JPH0356499A - 新規なサイトカイン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、炎症のメディエーターまたはメディエーター
の前駆体である約１６０ｋＤの見掛分子量を有するポリ
ペプチド、突然変異体及びフラグメントの如き、それら
の誘導体、それらの調製方法、前記のポリペプチド及び
誘導体をコードする、ＤＮＡ及びハイブリッドベクター
ならびにこのようなハイブリッドベクターで形質転換さ
れた宿主細胞、前記のポリペプチドまたはそれらの誘導
体に特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗
体ならびに抗体誘導体、ならびに炎症症状及びホジキン
リンパ腫の診断方法及び治療方法に関する． 〔従来の技術〕 サイトカインは、免疫系の種々の細胞型の分化、活性化
及び増殖、例えばマクロファージ機能の誘導または変調
を調節する、、生物活性の可溶性ポリベプチドのメディ
エーターである．サイトカインの例は、良く特性決定さ
れたインターフェロン、インターロイキン及びコロニー
刺激因子、ならびにマクロファージ阻止特性または活性
化特性を夫々示すマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ
）及びマクロファージ活性化因子（ＭＡＦ）である。

多数の活性がサイトカインを原因としていたが、これら
のほとんどが単一分子に特有のものではない可能性があ
る。例えば、一群のポリペプチドからなると考えられる
ヒトＭＩＦは、マクロファージの無秩序な遊走の阻止を
測定するアッセイにより試験管内で特定される。生体内
で、ヒトＭＩＦは、マクロファージ機能のその媒介によ
り細胞免疫反応（「遅延型過敏性」）の早期の事象に重
要な役状態は明らかに変化する。抗原との第二の接触の
際に、遅延過敏性反応は、細胞の浸潤により顕在化され
、抗原が配置される部位でリンパ球及び単球の脈管周囲
への蓄積が始まる。これらの細胞の幾つかは、抗原との
最初の接触の結果として特異的に感作される。これらの
細胞は抗原と反応し、これがリンホカインの放出及び多
数の不感作細胞の誘引及び保持をひき起こす。特に、Ｍ
ＩＦの産生は、血管壁の内皮を通り周囲の組織に人いる
単球の誘引をもたらすと思われる。この浸潤に付随して
、単球が組織マクロファージに分化する。遅延型過敏性
に見られる肉眼的現象は、細胞浸潤によりひき起こされ
る抗原との接触の部位に於ける膨潤及びその下にある血
管に拡張によりひき起こされる赤変（ｒｅｄｄｅｎｉｎ
ｇ）である．正常な状態では、炎症反応は、可能な組織
損傷が回復されたほぼ２ないし３日後に停止する。しか
しながら、未知の理由で炎症が慢性になることがあり、
広範な組織損傷、例えば慢性関節リウマチをひき起こす
。慢性炎症の発生についての可能な説明は、発症時に、
浸潤体マクロファージの分化が調節されなかったことで
あり得る． 〔発明が解決しようとする課題〕 本発明の目的は、炎症のメディエーターまたはメディエ
ーターの前駆体であるポリペプチド、特にヒトボリペプ
チド及びその誘導体を高純度で、しかも充分な量で提供
すること、及びそれらの調製方法を提供することにある
．工業的なポリペプチド合戒の課題は、組換えＤＮＡ技
術の方法により解決し得る．従って、本発明のもう一つ
の目的は、所望のポリペプチド及び誘導体をコードする
、ＤＮＡ及びハイブリッドベクター、ならびにこのよう
なベクターで形質転換された宿主を提供することにある
。その他の目的は、前記のＤＮＡ、ベクター及び形質転
換した宿主の生産方法である。

本発明のポリペプチドは、感染に対する抵抗、転移の制
御、炎症の処置及び組織回復の如き、臨床的に重要な領
域に於ける単核食細胞系の役割の良き理解を得るのに有
益である。更に、それらは慢性炎症症状の療法に有益で
ある。従って、本発明のその他の目的は、ポリベプチド
またはその誘導体を含む医薬製剤、及びそれらの調製方
法である。加えて、本発明のポリペプチド及び誘導体は
、抗炎症薬として使用し得る拮抗物質の研究、同定及び
生産に有益である． 本発明の別の目的は、本発明のポリペプチドまたは誘導
体に対して特異的な抗体を提供することにある。このよ
うな抗体は、炎症症状の診断に使用でき、このような症
状の治療を監視するのに使用できる．更に、これらの抗
体は、ホジキンリンパ腫の診断及び治療に有益である。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、炎症のメディエーターまたはメディエーター
の前駆体である、約１６０ｋＤの見掛分子量を有するポ
リペプチド、特にヒトボリベプチド、及びその誘導体に
関する。

炎症のメディエーターは、炎症反応を誘導する化学シグ
ナル分子である． ポリペプチドメディエーターの前駆体は、メディエータ
ー即ちポリペプチドの前段階であり、それらは、それら
の産生後に、例えばある種の末端アミノ酸配列を切断す
ることにより、及び／またはグリコシル化により処理さ
れ、または切除され、それにより、活性メディエーター
に転換されるか、あるいは前駆体そのものが活性メディ
エーターである場合には、それらのメディエーター活性
を保持する． 本発明のポリペプチド及び誘導体は、炎症症状に関連す
る免疫プロセスに重要な役割を果たす。

本発明のポリペプチドの炎症メディエーター活性は、例
えば、正常なモルモットにおいて皮下投与された場合に
局所的な炎症を誘発するそれらの効能により示すことが
できる． 一般に、未知の構造のポリペプチドの見掛分子量は、通
常の方法、例えば、沈降分析及び拡散係数の測定または
ゲル電気泳動法、特にドデシル硫酸ナトリウムの存在下
におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓ０５−Ｐ
ＡＧＥ）により測定され得る。

特に、本発明は、ＳＥ０　１０　ＮＯ：１で示されるア
ミノ酸配列を有するＭＲＰ−１６０で表わされた、炎症
のメディエーターまたはその前駆体であるポリペプチド
、またはその誘導体に関する． ＭＲＰ−１６０の計算分子量は、１６０，９８９である
。

本発明の誘導体は、本発明に従うポリペプチドの突然変
異体、特にＳＩＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１で示されるアミノ
酸配列を有するポリペプチドの突然変異体であり、ここ
で一種以上の単一アミノ酸、特にｌＯ％以下のアミノ酸
が欠失されるか、もしくは異なるアミノ酸により置換さ
れ、あるいは別のアミノ酸が挿入されている。

更に、本発明の誘導体は、本発明のポリペプチドのフラ
グメントまたはその突然変異体のフラグメント、特に少
なくとも１５個の連続するアミノ酸を含んでなる、ＳＥ
Ｑ　Ｉｎ　ＮＯ：１で示されるアミノ酸配列を有するポ
リペプチドまたはその突然変異体のフラグメントである
。

ＳＥＱ　ＩＤ　Ｈｏｗ１で示されるアミノ酸配列を有す
るアミノ酸８７８〜ｌ４２７を含むフラグメントが好ま
しく、この場合、Ｎ一末端は水素、アシル、アミノ酸配
列Ａｓｐ−Ｇｌｙ−　１　１ｅ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅ
ｕ−Ａｓｐ−　Ｉ　Ｉｇ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙまた
はアミノ酸配列Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−　Ｉｌｅ−Ａ
ｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−　Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐ
ｈｅ−Ｇｌｙである。Ｎ末端アミノ酸配列Ｍｅｔ−Ａｓ
ｐ−Ｇｌｙ−Ｉ　１ｅ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓ
ｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ　は、ｒＭＲＰ−
７０　と称される．ｒＭＲＰ−７０と称されるフラグメ
ントの推定分子量は６４．７１４であるが、ドデシル硫
酸ナトリウムボリアクリルアξドゲル電気泳動（ＳＯＳ
−ＰＡＧＥ）　：によると、このペプチドは、標識マー
カータンパク質と比較したとき、見掛分子量７０ｋＤの
ペプチドとして移動する． さらに、本発明の誘導体は、本発明のポリベプチド、突
然変異体またはフラグメント、特にＭＲＰ−１６０、そ
の突然変異体またはフラグメント由来の化合物であり、
この場合、官能基、例えば、アミノ基、ヒドロキシル基
、メルカブト基またはカルボキシル基は誘導体化され、
例えばグリコキシル化、アシル化、アミド化またはエス
テル化される。

グリコシル化誘導体では、炭水化物残基またはオリゴ糖
がアスパラギン、セリン及び／またはスレオニンに連結
される．アシル化誘導体は、特にチロシンまたはセリン
のアミノ基、特にＮ一末端アミノ基またはヒドロキシル
基で天然の有機もしくは無機の酸、例えば、ギ酸、酢酸
、リン酸または硫酸のアシル基により置換される．エス
テルは、天炊のアルコール、例えばメタノールまたはエ
タ一１一 ノールのエステルである．グリコシル化される本発明の
誘導体が好ましい。

本発明の別の誘導体は、塩、特に製薬学的に許容され得
る塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウ
ム塩、カルシウム塩、もしくは亜鉛塩の如き、アルカリ
金属塩及びアルカリ土類金属塩の如き、金属塩、または
アンモニアもしくは低級アルキルアミン、例えば、トリ
エチルアミン、ヒドロキシ低級アルキルアミン、例えば
、２−ヒドロキシエチルアξン、等の如き好適な有機ア
ごンにより生或されるアンモニウム塩である。

トランスフェクシゴンされた細胞または内皮細胞のよう
な天然細胞により産生される、１９０ｋＤの見掛分子量
または１４０ｋＤの見掛分子量を有する本発明のポリペ
プチドの誘導体が好ましい。

また、本発明は、炎症のメディエーターまたはメディエ
ーターの前駆体であるポリペプチド、即ち、天然、組換
えまたは合或のポリペプチド、及び本発明の誘導体の調
製方法に関する。

本発明の一態様において、このような化合物は、本発明
のポリペプチドまたは誘導体、例えば、刺激された正常
なヒトの白血球または遺伝子操作された微生物もしくは
連続継代哺乳類細胞系の、必要により予備精製された細
胞抽出物、細胞上澄液または培養濾液をクロマトグラフ
ィーで精製し、必要な場合には、化合物を単離し、それ
らの誘導体に転化する方法により調製される。

本発明の天然ポリペプチドを含む、刺激された正常なヒ
ト白血球の細胞抽出物、細胞上澄液及び培養濾液は、例
えば、旧Ｆに関して、欧州特許出願第０１６２８１２号
明細書に記載されているように調製される。特に、正常
なヒトの単核細胞は、好適な補助剤（ａｄｊｕｎｃｔ）
　、例えば、コンカナバリンＡまたはフィトヘムアグル
チニンにより刺激されてリンホカインを産生し、常法に
より培養される。

必要により、細胞抽出物、細胞上澄液または培養濾液は
、その後、免疫アフィニティークロマトグラフィーによ
り予備精製される。

所望の化合物の調製を目的とするクロマトグラフィーと
しては、イオン交換クロマトグラフィー逆相高性能液体
クロマトグラフィー、ゲル濾過、サイズ排除クロマトグ
ラフィー　（免疫）アフィニティークロマトグラフィー
、ヒドロキシルアパタイトによるクロマトグラフィーお
よび疎水性相互作用クロマトグラフィー等が挙げられる
。

イオン交換クロマトグラフィーに適した担体材料は、有
機起源または無機起源の担体材料、例えば架橋アガロー
ス、デキストラン、ポリアクリルアξド、スチレン／ジ
ビニルベンゼンコポリマーまたはセルロース等であって
もよい。この担体材料は塩基性官能基、例えば第三アミ
ノ基、四級アンモニウム基または酸性官能基、例えば、
カルボン酸基またはスルホン酸基を有する。好ましいイ
オン交換樹脂の例としては、ジエチルアミノエチル（Ｄ
ＥＡＥ）基またはジエチル−２−ヒドロキシブロピルア
ミノエチル基を担持するもの及びスルホプロビル（ＳＰ
）基またはカルボキシメチル（ＣＭ）基を有するものが
挙げられ、これらは通常の液体クロマトグラフィー、高
速タンパク賞液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）また
は高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に適した
担体に担持される．イオン交換クロマトグラフィーによ
る分離及び精製は、確立された操作に従って、徐々に増
加する量の塩、例えば塩化ナトリウムを含むｐＨ５〜ｐ
Ｈ９の水性緩衝液で行なわれる． ゲル濾過またはサイズ排除クロマトグラフィーに通した
担体材料は、架橋デキストラン、アガロース、適当に変
性ポリアクリルア稟ドまたはシリカ等を含む。必要によ
り、これらの担体は、ヒドロキシル基を有する置換基、
例えば１−ヒドロキシ低級アルキル基または１，２−ジ
ヒドロキシ一低級アルキル基で変性される。このような
ゲル濾過またはサイズ排除クロマトグラフィーは、可変
量の塩、例えば塩化ナトリウムを含むほぼ中性のｐＨの
水性緩衝液を用いて、上記の通常の液体クロマトグラフ
ィー、ＦＰＬＣまたはｔｌＰＬｃに適したカラムで行な
われてもよい。

逆相クロマトグラフィーは、疎水性基、例えば１〜２０
個の炭素原子、好ましくは４個、８個、１２個もしくは
１８個の炭素原子のアルキル基またはそれぞれ１〜８個
の炭素原子のアルキル基と１２〜１８個の炭素原子のア
ルキル基との混合物、あるいはフェニル基を有するシリ
カ系担体材料で行なわれるこの方法に関連するのは、疎
水性相互作用クロマトグラフィーであり、ここでは１２
個までの炭素原子のアルキル基及び／またはフェニル基
で覆われたアガロースまたは関連材料が使用される。こ
れらのクロマトグラフィー技法は、ＦＰＬＣまだはＨＰ
ＬＣを用いて適用される。シリカ系逆相材料による本発
明のポリベブチドの処理のための溶媒は、徐々に増加す
る量の極性の水混和性有機溶媒、例えばアセトニトリル
、低級アルコール、例えばメタノール、エタノール、も
しくはプロパノール、テトラヒドロフラン等、好ましく
はアセトニトリルを含む水性の酸、例えば水性のトリフ
ルオロ酢酸である。

また、アフィニティークロマトグラフィーは、本発明の
ポリペプチドもしくは誘導体、突然変異体、フラグメン
トまたはそれらの誘導体に対し高い親和性をもつ分子を
担持する、例えば抗体、特にポリクローナル抗体及びヒ
トＭＩＦに特異的なモノクローチル抗体の如きモノクロ
ーナル抗体（ＭＡｂ）を担持する、好適な担体材料、例
えば架橋アガロース、デキストランまたはポリアクリル
ア果ドを用いる、本発明のポリペプチドの精製をも意図
されている。

好ましいクロマトグラフィー法は、免疫アフィニティー
ク口マトグラフィー、スルホプ口ピル基を担持する担体
を用いるイオン交換クロマトグラフィー及び逆相高性能
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である． 本発明の化合物は、一般的な技法、例えば濾過または限
外濾過、透析、好適な塩または緩衝液の溶液及び溶媒混
合物中の溶解及び再沈、溶媒蒸発および凍結乾燥等によ
り分離される． 本発明の突然変異体は、ＤＮＡレベルでの自然の突然変
異または化学的に誘導される突然変異により、または化
学合或によるアミノ酸の置換により生戒される． 本発明のフラグメントは、ＤＮＡレベルでの自然の突然
変異または化学的に誘導される突然変異により生威され
（これにより、アごノ酸をコードするトリプレットが停
止コドンに変化される）、あるいはペプチドレベルで結
合を化学的もしくは酵素的に開裂することにより生戒さ
れる。本発明のフラグメントの調製に適した酵素は、例
えばブロテアーゼである。例えば、パバイン、トリプシ
ン、α−キモトリプシン、サーモリシン、ペプシン、ズ
プチリシン、リゾバクター・エンザイモゲネス（ｎ肚ｈ
１並堕ｕｌ１肱牡）由来のエンドプロテイナーゼＬｙｓ
−Ｃ、黄色ブドウ球菌由来Ｖ８プロテアーゼまたは関連
プロテアーゼが、本発明のポリペプチドの溶液に添加さ
れてもよく、次いで得られるフラグメントの混合物がク
ロマトグラフィー法、例えばゲル濾過及び／または逆相
ＨＰＬＣにより分離されてもよい． 本発明の組換えポリペプチドまたは本発明のそれらの誘
導体を含む、遺伝子操作された微生物または連続継代哺
乳類細胞系の抽出物、細胞上澄液及び培養濾液は、組換
えＤＮＡ技術により得られ、上記のように予備精製され
る。特に、本発明のポリペプチド及びその誘導体は、異
種ポリペプチドの形質発現を可能にする条件下で、本発
明のポリペプチドまたはその誘導体を形質発現する形質
転換した宿主細胞を培養し、必要な場合には、所望の化
合物を単離し、そして／またはそれらをその誘導体に転
化することにより、調製し得る。組換えＤＮＡ技術によ
る本発明のポリペプチド及び誘導体の調製に伴なわれる
工程は、以下に更に詳しく説明される． 本発明の別の態様において、本発明のポリペプチド及び
その誘導体、特にフラグメントは、化学方法、例えば門
．ボダンスキ４　（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ）著、″Ｐｒｉ
ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ”〔スプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）　１９８
４年）に記載された縮合反応により合成される。フラグ
メントは、例えば固相法により合成され、この方法では
、Ｎ一保護アミノ酸が好適な樹脂にカップリングされ、
保護基が除去され、第二〇Ｎ保護アａノ酸が第一のア泉
ノ酸のアミノ基と縮合され、所望の化合物のペプチド残
基が完結するまで、脱保護／別のＮ保護アミノ酸との縮
合が繰返され、最後にこのペプチド残基が樹脂から開裂
され、脱保護される．同様に、短かいＮ保護オリゴペプ
チドが単一のＮ保護アミノ酸に代えて使用されてもよい
。好適な樹脂、保護基、縮合試薬及び反応条件は、当該
技術分野で公知である。

また、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその誘導
体をコードするＤＮＡ、このようなＤＮＡの突然変異体
、例えば、１個以上、特に、ｌ個、２個、３個または４
個のヌクレオチドが突然変異されるＤＮＡ及び少なくと
も１５個のヌクレオチドを含むこのようなＤＮＡのフラ
グメントに関する．定義に従うと、このようなＤＮＡは
、コード化一本鎖ＤＮＡ　、前記のコード化ＤＮＡ及び
それに相補的なＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡ　，または
これらの相補的な（一本１ｊ［）ＤＮＡそのものを含む
．特に、本発明は、ＳＥ０　１０　ＮＯ：１で示される
ヌクレオチド配列を有するＭＲＰ−１６０をコードする
ＤＮＡ，並びにこのようなＤＮＡの突然変異体及びフラ
グメントに関する． また、本発明は、本発明のＤＮＡ、その突然変異体また
はフラグメントとハイブリッドを形或するＤＮＡに関す
る． 更に、本発明は、ゲノム起源のものである本発明のＤＮ
Ａ、その突然変異体またはフラグメントに関する。

本発明のＤＮＡは、例えば形質転換した宿主を培養し、
必要な場合には、所望のＤＮＡをそれから単離すること
により、またはヌクレオチド縮合による化学合或により
、調製し得る。

特に、このようなＤＮＡは、 ａ）好適な細胞、例えばヒト単核白血球またはヒトの胚
上皮肺細胞からｍＲＮＡを単離し、所望のｍＲＮＡを、
例えばＤＮＡプローブによるハイプリダイゼーシッンに
より、または好適な形質発現系による形質発現により選
抜し、所望のポリペプチドの形質発現に関してスクリー
ニングし、そのＯＩＲＮＡに相補的な一本鎖ｃＤＮＡを
調製し、次いでそれから二本鎖ｃＤＮＡを調製する工程
、または ｂ　）　ｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮ＾を単離し、
例えばＤＮＡプロープを使用して、または好適な形質発
現系を用いて、所望のｃＤＮＡを選抜し、所望のポリペ
プチドの形質発現に関してスクリーニングする工程、ま
たは Ｃ）好適なヒト組織、例えば胎盤細胞または胎児の肝細
胞から例えばＤＮＡブローブを用いてゲノムＤＮＡを単
離し、あるいは好適な形質発現系を用いて、所望のＤＮ
Ａを選抜し、所望のポリペプチドの形質発現に関してス
クリーニングする工程、及び ｄ）工程ａ）、ｂ）またはＣ）の二本鎖ＤＮＡを適当な
形質発現ベクターに組込む工程、Ｃ）得られたハイブリ
ッドベクターで適当な宿主細胞を形質転換する工程、 ｆ）未形質転換の宿主細胞からの所望のＤＮＡを含む形
質転換した宿主細胞を選抜すること、及び必要な場合に
、 ｇ）所望のＤＮＡを単離し、かつ／またはＤＮＡをその
突然変異体またはフラグメントに変換する工程、 により調製し得る。

ポリアデニル化メッセンジャーＲＮＡ　（工程ａ）は、
既知の方法により、好適な細胞、例えばヒトの単核白血
球またはヒトの胚上皮肺細胞から単離される。例えば、
白血球は新鮮なヒトの血液、例えば白血球細胞からなる
白血球層、または培養により増加させ得る樹立連続継代
細胞系の白血球から誘導されてもよい。単離方法は、例
えば、洗剤及びリボヌクレアーゼインヒビター、例えば
ヘパリン、グアニジニウムイソチオシアネートまたはメ
ルカプトエタノールの存在下で刺激した白血球を均一に
し、必要により塩溶液及び緩衝液、洗剤及び／またはカ
チオンキレート化剤の存在下でｍＲＮＡを好適なクロロ
ホルムーフェノール混合物で抽出し、次いでｎ＋ＲＮＡ
をエタノール、イソプロパノール等で残存の水性の塩を
含む相から沈殿させる工程を伴なう．単離したａＲＮＡ
は、塩化セシウムグラジェントによる遠心分離、その後
のエタノールによる沈殿及び／またはクロマトグラフィ
ー法、例えばアフィニティークロマトグラフィー、例え
ばオリゴ（ｄＴ）セルロースまたはオリゴ（Ｕ）セファ
ロースによるクロマトグラフィーにより更に精製されて
もよい．このような精製全ａ＋ＲＮＡは、グラジェント
遠心分離（例えば、直線的なＷｖＭ濃度勾配で）または
好適なサイズ分別力ラム、例えばアガロ−スゲルによる
クロマトグラフィーにより、サイズに応じて分別される
ことが好ましい。

