｕｓｌａ
ｅｖｉｓ）の卵母細胞に微量注入する。形質転換された
卵母細胞を、ＦＣＳが補充されたＢａｒｔｈ溶液中で約
２０℃にて約４５時間インキュベートする。インキュベ
ーション培地を除去した後、卵母細胞を卵母細胞溶解緩
衝液中でホモジナイズしそして遠心する。モノクローナ
ル抗体を用いるＲＩＡアッセイにより示されるように、
上清はこの発明のポリペプチドを含有する。この発明の
ポリペプチドを製造するためのこの方法は、主として同
定目的のために有用である。

【００３０】この発明のポリペプチドのレベルが最高に
達した時、培養を中断し、そしてポリペプチドを単離す
ることができる。ポリペプチドが適切なシグナルペプチ
ド配列と融合している場合、このものは細胞により直接
上清に分泌される。その他の場合には、細胞をＳＤＳ又
はトリトンのごとき洗剤で処理することにより破壊する
か、又はリゾチーム又は同様に作用する酵素により細胞
溶解しなければならない。宿主微生物として酵母を使用
する場合、グルコシダーゼによる酵素的消化によって細
胞壁を除去することができる。この方法に代えて、又は
この方法に加えて、機械的力、例えば剪断力（例えばＸ
−プレス、フレンチプラス、ダイノミルによる）、又は
ガラスビーズもしくは酸化アルミニウムとの振とう、あ
るいは例えば液体窒素中での凍結と解凍との反復、さら
には超音波を使用して細胞を破壊することができる。

【００３１】この発明のポリペプチドを含有する、細胞
上清又は細胞の破壊の後に得られた混合物を、当業界に
おいてよく知られている方法、特にポリエチレンイミン
処理、遠心分離、及び塩、例えば硫酸アンモニウム又は
亜鉛塩による沈澱によって濃縮することができる。追加
の精製段階は例えば超遠心分離、ダイアフィルトレーシ
ョン、ゲル電気泳動、クロマトグラフ法、例えばイオン
交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィ
ー、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相Ｈ
ＰＬＣ、ファスト・プレッシャー・液体クロマトグラフ
ィー（ＦＰＬＣ）等、適当なゲル濾過カラムによる分子
サイズに従う混合物の成分の分離、透析、アフィニティ
ークロマトグラフィー、例えば抗体、物にモノクローナ
ル抗体、特にＭａｂ−１３５及びＭａｂ−１７９を用い
るアフィニティークロマトグラフィー、並びに当業界に
おいて知られている他の方法である。

【００３２】好ましい態様においては、この発明のポリ
ペプチドは、モノクローナル抗体アフィゲル（ａｆｆｉ
ｇｅｌ）、例えばＭａｂ−４５−アフィゲルを通して細
胞上清を濾過し、結合したＩｇＥ−ＢＦポリペプチド
を、例えばpH２．６の０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝液
により溶出し、目的ポリペプチドを含有する画分を陰イ
オン交換カラム、例えばシンクロパック（ＳｙｎＣｈｒ
ｏｐａｋ）ＡＸ３００に負荷し、カラムを例えばＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ緩衝液（pH７．４）により洗浄し、蛋白質を
例えば塩化ナトリウム溶液、例えば１ＭＮａＣｌによ
り溶出し、目的ポリペプチドを含有する画分を透析しそ
して凍結乾燥し、透析された画分を逆相クロマトグラフ
ィー、例えばシンクロパックＲＰ−４カラム上に負荷
し、そして目的ポリペプチドを例えばアセトニトリル／
０．１％ＴＦＡグラジエントにより溶出することによ
り、細胞上清から単離される。

【００３３】この方法は特に、ＲＰＭＩ８８６６細胞上
清から天然ＩｇＥ−ＢＦを精製するために特に適当であ
る。この方法により精製された天然ＩｇＥ−ＢＦはアミ
ノ酸配列決定法のために十分な純度を有し、そしてこの
配列決定により、これが次のＮ−末端アミノ酸配列：

【００３４】

【化１０】を有する２種類の蛋白質から成ることが明らかになっ
た。

【００３５】上記の番号は式（Ｉ）の番号に対応する。
Ｘで示されるアミノ酸は決定されなかったが、式（II）
又は（III)のＤＮＡ配列との比較により次の様に帰属さ
せることができる：Ｘ₁₄₉＝Ｒ，Ｘ₁₅₁＝Ｅ，Ｘ₁₅₅＝
Ｓ，Ｘ₁₆₀＝Ｃ，Ｘ₁₆₃＝Ｃ。この分析により天然Ｉｇ
Ｅ−ＢＦは少なくとも２つのポリペプチド、すなわちＬ
₁₄₈からＳ₃₂₁に伸びるアミノ酸配列を有するもの及び
Ｍ₁₅₀からＳ₃₂₁に伸びるアミノ酸配列を有するもの
〔式（Ｉ）において〕が約４０：６０の比率で存在する
という結論が可能とする。

【００３６】最後に、単離された蛋白質のＩｇＥ−結合
活性は当業界においてよく知られた方法、例えばロゼッ
ト阻害アッセイ、抗−ＩｇＥ抗体へのＩｇＥ−結合のブ
ロック、アフィニティークロマトグラフィー実験、及び
アレルギー個体からのリンパ球によるインビトロＩｇＥ
合成の進行の抑制の測定実験により決定することができ
る。正しい配列を有するがしかし三次元的折りたたみが
誤っているこの発明のポリペプチドは再生実験における
中間体として有用である。この発明はまた、この発明の
方法により製造される式（Ｉ）のポリペプチド又はその
断片、変異体もしくは誘導体に関する。

【００３７】形質転換された宿主の調製この発明はさらに、この発明のポリペプチドを発現する
ことができる形質転換された宿主の多段階製造方法に関
し、この方法は、１）式（Ｉ）のポリペプチド又はその断片、変異体もし
くは誘導体をコードするＤＮＡを調製し；２）得られたＤＮＡを適当なベクターに導入し；３）得られたハイブリドベクターにより適当な宿主を形
質転換し；４）未形質転換宿主から形質転換された宿主を選択し；
そして場合によっては、形質転換された宿主からハイブ
リドベクターを単離し、該ハイブリドベクターのコード
領域又は非コード領域を変形し、そして段階３及び４を
再度行う；ことを特徴とする。宿主の調製に使用される
段階は後でさらに詳細に記載する。この発明はまた単一
の段階にも関する。

【００３８】１．この発明のポリペプチドをコードする
ＤＮＡの調製この発明は式（Ｉ）のポリペプチド、又はその断片、変
異体もしくは誘導体をコードするＤＮＡ、及びその製造
方法に関する。この発明のポリペプチドをコードするＤ
ＮＡは、ａ）単離されたｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写す
るか、ｂ）ゲノムＤＮＡを単離するか、又はｃ）化学合
成する、ことにより得ることができる。この発明におい
ては、ＤＮＡの構造が未知であったので、ＤＮＡをゲノ
ムＤＮＡから、又はｍＲＮＡを介してｃＤＮＡライブラ
リーから得なければならなかった。ｃＤＮＡライブラリ
ーは細胞から単離されたｍＲＮＡに対して相補的な遺伝
情報を含む。

【００３９】ａ）単離されたｍＲＮＡのｃＤＮＡへの逆
転写ｃＤＮＡライブラリーを得るため、ＩｇＥ−結合活性を
発現する細胞、特にヒトＢ−細胞及びこれに由来するセ
ルラインからｍＲＮＡを単離する。このｍＲＮＡを２本
鎖ｃＤＮＡに転換する。好ましいヒトＢ−セルラインは
ＲＰＭＩ８８６６である。他の有用なＢ−セルラインは
天然Ｂ−細胞をエプスタイン−バールウイルスにより不
滅化することによって調製することができる。当業界に
おいてよく知られている標準的方法がｍＲＮＡの調製の
ために使用される。細胞膜を破壊し、そして細胞内容物
を放出せしめ、これからｍＲＮＡを単離する。

【００４０】細胞膜は好ましくは、物理的方法により、
又はＳＤＳのごとき洗剤、グアニジニウムチオシアナー
ト、一定塩濃度又は好ましくは混合によるホモジネーシ
ョンによる細胞溶解により破壊する。フェノール抽出、
エタノール沈澱、遠心分離及びクロマトグラフィー、好
ましくは幾つかの方法の組合わせの標準的方法によりｍ
ＲＮＡを単離する。遠心分離は好ましくはグラジエン
ト、例えばＣｓＣｌグラジエント上で行う。クロマトグ
ラフィーのため、好ましくはカラム、特にオリゴ−ｄＴ
カラムを使用する。

【００４１】従来技術の方法に従って、全ｍＲＮＡを直
接ｄｓ−ｃＤＮＡに転換することができる。好ましく
は、幾つかの技法、例えば電気泳動、クロマトグラフィ
ー及び遠心分離、好ましくはシュークロースグラジエン
ト遠心分離を用いて、この発明のポリペプチドをコード
するｍＲＮＡをさらに濃縮する。この発明のポリペプチ
ドをコードするｍＲＮＡを含有する画分を、幾つかの方
法、例えばインビボ又はインビトロ翻訳とこれに続くＩ
ｇＥ−結合因子活性の検出により、あるいはヌクレオチ
ド配列が知られている場合にはオリゴヌクレオチドプロ
ーブとのハイブリダイゼーションにより検出することが
できる。

【００４２】インビボ翻訳系は原核系又は真核系である
ことができる。好ましいインビボ翻訳系はＭａｎｉａｔ
ｉｓ等（１）により記載されたアフリカツメガエル（Ｘ
ｅｎｏｐｕｓｌａｅｖｉｓ）卵母細胞系である。イン
ビトロ翻訳系は例えば小麦胚及びラビット網状赤血球ラ
イセート系であり、いずれも市販されている。ＩｇＥ結
合因子性のスクリーニングのための検出系においては、
好ましくは式（Ｉ）のペプチドに対するモノクローナル
抗体、特にＭａｂ−１３５又はＭａｂ−１７６を用い
る。他の可能な系においてはＩｇＥタイプの免疫グロブ
リンを常用のイムノアッセイにおいて使用する。

【００４３】未分画の又は分画されたｍＲＮＡ由来のｍ
ＲＮＡのプールから、当業界において良く知られている
方法によりｄｓ−ｃＤＮＡを得ることができる。好まし
い一般的方法がＭａｎｉａｔｉｓ等（１）、Ｏｋａｙａ
ｍａ及びＢｅｒｇ（２）、並びにＨｅｉｄｅｃｋｅｒ
（３）により記載されている。一般に、ｍＲＮＡを逆転
写酵素を使用してまずｓｓ−ｃＤＮＡに転換し、そして
次に逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏ
ｗ断片）を用いて２本鎖ｃＤＮＡに転換する。この発明
においては、この方法は好ましくはＭａｎｉａｔｉｓ等
（１）により記載された方法に従って行う。ｄｓ−ｃＤ
ＮＡの合成をプライムするために２つの方法のいずれか
を使用することができる。１つの方法においてはｓｓ−
ｃＤＮＡの天然ループ形成を用いる。第二の方法はｓｓ
−ｃＤＮＡをホモポリマーテイル、例えばポリ−ｄＣ又
はポリ−ｄＴによりテイル形成することにより行う。

【００４４】その対応するポリペプチドが検出系におい
て最高の活性を示すｍＲＮＡ画分を当業界においてよく
知られている方法により相補的ｃＤＮＡに転写する。ｍ
ＲＮＡ及びプライマーとしてのオリゴ−ｄＴを混合す
る。次に、ｄＮＴＰを出発物質として添加し、そしてｃ
ＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリド分子の合成を逆転写酵素に
より実現する。ＲＮＡ分子をＮａＯＨの添加により分解
する。ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはＤＮＡポリメラ
ーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片を混合し、そしてこの混合物
を適当な温度、例えば１２℃〜１５℃においてインキュ
ベートする。この混合物をヌクレアーゼＳ１と共にイン
キュベートし、そしてこの発明のポリペプチドをコード
するｍＲＮＡに対応するｄｓ−ｃＤＮＡを得る。

【００４５】増幅及び構造の解明のため、得られたｄｓ
−ｃＤＮＡを適当なベクター、例えばプラスミドｐＵＣ
−ＫＯに連結し、そして得られたハイブリドベクター
を、後でさらに詳細に記載するように、適当な宿主、例
えばＥ．コリＨＢ１０１を用いて複製する。ハイブリ
ドベクターの再単離、及び挿入されたｃＤＮＡの回収に
より、この発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの構
造決定が可能となる。得られたハイブリドベクターｐＣ
Ｌ−２及びｐＣＬ−１はそれぞれ式（II）及び式（III)
の挿入部を含有する。ｐＣＬ−２のｃＤＮＡ挿入部は次
の式（II）：

【００４６】

【化１１】

【００４７】

【化１２】

【００４８】

【化１３】

【００４９】

【化１４】

【００５０】で表わされる配列を有する。式（II）のＤ
ＮＡ配列中、式（Ｉ）のポリペプチドをコードする領域
がアミノ酸記号により標示されている。非コードフラン
キング領域もまた、単離されたｍＲＮＡの非コード領域
である。制限部位が、

【００５１】

【化１５】で示されている。

【００５２】ｍＲＮＡから得られた他のｃＤＮＡは式
（III)の配列を有し、この場合、式（Ｉ）のポリペプチ
ドのアミノ酸１０６−１２７をコードするヌクレオチ
ド、すなわち式（II）のヌクレオチド３１６−３７８が
欠失しており、そして他のコード領域及び２つのフラン
キング配列の部分が式（II）のＤＮＡ配列と同一であ
る。このｃＤＮＡ挿入部はｐＣＬ−１中に見出され、そ
して次の式（III)：

【００５３】

【化１６】

【００５４】

【化１７】

【００５５】

【化１８】

【００５６】

【化１９】により表わされる配列を有する。

【００５７】ｂ）ゲノムＤＮＡの単離この発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを得るため
の他の適当な方法は組織又は細胞培養のゲノムＤＮＡか
ら前記ＤＮＡを単離することから成る。細胞を好ましく
はＳＤＳ及びプロテイナーゼＫを用いて溶解し、そして
フェノールによる抽出を反復してＤＮＡの脱蛋白質を行
う。ＲＮＡを好ましくはＲＮＡアーゼにより消化する。
得られた原料ＤＮＡを適当な制限酵素例えばＨａｅIII
及びＡｌｕＩにより部分消化し、そして１５〜２０kbの
断片を単離し、そして適当なファージ又はコスミド、例
えばシャロン４Ａ又はＥＭＢＬ−３ファージ中で増幅
し、そして目的の配列について例えば放射能標識された
ＤＮＡプローブにより、又は前記の他の方法によりアッ
セイする。

【００５８】ｃ）ＤＮＡの化学合成この発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの第三の調
製方法は化学合成である。ＤＮＡの化学合成はＳ．Ａ．
Ｍａｒａｎｇ（４）により要約されている。既知の合成
法が４０又は６０塩基までのポリヌクレオチドの良好な
収量、高純度、且つ比較的短時間での調製を可能にす
る。適切に保護されたヌクレオチドをＫ．Ｌ．Ａｇａｒ
ｗａｌ等（５）のホスホジエステル法、Ｃ．Ｂ．Ｒｅｅ
ｓｍ（６）のホスホトリエステル法、又はＲ．Ｌ．Ｌｅ
ｔｓｉｎｇｅｒ等（６ａ）のホスファイトトリエステル
法により連結する。オリゴヌクレオチド及びポリヌクレ
オチドの合成の単純化が固相法により可能であり、この
方法においては核酸鎖が適当なポリマーに結合される。
ＤＮＡ合成機を使用するのが有利である。

【００５９】実際の２本鎖ＤＮＡは、化学合成された短
かいがしかしオーバーラップするセグメントから酵素的
に構成することができる。例えば、Ｋｈｏｒａｎａ等
（７）によれば、両ＤＮＡ鎖からのオーバーラップする
ポリヌクレオチドが使用され、これらが塩基対合によっ
て正しい配置に維持され、そして次にＤＮＡリガーゼ酵
素により化学的に連結される。

【００６０】他の可能性は、各場合において２本のＤＮ
Ａ鎖からの１つのポリヌクレオチド配列を、ＤＮＡ−ポ
リメラーゼ、例えばＤＮＡ−ポリメラーゼＩ、ポリメラ
ーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片もしくはＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼ又は逆転写酵素と共に４種類の必要なデオキシヌク
レオシドトリホスフェートの存在下で、短いオーバーラ
ップするセグメントと共にインキュベートする。これに
よって２本のポリヌクレオチド配列が塩基対合によって
正しい配置に維持され、そして必要なヌクレオチドが酵
素により補充されて完全な２本鎖ＤＮＡが得られる
〔Ｓ．Ａ．Ｎａｒａｎｇ等（８）〕。

【００６１】ｄ）式（Ｉ）のポリペプチドの断片をコー
ドするＤＮＡの調製式（Ｉ）のポリペプチドの断片をコードするＤＮＡは、
式（II）もしくは式（III)のＤＮＡ又はこれを含有する
ベクターを適当な制限酵素及び／又は適当なエキソヌク
レアーゼで消化し、そして必要な場合には得られたＤＮ
Ａ断片に化学的方法で合成されたＤＮＡ断片を補充し、
あるいは所望の断片を全体として化学合成することによ
り得られる。

【００６２】適当な制限酵素及びその制限部位は式（I
I）に示されている。式（Ｉ）のポリペプチド配列Ｄ
₁₁₉−Ｓ₃₂₁をコードするＤＮＡ断片の調製のため、Ｂ
ｇｌII及びＢｓａＩが適当である。ポリペプチド配列Ａ
₁₃₄−Ｓ₃₂₁をコードするＤＮＡ断片はＨｉｎｄIII 及
びＲｓａＩ〔式（II）、図４を参照のこと〕で制限酵素
処理することにより得られる。ＤＮＡ断片の調製はまた
段階的に達成することができ、この場合まずより大きな
ＤＮＡ断片を例えばＨｉｎｃII及びＲｓａＩによる制限
酵素処理により調製し、これを適当なベクターにサブク
ローニングし、次にこれをそれぞれＢｇｌII及びＢａｍ
ＨＩ、又はＨｉｎｄIII により切断する（図３及び図４
を参照のこと）。

【００６３】部分的又は全体的化学合成と制限酵素及び
／又はエキソヌクレアーゼの使用との組み合わせが、式
（II）に含まれる所望のＤＮＡ断片の調製を可能にす
る。この発明はまた、式（II）のＤＮＡの他のＤＮＡ断
片に関する。これらの断片はＩｇＥ−結合活性を有する
ポリペプチドをコードしており、又は天然もしくは合成
に由来する前記のようなＤＮＡを同定するためのプロー
ブとして使用することができる。好ましいＤＮＡ断片は
式（Ｉ）に含まれ好ましいポリペプチド断片をコードす
るものである。ＤＮＡプローブは７個以上、好ましくは
約１５個以上のヌクレオチドの配列を有する。

【００６４】２．ハイブリドベクターの調製この発明のハイブリドベクターは、式（Ｉ）のポリペプ
チド又はその断片、変異体もしくは誘導体をコードする
ＤＮＡを適当なベクターに連結することにより調製され
る。適当なベクターは組み込まれたパッセンジャーＤＮ
Ａのためのキャリャーであって宿主微生物例えばヒト細
胞を形質転換するために使用することができるものであ
り、そして宿主内で複成することができるものである。
プラスミド、ファージ又はコスミドがベクターとして適
当である。適当なベクターは定められた位置にＤＮＡ挿
入部を担持する。

【００６５】一般に、この様なベクターはレプリコン及
び制御配列、すなわちプロモーターを含有し、これら
は、これらが使用される宿主細胞と適合性の種に由来す
る。ベクターは通常、レプリコン部位、及び形質転換さ
れた細胞の表現型選択を行うことができる配列（マーカ
ー遺伝子）を担持する。適当なマーカーは宿主に抗生物
質耐性又は重金属耐性を付与し、又は宿主の遺伝的欠損
を補完する。この様なベクター中の他の有用な配列はエ
ンハンサー及びアクチベーター配列である。出発ベクタ
ーは広範囲の原核生物及び真核生物にわたる宿主細胞に
おいて使用するために適当なものである。ベクターは形
質転換に使用される宿主細胞に依存して選択される。

