JPH09188698A - 新規リンホカイン関連ペプチド - Google Patents

新規リンホカイン関連ペプチド

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JPH09188698A
JPH09188698A JP8338746A JP33874696A JPH09188698A JP H09188698 A JPH09188698 A JP H09188698A JP 8338746 A JP8338746 A JP 8338746A JP 33874696 A JP33874696 A JP 33874696A JP H09188698 A JPH09188698 A JP H09188698A
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クラーク ロジャー
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Josef Brueggen
ブリューゲン ヨーゼフ
Lajos Tarcsay
タルツァイ ラヨス
Clemens Sorg
ゾルク クレメンス
Walter Wiesendanger
ビーゼンダンガー バルター
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトマクロファージ遊走阻止因子関連ペプチ
ド及びそれに対する粒体の提供。 【解決手段】 見かけ分子量約８kD又は１４kDのヒトマ
クロファージ遊走阻止因子関連ペプチド、及びＭＲＰ−
８に対して特異的であり且つＭＲＰ−１４及びその他の
蛋白質と交叉反応しないモノクローナル抗体。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトマクロファー
ジ遊走阻止因子に関連するポリペプチド、これらの製造
方法、該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ，ＤＮＡ及
びハイブリドベクター、この様なハイブリドベクターに
より形質転換された宿主、該ポリペプチドに対するモノ
クローナル抗体及びポリクローナル抗体、並びに炎症状
態及びのう包繊維症の診断方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩ
Ｆ）は、抗原、マイトジエン等により刺激された場合に
リンパ球及び単球又はマクロファージにより分泌される
生物学的に活性な可溶性ポリペプチドを包むいわゆるリ
ンホカイン群に属する。リンホカインの他の例は免疫イ
ンターフェロン（γ−インターフェロン）、インターロ
イキン１及び２、並びにマクロファージ活性化因子（Ｍ
ＡＦ）である。これらのリンホカインは免疫系の種々の
細胞タイプの分化、活性化及び増殖を調節する。
【０００３】既知の技術によれば、ヒトＭＩＦはマクロ
ファージの遊走能力を阻害する一群のポリペプチドから
成る。ヒトＭＩＦは活性化されたリンパ球、Ｔ−細胞及
びＢ−細胞によってのみならず、非−リンパ系細胞、例
えば繊維芽細胞及び若干の腫瘍細胞によっても分泌され
る。ＭＩＦはγ−インターフェロン、マクロファージ活
性化因子（ＭＡＦ）及び他のリンホカインから明瞭に区
別され得る。
【０００４】ヒトＭＩＦは炎症反応（“遅延型過敏反
応”）の初期において決定的役割を演ずる。このもの
は、単球及び休止組織マクロファージの成熟、炎症マク
ロファージへの分化を誘導する。従って、ヒトＭＩＦ及
び関連蛋白質は炎症状態の重要な指標であり、そして免
疫調節疾患及び慢性炎症疾患の治療に有用である。コン
カナバリンＡにより刺激されたヒト単核細胞からの分子
量８kDのＭＩＦ蛋白質の単離及び精製がヨーロッパ特許
出願ＥＰ １６２，８１２に記載されている。この蛋白
質はＮ−末端アミノ酸配列（１６アミノ酸）及びそのマ
クロファージ遊走阻止活性、並びに選択されたモノクロ
ーナル抗体に対するその免疫反応性により特徴付けられ
る。１４kD，２８kD及び４５kDの他のＭＩＦ蛋白質が記
載されているが、あまり特徴付けられていない。１４kD
のＭＩＦ蛋白質は、８kD ＭＩＦ蛋白質と同じＮ−末端
アミノ酸配列（アミノ酸２〜１９）を有することが見出
された。
【０００５】ＥＰ １６２，８１２によれば、ヒトＭＩ
Ｆ及びその蛋白質は刺激されたヒト細胞の培養上清又は
濾液から得られる。適当なヒト細胞の培養に内在する問
題点、新鮮なヒトＭＩＦ−生産細胞の限定された入手可
能性、及び単一蛋白質のめんどうな単離のため、この方
法はヒトＭＩＦの入手可能性を制限する。近年における
組換ＤＮＡ技法の急速な進歩は、この様な化合物の一次
天然源から独立してポリペプチドを多量に製造するため
の一般的方法を提供する。所望のポリペプチドをコード
するｍＲＮＡ又はＤＮＡの同定がこのアプローチの成功
のために必須である。もし、部分的アミノ酸配列情報が
入手可能であれば、化学的に合成された核酸プローブ
が、所望のポリペプチドを生産する細胞由来のｍＲＮＡ
の混合物又はＤＮＡライブラリーからのそれぞれコード
ｍＲＮＡ又はＤＮＡの単離を導くであろう。今まで、所
望のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ又はＤＮＡの単
離についての多くの例が知られてきており、そして一般
的方法が原理的に記載されているが、個々の新しい特定
の問題点が特定の場合への技術の適合を要求する。
【０００６】所望のポリペプチドをコードするゲノムＤ
ＮＡ又は相補的ＤＮＡを一旦手にしたなら、適当な発現
ベクターの調製、これらのベクターによる宿主の形質転
換、形質転換された宿主の発酵及び発現されたポリペプ
チドの単離は標準的方法に従う。やはり、ＤＮＡの安定
な導入、選択された宿主生物体における所望のポリペプ
チドの十分に高い発現、及び純粋な、生物学的に活性
な、単離さたれ蛋白質の許容される収量を得るために
は、前記の方法も特定の問題に適合されなければならな
い。
【０００７】さらに、組換ＤＮＡ技法は、宿主生物体に
導入されるコードＤＮＡを変異せしめ又は変化せしめる
ことによりポリペプチド変形体を製造し、これによって
天然に単一ポリペプチド構造中に見出される活性成分の
潜在的な用途を拡大することを可能にする。慢性骨髄性
白血病細胞から単離されたのう包繊維症（ｃｙｓｔｉｃ
ｆｉｂｒｏｓｉｓ）抗原（ＣＦ抗原）についての最近
の発表（Ｊ．Ｒ．Ｄｏｒｉｎ等、Ｎａｔｕｒｅ １９８
７，３２６，６１４）は、このＣＦ抗原がこの発明のＭ
ＩＦ−関連蛋白質ＭＲＰ−８と同一であるか、又は非常
に関連していることを示唆している。しかしながら、こ
の発明はＭＲＰ−８がのう包繊維症（ｃｙｓｔｉｃｆｉ
ｂｒｏｓｉｓ）を示すものではないという証拠を提供す
る。同時に、他のＭＩＦ−関連蛋白質ＭＲＰ−１４の免
疫学的決定に基き、のう包繊維症の確実な診断法がこの
発明により記載される。
【０００８】
【発明の目的】高純度且つ十分な量のヒトマクロファー
ジ遊走阻止因子（ＭＩＦ）関連ポリペプチド、及びこれ
らの製造方法を提供するのがこの発明の１つの目的であ
る。組換ＤＮＡ技法によって工業的ポリペプチド合成の
問題点が解決され得る。従って、この発明の他の目的
は、ＭＩＦ−関連ペプチドをコードする天然起源のｍＲ
ＮＡ及びＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ，ＭＩＦ−
関連ポリペプチドをコードするＤＮＡ及びハイブリドベ
クター、並びに該ベクターにより形質転換された宿主を
提供することである。他の目的は、前記ハイブリドベク
ター、形質転換された宿主、ＲＮＡ及びＤＮＡ分子の製
造方法、さらには有効量のＭＩＦ−関連ポリペプチドを
含有する医薬及びその製造方法、並びに前記ポリペプチ
ドの使用である。
【０００９】ＭＩＦ−関連ポリペプチドに向けられたモ
ノクローナル抗体及びポリクローナル抗体、このような
モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマセルライ
ン、該抗体及びハイブリドーマセルラインの製造方法、
並びにこれらの抗体の使用がこの発明の他の目的であ
る。特定の目的は炎症状態及びのう包繊維症の確実な診
断方法である。これらの目的が本発明により達成され
た。
【００１０】
【発明の記載】この発明は、見かけ分子量約８kD又は約
１４kDのヒトマクロファージ遊走阻止因子関連ペプチド
（ＭＲＰ）、並びにその変異体、断片及び誘導体に関す
る。この発明は特に、次の式（Ｉ）：
【００１１】
【化９】
【００１２】（式中、Ｚ1 は水素、アシル又はアミノ酸
残基メチオニンである、）で表わされるヒトマクロファ
ージ遊走阻止因子関連ペプチド〔ＭＲＰ−８〕並びにそ
の変異体、断片及び誘導体；並びに次の式（II）：
【００１３】
【化１０】
【００１４】（式中、Ｚ2 は水素、アシル、又は１〜５
個のアミノ酸から成る場合によってはアシル化されてい
るペプチド残基である、）で表わされるヒトマクロファ
ージ遊走阻止因子関連ペプチド〔ＭＲＰ−１４〕並びに
その変異体、断片及び誘導体に関する。アシルＺ1 又は
Ｚ2 は、天然有機又は無機酸のアシル基、例えば蟻酸、
アルカンカルボン酸、例えば酢酸、プロピオン酸、パル
ミチン酸もしくはミリスチン酸、又はリン酸もしくは硫
酸、好ましくは酢酸のアシル基である。
【００１５】ペプチドＺ2 は１個、２個、３個、４個又
は５個の天然アミノ酸から成り、そして例えばMet-, Th
r-Cys-Lys-Met-、又はMet-Thr-Cys-Lys-Met-である。こ
の様なペプチド残基はＮ−末端アミノ基においてアシル
基、例えばＺ1 又はＺ2 のアシルとして定義されたアシ
ル基、例えばアセチルにより置換されていてもよく、そ
して例えばアセチル-Thr-Cys-Lys-Met- である。
【００１６】この発明の変異体は、式（Ｉ）又は（II）
の化合物の１個又は複数個、特に１個、２個又は３個の
単一のアミノ酸が異るアミノ酸により又は結合により置
き換えられているポリペプチドである。この様な変異体
はＤＮＡのレベルにおいて自然に又は化学的に誘導され
た変異により、又は化合合成によるアミノ酸の置き換え
により形成され得る。
【００１７】この発明の断片は２０個以上の連続するア
ミノ酸を含んで成る式（Ｉ）又は（II）の化合物の断片
である。この発明の断片はＤＮＡレベルでの自然の又は
化学的に誘導された変異によってアミノ酸をコードする
トリプレットを終止コドンに変化せしめることによっ
て、あるいはペプチドレベルにおいてペプチド結合を化
学的に又は酵素的に開裂せしめることによって形成する
ことができる。
【００１８】式（Ｉ）又は（II）のポリペプチドの誘導
体、又はその変異体もしくは断片は、例えば、官能基、
例えばアミノ、ヒドロキシ、メルカプト又はカルボキシ
基が誘導体化、例えばグリコシル化、アシル化、アミド
化又はエステル化されているものである。グリコシル化
誘導体において、炭水化物残基又はオリゴサッカライド
はアスパラギン、セリン及び／又はトレオニンに連結さ
れる。アシル化誘導体は天然有機酸又は無機酸、例えば
酢酸、リン酸又は硫酸により、アミノ基において、特に
Ｎ−末端アミノ基において、又はヒドロキシ基、特にチ
ロシン又はセリンのヒドロキシ基において置換されてい
る。エステルは天然アルコールの、例えばメタノール又
はエタノールのエステルである。
【００１９】この発明の誘導体はまた、式（Ｉ）の化合
物のもしくは式（II）の化合物のダイマー、その変異体
又は断片であって、システイン残基のメルカプト基が酸
化された形態ジスルフィド形であって分子間Ｓ−Ｓ結合
を提供しているもの、並びに式（Ｉ）の化合物又はその
変異体もしくは断片と式（II）の化合物又はその変異体
もしくは断片との混合二量体（ダイマー）であってシス
テイン残基の酸化されたメルカプト基を介して結合して
いるものである。
【００２０】他の誘導体は塩、特に医薬として許容され
る塩、例えば金属塩、例えばアルカリ金属塩及びアルカ
リ土類金属塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩、マグ
ネシウム塩、カルシウム塩もしくは亜鉛塩、又はアンモ
ニアもしくは適当な有機アミン、例えば低級アルキルア
ミン、例えばトリエチルアミン、ヒドロキシ−低級アル
キルアミン、例えば２−ヒドロキシエチルアミンとの塩
等である。
【００２１】Ｚ1 がＭｅｔ、すなわちアミノ酸残基メチ
オニンである式（Ｉ）の化合物ＭＲＰ−８が好ましい。
このポリペプチドの有効分子量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ）は１０．８kDであ
るが、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上でこのポリペプチドは
標準的マーカー蛋白質と比較した場合８kDのペプチドと
して泳動する。
【００２２】さらに、Ｚ2 がThr-Cys-Lys-Met-又は水素
である式（II）の化合物ＭＲＰ−１４が好ましい。後者
の化合物はＭＲＰ−１４ｄとも称される。これらのポリ
ペプチドの有効分子量はそれぞれ１３．１kD及び１２．
６kDであるが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で標準的マーカー蛋
白質と比較した場合１４kDのペプチドとして泳動する。
【００２３】好ましい誘導体は、Ｚ1 がＭｅｔである式
（Ｉ）のＭＲＰ−８のダイマー、Ｚ 2 がThr-Cys-Lys-Me
t-である式（II）のＭＲＰ−１４のダイマー、及びＺ1
がＭｅｔである式（Ｉ）のＭＲＰ−８とＺ2 がThr-Cys-
Lys-Met-である式（II）のＭＲＰ−１４との混合ダイマ
ーであり、いずれもシステイン残基の酸化されたメルカ
プト基を介して結合している。
【００２４】この発明はさらに、ヒトマクロファージ遊
走阻止因子関連ペプチド並びにその変異体及び誘導体の
製造方法に関し、この方法は、目的化合物を含有する溶
液、例えば刺激された正常ヒト白血球の又は遺伝子操作
された微生物もしくは永久哺乳類セルラインの前精製さ
れた抽出液、細胞上清又は培養濾液をクロマトグラフ法
により精製し、そして該化合物を単離し、そして所望に
よりこれから断片又は誘導体を調製することを特徴とす
る。
【００２５】式（II）の化合物又はその誘導体を含有す
る、刺激された正常ヒト白血球の前精製された抽出液、
細胞上清及び培養濾液はＥＰ １６２，８１２に記載さ
れている様にして調製される。特に、正常ヒト単核細胞
がマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）及び他のリン
ホカインを生産するように適当な添加物、例えばコンカ
ナバリンＡ又はフィトヘマグルチニンにより刺激され、
そして通常の方法に従って培養される。次に、抽出物、
細胞上清又は培養濾液が、ヒトＭＩＦに対して特異的な
抗体、例えばモノクローナル抗体ＩＣ５が負荷されたカ
ラム上でのイムノアフィニティークロマトグラフィーに
より前精製される。
【００２６】ヒトマクロファージ遊走阻止因子関連ペプ
チドを含有する遺伝子操作された微生物又は永久哺乳類
セルラインの抽出物、細胞上清及び培養濾液が得られ、
そして後で検討するように前精製される。目的化合物の
調製のために期待されるクロマトグラフ法はイオン交換
クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、ヒ
ドロキシアパタイト上でのクロマトグラフィー、疎水性
相互作用クロマトグラフィー等である。
【００２７】イオン交換クロマトグラフィー用の適当な
キャリヤー材料は有機又は無機起源のものであることが
でき、例えば架橋アガロース、デキストラン、ポリアク
リルアミド、スチレン／ジビニルベンゼンコポリマー、
セルロース等によるものであることができる。このキャ
リヤー材料は塩基性官能基、例えば第三アミノ官能基、
第四アンモニウム基、又は酸官能基、例えばカルボン酸
基又は硫酸基を担持する。好ましいイオン交換体の例に
はジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）又はジエチル−２
−ヒドロキシプロピル−アンモニオエチル官能基を担持
するもの、及びスルホプロピル（ＳＰ）又はカルボキシ
メチル（ＣＭ）官能基を担持するものが挙げられ、官能
基は通常の液体クロマトグラフィー、ファストプロテイ
ン（ｆａｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）液体クロマトグラフィ
ー（ＦＰＬＣ）又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）のいずれかに適するようにキャリヤーに付加され
ている。イオン交換クロマトグラフィーによる分離及び
精製は確立された方法に従って、例えば、増加する量の
塩、例えば塩化ナトリウムを含有するpH５〜pH９の水性
緩衝液中で行われる。
【００２８】ゲル濾過又はサイズ排除クロマトグラフィ
ーのために適当なキャリヤー材料は架橋デキストラン、
アガロース、適切に修飾されたポリアクリルアミド又は
シリカ等を包含する。場合によってはこれらのキャリヤ
ーはヒドロキシ官能基、例えば１−ヒドロキシ又は１，
２−ジヒドロキシ−低級アルキル基を担持する置換基に
より修飾される。クロマトグラフ材料は、５，０００〜
２０，０００ダルトン（５kD〜２０kD）の分子量の範囲
のペプチドの最適な分離を示すように選択される。この
様なゲル濾過又はサイズ排除クロマトグラフィーは、種
々の量の塩、例えば塩化ナトリウムを含有するおよそ中
性の水性緩衝液を用いて上記の通常液体クロマトグラフ
ィー、ＦＰＬＣ又はＨＰＬＣのために適当なカラム中で
行うことができる。
【００２９】逆相クロマトグラフィーは、疎水性基、例
えば１〜２０個の炭素原子、好ましくは４，８，１２又
は１８個の炭素原子を有するアルキル基、あるいはそれ
ぞれ１及び８又は２及び１８個の炭素原子を有するアル
キル基の混合、あるいはフェニル基を担持するシリカ性
キャリヤー上で行われる。１２個までの炭素原子のアル
キル基及び／又はフェニル基でコートされたアガロース
又は関連材料が使用される疎水性相互作用クロマトグラ
フィーがこの方法と関連する。これらのクロマトグラフ
法はＦＰＬＣ又はＨＰＬＣを用いて適用される。シリカ
性逆相材料上でのこの発明のポリペプチドの処理のため
の溶剤は例えば、増加する量の極性水混和性有機溶剤、
例えばアセトニトリル、低級アルコール、例えばメタノ
ール、エタノール又はプロパノール、テトラヒドロフラ
ン等、好ましくはアセトニトリルを含有する水性酸、例
えば水性トリフルオロ酢酸である。
【００３０】アフィニティークロマトグラフィーはま
た、式（Ｉ）の化合物、並びにその変異体、断片及び誘
導体に対して高い親和性を有する分子、例えば抗体、特
に、この発明のペプチドに対して特異的な後で記載する
ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を担持する
適当なキャリヤー材料、例えば架橋アガロース、デキス
トラン又はポリアクリルアミドを用いて本発明のペプチ
ドを精製するために期待される。
【００３１】好ましいクロマトグラフ法は、スルホプロ
ピル基を担持するキャリヤーを用いるイオン交換クロマ
トグラフィー、及び逆相高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）である。この発明の化合物は、通常の技
法、例えば濾過又は限外濾過、透析、適当な塩及び／又
は緩衝液と溶剤との混合物中での溶解及び沈澱、溶剤の
蒸発、凍結乾燥等により単離される。
【００３２】ＭＩＦ−関連ペプチドの断片は、例えばプ
ロテアーゼによる処理によって調製される。例えば、パ
パイン、トリプシン、α−キモトリプシン、サーモライ
シン、ペプシン、ズブチリシン、リソバクター・エンチ
モゲネス（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ｅｎｚｙｍｏｇｅｎ
ｅｓ）からのエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、スタフ
ィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓ ａｕｒｅｕｓ）からのＶ８プロテアーゼ、又は関
連プロテアーゼを式（Ｉ）又は（II）の化合物の溶液に
加え、そして生ずる断片の混合物をクロマトグラフ法、
例えばゲル濾過及び／又は逆相ＨＰＬＣによる分離す
る。
【００３３】Ｃｙｓ残基を含有する式（Ｉ）又は（II）
の化合物のダイマーは例えば、空気、酸素、ヨウ素、ジ
メチルスルホキシドとＨＣｌ又はＨＢｒ、あるいは他の
化学酸化剤による穏和な酸化により得られる。式（Ｉ）
の化合物と式（II）の化合物との接合体は適当な混合物
の同様の酸化により調製される。特に、式（Ｉ）又は
（II）の化合物、並びにその変異体、断片及び誘導体は
組換ＤＮＡ技法により、例えば、式（Ｉ）もしくは（I
I）のペプチド又はその変異体もしくは誘導体を発現す
る形質転換された宿主を異種性蛋白質の発現を許容する
条件下で培養し、そして目的化合物を単離することによ
り製造することができる。さらに具体的には、 ａ）ヒト細胞のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリー
から式（Ｉ）もしくは（II）の化合物又はその断片をコ
ードするＤＮＡを単離しそして場合によってはこれを変
異せしめるか、又はこの様なＤＮＡを化学的に合成し； ｂ）該ＤＮＡを適当な発現ベクターに導入し； ｃ）この得られたハイブリドベクターを受容宿主に移行
せしめ； ｄ）例えば形質転換された宿主のみが生存する条件下で
培養することにより未形質転換宿主から形質転換された
宿主を選択し； ｅ）形質転換された宿主を、異種性ポリペプチドの発現
を許容する条件下で培養し；そして ｆ）式（Ｉ）もしくは（II）の化合物又はその変異体、
断片もしくは誘導体を単離し；そして所望により、得ら
れた式（Ｉ）もしくは（II）の化合物、又はその変異体
もしくは断片を誘導体にする；ことにより目的化合物が
製造される。
【００３４】組換ＤＮＡ技法によるこれらのペプチドの
調製に関与する段階は後でさらに詳細に検討する。さら
に、式（Ｉ）又は（II）の化合物、並びにその変異体及
び特に断片は、化学的方法により、特にＭ．Ｂｏｄａｎ
ｓｚｋｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆＰｅｐｔｉｄｅ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｇ １９８４に記載されている縮合反応により合成する
ことが可能である。断片は例えば固相法により合成さ
れ、この方法においてはＮ−保護アミノ酸が適当な樹脂
に連結され、保護基が除去され、第二のＮ−保護アミノ
酸が第一アミノ酸のアミノ基と縮合され、次のＮ−保護
アミノ酸を用いる脱保護／縮合のサイクルが、所望の組
成のペプチド残基が完了するまで反復され、そして最後
にこのペプチド残基が樹脂から切り離され、そして脱保
護される。適当な樹脂、保護基、縮合剤、及び反応条件
は当業界において知られている。
【００３５】この発明はまた、式（Ｉ）もしくは（II）
の化合物をコードするＤＮＡ、又はその変異体、例えば
１個又は複数個の、特に１個、２個、３個又は４個のヌ
クレオチド変異しているＤＮＡ、及び少なくとも１５ヌ
クレオチドを含んで成るこれらのＤＮＡの断片に関す
る。これらのＤＮＡは単鎖又は二本鎖であると理解され
る。
【００３６】特に、この発明は、次の式（III ）：
【００３７】
【化１１】
【００３８】で表わされるＭＲＰ−８をコードするＤＮ
Ａ、及び次の式（IV）：
【００３９】
【化１２】
【００４０】で表わされるＭＲＰ−１４をコードするＤ
ＮＡ〔式中、Ｙ1 はプロモーターを含有する１２ヌクレ
オチド以上のフランキングＤＮＡ配列であり；Ｙ2 はＹ
M −ＹT −ＹC −ＹK であるか、又は存在せず；Ｙ3 は
１ヌクレオチド以上のフランキングＤＮＡ配列である
か、又は存在せず；ＹA はアラニン（Ａ又はAla ）をコ
ードし、そしてGCT, GCC, GCA 又はGCG であり；ＹC は
システイン（Ｃ又はCys ）をコードし、そしてTGT 又は
TGC であり；ＹD はアスパラギン酸（Ｄ又はAsp ）をコ
ードし、そしてGAT 又はGAC であり；ＹE はグルタミン
酸（Ｅ又はGlu ）をコードし、そしてGAA 又はGAG であ
り；ＹF はフェニルアラニン（Ｆ又はPhe ）をコード
し、そしてTTT 又はTTC であり；ＹG はグリシン（Ｇ又
はGly ）をコードし、そしてGGT, GGC, GGA 又はGGG で
あり；ＹH はヒスチジン（Ｈ又はHis ）をコードし、そ
してCAT 又はCAC であり；ＹI はイソロイシン（Ｉ又は
Ile ）をコードし、そしてATT, ATC又はATA であり；Ｙ
K はリジン（Ｋ又はLys ）をコードし、そしてAAA 又は
AAG であり；ＹL はロイシン（Ｌ又はLeu ）をコード
し、そしてTTA, TTG, CTT, CTC, CTA又はCTG であり；
ＹM はメチオニン（Ｍ又はMet ）をコードし、そしてAT
G であり；ＹN はアスパラギン（Ｎ又はAsn ）をコード
し、そしてAAT 又はAAC であり；ＹP はプロリン（Ｐ又
はPro ）をコードし、そしてCCT, CCC, CCA 又はCCG で
あり；ＹQ はグルタミン（Ｑ又はGln ）をコードし、そ
してCAA 又はCAG であり；ＹR はアルギニン（Ｒ又はAr
g ）をコードし、そしてCGT, CGC, CGA, CGG, AGA 又は
AGG であり；ＹS はセリン（Ｓ又はSer ）をコードし、
そしてTCT, TCC, TCA, TCG, AGT 又はAGC であり；ＹT
はトレオニン（Ｔ又はThr ）をコードし、そしてACT, A
CC, ACA 又はACGであり；ＹV はバリン（Ｖ又はVal ）
をコードし、そしてGTT, GTC, GTA 又はGTG であり；Ｙ
W はトリプトファン（Ｗ又はTrp ）をコードし、そして
TGG であり；ＹY はチロシン（Ｙ又はTyr ）をコード
し、そしてTAT 又はTAC であり；そしてＹ* は終止コド
ンTAA, TAG又はTGA である〕、式（III ）又は（IV）の
ＤＮＡとこれに対して相補的なＤＮＡとから成る二本鎖
ＤＮＡ（ここで、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と結合
し、この逆の場合もあり、グアニン（Ｇ）はシトシン
（Ｃ）と結合し、この逆の場合もある）、この相補的Ｄ
ＮＡ自体、１又は複数個、特に１個又は２個のイントロ
ンが式（III ）又は（IV）のＤＮＡを中断しているゲノ
ムＤＮＡ、１個又は複数個、特に１個、２個、３個又は
４個のヌクレオチドが変異しているこれらのＤＮＡの変
異体、並びに少なくとも１５ヌクレオチドを含んで成る
これらのＤＮＡの断片に関する。
【００４１】特に、この発明は次の式（Ｖ）：
【００４２】
【化１３】
【００４３】で表わされるＭＲＰ−８をコードするＤＮ
Ａ、及び次の式（VI）：
【００４４】
【化１４】
【００４５】で表わされるＭＲＰ−１４をコードするＤ
ＮＡ（式中、Ｙ1 はプロモーター配列を含有する１２ヌ
クレオチド以上のフランキングＤＮＡ残基であり、Ｙ2
はATGACTTGCAAAであるか、又は存在せず、そしてＹ3は
１ヌクレオチド以上のフランキングＤＮＡ残基であ
る）、式（Ｖ）又は（VI）のＤＮＡとこれに対して相補
的なＤＮＡとから成る二本鎖ＤＮＡ、該相補的ＤＮＡ自
体、式（Ｖ）又は（VI）のＤＮＡを１個又は複数個、特
に１個又は２個のイントロンが中断しているゲノムＤＮ
Ａ，１個又は複数個、特に１個、２個、３個もしくは４
個のヌクレオチドが変異しているこれらのＤＮＡの変異
体、又は少なくとも１５ヌクレオチドを含んで成るこれ
らのＤＮＡの断片に関する。
【００４６】この発明はまた、式（Ｖ）もしくは（VI）
のＤＮＡと、又は式（Ｖ）もしくは（VI）のＤＮＡに対
して相補的なＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡに関す
る。ＭＲＰ−８をコードする式（Ｖ）のこの発明のＤＮ
Ａの例は、例えば次の式（VII ）：
【００４７】
【化１５】
【００４８】で表わされる、ヒト単核白血球のｍＲＮＡ
に由来するｃＤＮＡである。ヒト単核白血球のｍＲＮＡ
由来の他の特定のｃＤＮＡはＹ1 〔式（VII ）における
ヌクレオチド１〜１２３〕の意味を異にする。Ｙ1 は例
えばAAGTCTGTGGGCATC-, ATGTCTCTTGTCAGCTGTCTTTCAGAAG
ACCTGGTGGGGCAAGTTCCGTGGGCATC-, TTGTCTCTTGTCAGCTGTC
TTTCAG-, AAGACCTGAAGGTTCTGTTTTTCAGGTGGGGCAAGTTCCGT
GGGCATC-、又は式（VII ）のヌクレオチド１０８〜１２
３もしくは８６〜１２３を含んで成り、ヌクレオチド１
１２と１１３の間にＴに挿入を伴う配列である。
【００４９】ＭＲＰ−８をコードする式（Ｖ）のＤＮＡ
の他の例は、ヒトの胎盤から単離されそしてアミノ酸４
７と４８との間〔式（Ｖ）のヌクレオチド１４１と１４
２との間〕に１５０ヌクレオチドのイントロンを含有し
次の式（VIII）で表わされるゲノムＤＮＡである。
【００５０】
【化１６】
【００５１】
【化１７】
【００５２】
【化１８】
【００５３】ＭＲＰ−１４をコードする式（VI）のこの
発明のＤＮＡの例は、次の式（IX）：
【００５４】
【化１９】
【００５５】で表わされる、ヒト単核白血球のｍＲＮＡ
由来のｃＤＮＡである。ＭＲＰ−１４をコードする式
（VI）のＤＮＡの他の例は、ヒト胎盤又は胎児肝細胞か
ら単離されそしてアミノ酸５０と５１との間〔式（VI）
のヌクレオチド１３８と１３９との間〕にイントロンを
含有する、次の式（Ｘ）で表わされるゲノムＤＮＡであ
る。
【００５６】
【化２０】
【００５７】
【化２１】
【００５８】
【化２２】
【００５９】さらに、この発明はまた、式（Ｉ）又は
（II）の化合物をコードするＲＮＡ、その変異体、例え
ば１個又は複数のヌクレオチドが変異しているＲＮＡ、
及びこの様なＲＮＡの断片、特に、Ｙが前記の意味を有
するが但しＤＮＡの代りにＲＮＡが存在し、そしてそれ
故にデオキシチミジン（Ｔ）の代りにウリジン（Ｕ）が
存在する式（Ｖ）又は（VI）のＲＮＡ、特にＴがＵで置
き換えられている式（VII ）又は（IX）のＲＮＡに関す
る。
【００６０】式（Ｉ）もしくは（II）の化合物又はその
変異体をコードするＤＮＡ及び該ＤＮＡの断片又は変異
体は例えば、形質転換された宿主を培養しそしてこれか
ら所望のＤＮＡを単離することにより、又はヌクレオチ
ド縮合により化学合成することによって製造することが
できる。特に、この様なＤＮＡは ａ）ヒト単核白血球からｍＲＮＡを単離し、目的とする
ｍＲＮＡを例えばＤＮＡプローブを用いるハイブリダイ
ゼーションにより選択し、該ｍＲＮＡに対して相補的な
単鎖ＤＮＡを調製し、次にそれから二本鎖ＤＮＡ（ｄｓ
ｃＤＮＡ）を調製し；あるいは ｂ）ヒト細胞、例えば胎盤又は胎児肝細胞からゲノムＤ
ＮＡを単離し、そしてＤＮＡプローブを用いて目的のＤ
ＮＡを選択し；そして ｃ）段階ａ）のｃＤＮＡ又は段階ｂ）のｃＤＮＡを適当
な発現ベクターに導入し； ｄ）この所望のハイブリドベクターにより適当な宿主を
形質転換し； ｅ）式（Ｉ）もしくは（II）又はその変異体もしくは断
片をコードするＤＮＡを含有する形質転換された宿主を
コードＤＮＡを含有しない宿主から選択し；そして ｆ）目的ＤＮＡを単離する；ことにより製造することが
できる。
【００６１】ポリアデニル化メッセンジャーＲＮＡはヒ
ト単核白血球から既知の方法により単離される。白血球
は新鮮なヒトの血液から、例えば白血球から成るバフィ
ーコートから、又は培養において拡大され得る樹立され
た連続セルラインの白血球から誘導することができる。
単離方法は例えば注剤及びリボヌクレアーゼ阻害剤、例
えばヘパリン、グアニジニウムイソチオシアネート及び
メルカプトエタノールの存在下で刺激された白血球をホ
モジナイズし、場合によっては塩及び緩衝液、洗剤及び
／又は陽イオンキレート剤の存在下で、ｍＲＮＡを適当
なクロロホルム−フェノール混合物により抽出し、そし
て残った水性の塩含有相からエタノール、イソプロパノ
ール等によりメッセンジャーＲＮＡを沈澱せしめる。単
離されたｍＲＮＡは塩化セシウムグラジエント中で遠心
し、そして次にエタノール沈澱及び／又はクロマトグラ
フィー、例えばアフィニティークロマトグラフィー、例
えばオリゴ（ｄＴ）セルロース又はオリゴ（Ｕ）セファ
ロース上でのクロマトグラフィーを行うことにより、さ
らに精製することができる。好ましくは、こうして精製