所望のｍＲＮＡは、ＤＮＡプロープによりｍＲＮＡを直
接スクリーニングすることにより、あるいは好適な細胞
もしくは無細胞系における翻訳により、次いで得られた
ポリペプチドをスクリーニングすることにより選抜され
る。

所望のｍＲＮＡの選択は、ＤＮＡハイプリダイゼーショ
ンブローブを用いて行なわれることが好ましく、それに
より、翻訳の追加の工程を避ける．好適なＤＮＡプロー
プは、少なくとも１７個のヌクレオチドからなる既知の
ヌクレオチド配列のＤＮＡ、例えば合或ＤＮＡ，勅物種
（そのＤＮＡはヒトＤＮＡと配列相同性を示す）中の所
望のポリペプチドをコードするｍＲＮＡから誘導された
ｃＤＮＡ，または、例えば、天然起源もしくは遺伝子操
作した微生物から単離される隣接ＤＮＡ配列を含むゲノ
ムＤＮＡフラグメントである． 合成ＤＮＡは、以下に詳述される既知の方法により、好
ましくは、例えば固相承スホトリエステル、ホスフィン
トリエステルまたはホスホラミジト（ｐｈｏｓｏｈｏｒ
ａｍ　ｉｄ　ｉ　ｔｅ）法を用いる段階縮合、例えばホ
スホトリエステル法によるジヌクレオチドカップリング
単位の縮合により、合成される。これらの方法は、ｖ６
イケ（Ｉｋｅ）　　ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　
Ｒｅｓｅａ−ｒｃｈ＋　１１、４７７頁、１９８３年）
により記載された適当な縮合工程での、２個、３個また
は４個の保護形態のヌクレオチドｄＡ，　ｄＣ，　ｄＧ
及び／またはｄＴの混合物または相当するジヌクレオチ
ドカップリング単位を使用することによる所望のオリゴ
ヌクレオチドの混合物の合戒に適する。

ハイブリダイゼーションでは、ＤＮＡプローブが周知の
キナーゼ反応により標識化され、例えば放射性標識され
る．標識を含むＤＮＡプローブによるサイズ分別したｍ
ＲＮＡのハイブリダイゼーシゴンは、既知の操作により
、例えば、選択的ハイブリダイゼーションに有利な温度
、例えば０゜Ｃ〜８０″Ｃ、例えば２５゜Ｃ〜５０℃ま
たは６５ｊＣ付近、好ましくはハイブリッド二本鎖ＤＮ
Ａ融解温度よりも低い２０゜Ｃ付近で、補助剤、例えば
カルシウムキレート化剤、粘度調節化合物およびタンパ
ク質、関係のないＤＮＡ等を含む緩衝液及び塩溶液中で
行なわれる．分別したｍＲＮＡは、細胞、例えばカエル
卵母細胞中、または無細胞系、例えば網状赤血球溶解産
物もしくは麦芽抽出物中で翻訳されてもよい。得られた
ポリペプチドは、メディエーター活性についてスクリー
ニングされ、または例えば免疫アッセイ、例えばラジオ
イムノアッセイ、酵素免疫アッセイもしくは蛍光マーカ
ーによる免疫アッセイによって、天然のメディエーター
に対して生じた抗体と反応に関してスクリーニングされ
る．選抜されたｍＲＮＡ鋳型から一本鎖相補ＤＮＡ　（
ｃＤＮＡ）の調製は、一本ｉｉＤＮＡから二本鎖ＤＮＡ
の調製と同様に、当該技術分野で周知である．　ａ＋Ｒ
Ｎ＾鋳型は、デオキシヌクレオシド三リン酸、必要によ
り放射性ラベルデオキシヌクレオシド三リン酸（反応の
結果をスクリーニングし得るため）　、ｍＲＮ＾のポリ
（Ａ）テイルとハイブリッドを形威するオリゴーｄＴ残
基の如きプライマー配列及び、例えば、鳥類の骨髄芽球
症ウイルス（ＡＭＶ）からの逆転写酵素の如き好適な酵
素の混合物で培養される。例えば、アルカリ加水分解に
よる、鋳型ｍＲＮＡの分解後に、ｃＤＮＡは、デオキシ
ヌクレオシド三リン酸と二本鎖ＤＮＡを与えるのに適し
た酵素との混合物としてインキエベートされる。好適な
酵素は、例えば逆転写酵素、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
ＩのクレノーフラグメントまたはＴ４　ＤＮＡポリメラ
ーゼである。通常、一本鎖ｃＤＮＡにより自然に形威さ
れるヘアピンループ構造は、第二の鎖の合或用プライマ
ーとして作用する。このヘアピン構造は、Ｓ１ヌクレア
ーゼによる消化により除去される。また、一本鎖ＤＮＡ
の３′末端は、ｍＲＮＡ鋳型の加水分解、次いで第二の
ｃＤＮＡ鎖の合或の前に、まずホモポリマ一〇デオキシ
ヌクレオチドテイルにより延長される。

別法では、二本鎖ｃＤＮＡがｃＯ〜Ａライブラリーから
単離され、所望のｃＤＮＡに関してスクリーニングされ
る（工程ｂ）．上記のように、ｃＤＮＡライブラリーは
、好適な細胞、例えばヒト単核白血球またはヒト胚上皮
肺細胞からｍＲＮＡを単離し、次いで一本鎖ｃＤＮ＾及
び二本鎖ｃＤＮＡを調製することにより構戒される．こ
のｃＤＮＡは好適な制限エンドヌクレアーゼにより消化
され、確立された操作に従って、λファージ、例えばλ
シャロン４Ａまたはλｇｔｌｌに組み込まれる。ニトロ
セルロース膜上で複製されたｃＤＮＡライブラリーは、
前記のＤＮＡプロープを用いることによりスクリーニン
グされ、または好適な形質発現系で形質発現され、得ら
れたポリペプチドが所望の化合物に対して特異的な抗体
、例えばヒｌ−ＭＩＦに特異的な抗体との反応によって
スクリーニングされる． 更に別法として、ゲノムＤＮＡが単離され、所望のＤＮ
Ａに関してスクリーニングし得る（工程Ｃ）．ゲノムＤ
ＮＡは、当該技術分野で既知の方法に従って、好適なヒ
ト組織、好ましくはヒトの胎盤またはヒトの胎児肝細胞
から単離される．ゲノムＤＮＡライブラリーは、好適な
制限エンドヌクレアーゼ、例えば＾ｌｕ■及びＨａｅ　
ｍによる消化及び確立された操作に従ってλファージ、
例えばλシャロン４Ａまたはλｇｔｌｌへの組み込みに
より、それらから調製される。ニトロセルロース膜上で
複製されたゲノムＤＮ＾ライブラリーは、前記のＤＮＡ
ブローブによりスクリーニングされ、または好適な形質
発現系で形質発現され、得られたポリペプチドが前記の
ようにスクリーニングされる。

二本鎖ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを適当なベクターに
組み込むための種々の方法が当該技術分野で知られてい
る（工程ｄ）。例えば、相補性ホモポリマートラックが
、対応するデオヌクレオシド三リン酸及び末端デオキシ
ヌクレオチジルトランスフェラーゼの如き酵素の存在下
のイン単ユベーションにより二本鎖ＤＮＡ及びベクター
ＤＮＡに付加されてもよい．その後、ＤＮＡが相補性ホ
モポリマーテイル間の塩基対形或により結合され、最後
にリガーゼの如き特異的連結酵素によって連結される。

その他の可能性は、二本鎖ＤＮＡの末端への合成リンカ
ーの付加または平滑末端連結またはスタガード末端連結
によるベクターへの二本鎖ＤＮＡの組み込みである．好
適なベクターは、以下に詳しく説明される。

得られたハイブリッドベクターによる好適な宿主細胞の
形質転換（工程ｅ）及び形質転換した宿主細胞の選抜（
工程ｆ）は、当該技術分野で公知であり、以下に更に詳
しく説明される。ハイブリッドベクター及び宿主細胞は
、ＤＮＡの産生、またはその他に所望のポリペプチドの
産生に適することがある。

本発明の所望のＤＮＡ、その突然変異体及びフラグメン
トの単離は、当該技術分野で既知の方法、例えばフェノ
ール及び／またはクロロホルムによる抽出により行なわ
れる。必要により、ＤＮＡは、例えば突然変異体を得る
ために突然変異誘発剤で処理することにより、あるいは
フラグメントを得、ベクター中への組み込みを容易にす
るため一方もしくは両方の末端を修飾し、介在配列を除
去する等のため制限酵素で消化することにより更に処理
されてもよい。

本発明に従うＯＮ＾のヌクレオチド配列は、それ自体既
知の方法、例えば末端ラベルしたＤＮＡを使用するマキ
サムーギルバー｝　（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）法
またはサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）のジデオキシ鎖終止法
により決定し得る。

また、本発明のＤＮＡ、その突然変異体または誘導体の
調製は、化学合成により行なわれてもよい。

ＤＮＡの合戒に適した方法は、Ｓ．Ａ．ナラング（Ｎａ
ｒａｎｇ）（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　３９巻、３頁、
１９８３年）により要約として提示されている。既知の
合戒技術は、良好な収率、高純度で比較的短時間で、４
０個までの塩基の長さのポリヌクレオチドを調製するこ
とを可能にする。適当な保護されたヌクレオチドが、ホ
スホジエステル法（Ｋ．Ｌ．ＡｇａｒｗａＬら著、Ａｎ
ｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ８４巻、４８９頁、１９７２年）
、更に効率の良いホスホトリエステル法（Ｃ．Ｂ．Ｒｅ
ｅｓｅ著、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　３４巻、３ｌ４３
頁、１９７２年）、ホスファイトトリエステル法（１，
ｌ．ｌＢｔａｉｎｇｅｒら著、Ｊ．Ａｓ．Ｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．９８巻、３６５５頁、１９７６年）またはホスホ
ルアミダイト法（Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＭ．Ｈ
＋Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ著、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　
２２巻、１８５９頁、１９８１年）により、相互に連結
される。

オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの合戒の簡略
化は、固相法により可能となり、この方法では、ヌクレ
オチド鎖が好適なボリマーに結合される。Ｒ．Ｒｉｎｋ
ら（Ｎｕｃｌ．＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１２巻
、６３６９頁、１９８４年）は、個々のヌクレオチドに
代えてトリヌクレオチドを使用し、固相合戒に於けるホ
スホトリエステル法によりそれらを連結する。こうして
、６７個までの塩基を有するポリヌクレオチドが、短時
間で、しかも良好な収率で調製し得る．実際の二本鎖Ｄ
ＮＡは、両方のＤＮＡ鎖から化学的に調製された重複オ
リゴヌクレオチドから酵素により形成され、これらのＤ
ＮＡ鎖は塩基対形成により正しい配置で一緒に保持され
、次いで、酵素Ｉ）ＮＡリガーゼにより化学的に連結さ
れる．その他の可能性は、４個の必要とされるデオキシ
ヌクレオシド三リン酸の存在下で、二つのＤＮＡ鎖から
の重複単一オリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼ、
例えばＤＮＡポリメラーゼＩ，ポリメラーゼ■のクレノ
ーフラグメントもしくはＴ４　０ＮＡポリメラーゼ、ま
たはＡＭＶ（鳥類の骨髄芽球症ウイルス）逆転写酵素と
共にインキユベーションすることを含んでなる．こうし
て二つのオリゴヌクレオチドは塩基対形或により正しい
配置で保持され、酵素により必要なヌクレオチドで補充
された完全な二本鎖ＤＮＡが得られる（Ｓ．Ａ．Ｎａｒ
ａｎｇら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２１巻、３５
６頁、１９８２年）。

更に、本発明は、形質発現調節配列に操作的に連結され
た、本発明のポリベプチドまたは誘導体をコードする前
記のＤＮＡ，その突然変異体またはフラグメントを含ん
でなるハイブリッドベクターに関する。ＳＥＱ　１０　
ＮＯ：１のＤＮＡ，その突然変異体もしくは誘導体また
は形質発現調節配列に操作的に連結されたＳＥＱ　Ｉｎ
　ＮＯ：１のＯＮ八のヌクレオチド２７６５〜４４１４
からなるＤＮＡフラグメントを含んでなるハイブリッド
ベクターが特に好ましい。

本発明のハイブリッドベクターは、染色体外の要素とし
て、あるいは宿主染色体中への組み込みにより、好適な
宿主中で所望のＤＮＡの複製及び形質発現を示す。幾つ
かの可能なベクター系が、本発明のクローン化ＤＮＡの
組み込み及び形質発現に利用可能である．原則として、
選抜された宿主により本発明の所望のポリペプチド遺伝
子を複製し、形質発現する全てのベクターが好適である
。ベクターは、形質転換について調べられる宿主細胞に
応じて選抜される。一般に、このような宿主細胞は、細
菌もしくは酵母の如き、原核微生物もしくは真核微生物
、または脊椎動物、特に啼乳類の細胞の如き、高等真核
起源の細胞であってもよい。

好適な宿主細胞が、以下に詳しく説明される。原則とし
て、本発明のハイブリッドベクターは、前記のＤＮＡ、
複製開始点または自律的に複製する配列、優性マーカー
配列、所望のＤＮＡの転写及び翻訳に必須の形質発現調
節配列ならびに、必要により、シグナル配列及び付加的
な制限部位を含む．複製開始点または自律的に複製する
配列（染色体外の要素に自律的に複製する能力を与える
ＤＮＡ要素）は、シミアンウイルス（ＳＶ４０）または
その他のウイルス起源から誘導されるような外来の起源
を含めるためのベクターの構築により、あるいは宿主細
胞染色体機構により、提供される。

マーカーは、ベクターを含む宿主細胞の選抜を可能にす
る。選択マーカーは、銅の如き重金属またはテトラサイ
クリン、アンピシリン、ゲネチシン（Ｇ−４１８）もし
くはヒグロマイシンの如き抗生物質に対する耐性を与え
る遺伝子、あるいはチミジンキナーゼ、ヒボキサンチン
ホスホリルトランスフェラーゼまたはジヒドロフォレー
トレダクターゼ等不在の如き、宿主細胞の遺伝子損傷を
補充する遺伝子を含む。

発現調節配列としてベクターＤＮＡは、プロモーター、
即ちＲＮ＾ボリメラーゼをＤＮＡにパインディングし、
かつＲＮＡ合成を開始するように指示するＤＮＡ配列、
リポソームパインディング部位、即ち翻訳、転写の開始
及び翻訳終止シグナルに必要な配列、及びｍＲＮＡを安
定化するのに必要な配列、ならびに必要によりエンハン
サー及び別の調節配列を含む． 多種多様なプロモーター配列が、宿主細胞の性質に応じ
て使用し得る．強力であり、同時に良く調節されるプロ
モーターが最も有用である。翻訳の開始のための配列は
、例えばシャインーダルガーノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇ
ａｒｎｏ）配列である。転写の開始及び終止に必要な配
列及びｍＲＮＡを安定化するのに必要な配列は、ウイル
スまたは真核ｃＤＮ＾の非コード化５′一領域及び３′
一領域のそれぞれから、例えば形質発現宿主から、−Ｓ
に入手可能である。

エンハンサーは、例えばシミアンウイルス、ポリオーマ
ウイルス、ウシの乳頭腫ウイルスもしくはモロニー肉腫
ウイルスから誘導される、ウイルス起源またはゲノム起
源の転写刺激ＤＮＡ配列である。

シグナル配列は、例えばポリペプチドの分泌、またはス
プライスシグナル等を指令する予備配列（ｐｒｅｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ）または分泌リーダーであってもよい。

ベクターＤＮＡの種々のＤＮＡセグメントは、操作的に
連結され、即ちそれらは連続しており、相互に機能的な
関係に置かれる。

大腸菌株での複製及び形質発現に適したベクターの例と
しては、バタテリオファージ、例えばλバクテリオファ
ージの誘導体、または特に、プラスミドＣｏｌＥｌ及び
その誘導体、例えばｐｌ’１８９．ｓｓＦ２１２４．　
ｐＢＲ３１７またはｐＢＲ３２２及びｐＵｃ９，　ｐｃ
ＫＯ，ｐＨＲｉｌ４８及びｐＬｃ２４の如き、ｐＢＲ３
２２由来のプラスミドの如きプラスξドが挙げられる。

好適なベクターは、完全なレプリコン、マーカー遺伝子
、外来ＤＮＡ及び、必要により、形質発現配列がこれら
の部位で挿入し得るような制限エンドヌクレアーゼの認
識配列、ならびに、場合により、シグナル配列及びエン
ハンサーを含む． 微生物プロモーターは、例えば、温度感受性リプレッサ
ーにより調節されるバクテリオファージλの強力な左側
プロモーターＰｔである。また、ｌａｃリプレッサーに
より制御され、そしてイソプロビルーβ−Ｄ−チオガラ
クトシドにより誘導されるｌａｃ（ラクトース）プロモ
ーター、ｔｒｐ　リブレッサーにより制御され、そして
、例えばトリプトファン枯渇により誘導されるｔｒｐ（
｝リプトファン）プロモーター、及びＩａｃリプレッサ
ーにより制御されるｔａｃ　（ハイブリッドｔｒｐ−　
１ａｃプロモーター）の如き、大腸菌プロモーターが好
適である。バクテリオファージのＰＬプロモーターを含
むベクターが好ましい。

酵母での複製及び形質発現に適したベクターは、酵母複
製開始及び酵母に選択的な遺伝子マーカーを含む．この
ようなベクターの一つのグループは、復製開始点として
、云わゆるａｒｓ配列（自己複製配列）を含む．これら
のベクターは、形質転換後に、酵母細胞内で染色体外で
保持され、自律的に複製される。更に、サッカロミセス
・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）に由来する２μ（２ミクロン）プラスミ
ドの全部または一部を含むベクターが使用し得る。この
ようなベクターは、細胞内に既に存在する２μプラスミ
ド中に組換えにより組み込まれるか、あるいは自律的に
複製する。２μ配列は、高い形質転換頻度及び高いコピ
ー数を得ようとする場合、特に好適である。

酵母中の形質発現に適する形質発現調節配列は、例えば
高度に発現された酵母遺伝子の形質発現調節配列である
。従って、ＴＲＰＩ遺伝子、ＡＤＨＩもしくはＡＤＯ　
ＩＩ遺伝子、酸性ホスファターゼ（理射または旦縣）遺
伝子、イソシトクローム（ｉ　ｓｏｃｙ　ｔｏｃｈｒｏ
ｍｅ）遺伝子のプロモーター、または、エノラーゼ、グ
リセルアルデヒド−３−ホスフェートキナーゼ（刑１）
、ヘキソキナーゼ、ビルビン酸デカルボキシラーゼ、ホ
スホフラクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェート
イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピル
ビン酸キナーゼ、トリオースホスフエートイソメラーゼ
、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼ遺
伝子のプロモーターの如き、解糖経路に関与するプロモ
ーターが、使用し得る． 哺乳類細胞での複製及び形質発現に通したベクターは、
ウイルス起源のＤＮＡ，例えばシミアンウイルス４０　
（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイ／Ｉｚス（ＲＳＶ）　、
７’デノウイルス２、ウシの乳頭腫ウイルス（ＲＰＶ）
、パポバウイルスＢＫ突然変異体（ＢＫＶ）　、または
マウスもしくはヒトのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）
由来のプロモーター配列を与えられることが好ましい．
また、ベクターは、アクチン、コラーゲン、ξオシン等
の如き、哺乳類形質発現産物由来のプロモーター、また
は通常、所望の遺伝子配列と会合している天然プロモー
ター及び調節配列を含んでもよい。例えば、プラスミド
は、マウスまたはヒトのサイトメガロウイルスの主要な
即時一初期遺伝子のエンハンサー単位、ヒトα−グロビ
ンプロモーターと組合わされたＳＶ４０エンハンサー、
及び／またはその他に、ヒートショック遺伝子もしくは
メタロチオネイン遺伝子由来のプロモーターの如き、誘
導プロモーターを含んでもよい。ネズミのサイトメガロ
ウイルスプロモーターを含むベクターが好ましい。

本発明の好ましいハイブリッドベクターは、プラスミド
ｐＵｃＫＯまたはプラスξドｐＰ１ｍｕ−ｂｉｏから誘
導されるハイブリッドベクターである。また、ｐＭＲＰ
１６０．　ｐＭＲＰｌ６０ｅｘ及びＰＭＲＰ７０ＰＬと
称されるベクターが好ましい． 更に、本発明は、本発明のポリベプチド及びその誘導体
を形質発現する形質転換した宿主細胞、特に本発明のハ
イブリッドベクターで形質転換された宿主細胞に関する
。このような宿主細胞は、遺伝的に安定であり、しかも
融解及びり・クローニングにより低温凍結培養物から活
性化し得る。

好適な宿主の例としては、バクテリア、特に大腸菌、例
えば大腸菌Ｘ１７７６　、大腸菌Ｙ１０９０　、大腸菌
ＨＢＩＯＩ　、大腸菌−３１１０　，大腸菌ＨＢ１０１
／ｌＪ１０３５、大腸菌Ｊ＾２２１、大腸菌ＤＨ５２ま
たは大腸菌Ｋ１２株、枯草菌、バチルス・ステアロサー
モフィルス（ＢａｃｉｌｌｕＳｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍ
ｏ　ｈｉｒｕｓ）　、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ）属、ヘモフイルス（Ｈａｅｍｏ　ｈｉｌｕｓ
）属、ストレプトコッカス（晶μｑ造１匹肘）　属等、
及び酵母、サッカロ稟セス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｕ９狙ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、例えばＳ．セレビ
シエ（ｃｅｒｅｖｉ−ｓｉａｅ）ＧＲＦ１Ｂなどの制限
酵素または修飾酵素を欠くか、または不充分である微生
物が挙げられる。更に好適な宿主細胞は、高等生物の細
胞、特に樹立連続継代のヒトまたは動物の細胞系、例え
ばヒト胚肺繊維芽細胞Ｌ１３２、ヒト悪性黒色腫ポーズ
（Ｂｏｗｅｓ）細胞、ヘラ（ＨｅＬａ）細胞、（＾ｆｒ
ｉｃａｎ　ｇｒｅｅｎａ＋ｏｎｋｅｙ）のＳＶ４０ウイ
ルスでトランスフォームしたアフリカ緑ザルの腎臓細胞
ＣＯＳ−７またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ
）細胞である。

大腸菌の上記の菌株、特に大腸菌Ｋ１２及びチャイニー
ズハムスター卵巣｛Ｃ｝１０）細胞が宿主として好まし
い． また、本発明は、前記の好適な宿主細胞が本発明に従い
ハイブリッドベクターで形質転換されている宿主細胞の
調製ならびにその形質転換された宿主細胞を選抜する方
法に関する。