【００６６】好ましい出発ベクターは当業界において入
手可能なプラスミドＤＮＡ及びバクテリアファージＤＮ
Ａである。特に、プラスミドｐＢＲ３２２及びその誘導
体が有用である。この様な誘導体は例えばプラスミドｐ
ＵＣ−８，ｐＵＣ−９，ｐＭＣ−９，ｐＧＥＭ^TM−１及
びｐＧＥＭ^TM−２である。バクテリオファージベクター
の内λファージのＤＮＡ、例えばλファージｇｔ−１１
のＤＮＡが好ましい。他の好ましいファージベクターは
シャロン４Ａ及びＥＭＢＬ−３ファージである。λクロ
ーニング系はＭａｎｉａｔｉｓ等（１）により記載され
ている。例えば式（II）又は（III)のパッセンジャーＤ
ＮＡを担持するベクターはハイブリドベクターと称され
る。

【００６７】得られたＤＮＡを常法により出発ベクター
に連結する。出発プラスミドはまず適当な制限酵素によ
り線状化する。例えばプラスミドｐＵＣ−ＫＯはＰｓｔ
Ｉにより線状化する。次にｄＧＴＰ及びターミナルデオ
キシヌクレオチジルトランスフェラーゼの存在下でｄＧ
テイルを付与する。２本鎖ｃＤＮＡ挿入部にｄＣＴＰ及
びターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラー
ゼの存在下でｄＣ−テイルを付与する。ｃＤＮＡ及びベ
クターの両者を一緒にしてハイブリドベクターを得る。
バクテリオファージ、例えばラムダ（λ）はゲノムライ
ブラリーを造成するために好ましい。

【００６８】λクローニング系はＭａｎｉａｔｉｓ等
（１）により記載されている。適当なベクターＤＮＡを
適当な制限酵素により完全消化して、そして速度勾配遠
心又はゲル電気泳動により中央断片からレフトアーム及
びライトアームを分離する。他の方法においてはレフト
アーム及びライトアーム内に認識部位を有しない制限酵
素により原料断片の部分を消化する。単離されたゲノム
ＤＮＡを１５〜２０kbの長さの断片に部分消化する。こ
の後、アームの末端と適合する末端を有する外来ＤＮＡ
の断片とアームとを連結する。

【００６９】適当なＤＮＡ挿入部をもとのクローニング
のために使用したもとのベクターから適当な発現ベクタ
ーにレクローニングする。この目的のため、適切な制限
酵素（図３及び図４）を最終的にはエキソヌクレアー
ゼ、特にＢａｌ３１と組み合わせて使用して所望のＤＮ
Ａ断片を生じさせる。これらの断片を、平滑末端を直接
使用することにより、又は適当な化学合成されたオリゴ
ヌクレオチド架橋の付加により、適当な発現ベクターに
組み込む。末端の変形のため、例えばＨｉｎｄIII 及び
ＢｇｌIIを使用することができる。この方法はこれらの
特定の制限酵素に限定されない。化学合成されたオリゴ
ヌクレオチドと組合わせて適当な制限酵素を用いて、発
現ベクターとＤＮＡ挿入部との間の望ましい連結を行う
ことができる。

【００７０】この発明はさらにハイブリドベクターに関
し、このハイブリドベクターでは式（Ｉ）のポリペプチ
ド又はその断片、変異体もしくは誘導体をコードするＤ
ＮＡが場合によっては発現制御配列に作用可能に連結さ
れている。発現のために、適当なハイブリド発現ベクタ
ーが使用される。ハイブリド発現ベクターなる語は、Ｄ
ＮＡ配列がその発現を行うことができる他の配列、すな
わちオペレーター、エンハンサー及びプロモーター配列
に作用可能に連結されている、ベクター中に含まれるＤ
ＮＡ配列を発現することができる特定のベクターを包含
する。要約すれば、発現ベクターは機能的定義により特
徴付けられ、その中に含まれる特定のＤＮＡを発現せし
めることができる任意のＤＮＡ配列を意味する。この発
明は、当業界において知られている発現ベクターから作
ることができるすべての形態の発現ベクター、及びこの
発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ挿入部を含有す
る機能的同等物を包含することが意図される。

【００７１】幾つかの発現制御配列を遺伝子発現の制御
のために用いることができる。微生物発現ベクターは一
般にそれ自体の蛋白質の発現のために微生物宿主により
使用されるプロモーターを含有する。組換ＤＮＡ造成の
ために最も一般に使用されるプロモーターにはβ−ラク
タマーゼ及びラクトースプロモーター系〔Ｃｈａｎｇ等
（９）；Ｇｏｅｄｄｅｌ等（１０）〕、トリプトファン
（ｔｒｐ）プロモーター系〔Ｇｏｅｄｄｅｌ等（１
１）〕、又はバクテリオファージプロモーター系、例え
ばλ由来のＰ_Lプロモーターが含まれる。これらが最も
一般的に使用されるが、他の微生物プロモーターが見出
されそして使用されており、そしてこれらのヌクレオチ
ド配列に関する詳細が公表されており、当業者はこれら
をプラスミドベクターと機能的に連結することができる
〔Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ等、（１２）〕。

【００７２】原理的には、選択された宿主中で複製しそ
してこの発明のポリペプチドを発現せしめるすべての宿
主が適当である。この発明のポリペプチドの発現のため
に適当なベクターの例としてプラスミドｐＫＫ２２２−
３，ｐＤＲ７２０及びｐＰＬ−λ、又はλ−ｇｔ１１の
ごときバクテリオファージλのベクターを挙げることが
でき、いずれも市販されている（ファルマシヤ、スエー
デン；プロモか、バイオフェック、米国）。この発明の
好ましいベクターはタイプｐＩＨ−ｏｍｐＡ〔Ｃｈａｒ
ａｙｅｂ等、（１３）〕の発現及び分泌ベクター、及び
Ｐ_Lプロモーターを含有するベクターである。

【００７３】酵母における複製及び発現のために適当な
ベクターは１又は複数の、例えば２個の酵母レプリコン
開始部及び１又は複数の酵母用選択マーカーを含有す
る。酵母レプリコン開始部、例えば染色体自律複製セグ
メント（ａｒｓｌ）又は２μori を含有するハイブリド
ベクターは形質転換の後酵細胞内で染色体外に維持され
そして自律複製する。酵母のための適当なマーカー遺伝
子は特に、抗生物質耐性を宿主に付与するもの、あるい
は栄養要求性酵母変異株の場合には宿主の欠損を補完す
る遺伝子である。

【００７４】対応する遺伝子は、例えば抗生物質シクロ
ヘキシミドに対する耐性を付与し、又は栄養要求変異株
において原栄養性を提供する遺伝子、例えばＵＲＡ３，
ＬＥＵ２，ＨＩＳ３、又は特にＴＲＰＩ遺伝子である。
酵母ハイブリドベクターはさらに、好ましくは、ベクタ
ー又はその中間体の造成及びクローニングを細菌宿主中
でも行うことができるように、細菌、特にＥ．コリのレ
プリコン開始部及びマーカー遺伝子を含有することがで
きる（シャトルベクター）。酵母での発現のために適当
な発現制御配列は、例えば高度に発現される酵母遺伝子
の発現制御配列である。

【００７５】すなわち、ＴＲＰＩ遺伝子、ＡＤＨＩ又は
ＡＤＨII遺伝子、ホスファターゼ（ＰＨ０３又はＰＨ０
５）遺伝子、イソチトクローム遺伝子のそれぞれのプロ
モーター、又は解糖系に関与するプロモーター、例えば
エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）又は３−ホスホグリセレ
ートキナーゼ（ＰＧＫ）のプロモーターを使用すること
ができる。好ましいベクターは増殖条件の変化によって
ターンオン又はターンオフされ得るプロモーターを含有
する。例えば、ＰＨ０５プロモーターは、培地中の無機
リン酸イオンの濃度を上昇又は低下せしめるだけで抑制
又は抑制解除することができる。

【００７６】このような細胞のための発現ベクターは、
発現されるべき遺伝子の前に位置する多才な（ｖｅｒｓ
ａｔｉｌｅ）そして強力なエンハンサー−プロモーター
ユニットを含有する。ｃＤＮＡが発現されるべき場合、
ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位及び最後に
転写停止配列が遺伝子に付加される。哺乳類細胞におい
て使用するため、発現ベクター上の制御機能はしばしば
ウイルス材料によって提供される。例えば、一般に使用
されるエンハンサー−プロモーターユニットはシミアン
ウイルス４０（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルス、アデ
ノウイルス２、又はマウス及びヒト−サイトメガロウイ
ルスに由来する。

【００７７】特に、マウス−サイトメガロウイルスの直
接初期遺伝子（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙｇｅｎ
ｅ）のエンハンサー−プロモーターユニット、及びヒト
α−グロビンプロモーターと組合わされたＳＶ４０のエ
ンハンサーが適当である。さらに、誘導性プロモータ
ー、例えば、ヒートショック遺伝子又はメタロチオネイ
ン遺伝子由来のプロモーターも有用である。さらに、目
的遺伝子配列に通常関連しているプロモーター又は制御
配列を使用することもできる。複製開始点は、例えばＳ
Ｖ４０又は他のウイルス起因（例えばポリオーマウイル
ス、アデノウイルス、ＶＳＶ，ＳＰＶ等）の外来開始点
を含有するようにベクターを造成することにより提供さ
れ、又は宿主細胞染色体複製機構により提供される。ベ
クターが宿主細胞染色体に組込まれる場合、後者の方法
が一層効果的である。

【００７８】クローン化されたＤＮＡ挿入部を含有する
ベクターＤＮＡの宿主からの再単離を常法に従って、特
に宿主細胞の溶解、並びに遠心分離、特にＣｓＣｌ密度
遠心分離及びフェノール／クロロホルムによるＤＮＡの
精製により達成される。この発明はまた、式（Ｉ）のポ
リペプチド又はその断片、変異体もしくは誘導体をコー
ドするＤＮＡ配列を挿入部として含有するハイブリドベ
クターに関する。

【００７９】特に、この発明は、挿入部が、アミノ酸１
０６−１２７を含んで成るアミノ酸配列が欠けている式
（Ｉ）のポリペプチド；あるいはアミノ酸１２０，１２
１，１２２，１２３，１２４，１２５，１２６，１２
７，１２８，１２９，１３０，１３１，１３２，１３
３，１３４，１３５，１３６，１３７，１３８，１３
９，１４０，１４１，１４２，１４３，１４４，１４
５，１４６，１４７，１４８，１４９，１５０，１５
１，１５２，１５３，１５４，１５５，１５６，１５
７，１５８，１５９又は１６０のいずれかから始まりそ
してアミノ酸２８２と３２１との間のいずれかのアミノ
酸で終るポリペプチドから成る群から選択される式
（Ｉ）のポリペプチドの断片；あるいは、

【００８０】アミノ酸１１９からアミノ酸３２１までの
アミノ酸配列から成る式（Ｉ）のポリペプチドの断片；
あるいは、アミノ酸１３４からアミノ酸３２１までのア
ミノ酸配列から成る式（Ｉ）のポリペプチドの断片；あ
るいは、アミノ酸１４８からアミノ酸３２１までのアミ
ノ酸配列から成る式（Ｉ）のポリペプチドの断片；ある
いは、アミノ酸１５０からアミノ酸３２１までのアミノ
酸配列から成る式（Ｉ）のポリペプチドの断片；をコー
ドしていることを特徴とする、式（Ｉ）のポリペプチド
の断片をコードしているＤＮＡ配列を挿入部として含ん
で成るハイブリドベクターに関する。

【００８１】特に、この発明は式（II）もしくは（III)
のＤＮＡ配列又はその断片もしくは変異体を含んで成る
ハイブリドベクターに関する。特定のハイブリドベクタ
ーは、ｐＣＬ２，ｐＣＬ１，ｐＦＫ−１，ｐＦＫ−２，
ｐＰＬ−ＢＦ，ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＲＨ０５−ＢＦ，ｐ
ＣＡＬ５−Ｒ／ＮＤ，ｐＣＡＬ８−ＢＦ／ＮＤ及びｐＰ
Ｌ．ＰＴＩＳ−ＢＦである（図１〜図８）。この発明の
他のハイブリドベクターは、式（II）の挿入部の一部分
に１００％相同である少なくとも１５ヌクレオチドのＤ
ＮＡ配列を含んで成る。

【００８２】３．宿主の形質転換強力な発現ベクターに続き、適合性の宿主細胞が、この
発明の目的ポリペプチドの発現のために使用される。一
般に、ＤＮＡ配列のクローニング及びベクターの組立て
のためには原核生物が好ましい。組立てられたベクター
は次に適当な宿主細胞に形質転換され、この場合原核細
胞及び真核細胞を使用することができる。

【００８３】使用することができる微生物種にはＥ．コ
リ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシルス・ズブチリス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシルス・ステアロサ
ーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、及び他のエンテロバクテリアッ
セー（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例え
ばサルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ
ａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）又はセラチア・マルセセ
ン（Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓａｎｓ）、及び色
々なシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の種が
含まれる。特に、Ｅ．コリの株、例えばＥ．コリＢ，
ＨＢ１０１，ＢＺ２３４，Ｘ１７７６，Ｗ３１１０，Ｊ
Ａ２２１及びＫ１２が有用である。これらの例は言うま
でもなく限定的なものではなく例示的なものである。

【００８４】原核生物に加えて、真核微生物、例えば酵
母を使用することもできる。真核微生物の間ではサッカ
ロミセス・セレビシエー、又は通常のパン酵母が最も一
般的に使用されるが、他の多くの種も利用可能である。
サッカロミセスでの発現のため、例えばプラスミドＹＲ
ｐ７〔Ｓｔｉｎｃｈｏｍｂ等（１４）；Ｋｉｎｇｓｍａ
ｎ等（１４ａ）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ等（１５）〕を使
用することができる。

【００８５】微生物のほかに、多細胞生物由来の細胞培
養物を宿主として使用することもできる。原理的には脊
椎動物又は無脊椎動物のいずれからの任意の細胞培養物
が有効であるが、しかしながら脊椎動物の細胞培養物が
最も興味深い。この様な有用なセルラインの例としてＶ
ｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、チャイニーズハムスター卵
巣（ＣＯＨ）セルライン、Ｂｏｗｅｓメラノーマセルラ
イン、ＲＰＭＩ８８６６、及びＣｏｓ−７セルラインが
挙げられる。

【００８６】得られたハイブリドベクターＤＮＡの受容
体への形質転換は、例えばＭａｎｉａｔｉｓ等（１）に
より記載されているような、当業界において良く知られ
ている方法により達成される。細菌はハイブリドベクタ
ーＤＮＡにより、例えばＣａＣｌ形質転換法により形質
転換される。ベクターとしてのλファージのＤＮＡとの
組合わせにおけるＥ．コリ宿主細菌のための他の適当な
形質転換法はハイブリドベクターＤＮＡのインビトロパ
ッケージング及び前記細菌の感染である。インビトロパ
ッケージングは主として入手可能なパッケージングキッ
ト（ファルマシァ、スエーデン；ベーリンガー、マンハ
イム）を用いることにより達成される。感染はＭａｎｉ
ａｔｉｓ（１），２７５頁、により記載されているＭｇ
Ｃｌ₂法により行われる。

【００８７】酵母の形質転換は、グルコシダーゼによる
酵母細胞壁の酵素的除去、得られたスフェロプラストの
ポリエチレングリコール及びＣａ⁺⁺イオンの存在下での
ベクターによる処理、並びに寒天へのスフェロプラスト
の包埋による細胞壁の再生を含んで成る。好ましくは、
再生寒天は再生及び形質転換された細胞の選択が同時に
可能なように調製される。

【００８８】組織培養で増殖した脊椎動物細胞の形質転
換は当業界においてよく知られている幾つかの方法の１
つを用いて達成することができる。細胞核へのＤＮＡの
直接注入、Ｅ．コリのプロトプラストと他の宿主細胞と
の融合、又はＤＮＡとリン酸カルシウムとの間の同時沈
澱物の添加を用いることができる。これに続く、形質転
換された細胞の選択は、発現ベクター中に共有結合によ
り組み込まれているか又は別個に添加される選択マーカ
ーを用いて行うことができる。選択マーカーはＧ４１８
及びハイガロマイシンのごとき抗生物質に対する耐性を
付与する遺伝子、又は宿主の遺伝的欠損、例えばチミジ
ンキナーゼ又はヒポキサンチンホスホリボシルトランス
フェラーゼの欠損を補完する遺伝子を包含する。

【００８９】４．形質転換された宿主の選択ベクターに組み込まれ選択ユニットの性質を担持する形
質転換された宿主は、形質転換された宿主のみが生存す
る適当な選択条件下で細菌を増殖せしめることにより未
形質転換宿主から選択される。バクテリオファージとの
組合わせにおける他の選択方法は、プレートされたＥ．
コリ宿主細菌上でのプラーク形成である。

【００９０】この発明のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列を挿入部として含有するハイブリドベクターを担
持する宿主のスクリーニングは、その様なポリペプチド
の断片をコードする放射能標識されたオリゴヌクレオチ
ドプローブを用いることにより、又は前記ＤＮＡ挿入部
のポリペプチド生成物についてスクリーニングすること
により達成することができる。ハイブリダイゼーション
は特に、この発明のポリペプチドの断片をコードする約
１２個又はそれより多くの連続するヌクレオチドを含有
するｍＲＮＡ又は任意のオリゴヌクレオチドプローブを
用いて行われる。

【００９１】特に、この発明のポリペプチドをコードす
る挿入部をコードするハイブリドベクターにより形質転
換されたＥ．コリ宿主の選択は、アガロースプレート上
に拡げられたｃＤＮＡライブラリーに由来するレプリカ
フィルターへのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリ
ダイゼーションにより行うことができる。オリゴヌクレ
オチドプローブは、Ｔ４−キナーゼ酵素を用いて³²Ｐ−
αＡＴＰにより５′−末端において、又はファージＭ１
３にクローン化されたこの発明のポリペプチドをコード
するｃＤＮＡの任意の断片を用いるＫｌｅｎｏｗポリメ
ラーゼによるプライム合成により内部的にラベルするこ
とができる。

【００９２】スクリーニング目的のための蛋白質生成物
はインビトロ又はインビボ翻訳、Ｍａｎｉａｔｉｓ等
（１）に記載されているように、特にアフリカツメガエ
ル（Ｘｅｎｏｐｕｓｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞系を用
いて得られる。翻訳された蛋白質生成物はモノクローナ
ル抗体、例えばＭａｂ−４５，Ｍａｂ−１７６及びＭａ
ｂ−１３５を用いることにより、あるいは機能的試験
系、例えばＳａｒｆａｔｉ等（１７）によるロゼット阻
害試験において行われるようなポリペプチドへのＩｇＥ
の結合を用いることにより出検される。

【００９３】この発明のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列を担持する組換ファージは、ハイブリダイゼーシ
ョンのために前記ポリペプチドをコードするＤＮＡの断
片を含んで成る放射能標識されたヌクレオチド配列を用
いるハイブリダイゼーションにより同定される。この方
法に代えて、これらはＭａｂ−１３５及びＭａｂ−１７
６のごときモノクローナル抗体を用いる免疫学的スクリ
ーニングにより検出される。ハイブリドベクターのコー
ド領域又は非コード領域の変形は例えば１ｄ）において
前記した方法により達成される。

【００９４】この発明はさらに、例えば花粉、ネコのフ
ケ、家庭のホコリダニ等あらゆる種類の抗原に対してア
レルギー性である患者におけるアレルギー状態の治療又
は予防のために、ＩｇＥ結合活性を有するこの発明のポ
リペプチドを使用することに関する。母乳が提供されな
い特に危険性の高い新生児を含む、危険期間中の高危険
患者の治療が特に重要であろう。

【００９５】この発明のポリペプチドは経腸的に、例え
ば鼻内に、直腸に、又は経口的に、あるいは非経口的
に、例えば筋肉内に、皮下に又は静脈内に、通常は投与
単位形として、例えば錠剤、丸剤、アンプル、バイアル
又は坐薬として適用される。投与されるべきポリペプチ
ドの量はその比活性、患者の体重及び一般的症状、疾患
の重症度、投与の態様等に依存し、そして医師の判断に
基かなければならない。一般に、体重１kg１日当り１０
０μｇ〜５０００μｇの量が投与される。この発明はさ
らに、抗アレルギー的に有効な量のＩｇＥ−結合活性を
有するこの発明のポリペプチドを、経口投与、直腸投
与、鼻内投与又は非経口投与、すなわち筋肉内投与、皮
下投与、又は腹腔内投与のために適当な医薬として許容
される常用のキャリャーと共に含んで成る医薬に関す
る。