されたｍＲＮＡを、例えばシュークロース直線勾配のご
とき勾配遠心により、又は適当なサイズ画分カラム、例
えばアガロースゲル上で、サイズに従って分画する。
【００６２】目的のｍＲＮＡはＤＮＡプローブを用いる
スクリーニングにより、又は適当な細胞もしくは無細胞
系での翻訳及び得られるポリペプチドのスクリーニング
により選択される。分画されたｍＲＮＡは細胞中で、例
えばカエルの卵母細胞中で、又は無細胞系で、例えば網
状赤血球ライセート又は小麦胚芽抽出物中で翻訳され得
る。得られたポリペプチドは、マクロファージ遊走阻止
活性について、又は天然マクロファージ遊走阻止因子
（ＭＩＦ）に対して生じた抗体との反応について、例え
ばイムノアッセイ、例えばラジオイムノアッセイ、酵素
イムノアッセイ又は蛍光マーカーを用いるイムノアッセ
イにおいてスクリーニングされる。このようなイムノア
ッセイ並びにモノクローナル抗体及びポリクローナル抗
体の調製は当業界においてよく知られており、従ってこ
れが適用される。ＭＩＦに対するモノクローナル抗体及
びこれらを用いるイムノアッセイは、例えばヨーロッパ
特許出願ＥＰ １６２，８１２に記載されている。
【００６３】所望のｍＲＮＡの選択は好ましくはＤＮＡ
ハイブリダイゼーションプローブを用いて達成され、こ
れにより翻訳の追加の段階が回避される。この様なハイ
ブリダイゼーションプローブは少なくとも１７個のヌク
レオチドから成る全合成ＤＮＡ、あるいは天然起源の又
は遺伝子操作された微生物から単離されＤＮＡ又はＤＮ
Ａ断片であることができる。
【００６４】合成ＤＮＡプローブは、天然源から単離さ
れたヒトＭＩＦ蛋白質、例えばＥＰ１６２，８１２に記
載されているヒトＭＩＦ８kD、又は約１４kDの分子量を
有するヒトＭＩＦ−関連蛋白質の部分アミノ酸配列に基
いて構成することができる。好ましくは１７以上のヌク
レオチドから成るオリゴヌクレオチドの混合物を調製
し、この場合該混合物の各構成員は式（III ）又は（I
V）の６個以上の連続するトリプレットコドンＹにより
定義される１つの断片に相補的である。この様なＤＮＡ
プローブもまたこの発明に含まれる。
【００６５】この発明のＤＮＡプローブの例は、式
（Ｉ）のＭＲＰ−８のアミノ酸１４−１９に対応する式
ＹD −ＹV −ＹY −ＹH −ＹK −ＴＡの及び式（Ｉ）の
ＭＲＰ−８のアミノ酸５２−５７に対応する式ＹD −Ｙ
V −ＹW −ＹF −ＹK −ＧＡのＤＮＡ断片に相補的な１
７−ｍｅｒオリゴヌクレオチド、並びに式（II）のＭＲ
Ｐ−１４のアミノ酸１４−２２に対応する式ＹT −ＹI
−ＹI −ＹN −ＹT −ＹF−ＹH −ＹQ −ＴＡのＤＮＡ
断片に相補的な２６−ｍｅｒオリゴヌクレオチド混合物
である。これらの式中、ＹD ，ＹF ，ＹH ，ＹI ，
ＹK ，ＹN ，ＹQ ，ＹT，ＹV ，ＹW 及びＹY の意味は
式（IV）において定義した通りである。２６−ｍｅｒオ
リゴヌクレオチドはトリプレットＹのヌクレオチドに相
補的なヌクレオチドの代りに３個のイノシン残基を有
し、従って相補的ヌクレオチド−ヌクレオチド相互作用
の数が２３に減少する。
【００６６】この様なオリゴヌクレオチドの合成は、後
に詳細に記載する既知の方法に従って、好ましくは、固
相ホスホトリエステル、ホスファイトトリエステル又は
ホスホルアミダイト法を用いる段階的縮合により、例え
ばホスホトリエステル法を用いるジヌクレオチドカップ
リングユニットの縮合により行われる。これらの方法
は、Ｙ．Ｉｋｅ等（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ，１９８３，１１，４７７）により記載さ
れているように、保護された形態の２個、３個又は４個
のヌクレオチドｄＡ，ｄＣ，ｄＧ及び／又はｄＴの混合
物を使用することにより又は適当な縮合段階で対応する
ジヌクレオチドカップリングユニットを用いることによ
り、所望のオリゴヌクレオチドの混合物の合成に適合さ
せることができる。
【００６７】所望のｍＲＮＡとのハイブリダイゼーショ
ンが検出され、そしてｍＲＮＡが同定されそして本発明
のポリペプチドをコードしない他のｍＲＮＡから分離さ
れ得るように、ＤＮＡプローブはマーカーを含有しなけ
ればならない。例えば、オリゴヌクレオチドの５′−末
端リン酸における放射性標識、例えば32Ｐ、蛍光マーカ
ー、又は適当にラベルされたアビジン、例えば蛍光マー
カーを担持しているかもしくは西洋ワサビパーオキシダ
ーゼのごとき酵素と接合したアビジンにより検出され得
るビオチンを含有する標識が適当である。
【００６８】マーカーを含有するＤＮＡプローブとサイ
ズ分画されたｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションは、
既知の方法に従って、すなわち添加剤、例えばカルシウ
ムキレート剤、粘土調整化合物、蛋白質、無関係のＤＮ
Ａ等を含有する緩衝及び塩溶液中で、選択的ハイブリダ
イゼーションのために好都合な温度、例えば１７−ｍｅ
ｒオリゴヌクレオチドについては２５℃〜４０℃の間そ
して２６−ｍｅｒオリゴヌクレオチドについては３０℃
〜５０℃の間、好ましくはハイブリドｄｓＤＮＡの溶融
温度より約２０℃低い温度において行われる。
【００６９】選択されたｍＲＮＡ鋳型からの単鎖相補的
ＤＮＡの調製は当業界においてよく知られており、単鎖
ＤＮＡからの二本鎖ＤＮＡの調製も同様である。ｍＲＮ
Ａ鋳型をデオキシヌクレオチドトリホスフェートの混合
物、場合によっては放射能標識されたデオキシヌクレオ
チドトリホスフェート（反応の結果をスクリーニングす
るため）、メッセンジャーＲＮＡのポリ（Ａ）テイルと
ハイブリダイズするオリゴ−ｄＴ残基のごときプライマ
ー配列、及び適当な酵素、例えば逆転写酵素と共にイン
キュベートする。
【００７０】鋳型ｍＲＮＡの分解の後、相補的ＤＮＡ
（ｃＤＮＡ）をデオキシヌクレオチドトリホスフェート
の混合物、及び上記のごとき適当な酵素と共にインキュ
ベートして二本鎖ＤＮＡを生じさせる。適当な酵素は逆
転写酵素、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏ
ｗ断片、又はＴ４ ＤＮＡポリメラーゼである。場合に
よっては、単鎖ＤＮＡをまず類似デオキシヌクレオチド
のテイルにより延長して相補的な類似デオキシヌクレオ
チドのプライマー配列の使用を可能にするが、１カルｄ
ｓ ＤＮＡの形成は通常自然的ヘアピン形成に基いて開
始される。ヘアピン形成の結果として得られたこのよう
なｄｓＤＮＡをさらに、該ヘアピンを切断するＳ１ヌク
レアーゼにより処理する。
【００７１】ｍＲＮＡからｃＤＮＡの調製に代り、ゲノ
ムＤＮＡを単離し、そして所望のポリペプチドをコード
するＤＮＡについてスクリーニングすることができる。
ゲノムＤＮＡは適当なヒト組織から、好ましくはヒト胎
盤又はヒト胎児肝細胞から、当業界において知られてい
る方法に従って単離される。これからゲノムＤＮＡライ
ブラリーが、確立された方法に従って、適当な制限エン
ドヌクレアーゼ、例えばＡｌｕＩ及びＨａｅIII による
消化、λシャロンファージ、例えばλシャロン４Ａへの
導入により調製される。ニトロセルロース膜上にレプリ
カされたゲノムＤＮＡライブラリーがＤＮＡプローブ、
例えば１６以上のヌクレオチドの合成ＤＮＡプローブ又
は前記のように所望のポリペプチドをコードするｍＲＮ
ＡからのｃＤＮＡによりスクリーニングされる。適当な
宿主微生物で増加したｃＤＮＡによりスクリーニングす
る場合、このｃＤＮＡをよく知られたニックトランスレ
ーション法によりラベルし、次に塩及び緩衝剤並びに前
記の他の添加剤を含有する溶液中で、好ましくは４０℃
〜８０℃、例えば約６５℃の温度において標識する。
【００７２】ｍＲＮＡから調製されたｄｓＤＮＡ又はゲ
ノム由来のｄｃＤＮＡの適当なベクターへの導入は当業
界においてよく知られている。例えば適当なベクターを
切断し、そして類似のデオキシヌクレオチドのテイルを
施す。これは対応するデオキシヌクレオチドトリホスフ
ェート及び酵素、例えば末端デオキシヌクレオチジルト
ランスフェラーゼの存在下でのインキュベーションによ
り達成される。別の方法においては、ｄｓＤＮＡはリン
カーオリゴデオキシヌクレオチドにより又は平滑末端連
結によりベクターに導入することができる。
【００７３】得られたハイブリドベクターによる適当な
宿主の形質転換は当業界においてよく知られている。例
えば、Ｅ．コリを塩化カルシウムを含有する培地中での
インキュベーションにより形質転換のために条件化し、
次にハイブリドベクターにより処理する。形質転換され
た宿主を適当なマーカー、例えば抗生物質耐性マーカ
ー、例えばテトラサイクリン又はアンピシリン耐性マー
カーにより選択する。
【００７４】この発明のＤＮＡの調製はまた化学合成に
よっても行うことができる。ＤＮＡを合成するための適
当な方法はＳ．Ａ．Ｎａｒａｎｇ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ１９８３，３９，３により要約の形で示されてい
る。既知の合成法は、好収量、高純度でかつ比較的短時
間での４０塩基までのポリヌクレオチドの調製を可能に
する。適切に保護されたヌクレオチドをホスホジエステ
ル法〔Ｋ．Ｌ．Ａｇａｒｗａｌ等、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅ
ｍ．１９７２，８４，４８９〕、さらに効率的なホスホ
トリエステル法〔Ｃ．Ｂ．Ｒｅｅｓｅ，Ｔｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎ １９７２，３４，３１４３〕、ホスファイト
トリエステル法〔Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ等、Ｊ．
Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９７６，９８，３６５
５〕、又はホスホルアミダイト法〔Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃ
ａｇｅ及びＭ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈ
ｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９８１，２２，１８５
９〕により相互に連結する。
【００７５】オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド
の合成の単純化が固相法により可能になり、この方法に
おいてはヌクレオチド鎖が適当なポリマーに連結され
る。Ｈ．Ｒｉｎｋ等〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ １９８４，１２，６３６９〕は個々の
ヌクレオチドではなくトリヌクレオチドを使用し、これ
らを固相合成においてホスホトリエステル法により連結
する。こうして、６７塩基までのポリヌクレオチドを短
時間で、且つ良好な収率で調製することができる。実際
の二本鎖ＤＮＡは、両ＤＮＡ鎖からの化合的に調製され
たオーバーラップするオリゴヌクレオチドから酵素的に
組み立てられ、この場合前記オリゴヌクレオチドが塩基
対合により正しい配置で一緒に保持され、そして次に酵
素ＤＮＡリガーゼにより化学的に連結される。
【００７６】他の可能性は、２つのＤＮＡ鎖からのオー
バーラップする単一オリゴヌクレオチドを４種類の必要
とされるデオキシヌクレオチドトリホスフェートの存在
下でＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ、ポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片又はＴ４ ＤＮ
Ａポリメラーゼと共に、あるいはＡＭＶ（鳥類骨髄芽球
症ウイルス）逆転写酵素と共にインキュベートする。こ
れにより２本のオリゴヌクレオチドが塩基対合により正
しい配置に保持され、そして酵素により必要なヌクレオ
チドが補給され完全な二本鎖ＤＮＡが生ずる〔Ｓ．Ａ．
Ｎａｒａｎｇ等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８
２，１２１，３５６〕。
【００７７】この発明はさらに、発現制御配列に作用可
能に連結された、式（Ｉ）もしくは（II）の化合物をコ
ードするＤＮＡ、その変異体又はそのＤＮＡの断片を含
んで成るハイブリドベクター、及びその製造方法に関す
る。ベクターは、形質転換のために使用される宿主細胞
に依存して選択される。適当な宿主の例として、制限酵
素又は修飾酵素を欠くか又はこれらが少ない微生物、例
えば酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエー（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、例
えばＳ．セレビシエーＧＲＦ １８、及び細菌の株、特
にエシェリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ）の株、例えばＥ．コリ×１７７６，Ｅ．コリＫ１
２株２９４、バシルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシルス・ステアロサーモフィ
ルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、スト
レプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）及び他
のもの、そしてさらに高等生物の細胞、時に樹立された
ヒト又は動物セルライン、例えばヒト胎児肺繊維芽細胞
Ｌ−１３２、ヒト悪性黒色腫Ｂｏｗｅｓ細胞、Ｈｅｌａ
細胞、アフリカミドリザルのＳＶ−４０ウイルス形質転
換腎細胞ＣＯＳ−７、又はチャイニーズハムスター卵巣
（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。Ｅ．コリの上記の細胞、
例えばＥ．コリＨＢ１０１，Ｅ．コリＫ１２及びＥ．コ
リＷ３１１０、並びにサッカロミセス・セレビシエーの
株、例えばサッカロミセス・セレビシエーＧＲＦ １８
が宿主として好ましく、さらにヒト胎児肺繊維芽細胞セ
ルラインＬ−１３２も好ましい。
【００７８】原理的には、選択された宿主中で複製し、
そしてこの発明の目的ポリペプチドを発現するすべての
ベクターが適当である。Ｅ．コリ株中での式（Ｉ）又は
（II）の化合物の発現のために適当なベクターの例とし
て、バクテリオファージ、例えばλバクテリオファージ
の誘導体、又はプラスミド、例えば特にプラスミドＣｏ
ｌＥ１及びその誘導体、例えばｐＭＢ９，ｐＳＦ２１２
４，ｐＢＲ３１７又はｐＢＲ３２２が挙げられる。この
発明の好ましいベクターはプラスミドｐＢＲ３２２に由
来する。適当なベクターは完全なレプリコン及びマーカ
ー遺伝子（発現プラスミドにより形質転換された宿主を
表現型形質に基いて選択しそして同定する）、並びに場
合によってはシグナル配列及びエンハンサーを含有す
る。
【００７９】適当なマーカー遺伝子は宿主に、例えば重
金属、抗生物質等に対する耐性を付与する。さらに、こ
の発明の好ましいベクターは、レプリコン及びマーカー
遺伝子領域の外に制限エンドヌクレアーゼのための認識
配列を含有し、これにより外来ＤＮＡ及び適当であれば
発現制御配列がこれらの部位に挿入され得る。好ましい
ベクターであるプラスミドｐＢＲ３２２及びこれに由来
するプラスミド、例えばｐＵＣ９，ｐＵＣ−ＫＯ，ｐＨ
Ｒｉ１４８及びｐＰＬｃ２４は無傷のレプリコン、例え
ばテトラサイクリン及びアンピシリンに対する耐性を付
与するマーカー遺伝子（ｔｅｔR 及びａｍｐR ）、及び
制限エンドヌクレアーゼのための多数のユニーク認識部
位を含有する。
【００８０】遺伝子発現の制御のために幾つかの発現制
御配列を使用することができる。特に、形質転換される
べき宿主の高度に発現される遺伝子の発現制御配列が使
用される。ハイブリドベクターとしてのｐＢＲ３２２及
び宿主微生物としてのＥ．コリの場合、例えば、ラクト
ースオペロン、トリプトファンオペロン、アラビノース
オペロン等の発現制御配列（これは特にプロモーター及
びリボゾーム結合部位を含む）、β−ラクタマーゼ遺伝
子、ファージλＮ遺伝子の対応する配列、特にＰL プロ
モーターを含有するそれ、又はファージｆｄ−コート蛋
白質遺伝子等が好ましい。プラスミドｐＢＲ３２２はβ
−ラクタマーゼ遺伝子をすでに含有するが、このプラス
ミドには他の発現制御配列が導入されなければならな
い。
【００８１】酵母における複製及び発現のために適当な
ベクターは酵母複製開始点及び酵母用選択遺伝子マーカ
ーを含有する。酵母複製開始点、例えば染色体自律複製
セグメント（ａｒｓ）を含有するハイブリドベクターは
形質転換の後酵母細胞内で染色体外に残り、そして自律
複製される。さらに、酵母２μプラスミドＤＮＡと相同
な配列を含有するハイブリドベクターを使用することが
できる。この様なハイブリドベクターは細胞内にすでに
存在する２μプラスミドに組換により取り込まれるか、
又は自律複製するであろう。２μ配列は高形質転換頻度
を有するプラスミドのために特に適当であり、そして高
コピー数を可能にするであろう。この発明の好ましい酵
母ベクターはｐＪＤＢ２０７である。
【００８２】酵母のための適当なマーカー遺伝子は特
に、宿主に抗生物質耐性を付与するもの、又は栄養要求
酵母変異株の場合には宿主の欠陥を補完する遺伝子であ
る。対応する遺伝子は、例えば抗生物質シクロヘキシミ
ドに対する耐性を付与し、又は栄養要求変異株において
原栄養性を提供し、例えばＵＲＡ３，ＬＥＵ２，ＨＩＳ
３、又は特にＴＲＰ１遺伝子である。酵母ハイブリドベ
クターは好ましくはさらに、細菌宿主、特にＥ．コリの
ための複製開始点及びマーカー遺伝子を含有し、これに
よりハイブリドベクター及びそれらの中間体の造成及び
クローニングを細菌宿主中で行うことができる。
【００８３】酵母における発現のために適当な発現制御
配列は例えば高度に発現される酵母遺伝子のそれであ
る。すなわち、ＴＲＰ１遺伝子、ＡＤＨＩ又はＡＤＨI
I、酸性ホスファターゼ（ＰＨ０３又はＰＨ０５）遺伝
子又はイソチトクローム遺伝子の各プロモーター、ある
いは解糖系に関与するプロモーター、例えばエノラー
ゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、３−ホスホグリセレートキナー
ゼ（ＰＧＫ）、ヘキソキナーゼ、ピルベートデヒドロゲ
ナーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−６−ホ
スフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムタ
ーゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイ
ソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコ
キナーゼの遺伝子のプロモーターを使用することができ
る。
【００８４】この発明の好ましいベクターは転写調節を
伴うプロモーター、例えば増殖条件の変化によりターン
オン又はターンオフされ得るＰＨ０５，ＡＤＨII及びＧ
ＡＰＤＨ遺伝子のプロモーターを含有する。例えば、Ｐ
Ｈ０５プロモーターは培地中の無機リン酸塩の濃度を上
昇又は低下せしめるのみで抑制又は抑制解除され得る。
【００８５】哺乳類細胞での複製及び発現のために適当
なベクターは、好ましくは、ウイルス由来の、例えばシ
ミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルス
（ＲＳＶ）、アデノウイルス２、ウシパピローマウイル
ス（ＢＰＶ）、パポバウイルスＢＫ変異株（ＢＫＶ）、
又はマウスもしくはヒトサイトメガロウイルス（ＣＭ
Ｖ）由来のＤＮＡを有する。好ましくは、これらのベク
ターは真核性転写制御配列と共にＥ．コリ中での増殖の
ための複製開始点及び抗生物質耐性を含有する。特に、
このようないわゆるシャトルベクターはｐＢＲ３２２
Ｅ．コリ用プラスミド並びにＳＶ４０及び／又はＣＭＶ
エンハンサー及びプロモーター領域から造成することが
できる。
【００８６】例えば、マウスもしくはヒトのサイトメガ
ロウイルス主要中間−初期遺伝子のエンハンサーユニッ
ト、ヒトα−グロビンプロモーターと組合わされたＳＶ
４０エンハンサー、及び／又はさらに誘導性プロモータ
ー、例えばヒートショック遺伝子又はメタロチオネイン
遺伝子由来のプロモーターを含有することができる。さ
らに、目的の遺伝子配列に天然に関連するプロモーター
又は制御配列を使用することも可能である。複製開始点
は、例えばＳＶ４０又は他のウイルス源由来の外来開始
点を含有するようにベクターを造成することにより、あ
るいは宿主細胞染色体複製機構により提供することがで
きる。ベクターが宿主細胞染色体に組み込まれる場合、
後者の方法がしばしば一層効率的である。
【００８７】好ましい態様において、この発明は宿主株
中で複製及び表現型選択が可能なハイブリドベクターに
関し、このベクターはプロモーター、及び式（Ｉ）もし
くは（II）又はその変異体もしくは断片をコードするＤ
ＮＡを含んで成り、このＤＮＡは該ハイブリドベクター
中に、形質転換された宿主中でそれが発現されポリペプ
チドが生産される様に前記プロモーターの制御のもと
に、転写開始及び終止シグナル並びに翻訳開始及び終止
シグナルと共に配置される。
【００８８】この発明はまた、形質転換された宿主の製
造方法に関し、この方法は発現制御配列により制御され
るこの発明のＤＮＡを含有する発現ベクターにより宿主
を形質転換（トランスフォーム又はトランスフェクト）
することを含んで成り、さらにこの発明はトランスフォ
ーム又はトランスフェクトされた宿主自体に関する。適
当な宿主の例として、上記の微生物、例えばサッカロミ
セス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、バシルス・ズブチリス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びエッシェリシャ・
コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の株が挙げ
られる。この発明の発現プラスミドによる形質転換は、
例えば文献に記載されている様にして、すなわちＳ．セ
レビシエーについてはＡ．Ｈｉｎｎｅｎ，Ｊ．Ｂ．Ｈｉ
ｃｋｓ及びＧ．Ｒ．Ｆｉｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９７８，７５，１９２９，
Ｂ．ズブチリスについてはＡｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌ
ｏｓ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９６１，８１，７
４１，Ｅ．コリについてはＭ．Ｍａｎｄｅｌ等、Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９７０，５３，１５９に記載されて
いる様にして行われる。
【００８９】すなわち、Ｅ．コリの形質転換方法はＤＮ
Ａの取り込みを可能にするための細胞のＣａ2+前処理、
及びハイブリドベクターとのインキュベーションを含
む。細胞を、形質転換された細胞の親細胞からの分離を
許容する選択増殖培地に移行せしめる。ベクターを含有
しない細胞はこの様な培地中で生存しないであろう。酵
母の形質転換は、例えば（１）グルコシダーゼによる酵
母細胞壁の酵素的除去、（２）ポリエチレングリコール
及びＣａ2+イオンの存在下でのベクターによる、得られ
たスフェロプラストの処理、及び（３）スフェロプラス
トを寒天に包埋することによる細胞壁の再生の段階を含
んで成る。好ましくは、再生寒天は再生と形質転換され
た細胞の選択とを同時に可能にするように調製する。
【００９０】適当な宿主の他の例は前記の哺乳類細胞、
例えばＣＯＳ−７細胞、Ｂｏｗｅｓ黒色腫細胞、チャイ
ニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は好ましくは胎
児肺細胞Ｌ−１３２である。ベクターは、レルパー化合
物、例えばジエチルアミノエチルデキストラン、ジエチ
ルスルホキシド、グリセロール、ポリエチレングリコー
ル等の存在下でのトランスフェクションにより、あるい
はベクターＤＮＡとリン酸カルシウムとの同時沈澱とし
て哺乳類細胞中に導入される。
【００９１】他の適当な方法は細胞核へのベクターＤＮ
Ａの直接マイクロインジェクション及びエレクトロポレ
ーション、すなわち細胞膜の透過性を増加せしめる短い
電気パルスによるＤＮＡの導入を包含する。これに続く
形質転換された細胞の選択は、発現ベクター中に共有結
合的に組み込まれた選択マーカー又は別個の存在として
加えられた選択マーカーを用いて行うことができる。選
択マーカーは、抗生物質、例えばＧ−４１８（ネオマイ
シン）又はハイグロマイシンに対する耐性を付与する遺
伝子、又は宿主細胞の遺伝的欠陥、例えばチミジンキナ
ーゼ又はヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラ
ーゼの不存在を補完する遺伝子を包含する。
【００９２】好ましい選択系は、外来ＤＨＦＲ遺伝子が
供給されない限り増殖のためにチミジン、グリシン及び
プリンを絶対的に要求する、ジヒドロフォレートレダク
ターゼを欠く（ＤＨＦＲ- ）細胞、例えばＣＨＯ細胞を
使用する。この発明のポリペプチドをコードする遺伝子
に連結されたＤＨＦＲ遺伝子を含有するベクターを適当
なＤＨＦＲ- 細胞、例えばＣＨＯ細胞に導入した後、形
質転換された細胞を、培地中の抗−葉酸剤メトトレキセ
ート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）の濃度を増加せしめ
ることにより選択する。この様な処理はさらに、目的ポ
リペプチドをコードする遺伝子を含有する実質的フラン
キング染色体領域と一緒になったＤＨＦＲ遺伝子の増幅
を介して目的ポリペプチドの生産を増加せしめる。
【００９３】哺乳類細胞、例えばヒト胎児肺細胞Ｌ−１
３２を式（Ｉ）又は（II）の化合物をコードする遺伝子
を含有するベクターＤＮＡ、抗生物質耐性、例えばＧ−
４１８に対する耐性をコードする遺伝子を含有するプラ
スミドＤＮＡ、及びリン酸カルシウムの同時沈澱物によ
り処理することによる選択方法が好ましい。形質転換さ
れた細胞は、対応する抗生物質、例えばＧ−４１８の存
在下で培養することにより、及び目的ポリペプチドの発
現についてスクリーニングすることにより選択される。
【００９４】形質転換された宿主細胞は、当業界におい
て既知の方法により、資化性の炭素源、窒素源及び無機
塩を含有する液体培地中で培養される。この発明の形質
転換された宿主の培養のために種々の炭素源を使用する
ことができる。好ましい炭素源の例として資化性炭水化
物、例えばグルコース、マルトース、マンニトールもし
くはラクトース、又は酢酸塩が使用され、これらはそれ
自体として、又は適当な混合物として使用することがで
きる。適当な窒素源の例としてアミノ酸、例えばカザミ
ノ酸、ペプチド及び蛋白質、並びにこれらの分解生成
物、例えばトリプトン、ペプトン、又は肉エキス、酵母
エキス、マルトエキス、及びさらにアンモニウム塩、例
えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム又は硝酸アン
モニウムが挙げられ、これらはそれ自体として又は適当
な混合物として使用することができる。使用することが
できる無機塩は、例えばナトリウム、カリウム、マグネ
シウム及びカルシウムのリン酸塩及び炭酸塩である。
【００９５】培地はさらに、例えば増殖促進物質、例え
ば微量元素、例えば鉄、亜鉛、マンガン等、及び好まし
くは選択圧を提供しそして発現プラスミドを失った細胞
の増殖を防止する物質を含有する。すなわち、例えば、
発現ベクターがａｍｐR 遺伝子を含有する場合、アンピ
シリンを培地に添加する。抗生物質のこの様な添加はま
た、抗生物質感受性の汚染微生物を殺すという効果を有
する。例えば必須アミノ酸について栄養要求性である酵
母株が宿主微生物として使用される場合、プラスミドは
好ましくは宿主の欠損を補完する酵素をコードする遺伝
子を含有する。酵母株の培養は前記アミノ酸を欠く最少
培地において行われる。
【００９６】脊椎動物細胞は、場合によっては増殖促進
物質及び／又は哺乳類血清が補充された商業的に入手可
能な培地を用いて、組織培養条件下で増殖せしめる。こ
の細胞は固体支持体、例えばミクロキャリヤーもしくは
多孔質ガラス繊維に付着して、又は適当な培養容器中で
自由浮遊しながら増殖する。培養は当業界において知ら
れている方法により行われる。培養条件、例えば温度、
培地のpH値、及び発酵時間は、この発明のポリペプチド
の最大力価が得られるように選択される。すなわち、
Ｅ．コリ又は酵母株は好ましくは好気的条件下で、振と
う又は攪拌を伴う液中培養により、約２０〜４０℃、好
ましくは３０℃の温度において、そして４〜８のpH、好
ましくはおよそpH７において、約４〜３０時間、好まし
くはこの発明のポリペプチドの最大収量が達成されるま
で培養する。
【００９７】細胞密度が十分な値に達した時、培養を中
断しそしてポリペプチドを単離する。ポリペプチドが適
切なシグナルペプチド配列と融合している場合、このも
のは細胞により直接に上清に分泌される。そうでない場
合には、細胞は例えば、洗剤、例えばＳＤＳ ＮＰ−４
０、トリトン又はデオキシコール酸で処理することによ
り破壊されなければならず、又はリゾチーム、同様に作
用する酵素又は超音波により溶解されなければならな
い。酵母が宿主微生物として使用される場合、細胞壁を
グルコシダーゼによる酵素的分解によって除去すること
ができる。この方法に代えて、又はこれに加えて、機械
的力、例えば剪断力（例えばＸ−プレス、フレンチプレ
ス、ダイノミル）、又はガラスビーズもしくは酸化アル
ミニウムとの振とう、あるいは例えば液体窒素中での凍
結と例えば３０℃〜４０℃での解凍の繰返し、並びに超
音波を用いて細胞を破壊することができる。
【００９８】細胞を破壊した後に得られる混合物の遠心
の後に得られる細胞上清又は溶液は蛋白質、核酸及び他
の細胞成分を含有し、これをそれ自体既知の方法でこの
発明のポリペプチドを含む蛋白質について濃縮する。す
なわち、例えば、非蛋白質成分のほとんどがポリエチレ
ンイミン処理により除去し、この発明のポリペプチドを
含む蛋白質を、例えば硫酸アンモニウム又は他の塩によ
る溶液の飽和によって沈澱せしめる。他の方法として、
細胞上清又は細胞溶解物をクロマトグラフィーにより前
精製する。
【００９９】遺伝子操作された微生物により生産された
ポリペプチドは、クロマトグラフ法の組合わせにより、
好ましくは前記の塩基性官能基及び酸性官能基によるイ
オン交換クロマトグラフィーと逆相高速液体クロマトグ
ラフィーの組み合わせにより精製される。精製法に他の
分離法、例えば分子量カットオフ膜を用いる濾過又は限
外濾過、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィ
ー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシア
パタイト上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカ
シング、並びに透析、溶解、及び適当な塩及び／又は緩
衝液及び溶剤の混合物中での再沈澱を含めることができ
る。
【０１００】粗細胞上清又は細胞溶解物を第四アミノ官
能基を担持するイオン交換カラム上、スルホン酸残基を
担持するイオン交換カラム上、及び逆相液体クロマトグ
ラフィーカラム上で逐次クロマトグラフ処理する精製方
式が好ましい。他の好ましい方式は、スルホン酸残基を
含有する１つのキャリヤー上でのみイオン交換クロマト
グラフィーを行う方式、及び／又はゲル濾過、すなわち
サイズ排除クロマトグラフィーを精製法に含める方式で
ある。
【０１０１】この発明はさらに、この発明の方法によっ
て製造されたすべての場合の、式（Ｉ）又は（II）の化
合物、並びにその変異体、断片及び誘導体に関する。こ
の発明は特に、例に記載されているような、ＤＮＡ、ハ
イブリドベクター、形質転換された細胞、式（Ｉ）及び
（II）の化合物、並びにその製造方法に関する。
【０１０２】ヒトマクロファージ遊走阻止因子関連ペプ
チド、並びにその変異体、断片又は誘導体は免疫調節疾
患及び慢性炎症疾患の治療のため、並びに感染に対する
保護のために有用であり、好ましくは療法的有効量の活
性成分を場合によっては無機又は有機の固体又は液体の
医薬として許容されるキャリヤーと共に又はこれと混合
して含有する医薬製剤の形で使用される。