微生物の形質転換は、文献、例えばＳ．セレビシエに関
する（Ａ．Ｈｉｎｎｅｎら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ　．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ｔｌｓＡ、７５巻、１９２９真、１
９７８年〉、枯草菌に関する（Ａｎａｇｎｏｓ　ｔｏｐ
ｏｕ　１ｏｓら著、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ１．８１巻、
７４１頁、１９６１年）および大腸菌に関する（Ｍ．Ｍ
ａｎｄｅｌ　ら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ１．　５３巻、
１５９頁、１９７０年）に記載されたように行なわれる
。

従って、大腸菌細胞の形質転換操作は、例えば、ＤＮＡ
の取り込みを可能にするための細胞のＣａ”前処理及び
ハイブリッドベクターによる培養を含む．形質転換した
細胞のその後の選択は、例えば、ベクターＤＮＡのマー
カー配列の性質に応じて、親細胞から形質転換した細胞
の分離を可能にする選択的増殖培地に細胞を移すことに
より行なうことができる．ベクターを含まない細胞の増
殖を不能にする増殖培地が使用されることが好ましい。

酵母の形質転換は、例えばグルコシダーゼにより酵母細
胞壁を酵素で除去する工程、得られたスフェロプラスト
をポリエチレングリコール及びＣａ”゜イオンの存在下
にベクターで処理する工程、並びにスフェロプラストを
寒天中に埋め込むことにより細胞壁を再生する工程を含
む．再生寒天は、上記の形質転換した細胞の再生及び選
択を同時に可能にする方法で調製されることが好ましい
。

哺乳類細胞系の如き、高等真核生物源の細胞の形質転換
は、トランスフェクシゴンにより行なわれることが好ま
しい。トランスフェクションは、リン酸カルシウム沈殿
、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合、エ
レクトロポレーション、即ち、細胞膜の透過性を一時的
に増大する短かい電気パルスによるＯＮ＾の導入の如き
通常の技術により行なわれ、あるいはジエチルアミノエ
チルデキストラン、ジメチルスルホキシド、グリセロー
ルまたはポリエチレングリコール、等の如きヘルパー化
合物の存在下で行なわれる．トランスフエクション操作
後に、トランスフェクションした細胞は、選択マーカー
の性質に応じて選ばれる選択培地、例えば相当する抗生
物質を含む、ダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）
、最小必須培地及びＲＰＭＩ１６４０培地等の如き、標
準培地中の培養により、同定され選抜される。

形質転換した宿主細胞は、資化性炭素源、例えばグルコ
ースまたはラクトースの如き炭水化物、資化性窒素源、
例えばアミノ酸、ペプチド、タンパク質、またはペプト
ンの如き、それらの分解生底物、アンモニウム塩等、並
びに無機塩、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウ
ム及びカルシウムの硫酸塩、リン酸塩及び／または炭酸
塩を含む液体培地を用い、当該技術分野で既知の方法に
より培養される。更に、培地は、例えば、微量元素、例
えば鉄、亜鉛、マンガン等の如き、増殖促進物質を含む
． 培地は、選択圧力を加え、かつ形質転換されなかったか
、またはハイブリッドベクターを失なった細胞の増殖を
防止するように選ばれることが好ましい。こうして、ハ
イブリッドベクターがマーカーとして抗生物質耐性遺伝
子を含む場合には、抗生物質が培地に添加される。例え
ば、必須アミノ酸中で栄養要求性である宿主細胞が使用
され、一方、ハイブリッドベクターが、宿主欠陥を相補
する酵素を暗号化する遺伝子を含む場合には、前記のア
ミノ酸を欠く最小培地が、形質転換した細胞を培養する
のに使用される． 哺乳類細胞の如き、高等真核生物源の細胞は、必要によ
り増殖促進物質及び／または哺乳類血清でもって補充さ
れた、市販の培地、例えば上記のダルベッコ修飾イーグ
ル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地、ＲＰＭＩ１６４０
培地等を用いて、組織培養条件下で増殖される。組織培
養条件下の細胞培養の技術は、当該技術分野で公知であ
り、例えばエアーリフトリアクターまたは連続撹拌リア
クターでの均一懸濁培養、あるいは、例えば中空繊維、
マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズ、多孔質
ガラスビーズ、セラミックカートリッジ、またはその他
のマイクロキャリャーに固定され、もしくは閉じ込めら
れた細胞培養を含む。

培養は、当該技術分野で既知の方法により行なわれる。

温度、培地のρＨ値及び発酵時間の如き、培養条件は、
本発明のポリペプチドまたはその誘導体の最高力価が得
られるように選ばれる．こうして、大腸菌または酵母株
は、約２０℃〜４０゜Ｃの温度、好ましくは約３０℃の
温度、４〜８のｐＨ値、好ましくは約７のｐＨで、約４
〜３０時間（好ましくは、本発明のポリペプチドまたは
誘導体の最高の収率が得られるまで）振盪または撹拌し
ながら液内培養により、好気条件下で培養されることが
好ましい。

細胞濃度が充分な値に達した時、培養が中断され、ポリ
ペプチドまたはその誘導体が単離され得る．ハイブリッ
ドベクターが好適な分泌シグナル配列を含む場合には、
ポリペプチドまたはその誘導体は、形質転換した細胞に
より、直接培地中に分泌される。そうでない場合には、
細胞は、例えばＳＯＳ．ＮＰ−４０、トリトン（Ｔｒｉ
ｔｏｎ）またはデオキシコール酸の如き洗剤処理により
分解され、リゾチームまたは同様に作用する酵素により
溶解され、あるいは超音波により破壊される必要がある
。酵母が宿主微生物として使用される場合には、細胞壁
がグルコシダーゼによる酵素消化により除去されてもよ
い．別法として、または付加的に、剪断力〔例えば、フ
レンチプレス、ダイノ（Ｄｙｎｏ）ミル等〕またはガラ
スビーズもしくは酸化アルミニウムを用いる振とうの如
き機械力、または交互の、例えば液体窒素中の凍結及び
、例えば３０゜Ｃ〜４０゜Ｃに於ける融解、並びに超音
波が、細胞を破壊するのに作用し得る． 細胞を破壊した後に得られる混合物の遠心分離後の細胞
上澄液または溶液（タンパク質、核酸及びその他の細胞
威分を含む）は、それ自体既知の方法により本発明のポ
リペプチドを含むタンパク質に濃縮される．こうして、
例えば、非タンパク質戒分の殆どが、ポリエチレンイξ
ン処理により除去され、本発明のポリペプチド及びその
誘導体を含むタンパク質が、例えば、硫酸アンモニウム
またはその他の塩の飽和溶液により沈殿される。

別法として、細胞上澄液または溶解産物が、前記のクロ
マトグラフィー法を用いて直接予備精製される。

本発明のポリペプチド及びその誘導体は、単核食細胞系
の役割を一層良く理解するのに有益であり、即ちマクロ
ファージ集団中のそれに対する細胞性応答のリンホカイ
ンシグナル及び性質を特定するのに有用である。

本発明のポリペプチド及びその誘導体は、それらの炎症
メディエーター活性のために、炎症プロセスに影響を及
ぼすのに使用し得る．それ故、それらは、慢性の炎症症
状の療法に有用である。

その他に、本発明のポリペプチドまたはその誘導体は、
抗炎症薬として使用し得る拮抗剤の研究、同定及び製造
に有用である． また、本発明は、療法有効量の本発明のポリペプチドま
たは誘導体及び製薬学的に許容され得る担体、例えば無
機もしくは有機の固体もしくは液体の担体を含む医薬製
剤に関する． 本発明の医薬製剤は、人を含む温血動物への、腸内投与
、例えば直腸投与または経口投与のための製剤及び、好
ましくは非経口投与、例えば鼻内投与、筋肉内投与、皮
下投与または静脈内投与のための製剤である。目的とす
る投与方法に応じて、医薬製剤は、単位投薬剤形、例え
ば液体剤形または固体剤形の、アンプル、バイアル、坐
薬、糖剤錠剤、カプセルまたは鼻内スプレーであっても
よい． 療法上有効な化合物の投与量は、体重、疾患の性質及び
重度並びに一般的な状態の如き、患者の状態に依存し、
また投与方式に依存し、処置する医師の判断に従って行
なわれる。本発明のポリペプチドまたはその誘導体の有
効投薬量は、１日に体重１ｋｇ当り０．００１〜１ｎの
程度である。

本発明の医薬製剤は、必要によりその他の療法上有効な
化合物及び／または補助剤と一緒に、通常の無機もしく
は有機の、固体もしくは液体の製薬学的に許容され得る
担体を含む。活性戒分の溶液または懸濁液、特に等張の
水性溶液または懸濁液、あるいはまた使用直前に水に溶
解される凍結乾燥製剤を使用することが好ましい．医薬
製剤は滅菌されてもよく、かつ／または防腐剤、安定剤
、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、増粘物賞、浸透圧を調製
するための塩及び／または緩衝剤、また、その他のタン
パク質、例えばヒト血清アルブミンまたはヒト血漿製剤
をも含んでよい． 療法上有効量のポリペプチドまたはその誘導体を含む水
性分散液中のリポソーム状の医薬製剤が好ましい。特に
、出来るだけ均一な大きさの分布を有し、かつ約０．２
Ｘ１０−＠〜５．　Ｏ　Ｘ　１０−’ｍの直径を有する
、脂質戒分、例えば、レシチン、セファリンまたはホス
ファチジン酸のようなリン脂質の如き両親媒性の脂質及
び、必要により天然脂質、例えばコレステロールの一種
以上の二重層（本発明のポリペプチドまたは誘導体を含
む水性の内部を包囲する）からなるリポソームが好適で
ある．合戒ホスファチジルセリン及びホスファチジルコ
リンの混合物からなるリポソームが好ましい。

更に、本発明は、本発明のポリペプチド、または本発明
の誘導体に特異的なポリクローナル抗体及びモノクロー
ナル抗体、特にＭＲＰ−１６０．　ｒＭＲＰ−７０、ま
たはＭＲＰ−　１６０のフラグメントに対し特異的な抗
体、またはそれらが誘導される抗体の特異性を保持する
ような抗体の誘導体に関する。

本発明のポリクローナル抗体は、哺乳類起源、例えば、
マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、
ブタ、チンパンジーまたはヒト起源、あるいは鳥類起源
、例えばニワトリのポリクローナル抗体である。マウス
、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジまたはニワトリの抗体
、特にウサギ抗体、またはそれらの誘導体が好ましい．
好ましポリクローナル抗体は、ＭＲＰ−１６０，　ｒＭ
ＲＰ−７０、またはＳＩＥ０　１０　ＮＯ：１の１２〜
３０個の隣接アミノ酸を含むＭＲＰ−１６０のフラグメ
ントに特異的である。ＭＲＰ−１６０．ｒＭＲＰ−７０
　、またはＳＥＱ　１０　ＮＱ：１のアミノ酸１１８９
〜１２０４　．　１２４２〜１２５５　．　１４０９〜
１４２７、及び１６２〜１７７のそれぞれに相当するＭ
ＲＰ−１６０のフラグメントに特異的なポリクローナル
抗体が特に好ましい。

ｒＭＲＰ−７０に特異的なポリクローナルウサギ抗体が
最も好ましい。

本発明のポリペプチドまたはその誘導体に特異的なモノ
クローナル抗体、特にＭＲＰ−１６０　、もしくはｒＭ
ＲＰ４０　、またはＭＲＰ−１６０のフラグメントに特
異的なモノクローナル抗体、またはこのような抗体の誘
導体が好ましい。本発明のモノクローナル抗体は、啼乳
類起源、例えばマウス、ラットまたはヒト起源、好まし
くはマウス起源のモノクローナル抗体である。ｒＭＲＰ
−７０に特異的なモノクローナルマウス抗体が好ましい
． 本発明のポリペフ′チドまたは誘導体に対する抗体の特
異性は、エンザイムイムノアッセイで定量的に検出する
ことができ、この分析では、マイクロタイタプレートが
ポリペプチドで覆われ、その後、試験すべき抗体で処理
され、結合抗体が抗体に向けてラベルした抗血清により
検出される。例えば、本発明のマウスモノクローナル抗
体の特異性は、サンドインチ型エンザイムイムノアッセ
イで測定され、このアッセイでは、マイクロタイタプレ
ートのウエルが、本発明のポリペプチドに特異的なウサ
ギポリクローナル抗体で覆われ、その後ポリペプチドそ
のもので覆われ、その後、試験すべき抗体で処理され、
結合されたモノクローナル抗体がマウス抗体の一定の部
分に対して向けられたラベルした抗血清で検出される． 本発明の抗体誘導体は、それらが誘導される抗体の特異
性を保持する．即ち、それらは、親抗体の特徴的なパイ
ンディングパターンを保持する。

このような誘導体の例は、抗体フラグメント、抗体と酵
素、蛍光マーカー、化学発光マーカー、金属キレート、
永久磁性粒子、アビジン、ビオチン等との複合体、また
は放射性ラベルで標識された抗体である。

本発明の抗体フラグメントは、例えば、一価のフラグメ
ントＦａｂもしくはＦａｂ　’または二価のフラグメン
トＦ（ａｂ’　）ｚである。

本発明の抗体の結合体に使用される酵素は、例えば、西
洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、
グルコア藁ラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、アセ
チルコリンステラーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロ
ゲナーゼまたはグルコースー６−ホスフエートデヒドロ
ゲナーゼである。

本発明の抗体と結合される蛍光マーカーは、フルオレセ
イン、フルオロクロム、ローダ果ン、等であり得る。

化学発光マーカーは、例えばルξノールのアクリジニウ
ムエステルである。

このような結合体において、抗体は、結合パートナーに
直接に結合されるか、またはスペーサーもしくはリンカ
ー基を介して結合される。

金属キレート化剤の例は、エチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）、
１．４．８．１１−テトラアザテトラデカン、ｌ．４．
８．１１−テトラアザテトラデカンーｌ．４．８．１１
−テトラ酢酸、１−オキサ−４．７．１２．１５−テト
ラアザヘブタデカン−４　．　７　．１２，１５一テト
ラ酢酸、等である． 本発明の放射性標識抗体は、例えば放射性ヨウ素（１！
３　１　，Ｉｔｓ　ｌ　，＋３１　１　）、トリチウム
（’Ｈ）、炭素（１４Ｇ）、硫黄（３ｓＳ）　、イｙ　
｝’）’７ム（”Ｙ）またはテクネチウム（””ＴＣ）
等を含む．本発明のポリクローナル抗体及びその誘導体
は、それ自体既知の方法、例えば、好適な補乳類または
鳥類が、必要により補助剤の存在下で、ＭＲＰ−１６０
、ｒＭＲＰ−　７０またはＭＲＰ−１６０のフラグメン
トの如き、本発明のポリペプチドまたはその誘導体によ
り免疫され、免疫された哺乳類の血清または免疫された
鳥類の卵が回収され、必要な場合には、抗体が単離され
、かつ／またはその誘導体に転化される方法により得ら
れる． 好適な哺乳類は、外来分子として、抗原、即ち本発明の
ポリペプチドまたはその誘導体を認識する啼乳類、例え
ば、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヤギ、ヒツジまた
はウマである．好適な鳥類は、ニワトリである． 免疫化の経路は、とりわけ、皮肉注射、皮下注射、筋肉
内注射、腹腔内注射、脈管内注射及び頭蓋内注射を含む
．高い抗体力価が所望されるので、連続注射が通常与え
られる。免疫化は、例えば、数日、例えば３〜７日、か
ら数ケ月まで、例えば４週の規則的もしくは不規則的な
間隔で、抗原を非経口的に、例えば腹腔内及び／または
皮下に２回、３回、４回またはそれ以上の回数で注射す
ることにより行なわれる。

抗原は、アジュバント、即ち免疫化操作のために免疫応
答を増大する薬剤と混合されてもよい．可能なアジュバ
ントは、フロイントの完全なアジュバント（Ｋ油、水、
及び逅コバクテリア抽出物のエマルション）、フロイン
トの不完全アジュバント（水と油だけのエマルシッン）
水酸化アルミニウムゲル等である． 哺乳類の免疫応答は、好適な抗体アッセイ、例えば前記
のエンザイムイムノアッセイによりモニターされること
が好ましい。哺乳類の血液が、最後の注射の数日後、例
えば２日〜５日後に集められる．同様に、鳥類の免疫応
答は、最後の注射後、数週間、例えば４〜６週間置かれ
た卵を分析することによりモニターされる。抗体は、既
知の方法により単離される．それらは、最初に、例えば
硫酸アンモニウムによる沈殿、ポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）の如き吸湿性材料に対する透析、選択膜によ
る濾過、等により濃縮され、必要により、及び／または
所望により、濃厚抗体が通例のクロマトグラフィー法、
例えばヒドロキシアジペートクロマトグラフィー、免疫
アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過、イオン
交換クロマトグラフィー、またはＤＥＡＲセルロースも
しくはプロテインＡによるクロマトグラフィーにより精
製される． 抗体のフラグメント、例えばＦａｂ，Ｆａｂ’　もしく
はＰ（ａｂ’　）．フラグメントは、上記のように調製
された抗体から、それ自体既知の方法により、例えばバ
パインもしくはベプシンの如き酵素による消化及び／ま
たは化学還元によるジスルフィド結合の開裂により、得
ることができる。

本発明の抗体の結合体は、当該技術分野で既知の方法に
より、例えば、カップリング剤、例えばグルタルアルデ
ヒド、過ヨウ素酸塩、Ｎ，Ｎ’Ｏ−フェニレンジマレイ
ミド、Ｎ　−　（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）一
スクシンイミド、Ｎ−（３−（２’−ビリジルジチオ〕
−プロビオンオキシ）一スクシンイξドおよびＮ一エチ
ル−Ｎ′−（３−ジメチルアミノプロピル）一カルボジ
イξド等の存在下で、前記のようにして調製された抗体
を反応させることにより調製される。ビチオンとの結合
体は、例えば、抗体をビオチンＮ−ヒドロキシースクシ
ンイミドエステルの如き、ビオチンの活性エステルと反
応させることにより調製される．蛍光マーカーまたは化
学発光マーカーとの結合体は、カップリング剤、例えば
上記のカップリング剤の存在下で調製されるか、あるい
はイソチオシアネート、好ましくはフルオレセインーイ
ソチオシアネートとの反応により調製される．ヨウ素で
放射性ラベルされた抗体は、それ自体既知のヨウ素化、
例えば放射性ヨウ化ナトリウムもしくはヨウ化カリウム
及び次亜塩素酸ナトリウムまたはクロラミンＴ等の如き
化学酸化剤、またはラクトペルオキシダーゼもしくはグ
ルコースペルオキシダーゼの如き酵素酸化剤及びグルコ
ースを用いるヨウ素化により本発明の抗体から得られる
．本発明の抗体は、例えば、ジエチレントリアξンペン
タ酢酸（ＤＰＴＡ）一キレート化により、イットリウム
にカップリングされる。テクネチウム−９９ｍでラベル
した抗体は、リガンド交換法により、例えばベルテクネ
ー｝　（ＴＣＯ４−）を第一スズイオン溶液で還元し、
還元したテクネチウムをセファデックス（Ｓｅｐｈａｄ
ｅｘ）カラムにキレート化し、抗体をこのカラムにかけ
ることにより、あるいは直接ラベル技法により、例えば
ベルテクネート、ＳｎＣ１ｚの如き還元剤、フタル酸ナ
トリウムーカリウムの如き緩衝液及び抗体を保温するこ
とにより調製される． 本発明のモノクローナル抗体及びその誘導体は、それ自
体既知の方法により得られ、この方法では、所望のモノ
クローナル抗体をスクリーニングするハイプリドーマ細
胞系の細胞が、試験管内または生体内で増殖され、必要
とされる場合には、得られたモノクローナル抗体が単離
され、そして／またはその誘導体に転化される。

試験管内の増殖は、好適な培地中で行なわれ、これらの
培地は、必要により哺乳類血清、例えばウシ胎児血清、
または微量元素及び増殖持続補充物、例えば正常なマウ
ス腹腔浸出細胞の如きフイーダ細胞、牌臓細胞、骨髄マ
クロファージ、２一アミノエタノール、インシュリン、
トランスフエリン、低密度リポタンパク質またはオレイ
ン酸等により補強された、通例の標準培地、例えばダル
ベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはＲＰＭＩ１
６４０培地である． 試験管内の生産は、比較的に純粋な抗体製剤を与え、し
かもスケールアップを可能にして多量の所望の抗体を与
える。組織培養条件下の哺乳類細胞培養技法は、当該技
術分野で知られており、例えば、エアーリフトリアクタ
ー中、または連続撹拌リアクター中の均一な懸濁培養、
または、例えば中空繊維、マイクロカプセル、アガロー
スマイクロビーズまたはセラミックカートリッジ中の、
固定化もしくは閉じ込められた、細胞培養を含む．また
、多量の所望のモノクローナル抗体は、細胞を生体内で
増殖することにより得ることができる。この目的で、所
望の抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞が組織適合性の
哺乳類に注射されて、抗体産生性腫瘍の増殖を生じる．
必要により、動物は、注射前に、炭化水素、特にブリス
タン（テトラメチルペンタデカン）の如き鉱油で感作さ
れる．１〜３週間後に、抗体は、これらの補乳頻の体液
から単離される。例えば、所望のモノクローナル抗体を
産生ずるＢａｌｂ／ｃマウスから誘導されたハイブリド
ーマ細胞が、必要によりプリスタンで前処理されたＢａ
ｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射され、１〜２週間後に、腹
水が動物から採取される。

モノクローナル抗体の単離、精製及び誘導体化は、ポリ
クローナル抗体に関して上記されたようにして行なわれ
る．また、放射性ラベルモノクローナル抗体は、放射性
ラベル栄養素を、試験管内の培地中に添加することによ
り、調製し得る。このようなラベル栄養素は、例えば放
射性炭素を含む。

更に、本発明は、本発明のモノクローナル抗体を分泌す
るハイブリドーマ細胞系に関する。

特に、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその誘導
体で免役された哺乳類のＢリンパ球及び骨髄腫細胞のハ
イブリッドであるハイブリドーマ細胞系に関する。優先
的に、これらの細胞系は、マウス骨髄腫細胞及びｒＭＲ
Ｐ−７０で免疫された同系マウスのＢリンパ球のハイブ
リッドである．本発明のハイブリドーマ細胞系は、遺伝
的に安定であり、一定の特異性でもって本発明のモノク
ローナル抗体を分泌し、低温凍結した培養物中で保つこ
ができ、融触及び必要によりり・クローニングにより再
活性化することができる。