【００９６】適当な錠剤、カプセル、固体粉末を含有す
るバイアル、又はネブライザー、スプレー、バイアル、
アンプル、及び等であって、注入溶液、好ましくは水溶
性又は懸濁液を含有する類似のものが存在し、これらは
使用前に、例えば活性成分をキャリャー、例えばマンニ
トール、グリコース、アルブミン等と共に含有する凍結
乾燥調製物から調製することができる。医薬製剤は無菌
化することができ、そして所望により助剤、例えば防腐
剤、安定剤、乳化剤、溶解剤、緩衝液、及び／又は浸透
圧調節塩を混合することができる。無菌化は小孔サイズ
（０．４５μｍ以下の直径）のフィルターを通して無菌
濾過することにより達成することができ、次に所望によ
り凍結乾燥を行うことができる。無菌性を維持するため
に抗生物質を添加することもできる。

【００９７】この発明の医薬調製物は、単位投与当り１
〜２０００mgの医薬として許容される担体、及び単位投
与当り好ましくは２〜５０mgの活性成分を含んで成る単
位投与剤、例えばアンプルに調製することができる。こ
の発明はまた、この発明のポリペプチドを医薬として許
容される担体と混合することを特許とする医薬の製造方
法に関する。この薬剤は、それ自体公知の方法により、
例えば常用の混合、溶解、凍結乾燥等の方法により製造
され、そして約０．１％〜１００％、特に約１％〜５０
％の活性物質を含有する。この発明の新規なポリペプチ
ドの、人体の予防的及び治療的処置のための使用もこの
発明の対象である。

【００９８】この明細書を通して使用される略号は次の
意味を有する。ｂｐ塩基対ＢＳＡウシ血清アルブミンｃＤＮＡ相補的ＤＮＡｃｐｍ分当りカウント（放射性崩壊）ｄＡ２′−デオキシアデノシンｄＡＴＰ２′−デオキシアデノシントリホスフェートｄＣ２′−デオキシシチジンｄＣＴＰ２′−デオキシシチジントリホスフェートｄＧ２′−デオキシグアノシンｄＧＴＰ２′−デオキシグアノシントリホスフェートｄＴ２′−デオキシチミジンｄＴＴＰ２′−デオキシチミジントリホスフェートＤＮＡデオキシリボ核酸

【００９９】ｄＮＴＰｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの混合物ｄｓ２本鎖ＤＴＴ１，４−ジチオスレイトールＥＤＴＡエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムＦＣＳウシ胎児血清ＨＡＴヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジンＨＢＳＳＨａｎｋの平衡塩溶液ＨＴヒポキサンチン／アミノプテリンＨｅｐｅｓＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸ＩｇＥ免疫グロブリンＥｍＲＮＡメッセンジャーＲＮＡｍｉｎ分

【０１００】ＰＢＳリン酸緩衝化生理的塩溶液Ｐｉｐｅｓピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸）ＰＭＳＦフェニルメチルスルホニルフルオリドＲＩＡラジオイムノアッセイＲＮＡリボ核酸ｒｐｍ分当り回転数ＳＤＳドデシル硫酸ナトリウムｓｓ単鎖Ｔｒｉｓトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンｔＲＮＡトランスファーＲＮＡ μｇマイクログラム

【０１０１】微生物の寄託プラスミドｐＣＬ−２を含有するエッセリシャ・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＨＢ１０１／ｐ
ＣＬ−２は、１９８６年７月３０日に、Ｄ−３４００ゲ
ッチンゲン・グリセバッハストラッセ８のＤｅｕｔｓｃ
ｈｅＳａｍｍｌｕｎｇｆｕｒＭｉｋｒｏ−ｏｒｇ
ａｎｉｓｍｅｎに受託番号ＤＳＭ３８０７として寄託さ
れた。次の例は、本発明を例示するものであって、限定
するものではない。

【０１０２】例次の緩衝溶液及び培地が使用される：寒天：２％寒天が補充されたＬＢ−ブイヨン。溶離緩衝液：１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，pH７．５，１
mMのＥＤＴＡ，０．２％ＳＤＳ。ＬＢ−ブロス：１％バクト−トリプトン（Ｄｉｆｃ
ｏ）、０．５％バクト酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、１７
０mMのＮａＣｌ；ＮａＯＨによりpH７．５に調整。細胞溶解溶液：０．５ＭＮａＯＨ，１．５ＮＮａＣ
ｌ。ＨＢＳＳ：水１ｌ中８ｇのＮａＣｌ，４００mgのＫＣ
ｌ、４８mgのＮａ₂ＨＰＯ₄，３５０mgのＮａＨＣ
Ｏ₃，６０mgのＫＨ₂ＰＯ₄，１００mgのフェノールレ
ッド。ＨＢＳＳ−ＦＣＳ：１０％のＦＣＳ，０．０１％Ｎａ
Ｎ₃，６６mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．２）を補充し
たＨＢＳＳ。ＨＴ−培地：２−メルカプトエタノール４０μｌ，１０
０μＭヒポキサンチン、１μＭチミジンが補充されたＲ
ＰＭＩ／Ｃ−培地。

【０１０３】ＨＡＴ−培地：１０μＭアミノプテリンが
補充されたＨＴ−培地。ＭＢＳ−Ｈ：８８mM ＮａＣｌ，１mM ＫＣｌ，０．３
３mM Ｃａ（ＮＯ₃）₂，０．４１mM ＣａＣｌ₂，０．８２
mM ＭｇＳＯ₄，２．４mM ＮａＨＣＯ₃，１０mM Ｈｅｐ
ｅｓ（pH７．４）。マッコンキー寒天：蒸溜水１ｌ当り予備混合されたマッ
コンキー寒天（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）５
０ｇ。卵母細胞溶解緩衝液：２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
７．５），５０mMＮａＣｌ，０．５％Ｔｒｉｔｏｎ×
１００，０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１
％メチオニン、１mMのＰＭＳＦ。ＰＢＳ：８ｇのＮａＣｌ，０．２ｇのＫＣｌ，１．４４
ｇのＮａ₂ＨＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ及び０．２ｇのＫＨ₂Ｐ
Ｏ₄を含む１ｌ溶液。ＲＰＭＩ１６４０−培地：Ｇｉｂｃｏから入手。

【０１０４】ＲＰＭＩ１６４０／Ｃ−培地：１％ペニシ
リン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、１％Ｌ−
グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）及び１５％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ
（Ｇｉｂｃｏ）が補充されたＲＰＭＩ１４０−培地。ＲＶＴ−緩衝液：２００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．
３，４２℃），２０mMＭｇＣｌ₂，２８０mM ＫＣｌ，
２０mM ＤＴＴ。ＳＯＣ−培地：２％バクトトリプトン（Ｇｉｂｃｏ）、
０．５％酵母エキス（Ｇｉｂｃｏ）、１０mM ＮａＣ
ｌ，２．５mM ＫＣｌ，１０mMＭｇＣｌ₂，５mM Ｍｇ
ＳＯ₄，２０mM グルコース。ＳＳＣ−緩衝液：１５mM クエン酸ナトリウム、１５０
mM ＮａＣｌ。ＴＢＥ−緩衝液：０．８ｇのＴｒｉｓ，５．５ｇの硼
酸、０．５mM ＥＤＴＡ（pH８．０）４mlを含む１ｌ溶
液。ＴＥ−緩衝液：１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．
５），１mM ＥＤＴＡ。ＴＮＥ−緩衝液：１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１mM Ｅ
ＤＴＡ，０．１ＭＮａＣｌ；ＮａＯＨによりpH７．８に調整。洗浄−緩衝液：１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．
５），１mM ＥＤＴＡ，０．５ＮａＣｌ，０．２％
ＳＤＳ。

【０１０５】制限酵素の使用及びＤＮＡの単離すべての制限酵素は、酵素データシートに基いて供給者
によって推薦されるような緩衝液条件下で使用される。
一般的に、３ユニットの酵素が、１μｇのＤＮＡを消化
するために使用される。そのインキュベーションは３７
℃で２時間維持される。酵素反応を停止するためには、
ＥＤＴＡ及び酢酸ナトリウムが、それぞれ１５mM及び２
００mMの最終濃度になるように添加される。ＤＮＡを抽
出するためにはクロロホルム：フェノールの１：１混合
物（ＴＮＴによりあらかじめ飽和された）１体積を添加
し、そしてその混合物を激しく振盪する。

【０１０６】有機相及び水性相を、５０００×ｇで５分
間（室温で）遠心分離することによって分離する。その
水性相を新しい管に移し、そしてクロロホルム１体積に
より抽出する。遠心分離した後、エタノール２．５体積
を添加することによってそのＤＮＡを沈澱せしめる。そ
のサンプルを−２０℃で少なくとも２時間インキュベー
トし、そして１００００×ｇで１０分間遠心分離にかけ
る。そのＤＮＡペレットを７０％エタノールにより１度
洗浄し、真空乾燥機により１０分間乾燥せしめ、そして
最後に適当な体積のＴＥ緩衝液中に溶解する。

【０１０７】次の株が使用される：Ｅ．コリ株ＨＢ１０１：Ｆ^-，ｈｓｄＳ２０（ｒ^-β，
ｍ^-Ｂ），ｒｅｃＡ１３，ａｒａ１４，ｐｒｏＡ２，ｌ
ａｃＹ１，ｇａｌＫ２，ｒｓｐＬ２０（Ｓｍ′），ｘｙ
ｌ−５，ｍｔｌ−１，ｓｕｐＥ４４，λ^-。（Ｂｏｙｅ
ｒ及びＲｏｕｌａｎｄ−Ｄｕｓｓｏｉｘ１９６９；Ｂ
ｏｌｉｖａｒ及びＢｅｃｋｍａｎ１９７９）。ＲＰＭＩ８８６６セルライン：ＲＰＭＩ８８６６細胞
（ＡＴＣＣ No．ＣＣＬ１０７）は、ＩｇＥのためのリ
セプターを発現するリンパ芽球様Ｂセルラインに由来す
る。この細胞系をＰ．Ｒａｌｐｈ博士（Ｓｌｏａｎ−Ｋ
ｅｔｔｅｒｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔ
ｅ，ＮＹ，ＵＳＡ）から得た。

【０１０８】次のプラスミドが使用される：ｐＵＣ−９：Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐ−ＬＢｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓＵｐｓａｌｌａ，Ｓｗｅｄｅｎから入
手できる。このｐＵＣ−９プラスミドはＰＢＲ３２２由
来のアンピシリナーゼ遺伝子及びＥ．コリのｌａｃＺ遺
伝子の一部に連結されたＤＮＡ複製の起点から成る。ユ
ニーク制限酵素認識部位を含むＤＮＡ挿入部が、このプ
ラスミドのｌａｃＺ領域に組込まれている。ｐＵＣ−ＫＯ：このプラスミドはｐＵＣ−９の誘導体で
あり、ここでｌａｃＺ遺伝子のプロモーター／オペレー
ター領域が前記プロモーター配列のちょうど外側のＨａ
ｅII制限部位とＨｉｎｄIII 制限部位との間で、ポリリ
ンカー内で削除されており、ｐＵＣ−９のプラスミドの
他の配列が未変化のまま残っている。

【０１０９】ｐＧＥＭ^TM−１：ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏ
ｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡから入手できる。この
プラスミドは、特別な転写ベクターである。これは、バ
クテリオファージのＳＰ６プロモーター含有プラスミド
ｐＳＰ６４〔Ｍｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ａ．，など．（１
６）〕及びバクテリオファージのＴ７プロモーターを用
いて構成される。この得られたプラスミドは、多数のク
ローニング部位を含むＤＮＡ短片によって分離された、
２種の相対するプロモーターＳＰ６及びＴ７を有する。

【０１１０】ｐＩＮ−III −ｏｍｐＡプラスミド：Ｇｈ
ａｒａｙｅｄなど．（１３）によって記載されている。
これらのプラスミドは、Ｅ．コリ中における特別な分泌
クローニングベクターである。該遺伝子生成物のアミノ
末端に適切なシグナルペプチドを融合することによっ
て、細胞膜を通してのクローン化された遺伝子生成物の
分泌を行うことができる。これらのプラスミドにおいて
は、ｏｍｐＡ蛋白質、すなわちＥ．コリの主要外層膜蛋
白質のシグナルペプチドをコードするＤＮＡフラグメン
トが、高レベルの発現ベクター中に挿入されている。外
来性ＤＮＡフラグメントは、前記ｏｍｐＡシグナルペプ
チドのコード配列のすぐ後のユニークＥｃｏＲＩ，Ｈｉ
ｎｄIII 又はＢａｍＨＩ部位で３種の読み枠のいづれか
１つと整合してクローン化され得る。タイプ１，２及び
３のｐＩＮ−III −ｏｍｐＡ−プラスミドは、翻訳のた
めに異なった読み枠を開始せしめる。

【０１１１】例１：ＲＰＭＩ８８６６細胞からのｍＲＮ
Ａの単離１５％ＦＣＳ，１００ユニット／mlのペニシリン及び
１００μｇ／mlのストレプトマイシンを補充しＲＰＭＩ
１６４０培地５０mlを有する組織培養フラスコ（Ｆａｌ
ｃｏｎ，１７５cm²）中でＲＰＭＩ８８６６細胞を増殖
せしめる。５０個のコンフルエントなフラスコ（およそ
１０⁸個の細胞／フラスコ）からの細胞を遠心分離によ
り集め、そしてＰＢＳ５０mlにより１度洗浄する。そ
の細胞ペレット（５ｇ）を、チオシアン酸グアニジニウ
ム１００ｇ、水１００ml，１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ１
０．６ml（pH７．５），０．５ＭＥＤＴＡ４．２m
l，２０％Ｎ−ラウリルサルコシン２１．２ml及び２
−メルカプトエタノール２．１mlから調製された溶液２
５ml中に溶解する。クロロホルム：フェノールの１：１
混合物の２体積を添加する。

【０１１２】その混合物を激しく１分間振盪し、そして
次に１０℃でＳｏｒｖａｌｌ遠心分離機により１０分
間、５０００×ｇで遠心分離する。水性相を回収し、そ
して抽出をさらに４度くり返す。２体積のエタノールを
その水性相に添加する。−２０℃で１５分間冷却し、続
いて４℃でＳｏｒｖａｌｌＳＳ３４ローターにより１
０分間１０，０００rpm で遠心分離することによって沈
澱物を回収する。このペレットを、ＴＥ緩衝液４ml中に
溶解する。加熱乾燥されたＣｓＣｌ（Ｍｅｒｃｋ）７．
５ｇ及び０．１ＮのＨＣｌ５０μｌを添加し、そして
その溶液を７．５mlに調整し、そして１２mlの遠心管中
５．７ＭＣｓＣｌのクッション２ml上に重ねる。その
管に水を満たし、そしてＴＳＴ４１ローター（Ｋｏｎｔ
ｒｏｎ）により２０℃で１６時間、２９０００rpm で遠
心分離する。

【０１１３】運転の最後で、ほとんどの上清液を除去
し、そしてその管を、手早く逆にすることによって排液
する。ガラス状のＲＮＡペレットを、１mlのＴＥ緩衝液
及び０．２％ＳＤＳ溶液中において３７℃で攪拌し、
そして時折暖める（２分間）ことによって溶解する。そ
のＲＮＡを、Ｍａｎｉａｔｉｓなど（１）（ページ４６
１〜４６２）によって記載されているようにしてエタノ
ールにより沈澱せしめる。乾燥したｍＲＮＡを溶離緩衝
液１ml中に溶解する。６８℃で２分間加熱し、そして氷
上で冷却した後、１３０mlの５ＭＮａＣｌを添加し、
そしてこの溶液を、洗浄緩衝液により平衡化されたオリ
ゴ−ｄＴセルロースの２mlカラム（５mlの注入器タイプ
７，Ｐ−ＬＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ中、２mlのベッ
ド体積）に適用する。

【０１１４】サンプルを２回続けて適用した後、そのカ
ラムを洗浄緩衝液１５mlにより洗浄し、そして結合され
たｍＲＮＡを溶離緩衝液４mlにより溶出する。溶出され
た材料を６８℃で２分間加熱し、氷上で冷却し、そして
０．４４mlの５ＭＮａＣｌを添加する。この溶液を、
再平衡化されたオリゴ−ｄＴセルロースカラムに２度適
用する。洗浄緩衝液１５mlにより洗浄した後、結合され
たｍＲＮＡを溶離緩衝液４mlにより溶離する。ｍＲＮＡ
の回収の程度を、２６０nmでの吸光度を測定することに
よって決定する（ＯＤ_260nm＝１は、４０μｇ／mlの濃
度に相当する）。ｍＲＮＡ（１５０μｇ）をエタノール
により沈澱せしめる。その沈澱物を遠心分離することに
よって集め、水０．４ml中に溶解し、そしてエタノール
により再沈澱せしめる。ｍＲＮＡのペレットを空気乾燥
し、そして０．１％ＳＤＳを補充したＴＥ緩衝液１５
０μｌ中に溶解する。

【０１１５】例２：ＩｇＥ−リセプター及びＩｇＥ−Ｂ
Ｆ関連のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの濃縮例１からのポリＡ−ｍＲＮＡ（１μｇ／μｌ）１３０μ
ｇを、７０℃で５分間加熱し、氷上で冷却し、そして
０．１ＭＮａＣｌ，１０ml Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
７．５），１ml ＥＤＴＡ及び０．５％ＳＤＳの溶液
中、５〜２０％の直線シュークロースグラジエント１２
ml上に負荷する。そのグラジエントを、２５℃でＴＳＴ
４１ローターにより５時間、４１，０００rpm で遠心
する。３０個の画分（０．４mlの体積／画分）を集め、
そして例３に記載しているようにして、キセノプス・レ
ービス（Ｘｅｎｏｐｕｓｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞中
に注入する。

【０１１６】例３：キセノプス・レービスの卵母細胞中
でのｍＲＮＡのインビボ翻訳成熟した雄及び雌のキセノプス・レービスを、種々の動
物供給業者、例えばＫ．Ｅｖａｎｓ（７１６Ｎｏｒｔ
ｈｓｉｃｄｅ，ＡｎｎＡｒｂｏｒ，ＭＩ４８１０５）
から得ることができる。このカエルを、通気しないで、
１８〜２２℃で任意の水槽で飼育することができる。牛
の肝臓及び牛の心臓の断片の定期的な供給（週二度）に
より、健康なコロニーが維持されるであろう。卵母細胞
は、健康で、成熟した雌のキセノプスから得られるべき
である。これは、エチルｍ−アミノ安息香酸の１：１０
００（ｗ／ｖ）水溶液中で１０〜３０分間、カエルに麻
酔をかけることによって容易に成し遂げられる。

【０１１７】後部腹側上での小さな切開（１cm）によ
り、カエルの卵巣に容易に接近することができる。卵巣
の切片を摘出した後、その切開部分を縫合することがで
き、そしてそのカエルを、すぐに水中にもどす。卵巣を
すぐに、改変Ｂａｒｔｈ生理的食塩水（ＭＢＳ−Ｈ）中
に置き、そして個々の卵母細胞を、白金のループにより
取り出さなければならない。十分に成長した大きな卵母
細胞に、微細マイクロピペット、マイクロメーター注射
器及び任意の標準の解剖用立体顕微鏡を用いて注入す
る。適切な注入用ピペットの構成は、Ｇｕｒｄｏｎ（１
８）によって記載されている。

【０１１８】卵母細胞を顕微鏡スライド上に置き、ペー
パータオルにより吸取り乾燥し、そして次にそのスライ
ドを顕微鏡の載物台上に置く。ピペットの挿入の前及び
挿入の間、その卵母細胞を、時計屋が使用する鋭利でな
いピンセットにより固定することができる。ピペットが
卵母細胞を貫通した後、例２のｍＲＮＡ溶液（１mg／m
l）の３０〜５０nlのアリコートをマイクロメーター注
射器を用いて供給する。

【０１１９】同じ画分のｍＲＮＡを含む４０個の卵のグ
ループを、２０℃で４５時間、６％ＦＣＳを補充したＢ
ａｒｔｈ溶液０．５ml中でインキュベートする。そのイ
ンキュベーション培地を除き、そして卵母細胞を卵母細
胞分解緩衝液９００μｌ中でホモジナイズする。そのホ
モジネートを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機により１
０分間遠心分離する。上相を回収し、そして例７に記載
しているようにして、５０μｌのアリコートをＲＩＡに
より試験する。