【０１０３】この発明の医薬製剤は、温血動物、例えば
ヒトに対する経腸投与、例えば直腸投与又は経口投与の
ためのもの、及び好ましくは非経腸投与、例えば鼻内投
与、筋肉内投与、皮下投与又は静脈内投与のためのもの
である。意図される適用方法に依存して、医薬製剤は単
位投与形、例えばアンプル、バイアル、坐薬、丸剤、錠
剤、カプセル、又は固体もしくは液体形の鼻内スプレー
の形態であることができる。
【０１０４】投与されるべき療法的に有効な化合物の量
は、温血動物、例えばヒトの状態、例えば体重、疾患の
性質及び重症度、及び一般状態、そしてさらに投与方法
に依存し、そして治療を行う医師の評価に行って決めら
れる。式（Ｉ）もしくは（II）の化合物又はその変異体
もしくは断片の有効量は体重当り１日当り０．００１〜
１μｇのオーダーである。
【０１０５】この発明の医薬製剤は常用の無機又は有機
の固体又は液体の医薬として許容されるキャリヤーを、
場合によっては他の療法的に活性な化合物及び／又はア
ジュバントと共に含んで成る。好ましくは、活性成分の
溶液又は懸濁液、特に等張水性溶液又は懸濁液が、ある
いはまた使用直前に水に溶解される凍結乾燥調製物が使
用される。医薬製剤は無菌化され、そして／又は防腐
剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、増粘剤、浸透
圧調整塩及び／又は緩衝剤、そしてさらに他の蛋白質、
例えばヒト血清アルブミン又はヒト血清調製物を含有す
ることができる。
【０１０６】ＭＩＦ−関連ペプチド又はその変異体、断
片もしくは誘導体を含有する水性分散体のリポゾームの
形の医薬製剤が好ましい。特に、この発明のＭＩＦ−関
連ペプチドを含有する水性内容物を収容する脂質成分、
例えば両親媒性脂質、例えばホスホリピド、例えばレシ
チン、ケファリン又はホスファチジン酸、及び場合によ
っては中性脂質、例えばコレステロールの単層又は複層
から成る約２．０×１０-8〜５．０×１０-6ｍの直径及
び可及的に均一なサイズの集団を有するリポゾームが好
ましい。合成ホスファチジルセリン及びホスファチジル
コリンの混合物から成るリポゾームが好ましい。
【０１０７】この発明はさらに、ヒトマクロファージ遊
走阻止因子関連ペプチド、特に式（Ｉ）のＭＲＰ−８及
び式（II）のＭＲＰ−１４並びにこれらの誘導体に対し
て特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体
に関する。ＭＩＦ−関連ペプチドに対するポリクローナ
ル抗体は哺乳類由来、例えばマウス、ラット、ラビッ
ト、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、チンパンジー又はヒト
由来のものである。マウス、ラット、ラビット、ヤギ又
はヒツジの抗体が好ましく、ラビットの抗体が特に好ま
しい。これらのポリクローナル抗体は、それぞれ式
（Ｉ）の化合物及び式（II）の化合物に対する抗体以外
の抗体を含有することができる。特に、ポリクローナル
抗体は、ＭＩＦ−関連ペプチドに対する異る親和性及び
選択性を有する抗体の集まりである。好ましいポリクロ
ーナル抗体はそれぞれＭＲＰ−８に対して特異的であり
そしてＭＲＰ−１４に対して特異的である。
【０１０８】この発明の好ましくはモノクローナル抗体
はＭＩＦ−関連ペプチドに対するモノクローナル抗体で
ある。モノクローナル抗体もまた哺乳類由来、例えばマ
ウス、ラット又はヒト由来のものであり、好ましくはマ
ウス抗体である。８−５Ｃ２及び８−１０Ｄ７と称する
ＭＲＰ−８に対するモノクローナル抗体並びに１４−６
Ｂ２及び１４−１９Ｃ９と称するＭＲＰ−１４に対する
モノクローナル抗体、並びにこれらの誘導体が好まし
い。これらのモノクローナル抗体は、それぞれ８−５Ｃ
２，８−１０Ｄ７，１４−６Ｂ２及び１４−１９Ｃ９と
称する対応するハイブリドーマセルラインにより分泌さ
れる。
【０１０９】この発明の抗体の誘導体は、例えば抗体断
片、放射性標識された抗体、及び抗体と例えば酵素、例
外的結合性を有する化合物、例えばアビジン又はビオチ
ン、蛍光マーカー、化学ルミネッセンスマーカー又は常
磁性粒子との接合体である。この発明の抗体の断片は例
えばＦａｂ，Ｆａｂ′又はＦ（ａｂ′）2 断片であっ
て、抗原決定基に対するそれらの特異性を保持している
もの、すなわちＭＩＦ−関連蛋白質に対する親抗体の特
徴的結合パターンを保持しているものである。
【０１１０】放射性標識された抗体は、例えば放射性ヨ
ウ素（ 123Ｉ， 125Ｉ， 131Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄
（35Ｓ）、トリチウム（ 3Ｈ）等を含有する。放射性ヨ
ウ素により標識された抗体、例えば 125Ｉにより標識さ
れたモノクローナル抗体が好ましい。この発明の抗体接
合体は、例えば酵素、例えば西洋ワサビパーオキシダー
ゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼ、グルコース−オキシダーゼ、グルコアミラーゼ、
カルボアンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、
リゾチーム、マレートデヒドロゲナーゼ又はグルコース
−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼとの接合体、アビ
ジン又はビオチンとの接合体、並びに蛍光マーカー、例
えばフルオレッセイン又はローダミンＢとの接合体、化
学ルミネッセンスマーカー例えばアクリジニウムエステ
ルとの接合体、あるいは固体常磁性粒子との接合体であ
る。このような接合体において、抗体は接合の相手方に
直接結合し、又はスペーサーもしくはリンカー基により
結合する。モノクローナル抗体と酵素西洋ワサビパーオ
キシダーゼ又はアルカリ性ホスファターゼとの接合体、
並びにポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体とビ
オチンとの接合体が好ましい。
【０１１１】ＭＩＦ−関連蛋白質に対する抗体の選択性
は酵素−イムノアッセイにおいて定性的に検出すること
ができ、この方法においてはミクロタイタープレートの
ウエルを蛋白質でコートし、次に試験されるべき抗体で
処理し、そして結合した抗体を該抗体に対する標識され
た抗血清により検出する。例えば、この発明のマウスモ
ノクローナル抗体の選択性はサイドイッチタイプの酵素
−イムノアッセイにより決定され、この方法においては
ミクロタイタープレートをＭＩＦ−関連蛋白質に対する
ラビットポリクローナル抗体によりコートし、次に該蛋
白質それ自体によりコートし、次に試験されるべき抗体
で処理し、そして結合したモノクローナル抗体をマウス
抗体の定常部分に対する標識された抗血清により検出す
る。
【０１１２】モノクローナル抗体はさらに、その免疫グ
ロブリンクラス及びサブクラスに関して、例えばクラス
特異的第二抗体を用いる免疫拡散オークテルロニー（Ｏ
ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法により分析することができ
る。この発明の抗体及びこの誘導体はそれ自体既知の方
法により得られる。この発明のポリクローナル抗体及び
その誘導体は、適当な哺乳類を免疫応答エンハンサーの
存在下での式（Ｉ）又は（II）の化合物の２回又は３回
の注射により免疫感作し、免疫感作された哺乳類の血清
を集め、そして抗体を単離しそして精製し、そして所望
により、得られた抗体をその誘導体に転換する方法によ
り得られる。
【０１１３】ポリクローナル抗体を製造するための適当
な哺乳類は例えばマウス、ラット、ラビット、ヤギ、ヒ
ツジ、ブタ又はウマである。好ましくはマウス又はラビ
ットが使用される。これらは、数日間、例えば３〜７日
の間隔で数ヶ月以下、例えば４週間、式（Ｉ）又は（I
I）の化合物を皮内に、皮下に、静脈内に又は腹腔内に
２回、３回、４回又はさらに多く注射することにより免
疫感作される。免疫応答エンハンサーはリンパ球の生産
を刺激するアジュバント、例えば完全又は不完全フロイ
ンドアジュバントである。
【０１１４】哺乳類の免疫応答は適当な抗体アッセイ、
例えば前記の酵素イムノアッセイによりモニターするの
が好ましい。最終追加免疫の数日数、例えば２〜５後に
哺乳類の血液を集める。抗体を既知の方法、例えば沈
澱、遠心及び／又はクロマトグラフィーにより単離す
る。粗免疫グロブリン画分は硫酸アンモニウム等を用い
る沈澱によって血清から得られる。これらの免疫グロブ
リン画分は、ゲル濾過又はモレキュラーシーブクロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ
セルロース上でのクロマトグラフィー又は免疫アフィニ
ティークロマトグラフィー、例えばスタフィロコッカス
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡもしく
は好ましくは対応するＭＩＦ−関連蛋白質を担持するキ
ャリヤー材料上でのクロマトグラフィーによりさらに精
製することができる。
【０１１５】抗原決定基に対する特異性を維持している
抗体断片、例えばＦａｂ，Ｆａｂ′又はＦ（ａｂ′）2
断片は、それ自体既知の方法により、例えば酵素、例え
ばペプシンもしくはパパインにより抗体を消化するか、
そして／又は化学還元によりジスルフィド結合を開裂せ
しめることにより得ることができる。放射性ヨウ素によ
り標識された抗体は当業界において知られているヨウ素
化法により、例えば放射性ヨウ化ナトリウム又はヨウ化
カリウム及び化学酸化剤、例えば次亜塩素酸ナトリウ
ム、クロラミンＴ等、又は酵素化酸化剤、例えばラクト
パーオキシダーゼ又はグルコースオキシダーゼ及びグル
コースを用いて抗体を標識することにより調製される。
【０１１６】この発明の抗体の接合体は、当業界におい
て知られている方法により、例えば前記の様にして調製
された抗体又はその断片をカップリング剤、例えばグル
タルアルデヒド、過ヨウ素酸塩、Ｎ，Ｎ′−ｏ−フェニ
レンジマレイミド、Ｎ−（ｍ−マレイミドベンゾイルオ
キシ）−サクシンイミド、Ｎ−（３−〔２′−ピリジル
ジチオ〕−プロピオノキシ）−サクシニミド、Ｎ−エチ
ル−Ｎ′−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジ
イミド等の存在下で酵素と反応せしめることにより製造
される。アビジンとの接合体は同様にして製造される。
【０１１７】ビオチンとの接合体は例えば抗体をビオチ
ンの活性化エステル、例えばビオチンＮ−ヒドロキシサ
クシニミドエステルと反応せしめることにより製造され
る。蛍光マーカー又は化学ルミネッセンスマーカーとの
接合体はカップリング剤、例えば前記のカップリング剤
の存在下で、又はイソチオシアネート、好ましくはフル
オレッセイン−イソチオシアネートとの反応により製造
される。常磁性粒子との接合体は、前活性化された粒子
を用いて、又はグルタルアルデヒド又は過ヨウ素酸塩の
存在下でのカップリングにより得られる。
【０１１８】この発明のモノクローナル抗体及びその誘
導体はそれ自体既知の方法により得られ、この方法は、
該モノクローナル抗体を含泌するハイブリドーマ細胞を ａ）インビトロで培養し、そして培養上清からモノクロ
ーナル抗体を単離するか；あるいは ｂ）適当な動物中でインビボ増殖せしめ、そして該動物
の体液からモノクローナル抗体を回収し；そして所望に
より、得られたモノクローナル抗体をその誘導体に転換
する；ことを特徴とする。
【０１１９】方法ａ）に従うインビトロ培養のための適
当な培地は標準的培地、例えば、場合によっては哺乳類
血清、例えばウシ胎児血清、又は他の増殖促進補填剤、
例えば２−アミノエタノール、インシュリン、トランス
フェリン、低密度リポプロテイン、オレイン酸等、及び
微量元素が補充されているダルベコ改変イーグル培地又
はＲＰＭＩ１６４０培地である。モノクローナル抗体の
単離は、培養上清中に含有される蛋白質を硫酸アンモニ
ウム等によって沈澱せしめ、次に標準的クロマトグラフ
法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、
ＤＥＡＥセルロース上でのクロマトグラフィー又は免疫
アフィニティークロマトグラフィーにより達成される。
【０１２０】インビトロ製造は、所望の抗体の大量製造
のためのスケールアップを可能にする。大規模なハイブ
リドーマ培養のための技法は当業界において知られてお
り、そして均一懸濁培養、例えばエアーリフト反応器又
は連続キャリヤー反応器中での培養、あるいは例えば中
空繊維、マイクロカプセル中、カガロースマイクロビー
ズ上又はセラミックカートリッジ上での固定化又は捕捉
された培養を含む。
【０１２１】多量の目的モノクローナル抗体はまた、方
法ｂ）に従ってハイブリドーマ細胞を増殖せしめること
によっても得られる。細胞クローンを同系哺乳類に注射
し、抗体産生腫瘍を増殖せしめる。１〜３週間後、前記
哺乳類の体液から目的モノクローナル抗体を回収する。
例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来のハイブリドーマ細胞
を、場合によってはプリスタンのごとき炭化水素により
前処理されたＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射し、そし
て１〜２週間後これらのマウスの腹水を集める。所望の
モノクローナル抗体を既知の方法により、例えば硫酸ア
ンモニウム等による蛋白質の沈澱により体液から集め、
次に標準的クロマトグラフ法、例えばゲル濾過、イオン
交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥセルロース上でのク
ロマトグラフィー、又は免疫アフィニティークロマトグ
ラフィーにより精製する。
【０１２２】モノクローナル抗体の断片、放射性ラベル
された誘導体及び接合体は前記の様にして調製される。
放射性標識されたモノクローナル抗体はまた、段階ａ）
のインビトロ培養の培地に放射性標識された栄養を添加
することによっても調製される。この様な標識された栄
養は例えば放射性炭素（14Ｃ）を含有する。この発明は
さらに、ＭＩＦ−関連ペプチド、特に式（Ｉ）のＭＲＰ
−８及び式（II）のＭＲＰ−１４に対するモノクローナ
ル抗体を分泌することを特徴とするハイブリドーマセル
ラインに関する。
【０１２３】特にこの発明は、骨髄腫細胞と式（Ｉ）又
は（II）の化合物により免疫感作された哺乳類のＢリン
パ球とのハイブリドであるセルラインに関する。好まし
くは、これらのセルラインはマウス骨髄腫細胞と式
（Ｉ）又は（II）の精製された化合物によって免疫感作
された同系マウスのＢリンパ球とのハイブリドーマであ
る。
【０１２４】名称８−５Ｃ２，８−１０Ｄ７，１４−６
Ｂ２及び１４−１９Ｃ９を有するハイブリドーマセルラ
インが好ましい。これらのセルラインはマウス骨髄腫セ
ルラインＰ３×６３−Ａｇ８．６５３と、それぞれＭＲ
Ｐ−８及びＭＲＰ−１４で免疫感作したＢａｌｂ／ｃマ
ウスの脾臓のＢリンパ球とのハイブリドである。これら
は安定なセルラインであり、対応する名称のモノクロー
ナル抗体を分泌し、そして深冷凍結培養物として維持さ
れそして解凍及び場合によっては再クローニングにより
再活性化される。
【０１２５】前記の好ましいハイブリドーマセルライン
は１９８７年９月９日に、ブダペスト条約の規定のもと
に、パスツール研究所“Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔ
ｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃ
ｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ、（パリ）に寄託された。セルライン 番 号 １４−１９Ｃ９ Ｉ−６８７ １４−６Ｂ２ Ｉ−６８８ ８−１０Ｄ７ Ｉ−６８９ ８−５Ｃ２ Ｉ−６９０ この発明はまた、式（Ｉ）又は（II）の化合物に結合す
るモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマセルラ
インの製造方法に関し、この方法は適当な哺乳類式
（Ｉ）又は（II）の化合物により免疫感作し、この哺乳
類の抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合せしめ、この融合
により得られたハイブリドーマ細胞をクローン化し、そ
して所望の抗体を分泌する細胞クローンを選択する。
【０１２６】この発明の方法における哺乳類の免疫感作
のために適当な抗原は、それぞれ式（Ｉ）及び（II）の
好ましい化合物、すなわち前記のＭＲＰ−８及びＭＲＰ
−１４である。免疫感作のための好ましい哺乳類はマウ
ス、特にＢａｌｂ／ｃマウスである。免疫感作は、例え
ばポリクローナル抗体の調製について前記したようにし
て行われる。
【０１２７】最終追加免疫の後２〜５日に採取された、
免疫感作された動物の抗体産生細胞、好ましくは脾細胞
を融合促進剤の存在下で適当なセルラインの骨髄腫細胞
と融合せしめる。幾つかの適当な骨髄腫セルラインが当
業界において知られている。酸素ヒホキサンチングアニ
ンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又
は酵素チミジンキナーゼ（ＴＫ）を欠き、それ故にヒポ
キサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有する選
択培地（ＴＡＴ培地）中で生存しない骨髄腫細胞が好ま
しい。
【０１２８】ＨＡＴ培地中で生存せず、そして免疫グロ
ブリン又はその断片を分泌しない骨髄腫セルライン及び
誘導されたセルライン、例えばセルラインＰ３×６３−
Ａｇ８．６５３、又はＳｐ２／０−Ａｇ１４が好まし
い。考えられる融合促進剤は例えば場合によっては不活
性化された形態のセンダイウイルス又は他のパラミキソ
ウイルス、カルシウムイオン、表面活性脂質、例えばリ
ゾレシチン、又はポリエチレングリコールである。好ま
しくは骨髄腫細胞が３〜２０倍過剰の免疫感作された動
物からの脾細胞と、１０００〜４０００の分子量の約３
０％〜約６０％のポリエチレングリコール及び約１０％
〜約２０％のジメチルスルホキシドを含有する溶液中で
融合する。
【０１２９】融合の後、細胞を再懸濁し、そして選択Ｈ
ＡＴ培地中で培養する。これによりハイブリドーマ細胞
のみが生存するであろう。これらは骨髄腫細胞に由来す
るインビトロで増殖しそして複製する能力、及び免疫感
作された哺乳類の抗体産生脾細胞に由来するＨＡＨ培地
中での生存に必須なＨＧＰＲＫ又はＴＫ遺伝子の欠失の
両者をあわせ持つからである。
【０１３０】ハイブリドーマ細胞を拡大するための適当
な培地は標準的培地、例えばダルベコの改変イーグル培
地、最少必須培地、ＲＰＭＩ１６４０培地等であり、場
合によっては血清、例えば１０〜１５％のウシ胎児血清
が補給されているものである。場合によっては、細胞増
殖の初期にフィーダー細胞、例えば正常マウス腹腔滲出
細胞、脾細胞、骨髄マクロファージ等が添加される。ハ
イブリドーマ細胞を正常骨髄腫細胞が圧倒しないよう
に、培地に選択ＨＡＴ培地を補充し、最終段階でヒポキ
サンチン／チミジン（ＨＴ）培地を補充する。
【０１３１】ハイブリドーマ細胞培養上清を所望のモノ
クローナル抗体について、好ましくは酵素イムノアッセ
イ又はラジオイムノアッセイによりスクリーニングす
る。陽性のハイブリドーマ細胞を例えば限界稀釈法によ
りクローン化する。クローン化されたセルラインは常法
に従って凍結することができる。この発明のポリクロー
ナル抗体及びモノクローナル抗体、及び／又はその誘導
体はＭＩＦ−関連蛋白質、特に式（Ｉ）又は（II）の化
合物の定量又は定性のために有用である。
【０１３２】例えば、抗体及びその誘導体、例えば酵素
接合体又は放射性誘導体は、ＭＩＦ−関連蛋白質の抗原
決定基と抗体との間の結合相互作用に基く既知のイムノ
アッセイのいずれかにおいて使用することができる。こ
の様なアッセイの例としてラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）、酵素イムノアッセイ、例えばエンザイム−リンク
ドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、イムノフ
ロウレッセンス、免疫沈澱、ラテックス凝集、及び血球
凝集が挙げられる。この様なイムノアッセイは、例えば
炎症状態を有する患者、のう包繊維症の素因を有する患
者又は健常者の生物学的流体又は組織中のＭＩＦ−関連
蛋白質の定量又は定性において有用である。
【０１３３】この発明の抗体はそれ自体として、又は放
射性標識された誘導体の形でラジオイムノアッセイにお
いて使用することができる。ＲＩＡの既知の変法のいず
れか、例えば均一相でのＲＩＡ、固相ＲＩＡ又は不均一
ＲＩＡ、シングルＲＩＡ又はダブル（サンドイッチ）Ｒ
ＩＡをこの発明の蛋白質の直接又は間接（競争的）測定
のために使用することができる。
【０１３４】サンドイッチＲＩＡが好ましく、この方法
においては適当なキャリヤー、例えばポリスチレン、ポ
リプロピレン又はポリ塩化ビニルのミクロタイタープレ
ートの又は試験管のプラスチック表面、ガラス又はプラ
スチックビーズ、濾紙、又はデキストラン、酢酸セルロ
ース又はニトロセルロースシート等を単純な吸着により
又は場合によっては例えばグルタルアルデヒド又は臭化
シアンによる活性化の後にこの発明のモノクローナル抗
体又はポリクローナル抗体でコートし、そして試験溶液
及び 125Ｉにより放射性標識されたモノクローナル抗体
の溶液（もし使用されたならキャリヤー結合モノクロー
ナル抗体とは異るこの発明の蛋白質の他のエピトープを
認識する溶解したモノクローナル抗体）と共にインキュ
ベートし、そしてこの発明の蛋白質の量を、キャリヤー
に結合した放射能の測定により決定する。
【０１３５】前記のサンドイッチラジオイムノアッセイ
が特に好ましく、この方法においては、この発明のモノ
クローナル抗体をビーズ、例えばポリスチレンビーズに
結合せしめ、このコートされたビーズをＭＩＦ−関連蛋
白質を含有する試験溶液又は標準溶液中でインキュベー
トし、そして最後に異るエピトープを認識する放射性ラ
ベルされたモノクローナル抗体により顕在化せしめる。
【０１３６】この発明の抗体はそのままで、又は酵素接
合誘導体又はビオチン接合誘導体の形で、酵素イムノア
ッセイ（ＥＩＡ）において使用することができる。この
様なイムノアッセイは、この発明の酵素標識されたモノ
クローナル抗体誘導体、この発明の抗体のエピトープを
認識しそして結合するそれ自体既知の酵素標識された抗
体、又は酵素−アビジン接合体を使用する試験方法を包
含する。ＥＩＡの既知の変法のいずれか、例えば均一相
におけるＥＩＡ、固相ＥＩＡ又は不均一ＥＩＡ、シング
ルＥＩＡ又はダブル（サンイット）ＥＩＡを使用してＭ
ＩＦ−関連蛋白質の直接又は間接（競争的）測定を行う
ことができる。
【０１３７】ＥＬＩＳＡ（エンザイム−リンクドイムノ
ソルベントアッセイ）が好ましく、この方法においては
ＲＩＡについて前記したキャリヤーをこの発明のポリク
ローナル抗体又はモノクローナル抗体でコートし、ＭＩ
Ｆ−関連蛋白質を含有する試験溶液と共にインキュベー
トし、そして次にビオチンに接合したポリクローナル抗
体又は異るモノクローナル抗体と共にインキュベート
し、そして最後に、結合した抗体−ビオチン接合体を酵
素−アビジン接合体によって顕在化せしめ、そして結合
した蛋白質の量を酵素基質反応により決定する。
【０１３８】さらに、この発明のポリクローナル抗体又
はモノクローナル抗体でコートされたキャリヤーを試験
溶液と共に、及び酵素と接合したモノクローナル溶液
（使用されたなら、キャリヤー結合モノクローナル抗体
認識するのとは異るＭＩＦ−関連蛋白質のエピトープを
認識する溶解したモノクローナル抗体）とインキュベー
トするＥＬＩＳＡが好ましい。例えば目で観察すること
ができるか又は光学測定装置で測定することができる色
の変化をもたらす酵素基質反応により試験溶液中の蛋白
質が測定される。
【０１３９】さらに、この発明のポリクローナル抗体又
はモノクローナル抗体によりコートされたキャリヤーを
試験溶液と共に、キャリヤー結合抗体とは異る種のモノ
クローナル又はポリクローナル抗体の溶液と共に、そし
て次に溶解した抗体の種特異的部分を認識しそして結合
する酵素標識された第二酵体とインキュベートするＥＬ
ＩＳＡが好ましい。結合した酵素の量は試験溶液中の蛋
白質の量に比例し、そして酵素基質反応により決定する
ことができる。
【０１４０】この発明のモノクローナル抗体はそのまま
で、又は蛍光マーカーと接合した形態でイムノフルオレ
ッセンス試験において使用することができる。この様な
イムノフルオレッセンス試験は、この発明のモノクロー
ナル抗体誘導体、例えばフルオレッセインと接合した誘
導体、又はこの発明のモノクローナル抗体のエピトープ
を認識しそして結合するそれ自体既知のフルオレッセン
スマーカー標識抗体を使用する方法を包含する。
【０１４１】ＲＩＡについて前記したキャリヤーを標準
的方法に従ってこの発明の蛋白質の存在について試験さ
れるべき細胞によりコートし、細胞を固定し、そして細
胞内の蛋白質性材料と適用される溶液との相互作用が可
能なように透過性にし、次にフルオレッセンスマーカー
と接合したこの発明のポリクローナル又はモノクローナ
ル抗体誘導体と共にインキュベートし、又はこの発明の
ポリクローナル又はモノクローナル抗体とインキュベー
トし次にこの発明の該抗体を認識しそして結合するフル
オレッセンスマーカー標識第二抗体、例えばフルオレッ
セイン標識ラビット抗−マウス免疫グロブリンと共にイ
ンキュベートすることによるイムノフルオレッセンス試
験が好ましい。次に、この発明の蛋白質の存在を検出
し、そして蛋白質を標準的蛍光顕微鏡又はフローサイト
メトリーにより位置決定する。
【０１４２】ＭＩＦ−関連蛋白質の定性又は定量のため
の前記のモノクローナル抗体及びその誘導体のこの発明
による使用はまた、それ自体既知の他のイムノアッセ
イ、例えばイムノドット分析、放射性標識された抗体又
は放射性標識されたＭＩＦ−関連蛋白質を用いる免疫沈
澱試験、抗体−コート又は抗原コートラテックス粒子を
用いるラテックス凝集、あるいは抗体−コート又は抗原
コート赤血球を用いる血球凝集等を包含する。
【０１４３】この発明はまた、ＭＩＦ−関連蛋白質、特
に式（Ｉ）又は（II）の化合物の定性及び定量のための
キットに関し、このキットはこの発明のポリクローナル
抗体及び／又はモノクローナル抗体及び／又はそれらの
誘導体、並びに場合によっては他のポリクローナル抗体
又はモノクローナル抗体及び／又は付属物を含んで成
る。
【０１４４】ラジオイムノアッセイのためのこの発明の
試験キットは例えばこの発明のポリクローナル抗体又は
モノクローナル抗体によりコートされているか又はコー
トされていない適当なキャリヤー、式（Ｉ）もしくは
（II）の化合物に対するモノクローナル抗体もしくはポ
リクローナル抗体及び／又は放射性標識されたそれらの
誘導体の場合によっては凍結乾燥又は濃縮された溶液、
式（Ｉ）又は（II）の対応する化合物の標準溶液、緩衝
液、場合によっては、非特異的吸着及び凝集の形成を防
止するためのポリペプチド及び洗剤、ピペット、反応容
器、換算曲線、説明書等を包含する。
【０１４５】酵素イムノアッセイのためのこの発明の試
験キットは例えば適切なキャリヤー、例えばミクロタイ
タープレート又はニトロセルロースシート、式（Ｉ）又
は（II）の化合物に対するポリクローナル抗体又はモノ
クローナル抗体の、及びこの蛋白質に対する酵素標識さ
れ又はビオチン標識されたモノクローナル又はポリクロ
ーナル抗体の場合によっては凍結乾燥され又は濃縮され
た溶液、ビオチン標識抗体が使用される場合には酵素−
アビジン接合体の溶液、固体又は溶解した形の酵素基
質、この発明の蛋白質の標準溶液、緩衝液、及び場合に
よっては、ポリペプチド及び洗剤、ピペット、反応容
器、換算曲線、色度表、説明書等を含む。
【０１４６】この発明のモノクローナル抗体及び抗体誘
導体はＭＩＦ−関連蛋白質、特に式（Ｉ）又は（II）の
化合物、例えばそれぞれＭＲＰ−８及びＭＲＰ−１４の
定性及び定量のため、好ましくは酵素イムノアッセイに
おいて使用される。生物学的流体、組織切片、及び細胞
中のＭＲＰ−８及びＭＲＰ−１４の量の確実な決定は、
炎症状態及び／又はのう包繊維症の遺伝的素因の単簡な
決定を可能にする。さらに、モノクローナル抗体及び抗
体誘導体は天然源からの又は組換宿主細胞からのこの発
明のＭＩＦ−関連蛋白質のイムノアフィニティークロマ
トグラフィーによる単離及び精製において使用すること
ができる。
【０１４７】この発明のＭＩＦ−関連ペプチドＭＲＰ−
８及びＭＲＰ−１４は供与体に依存して異る量の正常顆
粒球及び単球中に存在する。顆粒球及び単球の培養の
後、ＭＲＰ−８及びＭＲＰ−１４陽性細胞の数は培養の
３日目まで増加し、そして次に１０日目から０レベルに
達するように低下する。ＭＲＰ−８及びＭＲＰ−１４は
血管内単球中以外の正常ヒト組織、例えば肝臓中には存
在しない様であり、ＭＲＰ−１４はまた肺中の単球中及
び胎盤中にも存在する。
【０１４８】しかしながら、慢性炎症病変においてＭＲ
Ｐ−８−陽性マクロファージが検出される。皮膚サルコ
イドーシスの場合、内皮細胞もＭＲＰ−８を含有する。
ＭＲＰ−１４−陽性マクロファージはリウマチ様関節炎
組織中にかなりの数見られる。ＭＲＰ−８及びＭＲＰ−
１４は、一次慢性多発関節炎及び他の慢性炎症において
組織マクロファージのサブセットにより、歯肉炎のごと
き他の慢性炎症とは異るパターンで発現される。
【０１４９】従ってこの発明は慢性炎症状態の診断方法
に関し、この方法は前記のＭＲＰ−８及びＭＲＰ−１４
に対する抗体を使用して組織におけるＭＲＰ−８及びＭ
ＲＰ−１４の発現の量及びパターンを決定することを特
徴とする。のう包性繊維症（Ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏ
ｓｉｓ：ＣＦ）は常染色体性劣性疾患であって、その病
因はまだ知られていない。対象者が正常であるか、ＣＦ
ヘテロ接合性であるか、又はＣＦホモ接合性を迅速且つ
確実に決定することを可能にする簡単な方法が必要とさ
れている。ＣＦテトロ接合体は臨床的には影響ないが、
しかし疾患を次の世代に伝達する。
【０１５０】健常者、ＣＦヘテロ接合体、ＣＦホモ接合
体並びに異る炎症性及びアレルギー性状態及び他の疾患
を有する患者の血症サンプルのスクリーニングプログラ
ムはのう包繊維症のマーカーとしてのＭＲＰ−１４の有
用性を示している（表）。
【０１５１】
【表１】
【０１５２】健康な提供者に見出されるＭＲＰ−１４の
平均量は０．０４３μｇ／mlであり、最高値は０．１３
２１μｇ／mlである。ＣＦに罹患している患者は０．２
０４〜５．７８μｇ／mlの血漿中濃度を示し、平均値は
１．０７６μｇ／mlである。ＣＦヘテロ接合体、すなわ
ちＣＦ患者の親であるがそれら自体に臨床的に影響を与
えない血漿提供者は０．６１１μｇ／mlの平均ＭＲＰ−
１４濃度を示し、最小値は０．１６１μｇ／mlである。
従って、±１０％の標準アッセイの再現性を考慮して、
他の点では健康な対象がＣＦについてヘテロ接合性であ
るか否かを約０．１５μｇ／mlの限界をもって決定する
ことができよう。
【０１５３】リウマチ性関節炎、ぜん息、Ｔ−細胞リン
パ腫及び神経皮膚炎を有する患者も上昇したＭＲＰ−１
４レベルを示し、他方、乾癬を含む他の幾つかの疾患を
有する患者は正常範囲のＭＲＰ−１４濃度を有する。健
康な提供者、ＣＦホモ接合体及びＣＦヘテロ接合体の血
漿サンプル中に見出されるＭＲＰ−８の量は通常０．０
１μｇ／ml未満であり、そしてのう包性繊維症を示すも
のではない。
【０１５４】従ってこの発明は、のう包性繊維症の確実
な診断法に関し、この方法は前記のＭＲＰ−１４に対す
る抗体を使用して、のう包性繊維症についてホモ接合性
又はヘテロ接合性であると予想される他の点では健康な
患者の血漿サンプル中のＭＲＰ−１４の量を測定するこ
とを特徴とする。次に、例によりこの発明をさらに具体
的に記載する。但し、これによりこの発明の範囲を限定
するものではない。