また、本発明は、本発明のモノクローナル抗体を分泌す
るハイブリドーマの調製方法に関するものであり、この
方法では、好適な哺乳類が本発明のポリペプチドまたは
その誘導体で免役され、この哺乳類の抗体産生細胞が連
続継代細胞系の細胞と融合され、融合中に含まれるハイ
ブリッド細胞がクローン化され、所望のモノクローナル
抗体を分泌する細胞クローンが選抜される。

免疫化は、ポリクローナル抗体の調製に関して前記され
たように行なわれる．例えば、最後の注射の１〜５日後
に採取され、免疫化された噛乳頻の抗体産生細胞、好ま
しくは牌臓リンバ球の如きリンパ系細胞は、連続継代細
胞系、即ち、この複製能力を融合から生じるハイブリッ
ド細胞に与える連続的に複製する細胞クローン細胞と融
合される。このような細胞系の例は、それ自体免疫グロ
ブリンまたはそのフラグメントを実際に産生しないが、
多量の抗体を産生し分泌する能力を有し、かつハイブリ
ッド細胞が非融合親細胞に対して選抜し得るように遺伝
子マーカーを有する、Ｉｌ！１！瘍細胞系（骨髄腫）で
ある．幾つかの好適な骨髄腫細胞系が当該技術分野で知
られている。酵素ヒボキサンチングアニンホスホリボシ
ルトランスフエラーゼ（ＨＧＰＲＴ）またはチごジンキ
ナーゼ（ＴＫ）を欠く骨髄腫細胞系が好ましく、従って
、これらはヒボキサンチン、アミノプテリン及びチミジ
ンを含む選抜培地（ＨＡＴ培地）で生存しない。ＨＡＴ
培地で生存せず、しかも免疫グロブリンまたはそのフラ
グメントを分泌しない骨髄腫細胞及び誘導細胞系、例え
ば細胞系ｐ　３　ｘ６３Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／
０−Ａｇｌ４が特に好ましい。

融合は、必要によりＵＶ失活状態の、融合プロモーター
、例えばセンダイ（Ｓｅｎｄａｉ）ウイルスまたはその
他のパラミクソウイルスまたはカルシウムイオン、界面
活性脂質、例えばりゾレクチンまたはポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）の如き、化学融合剤の存在下で行なわ
れる。好ましくは、骨髄腫細胞が約３０％〜約６０％の
分子量１０００〜４０００のポリエチレングリコールを
含む溶液中で、免疫化した補乳類からの３倍〜２０倍過
剰の牌臓細胞と融合される． 融合後に細胞に再懸濁され、遺伝選択マーカーに応じて
選ばれた選抜培地、例えばＨＡＴ培地中で培養される。

この培地中では、ハイブリドーマ細胞のみが生存する．
何となれば、それらは親骨髄腫細胞のように試験管内で
増殖し複製する能力なるからである． ハイブリドーマ細胞の膨張に適した培地としては、必要
により哺乳類血清、例えば１０〜１５％のウシ胎児血清
により補給された、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭ
ＢＭ）、最小必須培地およびＲＰＭＩ１６４０培地等の
如き標準培地が挙げられる。好ましくは、フィーダ細胞
、例えば正常なマウス腹腔浸出細胞、牌臓細胞、骨髄マ
クロファージ等が融合工程直後の細胞増殖の開始時に添
加されて、ハイブリドーマ細胞に栄養素を与え、かつ、
特に細胞濃度が低い場合には、増殖因子等を与えること
によりそれらの増殖を支持する．マクロファージまたは
単球の如き食細胞が使用される場合には、それらはアミ
ノブテリン処理後に常に見られる死亡骨髄腫細胞の残滓
を浄化する点で有益な貢献をすることができる。骨髄腫
細胞がハイプリドーマ細胞を過剰に増殖させることを防
止するために、培地は選択培地で補充される。

ハイブリドーマ細胞培養上澄液は、好ましくはエンザイ
ムイムノアッセイまたはラジオイムノアッセイにより、
所望のモノクローナル抗体についてスクリーニングされ
る．陽性ハイブリドーマ細胞は、制限希釈によりまたは
軟質寒天中で、好ましくは２回以上クローン化される。

必要により、ハイプリドーマ細胞は、腹腔内注射及び腹
水の回収により動物、例えばマウスに継代接種され、こ
れはハイプリドーマを安定化し、増殖特性を改善する。

クローン化した細胞系は、通常の方法で凍結されてもよ
い． 本発明のポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は
、本発明のポリペプチドまたはその誘導体の定性測定及
び定量測定に有用である．これらのポリペプチド及びそ
の誘導体は、炎症症状のマーカーであるのと同時に、ホ
ジキンリンパ腫のマーカーである。

例えば、抗体またはその誘導体は、本発明のポリベプチ
ドまたはその誘導体の抗原決定基またはホジキンリンパ
腫マーカーと抗体のパラトープとの間の結合相互作用に
頼る如何なる既知のイムノアッセイにも使用し得る．こ
のようなアッセイの例としては、エンザイムイムノアッ
セイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、化
学発光イムノアッセイ、免疫沈降イムノアッセイ、ラテ
ックス凝集イムノアッセイ、血球凝集イムノアッセイ及
びイム染色が挙げられる． 本発明の抗体は、エンザイムイムノアッセイにそのまま
使用でき、または酵素結合誘導体の形態で使用できる．
エンザイムイムノアッセイのあらゆる既知の改良法、例
えば、可溶性相（均一）エンザイムイムノアッセイ、固
相（不均一）エンザイムイムノアッセイ、単一エンザイ
ムイムノアッセイまたは二重（サンドインチ）エンザイ
ムイムノアッセイが、本発明のポリペプチドまたは誘導
体の直接もしくは間接（競合的）な測定に使用できる． このようなエンザイムイムノアッセイの例は、サンドイ
ンチェンザイムイムノアッセイであり、この測定では、
好適な担体、例えばポリスチレン、ポリプロピレンまた
はポリ塩化ビニル製のマイクロタイタプレートまたは試
験管のプラスチック表面、ガラスもしくはプラスチック
のビーズ、濾紙゛またはデキストラン等、酢酸セルロー
スもしくはニトロセルロースのシート、磁性粒子等が、
簡単な吸着により本発明のポリクローナル抗体またはモ
ノクローナル抗体で覆われ、または必要により、例えば
グルタルアルデヒドまたはシアノゲンブロξドによる担
体の活性化後にそれらで覆われる．その後、本発明のポ
リペプチドもしくは誘導体またはホジキンリンパ腫マー
カーを含む、試験溶液、そして最後に、抗原とも反応し
、かつ酵素標識され、例えばアルカリホスファターゼま
たは西洋ワサビペルオキシダーゼを結合されたポリクロ
ーナル抗体が添加される．試験溶液中の本発明のポリベ
プチドもしくはその誘導体またはホジキンリンパ腫マー
カーの量は、結合したポリクローナル抗体の量に直接比
例し、酵素基質溶液を添加することにより測定される．
酵素基質反応は、例えば、目視観察でき、または光学測
定装置で観察できる色の変化を生じる。酵素ラベルした
ポリクローナル抗体は、担体に結合した抗体よりも抗原
の異なる抗原決定基を認識する本発明の酵素標識モノク
ローナル抗体により置換することができる。

本発明の抗体は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）に、
そのまま使用することができ、または放射性標識誘導体
の形態で使用することができる。エンザイムイムノアッ
セイについて上記したように、ラジオイムノアッセイの
あらゆる既知の改良法が使用できる． 試験は、酵素標識に代えて、放射性標識、例えばＩ！Ｊ
を用いて、上記のエンザイムイムノアッセイと同様の方
法で行なわれる。試験溶液中に存在する本発明のポリペ
プチドもしくはその誘導体またはホジキンリンパ腫マー
カーの量に相当する、生戒された免疫複合体の量が、免
疫複合体の放射能を測定することにより決定される。

本発明の抗体は、化学発光イムノアッセイに、そのまま
使用でき、または化学発光マーカーと結合された誘導体
の形態で使用できる。試験は、酵素標識に代えて化学発
光標識を用い、上記のエンザイムイムノアッセイと同様
の方法で行なわれる。

試験溶液中に存在する本発明のポリペプチドもしくはそ
の誘導体またはホジキンリンパ腫マーカーの量に相当す
る生或された免疫複合体の量が、発光を誘引する化合物
、例えばＨｔＯｔ及びＮａＯＨを添加して光の放出を光
学測定装置で測定することにより測定される。

免疫染色では、凍結保存された生検材料の凍結部分また
はパラフィンに埋め込まれた組織部分が、本発明の抗体
を含む溶液で処理され、次いで洗浄されて本発明の抗体
に結合する第二の抗体で展開される．この第二の抗体は
、放射性標識、それに結合された酵素、蛍光マーカーま
たはビオチンにより、検出することができる．そうでな
い場合には、凍結部分または埋め込まれたｍ織が、前記
の本発明の抗体誘導体、例えばＩ！Ｊを有する放射性標
識誘導体、酵素、例えば西洋ワサビベルオキシダーゼ、
アルカリホスファターゼもしくはβ−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼとの複合体、蛍光マーカー例えばフルオレセインと
の複合体またはビオチンとの複合体の溶液と反応させら
れる。結合された放射性標識抗体は、組織部分の放射能
を調べることにより検出される．結合された、酵素との
抗体複合体は、好適な酵素基質、好ましくは、抗体の部
位または本発明の抗体に結合する第二の抗体の部位で固
体沈着物（株）をもたらす酵素基質による処理の後に検
出される．酵素との抗体複合物に代えて、ビチオンとの
抗体複合体及びアビジンー酵素一複合体の溶液が使用さ
れてもよく、これは抗体の部位における一層高い酵素濃
度をもたらし、従って免疫染色法の増大された感度をも
たらす。

酵素基質の固体沈着物は、顕微鏡による検査により、ま
たは染色物の波長における光学濃度を調べることにより
検出される．蛍光マーカーとの抗体複合体による染色も
同様に検出される。

また、本発明のポリペプチドもしくはその誘導体または
ホジキンリンパ腫マーカーの測定のための前記の抗体及
びその誘導体の本発明の使用は、それ自体既知のその他
のイムノア・冫セイ、例えば、イムノ蛍光ア・ンセイ、
抗体もしくは抗原で被覆されたラテックス粒子によるラ
テックス凝集、抗体もしくは抗原で被覆された赤血球に
よる血球凝集、抗体で被覆された光学繊維を使用する透
過性の光測定及び結合結果を電気信号または光信号等に
変換するその他の直接作用免疫センサーを含む．また、
本発明は、本発明のポリペプチドもしくはその誘導体ま
たはホジキンリンパ腫マーカーの定性的な測定及び定量
的な測定のための試験キットに関するものであり、この
キットは本発明のポリクローナル抗体及び／またはモノ
クローナル抗体及び／またはそれらの誘導体並びに、必
要によりその他のポリクローナル抗体またはモノクロー
ナル抗体及び／または補助剤を含んでなる。

エンザイムイムノアッセイまたはエンザイム免疫染色の
ための本発明の試験キットは、例えば、好適な担体、一
種以上のポリクローナル抗体及び／またはモノクローナ
ル抗体の必要にまり凛結乾燥された溶液、酵素もしくは
ビチオンと結合された抗体の必要により、凍結乾燥もし
くは濃縮された溶液、ビチオン標識抗体が使用される場
合には酵素一アビジン複合体の溶液、固体形態もしくは
溶解形態の酵素基質、本発明のポリペプチドもしくはそ
の誘導体の標準溶液、緩衝液、並びに、必要により、非
特異的な吸着及び凝集物形或を防止するための、ポリペ
プチドもしくは洗浄、ピペット、反応器、較正曲線、指
示マニュアル等を含む。

試験キットの抗体の一種以上が本発明の抗体である． ラジオイムノアッセイまたは相当する免疫染色試験のた
めの本発明のキットは、例えば、好適な担体、一種以上
のポリクローナル抗体及び／またはモノクローナル抗体
の必要により凍結乾燥された溶液、放射性標識抗体の溶
液、本発明のポリペプチドもしくはその誘導体の標準溶
液、緩衝液、並びに必要により、非特異的な吸着及び凝
集物形或を防止するためのポリペプチドもしくは洗剤、
ピペット、反応器、較正曲線、指示マニュアル等を含む
．試験キットの抗体の一種以上は本発明の抗体である． 本発明の抗体及び抗体誘導体は、本発明のポリペプチド
またはその誘導体の定性的測定及び定量的測定に使用し
得る．これらのポリペプチドまたは誘導体が炎症のメデ
ィエーターまたはメディエーターの前駆体であるという
事実により、本発明の抗体及び抗体誘導体は、炎症症状
、特に遅延型過敏性反応の簡単で、しかも信頼のおける
診断にとって有用である．本発明のポリペプチドまたは
それらの誘導体の存在または量は、標準の診断操作、例
えば上記のイムノアフセイ、特にエンザイムイムノアッ
セイにより、ヒトの血清、関節液（ｊｏｉｎｔ　ｆｌｕ
ｉｄ）または血漿の如き生物液体中、組織部分及び細胞
中で測定することができる。

本発明のポリペプチド及びその誘導体の測定は、ポリペ
プチド及びその誘導体の量を測定することが治療の効果
を判定し得るので、療法中の炎症症状の療法をモニター
するのにも使用し得る．更に、本発明の抗体及びその抗
体誘導体は、天然メディエーターの拮抗物質として有用
であり、従って炎症プロセスを制御するのに使用できる
。

本発明の抗体及びその抗体誘導体は、天然起源または形
質転換した宿主細胞から、イムノアフィニティークロマ
トグラフィーにより本発明のポリペプチドまたは誘導体
を単離、精製するのに使用し得る。

さらに、本発明の抗体及びその抗体誘導体は、放射能走
査技法を用いて、患者のホジキンリンパ腫を局在化する
のに使用し得る。その目的で、ＭＲＰ−１６０．　ｒＭ
ＲＰ−７０またはＭＲＰ−１６０７ラグメントに結合す
る抗体の放射性標！Ｉｉ誘導体が患者に注射され、患者
が規則的な間隔でガンマ画像装置で検診される．ホジキ
ンリンパ腫マーカーを形質発現する細胞は、その他の組
織よりも多くの放射性抗体を吸収し、ガンマ画像カメラ
に，より明らかに認められる．好ましくは、１３１　１
または９９＋ｅ７ｃで標識されたモノクローナル抗体は
、１５〜３０μＣｉ／体重１ｋｇに相当する３〜８ｎの
量で放射能走査に使用される。

更に、抗体そのもの並びに、特に細胞毒性化合物及び制
ガン化合物との複合体の如きその誘導体は、ホジキンリ
ンパ腫の治療に使用し得る。哺乳類に関する処置投薬量
は、患者の状態及び適用方法に応じて、抗体そのものの
場合には、体重１ｋｇ当り約１０ｎ〜１■であり、細胞
毒性薬との複合体の場合には、体重１ｋｇ当り１ｎ〜１
００Ｊ！ｇである。

また、本発明は、ホジキンリンパ腫の療法のための固体
もしくは液体の有機もしくは無機の製薬学的に許容され
得る担体と一緒に、療法上有効量の、ＭＲＰ−１６０．
　ｒＭＲＰ−７０もしくはＭＲＰ−１６０フラグメント
に結合する抗体、またはその誘導体を含む医薬製剤に関
する。好適な医薬製剤は、ポリペプチドまたはポリペプ
チド誘導体に代えて本発明の抗体を含む上記の製剤であ
る。

本明細書で使用される略号は、下記のとおりである。

ＢＳＡ　　：ウシ血清アルブミン ＢＣＩＰ：５−ブロモー４−クロロー３−インドリルホ
スフエート ＣＴＡＰ　：仔ウシ腸内アルカリホスファターゼｄＮＴ
Ｐ　：デオキシヌクレオシド三リン酸（Ｎ＝アデニン、
シトシン、グアニンまたはチ藁ン〉 ＤＴＴ　　：ジチオスレイトール ＦＰＬＣ　：高速タンパク質液体クロマトグラフィーＬ
−ブロース：ルリア（Ｌｕｒｉａ）ブロースＭＡｂ　　
：モノクローナル抗体 ＮＴＢ　　：ニトロブルーテトラゾリウムＯＤ：光学濃
度 ｐｄＮ６　：　ｐＮｐＮｐＮｐＮｐＮｐＮ（Ｎ＝デオキ
シヌクレオチド）、ランダム５　−ｍａｒ ｒＡＴＰ　：　（リボ）アデノシン５′一トリホスフエ
ートＲＴ：室温 ＳＯＳ　　：ドデシル硫酸ナトリウム ＴＥ緩衝液：トリスーＥＤＴＡ緩衝液 Ｕ：単位 〔実施例〕 １．１．１全ＲＮＡ　ｆＺリ幻駄 ８Ｘ１０”個のＬ１３２細胞（ＡＴＴＣ　ＣＣＬ５、ヒ
ト胚上皮肺細胞）のべレット５ｄを、４Ｍのグアニジン
イソチオシアネート、２５ｎ＋Ｈの酢酸ナトリウム（ｐ
ｌｌ６）及び１２０ｍＭのβ−メルカブトエタノールを
含む０．８一濾過したＧｕＳＣＮ溶液２０ｌＩ１に溶解
する．激しく振盪した後、ＤＮＡを２２Ｇ二一ドルによ
る連続１０回の通過により部分剪断する．溶液を、ポリ
プロピレンチューブ中の２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ６）中の５．７ＭのＣｓＣ　１の溶液４−からなる三
つのＣａＣ　ｌクッションの上部に層形威させ、ＴＳ↑
４１ローター〔コントロン（Ｋｏｎｔｒｏｎ）　）中２
９．　００Ｏｒｐｍで２０℃でｌ６時間遠心分離する．
上澄液を注意して除去し、ペレットを１．　５　１ｎ１
の０．２％ＳＤＳに再溶解し、クロロホルム１．　５　
ｄで抽出する．２倍容量のエタノールを添加することに
より、ＲＮＡを水相から沈殿させ、１．５−の０．２％
ＳＯＳに再溶解し、０．１５Ｍの酢酸ナトリウムｐＨ６
及び２倍容量のエタノールの添加により再沈させる。

１．１．２妙…立垂離 総ＲＮＡ　１４■を含むＲＮＡペレットを溶Ｍ緩衝液（
１０ｍＭのトリスーＨＣｊ２ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤ
ＴＡ及び０．２％ＳＯＳ）　５ｍｌに溶解し、６５℃で
２分間加熱し、次いで室温まで急冷する，５ＭのＮａｌ
Ｊ０．５５ｄの添加後、溶液を洗浄緩衝液（０．５Ｍの
ＮａＣ　Ｉｌ、１０ｍＭのトリスーＨＣｊ！ｐＨ７．５
、１ｍＭのＥＤＴ八及び０．　２％ＳＤＳ）で平衡にし
たオリゴｄＴセルロース〔型７、ファーマシア（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）　）　０．５　ｇのカラムに３回かける
．カラムを洗浄緩衝液１５ｄで洗浄した後、結合された
ＲＮＡを溶離緩衝液４ＩＩＩ１で溶出させる。

溶出物質を６５℃で２分間加熱し、冷却し、０．　５　
ＭのＮａＣ　ｌに調節し、再平衡カラムに再度かける（
３回）．洗浄緩衝液１５ｄで洗浄した後、ｍＲＮＡをカ
ラムから４１ｄの溶離緩衝液中に溶出させ、３Ｍの酢酸
ナトリウム（ｐ｝１６〜１０）　０．２５一及びエタノ
ール１０ｄの添加後、−２０゜Ｃで一夜沈殿させる。沈
殿物（２７５，ｑ）を遠心分離（１６，ＯＯＯｇで１５
分）により集め、ＨｔＯ　Ｏ．４　Ｉｎ１に溶解し、酢
酸ナトリウム（３　Ｍ，　ｐＨ６　）　２５Ｊｌ！及び
エタノール１−の添加により沈殿させる。ドライアイス
で１０分間冷却した後、ＲＮＡをエッベンドルフ（Ｅｐ
ｐｅｎｄｏｒｆ）遠心分離器中で５分間遠心分離するこ
とにより回収する。