【０１２０】例４：ＦｃεＲに対するモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマの調製ＢＡＬＢ／ｃマウスを、４週ごとに５×１０⁷個の生存
ＲＰＭＩ８８６６細胞の腹腔内注射によって免疫感作す
る。最後の注射の２日後に集められた個々のマウスの血
清サンプルを抗−ＦｃεＲ活性について試験する。最も
高い力価を示す２匹の動物からの脾臓細胞をプールし、
そして次の日、融合のために使用する。脾臓を掻き裂
き、そして個々の融合のために、１×１０⁸個の洗浄さ
れた脾臓細胞を、２５×１０⁶個のＮＳＩ／１−Ａｇ４
／１マウス骨髄腫細胞（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ
ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
から得られた）と共に３５０×ｇで５分間ペレット化す
る。

【０１２１】その細胞ペレットを、１５％（ｖ／ｖ）ジ
メチルスルホキシドを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉ
ｂｃｏ）２８ml中に溶解されたＰＥＧ２０ｇから成る
ポリエチレングリコール溶液（ＰＥＧ−１５４０，Ｂａ
ｋｅｒ）２ml中に３秒間、穏やかに再懸濁する。ＲＲＭ
Ｉ／ｃ培地８mlを９０秒間にわたって滴下し、続いて追
加の培地５mlを急速に添加する。この細胞懸濁液を、管
に逆転することによって混合し、２．５分間静置し、そ
して３５０×ｇで５分間遠心分離する。

【０１２２】そのペレットをＲＰＭＩ／ｃ培地５ml中に
再懸濁し、そして５０μｌのアリコートを、ＨＡＴ−培
地１mlに１×１０⁶個の正常なＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞を
含む４個のＣｏｓｔａｒ＃３５９６の２４−ウェルプレ
ートのそれぞれのウェル中に計量分配する。すべての培
養物を、融合の後５日目から始まって、必要な場合数日
おきにＨＡＴ培地の交互の添加又は交換により維持す
る。１４日後、ＨＴＡをＨＴ培地で交換し、そして２８
日後ＲＰＭＩ／ｃと交換する。個々のウェル（１９２個
の培養物）の上清液を、融合の後１及び２週間で抗−Ｆ
ｃεＲ抗体についてスクリーンする。

【０１２３】目的とする抗体を産生する２１個の培養物
を限界希釈法によってクローン化する。すなわちこれら
をＲＰＭＩ／ｃ中に希釈して１０個の生存細胞／mlの濃
度にし、そしてこれらの懸濁液の５０μｌアリコート
を、ＨＩ培地１００μｌ及び１×１０⁵個の正常なＢＡ
ＬＢ／ｃ脾臓細胞を含む、９６−ウェルプレート（Ｌｉ
ｎｂｒｏ＃７６−００３−０５，ＦｌｏｗＬａｂｓ）
のウェル中に添加する。このウェルを顕微鏡により試験
し、増殖性培養物がモノクローナルであることを確認す
る。これらから採取した上清液のサンプルを抗体活性に
ついて試験し、陽性の培養物を選択し、そして大きな培
養容器中で拡張する。

【０１２４】必要な特異性を有する抗体を分泌する１４
種のモノクローナル細胞系を最終的に得る。３種のクロ
ーン、すなわち２０７．２５．Ａ．４．４／４５，２０
８．２５Ａ．４．３／１３５及び２０８．２５Ｄ．２．
１／１７６を、パリのＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＮａｔｉ
ｏｎａｌｅｄｅＣｕｌｔｕｒｅｓｄｅＭｉｃｒ
ｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓｏｆＩｎｓｔｉｔｕｔ
Ｐａｓｔｅｕｒに寄託し、そしてそれぞれ寄託番号Ｉ−
４５２，Ｉ−４２５及びＩ−４２０を得、そして本発明
において使用する。これらによって産生されたモノクロ
ーナル抗体をＭａｂ−４５，Ｍａｂ−１３５及びＭａｂ
−１７６と命名する。

【０１２５】例５：モノクローナル抗体の単離及び精製Ｂａｌｂ／ｃマウスを、プリスタン（Ａｌｄｒｉｃｈ）
０．５mlにより腹腔内前処理する。２週間後、例４の５
×１０⁶個のクローン化されたハイブリドーマ細胞を腹
腔内に注入する。８〜１０日後に腹水を集め、８００×
ｇで遠心分離し、そして−２０℃で貯蔵する。解凍され
た腹水を５０，０００×ｇで６０分間遠心分離する。表
面に浮かぶ脂肪層を注意して除去し、そして蛋白質濃度
を１０〜２０mg／mlの濃度に調整する。

【０１２６】粗免疫グロブリンを、０℃での０．９体積
の飽和硫酸アンモニウムの滴下により沈澱せしめ、次に
２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５０mM ＮａＣｌ（pH７．
９）中に溶解し、そして同じ緩衝液に対して透析する。
免疫グロブリンＧの画分を、２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
／２５〜４００mM ＮａＣｌ（pH７．９）の緩衝液グラ
ジエントシステムを用いてＤＥＡＥ−Ｄ５２セルロース
（Ｗｈａｔ−ｍａｎ）クロマトグラフィーによって得
る。

【０１２７】例６：¹²⁵Ｉによりラベルされた抗体Ｍａ
ｂ−１３５の調製Ｍａｂ−１３５（例５のＰＢＳ溶液）４０μｇを、Ｆ．
Ｃ．Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄなど．（１９）の一般的方法に
従って、０．５ｍCiの¹²⁵Ｉヨウ化ナトリウム及びクロ
ラミンＴによりヨウ素化する。ヨウ素化されたＭａｂ−
１３５−蛋白質を含む溶液を、１ｌのＰＢＳ−緩衝液に
対して４度、それぞれ６時間にわたって透析する。最終
生成物は蛋白質１μｇ当りおよそ２×１０⁷cpm の比活
性を有する。¹²⁵Ｉによりラベルされた抗体Ｍａｂ−１
７６を同じようにして調製する。

【０１２８】例７：細胞上清液及び血清中のＩｇＥ−Ｂ
Ｆの検出のためのラジオイムノアッセイ塩化ビニル製マイクロタイタープレートのウェルを、５
μｇ／mlの例５のＭａｂ−１７６を含む、０．０１Ｍ炭
酸塩緩衝液（pH９）１５０μｌと共に室温で１晩インキ
ュベートする。次に、そのプレートをＰＢＳにより１度
洗浄し、そして１０％ウシ胎児血清（ＨＢＳＳ−ＦＣ
Ｓ）を含むハンクス液２００μｌと共に室温で２時間反
応せしめ、次に再びＰＢＳにより１０度洗浄し、そして
室温で８時間、試験サンプル１００μｌと共にインキュ
ベートする。

【０１２９】ＨＢＳＳ−ＦＣＳを用いることによってブ
ランクを決定する。プレートをＰＢＳにより１０度洗浄
し、そしてウェル当り¹²⁵Ｉ−Ｍａｂ−１３５（ＨＢＳ
Ｓ−ＦＣＳ中において２〜４×１０⁵cpm 、例６）１０
０μｌと共に室温で一晩インキュベートし、次にＰＢＳ
により１０度洗浄し、そしてガンマカウンターにより計
数する。

【０１３０】例８：ｍＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡの合成例７のＲＩＡにより検出された、¹²⁵Ｉ−Ｍａｂ−１３
５に対して最っとも高い結合能力を示す例２のｍＲＮＡ
溶液１２μｌ（０．５mg／ml）を、ＲＶＴ緩衝液２５μ
ｌ，ｄＮＴＰ混合物（それぞれ２０mMのｄＡＴＰ，ｄＴ
ＴＰ及びｄＧＴＰ）２．５μｌ，１mg／mlのオリゴ−ｄ
Ｔ_12-18（Ｐ−Ｌ−ＢｉｏＣｈｅｍｉｃａｌｓ）５μ
ｌ，α−³²Ｐ−ｄＣＴＰ（１０μCi，３０００Ci／ｍモ
ル）１μｌ，ＲＮａｓｉｎ^TM（６０ユニット、Ｐｒｏｍ
ｅｇａＢｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）３μ
ｌ及び逆転写酵素（６６ユニット、ＰｒｏｍｅｇａＢ
ｉｏｔｅｃ．）３μｌの溶液に添加する。

【０１３１】放射性ｄＣＴＰは、その後の合成の段階の
すべてにおいてｃＤＮＡの回収率及びその収率の決定を
促進するためにその反応混合物に含まれる。混合物を４
２℃で１．５時間インキュベートする。この反応を、
０．５ＭＥＤＴＡ（pH７．５）２μｌを添加すること
によって停止する。２５μｌの０．１５ＭＮａＯＨの
添加及び４５℃での１時間のインキュベーションによ
り、ｍＲＮＡを分解する。この溶液を、１ＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（pH８．０）２５μｌ及び１ＭのＨＣｌ６μｌ
の添加により中和する。２μｌの２０％ＳＤＳを添加
し、そしてその溶液を、フェノール−クロロホルム混合
物（ＴＮＥ緩衝液により平衡化されたフェノールとクロ
ロホルムとの同体積の混合物）０．１５mlにより抽出す
る。

【０１３２】組み込まれなかったヌクレオチド及び分解
されたｍＲＮＡから新しく合成されたｃＤＮＡを分解す
るために、水性相をＴＮＥ緩衝液により平衡化されたパ
ストゥールピペット中の２mlのＳｅｐｈａｄｅｘ^RＧ−
５０カラムに適用する。それぞれ２００μｌの１２個の
画分を集め、そしてそれぞれの画分中の放射能をガイガ
ーカウンターにより決定する。放射能を含む、初めの３
個の画分をプールする。１．９μｇのＭａｎｉａｔｉｓ
など、（１）（４６１〜４６２ページ）によって記載し
ているようにして、一本鎖ＤＮＡを回収し、そしてエタ
ノールにより沈澱せしめる。その一本鎖ＤＮＡを水２０
μｌ中に溶解する。

【０１３３】例９：二本鎖−ｃＤＮＡの合成及びＳ１−
消化得られたｓｓ−ｃＤＮＡを、１００mM Ｈｅｐｅｓ（pH
６．９），１０mM ＭｇＣｌ₂，２．５mM ＤＴＴ，７
０mM ＫＣｌ、それぞれ０．５mMずつのｄＮＴＰ（ｄＡ
ＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ）及び２０ユニッ
トのＤＮＡポリマラーゼＩ大フラグメント、すなわちク
レノウ酵素（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉ
ｍ）を含む最終体積１００μｌ中において１５℃で３時
間インキュベートする。次に、他の２０ユニットの前記
同じ酵素を添加し、そしてそのインキュベーションを１
５℃で１０時間続ける。

【０１３４】ＥＤＴＡの濃度を２０mMになるように添加
することによって反応を停止する。Ｍａｎｉａｔｉｓな
ど．（１）（４６１〜４６２及び４５８〜４５９ペー
ジ）によって記載しているようにして、この反応混合物
をフェノールクロロホルムにより抽出し、そしてエタノ
ールにより沈澱せしめる。その得られた二本鎖ＤＮＡ
を、２５０mM ＮａＣｌ，５０mM 酢酸ナトリウム（pH
４．５）、１mM ＺｎＳＯ ₄，２００ユニットのＳ１ヌ
クレアーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ）を含むインキュベーション混合物１００μｌ中にお
いて３０℃で３０分間処理する。

【０１３５】ＥＤＴＡをその濃度が２５mMになるように
添加することによって反応を停止する。１ＭのＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（pH８．０）をその濃度が１００mMになるよう
に添加し、そしてＳＤＳをその濃度が１％になるように
添加した後、この反応混合物をフェノール／クロロホル
ムにより抽出し、そしてＴＮＥ緩衝液により平衡化され
たパストゥールピペット中２ml ＳｅｐｈａｄｅｘＧ
−２００カラムを通過せしめる。二本鎖ｃＤＮＡを含む
画分を、放射能を測定することによって決定し、プール
し、エタノールより沈澱せしめ、そして水１５μｌ中に
溶解する。二本鎖ｃＤＮＡ３．２μｇを得る。

【０１３６】例１０：３′−オリゴ（ｄＧ）−テイルｐ
ＵＣ−ＫＯプラスミドｐＵＣ−ＫＯプラスミド２０μｇを、５０ml Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（pH８．０），１０mM ＭｇＣｌ₂及び５０mM
ＮａＣｌの溶液２００μｌ中において、５０ユニット
のＰｓｔＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ）により切断する。ＥＤＴＡを２０mMまで添加し、そ
してその反応混合物を、等体積のクロロホルム／フェノ
ール（１：１）により抽出する。切断されたプラスミド
ＤＮＡを、２．５体積のエタノールの添加により沈澱せ
しめ、そして１００００×ｇで１０分間遠心分離するこ
とによって回収する。その上清液を捨て、そしてそのペ
レットを水５０μｌ中に溶解する。

【０１３７】２００mM カコジル酸カリウム（pH６．
９）、１mM ＣｏＣｌ，２mM ＤＤＴ，１０μＭｄＧ
ＴＰ及び８０ユニットのターミナルデオキシヌクレオチ
ジルトランスフェラーゼ（ＰｈａｒｍａｃｉａＰ−Ｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＵｐｓａｌｌａＳｗｅ
ｄｅｎ）を含む溶液１５０μｌ中に、プローブを３７℃
で５分間インキュベートする。反応を停止するために、
ＥＤＴＡを１０mMまで添加し、そしてこの混合物をフェ
ノール／クロロホルム（１：１）により１度抽出する。
ＤＮＡをエタノールにより沈澱せしめ、そして１０００
０×ｇで遠心分離することによって回収する。

【０１３８】このＤＮＡペレットをＴＥ緩衝液２００μ
ｌ中に溶解し、そして３cmの幅のスロットを用いて、Ｔ
ＢＥ緩衝液中水平な０．８％アガロースゲル上に負荷す
る。１Ｖ／cmで１６時間にわたり電気泳動した後、５Ｖ
／cmで２０分間電気溶離することによってＤＮＡを回収
し、そして激しいピペット操作によりバッグから回収す
る。ＤＮＡをフェノール−クロロホルムにより抽出し、
そして例１に記載したようにしてエタノールにより沈澱
せしめる。遠心分離後、ＤＮＡをＴＥ緩衝液中に溶解
し、そして−２０℃で貯蔵する。

【０１３９】例１１：ＩｇＥ−リセプター関連のポリペ
プチドをコードする二本鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドの
調製及びそれによるＥ．コリＨＢ１０１の形質転換８００ngの例９の二本鎖ｃＤＮＡを、２００mMカコジル
酸カリウム（pH６．９）、１mM ＣｏＣｌ₂，２mM Ｄ
ＴＴ，１００ピコモルの³Ｈ−ｄＣＴＰ及び１２ユニッ
トのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラ
ーゼ（Ｐ−ＬＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含む溶液４
０μｌ中で３７℃で５分間インキュベートする。その反
応を停止するために、ＥＤＴＡを１０mMまで添加する。
この混合物をフェノール／クロロホルムにより抽出し、
そしてＤＮＡをエタノールにより沈澱せしめる。ｄＣ−
テイル二本鎖ｃＤＮＡを水に溶解し、そして−２０℃で
貯蔵する。

【０１４０】ＴＮＥ緩衝液２００μｌ中、５０ngのｄＣ
−テイル二本鎖ｃＤＮＡと１５０ngの例１０のｄＧ−テ
イルｐＵＣ−ＫＯとの混合物を、６５℃で５分間、５５
℃で６０分間インキュベートし、そして次に水浴中で３
〜５時間にわたって３０℃にゆっくりと冷却する。この
アニーリング混合物の２μｌのアリコートを、２００μ
ｌのコンピテントＥ．コリＨＢ１０１〔Ｍａｎｉａｔ
ｉｓなど．（１）（２５０ページ）によって記載してい
るように塩化カルシウムによる処理により形質転換のた
めに調製された〕に添加する。

【０１４１】この混合物を氷上に３０分間維持し、そし
て２分間加熱して４２℃にし、次にＳＯＣ−培地１mlに
より希釈し、そして３７℃で１時間インキュベートす
る。１０本の管の内容物をプールし、そして細胞を２０
００×ｇで５分間遠心分離することによって集める。お
のおのの細胞ペレットを、ＳＯＣ−培地１ml中に再懸濁
し、そしてＬＢ−培地及び５０μｇ／mlのアンピシリン
を含む１０cmの寒天プレート上に広げる。アンピシリン
耐性によって特徴づけられた約５０００個の形質転換さ
れたコロニーを得る。

【０１４２】例１２：ハイブリド選択翻訳法によるヒト
ＩｇＥ−リセプター及びＩｇＥ−結合因子関連のポリペ
プチドをコードする二本鎖ｃＤＮＡを含むクローンの同
定例１１の個々のコロニーを、１００μｇ／mlのアンピシ
リンを含むＬＢ−ブイヨン２ml中で増殖せしめて飽和状
態にする。９６個の培養物をプールし、そしてプラスミ
ドＤＮＡをアルカリ細胞溶解法〔Ｍａｎｉａｔｉｓ，
Ｔ．など（１）（９０ページ）〕を用いて単離する。１
００μｇのアルカリ変性されたプラスミドＤＮＡを、Ｓ
ｅｅｄの方法（２０）によって調製された活性化ＡＴＰ
−セルロース５０mgに共有結合せしめる。

【０１４３】ＲＰＭＩ８８６６細胞（例１）からのポリ
Ａ−ｍＲＮＡ（６０μｇ）を、１５mM Ｐｉｐｅｓ（pH
６．４），１．５mM ＥＤＴＡ，６００mM ＮａＣｌ、
及び０．２％ＳＤＳ，５０％ホルムアミドの溶液３０
０μｌ中に溶解し、そしてゆるやかに攪拌しながら３７
℃で１６時間、セルロースに結合したプラスミド−ＤＮ
Ａにハイブリダイズせしめる。このセルロースを、５０
％ホルムアミド、４５mM ＮａＣｌ，４．５mM クエン
酸ナトリウム、２０mMプペス（pH６．４）及び１mM Ｅ
ＤＴＡを含む溶液により１０度洗浄する。

【０１４４】９０％ホルムアミド、０．２％ＳＤＳ，
１０mMピペス（pH６．４）、５mMＥＤＴＡ，２０μｇ／
mlのウシ肝臓ｔＲＮＡを含む溶液１００μｌ中において
６５℃で２分間、２度インキュベートすることによっ
て、ハイブリダイズされたｍＲＮＡを前記セルロースか
ら溶出する。溶出されたｍＲＮＡを２回エタノール沈澱
せしめる。おのおののプールから得られた沈澱したポリ
Ａ−ｍＲＮＡを水６μｌ中に溶解し、そしてキセノプス
・レービスの卵母細胞中への注入のために使用し、そし
て例３に記載したようにして分析する。翻訳された蛋白
質を、例７に記載したようにしてＲＩＡによりスクリー
ニングする。それぞれ９６個のコロニーを有する１０個
のプールのうち１つが陽性である。

【０１４５】これらの９６個のコロニーを、８個のコロ
ニーの１２個の新しいプールに一緒にし、そして同じ方
法でスクリーニングする。カエルの卵母細胞におけるｍ
ＲＮＡの翻訳の後、その蛋白質がＲＩＡにより陽性のシ
グナルを与える、１つのコロニーを最終的に同定する。
そのクローンを、１００μｇ／mlのアンピシリンを含む
ＬＢ−ブイヨン中で拡張する。プラスミドＤＮＡをこの
コロニーから単離する。１μｇのプラスミドＤＮＡを制
限酵素ＰｓｔＩにより消化し（該酵素は、ＤＮＡベクタ
ーとｄｓ−ｃＤＮＡ挿入体との間の両境界で切断す
る）、そしてｃＤＮＡ挿入部の配列をＳａｎｇｅｒなど
（２１）のジデオキシチェインターミネーター配列決定
法を用いて端から端まで決定する。

【０１４６】この配列決定は、配列決定キット（Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ，Ｎ４５０１及びＮ４５０２）に含まれる試
薬を用いて、Ａｍｅｒｓｈａｍハンドブックの“Ｍ１３
クローニング及び配列決定”に詳しく記載されているよ
うにして行われる。二本鎖ｃＤＮＡ挿入部は４１７bpの
長さであり、そしてその配列は式（II）中塩基対第８７
８〜塩基対第１２９５により示される。ＩｇＥ−リセプ
ター及びＩｇＥ結合因子のＣ末端部分をコードするこの
二本鎖ＤＮＡは、ヒトＩｇＥ−リセプター又はＩｇＥ結
合因子に関連するポリペプチドのためのすべてのコード
情報を含むより長いｃＤＮＡクローンをハイブリダイゼ
ーションによりスクリーニングするためのＤＮＡプロー
ブとして使用される。