【０１５５】以下の例においては次の略号を使用する。 ＡＴＰ アデノシントリホスフェート ｂｐ 塩基対 ＢＳＡ ウシ血清アルブミン ｃＤＮＡ 相補的ＤＮＡ ｃｐｍ カウント／分（放射性崩壊） ｄＡ ２′−デオキシアデノシン ｄＡＴＰ ２′−デオキシアデノシントリホスフェート ｄＣ ２′−デオキシシチジン ｄＣＴＰ ２′−デオキシシチジントリホスフェート ＤＥＡＥ ジエチルアミノエチル ｄＧ ２′−デオキシグアノシン ｄＧＴＰ ２′−デオキシグアノシントリホスフェート ＤＭＥＭ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変 Ｅａｇｌｅ培地 ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド ＤＮＡ デオキシリボ核酸 ｄＮＴＰ ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの混合物 ｄｐｍ 分散／分（放射性崩壊） ｄｓ ＤＮＡ 二本鎖ＤＮＡ ｄＴ （２′−デオキシ）チミジン ＤＴＴ １，４−ジチオスレイトール ｄＴＴＰ チミジントリホスフェート ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸 ＦＡＢ−ＭＳ ファストアトムボンバートメント（ｆａｓｔａｔｏｍ ｂｏｍｂ ａｒｄｍｅｎｔ）マススペクトル ＦＣＳ ウシ胎児血清 ＦＰＬＣ ファストプロテイン・ポリペプチド・ポリヌクレオチド液体クロ マトグラフィー ＨＡＴ ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン ＨＢＳ Ｈｅｐｅｓ緩衝化生理食塩水 Ｈｅｐｅｓ Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホ ン酢 ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー ＩｇＧ 免疫グロブリンＧ ｋｂ キロベース ｋＤ キロ・ダルトン（分子量） ＭＥＭ 最少必須Ｅａｇｌｅ培地 ＭＩＦ マクロファージ遊走阻害因子 ｍＲＮＡ メッセンジャーＲＮＡ ＭＲＰ ＭＩＦ関連ペプチド ＯＤ 光学濃度 ＰＡＧＥ ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ＰＢＳ リン酸緩衝化生理食塩水 ＰＭＳＦ フェリルメチルスルホニルフルオリド ＲＮＡ リボ核酸 ｒｐｍ 回転数／分 ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム ＴＦＡ トリフルオロ酢酸 Ｔｒｉｓ ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａ ｎｅ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ｔＲＮＡ トランスファーＲＮＡ 次の緩衝液及び培地を使用する。 デンハート溶液 ０．１％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ−３６０，Ｓｉｇｍ ａ）、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ４００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） 、０．１％ＢＳＡ。 溶出緩衝液 １０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１mM ＥＤＴＡ， ０．２％ＳＤＳ。 ＧｕＳＣＮ緩衝液 ４Ｍグアニジウムイソチオシアネート、５０mM Ｔｒｉｓ− ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０mM ＥＤＴＡ，２％ナトリウムＮ −ラウロイイルサルコシネート（サルコシル）、１４０mM β−メルカプトエタノール。 ＬＢ培地 １％バクトトリプトン（ディフコ）、０．５％バクト酵母エ （Ｌブロス） キス（ディフコ）、１７０mM ＮａＣｌ，ＮａＯＨによりｐ Ｈ７．５に調整。 ＰＢＳ １３６mM ＮａＣｌ，２mM ＫＣｌ，８mM Ｎａ2 ＨＰＯ4 ，１．４mM ＫＨ2 ＰＯ4 。 ＲＶＴ緩衝液 ２００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，４２℃にてｐＨ８．３，２０ mM ＭｇＣｌ2 ，２８０mM ＫＣｌ，２０mM ＤＴＴ。 ＳＯＣ培地 ２％トリプトン（ギブコ）、０．５％酵母エキス（ギブコ） 、１０mM ＮａＣｌ，２．５mM ＫＣｌ，１０mM ＭｇＣｌ 2 ，５mM ＭｇＳＯ4 ，２０mMグルコース。 ＳＳＣ緩衝液 １５mMクエン酸ナトリウム、１５０mM ＮａＣｌ，ＮａＯＨ にてｐＨ７．０に調製。 ＴＢＥ緩衝液 ８９mM Ｔｒｉｓ（ＴＲＩＺＭＡ（商標）ベース）、８９mM 硼酸、１mM ＥＤＴＡ。 ＴＮＥ緩衝液 １０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１mM ＥＤＴＡ， ０．１Ｍ ＮａＣｌ。 洗浄緩衝液 １０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１mM ＥＤＴＡ， ０．５Ｍ ＮａＣｌ，０．２％ ＳＤＳ。
【０１５６】例１．天然ＭＩＦ関連ペプチドの単離及び
精製 １．１．逆相ＨＰＬＣ ヒト単核細胞を刺激しそして培養し、そして得られる細
胞培養上清を濃縮し、そしてヨーロッパ特許出願No. １
６２，８１２に記載されているモノクローナル抗体１Ｃ
５を担持する免疫アフィニティークロマトグラフィーに
より精製する。蛋白質を含有する画分をＴＦＡ中１％に
し、そしてウオーターズ社製のＨＰＬＣ装置を用いてＶ
ｙｄａｃ ２１４ ＴＰ ５４１５逆相ＨＰＬＣカラム
（ザ・セパレーション・グループ、ヘスパリカ、ＣＡ、
米国）上で１．１mlの画分に分離する。
【０１５７】カラムを水中１％ＴＦＡを６５％とアセト
ニトリル中０．０７％ＴＦＡを３５％との混合物中で平
衡化し、そして生成物を、水中０．１％ＴＦＡを４５％
とアセトニトリル中０．０７％ＴＦＡを５５％との混合
物で終る直線グラジエントにより１ml／分の流速で溶出
する。溶出液を、クラトス・スペクトロフロウ７７３Ｈ
ＰＬＣ ＵＶディテクターにより２２０nmでの吸収によ
りモニターする。保持時間１１．８分（Ｉ）、１２．６
分（II）、１３．４分（III ）、１４．４分（IV）、１
５．２分（Ｖ）、１６．０分（VI）、及び１６．６分
（VII ）を有する７個の個々の画分を、ＵＶ吸収に従っ
て手動により集める。
【０１５８】１．２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析 画分（Ｉ）〜（VII ）のアリコートを、還元条件下及び
非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｖ．Ｋ．Ｌａｅｍ
ｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ １９７０，２２７，６８０）に
より分析し、そしてクマッシーブルーＲ−２５０により
染色する（第１図）。ＨＰＬＣ画分のアリコート（１〜
５％）を真空乾燥し、ＤＴＴ（１％）を伴う又は伴わな
い（還元）２０mlの解離緩衝液中に溶解し、９６℃にて
２分間加熱し、そして１５％ポリアクリルアミドゲルに
適用する。
【０１５９】画分（Ｉ）の蛋白質は、ＥＰ １６２，８
１２に記載されている見かけ分子量８kDの既知のヒトＭ
ＩＦ蛋白質と同一である。画分（II）はＭＩＦ蛋白質８
kDのダイマーを含有し、このものは非還元条件下では１
６．５kDに二重バンドとして現われ、そして還元条件下
ではわずかに速く移動するかすかなバンドを伴って８kD
における強いバンドとして現われる。画分（III ）の蛋
白質は還元条件下及び非還元条件下で１４kDに現われ、
そしてＭＲＰ−１４と命名される。画分（IV）の蛋白質
は１３kDに二重バンドを示し、そしてＭＲＰ−１４′と
称される。見かけ分子量２０kDを有する画分（Ｖ）の蛋
白質は還元条件下で示される８kD ＭＩＦ蛋白質とＭＲ
Ｐ−１４とのジスルフィド結合したヘテロダイマーから
成る。１７．５kDの画分（VI）の蛋白質は８kD蛋白質の
他のジスルフィド結合ヘテロダイマーであり、そして２
３．５kDに現われる画分（VII ）の蛋白質はＭＲＰ−１
４のジスルフィド結合したダイマーである。
【０１６０】１．３．天然ＭＩＦ関連ペプチドの単離の
ための他の方法 ヨーロッパ特許出願No．１６２，８１２の培養されたヒ
ト単核細胞の濃縮された上清７７０mlを５０mM酢酸ナト
リウム（ＮａＯＡｃ）緩衝液（ｐＨ４）に対して十分に
透析し、そしてＳＰ Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ Ｍ（ＬＫ
Ｂ）イオン交換カラム（２．６×１０cm）にポンプ輸送
する。ＵＶ ２５４nmの吸収がベースラインに達するま
でカラムを洗浄する。カラムに結合した蛋白質を、５０
mM ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）中０．０Ｍ〜１．０Ｍ
ＮａＣｌの直線グラジエント（３００ml）を用いて１．
８ml／分の流速で溶出する。１８mlずつの個々の画分を
集め、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。
【０１６１】ＭＲＰ−８，ＭＲＰ−１４及びＭＲＰ−１
４′は、約０．８Ｍ〜０．９Ｍ ＮａＣｌに相当する２
５０ml〜２８０mlの合計グラジエント容量の間の同じ画
分に一緒に溶出される。ＭＲＰ含有画分のプールをＹＭ
−１０膜（アミコン）上での限外濾過により濃縮し、そ
してＴＦＡ中１％にする。それぞれ純粋なＭＲＰ−８，
ＭＲＰ−１４及びＭＲＰ−１４′の単離はＶｙｄａｃ
２１４ ＴＰ ５１０逆相ＨＰＬＣカラム（ザ・セパレ
ーションズ・グループ、米国）上で達成される。カラム
を、水中０．１％ＴＦＡを７５％とアセトニトリル中
０．０７％ＴＦＡを２５％との混合物中で平衡化し、そ
して水中０．１％ＴＦＡを４５％とアセトニトリル中
０．０７％ＴＦＡを５５％との混合物で終る４５分間に
わたる直線グラジエントにより３ml／分の流速で蛋白質
を溶出する。溶出液を２３５nmでの吸収によりモニター
する。個々のピークを吸収の読みに従って手動で集め
る。例１．１．に従って単離されたペプチドとの比較に
よりＭＲＰ−８，ＭＲＰ−１４及びＭＲＰ−１４′が同
定される。
【０１６２】例２．ＭＲＰ−１４の酵素的開裂 ＭＲＰ−１４と称する画分（III ）（例１）の蛋白質２
５μｇを室温にて６時間、１００μｌの５０mM ＮＨ4
ＨＣＯ3 中０．５μｇのスタフィロコッカス・アウレウ
ス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｖ
８プロテアーゼ（クーパー・バイオケミカルス）と共に
インキュベートする。インキュベーション混合物の小ア
リコート（２％）をＶｙｄａｃ ２１４ ＴＰ ５４１
５逆相ＨＰＬＣカラム（ザ・セパレーションズ・グルー
プ）上で分析することにより消化の進行をモニターす
る。同じカラム上で、水中０．１％ＴＦＡ １００％か
らアセトニトリル中０．０７％ＴＦＡ １００％まで６
０分間にわたり、１ml／分の流速で溶出することによ
り、ペプチド断片の調製分離を達成する。３個の画分
を、２０．７分（Ａ）、２２．７分（Ｂ）及び２４．８
分（Ｃ）の保持時間において２２０nmでのＵＶ吸収に従
って手動的に集める。
【０１６３】例３．ＭＲＰ−１４のスタフィロコッカス
・アウレウスＶ８プロテアーゼ断片のアミノ酸配列分析 画分Ａ，Ｂ及びＣ（例２）を真空蒸発せしめ、それぞれ
を２５μｌの０．１％ＴＦＡ水溶液に溶解し、そしてア
プライド・バイオシステムス製の気相蛋白質シーケンサ
ーモデル４７０によるアミノ酸配列分析にかける。
【０１６４】Ｎ−末端アミノ酸配列は次の通りである。 Thr-Ile-Ile-Asn-Thr(5)-Phe-His-Gln-Tyr-Ser(10)-Val-Lys-Leu-Gly- （Ａ） Phe-Ile-Met-Leu-Met(5)-Ala-Arg-Leu-Thr-Trp(10)-Ala-Ser-X13-Glu-Lys(15)-M et- （Ｂ） Leu-Val-X3-Lys-Asp(5)-Leu-X7-Asn-Phe-Leu(10)-Lys-Lys-Glu-Asn-Lys(15)-Asn - Glu-Lys-Val-Ile(20)-X21-X22-Ile- （Ｃ） 上記の配列中ＸｎはＮ−末端からｎ番目にある未決定の
アミノ酸を示す。
【０１６５】例４．ヒト単核血液白血球からのメッセン
ジャーＲＮＡの単離 １．６×１０10個の単核ヒト血液白血球をバフィーコー
トから単離し、そしてヨーロッパ特許出願No．１６２，
８１２に記載されている様にしてコンカナバリンＡによ
り２時間処理する。スピンナーカルチュアー中ＲＰＭＩ
１６４０培地中（５％ＣＯ2 ）３７℃にて１６時間のイ
ンキュベーションの後、３５０×ｇにて１５分間の遠心
により細胞を集める。約１０mlのふわふわした細胞ペレ
ットを５０mlのＧｕＳＣＮ緩衝液に溶解し、そしてソル
バル−オムニミキサー（１００ml）中で最高速度で９０
秒間ホモジナイズする。次に、溶液を、１０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００mM ＮａＣｌ及び１
mM ＥＤＴＡを含有する溶液によりあらかじめ平衡化さ
れたフェノール６０mlと混合する。
【０１６６】６０mlのクロロホルムを加え、混合し、そ
して卓上遠心分離機中で３０００rpm にて遠心すること
により相分離を達成する。非粘性中間相のいくらかを含
む水相を集め、そして６０mlの平衡化されたフェノール
及びクロロホルムを次々と加える。この混合物を遠心
し、そして水相及び非粘性中間相を回収する。すべての
中間相が実質的に消失するまで、これらの段階を３〜４
回反復する。２容量のエタノール（１００ml）を添加す
ることにより核酸を−２０℃にて沈澱せしめる。次の様
にしてＲＮＡを汚染ＤＮＡからさらに精製する。核酸を
６mlの水に溶解する。１．５mlの０．５Ｍ ＥＤＴＡ
（ｐＨ７．５）、次に７．５ｇの乾燥したＣｓＣｌ及び
２１５μｌの１Ｎ ＨＣｌの混合物を添加する。この溶
液を、２本のＴＳＴ４１チューブ（コントロン）中０．
１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）（最終）中５．７Ｍ Ｃ
ｓＣｌのクッション２ml上に重相する。
【０１６７】チューブを水で満たし、そしてＴＳＴ４１
ローター中で２０℃にて１６時間遠心する。操作の終り
にほとんどの上清を除去し、そしてチューブを手早く逆
転させて排液した。ガラス状ＲＮＡペレットを、渦動攪
拌及び３７℃での加温（２分間）により４mlの溶出緩衝
液に溶解する。１０mlのエタノールを添加し、そしてＨ
Ｂ４ローター（ソルバル）中で１０分間遠心分離するこ
とによりＲＮＡを沈澱せしめる。このＲＮＡ（９．５m
g）を短時間乾燥し、そして０．４mlの溶出緩衝液中に
溶解する。６８℃で２分間加熱しそして氷上で冷却した
後、０．４４mlの５Ｍ ＮａＣｌを加え、そしてこの溶
液を、洗浄溶液で平衡化した０．５ｇのオリゴ−ｄＴセ
ルロース（タイプ７、ファルマシア）を周容したカラム
に適用する。サンプルを次々の３回適用した後、カラム
を１５mlの洗浄緩衝液で洗浄し、そして結合したＲＮＡ
を４mlの溶出緩衝液で溶出する。
【０１６８】溶出した材料を６８℃にて２分間加熱し、
冷却し、そして０．４４mlの５ＭＮａＣｌを添加する。
溶液を前平衡化したオリゴ−ｄＴセルロースカラムに適
用（３回）する。１５mlの洗浄緩衝液で洗浄した後、結
合したＲＮＡを４mlの溶出緩衝液で溶出する。０．２５
mlの３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．５）及び１０mlのエタ
ノールを添加することによりＲＮＡを−２０℃にて一夜
沈澱せしめる。沈澱（１１０μｇ）を遠心分離（１６，
０００×ｇにて１５分）により集め、０．４mlの水に溶
解し、そして２５μｌの３Ｍ ＮａＯＡｃ及び１mlのエ
タノールの添加によって再沈澱せしめる。ドライアイス
中で１０分間冷却した後、エッペンドルス遠心機中で５
分間遠心分離することによりＲＮＡを集める。ペレット
を空気乾燥し、そして１１０μｌの水に溶解する。
【０１６９】例５．ポリアデニル化ＲＮＡのサイズ分画 ９０μｇのポリアデニル化ＲＮＡ（例４）を２００μｌ
の５０％ＤＭＳＯ，１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５），１mM ＥＤＴＡ及び０．５％ＳＤＳ中で８０
℃にて２分間変性せしめる。冷却及び３００μｌの水の
添加の後、この溶液を、ＴＳＴ４１ローター（コントロ
ン）中の１００mM ＮａＣｌ，１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５），１mM ＥＤＴＡ及び０．５％ＳＤＳ
中５〜１５ｗ／ｖ％のシュークロースの直線グラジエン
ト１１．５ml上に重層する。４１，０００rpm ，２５℃
にて４．５時間遠心した後、３０個の０．４ml画分を集
め、個々のＵＶスペクトルを記録する。個々の画分から
のＲＮＡを１５μｌの０．３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．
５）及び１mlのエタノールの添加によって沈澱せしめ
る。−２０℃にて一夜インキュベートした後、前記の様
にして遠心によってＲＮＡを集め、溶解し、そして再沈
澱せしめる。最後にＲＮＡを２０μｌの水に溶解する。
【０１７０】例６．サイズ分画したＲＮＡ中のＭＲＰ−
８ ｍＲＮＡの位置決定 ＭＲＰ−８の既知の部分アミノ酸配列に基いて混合オリ
ゴヌクレオチドを合成する。オリゴヌクレオチド混合物
１は５′−TAYTTRTGRTANACRTC −３′の組成を有し、こ
こでＡ，Ｔ，Ｇ及びＣはそれぞれアデノシン、チミジ
ン、グアノシン及びシトシンであり、Ｙ及びＲはそれぞ
れピリミジン（Ｔ，Ｃ）及びプリン（Ａ，Ｇ）であり、
そしてＮは４種類のデオキシヌクレオチドの内のいずれ
かである。オリゴデオキシヌクレオチド混合物２は５′
−TCYTTRAACCANACRTC −３′から成り、ここでコードは
上記と同じ意味を有する。それぞれ６４種類及び３２種
類の異る１７−ｍｅｒから成るこれら２個の混合物は、
ＭＲＰ−８のアミノ酸１４−１９及び５２−５７に相補
的である可能性のあるＤＮＡ鎖である。
【０１７１】これらのオリゴデオキシヌクレオチドを
Ｙ．Ｉｋｅ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄＲｅｓｅａｒ
ｃｈ １９８３，１１，４７７の方法に従って合成す
る。これらのオリゴデオキシヌクレオチドの５′−末端
を、標準的方法（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒ
ｉｔｓｃｈ及びＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，“Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｍａｎｕａｌ”，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２）に従ってγ−32Ｐ
−ｄＡＴＰ（５０００Ci／mmol）及びポリヌクレオチド
キナーゼ（ファルマシア）を用いて放射性（１〜２×１
０9 dpm／μｇ）にする。
【０１７２】２μｌずつ２個の例５のサイズ分画された
ＲＮＡを２枚のフィルター（Ｐａｌｌ−Ｂｉｏｄｙｎ
ｅ）にスポットし、真空オーブン中で８０℃にて２時間
加熱する。このフィルターを３２℃にて３時間、０．９
Ｍ ＮａＣｌ，１８０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０），６mM ＥＤＴＡ，０．５％ＳＤＳ及び５０μｇ／
mlの剪断された単鎖ウシ胸腺ＤＮＡを含有するデンハー
ト溶液５０ml中でプレハイブリダイズせしめる。プレハ
イブリダイゼーション溶液を除去した後、１枚のフィル
ターを２９℃にて３６時間、さらに５×１０7 dpm のオ
リゴデオキシヌクレオチド混合物１を含有するプレハイ
ブリダイゼーション溶液１．５ml中でハイブリダイズせ
しめる。第二のフィルターを３２℃にて、５×１０7 dp
m のオリゴデオキシヌクレオチド混合物２を含有する同
じ溶液中でハイブリダイズせしめる。
【０１７３】ハイブリダイゼーションの終りにおいて、
フィルターを２５℃（フィルター１）又は２９℃（フィ
ルター２）にて、２５０mlの０．６Ｍ ＮａＣｌ，０．
１２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），４mM ＥＤ
ＴＡ及び０．２％ＳＤＳにより、及び２５０mlの０．３
Ｍ ＮａＣｌ，０．０６Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０），０．２mM ＥＤＴＡ及び０．２％ＳＤＳによ
り１５分間ずつ４回、洗浄する。フィルターを乾燥した
後、フィルターをイルフォルド・ファスト・タングステ
ート・スクリーン（Ｉｌｆｏｒｄ Ｆａｓｔ Ｔｕｎｇ
ｓｔａｔｅ Ｓｃｒｅｅｎ）を用いて−８０℃にて３日
間Ｘ−線フィルムに暴露する。２枚のフィルターを比較
することにより、画分２３（９Ｓ）がほとんどのＭＲＰ
−８ ｍＲＮＡを含有すると推定される。
【０１７４】例７．サイズ分画したＲＮＡ中ＭＲＰ−１
４ ｍＲＮＡの位置決定 次の組成：５′−TAYTGRTGRAAIGTRTTIATIATNGT−３′
（式中、Ｉはイノシンである）のオリゴデオキシヌクレ
オチド混合物３、すなわち例３のペプチド断片Ａのアミ
ノ酸１−９をコードするｍＲＮＡに対して相補的である
可能性のあるＤＮＡ鎖である６４種類の異る２６−ｍｅ
ｒを、例６に記載したようにして合成し、そして放射性
（１〜２×１０9 dpm／μｇ）にする。
【０１７５】サイズ分画されたＲＮＡを例５に記載した
様にして調製する。但し、０．３mlずつの４０個の画分
を集め、そして沈澱したＲＮＡを４０μｌの水に溶解す
る。２μｌずつ２個のこのＲＮＡを２枚のフィルター上
にスポットし、８０℃にて乾燥する。フィルターをプレ
ハイブリダイズせしめ、そして５×１０7 dpm の上記の
オリゴデオキシヌクレオチド混合物３の存在下でハイブ
リダイズせしめ、そして洗浄する。これらの操作は例６
に記載したようにして行うが、但しハイブリダイゼーシ
ョン温度を３７℃する。Ｘ−線フィルム上のレプリカを
比較することにより、画分１２及び１３がほとんどのＭ
ＲＰ−１４ ｍＲＮＡを含有すると推定される。
【０１７６】例８．ＭＲＰ−８のｃＤＮＡクローニング ８．１．ｄｓ ｃＤＮＡの調製 画分２３（例６を参照のこと）からのＭＲＰ−８をコー
ドする３μｇの９ＳｍＲＮＡを４２℃にて９０分間、１
００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（４０℃にて測定したｐＨ
８．３），１０mM ＭｇＣｌ2 ，１４０mM ＫＣｌ，１
０mM ＤＴＴ，１mMの各ｄＮＴＰ，１００μｇ／mlオリ
ゴ−ｄＴ12-18 （ファルマシア）、９０ユニットのＲＮ
ａｓｉｎ（ゲノフィト）、４０ユニットのＡＭＶ逆転写
酵素（ゲノフィト）及び３０μCiのα−32Ｐ−ｄＣＴＰ
（３０００Ci／mmol）を含有する反応混合物５０μｌ中
でインキュベートする。２μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ
（ｐＨ７．５）を添加することにより反応を停止せしめ
る。０．１５Ｎ ＮａＯＨと共に６５℃にて１時間イン
キュベートすることによりＲＮＡを分解する。
【０１７７】２５μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）及び６μｌの１Ｎ ＨＣｌの添加により溶液を中和
する。ＳＤＳを０．５％に添加した後、ＴＮＥ緩衝液で
平衡化されたフェノール／クロロホルム（１：１）１０
０μｌにより溶液を抽出する。ＴＮＥ緩衝液中セファデ
ックスＧ−５０（ファルマシア）を収容する２mlのカラ
ムに前記の水性相を通す。２×１０6 dpm 32Ｐ（１．６
μｇ）の単鎖ｃＤＮＡを流過画分（０．４ml）から回収
し、そして１mlのエタノールにより沈澱せしめる。沈澱
を遠心分離により集め、そして１００mM Ｈｅｐｅｓ
（ｐＨ６．９），１０mM ＭｇＣｌ，２．５mM ＤＴ
Ｔ，７０mM ＫＣｌ，０．５mMの各ｄＮＴＰ及び４０ユ
ニットのＤＮＡポリメラーゼ“大断片”（ベーリンガ
ー）を含有する５０μｌの反応混合物中で１５℃にて一
夜、二本鎖化する。
【０１７８】Ｓ１ヌクレアーゼによる消化のため、反応
混合物を水３０μｌ、及び１Ｍ ＮａＣｌ，２５０mM
ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５），５mM ＺｎＳＯ4 及び２．
５％グリセリンを含有する溶液２０μｌ、及び１μｌの
１Ｎ ＨＣｌで稀釈する。２ユニットのＳ１ヌクレアー
ゼ（ファルマシア）を添加した後、混合物を３０℃にて
３０分間インキュベートする。５μｌの０．５Ｍ ＥＤ
ＴＡ（ｐＨ７．５），５μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．３）及び５μｌの２０％ＳＤＳを添加するこ
とにより反応を停止せしめ、フェノール−クロロホルム
により抽出し、そして上記の様にしてセファデックスＧ
−５０上でクロマトグラフ処理する。２μｇの二本鎖ｃ
ＤＮＡを回収し、そしてエタノールで沈澱せしめる。
【０１７９】８．２．Ｅ．コリ中のｃＤＮＡライブラリ
ー 例８．１．のｄｓ ｃＤＮＡをホモポリマーｄＣ−テイ
ルにより、２００mMカコジル酸カリウム（ｐＨ６．９，
１mM ＣｏＣｌ2 ，１mM ＤＴＴ及び０．７５μＭ ｄ
ＣＴＰを含有する反応混合物２００μｌ中で延長する。
３０℃にて１０分間予備加混した後、１２０ユニットの
ターミナル・デオキシヌクレオチジルトランスフェラー
ゼ（ファルマシア）を加え、そして混合物を３０℃にて
１５分間インキュベートする。４μｌの０．５Ｍ ＥＤ
ＴＡ（ｐＨ７．５）及び２μｌの２０％ＳＤＳを添加
し、そして前記のようにしてＤＮＡを抽出し、クロマト
グラフ処理しそして沈澱せしめる。
【０１８０】４０ng（２０μｌ）のこのｄＣ−テイルｃ
ＤＮＡを８μｌ（１００ng）のオリゴ−ｄＧ10-20 テイ
ルｐＵＣ９ ＤＮＡ（ファルマシア）及び１７２μｌの
ＴＮＥ緩衝液と混合し、そして６５℃にて１０分間、４
６℃にて１時間、３７℃にて１時間、及び室温にて１時
間、次々とインキュベートする。アニールされたｃＤＮ
Ａを用いて、Ｄ．Ｈａｎａｈａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，１９８３，１６６，５５７により記載されている
様にして形質転換のために調製されたコンピテントＥ．
コリＨＢ１０１（ＬＭ１０３５株）細胞を形質転換す
る。１μｌのアニールされたＤＮＡを２００μｌのコン
ピテント細胞に加え、そして３０分間氷上に置く。
【０１８１】この方法を６０回行う。９０秒間のヒート
シュック及び氷中での２分間の冷却の後、チューブ当り
０．８mlのＳＯＣ培地を加え、これを次に３７℃にて６
０分間インキュベートする。インキュベーションの後、
すべてのチューブを一緒にし、そして２５μｇ／mlのア
ンピシリンを含有する３枚のマッコンキー寒天プレート
（１２cm）上にプレートする。これらのプレートを３７
℃にて一夜インキュベートする。プレート当り２５００
個の生ずる組換体をナイロン膜（Ｐａｌｌ−Ｂｉｏｄｙ
ｎｅ）上に拾い上げ、そして２枚のレプリカを作る。マ
スターフィルターを寒天プレート上で４℃にて貯蔵し、
そしてＭａｎｉａｔｉｓのハンドブックに記載されてい
る様にしてコロニーハイブリダイゼーションのためにレ
プリカを処理する。
【０１８２】８．３．前スクリーニング 例８．２．のレプリカフィルターを３２℃にて２時間、
０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．１８Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０），６mM ＥＤＴＡ，０．２％ＳＤＳ及び
５０μｇ／mlの変性されたウシ胸腺ＤＮＡを含有する２
×デンハート溶液１００ml中でプレハイブリダイズせし
める。密封されたプラスチックバッグ中で、２×１０7
dpm のオリゴヌクレオチド混合物２（例６）を含有する
同じ溶液１ml中で３６時間ハイブリダイゼーションを行
う。ハイブリダイゼーションの後、フィルターを洗浄、
そしてＸ−線フィルムに一夜暴露する。両レプリカフィ
ルター上に陽性が現われる。６個の陽性クローンを増殖
せしめ、そしてこれらのプラスミドＤＮＡを制限分析の
ために分析する。
【０１８３】これらの６個のクローンからの最長のｃＤ
ＮＡ挿入部（約５００塩基対、クローン３）を選択して
同じｃＤＮＡライブラリー及び第二のｃＤＮＡライブラ
リーを再スクリーニングする。この第二のｃＤＮＡライ
ブラリーは、全長ｃＤＮＡクローンを得るため次の様に
して調製する。 ８．４．第二ｃＤＮＡライブラリー ＭＲＰ−８をコードする９Ｓ ｍＲＮＡ（例６の画分２
３）１０μｌ（１mg／ml）を２５μｌのＲＶＴ緩衝液、
２．５μｌの２０mM ｄＮＴＰ混合物、５μｌの１mg／
mlオリゴ−ｄＴ12-18 （ファルマシア）、１μｌのα−
32Ｐ−ｄＣＴＰ（１０μCi，３０００Ci／mmol）、３μ
ｌ ＲＮａｓｉｎ（６０ユニット、バイオテック），３
μｌのＡＭＶ逆転写酵素（６６ユニット、ゲノフィト）
及び２μｌの水を含有する溶解中でインキュベートす
る。この混合物を４２℃にて１．５時間インキュベート
し、次に２μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）を
添加することにより反応を停止する。ＲＮＡを変性せし
め、そしてｃＤＮＡを例８．１．のようにして集める。
【０１８４】このｃＤＮＡをオリゴ−ｄＣテイルによ
り、３２μｌのｃＤＮＡ（２．８μｇ），１０μｌの１
Ｍカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０），５μｌの１０
mM ＣｏＣｌ2 ，５μｌの１mM ＤＴＴ、及び１０μCi
の 3Ｈ−ｄＣＴＰ（２０Ci／mmol，１０μｌ凍結乾燥）
を含有する反応混合物中で延長する。３７℃にて５分間
のプレインキュベーションの後、３μｌのターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（８１ユニッ
ト、ファルマシア）を加え、そして１０分間インキュベ
ートする。５０μｌのＴＮＥ緩衝液を加え、そして溶液
を０．１mlのフェノール／クロロホルム混合液で抽出す
る。０．２mlのエタノールの添加及びドライアイス上で
の冷却によりｃＤＮＡを沈澱せしめる。遠心分離の後、
ペレットを７０％エタノールにより洗浄し、空気乾燥
し、そして１３μｌの水に溶解する。
【０１８５】１３μｌの水、２５μｌのＲＶＴ緩衝液、
２．５μｌの２０mM ｄＮＴＰ混合物、５μｌの０．２
mg／mlオリゴ−ｄＧ12-18 （ファルマシア），３μｌの
α− 32Ｐ−ｄＣＴＰ（１０ｍCi／ml，３０００Ci／mmo
l）及び３μｌの逆転写酵素（６６ユニット、ゲノフィ
ト）中上記ｃＤＮＡの溶液を４２℃にて１．５時間イン
キュベートする。２μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ
７．５）及び５０μｌのＴＮＥ緩衝液の添加により反応
を停止せしめ、そして混合物を０．１５mlのフェノール
／クロロホルム混合物で抽出する。
【０１８６】水相をセファデックスＧ−５０カラム（Ｔ
ＮＥ緩衝液中２．５ml）に適用し、そして１．３μｇの
ｄｓ ｃＤＮＡを含有する流過画分を集める。１mlのエ
タノールの添加及びドライアイス上での冷却によりＤＮ
Ａを沈澱せしめる。得られるペレットを３２μｌの水に
溶解し、そして単鎖ｃＤＮＡについて前記したようにし
てオリゴ−ｄＣにより延長する。１μｌの０．５Ｍ Ｅ
ＤＴＡ（ｐＨ７．５）の添加により反応を停止せしめ、
そしてサンプルを０．５ml幅のスロットを用いてＴＢＥ
緩衝液中水平１％アガロースゲルに負荷する。
【０１８７】５Ｖ／cmにて１時間電気泳動した後、０．
３５〜０．７kbの適当なサイズのｃＤＮＡを含有する領
域を切り出し、そして２個のマイクロ−コロジオンバッ
グ（サルトリウム）に入れ、そして水に浸漬する。０．
３mlの水を加え、そしてバッグを半濃度のＴＢＥ緩衝液
を収容する電気泳動装置に入れる。ＤＮＡを５Ｖ／cmの
電極距離で２０分間電気泳動し、そして激しいピペット
操作によりバッグから回収する。０．６mlのフェノール
／クロロホルム混合物により抽出した後、４０μｌの３
Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．５）及び１．２mlのエタノー
ルを加え、そして溶解を１０分間ドライアイス中で冷却
する。遠心分離（エッペンドルフ遠心機、５分間）の
後、１６４ngのｄｓ ｃＤＮＡを回収し、そして１８μ
ｌの１０mlＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び１mM