ペレットを空気乾燥し、２７５　ｄのＨｔｏに再溶解す
る。

最初に、鋳型として、例１．１．２のＬ１３２ｄＮＡま
たはヒト末梢血単核白血球（ＭＮＣ　；欧州特許出願第
０２６３０７２号明細書に記載されたようにして調製）
由来のＲＮＡを使用して一本ＩＪｊｃＤＮＡを合戒する
．Ｌ１３２ｍＲＮＡの二つの１（ｌｗの試料またはＭＮ
Ｃ　ＲＮＡ　２０ｇを、１００ｍＭのトリスーＨＣｆ（
４３”Ｃで測定してｐＨ８．３）、１０ｍＭのＭｇＣｊ
！．、１４０ｍＭのＫ（Ｊ！，　１０ｓＭのＤＴＴ，　
　１　ｍＭの各ｄＮＴＰ、１００ｇ／ｄのオリゴーｄＴ
（１２−１８）　（ファーマシア）　、９０ＵのＲナシ
ン（Ｎａｓｉｎ）”（ブロメガ・バイオテク（Ｐｒｏ＋
＊ｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ））、４０ＵのＡＭＶ逆転写
酵素〔ゲノフィット（Ｇｅｎｏｆ　ｉ　ｔ）　）及び５
μｃｉのα一”Ｐ−ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／逅リモル
）を含むそれぞれ５０ｄの溶液中で４３゜Ｃで１時間保
温する．二つの相当する試料を合わせた後、ＲＮＡ−Ｄ
ＮＡハイブリッド分子を以下のようにして回収する。試
料をＥＤＴＡ（ｐＨ７．　５　）及び０．２％ＳＯＳ中
で２０１ＩＩＭのモル濃度に調節し、等容量のフェノー
ルークロロホルム（１：１、ＴＮＨ：１００ｍＭのＮａ
Ｃ　１、１０ｌＩＩＭのトリスー｝１ｃｊ！ｐＨ８．０
，ｌｌＩＩＭのＥＤＴＡで平衡にした）で抽出し、セフ
ァローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　−　４　Ｂ　（ファ
ーマシア、合計３００＋ｓＭのＮａＣ　ｌを含むＴＩＪ
Ｈ中で平衡にした）の１．　５　ｄカラムに装填した．
カラムを同じ緩衝液で洗浄する際に、物質の少なくとも
９０％を含む両分（組込まれた３１ｐにより判断）を合
わせ〔（４〜５）Ｘ５０μ〕、２倍容量のエタノールを
添加する。ドライアイス中でｌＯ分間冷却した後、エッ
ベンドルフ遠心分離器中で５分間遠心分離することによ
り沈殿を回収し、７０％エタノール０．　Ｉ　Ｊｄで洗
浄し、空気乾燥させる，　ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド
を、上記の５０ｊ１１の反応液（オリゴーｄＴを除く）
中で４３℃で１時間再度保温する．その後、反応混合物
をＥＤＴＡ中で２０ｍＭにｇ節し、ＩＮのＮａＯＨ　３
．　８　ｔｄを添加する．その後、反応混合物を７５℃
で２０分間保温し、冷却し、ＩＭのトリスーＨＣｌ（ｐ
Ｈ８　）　２５，ｍ及びＩＮのＲＣｊ！６ｍの添加によ
り中和し、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに関して上記し
たようにして、一本鎖ｃＤＮＡを回収する．二本鎖合戒
に関し、一本鎖ｃＤＮＡ　５　ｎを、３３ｍＭのトリス
ー酢酸塩（ｐＨ７．　９　）　、６６ｍＭの酢酸カリウ
ム、１０＋ｍＭの酢酸マグネシウム、０．５＋＋Ｍのａ
ｒｔ，ｌｍｇ／ｄのＢＳＡ　（ペンタックス・フラクシ
ョン（Ｐｅｎ　ｔａｘｆｒａｃｔｉｏｎ）　Ｖ　，カル
バイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、１０ｎｇ／ｉｄ
のｐｄＮ６　（ファーマシア）、１ａ＋Ｈの各ｄＮＴＰ
，１０μＣｉのα一”Ｐ−ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ミ
リモル）及び５００Ｕ／ｄのＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ
（ＦＰＬＣ一純粋、ファ−マシア）を含む緩衝液１００
メ中で３７℃で３０分間保温する，　ＲＮＡ−ＤＮＡハ
イブリッドに関して記載したようにして、二本饋ｃＤＮ
Ａを回収する．次の工程では、以下に説明される操作に
より、ｃＤＮＡをＳｌヌクレアーゼで消化する，ｃＤＮ
Ａ６ｇｒを、２００ｍＭのＮａＣ　ｌ　，　５０ｍＭの
酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、１ｍＨのＺｎＳＯ．及
び０．　５％グリセロールを含む溶液５０ｄ中で３７℃
で５分間保温する．Ｓｌヌクレアーゼ（ファーマシア）
２．５Ｕを添加し、保温を１０分間続ける，　ＲＮＡ−
ＤＮＡハイブリッドに関して上記したようにして、ＤＮ
Ａを回収する． その後、ＥｃｏＲ　Ｉメチル化を、以下のようにして行
なう．二本鎖ｃＤＮＡ　４　Ｎを、１００ｍＭのトリス
ーＨＣｌｐ｝１８、５ｍＨのＥＤＴＡ，　０．　４　ｍ
ｇ／ｍのＢＳＡ　（ペンタックス・フラクションｖ１カ
ルバイオケム）、１５−のＳ−アデノシルメチオニン〔
バイオラブス（Ｂｉｏｌａｂｓ）　）及び１００ＵのＥ
ｃｏＲ　Ｉメチラーゼ（プロメガ・バイオテク）を含む
溶液５０ｄ中で３７℃で２０分間保温する．０．５Ｍの
ＥＤＴＡ４　ｍ，　ＴＮＥ　１００ｍ及び２０％Ｓ［ｌ
５　１　ｄの添加後、溶液をフェノールークロロホルム
で抽出し、上記のようにしてエタノール沈殿によりＤＮ
Ａを回収する． Ｔ４ポリメラーゼ〔ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ）　）による処理に関してｃＤＮＡ　３　ｐｔｒを、
二本鎖合或に関して上記した溶液（ｐｄＮ６を含まない
）５０Ｉ！１中で３７゜Ｃで１５分間保温し、ＲＮＡ−
ＤＮＡハイブリッドに関して上記したようにしてＤＮＡ
を回収する。

その後、合戒オリゴヌクレオチドリンカーを、以下に説
明されるようにＴ４リガーゼによりＤＮＡフラグメント
の平滑末端嘔つなぐ。ｃＤＮＡ２５■を、２ｈＭの′ト
リスーＨＣｊ！ｐＨ７．８、１０ｍＭのＭｇ（：ｆ．、
ｌ一のロＴＴ，１ｍＭのｒＡＴＰ，　３ＡｚｉｏＵ／Ｉ
ｌｆｆｉのＥｃｏＲ　Ｉリンカー（ｐＣＣＧＧＡＡＴＴ
ＣＣＧＧ，バイオラブズ）及び８００ＵのＴ４リガーゼ
（バイオラブズ）を含む溶液３０ｄ中でｌ５゜Ｃで一夜
保温する．６５゜Ｃで１０分間保温することにより反応
を停止する。Ｈ，０　６０ｊ！１の添加後、ＩＭのＮａ
Ｃｆ，０．５ＭのトリスーＨＣｊ！ｐＨ７．５、０．１
ＭのＭｇＣｊ！　＊　、１０１ＩＭのＤＴＴ及び９０Ｕ
のＥｃｏＲＩ（ボーリンガー）を含む溶液ｌＯｌを添加
し、反応混合物を３７℃で３時間保温する．エタノール
沈降後にＤＮＡを第二のセファロース４Ｂカラムで再度
カラムクロマトグラフィーにかける以外は、ＲＮＡ−Ｄ
ＮＡに関して記載したようにして、ｃＤＮＡを回収する
。

１．３　　　−ム　　ｔ１に　るｃＤＮＡのクローニン
グ例１．２のｃＤＮＡ　Ｌ１３２及びＭＮＣの夫々２５
ｎｇを、２０ｍＭのトリスーＨ（／！ｐＨ７．８　、１
０ｍＷのＭｇＣ　ｆ　，、１ｍＭのＤＴＴ，　　Ｉ　ｎ
＋ＭのｒＡＴＰ及び４００ＵのＴ４リガーゼ（バイオラ
ブズ）を含む溶液中で、ｌ５゜Ｃで一夜で、０．５ｎの
脱ホスホリル化ＥｃｏＲ　Ｉ一消化ラムダｇｔｌｌアー
ム（プロメガ・バイオテク）につなぐ．製造業者により
記載されたように、ギガバック・ゴールド（Ｇｉｇａｐ
ａｃｋ　Ｇｏｌｄ）（商標〉包装抽出物〔ストラタゲン
（Ｓ　ｔｒａ　ｔａｇｅｎｅ）　）及び２０℃で２時間
の保温を用いてつないだＤＮＡを包装する，ＳＭ緩衝液
（１００ｎ＋ＭのＮａＣ／！，　５０＋＋＋Ｍのトリス
ーＨＣｆｐＨ７．５、８ＩＩＩＭのＭｇＳＯ４、０．０
１％ゼラチンからなるファージ希釈緩衝液）０．５ｔｅ
及びクロロホルム２０Ｉｌｌを添加し、ファージ懸濁液
を４℃で貯蔵する。

ラムタ’ｇｔｌｌで形質転換し得る受容細胞の調製のた
めに、大腸菌Ｙ１０９０（プロメガ・バイオテク）の一
夜培養液２Ｉｄを、０．２％マルトース及び５０ｎ／一
のアンピシリンで補充されたＴＭ培地（８ｇ／ｌのトリ
プトン、５　ｇ／ｌの酵母抽出物、２．５ｇ／ｌのＮａ
Ｃ　ｊ！　）２００ｍに添加し、３７℃で保温する。

００，。。が０．　７に達した時、遠心分離により細胞
を集め、５０＋ｓＭのＭｇＳＯ４５０ｄ中で再懸濁する
。

上記のファージ懸濁液の連続希釈液１０ｕＩを受容Ｙ１
０９０細胞の懸濁液１００Ｊ！１に添加し、３７”Ｃで
３０分間保温し、Ｈ．Ｏ中２０■／ｌＩ１のＩ　ＰＴＧ
２０メ及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムア逅ド中２０■／ｒ
ｄのＢｌｕ−ｇａｌ”（ＢＲＬ）　２０　ｌｌ１を含む
上部融解寒天（５５゜Ｃ）４−に添加し、ＴＹプレート
に塗布する．３７”Ｃで一夜保温後、Ｌ１３２ｃＤＮＡ
を含むファージ懸濁液の力価は１０’／一であると計算
され、その４％は野生型ファージである．単核白血球ｃ
ＤＮＡを含むファージ懸濁液の力価は２Ｘ１０’である
と計算され、その３０％は野生型である。

リノール酸誘導マウス腹腔マクロファージからのｃＤＮ
Ａライブラリー（ＭＬ１００５Ｂ）及び末誘導ヒトＵ９
３７細胞からのｃＤＮＡライブラリー（ＨＬ１０２９Ｂ
）　（これらは共にラムダｇｔｌｌ形質発現ライブラリ
ーであり、ゲノフィット（Ｇｅｎｏｆｉｔ）から購入さ
れる）を、免疫ベルオキシダーゼ技法を用いてスクリー
ニングする．そのスクリーニングは、モノクローナル抗
体１ｃ５（ＭＡｂｔｃ５）を結合する分子をコードする
ｃＤＮＡを同定するために行なわれる。このモノクロー
ナル抗体は、欧州特許出願第０１６２８１２号明細書に
記載されている．それは、名称ＩＣ５（ＣＮＣＭ寄託番
号！−３１６）を有するネズミハイブリドーマ細胞系に
より生産され、ヒトマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩ
Ｆ）に特異的である． ｃＤＮＡライブラリーを滴定して２Ｘ１０’個／戚のフ
ァージを生じ、ＳＭ緩衝液で１：１０００に希釈し、各
ライブラリーに関して、１０個のアリコート（２０Ｉ！
ｌ）を、例１．３ノ受容Ｙ１０９０細胞の懸濁液（７）
１０個のアリコート（ｌａｇ）と共に室温で２０分間保
温する．上部融解ＴＹ寒天（６０℃）　ＬＭ！を各試料
に添加し、これを１５ｃｍのＴＹ寒天プレートに塗布す
る。

ｌＯ分後に、プレートを４２℃で３．５時間保温する．
室温で０．４５ＡＩＩ＋のニトロセルロース膜（シュラ
イヒヤー・アンド・シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　
ａｎｄ　Ｓｃｈｕ−ｅｌｌ）を各プレートの上に置き、
湿らせ、Ｈ．０中１．３５ｇ／ｌのＩＰＴＧのフィルム
で３回噴霧する。１０分後、プレートを３７℃で３．５
時間保温する。位置をマークした後、フィルターをＴＢ
ＳＴ緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ，　１０ｍＭのトリ
スーＨｅ　ｌ　ｐＨ　８及び０．０５％トウイーン（Ｔ
ｗｅｅｎ，商標）２０〉中ですすぎ、続いて１％の脱脂
粉乳で補充された同じ乾燥液中で室温で３０分間徐々に
振動させ、ＴＢＳＴ緩衝液で更にすすぐ。

２×１０個のフィルターを、１％の脱脂粉乳及び２０ｍ
ｇ／ｍｌのＭＡｂｌＣ５で補充された２　Ｘ　２００ｄ
のＴＢＳＴ緩衝液中室温で一夜徐々に振動させる。フィ
ルターをＴＢＳＴで１５分間にわたって３回洗浄し、ア
ルカリホスファターゼと接合されたヤギ抗マウスＩｇＧ
〔ディアノバ（Ｄｉａｎｏｖａ））　２　Ｘ２００−で
室温で３０分間保温し、これを１％脱脂粉乳で補充され
たＴＢＳＴでｌ：２５００に希釈する。フィルターを、
１５分間にわたってＴＢＳＴで３回洗浄する。

フィルターを、下記の組ｔｃ　：　１００ｎ＋Ｍのトリ
スーＨ（／！ｐＨ９．５、１０（ｌｗＭのＮａＣ　ｊ！
　，　５　ｍＭのＭｇＣｌｔ　、７０％ジメチルホルム
ア竃ド中７５■／ｄのＮＢＴ　（バイオランド（Ｂｉｏ
ｒａｄ）　）の０．　５％の溶液及び１００％のジメチ
ルホルムア２ド中５０■／成のＢＣＩＰ（バイオラッド
）の０．３３％の溶液、を有する着色試薬の添加により
展開する。各フィルターに１０−の着色試薬を添加し、
信号が明らかに現われるまで（４時間まで）、反応を室
温で進行させ、その後、２０ｍＭのトリスーＨＣ　ｆ　
ｐＨ　８及び５ａ＋ＭのＥＤＴＡを含む溶液中にフィル
ターを入れることにより反応を停止する。

陽性プラークを取り出し、２０ｄのクロロホルムを含む
ＳＭ緩衝液ｌｄ中で室温下１時間振盪させた。ＳＭ中の
連続希釈液を塗布し、上記のようにしてＭＡｂｌＣ５で
スクリーニングする。全てのプラークが陽性反応を示す
までそのプロセスを繰返す．ｃＤＮＡライブラリーの各
々から、二つの陽性ブラークを単離する。即ち、Ｍ９及
びＭＩＯをマウスライブラリーＭＬ１００５Ｂから単離
し、Ｈ３１及びＨ３５をヒトライブラリーＨＬ１０２９
Ｂから単離する。

例２のファージ懸濁液１００Ｊ１１及び例１．３の受容
Ｙ１０９０細胞の懸濁液を混合し、室温で２０分間放置
し、１０ｍＭのＭｇＳＯ４で補充されたＴＹ培地１００
−に添加する。Ｉｆフラスコ中で２５Ｏｒｐｍで３７゜
Ｃで一夜振盪した後、クロロホルム１一及びＲナーゼＡ
ＩＯＯ罐を添加する。室温で３０分後、ＮａＣ　ｌを添
加してＩＭのモル濃度とし、氷で１時間冷却した後、溶
液を遠心分離（８６０００ソーバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）
　０−ター中２，　０００ｒｐｍで２０分）により透明
にする。ポリエチレングリコール６０００を上澄液に添
加してｌＯ％の最終濃度を生じ、混合物を氷の上に１時
間置き、ファージヲ遠心分Ｍ（ソーバルローター中、３
．００Ｏｒｐｍで２０分）によりペレットにする。ファ
ージペレットを、１０ｔｒｇのＲナーゼＡ及び５０Ｉ４
のＤナーゼ■で補充されたＳＭ緩衝液２１ｎ１中に再懸
濁する。

室温で３０分後、溶液をクロロホルム４１Ｉｌ１で抽出
し、続いて遠心分離（１．５００ｇで５分）する．水相
を１０ｍＨのＥＤＴＡｅｘ０．　１％ＳＯＳ及び２００
■のプロナーゼに調節し、室温で１５分間放置し、クロ
ロホルム４ＩＩＩ１で抽出し、続いて遠心分離する（１
．５００ｇで５分）。

水相を、０．５ＭのＮａＣ　ｌ　Ｏ．及び３３％の２−
プロパノールに調節する。氷で１時間冷却した後、遠心
分離（１０，ＯＯＯｇで１０分）によりＤＮＡを回収す
る。

ＤＮＡを２００　ｊ！ｌのＴＥ　（１０ｍＭのトリスー
ＨＣｊ！ｐＨ８．０，１ｍＭのＥＤＴＡ）に溶解し、５
Ｍの酢酸アンモニウム２００ｄ及び２−プロパノール０
．　８−の添加により再沈させ、その後、遠心分離する
（１０．０００ｇで１０分）．７０％エタノールで洗浄
した後、ＤＮＡを２００ｌのＴＥに溶解する。

３．２　　ｃＤＮＡインサー　の ファージＤＮＡ　１０ｌｔｇを、　ＩＯＯｎＩＭのＮａ
Ｃ　１、５０ｍＭのトリスーＨＣ　ｊ！　５０ｄ、１０
ｎ＋ＭのＭｇ（／！ｚ　、１ｍＭのＤＴＴ及び５０Ｕの
ＨｃｏＲ　Ｉを含む溶液１００Ｉｌ！中で３７゜Ｃで１
時間消化する。分取アガロースゲル電気泳動、その後の
電気溶離によりｃＤＮＡインサートを単離する．例２の
組換えファージＤＮＡインサート旧，　ＭＩ０，　８３
１及びＨ３５のサイズは、全て２．３ｋｂであるようで
ある． ３．３シたｃＤＮＡインサー　のサブクローニング 確立された操作（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら著、“Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ，ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　ｍａｎｕａｌ”，コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリイ（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８２年〕を用いて、Ｅ
ｃｏＲ　１ｃＤＮＡインサートをベクターｐＢＬＩＪＫ
ｓＰ”　（ストラタゲン）にサブクローン化する． 阿ＡｂｌＣ５と反応する分子をコードｃＤＮＡを、ＭＡ
ｂｌＣ５、例３．２のｃＤＮＡインサート及びそのサブ
インサートを用いる連続スクリーニングにより、例１．
３のヒトラムダｇｔｌｌｃＤＮＡライブラリーＬ１３２
及びＭＮＣ中で同定する． ｃＤＮＡライブラリーＬ１３２及びＭＭＣ　（例１．３
に記載されたようにして構或された）、市販のｃＤＮＡ
ライブラリーＭＬ１００５Ｂ及びＨＬ１０２９Ｂ　（例
２）、並びに未誘導ヒト白血病誘導ＨＬ６０ライブラリ
ー｝ＩＬ１０２ＱＢ　（ゲノフィット）の夫々５Ｘ１０
個のプラークを、ＩＰＴＧ及びＢｌｕ−ｇａｌ（商標）
を除いて、例１．３に上記されたようにして１０個の１
５ＣＩ１のプレートに塗布する．二つの複製フィルター
（ＮＥＦ−９７８Ａ，　ＮＥＮ）を、確立された操作（
Ｔ．マニアチスら著、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎ
ｉｎｇ．ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ａ＋ａｎｕａｌ“、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリイ、１９
８２年）に従って、それぞれのプレートからつくる。以
下に記載されるような数回のハイプリダイゼーションを
、下記の表１に列記された放射性標識プローブを用いて
行なう。

ハイブリダイゼーション操作を以下のように行なう。２
×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液、６ｘｓｓｃ（
食塩水−クエン酸ナトリウム緩衝液、Ｔ．マニアチスら
の上記の文献を参照のことＬ０．２％ＳＯＳ及び５０ｎ
／ｒｄの変性仔ウシ脳腺ＤＮ＾を含む溶液（１０ｍ／フ
ィルター）中でフィルターを６５゜Ｃで２時間プレハイ
ブリッドを形或する。下記の表１に従って、ハイブリダ
イゼーシゴンを、熱変性オリゴーラベルしたｃＤＮＡブ
ローブ（　３　〜６　Ｘ　１０６ｄｐｍ　／フィルター
）を含む同じ溶液中で６５゜Ｃで一夜行なう。適切なｃ
ＤＮＡフラグメントのオリゴ標識化は、以下のようにし
て行なう．１３ハ中の０．１４のＤＮＡを９５゜Ｃで５
分間静置し、冷却し簡単に遠心分離する。１０　Ｘ　Ｎ
Ｔ緩衝液Ｃｏ．５Ｍのトリス−｝１ｉｐｌ１７．　２、
０．１ＭのＭｇＳＯｎ　、１ｍＭのＤＴＴ及び０．５ｍ
ｇ／ａｆｆｉのＢＳＡ〔ペンタックス・フラクションｖ
１カルバイオケム））　２　ｐｌ，　２０ｍＦＩの夫々
のｄＧＴＰ，　ｄＴＴＰ及びｄＡＴＰを含む溶液１ｌ、
α−”Ｐ−ｄＣＴＰ　（１０ｗ＋Ｃｉ　／　ｔｔｄｌ、
３０００Ｃｉ／ミリモル）３Ｉｊ１、ｐｄＮ６　（　１
■／ＩＩ１、ファーマシア）ｌＪｌ１及びＤＮＡポリメ
ラーゼＩ　（５　Ｕ／Ｉｔｌ，ボーリンガー）１ｄの添
加後、混合物を３７゜Ｃで３０分間保温する．ラベルし
たＤＮＡ（５　Ｘ１０”ｄｐｍ／，ｇ）を、例１．２で
ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに関して記載したようにし
て、回収する．ハイブリダイゼーシゴン後に、二種の下
記の溶液中で６５℃で１５分間洗浄する。２　ＸＳＳＣ
，　０．　２％ＳＤＳ　；　Ｉ　ＸＳＳＣ，　０．　２
％ｓｎｓ及び０．　５　ＸＳＳＣ　，　０．　２％ＳＯ
Ｓ，陽性プラークを、オートラジオグラフィーにより視
覚化する。

ハイブリダイゼーシッン実験で、個々のライブラリー中
で同定されたｃＤＮＡサブフラグメントを下記の表１に
示す．各ブロープｃＤＮＡフラグメントに関し、クロー
ンの名称並びにＭＲＰ−１６０の配列における相対的な
概略配置（例５．２を参照のこと）が示される， 表土：ハイブＩ　゛イゼーシヲンに れたｃＤＮＡクローン ＊塗布された純粋なファージ 一例５：　　　ｃＤＮＡサ　　ー　メン　の　　　　ヌ
５．１　　１ｊ：シ２１製 例４に記載されたようにプラークハイブリダイゼーショ
ンにより同定された陽性プラークを取り出し、連続希釈
液を、例１．３及び例２に上記されたようにして塗布す
る。全てのプラークが陽性になるまで、精製サイクルを
繰り返す。ファージＤＮＡを調製し、ｃＤＮ＾インサー
ト（表１を参照のこと）を、例３に上記したようにして
、単離し、サブクローン化する。

５．２　　鑑剋犬定 ｃＤＮＡサブフラグメントの制限酵素分析を、標準操作
を用いて行なう。ｃＤＮＡフラグメントからの都合のよ
い制限フラグメントを、ベクターｐＢＬＵｓｃＲＩＰＴ
”ＭまたはｐＵｃＫＯ（Ｋ．Ｏｄｉｎｋら著、Ｎａｔｕ
ｒｅ　３３０巻、８０真、１９８７年）中でクローン化
する。

ｃＤＮＡ配列決定は、二本９３　０ＮＡ及びシークエナ
ーゼ（ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）　（商標）一キット及びー
プロトコルを用いるジデオキシヌクレオチド連鎖終止反
応法により行なう（米国生化学；　Ｍ．Ｈａｌｔｉｎｅ
ｒら著、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１３巻、ｌ
０１５頁、１９８５年を参照のこと）．万能プライマー
は、ストラタゲンから得られる．内部プライミング及び
配列確認に関して、表２中に示したブライマーを合戒す
る（Ｙ．Ｉｋｅら著、Ｎｕｃｌ．＾ｃｉｄ　Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ　１１巻、４７７頁、１９８３年を参照のこと〉
。配列を両方向で決定し、制限部位が配列戦略中に使用
される場合には、それらは表２の重複フラグメント及び
内部プライマーを用いて確認される。