【０１４７】例１３：ヒトＩｇＥ−リセプターのための
完全なコード配列を含むｃＤＮＡのクローニングポリＡ−ｍＲＮＡを、例１に記載しているようにしてＲ
ＰＭＩ８８６６細胞から単離する。ｃＤＮＡ合成の第一
段階は例２〜８に従って行われる。次に、十分な長さの
二本鎖ＤＮＡを濃縮するためにその方法を変える。一本
鎖ｃＤＮＡを水３２μｌ中に溶解する。一本鎖ｃＤＮＡ
（２．８μｇ）３２μｌ，１Ｍカコジル酸カリウム（pH
７．０）１０μｌ，１０mM ＣｏＣｌ₂ ５μｌ，１mM
ＤＴＴ５μｌ及びｎモルのｄＣＴＰ１を含む反応混合
物中において、一本鎖ｃＤＮＡをオリゴ−ｄＣ末端によ
り延長する。

【０１４８】３７℃で５分間予備インキュベーションし
た後、３μｌのターミナルデオキシヌクレオチジルトラ
ンスフェラーゼ（８１ユニット、Ｐ−ＬＢｉｏｃｈ−
ｅｍｉｃａｌｓ）を添加し、そしてさらに１０分間イン
キュベーションを行う。ＴＮＥ緩衝液５０μｌを添加
し、そして一本鎖ｃＤＮＡをクロロホルム／フェノール
により抽出し、そしてエタノールにより沈澱せしめる。
このペレットを７０％エタノールにより洗浄し、空気乾
燥し、そして水１５μｌ，ＲＶＴ緩衝液２５μｌ，ｄＮ
ＴＰ混合物（それぞれ２０mMのｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ及び
ｄＧＴＰ）２．５μｌ及び０．２mg／mlのオリゴｄＧ
_12-18（Ｐ−ＬＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）５μｌを
含む溶液中に溶解する。

【０１４９】３μｌの逆転写酵素（６６ユニット、Ｐｒ
ｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃ）を添加し、そしてその混合
物を４２℃で９０分間インキュベートする。この反応を
０．５ＭＥＤＴＡ（pH７．５）２μｌ及びＴＮＥ緩衝
液５０μｌの添加によって停止し、そしてこの混合物を
フェノール−クロロホルム（１：１）０．１５mlにより
抽出する。その水性相をＳｅｐｈａｄｅｘ^RＧ５０カラ
ム（ＴＮＥ緩衝液中２．５ml）上に適用し、そして１．
１μｇの二本鎖ｃＤＮＡを含む漏出画分（０．４ml）を
集める。この二本鎖ｃＤＮＡをエタノールにより沈澱せ
しめる。

【０１５０】その得られたペレットを水３２μｌ中に取
り、そしてこの二本鎖ｃＤＮＡを、例１１に記載してい
るようにして、放射性ラベルされたオリゴ−ｄＣテイル
により延長する。０．５ＭのＥＤＴＡ（pH７．５）１μ
ｌの添加によりこの反応を停止し、そしてそのサンプル
を０．５cmの幅のスロットを用いてＴＢＥ緩衝液中水平
の１％アガロースゲル上に負荷する。平行スロットにお
いて、バクテリオファージλＤＮＡ（ＥｃｏＲＩ及びＨ
ｉｎｄIII により消化された）１μｇをサイズマーカー
として役立てるために負荷する。２．５Ｖ／cmで２時間
電気泳動にかけた後、二本鎖ＤＮＡを染色するために、
０．５μｇ／mlのエチジウムブロミドを含むＴＢＥ緩衝
液中にゲルを浸漬する。

【０１５１】１．４〜２キロ塩基のおよそのサイズの二
本鎖ｃＤＮＡを含む領域を切断し、そして水中に予備浸
漬された２つのミクロ−コロジウムバック（Ｓａｒｔｏ
ｒｉｕｓ）に入れる。水０．３mlを添加し、そしてそれ
らのバックを、半分の濃度のＴＢＥ緩衝液を含む水平電
気泳動装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に入れる。５Ｖ／cmで２
０分間電気溶離し、そして激しくピペット操作すること
によって二本鎖ｃＤＮＡをバックから回収する。二本鎖
ｃＤＮＡをフェノール−クロロホルムにより抽出し、そ
してエタノールにより沈澱せしめる。遠心分離の後、こ
の二本鎖ｃＤＮＡをＴＮＥ緩衝液１００μｌ中に溶解す
る。１００ngの二本鎖ｃＤＮＡを回収する（放射能の収
量から決定された）。

【０１５２】例１４：ポリ（ｄＣ）テイルを有する二本
鎖ｃＤＮＡに対するポリ（ｄＧ）テイルを有するｄＧ−
テイルＵＣ−ＫＯのアニーリング及び得られたプラスミ
ドによるＥ．コリの形質転換４０μｌの二本鎖ｃＤＮＡ（例１３のサイズ分別された
材料４０ng）を、例１０からの１６μｌ（２００ng）の
オリゴ−ｄＧ_10-20テイルｐＵＣ−ＫＯプラスミドＤＮ
Ａ及びＴＮＥ緩衝液１９４μｌと混合し、そして次に、
６５℃で１０分間、４６℃で１時間及び室温で１時間イ
ンキュベートする。このアニールされたＤＮＡを用い
て、コンピテントＥ．コリＨＢ１０１細胞（ＬＭ１０
３５株）（例１１に記載しているようにして形質転換の
ために調製された）を形質転換する。このアニーリング
混合物の２μｌのアリコートをコンピテント細胞２００
μｌを含む２本の管に添加する。

【０１５３】この管を氷上に３０分間維持する。４２℃
での９０秒のヒートショック及び氷による２分間の冷却
の後、ＳＯＣ培地０．８mlをそれぞれの管に添加し、そ
して次に３７℃で６０分間インキュベートする。インキ
ュベーションの後、１０本の管の内容物をプールする。
２０００ｇで５分間遠心分離することによって細胞を集
め、そして１００μｇ／mlのアンピシリンを含むマッコ
ンキー寒天プレート（直径１５cm）上に置く。このプレ
ートを３７℃で一晩インキュベートする。およそ１００
０個のアンピシリン耐性コロニーを各プレートから得
る。

【０１５４】これらをナイロン膜（Ｐａｌｌ−Ｂｉｏｄ
ｙｎｅ，ＧｌｅｎＣｏｖｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ−ＵＳ
Ａ）上に拾い上げ、そしてその膜を、コロニーが上向き
になるようにマッコンキー寒天プレート上に押しつけ
る。３７℃で５時間のインキュベーションの後、２個の
レプリカをナイロン膜上で作る。そのマスター膜を寒天
プレート上で４℃で貯蔵する。

【０１５５】０．５ＭＮａＯＨ，１．５ＭＮａＣｌ
により飽和された３MM紙（ＷｈａｔｍａｎＬｔｄ．，
Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，ＵＳＡ）上に５分間、及び０．５
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０），１．５ＭＮａＣｌ
により飽和された３MM紙上に１０分間それらのレプリカ
を次々と置くことによって、これらのレプリカをコロニ
ーハイブリダイゼーションのために処理する。各インキ
ュベーションの中間で、フィルターを乾燥Ｗｈａｔｍａ
ｎ３MMフィルター上で吸い取る。このレプリカフィル
ターを真空オーブンにより８０℃で２時間加熱し、そし
てすぐにＤＮＡハイブリダイゼーションのために使用す
る。

【０１５６】例１５：フィルターのハイブリダイゼーシ
ョン例１２の陽性クローンから得られたＩｇＥ−リセプター
の一部をコードするプラスミド１０μｇからのｃＤＮＡ
挿入部を、ＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼによる消化
によって調製する。このｃＤＮＡ挿入部（４５０bp）
を、ＴＢＥ緩衝液中１．５％アガロースゲルを通して電
気泳動することによってｐＵＣ−ＫＯベクターＤＮＡ
（２９００bp）から分離し、そして電気溶出することに
よって回収し、そして例１３に記載しているようにして
エタノールにより沈澱せしめる。

【０１５７】純粋なｃＤＮＡ挿入部（２００ng）を、供
給者によって与えられた説明書に従って、Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ（Ｎ．５０００）からのニックトランスレーション
系を用いて放射性にする。この放射性ラベルされたｃＤ
ＮＡプローブは５×１０⁸ dpm／μｇの比活性を有す
る。この放射性ラベルされたｃＤＮＡを、９５℃で１０
分間インキュベートすることによって変性し、そしてす
ぐに氷上で冷却する。例１４のレプリカフィルターを、
０．９ＭＮａＣｌ，０．１８ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（pH８．０），６mM ＥＤＴＡ，０．０２％Ｆｉｃａ
ｌｌ４００，０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０
２％ＢＳＡ，０．２％ＳＤＳ及び５０μｇ／mlの変
性されたウシ胸腺ＤＮＡを含む溶液１００ml中で２時
間、密封されたプラスチックバックの中でプレハイブリ
ダイズする。

【０１５８】上記からの熱変性された放射性ラベルされ
たｃＤＮＡ挿入部を補充された同じ溶液５mlを含む密封
されたプラスチックバック中で、ハイブリダイゼーショ
ンを一晩行う。ハイブリダイゼーションの後、そのフィ
ルターを、２×ｓｓｃ／０．２％ＳＤＳにより洗浄
し、続いて６５℃で０．２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ
２００mlにより３度洗浄する。このフィルターを乾燥
し、そしてコダックＸ−線フィルム（ＸＡＲ−５）に一
晩暴露する。このフィルターに放射性インクにより印を
付け、そのフィルターとオートラジオグラムとの整合を
可能にする。２個の陽性クローンが見つけられ、そして
このＤＮＡは、ＩｇＥ−リセプターをコードする放射性
ラベルされたＤＮＡフラグメントにハイブリダイズす
る。これらをｐＵＬ−１及びｐＵＬ−２と命名する。

【０１５９】例１６：ｐＣＬ１−ＤＮＡ及びｐＣＬ２−
ＤＮＡの単離及び分析ｐＣＬ１クローン及びｐＣＬ２クローンを増殖せしめ、
そしてそれらのプラスミドＤＮＡをアルカリ細胞溶解法
〔Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，など（１）（９０ペー
ジ）〕を用いて単離する。これらのＤＮＡをＰｓｔＩに
より消化する。この酵素はベクターＤＮＡとＤＮＡ挿入
部との間の境界でｃＤＮＡを切る。このフラグメントを
電気泳動により分離し、そして完全なｃＤＮＡ挿入部を
例１３に記載しているようにして電気溶出により単離す
る。これらの２個のプラスミドのｃＤＮＡ挿入部を、Ａ
ｍｅｒｓｈａｍのハンドブックに詳しく記載されている
Ｓａｎｇｅｒなど（２１）の方法を用いて完全に配列決
定する。この制限酵素処理及び配列分析の要約は第２図
及び式IIに示される。

【０１６０】例１７：転写のために適切なプラスミド中
へのＩｇＥ−リセプター関連のｃＤＮＡの移行１０μｇのｐＣＬ−２プラスミドＤＮＡを制限酵素Ｐｓ
ｔＩ及びＨｉｎｃII（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ）により消化する。１．５kbのｃＤＮＡ挿入部
及び２．９kbのプラスミドベクターＤＮＡを、３cmの幅
のスロットを用いて、ＴＢＥ緩衝液中１％アガロースゲ
ル上で分離する。１Ｖ／cmで１６時間の電気泳動の後、
例１３に記載しているようにして電気溶出によりＤＮＡ
を回収する。平行して、１０μｇのプラスミドｐＧＥＭ
^TM−１をＰｓｔＩ及びＨｉｎｃIIにより消化し、フェノ
ール／クロロホルムにより１度抽出し、そしてエタノー
ルにより沈澱せしめる。

【０１６１】１．５kbのｃＤＮＡ挿入部１０ng及びＰｓ
ｔＩにより切断されたｐＧＥＭ^TM−１の１０ngを、１５
℃で４時間、１０μｌの容積中で連結する。この反応混
合物はさらに、１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．
５），１０mM ＭｇＣｌ₂，２mMＤＴＴ，０．１mM Ａ
ＴＰ及び１００ユニットのＴ₄リガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含む。この混合物５μ
ｌを用いて、Ｍａｎｉａｔｉｓなど（１）（２５０ペー
ジ）によって記載しているようにしてコンピテントＥ．
コリＨＢ１０１（ＬＭ１０３５株）を形質転換する。
約１００個のアンピシリン耐性コロニーを得る。２４個
のコロニーを増殖せしめ、そしてその培養物からプラス
ミドＤＮＡを単離する。

【０１６２】おのおのの培養物からのプラスミドＤＮＡ
約１μｇをＨｉｎｄIII により消化し、そしてこの消化
されたＤＮＡフラグメントの長さを、ＨｉｎｄIII によ
り消化されたλＤＮＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄ
ｅｎ）をサイズマーカーとして用いて、１％アガロース
ゲル上で分析する。いくつかのコロニーの消化されたプ
ラスミドＤＮＡは、１．０kb及び３．３kbの長さを有す
るＤＮＡフラグメントを与える。これらのプラスミドを
ｐＧＥＭ^TM−１／ＣＬ２と命名する（第３図を参照のこ
と）。これらは、ｐＧＥＭ^TM−１ベクターＤＮＡ上のＴ
₇ポリマラーゼプロモーターの近くにＩｇＥ−リセプタ
ーのアミノ末端を含む。

【０１６３】例１８：ＩｇＥ−リセプター関連のｃＤＮ
Ａの転写１０μｇの例１７のプラスミドｐＧＥＭ^TM−１／ＣＬ２
を制限酵素ＲｓａＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ）により消化する。５μｌの０．５ＭＥＤＴＡ
を添加し、そしてこの混合物をフェノール／クロロホル
ム（１：１，Ｖ：Ｖ）により１度そしてクロロホルムに
より１度抽出する。ＤＮＡをエタノールによる沈澱によ
って濃縮し、そしてＴＥ緩衝液２０μｌ中に溶解する。
このＤＮＡ溶液４μｌを４０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
７．５），６mM ＭｇＣｌ₂，２mMスペルミジン、１mM
ＮａＣｌ，１０mM ＤＴＴ，１ユニット／μｌのＲＮ
ａｓｉｎ，０．５mM ｄＮＴＰ及び２０ユニットのＲｉ
ｂｏｐｒｏｂｅＴ₇ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅ
ｇａＢｉｏｔｅｃ）を含む溶液１００μｌに添加す
る。

【０１６４】この混合物を３７℃で１時間インキュベー
トする。ＲＮＡ合成反応に続いて、２ユニットのＲＱＩ
ＴＭＤＮＡｓｅ（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃ）
を添加し、そしてそのインキュベーションを３７℃で１
時間続ける。この混合物をフェノール／クロロホルムに
より１度、そしてクロロホルムにより１度抽出し、そし
て新しく合成されたＲＮＡを、エタノールによる沈澱に
より回収する。このＲＮＡペレットを、７０％エタノー
ルにより洗浄し、そして最終的に水２０μｌに溶解す
る。

【０１６５】例１９：カエルの卵母細胞におけるプラス
ミド由来のＩｇＥ−リセプターｍＲＮＡの翻訳及びＩｇ
Ｅ−リセプター蛋白質の検出例１８において得られたｍＲＮＡを、例３において記載
しているようにして、カエルの卵母細胞中への注入のた
めに直接使用する。ＩｇＥ−リセプター蛋白質の合成
を、例７に記載したようにしてＲＩＡにより試験する。
例１からのポリＡ−ｍＲＮＡを対照サンプルとして使用
する。その結果を、次の表に挙げる。

【０１６６】

【表１】

【０１６７】例２０：ＩｇＥ−結合因子活性を有するポ
リペプチドのＥ．コリにおける発現のためのプラスミド
ｐＦＫ−１及びｐＦＫ−２の組立てこの例においては、ＩｇＥ結合因子に関連するポリペプ
チドのＥ．コリにおける産生及び分泌を可能にするプラ
スミドを造成し、この場合、膜係留部を含む位置Ｍｅｔ
₁からＡｌａ₁₁₈又はＧｌｕ₁₃₃までのアミノ末端領域
を除去する。１０μｇのｐＣＬ−２プラスミドＤＮＡを
制限酵素ＨｉｎｃII及びＲｓａＩにより消化する。１．
６，１．２５，０．７２，０．４６及び０．２３kbのフ
ラグメントを得、そしてＴＢＥ緩衝液中１％アガロース
ゲルによる電気泳動により分離する。

【０１６８】１．２５kbのＤＮＡフラグメントを例１３
に記載したようにして回収する。同時に、１０μｇのプ
ラスミドｐＧＥＭ^TM−１を１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（pH７．６），５０mM ＮａＣｌ，１０mM ＭｇＣｌ₂
及び５mM ＤＴＴの溶液５０μｌ中で２０ユニットのＨ
ｉｎｃII（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）により線状化する。
３７℃で２時間のインキュベーションの後、この反応混
合物に１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．５）５０μｌ、
水１０μｌ及び２０ユニットのウシ腸アルカリホスファ
ターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を補充し、そして３７
℃で３０分間インキュベーションをさらに続ける。その
混合物をフェノール−クロロホルムにより３度抽出し、
そして次にＴＢＥ緩衝液中１％アガロースゲルにより電
気泳動にかける。

【０１６９】このプラスミドＤＮＡを、例１３に記載し
ているようにして電気溶出により前記ゲルから回収す
る。１．２５kbのｃＤＮＡフラグメント１０ng及びＨｉ
ｎｃIIにより切断されたｐＧＥＭ^TM−１（１０ng）を、
１５℃で１０時間、１０μｌの容積において連結する。
この反応混合物は、さらに１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（pH７．５），１０mM ＭｇＣｌ₂，２mM ＤＴＴ，
０．５mM ＡＴＰ及び１００ユニットのＴ₄−リガーゼ
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を含む。その混合物５μｌを
用いて、Ｍａｎｉａｔｉｓなど（１）（２５０ページ）
によって記載されているようにしてコンピテントＥ．コ
リＨＢ１０１細胞を形質転換する。

【０１７０】細菌を１００μｇ／mlのアンピシリンを補
充し寒天プレート上に置く。約５０個のアンピシリン耐
性コロニーを得る。２４個のコロニーを増殖せしめ、そ
しておのおのの培養物からプラスミドＤＮＡを単離す
る。おのおのの培養物からのプラスミドＤＮＡ約１μｇ
をＨｉｎｄIII により消化し、そしてこの消化されたＤ
ＮＡフラグメントの長さを、サイズマーカーとしてＨｉ
ｎｄIII により消化されたλＤＮＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、％アガロースゲル上で分
析する。

【０１７１】いくつかのコロニーの消化されたプラスミ
ドＤＮＡは、フラグメントの挿入の２つの可能性ある方
向に対応して、０．５kb及び３．６kbの長さのＤＮＡフ
ラグメントをもたらし、そして他のいくつかは０．７kb
及び３．４kbの長さのフラグメントをもたらす。これら
のプラスミドを、それぞれｐＣＡＬ−３及びｐＣＡＬ−
４と命名する（図４）。１つのｐＣＡＬ−３クローン及
び１つのｐＣＡＬ−４クローンを増殖せしめ、そしてこ
れらのプラスミドＤＮＡをＭａｎｉａｔｉｓなど（１）
（９０ページ）によって記載されているようにしてアル
カリ細胞溶解法を用いて単離する。

【０１７２】１０μｇのｐＣＡＬ−４プラスミドＤＮＡ
をＨｉｎｄIII により消化し、そして１０μｇのｐＣＡ
Ｌ−３プラスミドＤＮＡをＢｇｌII及びＢａｍＨＩ制限
酵素により消化する。そのフラグメントを電気泳動によ
り分離し、そしてＢｇｌII−ＢａｍＨＩの０．８kbフラ
グメント及びＨｉｎｄIII −ＨｉｎｄIII の０．７５kb
フラグメントを、例１３に記載しているようにして電気
溶出することによって回収する。同時に、１０μｇのｐ
ＩＮ−III −ｏｍｐＡ−２プラスミドＤＮＡ〔Ｇｈａｒ
ａｙｅｄなど（５）〕及び１０μｇのｐＩＮ−III −ｏ
ｍｐＡ−３プラスミドＤＮＡをそれぞれＨｉｎｄIII 及
びＢａｍＨＩにより消化する。