ＥＤＴＡ中に溶解する。
【０１８８】２０μｌ（２７ng）の上記ｃＤＮＡを８μ
ｌ（１００ng）のオリゴ−ｄＧ10-2 0 テイルｐＵＣ９
ＤＮＡ（ファルマシア）とアニールし、そして得られた
ＤＮＡを用いて前記（例８．１）のようにしてコンピテ
ントＥ．コリＨＢ１０１（ＬＭ１０３５株）細胞を形質
転換する。プレート当り２６００個の得られる組換体を
ナイロン膜（Ｐａｌｌ−Ｂｉｏｄｙｎｅ）上に拾い上
げ、そして２株のレプリカを作る。マスターフィルター
を寒天プレート上４℃にて貯蔵し、そしてレプリカをコ
ロニーハイブリダイゼーションのためにＭａｎｉａｔｉ
ｓのハンドブックに記載されているようにして処理す
る。
【０１８９】８．５．スクリーニング クローン３（例８．３）の１μｇのプラスミドからのｃ
ＤＮＡ挿入部をＨｉｎｄIII 及びＥｃｏＲＩ制限エンド
ヌクレアーゼにより消化し、そしてアガロースゲル電気
泳動により単離しそしてゲル溶出する。純粋なｃＤＮＡ
挿入部（１００ng）をアメルシャムのニックトランスレ
ーションキット（Ｎ．５０００）を用いて、供給者の指
示に従って放射性にする。この放射性ｃＤＮＡプローブ
は５×１０8 dpm／μｇの比活性を有する。
【０１９０】例８．４のレプリカフィルターを、０．９
Ｍ ＮａＣｌ，０．１８Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０），６mM ＥＤＴＡ，０．２％ＳＤＳ及び５０μ
ｇ／mlの変性されたウシ胸腺ＤＮＡを含有する２メデシ
ハート溶液１００ml中で２時間プレハイブリダイズせし
める。密封されたプラスチックバック中熱変性されたニ
ックトランスレーションｃＤＮＡプローブ（６０×１０
6 dpm ）を含有する同じ溶液１ml中で一夜ハイブリダイ
ゼーションを行う。ハイブリダイゼーションの後、フィ
ルターを０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．１８Ｍ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ８．０），６mM ＥＤＴＡ及び０．２％Ｓ
ＤＳを含有する２００mlの溶液中で６５℃にて２回洗浄
し、次に０．４５Ｍ ＮａＣｌ，０．０９Ｍ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），３mM ＥＤＴＡ及び０．２％
ＳＤＳを含有する２００mlの溶液中で６５℃にて２回、
及び０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０３Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０），１mM ＥＤＴＡ及び０．２％ＳＤ
Ｓを含有する溶液２００mlで２回洗浄する。フィルター
をＸ−線フィルムに一夜暴露し、そして両レプリカフィ
ルター上に陽性が現われる。
【０１９１】例９．ＭＲＰ−１４のｃＤＮＡクローニン
グ ９．１．ｄｓ ｃＤＮＡの調製 画分１２及び１３（例７）からのＭＲＰ−１４をコード
するｍＲＮＡ各２０μｌ（０．１２５mg／ml）ずつを４
２℃にて６０分間、７０μｌのＲＶＴ緩衝液、７μｌの
２０mM ｄＮＴＰ混合物、１０μｌの１mg／mlオリゴ−
ｄＴ12-18 （ファルマシア）、３μｌのＲＮａｓｉｎ
（６０ユニット、バイオテック），２μｌのＡＭＶ逆転
写酵素（６６ユニット、ゲノフィト）及び７μｌのα−
32Ｐ−ｄＣＴＰ（１μCi，３０００Ci／mmol）を含有す
る溶解中でインキュベートする。６μｌの０．５Ｍ Ｅ
ＤＴＡ（ｐＨ７．５）の添加により反応を停止せしめ
る。
【０１９２】３．７５μｌの１Ｎ ＮａＯＨとの６５℃
にて１時間のインキュベーションによりＲＮＡを分解す
る。溶液を２５μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
及び６μｌの１Ｎ ＨＣｌの添加により中和する。ＳＤ
Ｓを０．５％に添加した後、ＴＮＥ緩衝液で平衡化され
た１００μｌのフェノール／クロロホルム（１：１）に
より溶液を抽出する。水相をＴＮＥ緩衝液中セファデッ
クスＧ−５０を含有する２mlのカラムに通す。２×１０
5 dpm 32Ｐ（１．０μｇ）の一本鎖ｃＤＮＡを流過画分
（０．４ml）から回収し、そして１mlのエタノールの添
加により沈澱せしめる。遠沈を遠心分離により集める。
【０１９３】ｃＤＮＡをオリゴ−ｄＣテイルにより、例
８．４においてＭＲＰ−８ ｃＤＮＡについて記載した
ようにして延長し、次にＲＶＴ緩衝液中ｄＮＴＰ混合
物、オリゴ−ｄＧ12-18 α−32Ｐ−ｄＣＴＰ及び３μｌ
の逆転写酵素により３７℃にて６０分間処理する。フェ
ノール／クロロホルム抽出の後、水相をセファデックス
Ｇ−５０カラム（ＴＮＥ緩衝液中２．５ml）に適用し、
そして０．５３μｇのｄｓ ｃＤＮＡを含有する流過画
分（０．４ml）を集める。ＤＮＡをオリゴ−ｄＣテイル
により延長し、次に０．５cm幅のスロットを用いてＴＢ
Ｅ緩衝液中水平１％アガロースゲルに適用する。５Ｖ／
cmにて１時間の電気泳動の後、０．５〜０．７５kbの適
当なサイズを有するｃＤＮＡを含有する領域を切り取
り、そして例８．４において記載した様にして電気泳動
する。１００ngのｄｓ ｃＤＮＡを回収し、そして２０
０μｌの１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び
１mMＥＤＴＡに溶解する。
【０１９４】９．２．Ｅ．コリ中ｃＤＮＡライブラリー 例９．１のｄＣ−テイルｄｓ ｃＤＮＡを２０ng（２０
μｌ）３０μｌ（６０ng）のオリゴ−ｄＧ10-20 テイル
ｐＵＣ−ＫＯ ＤＮＡ及び２０μｌの１０倍濃度のＴＮ
Ｆ緩衝液と混合し、そして６５℃にて１０分間、４６℃
にて１時間、３７℃にて１時間及び室温にて１時間、次
々とインキュベートする。ｐＵＣ−ＫＯプラスミドはｐ
ＵＣ９の誘導体（ファルマシアから得られる）であり、
このプラスミドにおいてはｌａｃＺ遺伝子のプロモータ
ー／オペレーター領域がプロモーター配列のすぐ外側の
ＨａｅII制限部位とポリリンカー内のＨｉｎｄIII 制限
部位間で除去されており、ｐＵＣ９プラスミドの他の配
列は変化しないままである。
【０１９５】アニールされたｃＤＮＡプラスミドＤＮＡ
を用いて、ＭＲＰ−８ ｃＤＮＡについて例８．２に記
載したようにしてコンピテントＥ．コリＨＢ１０１（Ｌ
Ｍ１０３５株）細胞を形質転換する。それぞれ２５００
個の組換体を含む６枚のマッコンキー寒天プレートから
２枚のレプリカを作る。ナイロン膜上のマスターフィル
ターを寒天プレート上で４℃にて貯蔵し、そしてレプリ
カをコロニーハイブリダイゼーションのために処理す
る。
【０１９６】９．３．配列決定 例８．３において前スクリーニングについて記載したよ
うにして、密封されたプラスチックバッグ中で例７のオ
リゴヌクレオチド混合物３を含有する溶液中で３７℃に
てハイブリダイズせしめる。陽性コロニーが増殖し、そ
してこれらのプラスミドＤＮＡを制限分析のために単離
する。
【０１９７】約５００ヌクレオチドの挿入部を有するｐ
ＭＲＰ−１４−１０と称する組換プラスミドを選択して
同じｃＤＮＡライブラリーを再スクリーニングする。こ
のクローンｐＭＲＰ−１４−１０のプラスミド１μｇか
らのｃＤＮＡ挿入部をＨｉｎｄIII 及びＥｃｏＲＩ制限
エンドヌクレアーゼで消化することにより取り出し、そ
してニックトランスレーションキットを用いて放射性５
×１０8 dpm／μｇの比活性）にする。このプローブを
用いて例８．５に記載したようにして例９．２のレプリ
カフィルターを再度スクリーニングする。両レプリカフ
ィルター上に陽性が現われる。
【０１９８】例１０．ＭＲＰ−８をコードするＤＮＡ配
列 クローン３（例８．３）のｃＤＮＡ挿入部及び例８．５
の陽性クローンからの多数のｃＤＮＡ挿入部を選択し
て、よく知られているＳａｎｇｅｒの方法、並びにＭａ
ｘａｍ及びＧｉｌｂｅｒｔの方法を用いて完全なヌクレ
オチド配列を決定する。コード領域の配列を両鎖につい
て決定し、オーバーラップする断片について決定された
配列決定方策において制限部位を使用する。この方策を
第２図（パートＣ）中に要約し、そして制限部位を示す
（パートＢ）。クローン３のコードｃＤＮＡ配列（及び
それがコードするアミノ酸配列）を式（VII ）に示す。
第２図のパートＡはこのｃＤＮＡの全配列を示す。特別
の特徴及びクローン３のこのｃＤＮＡと他のクローンと
の間の相違を番号で示し、そして下記する。 １． １位：クローン３の末端、６８位までの配列
はクローン３にのみ存在し、そして該遺伝子中に見出さ
れない。 ２． ６９位：クローン８及び１５の末端；クローン
３及び８ではＡであり、そしてクローン１５ではＴであ
る。 ３． ７２位：クローン３中GGCAAAからクローン８及
び１５中TCTCTTに６塩基が変化している。 ４． ８６位：クローン７の末端。 ５． １０２位：クローン１５において１７塩基AAGGTT
CTGTTTTTCAG が挿入されている。 ６． １０８位：クローン１４の末端。 ７． １０９位：クローン２及び１１０の末端。 ８． １１３位：クローン７，８，１４及び１５におい
てＴが挿入されている。 ９． １１５位：クローン２及び１１０において塩基が
Ｔに変化している。 10． １２４位：コード領域の開始。 11． ３７８位：該遺伝子中に見出されないＡＡがクロ
ーン２に挿入されている。 12． ４０３位：コード領域の末端。 13． ４７５位：ポリＡ−テイルの開始。
【０１９９】例１１．ＭＲＰ−１４をコードするＤＮＡ
配列 ２個のクローン（例９．３，ｐＭＲＰ−１４−１０及び
ｐＭＲＰ−１４−１６）のｃＤＮＡ挿入部を選択し全ヌ
クレオチド配列を決定する。この方法を第３図に示す。
これらのクローンのコードｃＤＮＡ配列（及びこれがコ
ードするアミノ酸配列）は同じであり、そして式（IX）
で与えられる。
【０２００】他の３個のクローン（ｐＭＲＰ−１４−１
５，１８及び１９）を３′−末端について分析する。す
べてが式（IX）において示されるものと同一の配列を示
し、ｍＲＮＡの天然３′−末端を欠く。例１２ ．ｔｒｐプロモーターの制御のもとでのＥ．コリ
中でのＭＲＰ−８の発現 ｔｒｐプロモーター及びＭＲＰ−８をコードするＤＮＡ
挿入部を含有するＥ．コリのための発現ベクターを、ヨ
ーロッパ特許出願ＥＰ １４６，７８５中に対応するエ
グリンＣ発現ベクターについて記載されているのと実質
的に同じ方法により調製する。
【０２０１】１２．１．ベクターの調製 ２０μｇのプラスミドｐＨＲｉ１４８（ＥＰ １４６，
７８５）を、ＢａｍＨＩを用いて完全消化する。３ユニ
ットのウシ小腸アルカリホスファターゼを用いて末端を
脱リン酸化する。ＤＮＡをフェノール／クロロホルム混
合物で抽出し、次にＥｃｏＲＩにより完全消化する。ベ
クターＤＮＡを例８．４においてｃＤＮＡについて記載
したアガロースゲル電気泳動及び電気溶出により単離す
る。ベクターＤＮＡを水に０．５μｇ／mlの濃度で溶解
する。
【０２０２】１２．２．リンカーの調製 ５′−AATTCATGCTGACTGAGC−３′及び５′−TCAGTCAGCA
TG−３′を標準的方法（Ｈ．Ｒｉｎｋ等、Ｎｕｃｌｅｉ
ｒ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８４，１２，６
３６９）を用いて合成する。２μｇの短い方のオリゴヌ
クレオチドをＡＴＰ及びヌクレオチドキナーゼを用いて
リン酸化し、そして２μｇの脱リン酸化された大きい方
のオリゴデオキシヌクレオチドにＤＮＡリガーゼにより
連結する。連結に続き、ｄｓ ＤＮＡをＡｌｕＩにより
完全消化する。ＤＮＡをフェノール／クロロホルム混合
物により抽出し、エタノールにより沈澱せしめ、そして
１０μｌ Ｈ2 Ｏに溶解する。
【０２０３】１２．３．挿入ＤＮＡの調製 ２０μｇのクローン３のｃＤＮＡ（例８．３）をＢａｍ
ＨＩ及びＰｖｕIIにより完全消化し、そして約４８０bp
のｃＤＮＡ挿入部をアガロースゲル電気泳動及びゲル溶
出により単離する。３μｇのこのＤＮＡ断片をＡｌｕＩ
により部分消化し、そして約３４０bpの断片を上記の様
にして単離する。７０μｇのこのＤＮＡを８μｇの水中
例１２．２のリンカーＤＮＡ溶液８μｌに連結する。得
られるＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにより完全消
化し、そして約４４０bpの得られる断片をＰＥＧＥ及び
電気溶出により単離する。
【０２０４】１２．４．ベクターと挿入部の連結 例１２．１のベクター０．５μｇ及び例１２．３の挿入
部−リンカーＤＮＡ５０ngを連結する。得られるＤＮＡ
を使用して上記（例８．２）の様にしてコンピテント
Ｅ．コリＨＢ１０１（ＬＭ１０３５株）細胞を形質転換
する。予想通りの制限酵素パターン及び挿入部のＤＮＡ
配列を示す組換体ｐＭＲＰ−８−ｔｒｐをＭＲＰ−８の
発現のために選択する。
【０２０５】１２．５．発 酵 ｐＭＲＰ−８−ｔｒｐ（例１２．４）を含有するＥ．コ
リを、１ｌ当り７ｇのＮａ2 ＨＰＯ4 ，３ｇのＫＨ2 Ｐ
Ｏ4 ，０．５ｇのＮａＣｌ，１ｇのＮＨ4 Ｃｌ，５ｇの
グルコース、０．０２ｇのＣａＣｌ2 ，０．２５ｇのＭ
ｇＳＯ4 ，２５ｇのカザミノ酸、０．１ｇのチアミン及
び５０mgのアンピシリンを含有する培地２００ml中で３
７℃にて一夜増殖せしめる。培養物を１２．５μｇ／ml
のβ−インドール酢酸が補充された、あらかじめ加温さ
れた上記と同じ培地で稀釈する。４．５時間後、光学濃
度ＯＤ650 が１．３に達する。細胞を遠心により集め
る。ｐＨＲｉ１４８を含有するＥ．コリを用いて対照培
養物を同様にして調製する。
【０２０６】１２．６．リゾチーム抽出 細菌ペレットを５０mlの５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０），３０mMＮａＣｌ及び１mg／ml卵白リゾチー
ム中に両懸濁する。この懸濁液を氷中に１時間保持す
る。０．１mM ＰＭＳＦを添加し、そして液体窒素中で
の凍結及び３７℃での解凍のサイクルにより細胞を破壊
する。ＳＳ３４ローター（ソルバル）中４℃，１７００
０rpm での３０分間の遠心により細胞溶解物を透明にす
る。
【０２０７】１２．７．尿素−音波処理（ｓｏｎｉｆｉ
ｅｄ）抽出 例１２．５の細菌ペレットから調製された５０mM Ｈｅ
ｐｅｓ（ｐＨ８．０），３０mM ＮａＣｌ及び０．１％
エタノールアミン中細胞懸濁液（ＯＤ650 ＝２０）２
２．５mlを１８ｇの尿素と混合する。懸濁液を、９．５
mmプローブ及び２４ミクロン強度を用いるＭＳＥソニプ
レプ１５０により３０分間隔で３×３０秒間音波処理す
る。ソルバルＳＳ３４ローター中２０℃，１７０００rp
m にて３０分間遠心することにより細胞溶解物を透明に
する。上清を０．１mMのＣａＣｌ2，ＭｇＣｌ2 ，Ｃｏ
Ｃｌ2 ，ＺｎＣｌ2 ，ＭｎＣｌ2 ，ＣｕＳＯ4 及びＦｅ
ＳＯ 4 とし、そして１０mM Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．
５），１３０mM ＮａＣｌ及び０．１mMの上記と同じ塩
の溶液を３回交換して透析する。透析物を、例１２．６
に記載したような遠心分離により透明にする。
【０２０８】例１３．ｔｒｐプロモーターの制御のもと
でのＥ．コリ中のＭＲＰの発現 ｔｒｐプロモーター及びＭＲＰ−１４をコードするＤＮ
Ａ挿入部を含有するＥ．コリのための発現ベクターを、
例１２に記載したのと実質的に同じ方法により調製す
る。 １３．１．リンカーの調製 標準的方法（Ｈ．Ｒｉｎｋ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１９８４，１２，６３６９）を用
いて次のオリゴデオキシヌクレオチド：（１）５′−AA
TTCATGACTTGCAAAATGTCGCAG−３′，（２）５′−CTGCGA
CATTTTGCAAGTCATG−３′，（３）５′−AATTCATGTCGCAG
−３′及び（４）５′−CTGCGACATG−３′を合成する。
オリゴデオキシヌクレオチド１及び３を、ＡＴＰ及びポ
リヌクレオチドキナーゼを用いて標準的方法によりリン
酸化する。リン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチド
１と未リン酸化オリゴデオキシヌクレオチドの等モル混
合物、及びリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチド
３と未リン酸化オリゴデオキシヌクレオチド４の等モル
混合物を調製する。混合物１−２を用いてＭＲＰ−１４
を発現するプラスミドを造成し、そして混合物３−４を
使用してＭＲＰ−１４の最初の４ヌクレオチドが欠失し
たＭＲＰ−１４ｄを発現するプラスミドを造成する。
【０２０９】１３．２．ベクターの調製 例１２．１において調製したプラスミドｐＨＲｉ１４８
からのベクターＤＮＡ１μｇずつを、それぞれ例１３．
１のリンカー混合物１−２、及び３−４（５０ｐmol ）
と連結する。アガロースゲル電気泳動及びゲル溶出によ
り遊離リンカーからベクターＤＮＡを分離する。１０μ
ｇのクローンｐＭＲＰ−１４−１０ｃＤＮＡ（例９．
３）をＢａｍＨＩ及びＰｖｕIIで完全消化し、そして約
４３０bpのｃＤＮＡ挿入部をアガロースゲル電気泳動及
びゲル溶出により単離する。２５ngずつのこのｃＤＮＡ
挿入部を０．２μｇのベクター−リンカー１−２（ＭＲ
Ｐ−１４）及び０．２μｇのベクター−リンカー３−４
（ＭＲＰ−１４ｄ）に連結する。生ずるＤＮＡを用いて
前記の様にしてコンピテントＥ．コリＨＢ１０１細胞
（ＬＭ１０３５株）を形質転換する。予想通りの制限酵
素パターン及び挿入部のＤＮＡ配列を示す組換体ｐＭＲ
Ｐ−１４−ｔｒｐ及びｐＭＲＰ−１４−ｔｒｐを、それ
ぞれＭＲＰ−１４及びＭＲＰ−１４ｄの発現のために選
択する。
【０２１０】１３．３．形質転換されたＥ．コリの発酵
及びＭＲＰ−１４の抽出 ＭＲＰ−１４−ｔｒｐ又はｐＭＲＰ−１４ｄ−ｔｒｐ
（例１３．２）を含有するＥ．コリを例１２．３に記載
したようにして増殖せしめそして処理する。細胞をリゾ
チームで処理するか、又は尿素溶液中での音波処理によ
って破壊し、そして細胞溶解物を例１２．６及び１２．
７に記載したようにして処理する。
【０２１１】例１４．ファージλのプロモーターＰL の
制御のもとでのＥ．コリ中でのＭＲＰ−８の発現 １４．１．ベクターの造成 プラスミドｐＰＬｃ２４（Ｅ．Ｒｅｍａｕｔ，Ｐ．Ｓｔ
ａｎｓｓｅｎｓ及びＷ．Ｆｉｅｒｓ，Ｇｅｎｅ １９８
１，１５，８１）をＥｃｏＲＩにより消化し、次にＫｌ
ｅｎｏｗポリメラーゼ及びｄＮＴＰで処理して平滑末端
化する。ＤＮＡをＢａｍＨＩで処理し、そして生ずるベ
クターＤＮＡをアガロースゲル電気泳動及び電気溶出に
より単離する。ｐＭＲＰ−８−ｔｒｐ ＤＮＡ（例１
２．４）をＢａｍＨＩにより完全消化し、そしてＨｐａ
Ｉにより部分消化する。約４４０bpの断片をアガロース
ゲル電気泳動及び電気溶出により単離する。
【０２１２】この断片をｐＰＬｃ２４由来のベクターＤ
ＮＡに連結し、そして生ずるＤＮＡを使用して野性型
Ｅ．コリＫ１２を形質転換する。形質転換体を４０μｇ
のアンピシリンを含有するＬ−プレートにプレートす
る。組換体の標準的配列分析を行って造成の正しさを確
認する。正しい配列のＤＮＡを使用してＥ．コリＷ３１
１０及びＨＢ１０１株（いずれもλｃＩ８５７を有す
る）（Ｒｅｍａｕｔ等前に引用）を形質転換する。形質
転換体を４０μｇ／mlのカナマイシン及びアンピシリン
を含有するＬ−プレート上にプレートする。得られる組
換体ｐＭＲＰ−８−Ｐ L を発酵のために使用する。
【０２１３】１４．２．発 酵 組換体ｐＭＲＰ−８−ＰL を、４０μｇ／mlのアンピシ
リン及びカナマイシンを含有するＬＢ培地中で３０℃に
て一夜増殖せしめる。培養物を同じ培地により１：５で
稀釈し、そして４２℃にて２．５時間インキュベートす
る。例１２．６又は１２．７に記載したようにして細胞
を溶解せしめる。
【０２１４】例１５．ファージλのプロモーターＰL の
制御のもとでのＥ．コリにおけるＭＲＰ−１４及びＭＲ
Ｐ−１４ｄの発現 ｐＭＲＰ−１４−ｔｒｐ及びｐＭＲＰ−１４ｄ−ｔｒｐ
のそれぞれとプラスミドｐＰＬｃ２４とからベクターを
造成し、そしてこれを用いて例１４．１に記載したよう
にしてＥ．コリＫ１２，Ｗ３１１０及びＨＢ１０１を形
質転換する。生ずる組換体ｐＭＲＰ−１４−ＰL 及びｐ
ＭＲＰ−１４ｄ−ＰL を例１４．２に記載したようにし
てＬＢ培地中で増殖せしめ、そして溶解する。
【０２１５】例１６．Ｓ．セレビシエー中でのＭＲＰ−
８の発現のためのプラスミドの造成１６．１．ｐＪＤＢ
２０７ベクター断片の単離 ６μｇのプラスミドｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨＯ−ＴＰＡ
１２−２（ヨーロッパ特許出願ＥＰ １４３，０８１）
を制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩにより完全消化す
る。６．８kb及び２．４kbのサイズの生ずるＤＮＡ断片
をエタノールで沈澱せしめ、そして４００μｌの５０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に再懸濁する。
４．５ユニットのウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ベ
ーリンガー・マンハイム）を加える。
【０２１６】混合物を３７℃にて１時間インキュベート
する。６５℃にて１．５時間のインキュベーションによ
りホスファターゼを不活性化する。溶液を１５０mM Ｎ
ａＣｌに調整する。１５０mM ＮａＣｌ及び１mM ＥＤ
ＴＡを含有する１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）で平衡化された１００μｌのベッドのＤＥ５２（ワ
ットマン）陰イオン交換体に適用する。同じ緩衝液で洗
浄した後、ＤＮＡを４００μｌの１．５Ｍ ＮａＣｌ，
１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び１mM Ｅ
ＤＴＡで溶出し、そしてエタノールにより沈澱せしめ
る。大６．８５kbＢａｍＨＩ断片を、ＴＢＥ緩衝液中１
％アガロースゲル上で小断片から分離する。ＤＮＡ断片
をゲルから電気溶出し、ＤＥ５２陰イオン交換クロマト
グラフィー（前記参照のこと）により精製し、エタノー
ルにより沈澱せしめ、そして水中に０．１ｐmol ／μｌ
の濃度で再懸濁する。
【０２１７】１６．２．５３４bp ＰＨ０５プロモータ
ー断片の単離 １０μｇのプラスミドｐ３１／Ｒ（ヨーロッパ特許出願
ＥＰ．１００，５６１）をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで
消化する。生ずる３個の断片をＴＢＥ緩衝液中１．２％
アガロースゲル上で分離する。５３４bp ＢａｍＨＩ−
ＥｃｏＲＩ断片がＰＨ０５プロモーターを含んで成る。
ＤＮＡ断片をゲルから電気溶出し、ＤＥ５２クロマトグ
ラフィーにより精製し、エタノール沈澱せしめ、そして
０．１ｐmol ／μｌの濃度に再懸濁する。
【０２１８】１６．３．ＭＲＰ−８をコードする０．４
kb ＤＮＡ断片の単離 １０μｇのプラスミドｐＭＲＰ−８−ｔｒｐ（例１２．
４）をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化する。生ずる２
種類のＤＮＡ断片を１．２％アガロースゲル上で分離す
る。０．４kbの断片を上記のようにして単離し、そして
水に０．１ｐmol ／μｌの濃度で再懸濁する。
【０２１９】１６．４．ＤＮＡ断片の連結 ０．１ｐmol （０．４５μｇ）の６．８kb ＢａｍＨＩ
ベクター断片、０．２ｐmol （７０μｇ）の５３４ｂｐ
ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩＰＨ０５プロモーター断片及
び０．２ｐmol （５２ng）のｐＭＲＰ−８−ｔｒｐの
０．４kb ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を、１５mlの６
０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０mM Ｍｇ
Ｃｌ2 ，１０mM ＤＴＴ，１mM ＡＴＰ及び６００ユニ
ットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（バイオラブス）中で１５℃
にて６時間連結する。連結混合物の１μｌのアリコート
をカルシウム処理された形質転換コンピテントＥ．コリ
ＨＢ１０１細胞１００μｌに添加する。
【０２２０】１２個の形質転換されたアンピシリン耐性
コロニーを１００μｇ／mlのアンピシリンを含有するＬ
Ｂ培地中で個別に増殖せしめる。Ｈｏｌｍｅｓ等の方法
（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８１，１１４，１
９３）に従ってプラスミドＤＮＡを精製し、そしてＢａ
ｍＨＩ及びＨｉｎｄIII ／ＥｃｏＲＩ消化により分析す
る。７８０bp ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII 断片の出現が
ＰＨ０５プロモーター−ＭＲＰ−８ ＤＮＡ挿入部の正
しい方向を示す。このようなクローンを単離し、そして
ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＭＲＰ−８と命名する。
【０２２１】例１７．Ｓ．セレビシエー中でのＭＲＰ−
１４及びＭＲＰ−１４ｄの発現のためのプラスミドの造
成 サッカロミセス・セレビシエー中でのＭＲＰ−１４及び
ＭＲＰ−１４ｄのためのプラスミドを、プラスミドｐＪ
ＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＴＰＡ１２−２、並びにｐＭ
ＲＰ−１４−ｔｒｐ及びｐＭＲＰ−１４ｄ−ｔｒｐの
０．４kb ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片から、例１６に
記載されているようにして調製する。
【０２２２】Ｅ．コリＨＢ１０１細胞の形質転換された
アンピシリン耐性コロニーを１００μｇ／mlのアンピシ
リンを含有するＬＢ培地に個別に増殖せしめる。プラス
ミドＤＮＡを調製しそしてＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII
／ＥｃｏＲＩ消化により分析する。７８０bpのＥｃｏＲ
Ｉ−ＨｉｎｄIII 断片の出現がＰＨ０５プロモーター−
ＭＲＰ−１４又は−ＭＲＰ−１４ｄ ＤＮＡ挿入部の正
しい方向を示す。この様なクローンを単離し、そしてそ
れぞれｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＭＲＰ−１４、及
びｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＭＲＰ−１４ｄと命名
する。
【０２２３】例１８．サッカロミセス・セレビシエーＧ
ＲＦ１８の形質転換 プラスミドｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＭＲＰ−８，
ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＭＲＰ−１４、及びｐＪ
ＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＭＲＰ−１４ｄを、Ｈｉｎｎ
ｅｎ等（Ｐｒｏｅ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ １９７８，７５，１９２９）により記載されている
形質転換法を用いて、サッカロミセス・セレビシエーＧ
ＲＦ−１８（α，ｈｉｓ３−１１，ｈｉｓ３−１５，ｌ
ｅｕ２−３，ｌｅｕ２−１１２，ＫａｎR ）に導入す
る。形質転換された酵母細胞をロイシンを欠く酵母最少
培地上で選択する。単独の形質転換された酵母コロニー
を単離し、そしてサッカロミセス・セレビシエーＧＲＦ
１８／ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＭＲＰ−８，ＧＲ
Ｆ１８／ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＭＲＰ−１４及
びＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＭＲＰ−
１４ｄと命名する。
【０２２４】例１９．形質転換された酵母の発酵 前記形質転換された酵母株サッカロミセス・セレビシエ
ーＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＭＲＰ−
８，ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＭＲＰ
−１４、及びＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０５
−ＭＲＰ−１４ｄを、５０mlの酵母最少培地（アミノ酸
を含有しないディフコ・イースト・ナイトロジェン・ベ
ースに２％のグルコース及び２０mg／ｌのＬ−ヒスチジ
ンを添加したもの）中で３０℃にて２５時間、３×１０
7 細胞／mlの濃度まで振とうする。細胞を０．９％ Ｎ
ａＣｌで洗浄し、そして０．０３ｇ／ｌのＫＨ2 Ｐ
Ｏ4 ，１ｇ／ｌのＫＣｌ，１０ｇ／ｌのＬ−アスパラギ
ン（（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 の代りに）、２％グルコース及
び１ｇ／ｌのＬ−ヒスチジンを含有するディフコ・イー
スト・ナイトロジェン・ベース培地（アミノ酸を含有し
ない）の配合に従って調製する。培地に出発ＯＤ600 が
０．２５になるように接種する。細胞を３０℃にて２４
時間増殖せしめ、そしてＯＤ600 がこの時点で収得す
る。
【０２２５】３５mlの低Ｐｉ培地の細胞を遠心分離によ
り集め、そして全４mlの冷６６mMリンサンナトリウム
（ｐＨ７．４）及び０．１ｖ／ｖ％トリトンＸ−１００
の緩衝液中に再懸濁する。細胞懸濁液を３０mlのコレッ
クスチューブに移し、８ｇのガラスビーズ（直径０．４
mm）を添加し、そして懸濁液をボルテックスミキサー
（サイエンティフィックインスツルトンツ社、ＵＳＡ）
上で全速で４分間振とうし、そして次に氷浴中で冷却す
る。この方法によって９０％以上の細胞が破壊される。
細胞破片及びガラスビーズを、ソルバルＨＢ−４ロータ
ー中４℃、８０００rpm にて１０分間の遠心分離により
沈澱せしめる。上清をＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移
し、液体窒素で凍結し、そして−６０℃にて貯蔵する。
【０２２６】例２０．ＭＲＰ−８の単離及び精製 ２０．１．ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー 例１２．６の７２mlの粗細胞溶解物を２０mM Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ，０．０１％ＤＴＴ（ｐＨ８．５）に対して透
析（スペクトラポール膜No．３，３．５kDカットオフ、
スペクトラム・メディカル・インダストリーズ）する。
透析された溶液を透析緩衝液で平衡化されたＤＥＡＥト
リスアクリルＭ（ＬＫＢ）イオン交換カラム（２．６×
１０cm）上にポンプ輸送する。サンプルを負荷した後、
ＵＶ２５４nmの吸収がベースラインレベルに対するまで
（ユビコード、Ｓ．ＬＫＢ）カラムを透析緩衝液で洗浄
する。
【０２２７】カラムに結合した蛋白質を、透析緩衝液中
０．０Ｍから０．２Ｍに上昇するＮａＣｌの直線グラジ
エントにより、次に透析緩衝液／０．２Ｍ ＮａＣｌ
（８０ml）及び透析緩衝液／１．０Ｍ ＮａＣｌ（２０
０ml）で１．８ml／分の流速にて溶出する（ペリスタポ
ンプＰ−Ｉ、ファルマシア）。個々の９mlの画分（ウル
トロラックII，ＬＫＢにより集める）を１５％ポリアク
リルアミドスラブゲル上ＳＤＳ−ＰＡＧＥ〔Ｕ．Ｋ．Ｌ
ａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ １９７０，２２７，６８
０〕により分析し、そしてそれらのＭＲＰ−８含量に従
ってプールする。１８０〜３８０μｓの間で溶出する画
分のプール（ビオラド導電モニター）を限外濾過により
（ＹＭ−１０膜、アミコン）濃縮して５．５mlの容量に
する。
【０２２８】ＭＲＰ−８を含有する例１２．７，１４．
２及び１９の粗細胞溶解物のサンプルを同様にして処理
する。 ２０．２．サイズ排除クロマトグラフィー 例２０．１からの濃縮されたプールを、ＨＰＬＣポンプ
２１５０，ＬＫＢからの２チャンネルレコーダー２２１