１．　　Ｈ　０２６３ｓ ２．　　Ｈ　０３１０ｒ ３．　　Ｈ　０６００ｒ ４．　　Ｈ　０６２１ｓ ５．　　Ｂ　０７９３ｓ ６．　　Ｂ　０８６５ｒ ７．　　Ｈ　０８８３ｓ ８．　　Ｈ　０９００ｒ ＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＣＴＧＡＧＡＣ ＡＣＴＣＧＡＡＡＧＴＣＡＴＣＣＡＣ ＡＴＧＣＴＧＧＣＣＧＴＡＧＡＡＧＴ ＣＣＴＴＣＡＡＡＣＡＴＣＣＣＴＣ＾ ＴＧＧＴＧＧＣＡＣＴＡＡＧＧＣＴＧ ＣＡＣＧＣＣＡＣＡＣＣＡＣＴＣＣＣ ＧＡＡＧＡＡＴＧＡＴＧＧＣＧＣＴＧ ＣＡＧＣＧＣＣＡＴＣＡＴＴＣＴＴＣ ９．　　Ｂ　　１１９０ｓ １０．Ｉｌ　　１４５０ｒ １１．ｔｌ　　１６０１ｓ １２．Ｈ　　１６５０ｒ １３．　　Ｂ　　１７８２ｒ １４．　　８　１８５５ｓ １５．　　Ｈ　２０５３ｓ １６．ｌＩ　　２３７９ｓ １７．　　Ｈ　２５１３ｒ １Ｂ．　　Ｈ　２６１０ｓ １９．Ｈ　　２８８４ｓ ２０．Ｈ　３１１１ｓ ２１．　　Ｈ　３１５７ｓ ２２．　　Ｈ　３４７６ｓ ２３．Ｈ　　３４９２ｒ ２４．　　Ｂ　３６０５ｒ ２５．ＩＩ　　３７３１ｓ ２６．Ｈ　４１１１ｒ ２７．Ｈ　　４２００ｓ ２８．Ｈ　４２５０ｒ ＴＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＣＴＧＡＡＧ ＡＧＧＴＣＣＴＣＡＡＣＣＴＴＣＣＴ ＧＧＴＧＧＣＴＡＣＡＧＴＴＴＣＡＧ ＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＣＡＧＴＴＣＣ ＧＣＴＴＣＴＡＧＣＴＴＴＴＣＴＴＧ ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＡＡＧＧＣＴＣ ＧＡＧＡＣＧＧＣＡＧＡＡＴＴＴＧＣ ＡＣＡＴＣＡＣＡＧＣＴＣＡＡＧＧＣ ＴＴＴＡＡＴＣＴＧＴＴＴＣＴＣＡＧ ＾ＧＴＧＡＡＡＧＡＧＡＣＴＴＴＧＧ ＡＴＧＴＣＡＧＧＡＧＡＴＡＡＣＴＣ ＧＡＡＡＴＴＧＴＣＧＧＡＣＣＴＧＧ ＧＣＣＡＧＧＴＡＴＧＡＧＡＧＡＧＣ ＡＴＧＴＧＧＡＡＧＡＧＣＴＧＡＡＣ ＧＴＴＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＡＣＡＴ ＡＣＴＴＣＴＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＣ ＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＡＡＡＡＧＡＣ ＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴＣＴＴＧＡＧＧ ＣＡＧＴＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＡＣＣ ＴＣＴＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＧＡＴＣ ２９．Ｈ　　４４００ｓ　　　　　ＣＣＴＣＣＡＧＴＧ
ＧＡＧＡＡＣＴＧ３０．　　ｐＵｃＫＯｒ　　　　　Ｃ
ＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＧＡＡＧＣＧ数値は、ＭＲＰ−１
６０の配列上の概略位置を示す（ＳＨＱ　１０　ＮＯ：
１を参照のこと）．Ｈは、オリゴヌクレオチドがヒト配
列上に予想されることを意味し、Ｂは、オリゴヌクレオ
チドがヒト配列及びマウス配列の両方に感作することを
意味する。或種のプライマーはＭＲＰ−１６０配列に完
全には適合しない。ｌｌｌｃＬ３０はｐＵｃＫｏの万能
プライマーである。

６ｋｂ　ｃＤＮＡは、ＭＲＰ−１６０　と称される約１
６０ｋＤの前駆体タンパク質をコードする，　ＭＲＰ−
１６０　ｃＤＮ＾の完全配列及び予想アミノ酸配列が、
ＳＥＱ　Ｉｎ　ＮＯ：１に示される．一つの情報配列を
おそらく代表する１０５個のヌクレオチドの配列が、ク
ローンＨ５及びＮ２から欠けていることがわかる。ＭＲ
Ｐ−１６０配列の上の例４のｃＤＮＡサプフラグメント
の位置が、表３に示される。

．表』一二 ｃＤＮＡサプフーグメン の ＊異常３′一末端；完全配列は不知である＊＊正確な３
′一末端は不知である 班立：迎■一匝財復４策 ＭＲＰ−１６０をコードするＤＮＲを含むハイブリッド
ベクターを、以下に記載されるようにして、構築する。

ベクターｐＵｃＫｏ　５　ｔｒｇ　＠　ＥｃｏＲ　Ｉで
消化し、ＣＩＡＰで脱ホスホリル化し、アガロース電気
泳動及び電気溶離により精製する（フラグメントａ）。

ｃＤＮＡサブフラグメントＨ２３５ｊ！ｇを、ＥｃｏＲ
　Ｉ及びＰｓｔｌで消化する。ＭＲＰ−１６０のＣ一末
端をコヲドする１．４ｋｂフラグメントを、アガロース
ゲル電気泳動及び電気溶離により精製する（フラグメン
｝ｂ）。ｃＤＮＡサブフラグメントＬ７　５［を、Ｐｓ
ｔｌ及びＫｐｎ　Ｉで消化する。ＭＲＰ−１６０の中央
部分をコードする２．　１ｋｂフラグメントを、アガロ
ースゲル電気泳動及び電気溶離により精製する（フラグ
メントＣ）．ｃＤＮＡサブフラグメントし４５■を、Ｅ
ｃｏＲ　Ｉ及びＫｐｎ　１で消化し、ＭＲＰ−１６０の
Ｎ末端部分を暗号化する１．２ｋｂフラグメントを、ア
ガロースゲル電気泳動及び電気溶離により精製する（フ
ラグメントｄ）。

フラグメントａ及びｃ　Ｏ．　ｌ　ｔｔｇ並びにフラグ
メントｂ及びｄｏ．０５ａｖをつなぎ、受容ＤＨ５α細
胞〔ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）　）に形質転換する．組換え
ＤＮＡを単離し、制限分析により分析する。４．７　ｋ
ｂ　ＥｃｏＲ　Ｉフラグメント並びに１．２ｋｂ及び３
．５ｋｂのＥｃｏＲ　　Ｉ−Ｋｐｎ　Ｉフラグメント並
びに０．５ｋｂ及び２．７ｋｂのＰｓｔ　Ｉ−ＥｃｏＲ
　Ｉフラグメントを生じるプラスξドをｐＭＲＰ１６０
と称する． １’ｌＲＰ−１６０コーディング領域の配列を、上記の
オリゴヌクレオチドプライマーを使用する塩基配列決定
により確認する。

■１：己旺別ム立盈染 Ｈ２３サブフラグメントのＤＮＡのコード部分を含むハ
イブリッドベクターを、以下に記載するようにして、構
威する。

ｐＢＬＵＫｓＰ　（商標〉中のＨ２３　ｃＤＮＡインサ
ートのサブクローンを制限分析により分析する．　１．
　２ｋｂ　Ｘｈｏｌフラグメントを生じるクローンをｐ
Ｈ２３と称する。

ｐＨ２３　１０ｇを旧ｎｃｎで消化し、タレノーボリメ
ラーゼで修復する．Ｈ２３のコード部分並びにリンカー
３３個のヌクレオチドを含む１．８ｋｂフラグメントを
、アガロースゲル電気泳動及び電気溶離により単離する
（フラグメントａ）。ベクターｐＰＬｍｕ−ｂｉｏ　（
バイオジエン（Ｂｉｏｇｅｎ）　）から入手した，？Ｕ
ｃ９ボリリンカーによるＮｃｏ　Ｉ−Ｈｉｎｄ　■フラ
グメントの置換により、ｐＰＬｍｕｓＭｃｏｒｉ　（Ｇ
．Ｂｕｅｌ　ｌら著、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ　１３巻、ｌ９２３頁、１９８５年）から誘導
される）１０ｎをＮｃｏ　！で消化する。付着末端をタ
レノーボリメラーゼで充填し、ＤＮＡをＣＩＡＰで脱ホ
スホリル化する。３ｋｂベクターをアガロースゲル電気
泳動及び電気溶離により単離する。

０．　１　ｔｒｇのフラグメントａ及びｂをつなぎ、大
腸菌Ｋ１２ラムダ溶原菌株に形質転換する。組換えプラ
スξドを単離し、制限消化により分析する。

０．６ｋｂのＢａｍＨ　Ｉ−Ｘｈｏ　Ｉフラグメントを
生じるプラスミドをｐＭＲＰ７０ｒＬと称する。ｐＭＲ
Ｐ７０ｐｔの正しい構築を配列決定により確認する。

ＰＭＲＰ７０ＦＬを、温度感受性ＣＩ遺伝子（Ｅ．Ｒｅ
ｍａｕｔら著、Ｇｅｎｅ　２２巻、１０３頁、１９８３
年）を有するプラスごドｐｃ１８５７を含む受容ＬＣ１
３７細胞（ＳＣ９３６；Ｇ，ブエル著、上記の文献及び
Ｓ．Ｇｏｆｆら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．＾ｃａｄ．ｓ
ｃｉ．ＵｓＡ　８１巻、６６４７頁、１９８４年）中で
、再度、形質転換する。形質転換体は、カナマイシン＋
アンビシリン抵抗性により選抜される。ｐＭＲＰ７０■
？含む細胞を、−７０゜Ｃでグリセロール培養液として
貯蔵する。

班主：■ｌ？Ｐ−７文へ免酵 １）ＭＲＰ７０ＦＬによりコードされているベプチドｒ
ＭＲＰ−７０を、以下に記載されるようにして大腸菌中
で形質発現する。

ｐＭＲＰ７０ｐｔを含む細胞を、グリセロール培養液か
らカナマイシン／アンピシリンプレートの上に線条接種
し、３０’Ｃで保温する。単一コロニーから、１２ｄの
培養菌をｔ，ｎＭ＊Ａ（５０ｇ／一のアンピシリン及び
４０ｎ／ｄのカナマイシンを含むＬ−プロース）中で３
０゜Ｃで６時間増殖させる（培養菌ａ〉。次に、２１フ
ラスコ中の１０個の２００ｊｄのＬＢＭＫＡを培養菌ａ
１−で接種し、３０゜Ｃで一夜振盪する．培養菌を８０
０一の３０″ＣのＬＢＭで希釈して更に３時間増殖させ
る（培養菌ｂ）．培養菌ｂを５０℃の水浴中で４２゜Ｃ
に迅速に加熱し、その後４２゜Ｃで２時間振盪すること
によりｒＭＲＰ−７０の合成を誘導する（培養菌ｃ）．
培養菌Ｃからの細胞を遠心分離により集める。

［１　：　ｒＭＲＰ−７　　の　　　び　　づ番９．１
　　農ＪＬｔＬ社 例日の１０１の発酵ブロースから１．　２　００／ｄ単
位の光学濃度に増殖されたｒＭＲＰ−７０を形質発現す
る大腸菌細胞を、２−プロパノール中１００一のフェニ
ルメチルスルホニルフルオライド（ＰＳＭＰ）　６　ｄ
ヲ含む、８Ｍのグアニジニウム塩酸塩、５０ｍＭのトリ
スーＨＣ　ｌ　％’　３０ｍＭのＮａＣ　ｌ　，　２５
０ｌＩ１（ｐＨ　８．　０　）で破壊する．懸濁液を２
０．　０００　ｇで４゜Ｃで６０分間遠心分離する．上
澄液をジチオスレイトール（ＤＴＴ）中で０．１％とし
、１０ｍＭのトリスーＨＣｌ、０．０１％ＤＴＴ，　ｐ
Ｈ８．　０に対して４℃で透析する〔スペクトラボ−（
Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ）膜ｋ３；３．５ｋＤカットオフ
：スペクトラム・メディカル・インダストリイズ（Ｓｐ
ｅｃｔｒｕ＋＊Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ
））　．生或した白色沈殿を、４゜Ｃ下２０．０００ｇ
で３０分間遠心分離により除去する。

９．２　　０ＥＡＲイオン　　クロマ　グーフィ一例９
．１の上澄液を、透析緩衝液で平衡にしたＤＥＡＥ−　
トリスアクリル（Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ）Ｍ（ＬＫＢ）イ
オン交換カラム（　５　Ｘ　１０ｃｍ）にポンプ輸送す
る．試料の装填後に、ＵＶ　２５４ｎｍの吸収が基準線
のレベルに達するまで、カラムを透析緩衝液で洗浄する
．４成／分の流量で、０．　Ｍ〜０．２ＭのＮａＣ　１
　（６００ｙｄ）の範囲透析緩衝液中のＮａＣ　ｌの線
形勾配、その後透析緩衝液／０．２ＭのＮａＣ　ｊ！　
（２００ｄ）そして透析緩衝液／０．１ＭのＮａＣ　Ｉ
ｌ　（２００ｍ）を用いて、カラム結合されたタンパク
賞を溶出する．個々のｌ２ＩＩ１の両分を集め、１５％
ポリアクリルアξドスラブゲル（コマシーブルーＲ−２
５０で染色）でＳＯＳ−ＰＡＧＥ（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍ
ｌｉ著、Ｎａｔｕｒｅ　２２７巻、６８０頁、１９７０
年〉により分析し、それらのｒＭＲＰ−７０の含量に応
じて溜める。０．１２〜０．２ＭのＮａＣ　ｌの両分を
溜め、透析緩衝液に対して透析し、カラム寸法（２．６
　Ｘ　１０ｃｍ）、緩衝溶容量（５０％）及び流量（２
ｍ／分）以外は同じ操作を用いて再度クロマトグラフィ
ーにかける，　０．１６　〜０．　２　ＭのＮａＣ　ｊ
！の画分を溜め、撹拌セル（ＹＭ−１０膜、アミコン（
Ａｍｉｃｏｎ）　）中の限外濾過により１０倍に濃縮す
る。

９．３　　サイズ　　クロマトグーフィー例９．２の限
外濾過後の濃縮溜め液（タンパク質濃度１４■／ＩＩ１
）２ＩＩ１を、３ＩＩｌ１／分の流量で２０−のリン酸
ナトリウム、１５０ｍＭのＭａｃｅ，　ｐＨ７．　０で
ウルトロバック（Ｕｌｔｒｏ　Ｐａｃ）ＴＳＫ−Ｇ２０
００ＳＷＧ（ＬＫＢ）（２１．５Ｘ６００ｍ）カラムで
分離する，ＵＶ吸収を２８０ｎｏ＋でモニターし、個々
の６ｊｄの百分を、例９．２に記載したようにして、Ｓ
ＯＳ−ＰＡＧＢにより分析する．試料注入の３２〜３６
分後に採取した両分を溜め、撹拌セル（ＹＭ−１０膜、
アミコン）中の限外濾過により７倍に濃縮する． 例９．３の限外濾過後の濃縮溜め液４−（タンパク賞濃
度４．９■／一）を、２ｈＭのジエタノールアξン／Ｈ
Ｃｌ，　ｐＨ８．５　（開始緩衝液）中で平衡にされた
ＭｏｎｏＱ　（商標）ＨＲ　１０／１０カラム（１０ｍ
ｎ＋Ｘ　１００ｍ）（ファーマシア）に装填する．カラ
ムを、開始緩衝液でもって、４−／分の流量で１０分間
洗浄する。

その後、タンパク賞を開始緩衝液／０．１ＭのＮａＣ　
１で終了するまでの２０分間にわたる直線グラジエント
により溶出する．溶出液を２８０ｎｍにおける吸光度に
ついてモニターする．ｒＭＲＰ−７０は、試料（約０．
５５　〜０．６５ＭのＮａ（／！）の注入の２１〜２３
分後に溶出される． ９．５　Ｌ徂肚銭 例９．３に記載されたサイズ排除｝ＩＰＬｃ、または例
９．４に記載されたＭｏｎｏＱによるＦＰＬＣによる精
製の別法として、例９．２の限外濾過後の濃縮溜め液を
１／ｌＯの容量の１０％のトリフルオ口酢酸（ＴＰＡ）
で酸性にし、バイダック（Ｖｙｄａｃ）　２１４ＴＰ５
１０ＨＰＬＣカラム（１０Ｘ２５０ｍｍ）　（ザ・セパ
レーション・グループ（Ｔｈｅ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ
　Ｇｒｏｕｐ）、ヘスペリア、カリフォルニア州、米国
）で精製する．カラムを、７０％の水中０．　１％のＴ
ＦＡと３０％のアセトニトリル中０．０８％のＴＦＡと
の混合物で平衡にし、ｌＩｉ／分の流量で、５０％の水
中０．１％のＴＦＡと５０％のアセトニトリル中０．０
８％のＴＦＡとの混合物で終了する、２４分にわたる直
線グラジエントにより生威物を溶出する．溶出液を２２
０ｎａ＋における吸光度に関してモニターし、ＵＶ吸光
度に応じて個々のピークを手動で集める．二つの主要ピ
ークが、それぞれ１５分及び１６．５分で得られ、例９
．６に下記するようにして分析される． ９．６　　ＳＤＳ−ＰＡＧＥに 例９．５の逆相カラムからの両分のアリコートを、減圧
乾燥し、解離緩衝液に溶解し、９６゜Ｃで２分間加熱し
、次いで１５％ポリアクリルアミドゲル（コーマシープ
ルーＲ−２５０で染色）に適用する．例９．５の１５分
目のピークは、それぞれ５５ｋＤ，　４４ｋＤ，　３８
ｋＤ及び３３ｋＤの概略の見掛分子量のｒＭＲＰ−７０
の幾つかの短縮された変種を含む．　１６．５分目のピ
ークの物質は、７０ｋＤの概略分子量を有する、単一帯
中で移行する純粋なｒＭＲＰ−ＴＯからなる．９．７　
　ヱまＬ葭父朝公捉 例９．６の精製ｒＭＲＰ−７０を、Ｍ．Ｗ．ｌＩｕｎＫ
ａｐｉ　ｌｉａｒ及びＬ．ｌＥ．｝ｌｏａｄの方法（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｏ＋ｏｌ．　９１巻、３
９９頁、１９８３年）による気相配列決定装置〔型式４
７０、アプライド・バイオシステムズ（ＡｐｐＩｌｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓ−ｔｅａ＋ｓ）　）を用いて、Ｎ一末端ア
ミノ酸配列分析にかける．アニリノーチアゾリノン誘導
体を、５０゜Ｃで２５％の水性ＴＦＡによる処理により
、フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）に転位させる，
　ＰＴＩ｛アミノ酸を、Ｒ，Ｋｎｅｃｈｔら（Ａｎａｌ
，Ｂｉｏｃｈｅｓ．　１３０巻、６５頁、１９８３年）
によるゾルバクス（Ｚｏｒｂａｘ）　（商標）　ＣＮＨ
ＰＬＣカラム（デュポン；　２００Ｘ　４．　６閣）で
分析する．下記のＮ末端アミノ酸配列が見られる．Ｍｅ
ｔ−ＡＳＰ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ
−Ａｓｐ−　Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ
−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ．アミノ酸配列は、例５．２
に記載されたｃＤＮＡ構築から予想される配列と正確に
合致する。

９．８　　免疫監叉公捉 ２０％ヒト血清で補充されたマッコイ培地（バイオクロ
ム、ベルリン、ＦＲＧ）中の培養３日後に、単球１５０
ｇでｌＯ分間遠心分離によりテフロンバッグ中に回収し
、ＰＢＳ中で洗浄し、ｌ％ＢＳＡ，ｌａｅＰＢＳ／　Ｉ
　Ｘ　１０’個の細胞中の１躍／ＩＩ１のマウスＩｇＧ
中で４゜Ｃで３０分間保温する．細胞をＰＢＳ中で２回
洗浄し、１．５ｍのエッペンドルフバイアル中の試験場
所当りＩＸＩＯ”個の細胞に分別する。ｒＭＲＰ−７０
または天然ヒトＭＩＦ（欧州特許出願第０１６２８１２
号明細書）の適当ナ希釈液ＣＰＢＳ中、１００ｍ／　Ｉ
　Ｘ　１０’個の細胞）中の保温は、４゜Ｃで１０分間
行なわれる。

細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、ビチオニル化モノクロー
ナル抗体ＩＣ５（マウス、欧州特許出願第０１６２８１
２号明細書を参照のこと〉または抗ｒＭＲＰ−ＴＯ血清
（ウサギ）と共に４５分間保温する．対照は、夫々、ビ
オチニル化マウスＩｇＧまたは正常のウサギＩｇＧであ
る。ＰＢＳ／０．０５％ＢＳＡ中の２回の洗浄後に、細
胞を、ビオチニル化抗体処理プローブに関しては、スト
レプトアビジンーＦＩＴＣ　（シグマ、ミュンヘン、Ｆ
ＲＧ）と共に、またウサギ抗血清処理ブローブに関して
は、ヤギ抗ウサギＦ（ａｂ’　）＊−ＦＩＴＣ（ディア
ノバ、ハンブルグ、ＦＲＧ）と共に、４℃で４５分間保
温する。

細胞をＰＢＳ７０．０５％ＢＳＡ中で２回洗浄する。最
後の洗浄の前に、細胞をＰＢＳ中１ｍＭのプロピジウム
ヨージド１００〆中で再度懸濁し、４℃で５分間保温し
、洗浄し、ＥＰＩＣＳＴＭセルソーター〔コールター・
エレクトロニクス（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ
ｉｃｓ）、ヒアリー（Ｈｉａｌｅａｈ）　、フロリダ州
、米国〕中で分析する。赤色の蛍光細胞を、細胞の緑色
蛍光測定から電気的に排除する。緑色蛍光性の陽性細胞
の比率（％）を、コールター・エレクトロニクスにより
供給された免疫プログラムにより計算する。