【０１７３】これらの２種のプラスミドは、Ｅ．コリに
おける良く知られた分泌クローニングベクターであり、
ＯｍｐＡ蛋白質のシグナルペプチドをコードする配列に
２つのリーディングフレームで融合される外来性ＤＮＡ
フラグメントのクローニングを可能にする。次に、線状
化されたプラスミドをウシの腸からのアルカリホスファ
ターゼにより処理し、そしてその線状ＤＮＡを、上記の
ようにして０．８％アガロースゲル上で精製する。

【０１７４】ＨｉｎｄIII により切断されたｐＩＮ−II
I −ｏｍｐＡ−２（１０ng）及び０．８kbのＨｉｎｄII
I −ＨｉｎｄIII フラグメント（１０ng）（混合物
１）、並びに０．７５kbのＢｇｌII−ＢａｍＨＩフラグ
メント（１０ng）及びＢａｍＨＩにより切断されたｐＩ
Ｎ−III −ｏｍｐＡ−３（１０ng）（混合物２）を含む
２種の連結混合物を、２０μｌの体積で調製する。これ
らの反応混合物はさらに、１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（pH７．５），１０mM ＭｇＣｌ₂，２mM ＤＴＴ，
０．１mM ＡＴＰ及び１００ユニットのＴ₄−リガーゼ
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含む。
１５℃で１２時間のインキュベーションの後、この混合
物５μｌを用いてＭａｎｉａｔｉｓなど（１）（２５０
ページ）によって記載されているようにしてコンピテン
トＥ．コリＨＢ１０１細胞を形質転換する。

【０１７５】混合物１及び２から５０〜１００個のアン
ピシリン耐性コロニーを得る。それぞれの混合物からの
１２個のコロニーを増殖せしめ、そしてそのプラスミド
ＤＮＡを培養物から単離する。それぞれの培養物からの
プラスミドＤＮＡ約１μｇを、ＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩ
（混合物１）及びＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ（混合物
２）により消化する。そのＤＮＡフラグメントの長さ
を、サイズマーカーとしてＨｉｎｄIII により消化され
たλＤＮＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用
いて１％アガロースゲル上で分析する。

【０１７６】混合物１に由来されるいくつかのプラスミ
ドは０．７５kbのフラグメントを産生する。これらのプ
ラスミドをｐＦＫ−２と命名する。これらは、ＯｍｐＡ
シグナル配列に融合されたＩｇＥ−リセプターのアミノ
酸Ａｌａ₁₃₄〜Ｓｅｒ₃₂₁をコードするＤＮＡを含む。
同様に、混合物２に由来するいくつかのプラスミドは、
０．８kbのフラグメントを産生する。これらのプラスミ
ドをｐＦＫ−１と命名する。これらは、ＯｍｐＡシグナ
ル配列に融合されたアミノ酸Ａｓｐ₁₁₉〜Ｓｅｒ₃₂₁を
コードするＤＮＡを含む。

【０１７７】例２１：プラスミドｐＦＫ−１及びｐＦＫ
−２を担持するＥ．コリ株におけるＩｇＥ−結合因子関
連のポリペプチドの検出プラスミドｐＦＫ−１，ｐＦＫ−２、及び対照としての
プラスミドｐＩＮ−III −ｏｍｐＡ−２（１０ng）を用
いて、コンピテントＥ．コリＢＺ２３４細胞及びＥ．コ
リＢ１４７２細胞をトランスフェクトする。コンピテン
ト細胞を、Ｍａｎｉａｔｉｓなど（１）（２５０ペー
ジ）によって記載されているようにして調製し、そして
トランスフェクトする。それぞれのトランスフェクショ
ンから１００個以上のアンピシリン耐性コロニーを得
る。

【０１７８】１つのコロニーを１００μｇ／mlのアンピ
シリンを補充したＬＢ−ブイヨン２ml中に移し、そして
３７℃で一晩増殖せしめる。この培養物１mlを１００μ
ｇ／mlのアンピシリンを補充したＬＢ−ブイヨン１００
ml中に移す。この細胞を３７℃で激しく振盪（２５０rp
m ）しながら増殖せしめる。４，７，１０及び２４時間
後、１０mlのアリコートを取り出す。これらのアリコー
トをすぐに処理する。室温で１０分間１０００×ｇで遠
心分離にかけることによって細胞を集める。その上清液
を捨て、そして細胞を０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
８．０）中２０％シュークロース２．５ml中に懸濁す
る。

【０１７９】この混合物を室温で２０分間放置し、そし
て細胞を遠心分離にかけることによって再び集める。そ
の上清液を捨て、そして細胞を氷により冷却された水
１．５ml中に懸濁する。この混合物を２０分間氷上でイ
ンキュベートし、そして４℃で１０分間、１２０００×
ｇで遠心分離する。この上清液５μｌをＨＢＳＳ−ＦＣ
Ｓ１００μｌに添加し、そしてこれらのサンプルを例
７に記載したＲＩＡにより分析する。ｐＩＮ−III −ｏ
ｍｐＡ−２を対照として使用する。次の結果を得る。

【０１８０】

【表２】値は、例７に記載したＲＩＡにおいて、ウェル当り測定
されたcpm として与える。ウェル当りの放射能のインプ
ットは３２５，０００cpm である。

【０１８１】例２２：ＩｇＥ結合因子蛋白質の精製のた
めのイムノアフィニティゲルの調製Ａｆｆ−Ｇｅｌ^R１０材料（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を、精製
業者によって指示されているようにして、冷蒸留水及び
カップリング緩衝液（pH８．０）（０．１ＭＮａＨＣＯ
₃溶液）により洗浄する。カップリング緩衝液２ml中５
０％の濃度のゲル懸濁液をプラスチック管に入れ、そし
て１０mgのＭａｂ−１３５又はＭａｂ−１７６を含む同
じ体積の溶液と混合し、そしてこの混合物を室温で４時
間、回転混合せしめる。このゲルをカップリング緩衝液
により再び洗浄する。なお遊離している活性部位をブロ
ックするため、このゲルを１Ｍエタノールアミン−ＨＣ
ｌ（pH８．０）０．１mlにより室温で２時間処理し、次
に１０mMアジ化ナトリウムを含むＰＢＳにより洗浄し、
そして４℃でその中に保持する。

【０１８２】例２３：形質転換された細胞による発酵及
び細菌培養からのＩｇＥ結合因子蛋白質の単離例２０からのプラスミドｐＦＫ−１を含むＥ．コリＢ
Ｚ２３４の１つのコロニーを、アンピシリン（１００μ
ｇ／ml）を補充したＬＢ−ブイヨン培地１０ml中に移
し、そして激しく振盪しながら一晩、３７℃で増殖せし
める。この培養物の１mlをアリコートを、６個のフラス
コ〔おのおののフラスコは、アンピシリン（１００μｇ
／ml）を補充したＬＢ−ブイヨン８００mlを含む〕に移
す。

【０１８３】細胞を３７℃で８時間激しく振盪（２５０
rpm ）しながら増殖せしめ、そして室温で１０分間１０
００×ｇで遠心分離することによって集める。その上清
液を捨て、そして２０％シュークロース、３０mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０）及び１mM ＥＤＴＡを含む溶
液３００ml中に細胞を懸濁する。この懸濁液を室温で２
０分間放置し、そして遠心分離することによって細胞を
再び集める。上清液を捨て、そして細胞を氷により冷却
された水２００ml中に懸濁する。この懸濁液を氷上で２
０分間インキュベートし、そして４℃で１５分間１００
００×ｇでＳｏｒｖａｌｌ遠心機のローターにより遠心
分離する。

【０１８４】この上清液（約１８０ml）を注意して回収
し、アジ化ナトリウム（０．１mg／ml）を補充し、そし
てＮａｌｇｅｎｅ登録商標殺菌フィルターユニット
（０．２ミクロン；ＮａｌｇｅＣｏｍｐａｎｙ，Ｒｏ
ｃｈｅｓｔｅｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ）を通して濾過す
る。濾過された溶液を、例２２に記載のようにして得ら
れたＭａｂ−１３５又はＭａｂ−１７６結合Ａｆｆｉ−
Ｇｅｌ^R１０の２mlカラム上に流速５０ml／時で負荷す
る。

【０１８５】ゲルを、０．５％ＮａＣｌ及び０．０５
％Ｔｗｅｅｎ登録商標２０を補充した２０体積のＰＢ
Ｓ，５体積のＰＢＳ及び５体積の０．９％ＮａＣｌに
より次々と洗浄する。洗浄溶液の蛋白質内容物を、２８
０nmでの吸光度を測定することによってスクリーニング
して非結合蛋白質の完全な除去を確保する。次にカラム
を、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ，０．１ＭＮａＣｌ
（pH２．６）をそれぞれ含む１体積の溶液のアリコート
により溶出する。蛋白質を含む画分をプールし、そして
１ＭＴｒｉｓにより中和する。

【０１８６】本発明の精製されたポリペプチドの濃縮溶
液を、ＩＳＣＯ電気泳動濃縮機モデル１７５０（Ｉｓｃ
ｏＩｎｃ．）及び３．５KDカット−オフのＳｐｅｃｔ
ｒａｐｏｒ登録商標膜（ＳｐｅｃｔｒｕｍＭｅｄｉｃ
ａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）による処理によって得
る。その溶液を２５mMの酢酸アンモニウム（pH８．３）
に対して透析し、そしてそれによって０．２mlの体積に
濃縮する。

【０１８７】精製された蛋白質を次の方法により分析す
る。画分をＬａｅｍｍｌｉ緩衝液と共にインキュベート
し、次に１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより個々の蛋白質
に分離し、そしてＢｉｏＲａｄマニュアルに記載のよう
にして銀染色する。およそ２５KDの分子量を有する蛋白
質が検出される。それらを、トランスフー緩衝液を用い
て０．１２アンペアで４時間電気泳動することによりニ
トロセルロース膜に移す。この膜を、１０％ＦＣＳを
含むＴｒｉｓ緩衝化塩溶液によりブロックする。

【０１８８】ストリップを切り出し、そしてそれぞれＭ
ａｂ−１３５及びＭａｂ−１７６（それぞれ１０μｇ／
ml）と反応せしめる。６時間のインキュベーションの
後、これらのストリップを洗浄し、そしてホースラジィ
シュペルオキシダーゼヤギ抗−マウスＩｇＧと一晩反応
せしめる。このストリップを洗浄し、そしてＢｉｏＲａ
ｄの指針マニュアルに記載しているようにして４−クロ
ロ−１−ナフトール（ペルオキシダーゼ基質）により発
色せしめる。Ｍａｂ−１３５及びＭａｂ−１７６モノク
ローナル抗体のそれぞれは２５KDの蛋白質フラグメント
と反応せしめる。

【０１８９】例２４：ファージλのプロモーターＰ_Lの
制御下でのＩｇＥ結合因子活性を有するポリペプチドの
Ｅ．コリ中での発現２４．１発現プラスミドの造成：プラスミドｐＨＲｉ
１４８（ヨーロッパ特許出願ＥＰ１４６７８５）を中間
ベクターとして使用する。１０μｇのｐＨＲｉ１４８プ
ラスミドＤＮＡをＮｃｏＩにより消化し、次に末端を平
滑端にするためにクレノウポリマラーゼ及びｄＮＴＰ
（５０μＭ）により処理する。このＤＮＡをＢａｍＨＩ
によりさらに消化し、そしてアルカリホスファターゼに
より処理する。４．３kbのベクターＤＮＡをアガロース
ゲル電気泳動により単離する。同時に、ｐＣＡＬ３プラ
スミドＤＮＡ（例２０）１０μｇをＢｇｌIIにより切断
し、次にクレノウポリマラーゼ及びｄＮＴＰ（５０μ
Ｍ）により処理する。

【０１９０】このＤＮＡをＢａｍＨＩによりさらに切断
し、そして０．７８kbの挿入部ＤＮＡフラグメントをア
ガロースゲル電気泳動により単離する。精製されたベク
ター１０ng及び精製された３ngの挿入部ＤＮＡを連結
し、そしてその混合物を用いてコンピテントＥ．コリ
ＨＢ１０１細胞を形質転換する。正しい組換えプラスミ
ドを有するクローンを制限酵素分析に基いて選択する
（図５）。正しいプラスミドの１０μｇのＤＮＡをＢａ
ｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにより消化する。０．７９kbの挿
入部ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により単離する。
同時に、１０μｇのｐＰＬｃ２４プラスミドＤＮＡ〔Ｒ
ｅｍａｕｔ，Ｅ．など．（１９８１），Ｇｅｎｅ１
５，８１〜９３〕をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにより消
化し、次にアルカリホスファターゼにより処理し、そし
て２．９kbのベクターＤＮＡをアガロースゲル電気泳動
により精製する。１０ngの２．９kbのベクターＤＮＡ及
び３ngの０．７９kbの挿入部ＤＮＡを連結し、そして次
にこれを用いてコンピテントＥ．コリＫ１２細胞を形
質転換する。

【０１９１】標準的な制限分析を行い、正しいプラスミ
ド（ｐＰＬ−ＢＦ；図５）を選択する。このプラスミド
は、熱誘導性Ｐ_Lプロモーターの下流に式（Ｉ）のポリ
ペプチドのアミノ酸１１９〜３２１をコードする式（I
I）のＤＮＡ配列を担持する。中間のクローニング段階
の間にプラスミドｐＨＲｉ１４８に付加されたメチオニ
ンがアミノ酸１１９の前に存在する。プラスミドｐＰＬ
−ＢＦを用いて、Ｅ．コリ株Ｗ３１１０及びＨＢ１０１
〔両者はλｃＩ８５７（Ｒｅｍａｕｔなど．，ｌｏｃ．
ｃｉｔ．）を含む〕を形質転換する。この形質転換体
を、４０μｇ／mlのカナマイシン及びアンピシリンを含
むＬＢ−プレート上に移し、そして３０℃で２４時間イ
ンキュベーションすることによって増殖せしめる。得ら
れた組換え体コロニーを発酵のために使用する。

【０１９２】２４．２発酵例２４．１において得られた組換え体Ｅ．コリ株を、４
０μｇ／mlのアンピシリン及びカナマイシンを含むＬＢ
−ブイヨン中において３０℃で増殖せしめる。この培養
物を同じ培地により１：５に希釈し、そして４２℃で４
時間インキュベートする。遠心分離することによって細
胞を集める。

【０１９３】２４．３ＩｇＥ結合活性を有するポリペ
プチドの精製例２４．２の細菌ペレットから調製された、５０mM Ｈ
ｅｐｅｓ（pH８．０），３０mM ＮａＣｌ及び０．１％
エタノールアミンを含む溶液中細胞懸濁液（ＯＤ₆₅₀＝
２０）２２．５mlを、尿素１８ｇと混合する。この懸濁
液を、９．５mmのプローブ及び２４ミクロンの振幅を用
いて、ＭＳＥＳｏｎｉｐｒｅｐ^R１５０により３０秒
間隔で３×３０秒間音波処理する。この細胞溶解物を、
２０℃で３０分間ＳｏｒｖａｌｌＳＳ３４ローターに
より１７０００rpm で遠心分離することによって透明に
する。

【０１９４】その上清液を、４℃で、１０mM Ｈｅｐｅ
ｓ（pH７．５）及び１３０mM ＮａＣｌを含む溶液に対
して３度透析する。この透析物を、４℃で３０分間、Ｓ
Ｓ３４ローター（Ｓｏｒｖａｌｌ）により１７０００rp
m で遠心分離することによって透明にし、そしてその上
清液にアジ化ナトリウム（０．１mg／ml）を補充する。
ＩｇＥ結合活性を有するポリペプチドをさらに精製し、
そして例２２及び２３に記載しているようにして分析す
る。

【０１９５】例２５：酵母サッカロマイセスセレビシア
エ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）におけるＩｇＥ結合因子活性を有するポリペプチド
の発現２５．１発現プラスミドｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０５
−ＢＦ（第６図）の造成ベクターＤＮＡを調製するために、１０μｇのプラスミ
ドＤＮＡｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＴＰＡ（１２
−２）（ヨーロッパ特許出願ＥＰ１４３０８１）をＢａ
ｍＨＩにより完全に消化する。この消化されたＤＮＡを
アルカリホスファターゼにより処理する。６．８５kbの
ＢａｍＨＩ大フラグメントを、ＴＢＥ緩衝液中１％アガ
ロースゲル上で小フラグメントから分離し、そしてその
６．８５kbのＤＮＡフラグメントを電気溶出によってゲ
ルから回収する。誘導性ＰＨ０５プロモーター及びＰＨ
０５シグナル配列をコードするＤＮＡフラグメントは、
プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−ＴＰＡ１８（ヨ
ーロッパ特許出願１４３′０８１）に由来する。

【０１９６】このプラスミド５０μｇをＢａｍＨＩ及び
ＨｉｎｄIII により完全に消化し、そして２．３kbのフ
ラグメントを単離する。このフラグメント５μｇをＢｇ
ｌＩによりさらに消化し、そして０．５８kbのフラグメ
ントを単離する。上記の２０ngのベクターＤＮＡ、０．
５８kbのフラグメント４ng，ｐＣＡＬ３（例２０）に由
来する０．８kbのＢｇｌII／ＢａｍＨＩｃＤＮＡフラ
グメント８ng、及び核酸配列：５′pCCAATGCA −３′／
３′−GGTTACGTCTAGp −５′を有する化学的に合成され
た二本鎖ＤＮＡリンカー０．１ngを混合し、そして１５
℃で２４時間、２０μｌの体積において連結する。

【０１９７】その連結されたＤＮＡを用いてコンピテン
トＥ．コリＨＢ１０１細胞を形質転換する。約１００
個のアンピシリン耐性コロニーからプラスミドＤＮＡを
制限酵素による消化によって分析する。目的とする方向
にすべての３種の挿入体ＤＮＡフラグメントを有する数
個のコロニーが見出される（プラスミドｐＪＤＢ２０７
Ｒ／ＰＨ０５−ＢＦ；図６）。ＰＨ０５シグナル配列、
化学的に合成されたリンカーＤＮＡ及びＩｇＥ−ＢＦ
ｃＤＮＡの間の接合点でこの造成物における正しい構造
を配列決定によって確かめる。

【０１９８】２５．２酵母の形質転換及び発酵プラスミドｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＢＦを、Ｈｉ
ｎｎｅｎなど（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ１９７８，７５，１９７９）によって記載
されている形質転換法を用いて、サッカロマイセスセ
レビジアエ株ＧＲＦ１８（α，ｈｉｓ３−１１，ｈｉ
ｓ３−１５，ｌｅｕ２−３，ｌｅｕ２−１１２，ｋ
ａｎ^R）に形質転換する。形質転換された酵母細胞を、
ロイシンを欠く酵母最少培地プレート上で選択する。１
つの形質転換された酵母コロニーを単離し、そしてサッ
カロマイセスセレビジアエＧＲＦ１８〔ｐＪＤＢ２０
７Ｒ／ＰＨ０５−ＢＦ〕と称する。

【０１９９】そのような形質転換された酵母細胞を、５
０mlの酵母最少培地（アミノ酸を含まないＤｉｆｃｏ
ＹｅａｓｔＮｉｔｒｏｇｅｎＢａｓｅ培地に２％グ
ルコース、２０mg／ｌのＬヒスチジン及び１０ｇ／ｌの
Ｌ−アスパラギンを添加したもの）中で、３０℃にて２
５時間振とうして増殖せしめ、３×１０⁷個の細胞／ml
の密度にする。この細胞を０．９％ＮａＣｌ中で洗浄
し、そしてこれを、０．０３ｇ／ｌのＫＨ₂ＰＯ₄，１
ｇ／ｌのＫＣｌ，（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄の代わりに１０ｇ
／ｌのＬ−アスパラギン、２％及び１ｇ／ｌのＬ−ヒス
チジンを含有するＤｉｆｃｏＹｅａｓｔＮｉｔｒｏ
ｇｅｎＢａｓｅ培地（アミノ酸を含まない）の配合に
従って調製された低Ｐｉ最少培地１００ml中に接種す
る。この細胞を３０℃で４８時間増殖せしめ、そして約
１０のＯＤ₆₀₀で収得する。