０及びＫｒａｔｏｓからのＨＰＬＣ ＵＶ検出機スペク
トロフロ−７５７から成るＨＰＬＣ系で、３０mM Ｎａ
ＯＡｃ及び１５０mM ＮａＣｌ（ｐＨ６．５）中で平衡
化されたＧ３０００ＳＷＧ高速ゲル濾過カラム（ＬＫ
Ｂ）により分離する。適用された最大サンプル容量は２
mlであり、流速は３ml／分であり、そして画分は１分間
ごとに自動的に集める（フラクションコレクター・スー
パーラック、２２１１，ＬＫＢ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
よる分析に基いて、溶出容量１６３ml〜１８２mlの間で
溶出する画分をプールし、そして上記のようにして限外
濾過により６mlの容量に濃縮する。
【０２２９】２０．３．モノＱカラムにおける高分離イ
オン交換クロマトグラフィー 例２０．２の濃縮されたプール０．８mlを３mlの水で稀
釈し、そして希アンモニアによりｐＨ８．５に調整す
る。この溶液を２０mMジエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．５）中で平衡化されたモノＱ ＨＲ ５／５カラ
ム（ＦＰＬＣ、ファストプロテイン、ポリペプチド、ポ
リヌクレオチド液体クロマトグラフィー系、ファルマシ
ア）に適用する。このカラムを１２mlのジエタノールア
ミン緩衝液で洗浄し、そして同じ緩衝液中０．０５〜
０．１２５Ｍ ＮａＣｌの直線ＮａＣｌグラジエントに
より、２１分間にわたり１．５ml／分の流速で溶出す
る。個々のピークの画分をＵＶ２８０nm溶出パターンに
従って手動で集める。
【０２３０】２０．４．スルホプロピルイオン交換クロ
マトグラフィー サイズ排除クロマトグラフィー及びモノＱイオン交換ク
ロマトグラフィー（例２０．２及び２０．３）に代る方
法として、例２０．１からの濃縮されたプール（約２５
０mgの蛋白質を含有する５２ml）を５０mM ＮａＯＡｃ
／０．０１％ＤＴＴ（ｐＨ５．５）（出発緩衝液）に対
して透析し、そして同じ緩衝液で平衡化されたＳＰトリ
スアクリルＭ（ＬＫＢ）イオン交換カラム（２．５×１
０cm）にポンプ輸送する。ＵＶ２５４nmの吸収がベース
ラインレベルに達するまでカラムを緩衝液により洗浄す
る。カラムに結合した蛋白質を出発緩衝液中０．０Ｍ〜
０．５Ｍ ＮａＣｌの直線グラジエント、次に出発緩衝
液／０．５Ｍ ＮａＣｌ（１００ml）及び出発緩衝液／
１．０Ｍ ＮａＣｌ（１００ml）により２．０ml／分の
流速で溶出する。ＭＲＰ−８は０．２５Ｍ〜０．３５Ｍ
ＮａＣｌの間で溶出する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判
定した純度は、この段階で９０％より高い。
【０２３１】２０．５．逆相ＨＰＬＣ 例２０．３又は２０．４の蛋白質画分を、バリアン５０
００液体クロマトグラフを用いて、Ｖｙｄａｃ ２１８
ＴＰ ５４１５逆相ＨＰＬＣカラム（ザ・セイレーシ
ョンズ・グループ、ヘスパリア、ＣＡ、米国）によりさ
らに精製する。カラムを、水中０．１％ＴＦＡを６５％
とアセトニトリル中０．０７％ＴＦＡを３５％との混合
物中で平衡化する。サンプルを注入して５分間後、１２
分間の直線グラジエントを開始し、水中０．１％ＴＦＡ
を４５％とアセトニトリル中０．０７％ＴＦＡを５５％
の混合物で終り、流速は１ml／分とする。溶出液は２１
５nmにおけるＵＶ吸収によりモニターする。
【０２３２】ＭＲＰ−８は、それぞれ保持時間が１４．
５分と１５．８分の２つの別個のピーク中に溶出する。
還元条件下又は非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り示されるように、早い溶出物はＭＲＰ−８のモノマー
形（見かけ分子量８kD）であり、第二のピークはＭＲＰ
−８の二量体ジスルフィド結合誘導体（見かけ分子量１
６kD）から成る。
【０２３３】例２１．ＭＲＰ−８の特徴付け ２１．１．アミノ酸配列分析 例２０の精製されたＭＲＰ−８を、Ｍ．Ｗ．Ｈｕｎｋａ
ｐｉｌｌａｒ及びＬ．Ｅ．Ｈｏｏｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９８３，９１，３９９
の方法に従って、気相蛋白質シーケンサーモデル４７０
（アプライドバイオシステムス）を用いてＮ−末端アミ
ノ酸配列分析にかける。アニリノ−チアゾリノン誘導体
を５０℃にて２５％水性ＴＦＡで処理することによりフ
ェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸に転換す
る。ＰＴＨアミノ酸をＺｏｒｂａｘＣＮ ＨＰＬＣカラ
ム（デュポン、２００×４．６mm）〔Ｒ．Ｋｎｅｃｈｔ
等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８３，１３０，６
５〕上で分析する。次のＮ−末端アミノ酸配列が見出さ
れる。 Met-Leu-Thr-Glu-Leu-Glu-Lys-Ala-Leu-Asn (10)-Ser-I
le-Ile-Asp-Val-Tyr-X17-Lys-Tyr-Ser (20)-Leu-Ile-Ly
s-Gly-Asn-Phe-X27-Ala-Val-Tyr (30)-X31-Asp-Asp-Leu
-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Thr (40)-Glu-X42-Pro-Gln-Tyr-
Ile-X47-Lys-Lys-Gly (50)-Ala-Asp-Val-Trp-Phe-Lys- Ｘ17，Ｘ27，Ｘ31，Ｘ42及びＸ47は未決定アミノ酸であ
る。この配列はｃＤＮＡ分析（例１０）により決定され
た式（Ｉ）又は（II）の配列と一致する。
【０２３４】２１．２．逆相ＨＰＬＣ 分析逆相ＨＰＬＣを、Ｖｙｄａｃ ２１８ ＴＰ−Ｂ５
−５μ（４．０×１２０mm）上で、ＥＰ １６２，８１
２のヒトＭＩＦ ８kD、例２０のＭＲＰ−８、及びこれ
らの混合物について、水中０．１％ＴＦＡを６５％とア
セトニトリル中０．０８％ＴＦＡを３５％の混合物から
水中０．１％ＴＦＡを４５％とアセトニトリル中０．０
８％ＴＦＡを５５％の混合物まで、３０分間の直線グラ
ジエントを用いて行う。ヒトＭＩＦ ８kDとＭＲＰ−８
はこれらの条件下で識別されず、そして１１．２分間の
保持時間（２１５nmでのＵＶ吸収）で溶出する。
【０２３５】２１．３．サイズ排除クロマトグラフィー ＭＲＰ−８及び例２０の二量体ジスルフィド結合ＭＲＰ
−８誘導体を３０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ及び１５０mM Ｎ
ａＣｌ（ｐＨ７．０）中ＳｈｉｍｐａｃｋＤｉｏｌ １
５０高速サイズ排除クロマトグラフィーカラム（シマ
ズ、７．９×５００mm）中で１ml／分の流速でクロマト
グラフ分析する。ＵＶ吸収を２１５nmで測定する。標準
分子量マーカーであるチトクロームｃ（１２kD）、ミオ
グロビン（１７kD）、カルボニックアンヒドラーゼ（３
０kD）、オバルブミン（４５kD）及びＢＳＡ（６６．２
kD）と比較した場合、モノマーＭＲＰ−８は見かけ分子
量３０kDをもって１６．４分間の後に溶出し、そして二
量体ＭＲＰ−８誘導体は見かけ分子量４２kDをもって１
５．１分間後に溶出する。
【０２３６】２１．４．マススペクトル ＭＲＰ−８の分子量を、ファスト・アトム・ボンバード
メント（ＦＡＢ−ＭＳ）法により、Ｍ．Ｂａｒｂｅｒ等
（Ｎａｔｕｒｅ １９８１，２９３，２７０）に従っ
て、ＺＡＢ−ＳＥスペクトロメーター（ＶＧアナリティ
カル社、マンチェスター、ＧＢ）を用いて８kVにて決定
する。３５kVのセシウムガンによりイオン化を行う。
０．１％ＴＦＡを含有するチオグリセロールをマトリク
スとして使用する。
【０２３７】Ｍ（計算値）：１０′８２３．５３ Ｍ（測定値）：１０′８３３．６ ±２．１（４個の測
定値の平均） ＭＲＰ−８のアリコートを１／１０量のトリプシン、キ
モトリプシン、又はスタフィロコッカス・アウレウスか
らのＶ８蛋白質（５０mM ＮＨ4 ＨＣＯ3 中）により消
化する。Ｖ８断片はメトノール中１．２５Ｎ ＨＣｌに
より室温にて１時間メチルエステルに転換する。トリプ
シン断片（５０μｇ）は５０μｌの過蟻酸（１部の３０
％Ｈ2 Ｏ2 及び２９部のＨＣＯＯＨ）により室温にて２
時間酸化する。誘導体化されておらず、エステル化され
ておりそして酸化された断片のＦＡＢ−ＭＳはそれぞれ
アミノ酸１−１６，１９−４１，５７−７０、及び７２
−７７を含んで成るＭＲＰ−８断片の明白な同定を可能
にする。
【０２３８】例２２．組換ＭＲＰ−１４の単離及び精製 ２２．１．ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー ｐＭＲＰ−１４−ｔｒｐを含有するＥ．コリからの例１
３．３からの粗細胞溶解物９０mlを透析し、そして例２
０．１に記載されている様にしてＤＥＡＥトリスアクリ
ルＭ（ＬＫＢ）イオン交換カラム（５×１０cm）上で精
製する。ＭＲＰ−１４は、２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，
０．０１％ＤＴＴ（ｐＨ８．５）（透析緩衝液）中０．
１２〜０．１５Ｍ ＮａＣｌの濃度において溶出する。
例１５及び例１９のＭＲＰ−１４を含有する粗細胞溶解
物のサンプルを同様にして処理する。
【０２３９】２２．２．スルホプロピルイオン交換クロ
マトグラフィー 例２２．１からの画分を含む組換ＭＲＰ−１４のプール
（６８ml）を１０％酢酸によりｐＨ５．５に酸性化し、
そして５０mM ＮａＯＡｃ／０．０１％ＤＴＴ（ｐＨ
５．５）（出発緩衝液）により平衡化されたＳＰトリス
アクリルＭ（ＬＫＢ）イオン交換カラム（２．５×１０
cm）にポンプ輸送する。ＵＶ２５４nmの吸収がベースラ
インレベルに達するまでカラムを出発緩衝液により洗浄
する。カラムに結合した蛋白質を、出発緩衝液中０．０
Ｍ〜０．５Ｍ ＮａＣｌの直線グラジエント、次に出発
緩衝液／０．５Ｍ ＮａＣｌ（８０ml）及び出発緩衝液
／１．０Ｍ ＮａＣｌ（２００ml）を用いて１．７ml／
分の流速において溶出する。個々の１７mlの画分を集
め、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。プールさ
れた画分からの組換ＭＲＰ−１４は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
によればこの段階で９０％より高純度であると判断され
る。
【０２４０】２２．３．逆相ＨＰＬＣ 例２２．２の組換ＭＲＰ−１４を、２１８ＴＰ−Ｂ５−
５μ（ザ・セパレーションズ・グループ）を充填したＨ
ＰＬＣカラム（０．４×１２cm）上でさらに精製する。
例１．１の装置及び条件を使用する。すなわち、水中
０．１％ＴＦＡ６５％から４５％とアセトニトリル中
０．０７％ＴＦＡ ３５％から５５％の３０分間の直線
グラジエントにおいて、ＭＲＰ−１４は１３．８分間後
に溶出する。二量体のジスルフィド結合ＭＲＰ−１４は
１６．２分間の後に溶出する。この二量体は０．２％Ｄ
ＴＴで室温にて１５分間処理することによりモノマーＭ
ＲＰ−１４に転換され得る。
【０２４１】２２．４．アミノ酸配列分析 例２２．３の精製されたＭＲＰ−１４を例２１．１に記
載した様にしてＮ−末端アミノ酸分析にかける。次のＮ
−末端アミノ酸配列が見出される。 Thr-X2-Lys-Met-Ser-Gln-Leu-Glu-X9-X (10)-Ile-Glu-T
hr-Ile-Ile-Asn-Thr-Phe-His-X (20)-Tyr-X22-Val-Lys-
Leu-Gly-X27-Pro-Asp-X (30)-Lue-Asn- Ｘ2 ，Ｘ9 ，Ｘ10，Ｘ20，Ｘ22，Ｘ27及びＸ30は未決定
アミノ酸を示す。ＭＲＰ−１４のＮ−末端に予想される
アミノ酸メチオニンはＭＲＰ−１４−ｔｒｐを有する
Ｅ．コリ宿主により明らかに開裂されている。
【０２４２】２２．５．マススペクトル 例２１．４に記載したようにしてＦＡＢ−ＭＳを行う。 Ｍ（計算値、第一アミノ酸Thr ）：１３′１１０．９４ Ｍ（測定値）：１３′１１２．８（３回の別個の分析の
貯積値） トリプシン、キモトリプシン及びＶ８消化物のＦＡＢ−
ＭＳは、アミノ酸１０−１９，２３−５２，５８−７
７、及び７９−９３を含んで成るＭＲＰ−１４の明白な
同定を可能にする。
【０２４３】例２３．組換ＭＲＰ−１４ｄの単離及び同
定 ２３．１．ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー ｐＭＲＰ−１４−ｔｒｐを含有するＥ．コリからの例１
３．３の粗細胞溶解物３２０mlを、例２０．１において
記載したように、透析し、そしてＤＥＡＥトリスアクリ
ルＭイオン交換カラム（２．６×１０cm）に負荷する。
カラムを透析緩衝液８０mlで洗浄し、次に透析緩衝液中
０．０Ｍ〜０．２Ｍ ＮａＣｌの直線グラジエントを用
いて溶出する。ＭＲＰ−１４ｄは０．０８〜０．１９Ｍ
ＮａＣｌの間で溶出する。
【０２４４】２３．２．スルホプロピルイオン交換クロ
マトグラフィー 例２３．１からの組換ＭＲＰ−１４ｄを含有する一緒に
した画分をｐＨ５．５に酸性化し、そして例２２．２に
記載した様にしてＳＰトリスアクリルＭイオン交換カラ
ムに付加する。前記の出発緩衝液中０．０Ｍ〜０．５Ｍ
の直線グラジエント、次に０．５Ｍ及び１．０Ｍ Ｎａ
ＣｌによりＭＲＰ−１４ｄを溶出し、そしてＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによれば９５％より高純度であると判断される。
【０２４５】２３．３．アミノ酸配列分析 例２３．２の精製されたＭＲＰ−１４ｄを例２１．１に
記載したようにしてＮ−末端アミノ酸配列分析にかけ
る。次のＮ−末端アミノ酸配列が得られる。 Ser-Gln-Leu-Glu-Arg (5)-Asn-Ile-Glu-Thr-Ile (10)-I
le-Asn-Thr-Phe-His (15)-Gln-Tyr-Ser-Val-Lys (20)-L
eu-Gly-His-Pro-Asp (25)-Thr-Leu-Asn-Gln-Gly(30)-Gl
u-Phe-Lys-Glu-Leu (35)-Val- ＭＲＰ−１４ｄのＮ−末端に予想されるアミノ酸メチオ
ニンが欠けている。
【０２４６】例２４．ＭＲＰ−８をコードするヒトゲノ
ムＤＮＡ ２４．１．ヒト胎盤ゲノムＤＮＡの単離 ヒト胎盤の組織細片を液体窒素中で凍結し、そして乳鉢
中で粉砕することにより細切する。この微細組織粉末の
２mlずつの幾つかのアリコートを３０mlの０．１Ｍ Ｅ
ＤＴＡ，０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），
１％サルコシル、０．３Ｍ β−メルカプトエタノール
及び１００μｇ／mlのプロテイナーゼＫ中で、ロータリ
ーディスク上で穏和に溶解せしめることによりＤＮＡを
単離する。塊の形成を防止するため、溶解緩衝液に加え
る前に粉末を微細シフターに通す。２８ｇのＣｓＣｌ及
び１０mgの臭化エチジウムを加え、そしてＶＴ５０ベッ
クマンローター中で４９０００rpm にて３６時間の平衡
遠心によりＤＮＡをバンドにする。このバンドを分離
し、そしてイソアミルアルコールにより臭化エチジウム
を３回抽出する。ＤＮＡを１０００容量の１０mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び０．５mM ＥＤＴＡに
対して４℃にて２日間にわたり十分に透析する。
【０２４７】２４．２．制限消化 １０〜１５μｇのヒト胎盤ＤＮＡ（例２４．１）を、制
限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄIII ，Ｅｃ
ｏＲＩ又はＰｓｔＩ（ベーリンガー）により、製造者の
処方に従って３７℃にて２時間完全消化する。制限消化
物を、５０mMＴｒｉｓ−アセテート（ｐＨ８．０）及び
１mM ＥＤＴＡ中０．６％アガロースゲル上の別々のス
ロットに負荷し（スロット当り１０μｇ）、そしてこの
緩衝液中で４℃，１００Ｖにて６時間泳動せしめる。電
気泳動の後、ゲルを臭化エチジウム（５μｇ／ml水）に
より１０分間染色し、そしてＵＶ２６０nmトランスイル
ミネーターを用いて写真にとる。
【０２４８】２４．３．サザンブロット 例２４．２の染色されたゲルを２６０nmのＵＶ照射に５
分間暴露して高分子量ＤＮＡ分子の効率的な移行を可能
にする。次に、ゲルを、変性のために０．４ＮＮａＯＨ
及び０．６Ｍ ＮａＣｌ中で３０分間インキュベート
し、そして中和のために０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）及び１．５Ｍ ＮａＣｌ中で３０分間イ
ンキュベートする。ゲルをガラス板上に置いた後３MMワ
ットマン紙にパックしそして２０×ＳＳＣ緩衝液（３Ｍ
ＮａＣｌ及び０．３Ｍ珪酸ナトリウム）に浸漬する。
２×ＳＳＣによりあらかじめ湿した“ＧｅｎｅＳｃｒｅ
ｅｎｐｌｕｓ”膜（ニューイングランドニュクレア）及
び３MMワットマン紙の５cmパイルをゲル上に置き、室温
にて１８時間にわたり２０×ＳＳＣへの核酸の流動移行
を許容する。
【０２４９】２４．４．ＭＲＰ−８ ｃＤＮＡプローブ
とのハイブリダイゼーション 全ヒト胎盤ＤＮＡのＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ，Ｈｉｎｄ
III 及びＰｓｔＩ制限消化物を、ヒトＭＲＰ−８ ｃＤ
ＮＡ（例８．３のクローン３）に相同な及び部分的に関
連する配列を含有する断片について試験する。“Ｇｅｎ
ｅＳｃｒｅｅｎｐｌｕｓ”上の胎盤ＤＮＡ断片を低スト
リンジェンシー及び高ストリンジェンシーにおいてＭＲ
Ｐ−８ ｃＤＮＡの32Ｐ標識化プローブ（１．２×１０
7 cpm／μｇ）とハイブリダイズせしめる。このプロー
ブはクローン３（例８．３）から、３６９bpの断片を開
裂せしめるＰｖｕII／ＰｓｔＩ消化、及び例８．５に記
載したニックトランスレーションにより調製される。
【０２５０】ＤＮＡ断片を伴う膜を６５℃にて６×ＳＳ
Ｃ緩衝液、５×デンハート液、０．１％ＳＤＳ及び１０
０μｇ／mlのウシ胸腺音波処理キャリヤーＤＮＡ中で１
２時間、５〜１０×１０6 cpm／mlのＭＲＰ−８ ｃＤ
ＮＡプローブとハイブリダイズせしめる。膜を６５℃に
て、０．１％ＳＤＳを含有する６×ＳＳＣ，４×ＳＳ
Ｃ，２×ＳＳＣ，１×ＳＳＣ及び０．１×ＳＳＣ中で次
々と洗浄し、乾燥し、そしてオートラジオグラフィーに
暴露する。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーショ
ンを同様にして行うが、しかし６５℃にて０．１％ＳＤ
Ｓを含有する６×ＳＳＣ中でのみ洗浄を行う。
【０２５１】高ストリンジェンシー及び低ストリンジェ
ンシーにおいて強くハイブリダイズするＤＮＡ断片のみ
が観察される。ＢａｍＨＩ消化はハイブリダイズする１
８kb断片をもたらし、ＨｉｎｄIII は２２kb断片を、Ｅ
ｃｏＲＩは２１kb断片を、そしてＰｓｔＩは５kb断片を
もたらす。この結果は、ＭＲＰ−８遺伝子がヒトゲノム
中に単一コピーとして存在することを強く示唆する。ゲ
ノムＤＮＡが本当に完全消化されたか否かをチェックす
るため、対照サザンブロットをヒト組織プラスミノーゲ
ン活性化因子ｃＤＮＡプローブ（Ｓ．Ｆｒｉｅｚｎｅｒ
−Ｄｅｇｅｎ，Ｂ．Ｒａｊｐｕｔ及びＥ．Ｒｅｉｃｈ，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８６，２６１，６９７
２）とハイブリダイズせしめる。ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲ
Ｉ，ＨｉｎｄIII 及びＰｓｔＩ断片との公表されたバン
ドパターンが確認される。
【０２５２】２４．５．ＭＲＰ−８遺伝子を含有するゲ
ノムクローンの単離 ヒトλシャロン４Ａゲノムライブラリーをヒト胎児肝Ｄ
ＮＡから制限エンドヌクレアーゼＨａｅIII 及びＡｌｕ
Ｉにより限定された消化により造成する（Ｒ．Ｍ．Ｌａ
ｗｎ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｒ．Ｃ．Ｐａｒｋｅ
ｒ，Ｇ．Ｂｌａｋｅ及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｅｌ
ｌ，１９７８，１５，１１５７−１１７４）。このライ
ブラリーを例２４．４に記載したＭＲＰ−８ ｃＤＮＡ
プローブによりスクリーニングする。６００，０００個
の独立したファージλプラークをナイロン膜（Ｐａｌｌ
−Ｂｉｏｄｙｎｅ）に移行せしめ、そして標準的方法
（Ｍａｎｉａｔｉｓ、ハンドブック）に従って膜当たり
８×１０6 cpm32 ＤＮＡと二重にハイブリダイズせしめ
る。
【０２５３】マスタープレートは４℃にて数ヶ月間維持
される。６個の陽性プラークを拾い上げ、精製し、そし
てλＤＮＡを単離してさらに分析する。ＤＮＡのサザン
ブロット分析は、６個すべての組換体ファージがファー
ジヒトＤＮＡ挿入部上に完全な遺伝子を含有することを
示した。完全なＭＲＰ−８コード領域を含有する５kbの
長さのＨｐａII ＤＮＡ断片をファージλクローン３か
らＣｌａＩにより線状化された野性型ｐＢＲ３２２にサ
ブクローニングしプラスミドｐＢＲＭＲＰ−８／３Ａ−
ＨｐａIIを生じさせる。
【０２５４】例２５．プラスミドｐＢＲＭＲＰ−８／３
Ａ−ＨｐａIIの配列分析 配列決定方法を第４図に示し、そして配列決定された領
域をＤＮＡ配列決定方向を示す線と黒丸で示す。ＤＮＡ
配列決定は、製造者（アメルシャム）の処方に従ってバ
クテリオファージＭ１３単鎖鋳型上で行う。ＭＲＰ−８
遺伝子の完全なＤＮＡ配列を両鎖上で読み取る。
【０２５５】ＭＲＰ−８遺伝子は２個のイントロン（イ
ントロン１及び２）並びに３個のエクソン（エクソン１
〜３）を含有する。イントロン１はＡＴＧ開始コドンか
ら２３ヌクレオチド上流の５′非翻訳領域を中断し、他
方１５０bpの長さのイントロン２はコード領域をアミノ
酸位置４７において中断する。非コードエクソン１は３
３bpの長さを有する。エクソン２は１６４bpの長さを有
し、アミノ酸１〜４７のＭＲＰ−８蛋白質をコードし、
他方エクソン３は２１１bpの長さを有し、そしてアミノ
酸４８〜９３（Ｃ−末端）をコードする。５６bpの長さ
のｍＲＮＡリーダー配列はＣＡＰ部位の３３bp下流で４
８４bpの長さのイントロン１により中断されている。ポ
リ（Ａ）付加部位までのｍＲＮＡトレーラーはクロヌク
レオチドの長さを有する。ポリ（Ａ）付加部位は全長Ｍ
ＲＰ−８ ｃＤＮＡ（例１０）の３′末端ＤＮＡ配列か
ら推定される。
【０２５６】ＭＲＰ−８をコードする完全ＤＮＡ配列及
びフランキングＤＮＡ制御領域は式（VIII）に示され
る。制御ＤＮＡ配列及びイントロン−エクソン連結部を
式（VIII）に要約する。遺伝子の５′末端において、主
要ＭＲＰ−８ ｍＲＮＡ ＣＡＰ部位の２９bp上流に
５′−TATAAAA −３′プロモーター要素が見出される。
３′末端において、アンバーコドンの５３bp下流にポリ
（Ａ）付加シグナル５′−AATAAA−３′が見出される。
確立されたＧＴ／ＡＧ規則（Ｒ．Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈ
等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１
９７８，７５，４８５３−４８５７）に一致する保存さ
れたスプライシング部位のほかに、イントロンはポリピ
リミジンストレッチ及びラリアト（ｌａｒｉａｔ）構造
形成のための共通ＤＮＡ配列を含有する。
【０２５７】例２６．ＭＲＰ−１４をコードするヒトゲ
ノムＤＮＡ ２６．１．ヒト胎盤ＤＮＡとＭＲＰ−１４ｃＤＮＡプロ
ーブとのハイブリダイゼーション 例２４．２の全ヒト胎盤ＤＮＡのＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲ
Ｉ，ＨｉｎｄIII 及びＰｓｔＩ制限消化物を、ヒトＭＲ
Ｐ−１４ｃＤＮＡ（例９．３のクローンｐＭＲＰ−１４
−１０）と相同であり且つ部分的に関連する配列を含有
する断片について試験する。“ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ”
上の胎盤ＤＮＡを低ストリンジェンシー及び高ストリン
ジェンシーにおいてＭＲＰ−１４ｃＤＮＡの32Ｐ標識化
プローブ（１．２×１０7 cpm／μｇ）とハイブリダイ
ズせしめる。このプローブはクローンｐＭＲＰ−１４−
１０（例９．３）のプラスミドから、３６４bpの断片を
開裂せしめるＢｒａIII ／ＡｖａＩ消化、及び例９．３
に記載されているニックトランスレーションにより調製
する。
【０２５８】ＤＮＡ断片を有する膜を６５℃において６
×ＳＳＣ緩衝液、５×デンハート溶液、０．１％ＳＤＳ
及び１００μｇ／mlの音波処理されたウシ胸腺キャリヤ
ーＤＮＡ中で１２時間にわたり５〜１０×１０6 cpm／
mlのＭＲＰ−１４ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズせ
しめる。膜を６５℃にて０．１％ＳＤＳを含有する６×
ＳＳＣ，４×ＳＳＣ，２×ＳＳＣ，１×ＳＳＣ、及び
０．２×ＳＳＣ中で次々と洗浄し、乾燥し、そしてオー
トラジオグラフィーのために暴露する。低ストリンジェ
ンシーハイブリダイジェーションを同様にして行う。但
し、６５℃にて０．１％ＳＤＳを含有する４×ＳＳＣの
みで洗浄する。
【０２５９】高ストリンジェンシー及び低ストリンジェ
ンシーにおいて、強くハイブリダイズするＤＮＡ断片の
みが観察される。ＢａｍＨＩ消化はハイブリダイズする
１１．６kb断片をもたらし、ＰｓｔＩ消化は６kb断片を
もたらす。ＨｉｎｄIII 消化及びＥｃｏＲＩ消化はいず
れも２種類の断片、すなわちＨｉｎｄIII は５．７kb及
び３．６kbの断片を、そしてＥｃｏＲＩは５．４kb及び
２．７kbの断片をもたらす。この結果は、ＭＲＰ−１４
遺伝子がヒトゲノム中に単一コピーとして存在すること
を強く示唆している。
【０２６０】２６．２．ＭＲＰ−１４遺伝子を含有する
ゲノムクローンの単離 ヒトλシャロン４Ａゲノムライブラリーをヒト胎児肝Ｄ
ＮＡから造成し、そして例２４．５に記載したようにし
てＭＲＰ−１４ｃＤＮＡプローブによりスクリーニング
する。６００，０００個の独立したファージλプラーク
を２０枚のナイロン膜に移行せしめ、そして標準的方法
に従ってハイブリダイズせしめる。５個の陽性プラーク
を拾い上げ、精製し、そしてλＤＮＡを単離してさらに
分析する。ＤＮＡのサザンブロット分析は４種類すべて
の組換ファージがファージヒトＤＮＡ挿入部上に完全な
遺伝子を含有することを示した。完全なＭＲＰ−１４コ
ード領域を含有する６kb長のＰｓｔＩ ＤＮＡ断片をフ
ァージλシャロン２からＰｓｔＩにより線状化された野
性型ｐＵＣ９ベクターに挿入し、プラスミドｐＵＣＭＲ
Ｐ−１４／Ｐｓｔ６を生じさせる。
【０２６１】例２７．プラスミドｐＵＣＭＲＰ−１４／
Ｐｓｔ６の配列分析 配列決定方法を第５図に示し、そして配列決定された領
域をＤＮＡ配列決定方向を示す線及び黒円で示す。ＤＮ
Ａ配列決定はバクテリオファージＭ１３単鎖鋳型上での
及び二本鎖スーパーコイルＤＮＡ鋳型上でのジデオキシ
チェインターミネーション法によりＭａｎｉａｔｉｓの
ハンドブックに従って行われる。ＭＲＰ−１４遺伝子の
コード領域は２個のイントロン、すなわちイントロン１
及びイントロン２により中断されている。イントロン１
は３８７bpの長さを有し、そしてＡＴＧ開始コドンから
１５bp上流の５′非翻訳領域を中断している。イントロ
ン２は約２２２７bpの長さを有し、そしてアミノ酸位置
５０においてコード領域を中断する。非コードエクソン
１は２８bpの長さを有する。エクソン２は１６５bpの長
さを有し、そしてＭＲＰ−１４蛋白質のアミノ酸１〜５
０をコードし、他方エクソン３は３８９bpの長さを有
し、そしてアミノ酸５１−１１５（ＣＯＯＨ末端）をコ
ードする。
【０２６２】ＭＲＰ−１４をコードする遺伝子の配列及
びフランキングＤＮＡ制御領域を式（Ｘ）に示す。位置
１７３７及び２０９８の間で配列は知られていない。制
御ＤＮＡ配列、及びイントロン−エクソン連結部は式
（Ｘ）中に示されている。遺伝子の５′末端において、
５′−TATAAAT −３′プロモーター要素がＭＲＰ−１４
ｍＲＮＡ ＣＡＰ部位から２９bp上流に見出される。
３′末端に、ポリ（Ａ）付加シグナル５′−AAATAAA −
３′がオクラ（ｏｃｈｒｅ）コドンの１６４bp下流に見
出される。確立されたＧＴ／ＡＣ規則（Ｒ．Ｂｒｅａｔ
ｈｎａｃｈ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，１９７８，７５，４８５３−４８５７）と一致
する保存されたスプライシング部位のほかに、イントロ
ンはポリピリミジンストレッチ及びラリアト（ｌａｒｉ
ａｔ）構造の形成のための共通ＤＮＡ配列を含有する。
【０２６３】例２８．哺乳類細胞中でのＭＲＰ−８の発
現のためのベクターの造成 発現ベクターｐＣＭＶｅ／ＭＲＰ−８を標準的ＤＮＡ操
作によって造成し、そして第６図に示す。このプラスミ
ドはＥ．コリ中での増幅のためのｐＢＲ３２２の複製開
始点及びアンピシリン耐性遺伝子を有する。このプラス
ミドは、例２４．５のプラスミドｐＢＲＭＲＰ−８／３
Ａ−ＨｐａIIからの４３２０bpのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲ
Ｉ ＤＮＡ断片を含有し、この断片はＭＲＰ−８コード
領域、並びに５′及び３′ＤＮＡ制御要素を含有し、該
プラスミドはさらに、ＤＮＡ断片からのＡｃｃＩ部位
（ｐＢＲ３２２中の２２４６位）と前記４３２０bpの長
さのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩからのＢａｍＨＩとの間に
位置する３００bpの長さのＤＮＡ断片上に非常に強力な
構成的エンハンサーの形で真核性転写制御配列を含有す
る。
【０２６４】主要ＩＥＩ遺伝子プロモーター領域（Ｍ．
Ｂｕｓｈａｒｔ，Ｆ．Ｗｅｂｅｒ，Ｇ．Ｊａｈｎ，Ｋ．
Ｄｏｒｓｃｈ−Ｈａｅｓｌｅｒ，Ｂ．Ｆｌｅｃｈｅｎｓ
ｔｅｉｎ及びＷ．Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ，Ｃｅｌｌ，１９
８５，４１，５２１−５３０）からのこのヒト−サイト
メガロウイルス（ＨＣＭＶ）は、標準的ＤＮＡ操作（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓのハンドブック）によりプラスミドｐＢ
Ｒ３２２ ＡｃｃＩから導びかれる。プラスミドｐＢＲ
３２２ ＡｃｃＩは、ｐＢＲ３２２（Ｊ．Ｇ．Ｓｕｔｃ
ｌｉｆｆｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，１９７８，７５，３７３７−３７４１）からの２
１４４bpの長さのＡｃｃＩ／ＨｉｎｄIII ＤＮＡ断片を
ＸｂａＩリンカー（バイオラブス社）を用いて、ｐＳＶ
４０−ＨＣＭＶ（組換体Ｃ４）をＮｃｏＩにより切断す
ることにより単離される３００bpのＨＣＭＶエンハンサ
ー含有ＤＮＡ断片に連結することにより作られる。３０
０bpのＮｃｏＩエンハンサーＤＮＡ断片は、ＨＣＭＶ主
要ＩＥ１遺伝子プロモーター中のヌクレオチド−２６２
と−５２４の間の開始部位の上流の領域をカバーする。
【０２６５】例２９．哺乳類細胞中でのＭＲＰ−１４の
発現のためのベクターの造成 発現ベクターｐＣＭＶｅ／ＭＲＰ−１４は標準的ＤＮＡ
操作により造成され、そして第７図に示される。このプ
ラスミドは次の点を除き例２８のプラスミドｐＣＭＶｅ
／ＭＲＰ−８と同一である。すなわち、このプラスミド
は例２６．２のプラスミドｐＵＣＭＲＰ−１４／Ｐｓｔ
６に由来する６０００bpのＰｓｔＩ ＤＮＡ断片を含有
し、このものはＭＲＰ−１４コード領域並びに５′及び
３′ＤＮＡ制御要素を担持する。
【０２６６】例３０．哺乳類細胞中へのプラスミドｐＣ
ＭＶｅ／ＭＲＰ−８及びｐＣＭＶｅ／ＭＲＰ−１４の遺
伝子移行及び一時的発現 ＭＲＰ−８遺伝子及びＭＲＰ−１４遺伝子を、ＤＥＡＥ
−デキストラン技法の変法（Ｊ．Ｈ．Ｃｕｔｃｈａｎ及
びＪ．Ｐａｇａｎｏ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉ
ｎｓｔ．１９６８，４１，３５１−３５７；Ｊ．Ｂａｎ
ｅｒｊｉ，Ｌ．Ｏｌｓｏｎ及びＷ．Ｓｃｈａｆｆｎｅ
ｒ，Ｃｅｌｌ，１９８３，３３，７２９−７４０）によ
り哺乳類細胞にトランスフェクトする。
【０２６７】３０．１．ｐＣＭＶｅ／ＭＲＰ−８の発現 例２８のプラスミドＤＮＡをＣｓＣｌ／臭化エチジウム
密度勾配上で２回次々と精製し、そして１０mM Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ及び１mM ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）中に再懸