蛍光細胞の相対量は、ｒＭＲＰ−７０及び天然のＭＩＦ
に関して同様である。これは、天然のＭＩＦ及びｒＭＲ
Ｐ−７０の両方が培養単球に結合することを示す。

９．９　　遵走祖止成竣 テフロン膜上で、１０％ＦＣＳ　（バイオクロム、ベル
リン、ＦＲＧ）で供給されたダルベッコ培地中で１日培
養された白血球層単球を、１５０ｇで１０分間の遠心分
離により回収し、ＦＣＳを含まないダルベッコ培地中で
２回洗浄し、１．　５　１ＩＩ１のエッペンドルフバイ
アル中２Ｘ１０’個の細胞／試験場所に分別する．細胞
を再度懸濁し、ｒＭＲＰ−７０または天然ＭＩＦ（欧州
特許出願第０１６２８１２号明細書）の適当な希釈液を
用いて、または用いずに、２００ｉｌＩのＰＢＳと共に
４゜Ｃで１０分間保温する。細胞を１５０ｇで５分間遠
心分離し、洗浄し、２００ｄのＰＢＳ中で再度懸濁し、
３７゜Ｃで３０分間保温する。

ＰＢＳで洗浄した後、ペレット化した細胞を、０．２％
の低温融解性のアガロース（マイルズ（Ｍｉｌｅｓ）、
フランクフルト、ＦＲＧ　）を含む４Ｉ１ｌのダルベッ
コ培地中で３７”Ｃで再度懸濁する。細胞懸濁液ｌＪ１
！を、９６個のウエルプレートの内部の６０個のウエル
の一つにピペットで入れる。それぞれの試料を２回試験
する。プレートを４゜Ｃで１０分間保つ。ウエルに１０
０Ｉｌｌ／ウエルのダルベッコ培地、１０％ＦＣＳを満
たし、７％のＣＯｔを含む湿った空気中で３７゜Ｃで１
６〜２４時間保温する。

保温後に、アガロース液滴からの単球の遊走を、顕微鏡
の接眼レンズ中の目盛付きレチクルの助けにより測定す
る。対照溶液中の細胞の遊走を、１００％の遊走または
Ｏ％の遊走阻止と設定する。遊走距離を、遊走阻止率（
％）として表わす。物質が３０％以上の遊走阻止率を生
じる場合に、それは生物活性と考えられる。

ｒＭＲＰ−７０による遊走阻止試験の結果を、下記の表
４に要約する。

１：　ｒＭＲＰ− の ｐｓＶＯｄ　ＤＮＡ（Ｐ．Ｍｅｌｌｏｎら著、Ｃｅｌｌ
　２７巻、２７９頁、１９８１年）　１０ｇ＠Ｈｉｎｄ
ｌＩ［で消化する．付着末端をクレノーポリメラーゼで
満たし、ポリメラーゼの熱失活後に、ＤＮＡをＮａｅＩ
で消化する．複製のＳＶ４０源を有する２．２ｋｂベク
ターフラグメントを、アガロースゲル電気泳動及び電気
溶離により単離する（フラグメントａ　）　．　１０ｇ
のｐＣＧＡ２８ＤＮＡ　（欧州特許出願第０３０５９６
７号明細書）をＢａＩＩＩＩ　Ｉで消化する．付着末端
をタレノーボリメラーゼで満たし、ＤＮＡを仔ウシ腸ホ
スファターゼで脱ホスホリル化する。

ネズξサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）プロモーター
／エンハンサー、ｔＰＡｃＤＮＡ及びβ−グロビンスプ
ライスドナー／アクセブター及びボリー付加部位を有す
る３．９ｋｂフラグメントを、アガロースゲル電気泳動
及び電気溶離により単離する（フラグメントｂ）．約５
０ｎＨのフラグメントａ及びｂをつなぎ受容ＤＨ５α細
胞中に形質転換する。！ｆｌ換えプラスミドを単離して
Ｐｖｕ　Ｉ及びｆｌｉｎｄＩ［［による消化により分析
する。１．４ｋｂのフラグメント及び４．８ｋｂのフラ
グメントを生じるプラスミドをｐｃＯＮ１０と称する．
５趨のｐｃＯＮ１０をＸｔａａｘ　Ｉで消化し、ＣＩＡ
Ｐで脱ホスホリル化する．ＤＮＡを、アガロースゲル電
気泳動及び電気溶離により精製する。

配列５’−ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ−３’を有するアダプ
ター（バイオラブズａｌｌ０１）　Ｉ　ｎを、Ｔ４ボリ
ヌクレオチドキナーゼで付活し、′ｒ４リガーゼとつな
ぐ。

リガーゼの熱失活後に、ＤＮＡ＠Ｘ＋Ｉｌａｘ　Ｉで消
化する。

フェノール／クロロホルムによる抽出後に、ＤＮＡをエ
タノールで沈殿させる（アダプターｅ）。

５０ｎｇのＤＮＡフラグメントｄを５０ｎｇのアダプタ
ーｅにつなぎ、受容ＤＨ５α細胞中に形質移入する。

組換えＤＮＡを単離し、ＢａｍＨＩ及び旧ｎｄｌｌＩに
よる消化により分析する。１．　７　ｋｂのフラグメン
ト及び４．　４　ｋｂのフラグメントを生じるプラスミ
ドをｐｃＤＥＸと称する。

Ｖｉ：迎討記匪μΔ通築 ５ｊｔｇのｐＭＲＰ１６０をＥｃｏＲ　Ｉで消化し、付
着末端をクレノーポリメラーゼで満たす。ＭＲＰ−１６
０を暗号化する４．　７　ｋｂのフラグメントを、アガ
ロースゲル電気泳動及び電気溶離により単離する（フラ
グメントａ）．５ｎのｐＣＤＥＸを、Ｈｉｎｄ［［及び
Ｂａｗｌ｛　Ｉで消化する。付着末端をクレノーポリメ
ラーゼで満たし、ＤＮＡをＣＩＡＰで脱ホスホリル化す
る（フラグメントｂ）。Ｏ．　ｉ　ｎのフラグメントａ
及びｂをつなぎ、受容ＤＨ５α細胞中に形質転換する。

組換えＤＮＡを単離し、制限分析により分析する。０．
６ｋｂＫｐｎ　Ｉフラグメント並びに４．１ｋｂのＸｈ
ｏ　Ｉフラグメントを生じるプラスミドをｌ）ＭＲＰ１
６０．Ｘと称する．ＭＲＰ−１６０コード領域の配列を
、上記のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる配列決
定により確認する。

班肥：チ　イニーズハムス の プラスミドｐＭＲＰｌ６０ｅｘを、チャイニーズノ＼ム
スター卵巣（ＣＩＯ）細胞系ＤＵＫＸＢＩ、即ち酵素ジ
ヒドロフォレートリダクターゼを欠く変異体（Ｇ．Ｕｒ
ｌａｕｂら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．［ＩＳＡ　７７巻、４２１６真、１９８０年）中で形
質発現する．細胞を、ヌクレオシド及び５％の仔ウシ胎
児血清（全てギブコから入手）を含むα−ＭＥＭ　（最
小必須培地）中で培養する。

細胞を６個のウエルのプレー｝（３．４ｃｍ直径；ヌン
ク（Ｎｕｎｃ））中ｌ０４個／ｄの密度で塗布し、プラ
スミドｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｐ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ及びＰ
，Ｂｅｒｇ　１巻、３２７頁、１９８２年）のＤＮＡ４
ｇと同時形質移入し、その後、米国特許第４．３９９，
２１６号明細書、，Ｒ，Ｊ，Ｋａｕｆｍａｎ及びＰ．Ａ
．Ｓｈａｒｐ著、Ｊ．Ｍｏ１．Ｂｉｏ１．１５９巻、６
０１頁、１９８２年及びＡｓｓｅｌｂｅｒｇｓら著、Ｊ
．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．　１８９巻、４０１頁、１９８６
年に詳しく記載された標準操作を行なう。第二の実験で
は、プラス旦ドｐＮＤ２（ＤＨＦＲ）のＤＮＡ　０．４
ｇを、ｐＭＲＰ１６０ｅｘのロＮＡ　Ｏ．４ｎ及びｐＳ
Ｖ２−ｎｅｏ　（アッセルベルグズらの上記の文献）０
．４ａｇと同時形質移入する。

４８時間後に、形質移入した細胞をトリプシン処理し（
ｔｒｙｐｓｉｎｉｚｅｄ）　、３枚のべトリ皿（直径８
．　０ｃｍ、ヌンク）、に移す．翌日、非選択培地を選
択培地（５％（Ｖ／Ｖ）の透析された仔ウシ胎児血清及
び１．　０■／ｄのゲネチシン〔ギブコ〕を含み、ヌク
レオシドを含まないα−ＭＩＥＭ）により置換する．２
週″間後に、１８個のゲネチシン抵抗性クローンを単離
し、確立されたプロトコル（Ｓｕｔｅｒら著、Ｃａｎｃ
ｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１６巻
、５３頁、１９８３年）に従って、例１４．２のアフィ
ニティー精製したウサギ抗−ｒＭＲＰ−７０抗体を用い
る単一細胞分析でＭＲＰ−１６０の形質発現に関して調
べる．４個のクローンは、抗−ｒＭＲＰ−７０　１ｇＧ
でもって選択的に染色する。それらをＩＢ８，　２Ａ２
．　２Ｂ１及び２Ｂ３と称する。これらのクローンのう
ち、２八２．　２Ｂ１及び２Ｂ３は、ブラスミドｐＮＤ
２で同時形質移入された。

これらの形質移入体の細胞溶解産物による免疫プロット
法（Ｈ．Ｔｏｗｂｉｎら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７６巻、４３５０頁、１９７９
年）は、還元条件下で（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ著、Ｎ
ａｔｕｒｅ　２２７巻、６８０頁、１９７０年）、ウサ
ギ抗−ｒＭＲＰ−７０抗体が１２０ｋロ及び１４０ｋＤ
の分子量種と反応することを示す。

ＣＨＯクローン２８１のサブコンフルエント培養液を、
２０ｎＨのメトトレキセー｝　（ＭＴＸ，シグマ）で２
４時間前処理し、直径８Ｃｌ（ヌンク）のべトリ皿中に
１：２０に分断する．細胞を、５％の透析された仔ウシ
胎児血清及び０．０５■／ｄのゲンタマイシン（全てギ
ブコから入手）（Ｒ５カウフマン及びＰ．Ａ．シャープ
の上記の文献を参照のこと）で、補充されたヌクレオシ
ドを含まない選択培地α−ＭＥｌ’！中で増殖させる。

２０ｎＭのＭＴＸをペトリ皿に添加することにより選抜
を２４時間後に開始する。１４日後に、抵抗性コロニー
を溜め、５０ｎＭのＭＴＸを含む選択培地中で希釈を９
６個のウエルプレート（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）中
に制限することによりクローン化する。

単離された１６個のクローンのうち、３個がウサギ抗一
ｒＭＲＰ−７０抗体でもって強い陽性である。２Ｂ１−
８４と称されるクローンを、１００ｎＭのＭＴＸを含む
選択培地中で希釈を制限することにより再クローン化す
る。８個の抵抗性クローンが選抜され、それらの全てが
ウサギ抗一ｒＭＲＰ−７０と反応する。２Ｂ１−８４Ｃ
２及び２８１−８４Ｅ３と称されるクローンを、５００
ｎＭまでのＭＴＸ　濃度の段階的な増加にかける．増殖
されたＣＨＯクローン２８１−８４Ｃ２及び２Ｂ１−Ｂ
４ｆ！３の細胞溶解産物及び培養上澄液中のｒＭＲＰ−
７０及びＭＲＰ−１６０の定量測定に関して、二つの部
位で酵素連鎖される免疫吸着剤分析（ＥＬＩＳＡ）が行
なわれる。

１２．３．１　　　　　　　　　　　　び　　　上　　
　の培養上澄液の生或に関して、ＣＨＯクローン２Ｂ１
，２８１−８４Ｃ２．　２Ｂ１−Ｂ４Ｅ３及びＣＨＯ偽
形質移入されたクローン３ＡＢ　（例１２．１）をサブ
コンフレンシー（Ｓｕｂｃｏｎ−ｆ　ｌｅｎｃｙ）まで
増殖させ、５％の透析された仔ウシ胎児血清で補充され
たα−ＭＢＭで４８〜７２時間培養する。クローン２Ｂ
１−８４Ｃ２及び２８１−８４Ｅ３は、その他に２００
ｎＭのＭＴＸを受容した。回収後、上澄液を２，０００
ｇで１５分間遠心分離し、その後１２，０００ｇで１５
分間遠心分離し、次いで−８０゜Ｃにて貯蔵する。

細胞溶解産物の調製は標準プロトコルに従って行なう．
簡単に云えば、トリプシン処理した細胞（２Ｘ１０’個
／一）を、氷冷しなから溶菌緩衝液（１００ｍＭのトリ
ス、１００ｍＭのＮａＣ　ｌ　，　　１　ｍＭのＥＤＴ
Ａ，０．　１％ＳＤＳ　（以上、全てバイオラドから人
手）、１．０％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０　
（Ｓｈｅｌｌ）　、１．０ｍＭのフェニルメチルスルホ
ニルフルオリド〔ベーリンガー・マンハイム）　、ｐＨ
７．　５　；　Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ及びＰ．Ａ．Ｓ
ｈａｒｐの上記の文献を参照のこと）でｌ５分閾処理す
る。細胞残滓を２．０００ｇで１５分間回転させた後、
上澄液を１２，ＯＯＯｇでｌ５分間遠心分離し、一８０
゜Ｃで貯蔵する．全タンパク質濃度を、Ｌｏｗｒｙらの
方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｎ＋．　１９３巻、２６５
頁、１９５１年）に従って測定する。

１２．３．２　　二里且匹旦Ｌ 偽形質移入体３ＡＢ　，親形質移入体、並びにＭＴＸで
処理したクローン２Ｂ１−８４Ｃ２及び２Ｂ１−８４Ｅ
３の細胞溶解産物及び培養上澄液のアリコートを、以下
に記載される、二つの部位で酵素連鎖された免疫吸着剤
分析（ＥＳＩＳＡ）を用いて、ｒＭＲＰ−７０及びＭＲ
Ｐ−１６０のそれらの濃度に関して試験する．ＥＬＩＳ
Ａは、標準プロトコル（Ｅ．Ｅｎｇｖａｌｌ及びＰ．Ｐ
ｅｒｌｍａｎ著、Ｉ＋ｕ＋ｕ−ｎｏｃｈｅ＋ｓ．　８巻
、８７１頁、１９７ｌ年；　Ｊ　，　Ｂｒｕｅｇｇｅｎ
ら著、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｓｕｎｏ１．Ｉｍｍｕｎｏｔ
ｈｅｒ．１５巻、２００頁、１９８３年）に従って、例
１４．２のアフィニティー精製したウサギ抗−ｒＭＲＰ
−７０抗体を用いて行なう．　０．０５Ｍの炭酸塩緩衝
液ｐＨ９．６中のウサギ抗−ｒＭＲＰ−ＴＯ　ＩｇＧ（
１．０ｇ／Ｉｎ１）を１００Ｉｌ１／ウェルで９６個の
ウェルプレート（Ｎｕｎｃ　Ｆｌ）に塗布し、４℃で一
夜保温する．非特異的部位を、０．２％ゼラチン及び（
バイオラド）、１．０％ウシ血清アルブくン（Ｓｅｒｖ
ａ）及びトゥイーン（商標）２０（バイオラド）を含む
、トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ．０．０５Ｍ，　ｐＨ７．
　４　）で室温で１時間封鎖した後、試験試料（５０Ｉ
ｌ１）、組換えｒＭＲＰ−７０標準物質（１．９〜２５
０ｎｇ／　ｒｔｔｆｌ、例９を参照のこと）及びプロッ
キング緩衝液中で希釈された対照を、３７℃で１時間に
わたって添加する。プレートを、ビオチニル化抗一ｒＭ
ＲＰ−ＴＯ　ＩｇＧ　（５０，ｎ、０．　５　ｎ／　ｔ
ｔｄｌ　；Ｌｅｒｎｅｒらの改良プロトコル（Ｊ．Ｅｘ
ｐ．　Ｍｅｄ．　１５２巻、１０８５頁、１９８０年）
によるビオチニル化）を含むＴＢＳで３７゜Ｃで３０分
間洗浄する〔スカトロン・ミクロウォシュ（Ｓｋａｔｒ
ｏｎ　Ｍｉｃｒｏｗａｓｈ）　ＩＩ　）　６洗浄後、ス
トレブトアビジンアルカリホスファターゼ複合体（ギプ
コＢＲＬ）５０ｍを３７゜Ｃで３０分間添加する。結合
された酵素を、Ｐ−ニトロフエニルホスフェート（ジエ
タノールアξンＩＩｄ中１．　０■の緩衝剤ＩＭ，ｐＨ
９．８；シグマ）１００ｍで周囲温度で３０分保温し、
０．　５　ＮのＨｉで停止する。４０５ｎｍにおける吸
光度を読み取る〔マルチスキャン（Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ
）ＭＣＣ，（Ｆｌｏｗ））　．データーは、４−パラメ
ーター計算曲線適合プログラム（フロー）を用いて減少
される。

ＥＬＩＳＡの結果を、下記の表５に要約する。

．表Ｊ一： ＣＩＯ １の ａ，二部位ＥＬＩＳＡ．ウサギ抗−ｒＭＲＰ−７０対ビ
オチニル化ウサギ抗−ｒＭＲＰ−７０；値はｎｇ／Ｉｄ
であり、組換えｒＭＲＰ−７０標準物質を基準とする．
検出限界は１．　０　ｎｇ／一である。

ｂ．全細胞タンパク質の■数に関係する。

Ｃ．上澄液は、サブコンフルエント細胞培養の開始の７
２時間後に回収される。

ＭＴＸ で処理されたクローンは、親細胞２Ｂ１よりも約５０倍
以上のｒＭＲＰ−７０関連タンパク質を細胞内で形質発
現する。ＭＴＸクローンの上澄液は、免疫活性タンパク
質５０〜６０ｎｇ／Ｉｎ１／１０６個の細胞を含み、一
方、親細胞２８１は陰性である。

ｆ！Ｌｕ：モルモ　　の　　にお番る　　　　の嫌ＭＲ
Ｐ−１６０を、正常なモルモットを使用する試験で皮膚
反応を誘導する能力に関して試験する，正常なモルモッ
トを剃毛し、麻酔し、幾らかの？ＩＲＰ−１６０で増殖
したＣＯＯ細胞系の上澄液各ｌＯＯｌｌＩで皮下注射す
る．皮膚反応を、２４時間後及び４８時間後に調べる．
陽性反応は、直径約５〜１２ｍｍの領域で著しい赤変を
生じる。幾つかのＭＲＰ−１６０で増殖した細胞系は、
皮膚反応を誘導するが、一方、同一条件下で培養され注
射された対照細胞または培地そのもののいずれもが効果
を生じなかったことがわかる． 完全フロイントアジュバント（ギブコ）中の０．５■の
ｒＭＲＰ−７０（例８及び例９に記載したようにして調
製された）をウサギに注射し、２０日後に不完全フロイ
ントアジュバント（ギブコ）中の０．　５■のｒＭＲＴ
−７０をブースター注射する。ウサギ血清の力価を、確
立されたプロトコル（Ｅ．Ｅｎｇｖａｌｌ及びＰ．Ｐｅ
ｒｌｍａｎｎ，　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．　８巻、８７
１頁、１９７１年）に従って、ｒＭＲＰ−７０″？！塗
布されたマイクロタイタプレート中で酵素連鎖免疫吸着
剤分析（ＥＬＩＳＡ）により監視する。ウエスタンプロ
ット試験は、未形質移入大腸菌細胞の溶解産物による徹
底的な吸着後に、血清中に唯一残された反応性がｒＭＲ
Ｐ−７０に対して示されるものであることを明らかにす
る．ｒ−ＭＲＰ−７０−アフィゲル（＾ｆｆｉｇｅｌ）
１０免疫吸着剤力ラムは、製造業者の操作（バイオラド
）を用いて、４〜５■の精製ｒＭＲＰ−７０を１一のア
フィゲル（商標）１０にカップリングすることにより調
製される。例１４．１の単一特異性ウサギ抗−ｒＭＲＰ
−７０血清からの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を、５０
％飽和硫酸アンモニウムにより沈殿させる。沈殿をＰＢ
Ｓに溶解し、ＰＢＳに対して透析する．約１００■のＩ
ｇＧを含む透析溶液を、ｌＯ〜１２ｍｆｌ／時間の流量
で、イムノアフィニティーカラム中にポンプ輸送する。

非特異的に結合された物質は、カラムをＰＢＳ／０．４
　Ｍの塩化ナトリウムで洗浄することにより除去される
．特異的に結合されたＩｇＧを、０．１Ｍのグリシン塩
酸塩（ｐＨ２．　５　）で溶出する。抗体を含む両分を
溜め、ＩＭのトリスを添加することにより中和し、ＰＢ
Ｓに対して透析する。ｒＭＲＰ−７０に対して特異的な
ＩｇＧ約４■が得られる。

下記のオリゴベプチドを、Ｈ．Ｒｉｎｋら著”Ｐｅｐｔ
ｉｄ−ｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｊ．Ｅ．Ｒｉｖｅｒ及び
Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ［）、ＥＳＣＯＭ．Ｌｓｉｄ
ｅｎ　１９９０、１０４１頁に記載された方法を用いて
、Ｎ−メチルビロリドン中で、それらの予備生或１−ヒ
ドロキシベンゾトリアゾールエステルとして、９−フル
オレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護アミノ酸
を用いて、段階的固相ペプチド合或により合或する。