【０２００】低Ｐｉ培地３５mlの細胞を遠心分離するこ
とによって集め、そして６６mMの冷リン酸ナトリウム緩
衝液（pH７．４）及び０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００^Rの合計体積４ml中に再懸濁する。この細
胞懸濁液を３０mlのＣｏｒｅｘ管に移す。ガラスビーズ
（０．４mmの直径）８ｇを添加し、そしてこの懸濁液を
十分な速度で４分間、ボルテックスミキサ（Ｖｏｒｔｅ
ｘＭｉｘｅｒ）（ＳｃｉｅｎｔｒｆｉｃＩｎｓｔｒ
ｕｍｅｎｔｓＩｎｃ．，ＵＳＡ）上で振盪し、そして
次に氷浴中で冷却する。

【０２０１】この方法によって９０％以上の細胞が破壊
される。細胞破片及びガラスビーズを、４℃で１０分
間、８０００rpm でＳｏｒｖａｌＨＢ４ローターによ
り遠心分離することによって沈降せしめる。ＩｇＥ結合
因子活性を有するポリペプチドを、例２２及び２３に記
載しているようにしてアフィニティクロマトグラフィー
を用いて前記上清液から精製する。

【０２０２】例２６：培養された哺乳類細胞におけるＩ
ｇＥ結合活性を有するポリペプチドの発現のためのプラ
スミドｐＣＡＬ５−Ｒ／ＮＤ及びｐＣＡＬ８−ＢＦ／Ｎ
Ｄの組立てこの例においては、プラスミドｐＣＡＬ５−Ｒ／ＮＤ及
びｐＣＡＬ８−ＢＦ／ＮＤの造成を記載する（図７を参
照のこと）。これらは、培養された哺乳類細胞において
膜−結合ＩｇＥリセプター又は分泌されるＩｇＥ結合因
子の産生を可能にする。さらに、これらのプラスミド
は、目的とするポリペプチドの高収率を導びく１つの方
法である宿主細胞中での遺伝子の増幅の選択のために設
計される。

【０２０３】２６．１プラスミドｐＣＡＬ５の造成プラスミドｐＳＶ２９１１ｎｅｏ〔Ａｓｓｅｌｂｅｒｇ
ｓ，Ｆ．Ａ．Ｍ．，など（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．１８９，４０１〜４１１ページ〕を用いてベクタ
ーＤＮＡを調製する。これを制限酵素、ＨｉｎｄIII 及
びＳａｌＩにより消化する。３．９kb及び１．８kbのフ
ラグメントを得る。この混合物をアルカリホスファター
ゼにより処理し、１％アガロースゲルを用いる電気泳動
にかけた後そして３．９kbのフラグメントを単離する。

【０２０４】同時に、ＩｇＥリセプター及びウサギβ−
グロビン遺伝子の３′−半分をそれぞれコードする２種
類の挿入部を調製する。一方では、プラスミドｐＣＡＬ
３（例２０；図４）１０μｇをＨｉｎｄIII により部分
消化し、そしてＢａｍＨＩにより完全消化する。１．２
６kbのｃＤＮＡ挿入部をアガロースゲル電気泳動及びゲ
ル溶離により単離する。他方では、１０μｇのプラスミ
ドｐＵβ〔Ｗｅｂｅｒ，Ｆ．及びＳｃｈａｆｆｎｅｒ，
Ｗ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１５，７５〜７７ペ
ージ〕をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩにより完全消化する。
１．２kbのＤＮＡフラグメントを単離する。これは大イ
ントロン及びウサギβ−グロビン遺伝子のポリ（Ａ）シ
グナルを含む。

【０２０５】上記からの１０ngのベクターＤＮＡ及びそ
れぞれの１０ngの挿入部ＤＮＡを連結する。得られたＤ
ＮＡを用いてコンピテントＥ．コリＨＢ１０１をトラ
ンスフェクトする。ベクターＤＮＡ中への両ＤＮＡ挿入
部の取込みの後予測されるような、予定された制限パタ
ーンを示す組換えプラスミド（ｐＣＡＬ５；図７）を選
択する。

【０２０６】２６．２プラスミドｐＣＡＬ５−Ｒ／Ｎ
Ｄの造成１０ngのｐＣＡＬ５プラスミドＤＮＡを、ＳａｌＩによ
り部分消化する。１度だけ切断され、そしてそれ故に十
分な長さの直線を示すＤＮＡ分子を、アガロースゲル電
気泳動により精製する。同時に、ｐＮＤプラスミドＤＮ
Ａ（Ａｓｓｅｌｂｅｒｇｓなど．；ｌｏｃ．ｃｉｔ．）
１０μｇをＸｈｏＩ及びＳａｌＩにより完全に切断す
る。このプラスミドは、２種の選択マーカー、すなわち
ネオマイシン（ｎｅｏ）及びジヒドロ葉酸レダクターゼ
（ｄｈｆｒ）を含み、そしてこれらはそれぞれ、哺乳類
宿主のゲノムにおける外来ＤＮＡの組込み及び増幅につ
いての選択を可能にする。切断されたｐＮＤ２ＤＮＡ
をアルカリホスファターゼにより処理する。

【０２０７】次に、ＳａｌＩにより切断されたｐＣＡＬ
５（１０ng）及びＳａｌＩ／ＸｈｏＩにより切断された
ｐＮＤ２プラスミドＤＮＡ（１０ng）を混合し、そして
連結する。その得られたＤＮＡを用いてコンピテント
Ｅ．コリＨＢ１０１細胞を形質転換する。この形質転
換された細胞を、ＬＢ−ブイヨン及び５０μｇ／mlのカ
ナマイシンを含む寒天プレート上に広げる。予定された
ＤＮＡ制限パターンを示す組換えプラスミド（ｐＣＡＬ
５−Ｒ／ＮＤ、第７図）を、哺乳類宿主におけるＩｇＥ
リセプターの発現のために選択する。このものは、Ｉｇ
ＥリセプターＤＮＡの下流にｎｅｏ−及びｄｈｆｒ選択
マーカーを含む。転写の方向はすべての３種の遺伝子で
同一である。

【０２０８】２６．３プラスミドｐＣＡＬ８−ＢＦ／
ＮＤの造成プラスミドｐＣＡＬ８−ＢＦ／ＮＤは上記プラスミドｐ
ＣＡＬ５−Ｒ／ＮＤの誘導体であり、このプラスミドに
おいては式（Ｉ）のポリペプチドのアミノ酸１〜１４７
をコードするＤＮＡ配列が、鳥類のインフルエンザヘマ
グルチニンのシグナル配列をコードする新ＤＮＡ配列に
よって取り替えられている。この変化は、式（Ｉ）のポ
リペプチドのアミノ酸１４８〜３２１を含んで成るＩｇ
Ｅ結合因子の分泌を可能にする。このために、下記の式
を有する二本鎖ＤＮＡ、フラグメントを、参考文献４，
５，６，６ａ，７，８に記載されている標準的方法に従
って化学的に合成する。

【０２０９】

【化２０】

【０２１０】この０．２ngのＤＮＡを、１０ngのベクタ
ーＤＮＡ及び０．７kbのＤｄｅＩ／ＸｂａＩｃＤＮＡ
挿入部２ngと連結する。このベクターは、（ａ）Ｘｂａ
及びＨｉｎｄIII による完全な消化、（ｂ）アルカリホ
スファターゼによる脱リン酸化及び（ｃ）５．９kbのベ
クターＤＮＡのアガロースゲル精製によってｐＣＡＬ５
プラスミドＤＮＡから得られる。０．７kbのｃＤＮＡ挿
入部フラグメントはｐＣＡＬ３（例２０）に由来する。
３０μｇのｐＣＡＬ３プラスミドＤＮＡをＨｉｎｄIII
及びＸｂａＩにより消化し、そして０．８kbのｃＤＮＡ
挿入部をアガロースゲル精製により単離する。

【０２１１】この０．８kbのフラグメント３μｇをＤｄ
ｅＩにより消化し、それによって０．１及び０．７kbの
ＤＮＡフラグメントを得る。最後に、０．７kbのＤＮＡ
フラグメントをアガロースゲル電気泳動及び精製により
単離する。連結されたＤＮＡを用いてコンピテントＥ．
コリＨＢ１０１細胞を形質転換する。ベクターＤＮＡ
中へのＤＮＡ挿入部の組込みの後、予測されるような、
予定された制限フラグメントを示す組換え体プラスミド
（ｐＣＡＬ８；図７）を選択する。１０μｇのｐＣＡＬ
８プラスミドＤＮＡをＳａｌＩにより完全に消化する。

【０２１２】その線状ＤＮＡ分子をアガロースゲル電気
泳動により精製する。ＳａｌＩにより切断されたｐＣＡ
Ｌ８（１０ng）と、ＳａｌＩ／ＸｈｏＩにより切断され
たｐＮＤ２プラスミド（例２６．２）１０ngとを連結す
る。この連結されたＤＮＡを用いて、５０μｇ／mlのカ
ナマイシンを補充したＬＢ培地を含む寒天プレート上に
プレートされたコンピテントＥ．コリＨＢ１０１細胞
を形質転換する。組換え体プラスミド（ｐＣＡＬ８−Ｂ
Ｆ／ＮＤ；図７）を、形質転換された哺乳類宿主におけ
るＩｇＥ−ＢＦの発現及び産生のために選択する。

【０２１３】例２７：ＩｇＥ結合活性を有するポリペプ
チドを発現する形質転換された哺乳類細胞系の選択哺乳類細胞中へのＤＮＡのトランスフェクションのため
に使用される方法、並びに形質転換された細胞の選択及
び遺伝子増幅のための選択は詳しく記載されており〔ア
メリカ特許第４．３９９．２１６号（１９８３）；Ｋａ
ｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．及びＳｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．（１９
８２），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９，６０１〜６２
１ページ〕、そして当業者によく知られている。チャイ
ニーズハムスターの卵巣セルラインのジヒドロ葉酸レダ
クターゼ陰性突然変異体（ｄｈｆｒ^-）〔Ｃｅｌｌｌ
ｉｎｅＤＵＫＸ−Ｂ１：Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．及び
Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７，４２１６〜４２２０ペ
ージ〕を宿主として使用する。

【０２１４】この細胞を、透析された５％ＦＣＳ及び
０．１mg／mlのゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充し
たＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｐａｉｓｌａｙ，Ｓｃｏｔ
ｌａｎｄ）に保持する。半コンフルエントＣＨＯ細胞
を、Ｃａ−ホスフェート同時沈澱法を用いて１０μｇの
ｐＣＡＬ５−Ｒ／ＮＤ又はｐＣＡＬ８−ＢＦ／ＮＤプラ
スミドＤＮＡによりトランスフェクトする。このトラン
スフェクトされた細胞を、５％ＦＣＳ、ゲンタマイシ
ン及び０．５mg／mlのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ）を補充し
たα−ＭＥＭ培地中で増殖せしめる。２週間後、Ｇ４１
８耐性細胞の単一のコロニーが増殖する。４８個のコロ
ニーのそれぞれを２４ウェルのマイクロタイタープレー
トのウェル中に移し、そして上記の選択培地中でコンフ
ルエントに増殖せしめる。

【０２１５】次に、この培地のアリコートを取り、そし
て例７に記載のＲＩＡを用いてＩｇＥ結合活性の存在に
ついて試験する。コロニーの約５０％が陽性であり、そ
して１ml当り約０．１〜１０ngの組換体ポリペプチドを
産生する。プラスミドｐＣＡＬ８−ＢＦ／ＮＤに由来す
る形質転換されたコロニーは、一般的に、プラスミドｐ
ＣＡＬ５−Ｒ／ＮＤにより得られたコロニーよりもより
高い生産体である。５個の最良の産性コロニーを、メト
トレキセート（ＫａｕｆｍａｎａｎｄＳｈａｒｐ
ｏｐ．ｃｉｔ．）と共に遺伝子増幅のために使用する。
数回の増幅の後、１μｇ／mlまでの組換体ポリペプチド
を産生する細胞系を得る。最良の生産体、すなわちセル
ラインＣＨＯ−ＢＦ／ＮＤを大きな培養物に増殖せしめ
る。

【０２１６】選択培地５０mlを含む組織培養フラスコ
（Ｆａｌｃｏｎ，１７５cm²）およそ３×１０⁶個の細
胞を接種する。細胞層がコンフルエントになった後、そ
の培地を除去し、そして１％ＦＣＳ及び０．１mg／ml
のゲンタマイシンを補充したα−ＭＥＭ培地５０mlと取
り換える。培地を１週当り２度、数週間にわたり集め
る。これを５０００ｇで１０分間、遠心分離し、そして
−２０℃で貯蔵する。最後に、ＩｇＥ結合活性を有する
組換体ポリペプチドを、例えば例２２及び２３に記載し
ているようにしてアフィニティクロマトグラフィーによ
って、集められた上清液から精製する。

【０２１７】ＲＰＭＩ８８６６細胞からの天然のＩｇＥ
−ＢＦの精製及び配列の分析次の例Ｂ〜Ｄに従って、ＩｇＥ−ＢＦを含むＲＰＭＩ８
８６６細胞上清液の画分（ＥＰ８６８１０２４４．３）
を精製することによって、配列決定するために十分に純
粋であるＩｇＥ−ＢＦを得、そしてそのアミノ末端を決
定することが可能である。

【０２１８】例Ａ：ＩｇＥ−ＢＦのエンザイム−リンク
ド−イムノソーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）画分を次の方法でＩｇＥ−ＢＦについて分析する。ＰＶ
Ｃ製マイクロタイタープレートのウェルを、室温で湿潤
チャンバー中で一晩、Ｍａｂ−１７６（ＰＢＳ中５μｇ
／ml；ウェル当り１００μｇ）により被覆する。ＰＢＳ
により２度洗浄した後、非特異的な結合部位を、０．２
％ゼラチンを含むＰＢＳによりブロックする（１５０μ
ｌ／ウェル；３７℃で１時間）。プレートをＰＢＳによ
り再び２度洗浄する。クロマトグラフィー実験からの画
分をＰＢＳにより１／５０に希釈し、ウェルに添加し
（１００μｌ／ウェル）、そして温潤チャンバー中にお
いて室温で一晩インキュベートする。

【０２１９】プレートをＰＢＳにより４度洗浄する。結
合されたＩｇＥ−ＢＦを、ビオチンが共有結合している
Ｍａｂ−１３５（例１９，ＥＰ８６８１０２４４．３）
（０．２％ゼラチンを含むＰＢＳ中、０．５μｇ／ml；
１００μｌ／ウェル）を添加することによって検出し、
そして温潤チャンバー中において３７℃で４時間、イン
キュベートする。ＰＢＳにより４度洗浄した後、そのプ
レートを、０．２％ゼラチンを含むＰＢＳ中アビジン及
びとアルカリホスファターゼとの接合体（Ｓｉｇｍａ
Ｃａｔ．No．Ａ２５２７，０．５μｇ／ml）１００μｌ
と共に３７℃で２時間インキュベートする。

【０２２０】さらにＰＢＳにより洗浄した後、基質緩衝
液（１００mgのＭｇＣｌ₂×６Ｈ₂Ｏ，２００mgのＮａ
Ｎ₃、水８００ml中に溶解されたジエタノールアミン９
７ml，３７％ＨＣｌによりpH９．８に調整）中、１mg
／mlのｐ−ニトロフェニルホスフェート二ナトリウムに
よりそのプレートを発色せしめる。３７℃で２０〜４０
分の後、黄色の反応が最適である。次に、ウェル当り５
０μｌのＮａＯＨ（１Ｍ）により反応を停止する。モデ
ル２５５０ＥＩＡＲｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を
用いて、４０５mmで光学濃度を決定する。

【０２２１】例Ｂ：イムノアフィニティクロマトグラフ
ィーによるヒトＢ−細胞上清液からのＩｇＥ−ＢＦの精
製ＲＰＭＩ８８６６細胞からの培養上清液１０ｌを、Ｍａ
ｂ−４５−ａｆｆｉｇｅｌの２０mlカラム（ＥＰ８６８
１０２４４．３の例）に通して１２０ml／時の流速で濾
過する。このゲルをＰＢＳにより洗浄する。流出液の蛋
白質含有量を、Ｕｖｉｃｏｒｄ^Rスペクトロメーターに
よって２８０nmでのオンラインの吸光度によりモニター
し、結合されなかった蛋白質が完全に除去されたことを
確かめる。このカラムを０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ
（pH２．６）５０mlにより溶出する。１ＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ（pH８．０）及び０．５％Ｔｗｅｅｎ２０の等
量を含む管に画分を集める。ＩｇＥ−ＢＦ含有の画分を
プールし、そして１０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．
４）に対して透析する。

【０２２２】例Ｃ：イオン交換クロマトグラフィーによ
るＩｇＥ−ＢＦの精製例Ｂの精製されたＩｇＥ−ＢＦをＳｙｎＣｈｒｏｐａｋ
ＡＸ３００陰イオン交換カラム（ＳｙｎＣｈｒｏｍ
Ｉｎｃ．，Ｌｉａｄｅｎ，ＩＮ）上に負荷する。このカ
ラムを１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４）により洗
浄し、そして蛋白質を、１ml／分の流速で１００分間に
わたって、０〜１ＭのＮａＣｌのグラジエントにより溶
出する。この溶出を２５４nmでＵＶ吸光度によりモニタ
ーする。この画分を１％オクチルピラノグルコシド（Ｓ
ｉｇｍａ）中に集め、そして例Ａに記載のようにしてＩ
ｇＥ−ＢＦについて検定する。

【０２２３】例Ｄ：逆相クロマトグラフィーによるＩｇ
Ｅ−ＢＦの追加の精製例Ｃの５０mlのＩｇＥ−ＢＦを、０．５ｌのＰＢＳに対
して透析し、そして０．１％オクチルピラノグルコシド
を含む０．５ｌのＰＢＳに対して２度透析する。凍結乾
燥した後、ＩｇＥ−ＢＦを水１．５ml中に溶解し、そし
て０．１％オクチルピラノグルコシドを含む２×０．５
ｌのＰＢＳに対して再び透析する。逆相クロマトグラフ
ィーを、０．１％ＴＦＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）及び５％ア
セトニトリル（Ｍｅｒｃｋ）中ＳｙｎＣｈｒｏｐａｋ
ＲＰ−４（ＳｙｎＣｈｒｏｍ）カラム上で行う。

【０２２４】０．５ml／分の流速で３０分間、０．１％
ＴＦＡ中５〜６０％アセトニトリルのグラジエントを
適用することによって、ＩｇＥ−ＢＦの溶出を行う。こ
の溶出を２５４nmでのＵＶ吸光度によりモニターする。
１mlの画分を０．０５％ＳＤＳ中に集め、そして例Ａ
に記載のようにしてＩｇＥ−ＢＦについて分析する。Ｉ
ｇＥ−ＢＦの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって制御し、
そして続いて銀染色を行う（ＥＰ８６８１０２４４．
３、例２２）。

【０２２５】例Ｅ：ＩｇＥ−ＢＦのアミノ酸配列分析Ｍ．Ｗ．Ｈｕｎｋａｐｉｌｌａｒ及びＬ．Ｅ．Ｈｏａ
ｄ，ＭｅｔｈｏｄｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，９１，
３９９ページ、（１９８３）の方法に従って、例Ｄの精
製されたＩｇＥ−ＢＦを、ポジティブ・フェーズ・プロ
テイン・スクエンサーモデル４７０（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＮ−末端のアミノ酸配
列分析にかる。アミノ−チオゾリン誘導体を、５０℃で
２５％水性ＴＦＡによる処理によって、フェニルチオビ
タントイン（ＰＴＨ）アミノ酸に転換する。このＰＴＨ
アミノ酸をＺｏｒｂａｘＣＮ^RＨＰＬＣカラム（Ｄｕ
Ｐｏｎｔ，２００×４．６mm）上で分析する（Ｒ．Ｋｎ
ｅｃｈｔなど．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３０，
６５ページ、１９８３）。次のＮ−末端のアミノ酸配列
が、材料の４０％で見出される：

【０２２６】

【化２１】〔配列中、Ｘ₁₄₉，Ｘ₁₅₅，Ｘ₁₆₀及びＸ₁₆₃は、決定
されなかったアミノ酸を表わす〕。この配列は、ｃＤＮ
Ａ分析によって決定されたＩｇＥ−リセプターの配列に
従えば、該リセプターの第１４８番目のアミノ酸から始
まる。次のＮ−末端のアミノ酸配列が、材料の６０％で
見出される：