濁し、次に１０mM Ｈｅｐｅｓ（ギブコ）を含有するＤ
ＥＭＥ（ギブコ）中ＤＥＡＥ−デキストラン（０．５mg
／ml、ファルマシア、分子量５×１０5）と混合して１
μｇ／mlのプラスミドＤＮＡの最高濃度にする。この溶
液を室温にて１０分間インキュベートする。遺伝子を有
しないプラスミドを含有しない模擬対照を同様に処理す
る。
【０２６８】ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６
５１，ＳＶ−４０ウイルスで形質転換されたアフリカ緑
ザルの腎細胞、Ｙ．Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ，１９８
１，２３，１７５−１８２），Ｂｏｗｅｓ細胞（ＲＰＭ
Ｉ ７２７２，ヒト悪性黒色腫、Ｄ．Ｃ．Ｒｉｊｋｅｎ
及びＤ．Ｃｏｌｌｅｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１
９８１，２５６，７０３５−７０４１）、及びＬ−１３
２細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ５、ヒト胎児肺繊維芽細胞、
Ｃ．Ｄａｖｉｓ等、Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．１９６０，１
９，３８６）を、９６ウエルミクロタイタープレート又
は１０cmペトリ皿（ファルコン）中で、５〜１０％のＦ
ＣＳ（ギブコ）を含有するＭＥＭ中にプレートする。２
４時間後に、細胞密度が６０〜８０％コンフルエンシー
に達する。細胞単層をＤＥＭＥにより２回すすぐ。プラ
スミドＤＮＡ／ＤＥＡＥ−デキストラン混合物を加える
（ミクロタイタープレートのウエル当り５０μｌ，１０
cmペトリ皿当り１．２ml）。
【０２６９】細胞を３７℃／５％ＣＯ2 にて３０分間イ
ンキュベートし、次に細胞のタイプに依存して３７℃／
７．５％ＣＯ2 にて９０〜１２０分間インキュベートす
る。細胞をＤＥＭＥ中１５ｖ／ｖ％ＤＭＳＯ（メルク）
と共にさらに９０秒間インキュベートし、ＤＥＭＥで２
回すすぎ、次に５ｖ／ｖ％のＦＣＳ及び５mM酪酸ナトリ
ウム（シグマ）を含有する１００μｌ（ミクロタイター
ウエル当り）又は１０．０ml（ペトリ皿当り）ＭＥＭ中
で３７℃／５％ＣＯ2 にて１２時間インキュベートす
る。培地を５ｖ／ｖ％のＦＣＳを含有するＭＥＭに変え
る。４８〜７２時間後、トランスフェクトされた細胞を
ＭＲＰ−８の発現についてチェックする。
【０２７０】３０．２．ｐＣＭＶｅ／ＭＲＰ−１４の発
現 例２９のプラスミドＤＮＡを精製し、ＤＥＡＥ−デキス
トランと混合し、そして上記（例３０．１）のようにし
てＬ−１３２細胞に加える。Ｌ−１３２細胞を３７℃／
７．５％ＣＯ2 にて３０分間インキュベートし、さらに
上記の様にして処理する。形質転換された細胞を４８〜
７２時間後ＭＲＰ−１４の発現についてチェックする。
【０２７１】例３１．哺乳類細胞中で発現されたＭＲＰ
−８の特徴付け ３１．１．ｐＣＭＶｅ／ＭＲＰ−８により形質転換され
たＬ−１３２細胞からのＲＮＡの単離 ７×１０6 個のＬ−１３２細胞を含有するペレットを、
トランスフェクション（例３０．１）の４８時間後、５
００μｌのＧｕＳＣＮ緩衝液に再懸濁する。このＧｕＳ
ＣＮ溶液を無菌のディスポーサブル１mlピペットチップ
に数回通すことにより細胞をホモジナイズする。溶解し
た細胞をフェノールで処理し、そして標準的方法（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓのハンドブック）に従って核酸を沈澱せし
める。核酸を遠心し、７．５mlの１０mM Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．０）及び１mM ＥＤＴＡ中に再溶解し、
そして７．５ｇのＣｓＣｌ（メルク）に加える。
【０２７２】ＣｓＣｌ溶液を、ＴＳＴ４１（１５ml）超
遠心ポリアロマーチューブ中２mlの５．７Ｍ ＣｓＣｌ
のクッション上に置く。コントロンＴＳＴ４１ローター
中で２９００rpm ，２０℃にて１６時間の後、ＲＮＡ分
子がペレット化される。ＣｓＣｌクッションの上部に残
るＤＮＡを除去する。ＲＮＡペレットを２mlの溶出緩衝
液中に再溶解し、エタノールで沈澱せしめ、１００μｌ
の０．１％ＳＤＳ中に再懸濁し、そしてプライマー発現
実験に使用する。濃度を分光光度計により決定する。１
６6 個の細胞当り３０〜５０μｇのＤＮＡである。
【０２７３】３１．２．放射性プライマーの調製 式（VII ）のＭＲＰ−８ｃＤＮＡの１３１位〜１５０位
に対して相補的な５００ngの合成ＤＮＡオリゴマー５′
−GGCTCGACCTCTTTCGGAAC−３′と完全ＭＲＰ−８ｃＤＮ
Ａ配列（例１０）を含有するＭ１３単鎖鋳型１μｇとの
６０分間にわたる６０℃でのアニーリングにより放射性
プライマーを調製する。５ユニットのＫｌｅｎｏｗ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（ベーリンガー）及び６０μCiの４種
類の放射性標識されたα−32Ｐ−ｄＮＴＰを含有する溶
液５０μｌ中で室温にて３０分間インキュベートするこ
とによりオリゴマーを延長する。５μｌの追跡（ｃｈａ
ｓｅ）混合物（０．２mM ｄＮＴＰ）により１５分間反
応を追跡し、そして６５℃に５分間置くことにより反応
を停止せしめる。新しく合成されたＤＮＡをＰｖｕIIに
より開裂せしめ、そして反応混合物を変性用８Ｍ尿素８
％ＰＡＧＥにより分離する。延長生成物、すなわち６８
ヌクレオチドの長さのＤＮＡ断片を切り出し、そしてポ
リアクリルアミドゲルから溶出する。合成されたプライ
マーの比活性は０．５×１０7 cpm／μｇである。
【０２７４】３１．３．ＭＲＰ−８ｍＲＮＡの５′末端
のマッピング トランスフェクトされたヒトＬ−１３２細胞（例３１．
１）からの１０μｇの全ＲＮＡを例３１．２の１×１０
6 cpm の合成プライマーと共に、エタノールにより同時
沈澱せしめる。核酸を、２７μｌの無菌水及び３μｌの
２．５Ｍ ＫＣｌ中に、３０分間振とうすることにより
再懸濁する。ＲＮＡ及びプライマーを９９℃にて３分間
変性せしめ、そして６０℃にて１時間アニールせしめ
る。３倍濃度の逆転写酵素緩衝液（６０mM Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ，ｐＨ８．８，３０mM ＭｇＣｌ2 ，３０mM Ｄ
ＴＴ）３０μｌを加え、そして反応混合物を９０μｌ中
３mMｄＮＴＰ混合物に調整する。１０ユニットの逆転写
酵素（ＢＲＬ）を加え、そして反応混合物を３７℃にて
３０分間インキュベートし、次に４μｌの０．５ＭＥＤ
ＴＡ（ｐＨ７．５）により停止せしめる。ＲＮＡを５０
mM ＮａＯＨによるアルカリ処理により６５℃にて１時
間加水分解する。
【０２７５】核酸を中和し、次にキャリヤーｔＲＮＡの
存在下でエタノールにより沈澱せしめる。核酸をホルム
アミドサンプル緩衝液（８０％ホルムアミド、１０mM
ＮａＯＨ，１mM ＥＤＴＡ，０．１％キシレンシアノー
ル、０．１％ブロモフェノールブルー）中に再懸濁し、
そして延長されたプライマーをＴＢＥ緩衝液中ＤＮＡ配
列決定８Ｍ尿素８％ＰＡＧＥ上で可視化する。９０％の
延長されたＲＮＡ分子は５′−TATAAAA −３′制御因子
の３０bp下流に位置するデオキシアデノシンと共に同時
泳動する。ヒト血液単核細胞から単離されたポリ（Ａ）
ＲＮＡを上記と同じプライマーを用いてアッセイする場
合同じ結果が得られる。模擬トランスフェクトされた細
胞ＲＮＡをｐＣＭＶｅ／ＭＲＰ−８で形質転換された細
胞と同一の条件下でアッセイする場合、この様な延長さ
れた生成物は前者からは検出されない。
【０２７６】３１．４．ＭＲＰ−８のその場での免疫組
織学的検出 例３０．１のｐＣＭＶｅ／ＭＲＰ−８により形質転換さ
れた細胞を確立された方法（Ｊ．Ｂｒｕｅｇｇｅｎ等、
Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅ
ｒ．１９８３，１５，２００−２０５）を用いてグルタ
ルアルデヒドにより固定する。細胞単層をＰＢＳで２回
すすぎ、そしてＰＢＳ中０．０５ｖ／ｖ％のグルタルア
ルデヒドと共に室温にて５分間インキュベートし、次に
ＰＢＳにより２回すすぐ。
【０２７７】固定された細胞を、イムノパーオキシダー
ゼ法（Ｊ．Ｂｒｕｅｇｇｅｎ等、１９８３、前揚；Ｓｕ
ｔｅｒ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｔｈｅｒ．１９８３，１６，５３−３８）の変法を用
いて次の様にしてＭＲＰ−８の発現について試験する。
１０ｖ／ｖ％の正常豚（ギブコ）により非特異的結合を
ブロックした後、細胞を単一特異的ラビット抗−ＭＲＰ
−８血清（例３４．１）と共に３７℃にて３０分間イン
キュベートする。細胞に結合した特異的抗体を西洋ワサ
ビパーオキシダーゼ（ＤＡＫＯ）に接合されたブタ抗−
ラビットＩｇＧと共に３７℃にて３０分間インキュベー
トする。
【０２７８】結合したパーオキシダーゼを、０．１Ｍ酢
酸緩衝液（ｐＨ５．２）中０．１０ｖ／ｖ％のＨ2 Ｏ2
（メルク）及び０．２６ｗ／ｖ％の３−アミノ−９−エ
チルカルバゾール（ＡＥＣ、シグマ）と室温にて７分間
反応せしめる。５００個の細胞について顕微鏡観察によ
り評価を行う。ＭＲＰ−８陽性細胞は赤く着色した沈澱
を示す。第１表は試験された細胞中の発現の％を示す。
ＭＲＰ−８はヒト胎児肺細胞Ｌ−１３２中で高い％で発
現する。ＳＶ−４０で形質転換されたサル腎細胞ＣＯＳ
−７及びヒト悪性黒色腫細胞（Ｂｏｗｅｓ）中で発現は
一層低い。模擬処理対照及び陰性対照は陰性である。
【０２７９】
【表２】
【０２８０】３１．５．哺乳類細胞中で発現されたＭＲ
Ｐ−８のウエスタンブロット 例３０．１において記載したようにしてＭＲＰ−８によ
りトランスフェクトされた胎児肺細胞Ｌ−１３２を０．
０５ｗ／ｖ％のトリプシン及び０．０２ｗ／ｖ％のＥＤ
ＴＡ（ギブコ）により脱着せしめ、８０×ｇでペレット
化し、そして２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１２０mM Ｎ
ａＣｌ，５mM ＫＣｌ，１．４mM Ｍｇ（ＯＡｃ）2 ，
３．６mM ＣａＣｌ2 ，６．０mM β−メルカプトエタ
ノール及び１mM ＰＭＳＦ（すべての試薬はビオラド
製）を含有する緩衝液中０．５ｖ／ｖ％のＮＰ−４０又
は０．１ｗ／ｖ％のＳＤＳにより氷上で１５分間細胞溶
解する。
【０２８１】細胞溶解物を４８，０００×ｇにて６０分
間遠心し、そして上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５ｗ／ｖ
％；Ｖ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ １９７
０，２２７，６８０−６８５）により処理する。スロッ
ト当り導入される蛋白質の量は５×１０5 個の細胞に相
当する。分離された蛋白質をニトロセルロース上に電気
的に移行せしめる（ミリホＰ；Ｔｏｗｂｉｎ等、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９７９，７
６，４３５０）。テトロセルロースシートに移行した蛋
白質を４５ｖ／ｖ％メタノール及び１０ｖ／ｖ％酢酸中
０．１ｗ／ｖ％のアミドブラック（メルク）により染色
する。
【０２８２】ニトロセルロースの未処理シートを、ラビ
ット抗−ＭＲＰ−８血清（例３４．１）により４℃にて
１４時間処理し、次に西洋ワサビパーオキシダーゼに接
合したブタ抗ラビットＩｇＧ（ＤＡＫＯ）により処理す
る。結合したパーオキシダーゼをＰＢＳ中に稀釈された
０．１％Ｈ2 Ｏ2 及び０．３ｗ／ｖ％クロロナフトール
（メルク）により７分間可視化する。ラビット抗−ＭＲ
Ｐ−８血清は、８kg／mol の分子量を示しそしてＥ．コ
リ又は酵母（例２１）中で発現された組換ＭＲＰ−８蛋
白質と同じ特徴を示す細胞溶解物中の蛋白質バンドを認
識する。
【０２８３】例３２．哺乳類細胞中で発現されたＭＲＰ
−１４の特徴付け ３２．１．ｐＣＭＶｅ／ＭＲＰ−１４でトランスフェク
トされたＬ−１３２細胞中その場でのＭＲＰ−１４の免
疫組織学的検出 例３０．２の形質転換されたＬ−１３２細胞を、例３
１．４の方法を用いて、グルタルアルデヒドで同定しそ
してＭＲＰ−１４の発現について試験する。細胞を例３
５．１の単一特異的ラビット抗−ＭＲＰ−１４血清と共
にインキュベートする。５００個の細胞について顕微鏡
観察により評価を行う。ＭＲＰ−１４陽性細胞は赤に着
色した沈澱を示す。ＭＲＰ−１４は、トランスフェクト
されたヒト胎児肺細胞Ｌ−１３２の７５％において発現
される。模擬処理された対照及び陰性対照血清は陰性で
ある。
【０２８４】３２．２．Ｌ−１３２細胞中で発現された
ＭＲＰ−１４のウエスタンブロット 例３０．２に記載したようにしてｐＣＭＶｅ／ＭＲＰ−
１４によりトランスフェクトされた胎児肺細胞Ｌ−１３
２を例３１．５に記載したようにして細胞溶解し、そし
て細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより処理する。分離
された蛋白質をニトロセルロース上に電気泳動的に移行
せしめ、そしてラビット抗−ＭＲＰ−１４抗体（例３
５．１）で４℃にて１４時間処理し、次に西洋ワサビパ
ーオキシダーゼに接合したブタ抗−ラビットＩｇＧ（Ｄ
ＡＫＯ）により処理する。ラビット抗−ＭＲＰ−１４血
清は、１４kg／mol の分子量を示しそしてＥ．コリ又は
酵母（例２２）中で発現される組換ＭＲＰ−１４蛋白質
と同じ特徴を示す細胞溶解物内の蛋白質バンドを認識す
る。
【０２８５】例３３．ＭＲＰ−８又はＭＲＰ−１４を発
現する安定なヒトセルラインの単離 組換ＭＲＰ−８又はＭＲＰ−１４を生産する永久ヒトセ
ルラインの単離を行うため、Ｇ−４１８に対する耐性を
付与する優性選択マーカーＴｎ５ネオマイシンを含むプ
ラスミドを、ＭＲＰ−８遺伝子を含有するプラスミド又
はＭＲＰ−１４遺伝子を含有するプラスミドと共に、ヒ
ト胎児肺細胞Ｌ−１３２上に、リン酸カルシウム法
（Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａｍ及びＡ．Ｊ．ｖａｎ ｄｅｒ
Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９７３，５２，４５６−４
６７；Ｄ．Ｐｉｃａｒｄ及びＷ．Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９
８３，８０，４１７−４２１）を用いて同時沈澱せしめ
る。
【０２８６】プラスミドｐＳＶ2 ｎｅｏ（Ｐ．Ｓｏｕｔ
ｈｅｒｎ及びＰ．Ｂｅｒｙ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．
Ｇｅｎｅｔ．，１９８２，１，３２７−３４１）と、ｐ
ＣＭＶｅ／ＭＲＰ−８（例２８）又はｐＣＭＶｅ／ＭＲ
Ｐ−１４（例２９）とを１：５の比率で、１０mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ／１mM ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）中で混合
する。０．１Ｍ Ｈｅｐｅｓ（ギブコ）を含有する等容
量の０．５Ｍ ＣａＣｌ2 を添加し、そしてこの混合物
を２２℃にて５分間インキュベートする。その容量の２
×ＨＢＳ（０．０５Ｍ Ｈｅｐｅｓ，０．２８Ｍ Ｎａ
Ｃｌ，０．７５mM Ｎａ2 ＨＰＯ4 及び０．７５mM Ｎ
ａ2 ＨＰＯ4 ）を２回添加して４μｇ／mlのｐＳＶ2 ｎ
ｅｏ及び２０μｇ／mlのｐＣＭＶｅ／ＭＲＰ−８又はｐ
ＣＭＶｅ／ＭＲＰ−１４の最終濃度とし、そしてこの混
合物を３０分間氷上に置く。１０μｌのこの混合物を、
９６ウエルミクロタイタープレート中１００μｌ中に増
殖したサブコンフルエントのＬ−１３２細胞（例３０）
に加える。
【０２８７】細胞を３７℃／５％ＣＯ2 にて１６時間イ
ンキュベートし、１５ｖ／ｖ％ＤＭＳＯにより１０秒間
処理し、５ｖ／ｖ％ ＦＣＳ及び５mM酪酸ナトリウムを
含有するＭＥＭを再フィードし、３７℃／５％ＣＯ2 に
て６時間インキュベートし、ＭＥＭを再フィードし、そ
して３７℃／５％ＣＯ2 にて２４時間インキュベートす
る。選択剤Ｇ−４１８（ギブコ）を１mg／mlの最終濃度
に加える。細胞を５日間培養し、トリプシン処理し、Ｍ
ＥＭ／５％ＦＣＳ中１：５の比率で９６ウエルミクロタ
イタープレートに分け、そして３７℃／５％ＣＯ2 にて
Ｇ−４１８と共にインキュベートする。１０日後、単一
細胞コロニーを単離し、そして標準的方法に従って増殖
せしめて多量細胞培養物にする。例３１及び３２に記載
したようにしてＭＲＰ−８又はＭＲＰ−１４の発現につ
いて細胞を試験し、そして陽性クローンを選択する。
【０２８８】例３４．ＭＲＰ−８に対するポリクローナ
ル抗体 ３４．１．ラビット抗−ＭＲＰ−８血清 サイズ排除クロマトグラフィー（例２０．２）により精
製されたＥ．コリからの組換ＭＲＰ−８（例１２）によ
りラビットを免疫感作することによりラビット抗−ＭＲ
Ｐ−８血清を生じさせる。完全フロインドアジュバント
（ギブコ）中０．５mgの蛋白質を注射し、次に２０日後
不完全フロインドアジュバント中０．５mgの蛋白質を追
加免疫注射する。ラビット血清の力価を、確立された方
法に従って組換ＭＲＰ−８によりコードされたマイクロ
タイタープレート中でエンザイム・リンクド・イムノソ
ルベント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によりモニターす
る。ウエスタンブロット試験によれば、未形質転換Ｅ．
コリの細胞溶解物による消耗吸収（ｅｘｈａｕｓｔｉｖ
ｅ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）の後、抗血清中残留する唯
一の反応性はＭＲＰ−８に対して向けられる。
【０２８９】３４．２．ＭＲＰ−８に特異的なラビット
抗体の免疫アフィニティークロマトグラフィーによる単
離 ４〜５mgの精製された組換ＭＲＰ−８（例２０）を１ml
のアフィーゲル１０に製造者（ビオーラド、リッチモン
ド、カリホルニア）の方法を用いて連結することにより
ＭＲＰ−８−アフィーゲル１０イムノアドゾルベントカ
ラムを調製する。単一特異的ラビット抗−ＭＲＰ−８血
清（例３４）からの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を５０
％飽和の硫酸アンモニウムにより沈澱せしめる。沈澱を
ＰＢＳ中に溶解し、そしてＰＢＳに対して透析する。約
１００mgのＩｇＧを含有する透析された溶液１５mlを１
０〜１２ml／時の流速でイムノアフィニティーカラムに
ポンプを用いて通す。カラムをＰＢＳ／０．４Ｍ塩化ナ
トリウムで洗浄することにより非特異的に結合した物質
を除去する。０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）
を用いて特異的に結合したＩｇＧを溶出せしめる。抗体
を含有する画分をプールし、１Ｍ Ｔｒｉｓを加えて中
和し、そしてＰＢＳに対して透析する。ＭＲＰ−８に対
して特異的なＩｇＧが約４mg得られる。
【０２９０】例３５．ＭＲＰ−１４に対するポリクロー
ナル抗体 ３５．１．ラビット抗−ＭＲＰ−１４血清 Ｅ．コリからの精製された組換ＭＲＰ−１４（例２２）
によりラビットを免疫感作することによりラビット抗−
ＭＲＰ−１４血清を生じさせる。完全フロインドアジュ
バント（ギブコ）中０．５mgの蛋白質を注射し、次に２
０日後に不完全フロインドアジュバント中０．５mgの蛋
白質を追加免疫注射する。ラビット血清の力価を、確立
された方法に従って組換ＭＲＰ−１４でコートされたミ
クロタイタープレート中でエンザイム・リンクド・イム
ノソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によりモニター
する。ウエスタンブロットの試験によれば、未形質転換
Ｅ．コリの細胞溶解物による消耗吸収の後、清血清中に
残る唯一の活性はＭＲＰ−１４に対して向けられる。
【０２９１】３５．２．ＭＲＰ−１４に対して特異的な
ラビット抗体のイムノアフィニティークロマトグラフィ
ーによる単離 例３４．２に記載したのと同様にして、組換ＭＲＰ−１
４−アフィーゲル１０イムノアドゾルベントカラムを調
製し、そして単一特異的ラビット抗−ＭＲＰ−１４血清
からのラビット抗−ＭＲＰ−１４ ＩｇＧの単離に使用
する。ＭＲＰ−１４に対して特異的なＩｇＧ約３．２mg
が得られる。
【０２９２】例３６．ＭＲＰ−８に対するモノクローナ
ル抗体を生産するハイブリドーマ細胞 ３６．１．免疫感作法 ３匹の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスに、完全フロインドアジ
ュバント中０．１mgの組換ＭＲＰ−８（例１２；例２
０．２と同様にして精製したもの）を腹腔内注射し、次
に１４日間隔で２回、不完全フロインドアジュバント中
０．０５mgのＭＲＰ−８を追免疫注射する。６週間後、
生理食塩水中０．０５mgのＭＲＰ−８を注射し、そして
４日後にマウスを殺す。
【０２９３】３６．２．細胞融合及びハイブリドーマの
単離 すべての融合実験を確立された方法（Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅ
ｒ及びＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，１９７
６，２５６，４９５）に従って非水泌性骨髄腫細胞系Ｐ
３×６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ No．ＣＲＬ １
５８０）を用いて行う。１０8 個の脾細胞を、３５ｗ／
ｖ％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００、メル
ク）及び１５％のジメチルスルホキシド（メルク）の存
在下で１０ 7 個の骨髄腫細胞と融合せしめる。融合混合
物を、フィーダー細胞としてマウス腹腔滲出細胞を収容
するミクロタイタープレート（ファルコン）の１２００
個のウエル中の標準ＨＡＴ選択培地（２０％ＦＣＳ、ギ
ブコ）中に分配する。１０〜１４日後、増殖中のハイブ
リドーマの上清をサンドイッチＥＬＩＳＡ（例４０．
２）によりＭＲＰ−８への結合について試験する。試験
した６３３個のハイブリドーマ上清の内４８個がこのア
ッセイにおいて強く陽性であった。適当なハイブリドー
マを、限界稀釈法により少なくとも２回再クローニング
する。
【０２９４】例３７．ＭＲＰ−８に対するモノクローナ
ル抗体の単離及び特徴付け ３７．１．単離及び精製 ８〜１０週令のＢａｌｂ／ｃマウスを０．３mlのプリス
タン（アルドリッチ）により腹腔内（ｉ．ｐ．）前処理
する。２〜３週間後、５〜１０×１０6 のクローン化ハ
イブリドーマ細胞及び０．２mlのプリスタンをｉ．ｐ．
注射する。８〜１０週間後に腹水を集め、８００×ｇで
遠心分離し、そして−８０℃にて貯蔵する。
【０２９５】他の方法として、ハイブリドーマをハイブ
リドーマ培地（ギブコ）を用いて大規模にインビトロ増
殖せしめる。上清を８００×ｇにて遠心し、０．４５μ
ｍナルゲン（Ｎａｌｇｅｎｅ）により濾過し、そして−
８０℃にて貯蔵する。０．９容量の飽和硫酸アンモニウ
ムを０℃にて滴加することにより粗免疫グロブリンを沈
澱せしめ、次に２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５０mM Ｎ
ａＣｌ（ｐＨ７．９）中に溶解する。ビオーラドのアフ
ィゲル・プロテインＡ ＭＡＰＳキットを用いてＩｇＧ
画分を得る。溶出したＩｇＧ画分を硫酸アンモニウムに
より再度沈澱せしめ、そして１０mg／mlの濃度でＰＢＳ
中に溶解し、そして同じ緩衝液に対して透析する。
【０２９６】３７．２．特徴付け 選択されたハイブリドーマ８−５Ｃ２及び８−１０Ｄ７
により生産された抗体をその特異性について、ラビット
抗−ＭＲＰ−８及び抗−ＭＲＰ−１４を用いるサンドイ
ッチ型ＥＬＩＳＡ（例４０及び４２）、ＭＲＰ−８及び
ＭＲＰ−１４についてのウエスタンブロット（例３１．
５及び３２．２）、並びにＭＲＰ−８及びＭＲＰ−１４
についての単一細胞アッセイ（例３１．４及び３２．
１）において試験する。モノクローナル抗体８−５Ｃ２
及び８−１０Ｄ７は、ＥＰ １６２，８１２のＭＩＦ
８kD、及びＥ．コリ（例１２）、酵母（例１９）及びト
ランスフェクトされた胎児肺細胞Ｌ−１３２において発
現された組換ＭＲＰ−８を選択的に認識するが、しかし
天然のもしくは組換ＭＲＰ−１４又は他の蛋白質とは交
叉反応しない。認識されるエピトープはＳＤＳ−安定で
ある。
【０２９７】モノクローナル抗体のサブクラスは標準的
方法（Ｊ．Ｂｒｕｇｇｅｎ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１９８３，１５，２０
０）に従って決定され、そして８−５Ｃ２及び８−１０
Ｄ７の両者ともＩｇＧ1 であることが見出された。例３８ ．ＭＲＰ−１４に対するモノクローナル抗体を生
産するハイブリドーマ細胞 Ｂａｌｂ／ｃマウスを完全フロインドアジュバント中
０．１mgのＥ．コリ由来組換ＭＲＰ−１４（例１３；例
２２に従って精製したもの）により免疫感作し、次に１
４日の間隔で２回、不完全フロインドアジュバント中
０．０５mgのＭＲＰ−１４の追加免疫注射する。６週間
後、生理食塩水中０．０５mgのＭＲＰ−１４を注射す
る。４日後、免疫感作されたマウスの脾細胞を集め、そ
してマウス骨髄腫細胞Ｐ３×６３−Ａｇ８．６５３（Ａ
ＴＣＣ No．ＣＲＬ １５８０）と融合せしめ、そして
生ずるハイブリドーマ細胞を例３６に記載したようにし
てスクリーニングする。試験した４２０個のハイブリド
ーマ上清の内、例４２のサンドイッチ型エリサにおいて
２７が陽性であった。適当なハイブリドーマを限界稀釈
注により少なくとも２回再クローニングする。
【０２９８】例３９．ＭＲＰ−１４に対するモノクロー
ナル抗体の単離及び特徴付け 例３８の選択されたハイブリドーマ細胞を、例３７．１
において記載したインビボ増殖又はインビトロ培養す
る。沈澱したＩｇＧ画分をアフィゲル−プロテインＡ
ＭＡＰＳキットを用いて精製し、硫酸アンモニウムで再
び沈澱せしめ、ＰＢＳ中に１０mg／mlの濃度に溶解し、
ＰＢＳに対して透析し、そして−８０℃にて貯蔵する。
【０２９９】選択されたハイブリドーマ１４−６Ｂ２及
び１４−１９Ｃ９により生産された抗体をその特異性に
ついて、例３７．２において記載したようにサンドイッ
チ型ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット及び単一細胞アッ
セイにおいて試験する。モノクローナル抗体１４−６Ｂ
２及び１４−１９Ｃ９は天然ＭＲＰ−１４，ＭＲＰ−１
４′、組換ＭＲＰ−１４及びＭＲＰ−１４ｄを選択的に
認識するが、しかしＭＲＰ−８又は他の蛋白質と交叉反
応しない。モノクローナル抗体１４−６Ｂ２及び１４−
１９Ｃ９のサブクラスはＩｇＧ1 と決定される。
【０３００】例４０．酵素−イムノアッセイ（ＥＬＩＳ
Ａ）によるＭＲＰ−８の検出 ４０．１．ＭＲＰ−８に対するポリクローナル抗体及び
モノクローナル抗体のビオチン化 １mgのポリクローナル−ラビット抗−ＭＲＰ−８抗体
（例３４）又はモノクローナル抗体８−５Ｃ２（例３
７）と０．１mgのビオチン−Ｘ−ＮＨＳ（カルビオケ
ム）を、１mlの０．１Ｍ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ８．
０）中で４℃にて４時間、Ｌｅｒｎｅｒ等（Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．１９８０，１５２，１０８５）の方法の変
法に従って反応せしめる。ビオチン化された抗体を４℃
にてＰＢＳに対して透析し、そして−８０℃にて貯蔵す
る。
【０３０１】４０．２．ポリクローナル−ラビット抗−
ＭＲＰ−８及びビオチン化ラビット抗−ＭＲＰ−８抗体
を用いるサンドイッチ型ＥＬＩＳＡ ミクロタイタープレート（ＮＵＮＣ ＦＩ）を０．０５
Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中例３４．２のアフィニ
ティー精製されたラビット抗−ＭＲＰ−８抗体（５μｇ
／ml）を５０μｌ／ウエルでコートし、そして４℃にて
一夜インキュベートする。コートされたプレートは２週
間貯蔵することができる。非特異的部位を０．２％のゼ
ラチン及び１％のＢＳＡ（セルバ）を含有するＰＢＳに
より３７℃にて１時間ブロックした後、５０μｌ／ウエ
ルの稀釈シリーズのＭＲＰ−８（例２０．２，０．１〜
５０ng／ml）及び５０μｇ／ウエルの稀釈シリーズの試
験サンプル〔０．２％ゼラチン、１％ＢＳＡ及び０．０
５％トウィーン２０（ビオーラド）を含有するＰＢＳ
中〕を加え、そして４℃にて一夜インキュベートする。
【０３０２】０．０５％のトウィーン２０を含有するＰ
ＢＳですすいだ後、ＰＢＳ中例４０．１のビオチン化ラ
ビット抗−ＭＲＰ−８（１μｇ／ml）、０．２％ゼラチ
ン及び０．０５％トウィーン２０を３７℃にて１時間イ
ンキュベートし、次にストレプトアビジン−パーオキシ
ダーゼ（ＢＲＬ）により３７℃にて３０分間処理する。
ＰＢＳ及び０．０５％トウィーン２０すすいだ後、０．
０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）中に溶解した０．
０６４ｖ／ｖ％のＨ2 Ｏ2 （メルク）及び２，２′−ア
ジノ−ビス−（３−エチルベンズチアゾリンスルホン
酸）〔ＡＢＴＳ，０．５４mg／ml（ｗ／ｖ）、ベーリン
ガーマンハイム〕を用いて、結合したパーオキシダーゼ
を発色せしめる。３７℃にて３０分間の後、８チャンネ
ル光度計（フロウ）を用いて４１５nmにて光学濃度を測
定する。
【０３０３】このアッセイは、ヒト単球の細胞溶解物
中、ＭＲＰ−８でトランスフェクトされた胎児肺細胞Ｌ
−１３２（例３１）中、並びにヒト患者及び正常対照者
の血漿サンプル中、５０pg／ml以上のＭＲＰ−８を検出
する。ビオチン化ラビット抗−ＭＲＰ−８の代りにビオ
チン化マウスモノクローナル抗体８−５Ｃ２（１μｇ／
ml）を用いることができる。
【０３０４】４０．３．モノクローナル抗体８−１０Ｄ
７及びビオチン化抗体８−５Ｃ２を用いるサンドイッチ
型ＥＬＩＳＡ アッセイ方法は例４０．２と同様であるが、ただし、ミ
クロタイタープレートをまずモノクローナル抗体８−１
０Ｄ７（１０μｇ／ml）でコートする。非特異的部位を
ブロックした後、被験サンプル及びＭＲＰ−８の標準液
を加え、そして次にビオチン化抗体８−５Ｃ２（１μｇ
／ml）と反応せしめる。他の操作は前記の通りである。
【０３０５】ビオチン化モノクローナル抗体８−５Ｃ２
の代りにビオチン化ラビット抗−ＭＲＰ−８を用いるこ
とができる。 ４０．４．モノクローナル抗体８−１０Ｄ７又は８−５
Ｃ２及びラビット抗−ＭＲＰ−８を用いるサンドイッチ
型ＥＬＩＳＡ アッセイ方法は例４０．２に記載した通りである。捕捉
抗体として８−１０Ｄ７（又は８−５Ｃ２）（１０μｇ
／ml）をミクロタイタープレート上にコートする。非特
異的部位をブロックした後、被験サンプル及びＭＲＰ−
８を含有する標準溶液を添加し、そして次にラビット抗
−ＭＲＰ−８と反応せしめる。結合したラビット抗体を
種特異的ヤギ抗−ラビットＩｇ−パーオキシダーゼ接合
体（ＤＩＡＮＯＶＡ）により検出し、さらに例４０．２
のようにして処理する。
【０３０６】同様のアッセイにおいては、コートするた
めにポリクローナル−ラビット抗−ＭＲＰ−８を使用
し、次に被験サンプルで処理し、次にモノクローナル抗
体８−５Ｃ２又は８−１０Ｄ７で処理する。結合したマ
ウス抗体を種特異的ヤギ抗−マウスＩｇ−パーオキシダ
ーゼ接合体（ＤＩＡＮＯＶＡ）と反応せしめる。例４１ ．ＭＲＰ−８のためにサンドイッチＥＬＩＳＡ用
キット 例４０．２のサンドイッチＥＬＩＳＡのためのキットは
次のものを含む。
【０３０７】１）ミクロタイタープレート（ＮＵＮＣ
ＦＩ） ２）０．０５Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中アフィニ
ティー精製されたラビット抗−ＭＲＰ−８ポリクローナ
ル抗体（５μｇ／ml；例３４．２）１０ml ３）０．０５％のトウィーン２０を含有するＰＢＳ中組
換ＭＲＰ−８標準溶液（１mg／ml）１．０ml ４ａ）ＰＢＳ（ｐＨ７．４），０．２％ゼラチン、１％
ＢＳＡ，０．０５％トウィーン２０中ビオチン化ラビッ
ト−抗−ＭＲＰ−８（１μｇ／ml；例４０．１）１０ml
又は ４ｂ）ＰＢＳ（ｐＨ７．４），０．２％ゼラチン、１％
ＢＳＡ，０．０５％トウィーン２０中ビオチン化モノク