ＭＲＰ−１６０フラグメント１　：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ
Ｏ：１のアごノ酸１１８９　〜１２０４に相当するＧｌ
ｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｖａ　ｌ−Ｌｅ
ｕ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇ　
ｌｕ−Ｍｅ　ｔ−Ｍｅ　ｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ， ＭＲＰ−　１６０フラグメント２　：　ＳＥＱ　１０　
ＮＯ：１のアミノ酸１２４２　〜１２５５に相当するＡ
ｒｇ−＾ｓｎ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅ
ｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ
−Ａｌａ　，ＭＲＰ−１６０フラグメント３　：　ＳＥ
Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：ｌのアミノ酸１４０９　〜１４２７に
相当するＧｌｕ−　Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−
Ｐｈｅ−Ｇｌｙ一旧ｓ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｓ
ｎ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ
−Ｐｈｅ　． ＭＲＰ−１６０フラグメント４　：　ＳＥＱ　１０　Ｎ
Ｏ：１のアミノ酸１６２〜１７７に相当するＳｅｒ−Ｔ
ｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌ
ｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｔ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ
−Ａｌａ−Ｌｙｓ　，完全フロイントアジュバント（ギ
ブコ）中の例ｌ４．３の４種のオリゴペプチドの夫々０
．　５　ｍｇを、４匹の異なるウサギに注射し、２０日
後に不完全フロイントアジュバント（ギブコ）中でブー
スター注射する。ウサギ血清の力価は、例１４．１の夫
々のペプチドで塗布されたマイクロタイタプレート（ヌ
ンク）中の酵素連鎖免疫吸着剤分析（ＥＬＩＳＡ）によ
監視される。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を、５０％の
硫酸アンモニウムにより血清から沈殿させる。

アフィゲル１０免疫吸着剤カラムは、製造業者の操作（
バイオラド）を用いて、ＭＲＰ−１５Ｑフラグメント１
，２．３及び４の夫々４〜５ｍｇをアフィゲル（商標）
１０にカップリングすることにより調製される。ＩｇＧ
の４種の沈殿をそれぞれ、ＰＢＳに溶解し、ＰＢＳに対
して透析する。約１００■のＩｇＧを含む夫々の抗−Ｍ
ＲＰ−１６０７ラグメントＩｇＧ沈殿の透析溶液１５−
を、１０〜１２−／時間の流量で、イムノアフィニティ
ー力ラムにポンプ輸送する。例１４。２に記載したよう
にして、ＩｇＧを溶出する。ＭＲＰ−１６０７ラグメン
ト１　，　２　，’３及び４の夫々に対して特異的なＩ
ｇＧ約４■が得られる。

Ｊｌｌ長：　ｒＭＲＰ−７０に　してモノクロー　ル１
５．１　　　　　　７’ｏ　｝　−ｉ　ｔｖ三匹の雌の
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、完全フロイントアジュバント（
ギブコ）中の０．　１■のｒＭＲＰ−７０で夫々腹腔内
注射し、その後１４日間隔で、不完全フロイントアジュ
バント（ギブコ）中の０．０５■のｒＭＲＰ−Ｔｏを２
回ブースター注射する。６週間後に、生理食塩水中の０
．０５■のｒＭＲＰ−７０を注射し、４日後にマウスを
犠牲にする。

１５．２　　　　　人　びハイブｉ　ドーマの全ての融
合は、非分泌性骨髄腫細胞系Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３
（ＡＴＣＣぬＣＲＬ　１５８０）を用いて、確立された
プロトコル（Ｇ．Ｋ６ｈｌｅｒ及びＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎ著、Ｎａｔｕｒｅ２５６巻、４９５頁、１９７６年）
に従って行なう。１０＠個の牌臓細胞を、３５％（Ｗ／
Ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ　４０００　、メ
ルク）及び１５％ジメチルスルホキシド（メルク）の存
在下で１０７個の骨髄腫細胞と融合する。融合混合物は
、フィーダ細胞としてマウス腹腔浸出細胞を含むマイク
ロタイタプレート（ファルコン）の１２００個のウエル
中で、２０％ＦＣＳ　（ギブコ）で補充された標準ＨＡ
Ｔ選択培地中に分配する。１０〜１４日後、増殖ハイブ
リドーマの上澄液が、サンドイッチＥＬＩＳＡ（例１６
）によりｒＭＲＰ−７０の結合に関して試験される。陽
性ハイフリドーマを、希釈を少なくとも２倍に制限する
ことにより、再クローン化する。

年令８〜１０週のＢａｌｂ／ｃマウスを、０．３一のプ
リスタン（Ａｌｄｒｉｃｈ）で腹腔内で（ｉ．ｐ．）前
処理する。

２〜３週後、（５〜１０）　ＸＩＯ’個のクローン化ハ
イブリドーマ細胞及び０．　２　７ｄのブリスタンでｉ
．ｐ．注射する。８〜１０日後、腹水を集め、８００ｇ
で遠心分離し、一８０゜Ｃで貯蔵する． 別途、ハイブリドーマ培地（ギブコ）を用いて、ハイブ
リドーマを、大規模で試験管内で増殖する。

一上澄液を８００ｇで遠心分離し、０．４５１ｌｍのナ
ルゲン（Ｎａｌｇｅｎｅ，商標）フィルターで濾過し、
−８０゜Ｃで貯蔵する。

粗免疫グロブリンを、０．９等倍容量の飽和硫酸アンモ
ニウムのＯ℃での滴下添加により沈殿させ、その後、２
０ａ＋ＨのトリスーＨＣｆ，５０ｍＭのＮａＣ　ｌ　（
　ｐＨ７．９）に溶解する。ＩｇＧ画分は、バイオラド
のＡｆｆｉｇｅｌ（商標）タンパク質ＡＭＡＰＳキット
操作を用いることにより得られる。溶出したＩｇＧ画分
を再度硫酸アンモニウムで沈殿させ、ｌＯ■／ｄの濃度
でＰＢＳに溶解し、同じ緩衝液に対して透析する．ポリ
クローナルウサギ抗−ｒＭＲＰ−７０または例ｌ４の抗
−ＭＲＰ−１６０７ラグメント１．２．３もしくは４抗
体または例１５のモノクローナル抗−ｒＭＲＰ−７０抗
体ｌ■及びＢｉｏｔｉｎ−Ｘ−ＮＨＳ（商標）（カルバ
イオケム）を、製造業者により提案された操作に従って
、０．１Ｍのヘペス（Ｈｅｐｅｓ）緩衝液（ｐＨ　８．
　０　）１．Ｏａｅ中で４゜Ｃで４時間反応させる。ビ
オチニル化した抗体をＰＢＳに対して４゜Ｃで透析し、
−８０”Ｃで貯蔵する。

１６．２　　　ン゛イ・・　ＥＬＩＳＡＭＲＰ−１６０
．　ｒＭＲＰ−７０及びＭＲＰ−１６０７ラグメントを
、例１２．３．２に記載された二部位サンドイッチＥＬ
ＩＳＡにより検出する． その分析は、形質転換された細胞中のｒＭＲＰ−７０、
またはヒト単球の細胞溶解産物中、形質転換された細胞
中、及び１．０ｎｇ／一までのヒト患者の体液中のＭＲ
Ｐ−１６０を検出する． １６．３　　サン　イ　　ＢＬＩＳＡ　　の゛　キ　ト
例１６．２のサンドイッチＥＬＩＳＡ用の試験キットは
、例えば、下記の要素を含む． ・マイクロタイタプレート（ヌンクＦｌ）・０．０５Ｍ
の炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）　２０ＷＩＱ中のアフィ
ニティー精製されたポリクローナル抗一ｒＭＲＰ−７０
ウサギ抗体（ＩＲ／ａｅ） ・０．０５％のトゥイーン２０を含むＴＢＳ中の組換え
ｒＭＲＰ一標準溶液（ｌｌｌｇ／Ｊｄ！）　１．０ｄ・
ＴＢＳ（ｐＨ　７．　４　）　、０．　２％ゼラチン、
１％ＢＳＡ　，０．０５％トゥイーン２０中のビオチニ
ル化ポリクロ一ナルウサギ抗−ｒＭＲＰ−７０抗体Ｃ０
．５ｎ／　ｄ　）　１０ＩＩｄｔ・ＴＢＳ（ｐＨ７．　
４　＞、０．２％ゼラチン、１％ＢＳＡ，　０．０５％
トゥイーン２０中のストレプトアビジンーアルカリホス
ファターゼ（ＢＲＬ）１：５０００　１０ａｄｉ２００
ｄＴＢＳ　Ｓ０．０５％トゥイーン２０２００ａｅＴＢ
Ｓ（ｐＨ７．　４　）、０．２％ゼラチン、ｌ％ＢＳＡ
０．０５％トゥイーン２０ ・ジエタノールア逅ン緩衝液（ＬＭ，ｐＨ９．８）中の
ｐ−ニトロフェニルホスフェート（１．０■／１１１１
！）２０成 ・較正曲線 ・指示マニュアル 奥旦：　　　　　によるホジキン１ンパ　のリンパ節生
検材料、皮膚生検材料、またはその他の組織生検材料を
、液体窒素により冷却されたイソペンタン中に急に凍結
させ、−７５゜Ｃで貯蔵する。５−の組織部分を切断し
、アセトン中に１５分間定着し、室温で一夜乾燥する。

これらの部分をＰＢＳ中で１０分間水和させ、その後、
例１４．２の抗一ｒＭＲＰ−７０ウサギポリクローナル
抗体の１：１００希釈？中で３０分間保温し、ＰＢＳ中
で１０分間すすぎ、その後、ビオチニル化マウス抗一ウ
サギモノクローナル抗体（ダコパッツ、コペンハーゲン
、デンマーク）の１：４００希釈液中で３０分間保温す
る。これらの部分を、製造業者の指示に従って、ＰＢＳ
中で１０分間すすぎ、ＡＢ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　（商標）
（ビオチニル化ベルオキシダーゼと複合されたアビジン
、ダコパッツ）で処理する。反応生威物を、色素産生基
１ｉ　ＡＢＣ／過酸化水素（５０■のア累ノエチルカル
バゾール、３３Ｊの３０％Ｈ．Ｏ■、５ＩＩ１のジメチ
ルホルムア竃ド、１００ｍの酢酸塩緩衝剤０．０５ＭＳ
ｐＨ６．　９　）で展開する．これらの部分を酢酸塩緩
衝液中で４分間すすぎ、マイヤーのヘマトキシリンで逆
染色し、グリセリンゼリーを取り付け、顕微鏡で検査す
る． 異なる源からの生検材料から得られた結果を表６中にま
とめる．抗−ｒＭＲＰ−７０抗血清を用いる免疫染色は
、ホジキン症及び関連の未分化大細胞リンパ腫に明らか
に限定される。

，表』ー ホジキンＩンパ　　び ２００　ＩＩｇのｒＭＲＰ−７０またはＭＲＰ−１６０
を５Ｎのヒト血清アルプミン３ＩＩｉに溶解する。得ら
れた溶液を細菌フィルターに通し、濾液を無菌条件下で
１０個のパイアル中に分ける。バイアルは低温例えば２
０’Ｃで貯蔵されることが好ましい。

同様に、５Ｎのヒト血清アルプごン３ｄ中の例１４及び
１５のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体０
．　５■、１■、２■及び５■を含む医薬製剤が好まし
い。滅菌生理食塩水２　ｍｌｌ中にｒＭＲＰ−７０（例
１５）に関するモノクローナル抗体１０■を溶解するこ
とにより、一層高い濃度の医薬製剤が得られる。

起』巳し瓦上 ＳＥ０　　１０　　ＮＯ：１ 配列型：相当するタンパク質を有するヌクレオチド配列
長さ：　５８５Ｂ塩基対／１４２７アミノ酸起源生物：
ヒト 中間体実験源：λｇｉｌｌにおけるｃＤＮＡライブラリ
ー性質：炎症及びホジキンリンパ腫マーカーＧＣＧＧＣ
ＧＣＡＧＧ　ＣＧＧＣＧＧＣＧＴＣ　ＣＧＡＧＧＡＧＡ
ＴＴ　ＴＡＡＴＣＣＡＧＡＧ　ＡＣＴＧＡＣＴＴＣＡＣ
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ＣＡＧ１υプ １１ＬＩ ＳＥＱ　ＩＱ　ＮＯ：１続き ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１　ａき Ｊ８ｂ Ｊソυ ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１続き Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　ｌ
ｉｌｙ　Ａｓｐ　ｖａｔ　ＡＳＩ１　ｎｅｔ　：ｓｅｒ
　Ｌｅｕ　Ｓ１ｅｒＳＥＱ　　１０　　ＮＯ：１　　続
き Ｓｔ！０　１０　ＮＯ：１続き Ｇｌｔ＋　　Ｓｅｔ　　Ｓｅｒ　　Ｌｙｓ　　Ａｌａ　
　Ｓｅｒ　　ｓｅｒ　　ｈｅ　　Ｉｒｌｒ　　Ａｒｇ　
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　１０　ＮＯ：１続き ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１続き ＳＥΩ１０　Ｈｏｗｌ続き １２；１０ ＩＺＪ） ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１続き ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１続き ＾ＣＡＣＣＡＧＣＡＴ　ＴＧＴＧＴＧＴＧＣＡ　ＧＡＣ
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ＣＣＡＡＡＳＥＱ　１０　ＮＯ：１続き

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、炎症のメディエーターまたはメディエーター前駆体
   である約１６０ｋＤの見掛分子量を有するポリペプチド
   、またはその誘導体。 ２、ヒト起源のものである請求項１記載のポリペプチド
   、またはその誘導体。 ３、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるアミノ酸配列を有す
   るＭＲＰ−１６０で表わされる請求項１記載のポリペプ
   チド、またはその誘導体。 ４、フラグメントである請求項１記載の誘導体。 ５、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるアミノ酸配列を有す
   るアミノ酸８２８〜１４２７を含み、Ｎ末端が水素、ア
   シル、アミノ酸配列Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−
   Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇ
   ｌｙもしくはアミノ酸配列Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｉ
   ｌｅ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌ
   ｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−である請求項４記載のフラグメン
   ト。 ６、アミノ基及び／またはヒドロキシル基がグリコシル
   化またはアシル化されている化合物である請求項１記載
   の誘導体。 ７、製薬学的に許容され得る塩である請求項１記載の誘
   導体。 ８、１９０ｋＤの見掛分子量を有する請求項１記載の誘
   導体。 ９、１４０ｋＤの見掛分子量を有する請求項１記載の誘
   導体。 １０、請求項１記載のポリペプチドまたはその誘導体の
   調製方法であって、 このようなペプチドまたはその誘導体を含む溶液がクロ
   マトグラフィー法により精製され、必要な場合に、所望
   の化合物が単離され、そして／またはその誘導体に転化
   される、前記のポリペプチドまたはその誘導体の調製方
   法。 １１、所望の化合物を含む溶液が、刺激された正常なヒ
   ト白血球もしくはヒト胚上皮肺細胞または遺伝子操作さ
   れた微生物もしくは連続継代哺乳類細胞系の任意に予備
   精製された細胞抽出物、細胞上澄液または培養濾液であ
   る請求項１０記載の方法。 １２、所望の化合物を含む溶液が、異種ポリペプチドの
   形質発現を可能にする条件下で所望の化合物を形質発現
   する形質転換した宿主細胞を培養することにより得られ
   る請求項１０記載の方法。 １３、請求項１記載のポリペプチドまたはその誘導体を
   コードするＤＮＡ、またはこのようなＤＮＡの突然変異
   体もしくはフラグメント。 １４、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるヌクレオチド配列
   を有するＭＲＰ−１６０をコードする請求項１３記載の
   ＤＮＡ、またはこのようなＤＮＡの突然変異体もしくは
   フラグメント。 １５、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるヌクレオチド配列
   を有するＤＮＡのヌクレオチド２７６５〜４４１４を含
   む請求項１３記載のＤＮＡフラグメント。 １６、請求項１３記載のＤＮＡ、その突然変異体または
   フラグメントとハイブリッドを形成するＤＮＡ。 １７、ゲノム起源のものである請求項１３記載のＤＮＡ
   、その突然変異体またはフラグメント。 １８、請求項１３記載のＤＮＡ、その突然変異体または
   フラグメントの調製方法であって、 所望の化合物を形質発現する形質転換した宿主細胞が培
   養され、必要な場合に、所望のＤＮＡがそれから単離さ
   れる前記のＤＮＡ、その突然変異体またはフラグメント
   の調製方法。 １９、ａ）好適な細胞からｍＲＮＡを単離し、所望のｍ
   ＲＮＡを選抜し、そのｍＲＮＡに相補的な一本鎖ｃＤＮ
   Ａを調製し、次いでそれから二本鎖のｃＤＮＡを調製す
   る工程、または ｂ）ｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡを単離し、所望
   のｃＤＮＡを選抜する工程、または ｃ）好適なヒト組織からゲノムＤＮＡを単離し、所望の
   ＤＮＡを選抜する工程、ならびにｄ）工程ａ）、ｂ）ま
   たはｃ）の二本鎖ＤＮＡを適当な形質発現ベクターに組
   込む工程、 ｅ）得られたハイブリッドベクターで適当 な宿主細胞を形質転換する工程、 ｆ）未形質転換宿主細胞からの所望のＤＮＡを含む形質
   転換宿主細胞を選抜する工程、及び、必要な場合に、 ｇ）所望のＤＮＡを単離し、そして／またはそれを突然
   変異体またはフラグメントに変換する工程、 を含んでなる請求項１８記載の方法。 ２０、所望の化合物が化学的に合成されるものである請
   求項１３記載のＤＮＡ、その突然変異体またはフラグメ
   ントの調製方法。 ２１、形質発現調節配列に操作的に連結された請求項１
   ３記載のＤＮＡ、その変異体またはフラグメントを含ん
   でなるハイブリッドベクター。 ２２、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるヌクレオチド配列
   を有するＤＮＡ、またはその変異体もしくはフラグメン
   トを含んでなる請求項２１記載のハイブリッドベクター
   。 ２３、ＳＥＱＩＤＮＯ：１で示されるヌクレオチド配列
   を有するＤＮＡのヌクレオチド２７６５〜４４１４を含
   んでなるＤＮＡを含む、請求項２１記載のハイブリッド
   ベクター。 ２４、ベクターｐＭＲＰ１６０である請求項２１記載の
   ハイブリッドベクター。 ２５、ベクターｐＭＲＰ１６０＿ｅ＿ｘである請求項２
   １記載のハイブリッドベクター。 ２６、ベクターｐＭＲＰ７０＿Ｐ＿Ｌである請求項２１
   記載のハイブリッドベクター。 ２７、請求項１記載のポリペプチドまたはその誘導体を
   形質発現する形質転換宿主細胞。 ２８、請求項２１記載のハイブリッドベクターで形質転
   換された請求項２７記載の宿主細胞。 ２９、属が大腸菌に属する請求項２７記載の宿主細胞。 ３０、哺乳類起源のものである請求項２７記載の宿主細
   胞。 ３１、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であ
   る請求項３０記載の宿主細胞。 ３２、好適な細胞が、必要によりヘルパー化合物の存在
   下で、エレクトロポレーション、カルシウム処理、マイ
   クロインジェクションまたはプロトプラスト融合により
   ハイブリッドベクターで形質転換され、次いでその形質
   転換された細胞が選抜される請求項２７記載の宿主細胞
   の調製方法。 ３３、炎症症状の処置のための請求項１記載のポリペプ
   チドまたはその誘導体の使用。 ３４、治療有効量の請求項１記載のポリペプチドまたは
   その誘導体及び製薬学的に許容され得る担体を含んでな
   る医薬品製剤。 ３５、炎症のメディエーターまたは炎症のメディエータ
   ーの前駆体である約１６０ｋＤの見掛分子量のポリペプ
   チドまたはその誘導体に特異的なポリクローナル抗体ま
   たはモノクローナル抗体、あるいは抗体が誘導される抗
   体の特異性を保持するような前記抗体の誘導体。 ３６、ＭＲＰ−１６０に特異的である請求項３５記載の
   ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、また
   はそれらの誘導体。 ３７、ｒＭＲＰ−７０に特異的である請求項３５記載の
   ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、また
   はそれらの誘導体。 ３８、ＭＲＰ−１６０のフラグメントに特異的である請
   求項３５記載のポリクローナル抗体もしくはモノクロー
   ナル抗体、またはそれらの誘導体。 ３９、ｒＭＲＰ−７０に特異的である請求項３５記載の
   ポリクローナルウサギ抗体。 ４０、抗体フラグメントならびに抗体と酵素、蛍光マー
   カー、化学発光マーカー、金属キレート、永久磁性粒子
   、アビジン及びビオチンとの結合体ならびに放射性標識
   抗体からなる群から選ばれる請求項３５記載のポリクロ
   ーナル抗体またはモノクローナル抗体の誘導体。 ４１、好適な哺乳類または鳥類が、炎症のメディエータ
   ーまたはメディエーターの前駆体である約１６０ｋＤの
   見掛分子量のポリペプチドまたはその誘導体で免疫され
   、免疫された哺乳類の血清または免疫された鳥類の卵が
   回収され、必要な場合に、抗体が単離され、そして／ま
   たはその誘導体に転化される請求項３５記載のポリクロ
   ーナル抗体またはその誘導体の調製方法。 ４２、前記のモノクローナル抗体を分泌するハイブリド
   ーマ細胞が試験管内もしくは生体内で増殖され、必要な
   場合に、次いで抗体が単離され、そして／またはその誘
   導体に転化される請求項３５記載のモノクローナル抗体
   またはその誘導体の調製方法。 ４３、請求項３５記載のモノクローナル抗体を分泌する
   ハイブリドーマ細胞系。 ４４、好適な哺乳類が、炎症のメディエーターまたはメ
   ディエーターの前駆体である約１６０ｋＤの見掛分子量
   のポリペプチドまたはその誘導体で免疫され、この哺乳
   類の抗体産生細胞が連続継代細胞系の細胞と融合され、
   融合で得られたハイブリッド細胞がクローン化され、次
   いで所望のモノクローナル抗体を分泌する細胞クローン
   が選抜される請求項４３記載のハイブリドーマ細胞系の
   調製方法。 ４５、炎症のメディエーターまたはメディエーターの前
   駆体である約１６０ｋＤの見掛分子量のポリペプチドま
   たはその誘導体の定性測定及び定量測定のための請求項
   ３５記載のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗
   体の使用。 ４６、炎症症状の診断のための請求項３５記載のポリク
   ローナル抗体またはモノクローナル抗体の使用。 ４７、ホジキンリンパ腫の診断または処置のための請求
   項３５記載のポリクローナル抗体またはモノクローナル
   抗体の使用。 ４８、請求項３５記載のポリクローナル抗体またはモノ
   クローナル抗体及び、必要により、その他のモノクロー
   ナル抗体もしくはポリクローナル抗体及び／または補助
   剤を含んでなる炎症のメディエーターまたはメディエー
   ターの前駆体である約１６０ｋＤの見掛分子量のポリペ
   プチドまたはその誘導体の定性測定及び定量測定のため
   の試験キット。 ４９、療法上有効量の請求項３５記載のポリクローナル
   抗体もしくはモノクローナル抗体またはそれらの誘導体
   及び製薬学的に許容され得る担体を含んでなる医薬製剤
   。