【０２２７】

【化２２】〔配列中、Ｘ₁₅₁，Ｘ₁₆₀及びＸ₁₆₃は決定されなかっ
たアミノ酸を表わす〕。この配列は、ｃＤＮＡ分析によ
って決定されたＩｇＥリセプターの配列に従えば、該リ
セプターの第１５０番目のアミノ酸から始まる。

【０２２８】例２８：ＩｇＥ−結合因子活性を有するポ
リペプチドのＥ．コリにおける高レベルの発現２８．１発現プラスミドの構成例２４．１の精製された２．９kbのベクターＤＮＡ（Ｅ
ｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにより切断されたプラスミドｐ
ＰＬｃ２４）１０ngを、０．１ngのオリゴヌクレオチド５′−pAATTTGGAGGAAAAAATTATG（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，
No．２７−４８７８−０１）及び０．１ngのオリゴヌク
レオチド５′−pGATCCATAATTTTTTCCTCCA（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，
No．２７−４８９８−０１）と共に、１０mM Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（pH７．５）、１０mM ＭｇＣｌ₂，２mM Ｄ
ＤＴ，０．１mM ＡＴＰ及び１００ユニットのＴ₄ＤＮ
Ａリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ）を含む溶液２０μｌ中で混合する。４℃で１６時間
後、その混合物を用いてコンピテントＥ．コリＫ１２
細胞を形質転換する。

【０２２９】個々のコロニーを増殖せしめ、そしてその
プラスミドを単離する。標準的制限酵素分析を行い、Ｂ
ａｍＨＩによっては切断されるが、しかしＥｃｏＲＩに
よっては切断されない正しいプラスミド（ｐＰＬ．ＰＴ
ＩＳ；第８図を参照のこと）を選択する。オリゴヌクレ
オチドの正しい挿入をＤＮＡ配列決定により確認する。
新しく挿入されたＤＮＡフラグメントはポータブル翻訳
開始部位（ＰＴＩＳ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をコードす
る。

【０２３０】１０μｇのｐＰＬ．ＰＴＩＳプラスミドＤ
ＮＡをＢａｍＨＩにより消化し、次にアルカリホスファ
ターゼにより処理し、そして線状の２．９kbベクターＤ
ＮＡをアガロースゲル電気泳動により精製する。１０ng
のこのベクターＤＮＡを、プラスミドｐＣＡＬ−３（例
２０）に由来する０．８kbのＢｇｌII−ＢａＨＩフラグ
メント３ngに連結し、そして次に、これを用いてコンピ
テントＥ．コリＫ１２細胞を形質転換する。

【０２３１】個々のコロニーからプラスミドＤＮＡを単
離し、そして標準的制限酵素分析を行って、正しい方向
に０．８kbの挿入体を有するプラスミドｐＰＬ．ＰＴＩ
Ｓ−ＢＦ（図８）を選択する。プラスミドｐＰＬ．ＰＴ
ＩＳ−ＢＦを用いてＥ．コリ株Ｗ３１１０及びＨＢ１０
１〔両者はλＩ８５７（Ｒｅｍａｕｔなど．，Ｉｏｃ．
ｃｉｔ．）を含む〕を形質転換する。この形質転換体
を、４０μｇ／mlのカナマイシン及びアンピシリンを含
むＬＢ−プレート上に広げ、そして３０℃で２４時間イ
ンキュベートすることによって増殖せしめる。得られた
組換体コロニーを発酵のために使用する。

【０２３２】２８．２発酵例２８．１で得られた組換え体Ｅ．コリ株を例２４．２
に記載のようにして増殖せしめる。４２℃で３時間のイ
ンキュベーションの後、その培養物を氷／水浴中で３０
分間冷却し、そして遠心分離することによって細胞を集
める。

【０２３３】２８．３ＩｇＥ−結合活性を有するポリ
ペプチドの精製熱誘導された培養物１mlから得られた細胞のペレット
を、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）及び１mM
ＥＤＴＡを含む溶液２０ml中に４℃で再懸濁する。この
細胞懸濁液を、１分間隔で４×３０秒間、氷上で常に冷
却しながら音波処理する（ＭＳＥＳｏｎｉｐｒｅｐ^R
１５０，９．５mmのプローブ、２４ミクロンの振幅）。
次に、この懸濁液を１０分間遠心分離にかける（Ｓｏｒ
ｖａｌｌ遠心機、ＨＢ−４ローター、９０００rpm ，４
℃）。このペレットを５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
７．５）及び１mM ＥＤＴＡを含む溶液２０ml中に４℃
で再懸濁し、そして上記のようにして３０秒間音波処理
する。その懸濁液を上記のように遠心分離にかけ、そし
て洗浄サイクルをさらに２度、くり返す。

【０２３４】文献１．Ｍａｎｉａｔｉｓ等、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏ
ｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ（１９８２）。２．Ｏｋａｙａｍａ及びＢｅｒｇ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ２，１
６１−１７０（１９８２）。３．Ｈｅｉｄｅｃｋｅｒ及びＭｅｓｓｉｎｇ，Ｎｕｃｌ
ｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１１，４８９１
−４９０６（１９８３）。４．Ｓ．Ａ．Ｎａｒａｎｇ等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１２１，３６５（１９８２）。５．Ｋ．Ｌ．Ａｇａｒｗａｌ等、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅ
ｍ．８４，４８９（１９７２）。６．Ｃ．Ｂ．Ｒｅｅｓｅ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ３
４，３１４３（１９７２）。６ａ．Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｏｃ．９８，３６５５（１９７６）。

【０２３５】７．Ｋｈｏｒａｎａ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２５１，５６５（１９７６）。８．Ｓ．Ａ．Ｎａｒａｎｇ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
３９，３（１９８３）。９．Ｃｈａｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ，２７５：６１５（１
９７８）。１０．Ｇｏｅｄｅｌｌ等、Ｎａｔｕｒｅ，２８１：５４
４（１９７９）。１１．Ｇｏｅｄｅｌｌ等、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
Ｒｅｓ．，８：４０５７（１９８０）。１２．Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ等、Ｃｅｌｌ２０：２６
９（１９８０）。１３．Ｊ．Ｇｈａｒａｙｅｂ等、ＴｈｅＥＭＢＯＪ
ｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．３，２４３７−２４４２（１９
８４）。１４．Ｓｔｉｎｃｈｏｍｂ等、Ｎａｔｕｒｅ，２８２：
３９（１９７９）。１４ａ．Ｋｉｎｇｓｍａｎ等、Ｇｅｎｅ，７：１４１
（１９７９）。１５．Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ等、Ｇｅｎｅ，１０，１５７
（１９８０）。

【０２３６】１６．Ｍｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ａ．等（１９８
４）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１
２，７０３５−７０５６。１７．Ｍ．Ｓａｒｆａｔｉ等、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，
１９８４，５３，１９７−２０５。１８．Ｊ．Ｂ．Ｇｕｒｄｏｎ，Ｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌ
ｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎａｎ
ｉｍａｌｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｃｌａｒｅｎｔｏ
ｎＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９７４。１９．Ｆ．Ｃ．Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ等、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｊ．８９，１１４（１９６３）。２０．Ｂ．Ｓｅｅｄ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲ
ｅｓ．１０，１７９９−１８１０（１９８２）。２１．Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４，５４６３−５４６７。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はＲＰＭＩ８８６６Ｂ−細胞から単離され
たｍＲＮＡからのｄｓ−ｃＤＮＡを挿入部として含有す
るプラスミドｐＣＬ−１及びｐＣＬ−２の調製を示す。
挿入部ｃＤＮＡはＩｇＥ−リセプター、及びＩｇＥ−結
合因子に関するポリペプチドをコードしている。

【図２】図２はプラスミドｐＣＬ−１及びｐＣＬ−２の
２つの挿入部の比較を示し、両挿入部に共通のコード領
域、両挿入部に共通の非−コード領域、ｐＣＬ−２中に
のみ存在するコード領域及び両挿入部において異る非コ
ード領域、並びに若干の制限部位が示されている。

【図３】図３は、ｐＣＬ−２及びｐＧＥＭ^TM−１からの
プラスミドｐＧＥＭ^TM−１／ＣＬ２の造成、並びにｍＲ
ＮＡへのＤＮＡ挿入部の転写を示す。

【図４】図４は、プラスミドｐＣＬ−２から、アミノ酸
配列Ａｓｐ₁₁₉−Ｓｅｒ₃₂₁をコードする挿入部を有す
るプラスミドｐＦＫ−１、及び式（Ｉ）のＡｌａ₁₃₄−
Ｓｅｒ₃₁₂のアミノ酸配列をコードするｐＦＫ−２を造
成する過程を示す。

【図５】図５はＥ．コリＷ３１１０及びＨＢ１０１中
でＩｇＥ−ＢＦを発現するためのプラスミドｐＢＬ−Ｂ
Ｆの造成を示す。ファージλのＰ_Lプロモーターのもと
でアミノ酸１１９−３２１が発現される。

【図６】図６はサッカロミセス・セレビシエーにおいて
ＩｇＥ−ＢＦを発現するためのプラスミドｐＪＤＢ２０
７Ｒ／ＰＨ０５−ＢＦの造成を示す。ＰＨ０５プロモー
ターのもとでアミノ酸１１９−３２１が発現される。

【図７】図７は培養された哺乳類細胞（チャイニーズハ
ムスター卵巣細胞）中でそれぞれ膜結合ＩｇＥリセプタ
ー又は分泌されるＩｇＥ−ＢＦを発現するためのプラス
ミドｐＣＡＬ−５及びｐＣＡＬ８−ＢＦ／ＮＤの造成を
示す。

【図８】図８はＥ．コリ中でのＩｇＥ−ＢＦの発現及び
形質転換のためのプラスミドｐＰＬ．ＰＴＩＳ−ＢＦの
造成を示す。図中の記号は次の意味を有する：

【表３】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＦＣ１２Ｎ 5/00 ＢＣ０７Ｋ 14/735 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＦ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト免疫グロブリンＥ結合因子の生物学
的活性を有するポリペプチドであって、下記（１）〜
（６）に定義されるポリペプチド：次のアミノ酸配列
（Ｉ）：【化１】において、（１）上記アミノ酸配列（Ｉ）の全配列から成るポリペ
プチド；（２）上記アミノ酸配列（Ｉ）において、アミノ酸残基
１０６〜１１０中のアミノ酸からアミノ酸残基１２７〜
１３０中のアミノ酸までのアミノ酸配列が除去されてい
るポリペプチド；（３）上記アミノ酸配列（Ｉ）において、アミノ酸残基
１１９〜１６０中のアミノ酸からアミノ酸残基２８２〜
３２１中のアミノ酸までのアミノ酸配列から成るポリペ
プチド；（４）上記ポリペプチド（１）〜（３）から選択される
ポリペプチドにおいて、１〜１０個のアミノ酸残基が他
のアミノ酸残基により置き換えられているポリペプチ
ド；（５）上記（１）〜（４）から選択されたポリペプチド
において、アミノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基及
び／又はカルボキシル基がグリコシル化、アシル化、ア
ミド化及び／又はエステル化されているポリペプチド；
あるいは（６）上記（１）〜（５）から選択されるポリペプチド
において、塩の形態であるポリペプチド；をコードする
ＤＮＡ。
【請求項２】次のアミノ酸配列（II）：【化２】をコードする、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】次のアミノ酸配列（III)：【化３】をコードする、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項４】次（Ｉ）のＡ₁₃₄−Ｓ₃₂₁のアミノ酸配
列を有するポリペプチドをコードしている請求項１に記
載のＤＮＡ。
【請求項５】式（Ｉ）のＬ₁₄₈−Ｓ₃₂₁のアミノ酸配
列を有するポリペプチドをコードする請求項１に記載の
ＤＮＡ。
【請求項６】式（Ｉ）のＭ₁₅₀−Ｓ₃₂₁のアミノ酸配
列を有するポリペプチドをコードしている請求項１に記
載のＤＮＡ。
【請求項７】ヒト免疫グロブリンＥ結合因子の生物学
的活性を有するポリペプチドであって、下記（１）〜
（６）に定義されるポリペプチド（Ｉ）：【化４】において、（１）上記アミノ酸配列（Ｉ）の全配列から成るポリペ
プチド；（２）上記アミノ酸配列（Ｉ）において、アミノ酸残基
１０６〜１１０中のアミノ酸からアミノ酸残基１２７〜
１３０中のアミノ酸までのアミノ酸配列が除去されてい
るポリペプチド；（３）上記アミノ酸配列（Ｉ）において、アミノ酸残基
１１９〜１６０中のアミノ酸からアミノ酸残基２８２〜
３２１中のアミノ酸までのアミノ酸配列から成るポリペ
プチド；（４）上記ポリペプチド（１）〜（３）から選択される
ポリペプチドにおいて、１〜１０個のアミノ酸残基が他
のアミノ酸残基により置き換えられているポリペプチ
ド；（５）上記（１）〜（４）から選択されたポリペプチド
において、アミノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基及
び／又はカルボキシル基がグリコシル化、アシル化、ア
ミド化及び／又はエステル化されているポリペプチド；
あるいは（６）上記（１）〜（５）から選択されるポリペプチド
において、塩の形態であるポリペプチド；をコードする
ＤＮＡ配列を挿入部として含んで成るハイブリドベクタ
ー。
【請求項８】式（Ｉ）においてアミノ酸１０６−１２
７を含んで成るアミノ酸配列が除去されているポリペプ
チドを前記挿入部がコードしていることを特徴とする、
請求項７に記載のハイブリドベクター。
【請求項９】式（Ｉ）において、アミノ酸１２０，１
２１，１２２，１２３，１２４，１２５，１２６，１２
７，１２８，１２９，１３０，１３１，１３２，１３
３，１３４，１３５，１３６，１３７，１３８，１３
９，１４０，１４１，１４２，１４３，１４４，１４
５，１４６，１４７，１４８，１４９，１５０，１５
１，１５２，１５３，１５４，１５５，１５６，１５
７，１５８，１５９又は１６０のいずれかから始まりそ
してアミノ酸３２１で終るポリペプチドから成る群から
選択されるポリペプチドの断片を前記挿入部がコードし
ていることを特徴とする、請求項７に記載のハイブリド
ベクター。
【請求項１０】式（Ｉ）において、アミノ酸１２０，
１２１，１２２，１２３，１２４，１２５，１２６，１
２７，１２８，１２９，１３０，１３１，１３２，１３
３，１３４，１３５，１３６，１３７，１３８，１３
９，１４０，１４１，１４２，１４３，１４４，１４
５，１４６，１４７，１４８，１４９，１５０，１５
１，１５２，１５３，１５４，１５５，１５６，１５
７，１５８，１５９又は１６０のいずれかから始まりそ
して２８２と３２１との間のアミノ酸のいずれかで終る
ポリペプチドから成る群から選択されるポリペプチドを
前記挿入部がコードしていることを特徴とする、請求項
７に記載のハイブリドベクター。
【請求項１１】式（Ｉ）において、アミノ酸１１９か
らアミノ酸３２１までのアミノ酸配列から成るポリペプ
チドを前記挿入部がコードしていることを特徴とする、
請求項７に記載のハイブリドベクター。
【請求項１２】式（Ｉ）において、アミノ酸１３４か
らアミノ酸３２１までのアミノ酸配列から成るポリペプ
チドを前記挿入部がコードしていることを特徴とする、
請求項７に記載のハイブリドベクター。
【請求項１３】式（Ｉ）において、アミノ酸１４８か
らアミノ酸３２１までのアミノ酸配列から成るポリペプ
チドを前記挿入部がコードしていることを特徴とする、
請求項７に記載のハイブリドベクター。
【請求項１４】式（Ｉ）において、アミノ酸１５０か
らアミノ酸３２１までのアミノ酸配列から成るポリペプ
チドを前記挿入部がコードしていることを特徴とする、
請求項７に記載のハイブリドベクター。
【請求項１５】次の式（II）：【化５】又は次の（III) 【化６】で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドを前記挿
入部がコードしていることを特徴とする、請求項７に記
載のハイブリドベクター。
【請求項１６】ｐＣＬ２である請求項７に記載のハイ
ブリドベクター。
【請求項１７】ｐＣＬ１である請求項７に記載のハイ
ブリドベクター。
【請求項１８】ｐＰＬ−ＢＦである請求項７に記載の
ハイブリドベクター。
【請求項１９】ｐＣＡＬ８−ＢＦ／ＮＤである請求項
７に記載のハイブリドベクター。
【請求項２０】ｐＰＬ．ＰＴＩＳ−ＢＦである請求項
７に記載のハイブリドベクター。
【請求項２１】ヒト免疫グロブリンＥ結合因子の生物
学的活性を有するポリペプチドであって、下記（１）〜
（６）に定義されるポリペプチド：次のアミノ酸配列
（Ｉ）：【化７】において、（１）上記アミノ酸配列（Ｉ）の全配列から成るポリペ
プチド；（２）上記アミノ酸配列（Ｉ）において、アミノ酸残基
１０６〜１１０中のアミノ酸からアミノ酸残基１２７〜
１３０中のアミノ酸までのアミノ酸配列が除去されてい
るポリペプチド；（３）上記アミノ酸配列（Ｉ）において、アミノ酸残基
１１９〜１６０中のアミノ酸からアミノ酸残基２８２〜
３２１中のアミノ酸までのアミノ酸配列から成るポリペ
プチド；（４）上記ポリペプチド（１）〜（３）から選択される
ポリペプチドにおいて、１〜１０個のアミノ酸残基が他
のアミノ酸残基により置き換えられているポリペプチ
ド；（５）上記（１）〜（４）から選択されたポリペプチド
において、アミノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基及
び／又はカルボキシル基がグリコシル化、アシル化、ア
ミド化及び／又はエステル化されているポリペプチド；
あるいは（６）上記（１）〜（５）から選択されるポリペプチド
において、塩の形態であるポリペプチド；をコードする
ＤＮＡ配列を挿入部として含んで成るハイブリドプラス
ミドにより形質転換された宿主。
【請求項２２】Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である請求
項２１に記載の宿主。
【請求項２３】Ｅ．コリＨＢ１０１，Ｅ．コリＢ
Ｚ２３４，Ｅ．コリＢ１４７２及びＥ．コリＷ３１１
０から選択される請求項２１に記載の宿主。
【請求項２４】サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｓｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の株
である請求項２１に記載の宿主。
【請求項２５】前記株がＧＲＦ１８である、請求項２
４に記載の宿主。
【請求項２６】哺乳類セルラインである請求項２１に
記載の宿主。
【請求項２７】前記セルラインがチャイニーズハムス
ター卵巣セルラインＤＵＫＸ−１３１である、請求項２
６に記載の宿主。
【請求項２８】ヒト免疫グロブリンＥ結合因子の生物
学的活性を有するポリペプチドであって、下記（１）〜
（６）に定義されるポリペプチド：次のアミノ酸配列
（Ｉ）：【化８】において、（１）上記アミノ酸配列（Ｉ）の全配列から成るポリペ
プチド；（２）上記アミノ酸配列（Ｉ）において、アミノ酸残基
１０６〜１１０中のアミノ酸からアミノ酸残基１２７〜
１３０中のアミノ酸までのアミノ酸配列が除去されてい
るポリペプチド；（３）上記アミノ酸配列（Ｉ）において、アミノ酸残基
１１９〜１６０中のアミノ酸からアミノ酸残基２８２〜
３２１中のアミノ酸までのアミノ酸配列から成るポリペ
プチド；（４）上記ポリペプチド（１）〜（３）から選択される
ポリペプチドにおいて、１〜１０個のアミノ酸残基が他
のアミノ酸残基により置き換えられているポリペプチ
ド；（５）上記（１）〜（４）から選択されたポリペプチド
において、アミノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基及
び／又はカルボキシル基がグリコシル化、アシル化、ア
ミド化及び／又はエステル化されているポリペプチド；
あるいは（６）上記（１）〜（５）から選択されるポリペプチド
において、塩の形態であるポリペプチド；を発現するこ
とができる形質転換された宿主の製造方法であって、１）前記のポリペプチドをコードするＤＮＡを用意し；２）得られたＤＮＡを適当なベクターに導入し；３）得られたハイブリドベクターにより適当な宿主を形
質転換し；４）未形質転換宿主から形質転換宿主を選択し；そして
場合によっては、該形質転換宿主からハイブリドベクタ
ーを単離し、該ハイブリドベクターのコード領域又は非
コード領域を変形し、そして段階３）及び４）を再度行
う；ことを特徴とする方法。