ローナル抗体８−５Ｃ２（１μｇ／ml）１０ml ５）ＰＢＳ（ｐＨ７．４），２％ゼラチン、１％ＢＳ
Ａ，０．０５％トウィーン２０中ストレプトアビジン−
パーオキシダーゼ（ＢＲＬ）１：２０００１０ml ６）ＰＢＳ，０．０５％トウィーン２０ ２００ml ７）ＰＢＳ（ｐＨ７．４），０．２％ゼラチン、１％Ｂ
ＳＡ，０．０５％トウィーン２０ ２００ml ８）０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）中ＡＢＴ
Ｓ（０．５４mg／ml）及び０．０６４％Ｈ2 Ｏ2 ４０
ml ９）換算曲線 １０）説明書。
【０３０８】例４０．３のサンドイッチ型ＥＬＩＳＡの
ための試験キットは前記の要素を含むが次の点で異る。 ２）モノクローナル抗体８−１０Ｄ７（１０μｇ／ml）
１０ml ４ａ）ビオチン化モノクローナル抗体８−５Ｃ２（１μ
ｇ／ml）１０ml又は ４ｂ）ビオチン化ポリクローナル−ラビット抗−ＭＲＰ
−８抗体（１μｇ／ml）１０ml 例４０．４のサンドイッチ型ＥＬＩＳＡのための試験キ
ットは前記と同じ要素を含むが、次の点で異る。
【０３０９】２ａ）モノクローナル抗体８−１０Ｄ７又
は８−５Ｃ２（１０μｇ／ml）１０ml又は ２ｂ）アフィニティー精製されたポリクローナル−ラビ
ット抗−ＭＲＰ−８抗体（５μｇ／ml）１０ml ４ａ）ポリクローナル−ラビット抗−ＭＲＰ−８抗体
（１μｇ／ml）１０ml及び ５ａ）ヤギ抗−ラビットＩｇ−パーオキシダーゼ接合体
１：５０００ １０ml又は ４ｂ）モノクローナル抗８−５Ｃ２（１μｇ／ml）１０
ml及び ５ｂ）ヤギ抗−マウスＩｇ−パーオキシダーゼ接合体
１：５０００ １０ml例４２ ．酵素イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるＭＲ
Ｐ−１４の検出 ポリクローナル−ラビット抗−ＭＲＰ−１４抗体（例３
５）、又はモノクローナル抗体１４−６Ｂ２もしくは１
４−１９Ｃ９（例３９）を例４０．１に記載したように
してビオチン化する。
【０３１０】例４０．２又は４０．４に記載したように
してＭＲＰ−１４の検出のためのサンドイッチ型ＥＬＩ
ＳＡを行う。ただし、ポリクローナル抗体抗−ＭＲＰ−
８の代りにポリクローナル抗体抗ＭＲＰ−１４を使用
し、そしてモノクローナル抗体８−１０Ｄ７又は８−５
Ｃ２の代りにモノクローナル抗体１４−６Ｂ２又は１４
−１９Ｃ９を使用する。標準溶液は例２２のＭＲＰ−１
４から調製する（０．１〜１００ng／ml）。
【０３１１】血漿中のＭＲＰ−１４の測定のため、ヘパ
リンと共に採取した血漿サンプルをすぐに１mMフェニル
メタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ、フルカ）に
し、そして−８０℃にて貯蔵する。分析のため、サンプ
ルを１：５〜１：１０，０００に稀釈し、そして前記の
サンドイッチアッセイにおいて試験する。例４３ ．ＭＲＰ−１４のためのサンドイッチＥＬＩＳＡ
用試験キット ポリクローナル抗−ＭＲＰ−１４抗体、及びビオチン化
抗−ＭＲＰ−１４又はビオチン化モノクローナル抗体１
４−６Ｂ２を用いる例４２のサンドイッチＥＬＩＳＡの
ための試験キットは次のものを含む。
【０３１２】１）ミクロタイタープレート（ＮＵＮＣ
ＦＩ） ２）０．０５Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中アフィニ
ティー精製されたラビット抗−ＭＲＰ−１４ポリクロー
ナル抗体（５μｇ／ml、例３５．２）１０ml ３）０．０５％のトウィーン２０を含有するＰＢＳ中組
換ＭＲＰ−１４標準溶液（１mg／ml）１．０ml ４ａ）ＰＢＳ（ｐＨ７．４），０．２％ゼラチン、１％
ＢＳＡ，０．０５％トウィーン中ビオチン化ラビット−
抗−ＭＲＰ−１４（１μｇ／ml）１０ml又は ４ｂ）ＰＢＳ（ｐＨ７．４），０．２％ゼラチン、１％
ＢＳＡ，０．０５％トウィーン２０中ビオチン化モノク
ローナル抗体１４−６Ｂ２（１μｇ／ml）１０ml ５）ＰＢＳ（ｐＨ７．４），２％ゼラチン、１％ＢＳ
Ａ，０．０５％トウィーン２０中ストレプトアビジン−
パーオキシダーゼ（ＢＲＬ）１：２０００／１０ml ６）ＰＢＳ，０．０５％トウィーン２０ ２００ml ７）ＰＢＳ（ｐＨ７．４），０．２％ゼラチン、１％Ｂ
ＳＡ，０．０５％トウィーン２０／２００ml ８）０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）中ＡＢＴ
Ｓ（０．５４mg／ml）及び０．０６４％Ｈ2 Ｏ2 ／４０
ml ９）換算曲線 １０）説明書。
【０３１３】ビオチン化ポリクローナル抗体又はモノク
ローナル抗体、及びストレプトアビジン−パーオキシダ
ーゼ接合体（４及び５）の代りに、ポリクローナル抗体
又はモノクローナル抗体それ自体、及び種特異的抗−Ｉ
ｇ血清−パーオキシダーゼ接合体（例４１のごとく）を
使用することができる。例４４ ．非経口投与のための医薬製剤 ２００μｇの例２０．５のＭＲＰ−８又は例２２．３の
ＭＲＰ−１４を３mlの５Ｎヒト血清アルブミンに溶解す
る。生ずる溶液を細菌学的フィルターに通し、そして濾
過された溶液を無菌条件下で１０本のバイアルに分け
る。これらのバイアルは、例えば−２０℃において冷所
に貯蔵するのが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、例１．２．に記載した還元条件下
（Ａ）及び非還元条件下（Ｂ）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの
ポリアクリルアシドゲルを示す。レーン１及び２：分子
量マーカー；レーン３：例１．１．の１Ｃ５アフィニテ
ィーカラムから溶出した全蛋白質；レーン４〜１０：Ｈ
ＰＬＣ画分Ｉ〜VIII。
【図２】図２は、クローン３から単離された式（VII ）
のＭＲＰ−８のｃＤＮＡを模式的に示す。パートＡには
コード領域が示されている。丸で囲んだ数字はクローン
３のｃＤＮＡと他のクローンから単離されたｃＤＮＡで
異る塩基の位置、及び例１０において検討した他の特定
の特徴を示す。レーンＢは配列決定のために使用された
制限部位の位置を示す。パートＣは配列決定の方策を要
約したものであり、制限部位における配列の開始（垂直
の線）及び終止（矢じり）、明瞭な配列の終止（点）及
び各クローンのＤＮＡの終点（クロス印）を示す。数値
は異るクローンの番号を示し、文字は配列決定法（Ｓ：
Ｓａｎｇｅｒ法、ＭＧ：ＭａｘａｍＧｉｌｂｅｒｔ法）
を示す。
【図３】図３は、式（IX）のＭＲＰ−１４のｃＤＮＡを
模式的に示し、コード領域（レーンＡ）、配列決定に使
用された制限部位の位置（レーンＢ）、並びにクローン
ＭＲＰ−１４−１０、クローンＭＲＰ−１４−１６及び
クローンＭＲＰ−１４−１５，１８及び１９に適用され
た配列決定法（レーンＣ）を示す（例１１）。
【図４】図４は、式（VIII）（ＭＲＰ−８）のゲノムＤ
ＮＡを模式的に示す。下方のレーンは配列決定に使用し
た制限部位の位置、エクソン１，２及び３の位置（箱）
並びにトリプレットＡＴＢ及びＴＡＧ間のコード配列
（黒箱）を示す。上方のレーンは配列決定法を要約する
ものであり、制限部位における配列の開始及び読取可能
配列の終止又は制限部位における配列の終止を示す。配
列決定法はＳａｎｇｅｒ及びＣｏｕｌｓｏｎに従った。
【図５】図５は、式（Ｘ）（ＭＲＰ−１４）のゲノムＤ
ＮＡを模式的に示す。エクソン１，２及び３（箱）の、
並びにトリプレットＡＴＧ及びＴＡＡ間のコード配列
（黒箱）の制限部位の位置を示す。配列決定法は矢印か
ら演繹することができる。配列は制限部位（矢印の始
め）から次の制限部位又は読み取り可能な配列の終点ま
で読み取られた。Ｓａｎｇｅｒ及びＣｏｕｌｓｏｎの配
列決定法が使用された。
【図６】図６は、プラスミドｐＣＭＶｅ／ＭＲＰ−８の
制限地図を、複製開始点Ｏｒｉ、アンピシリン耐性遺伝
子ＡｍｐR 、ヒトＣＭＶエンハンサー及びＭＲＰ−８を
コードする遺伝子の３個のエクソンの相対的の位置と共
に示す。
【図７】図７は、プラスミドｐＣＭＶｅ／ＭＲＰ−１４
の制限地図を、複製開始点Ｏｒｉ、アンピシリン耐性遺
伝子（ＡｍｐR ）、ヒトＣＭＶエンハンサー、ＭＲＰ−
１４プロモーター領域及びＭＲＰ−１４の３個のエクソ
ンの相対位置と共に示す。
【図８】図８は、３９人の正常な健康な提供者（Ａ）、
及び合計１８人ののう包性繊維症（ＣＦ）（白丸はホモ
接合体、黒丸はヘテロ接合体）（Ｂ）のＭＲＰ−１４の
血漿中濃度を示す。ＭＲＰ−１４の濃度ng／mlの対数ス
ケールで示す。ヘパリンと共に採取した血漿サンプルを
１mMフェニルメタンスルホニルフルオリドに調整し、そ
して例３５のＭＲＰ−１４に対するポリクローナル抗体
を用いる例４２のサンドイッチＥＬＩＳＡにより二連で
試験した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＺＮＡＫ 5/10 21/08 15/09 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｔ Ｃ１２Ｐ 21/02 ＺＮＡ 33/53 Ｐ 21/08 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＥ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 9282−4Ｂ 15/00 Ａ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 ロジャー クラーク スイス国，4057 バーゼル，クリンゲンタ ルグラベン ７ (72)発明者 ニコ セルレッティ スイス国，4103 ボットミンゲン，リュテ ィシュトラーセ 11 (72)発明者 ヨーゼフ ブリューゲン スイス国，4125 リーエン，シュトツェン ガッセ ５ (72)発明者 ラヨス タルツァイ ドイツ連邦共和国，7889 グレンツァッハ −ビーレン，ムッテンツァーシュトラーセ 25 (72)発明者 クレメンス ゾルク ドイツ連邦共和国，4400 ミュンステル, アルハルトシュトラーセ 21 (72)発明者 バルター ビーゼンダンガー スイス国，4142 ミュンヘンシュタイン, シュタイングルベンベーク 12

Claims (61)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 見かけ分子量約８kD又は約１４kDのヒト
    マクロファージ遊走阻止因子関連ペプチド（ＭＲＰ）、
    又はその変異体、断片もしくは誘導体。
  2. 【請求項２】 次の式（Ｉ）： 【化１】 （式中、Ｚ1 は水素、アシル又はアミノ酸残基メチオニ
    ンである、）で表わされる特許請求の範囲第１項に記載
    のヒトマクロファージ遊走阻止因子関連ペプチド、又は
    その変異体、断片もしくは誘導体。
  3. 【請求項３】 次の式（II）： 【化２】 （式中、Ｚ2 は水素、アシル、又は１〜５個のアミノ酸
    から成る場合によってはアシル化されているペプチド残
    基である、）で表わされる特許請求の範囲第１項に記載
    のヒトマクロファージ遊走阻止因子関連ペプチド、又は
    その変異体、断片もしくは誘導体。
  4. 【請求項４】 Ｚ1 が水素、アセチル、又はアミノ酸残
    基メチオニン（Ｍｅｔ）である特許請求の範囲第２項に
    記載の式（Ｉ）のヒトマクロファージ遊走阻止因子関連
    ペプチドＭＲＰ−８。
  5. 【請求項５】 Ｚ1 がＭｅｔである特許請求の範囲第２
    項に記載の式（Ｉ）のヒトマクロファージ遊走阻止因子
    関連ペプチドＭＲＰ−８。
  6. 【請求項６】 Ｚ2 が水素、アセチル、Met-, Thr-Cys-
    Lys-Met-, Met-Thr-Cys-Lys-Met-又はアセチル-Thr-Cys
    -Lys- Met-である特許請求の範囲第３項に記載の式（I
    I）のヒトマクロファージ遊走阻止因子関連ペプチドＭ
    ＲＰ−１４。
  7. 【請求項７】 Ｚ2 が水素、又はThr-Cys-Lys-Met-であ
    る特許請求の範囲第３項に記載の式（II）のヒトマクロ
    ファージ遊走阻止因子関連ペプチドＭＲＰ−１４。
  8. 【請求項８】 式（Ｉ）の化合物の１個、２個又は３個
    の単一のアミノ酸が異るアミノ酸又は結合により置き換
    えられている、特許請求の範囲第２項に記載の式（Ｉ）
    のＭＲＰ−８の変異体。
  9. 【請求項９】 ２０個以上の連続するアミノ酸を含んで
    成る特許請求の範囲第２項に記載の式（Ｉ）のＭＲＰ−
    ８の断片。
  10. 【請求項１０】 アミノ及び／又はヒドロキシ官能基が
    グリコシル化されている特許請求の範囲第２項に記載の
    式（Ｉ）のＭＲＰ−８の誘導体。
  11. 【請求項１１】 Ｚ1 がＭｅｔであり、そしてシステイ
    ン残基のメルカプト基が酸化された形態にあって分子間
    Ｓ−Ｓ橋を提供している特許請求の範囲第２項に記載の
    式（Ｉ）のＭＲＰ−８のダイマー。
  12. 【請求項１２】 式（II）の化合物の１個、２個又は３
    個の単一のアミノ酸が異るアミノ酸又は結合により置き
    換えられている、特許請求の範囲第３項に記載の式（I
    I）のＭＲＰ−１４の変異体。
  13. 【請求項１３】 ２０個以上の連続するアミノ酸を含ん
    で成る特許請求の範囲第３項に記載の式（II）のＭＲＰ
    −１４の断片。
  14. 【請求項１４】 アミノ及び／又はヒドロキシ官能基が
    グリコシル化されている特許請求の範囲第３項に記載の
    式（II）のＭＲＰ−１４の誘導体。
  15. 【請求項１５】 Ｚ2 がThr-Cys-Lys-Met-であり、そし
    てシステイン残基が酸化された形態にあって分子間Ｓ−
    Ｓ橋を提供している特許請求の範囲第３項に記載の式
    （II）のＭＲＰ−１４のダイマー。
  16. 【請求項１６】 システイン残基のメルカプト基が酸化
    された形態にあって分子間Ｓ−Ｓ橋を形成している、Ｚ
    1 がＭｅｔである式（Ｉ）のＭＲＰ−８とＺ 2 がThr-Cy
    s-Lys-Met-である式（II）のＭＲＰ−１４との、特許請
    求の範囲第１項に記載のダイマー。
  17. 【請求項１７】 見かけ分子量約８kD又は約１４kDのヒ
    トマクロファージ遊走阻止因子関連ペプチド、又はその
    変異体、断片もしくは誘導体の製造方法であって、目的
    の化合物を含有する溶液をクロマトグラフ法により精製
    し、そして該化合物を単離し、そして所望によりそれか
    ら断片又は誘導体を調製することを特徴とする方法。
  18. 【請求項１８】 前記目的化合物を含有する溶液が、刺
    激された正常ヒトリンパ球の又は遺伝子操作された微生
    物もしくは永久哺乳類セルラインの前精製された抽出
    物、細胞上清又は培養濾液である、特許請求の範囲第１
    ７項に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記クロマトグラフ精製法がイオン交
    換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィ
    ー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、ヒ
    ドロキシアパタイト上でのクロマトグラフィー、疎水性
    相互作用クロマトグラフィー又はこれらの組合わせから
    選択される、特許請求の範囲第１７項に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 目的化合物を含有する溶液を、異種性
    ポリペプチドの発現を許容する条件下で、式（Ｉ）又は
    （II）のペプチド、又はその変異体もしくは誘導体を発
    現する形質転換された宿主を培養することにより得る、
    特許請求の範囲第１７項に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 次の段階： ａ）式（Ｉ）もしくは（II）の化合物又はその断片をコ
    ードするＤＮＡをヒト細胞のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ
    ライブラリーから単離しそして場合によってはそれを変
    異せしめるか、又はそのようなＤＮＡを化学的に合成
    し； ｂ）該ＤＮＡを適当な発現ベクターに導入し； ｃ）該得られたハイブリドベクターを受容宿主に移行せ
    しめ； ｄ）形質転換された宿主のみが生存する条件下で培養す
    ることにより未形質転換宿主から形質転換された宿主を
    選択し； ｅ）異種性ポリペプチドの発現を許容する条件下で、形
    質転換された宿主を培養し；そして ｆ）式（Ｉ）もしくは（II）の化合物又はその変異体、
    断片もしくは誘導体を単離し；そして所望により、式
    （Ｉ）もしくは（II）の化合物又はその変異体もしくは
    断片を誘導体にする；を含んで成る特許請求の範囲第２
    ０項に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 式（Ｉ）もしくは（II）の化合物又は
    その変異体もしくは断片をコードし、少なくとも１５ヌ
    クレオチドを含んで成るＤＮＡ。
  23. 【請求項２３】 次の式（III ）： 【化３】 〔式中、 Ｙ1 はプロモーター配列を含有する１２ヌクレオチド以
    上のフランキングＤＮＡ残基であり；Ｙ2 はＹM −ＹT
    −ＹC −ＹK であるか、又は存在せず；Ｙ3 は１ヌクレ
    オチド以上のフランキングＤＮＡ残基であるか、又は存
    在せず；ＹA はアラニン（Ａ又はAla ）をコードし、そ
    してGCT, GCC, GCA 又はGCG であり；ＹC はシステイン
    （Ｃ又はCys ）をコードし、そしてTGT 又はTGC であ
    り；ＹD はアスパラギン酸（Ｄ又はAsp ）をコードし、
    そしてGAT 又はGAC であり；ＹE はグルタミン酸（Ｅ又
    はGlu ）をコードし、そしてGAA 又はGAG であり；ＹF
    はフェニルアラニン（Ｆ又はPhe ）をコードし、そして
    TTT 又はTTC であり；ＹG はグリシン（Ｇ又はGly ）を
    コードし、そしてGGT, GGC, GGA 又はGGG であり；ＹH
    はヒスチジン（Ｈ又はHis ）をコードし、そしてCAT 又
    はCAC であり；ＹI はイソロイシン（Ｉ又はIle ）をコ
    ードし、そしてATT, ATC又はATA であり；ＹK はリジン
    （Ｋ又はLys ）をコードし、そしてAAA 又はAAG であ
    り；ＹL はロイシン（Ｌ又はLeu ）をコードし、そして
    TTA, TTG, CTT, CTC, CTA又はCTG であり；ＹM はメチ
    オニン（Ｍ又はMet ）をコードし、そしてATG であり；
    ＹN はアスパラギン（Ｎ又はAsn ）をコードし、そして
    AAT 又はAAC であり；ＹP はプロリン（Ｐ又はPro ）を
    コードし、そしてCCT, CCC, CCA 又はCCG であり；ＹQ
    はグルタミン（Ｑ又はGln ）をコードし、そしてCAA 又
    はCAG であり；ＹR はアルギニン（Ｒ又はArg ）をコー
    ドし、そしてCGT, CGC, CGA, CGG, AGA 又はAGG であ
    り；ＹS はセリン（Ｓ又はSer ）をコードし、そしてTC
    T, TCC, TCA, TCG, AGT 又はAGC であり；ＹT はトレオ
    ニン（Ｔ又はThr ）をコードし、そしてACT, ACC, ACA
    又はACGであり；ＹV はバリン（Ｖ又はVal ）をコード
    し、そしてGTT, GTC, GTA 又はGTG であり；ＹW はトリ
    プトファン（Ｗ又はTrp ）をコードし、そしてTGG であ
    り；ＹY はチロシン（Ｙ又はTyr ）をコードし、そして
    TAT 又はTAC であり；そしてＹ* は終止コドンTAA, TAG
    又はTGA である、〕で表わされるＭＲＰ−８をコードす
    る特許請求の範囲第２２項に記載のＤＮＡ、式（III ）
    のＤＮＡとこれに対して相補的なＤＮＡとから成る二本
    鎖ＤＮＡ、該相補的ＤＮＡ自体、式（III ）のＤＮＡを
    １個又は２個のイントロンが中断しているゲノムＤＮ
    Ａ、１個、２個、３個もしくは４個のヌクレオチドが変
    異しているこれらのＤＮＡの変異体、又は少なくとも１
    ５ヌクレオチドを含んで成るこれらのＤＮＡの断片。
  24. 【請求項２４】 次の式（IV）： 【化４】 〔式中、 Ｙ1 はプロモーターを含有する１２ヌクレオチド以上の
    フランキングＤＮＡ配列であり；Ｙ2 はＹM −ＹT −Ｙ
    C −ＹK であるか、又は存在せず；Ｙ3 は１ヌクレオチ
    ド以上のフランキングＤＮＡ配列であるか、又は存在せ
    ず；ＹA はアラニン（Ａ又はAla ）をコードし、そして
    GCT, GCC, GCA 又はGCG であり；ＹC はシステイン（Ｃ
    又はCys ）をコードし、そしてTGT 又はTGC であり；Ｙ
    D はアスパラギン酸（Ｄ又はAsp ）をコードし、そして
    GAT 又はGAC であり；ＹE はグルタミン酸（Ｅ又はGlu
    ）をコードし、そしてGAA 又はGAG であり；ＹF はフ
    ェニルアラニン（Ｆ又はPhe ）をコードし、そしてTTT
    又はTTC であり；ＹG はグリシン（Ｇ又はGly ）をコー
    ドし、そしてGGT, GGC, GGA 又はGGG であり；ＹH はヒ
    スチジン（Ｈ又はHis ）をコードし、そしてCAT 又はCA
    C であり；ＹI はイソロイシン（Ｉ又はIle ）をコード
    し、そしてATT, ATC又はATA であり；ＹK はリジン（Ｋ
    又はLys ）をコードし、そしてAAA 又はAAG であり；Ｙ
    L はロイシン（Ｌ又はLeu ）をコードし、そしてTTA, T
    TG, CTT, CTC, CTA又はCTG であり；ＹM はメチオニン
    （Ｍ又はMet ）をコードし、そしてATG であり；ＹN は
    アスパラギン（Ｎ又はAsn ）をコードし、そしてAAT 又
    はAAC であり；ＹP はプロリン（Ｐ又はPro ）をコード
    し、そしてCCT, CCC, CCA 又はCCG であり；ＹQ はグル
    タミン（Ｑ又はGln ）をコードし、そしてCAA 又はCAG
    であり；ＹR はアルギニン（Ｒ又はArg ）をコードし、
    そしてCGT, CGC, CGA, CGG, AGA 又はAGG であり；ＹS
    はセリン（Ｓ又はSer ）をコードし、そしてTCT, TCC,
    TCA, TCG, AGT 又はAGC であり；ＹT はトレオニン（Ｔ
    又はThr ）をコードし、そしてACT, ACC, ACA 又はACG
    であり；ＹV はバリン（Ｖ又はVal ）をコードし、そし
    てGTT, GTC, GTA 又はGTG であり；ＹW はトリプトファ
    ン（Ｗ又はTrp ）をコードし、そしてTGG であり；ＹY
    はチロシン（Ｙ又はTyr ）をコードし、そしてTAT 又は
    TAC であり；そしてＹ* は終止コドンTAA, TAG又はTGA
    である〕で表わされるＭＲＰ−１４をコードする特許請
    求の範囲第２２項に記載のＤＮＡ、式（IV）のＤＮＡと
    これに対して相補的なＤＮＡとから成る二本鎖ＤＮＡ、
    該相補的ＤＮＡ自体、式（IV）のＤＮＡを１個又は２個
    のイントロンが中断しているゲノムＤＮＡ、１個、２
    個、３個もしくは４個のヌクレオチドが変異しているこ
    れらのＤＮＡの変異体、又は少なくとも１５ヌクレオチ
    ドを含んで成るこれらのＤＮＡの断片。
  25. 【請求項２５】 次の式（Ｖ）： 【化５】 （式中、Ｙ1 はプロモーター配列を含有する１２ヌクレ
    オチド以上のフランキングＤＮＡ残基であり、そしてＹ
    3 は１ヌクレオチド以上のフランキングＤＮＡ残基であ
    るか、又は存在しない）で表わされる特許請求の範囲第
    ２３項に記載のＤＮＡ、式（Ｖ）のＤＮＡとこれに対し
    て相補的なＤＮＡとから成る二本鎖ＤＮＡ、該相補的Ｄ
    ＮＡ自体、式（Ｖ）のＤＮＡを１個又は２個のイントロ
    ンが中断しているゲノムＤＮＡ、１個、２個、３個又は
    ４個のヌクレオチドが変異しているこれらのＤＮＡの変
    異体、及び少なくとも１５ヌクレオチドを含んで成るこ
    れらのＤＮＡの断片。
  26. 【請求項２６】 次の式（VI）： 【化６】 （式中、Ｙ1 はプロモーター配列を含有する１２ヌクレ
    オチド以上のフランキングＤＮＡ残基であり、Ｙ2 はAT
    GACTTGCAAAであるか、又は存在せず、そしてＹ 3 は１ヌ
    クレオチド以上のフランキングＤＮＡ残基である、）で
    表わされる特許請求の範囲第２４項記載のＤＮＡ、式
    （VI）のＤＮＡとこれに対して相補的なＤＮＡとから成
    る二本鎖ＤＮＡ、該相補的ＤＮＡ自体、式（VI）のＤＮ
    Ａを１個又は２個のイントロンが中断しているゲノムＤ
    ＮＡ、１個、２個、３個もしくは４個のヌクレオチドが
    変異しているこれらのＤＮＡの変異体、又は少なくとも
    １５ヌクレオチドを含んで成るこれらのＤＮＡの断片。
  27. 【請求項２７】 次の式（VII ）： 【化７】 で表わされる特許請求の範囲第２５項に記載のＤＮＡ。
  28. 【請求項２８】 式（VIII）の特許請求の範囲第２５項
    に記載のＤＮＡ。
  29. 【請求項２９】 次の式（IX）： 【化８】 で表わされる特許請求の範囲第２６項に記載のＤＮＡ。
  30. 【請求項３０】 式（Ｘ）の特許請求の範囲第２６項に
    記載のＤＮＡ。
  31. 【請求項３１】 式（Ｖ）もしくは（VI）のＤＮＡと、
    又は式（Ｖ）もしくは（VI）のＤＮＡに対して相補的な
    ＤＮＡとハイブリダイズする、特許請求の範囲第２２項
    に記載のＤＮＡ。
  32. 【請求項３２】 式（Ｉ）もしくは（II）の化合物をコ
    ードするＤＮＡ、その変異体及びこれらのＤＮＡの断片
    の製造方法であって、形質転換された宿主を培養しそし
    てこれから所望のＤＮＡを単離するか、又はヌクレオチ
    ドの縮合によりそれを合成することを含んで成る方法。
  33. 【請求項３３】 次の段階： ａ）ヒト単核白血球からｍＲＮＡを単離し、目的のｍＲ
    ＮＡを選択し、該ｍＲＮＡに対して相補的な単鎖ＤＮＡ
    を調製し、次にこれから二本鎖ＤＮＡ（ｄｓｃＤＮＡ）
    を調製するか、又は ｂ）ヒト細胞からゲノムＤＮＡを単離しそしてＤＮＡプ
    ローブを用いて目的のＤＮＡを選択し；そして ｃ）段階ａ）のｄｓ ｃＤＮＡ又は段階ｂ）のｄｓ Ｄ
    ＮＡを適当な発現ベクターに導入し； ｄ）適当な宿主微生物を前記の得られたハイブリドベク
    ターにより形質転換し； ｅ）式（Ｉ）もしくは（II）の化合物をコードするＤＮ
    Ａ又はその変異体もしくは断片を含有する形質転換され
    た宿主をコードＤＮＡを含有しない宿主から選択し；そ
    して ｆ）目的のＤＮＡを単離する；を含んで成る特許請求の
    範囲第３２項に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 発現制御配列に作用可能に連結され
    た、式（Ｉ）もしくは（II）の化合物をコードするＤＮ
    Ａ、その変異体又はこれらのＤＮＡの断片を含んで成る
    ハイブリドベクター。
  35. 【請求項３５】 プラスミドｐＢＲ３２２由来の特許請
    求の範囲第３４項に記載のハイブリドベクター。
  36. 【請求項３６】 ｔｒｐプロモーターを含有する特許請
    求の範囲第３４項に記載のハイブリドベクター。
  37. 【請求項３７】 ファージλのプロモーターＰL を含有
    する特許請求の範囲第３４項に記載のハイブリドベクタ
    ー。
  38. 【請求項３８】 酵母染色体自律複製セグメント（ａｒ
    ｓ）及びＰＨ０５プロモーターを含有する特許請求の範
    囲第３４項に記載のハイブリドベクター。
  39. 【請求項３９】 ベクターｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０５
    −ＭＲＰ−８，ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＭＲＰ−
    １４、又はｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＭＲＰ−１４
    ｄである特許請求の範囲第３８項に記載のハイブリドベ
    クター。
  40. 【請求項４０】 ヒトサイトメガロウイルス主要中間−
    初期遺伝子のエンハンサーユニットを含有する特許請求
    の範囲第３４項に記載のハイブリドベクター。
  41. 【請求項４１】 ベクターｐＣＭＶｅ／ＭＲＰ−８、又
    はｐＣＭＶｅ／ＭＲＰ−１４である特許請求の範囲第４
    ０項に記載のハイブリドベクター。
  42. 【請求項４２】 特許請求の範囲第３４項〜第４１項の
    いずれか１項に記載のハイブリドベクターにより形質転
    換された宿主細胞。
  43. 【請求項４３】 エシェリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
    ｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である特許請求の範囲第４２項に
    記載の宿主細胞。
  44. 【請求項４４】 Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１
    ／ＬＭ １０３５，Ｋ１２又はＷ３１１０株である特許
    請求の範囲第４３項に記載の宿主細胞。
  45. 【請求項４５】 サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａ
    ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であ
    る特許請求の範囲第４２項に記載の宿主細胞。
  46. 【請求項４６】 Ｓ．セレビシエー（Ｓ．ｓｅｒｅｖｉ
    ｓｉａｅ）ＧＲＦ１８株である特許請求の範囲第４５項
    に記載の宿主細胞。
  47. 【請求項４７】 胎児肺細胞Ｌ−１３２である特許請求
    の範囲第４２項に記載の宿主細胞。
  48. 【請求項４８】 ｐＣＭＶｅ／ＭＲＰ−８又はｐＣＭＶ
    ｅ／ＭＲＰ−１４及びｐＳＶ2 ｎｅｏで安定に形質転換
    された胎児肺細胞Ｌ−１３２である特許請求の範囲第４
    ７項に記載の宿主細胞。
  49. 【請求項４９】 療法的に有効な量のヒトマクロファー
    ジ遊走阻止因子関連ペプチド、又はその変異体、断片も
    しくは誘導体を含有する医薬。
  50. 【請求項５０】 ＭＲＰ−８に対して特異的であり且つ
    ＭＲＰ−１４及び他の蛋白質と交叉反応しないモノクロ
    ーナル抗体、及びその誘導体。
  51. 【請求項５１】 ＣＮＣＭ、パスツール研究所（パリ）
    にそれぞれＩ−６９０及びＩ−６８９として寄託されて
    いる８−５Ｃ２及び８−１０Ｄ７と称するハイブリドー
    マセルラインにより生産され、８−５Ｃ２及び８−１０
    Ｄ７と称する、請求項５０に記載のモノクローナル抗
    体。
  52. 【請求項５２】 ビオチンとの結合体である、請求項５
    ０に記載のモノクローナル抗体。
  53. 【請求項５３】 ＭＲＰ−８に対して特異的であり且つ
    ＭＲＰ−１４及び他の蛋白質に対して交叉反応しないモ
    ノクローナル抗体、及びその誘導体の製造方法におい
    て、 ａ）前記モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ
    細胞をインビトロで培養し、そして培養上清から該モノ
    クローナル抗体を単離し；あるいは ｂ）前記ハイブリドーマ細胞を適当な哺乳類中でインビ
    ボで増殖せしめそして該哺乳類の体液から該モノクロー
    ナル抗体を回収し；そして所望により、得られたモノク
    ローナル抗体をその誘導体に変換する、ことを特徴とす
    る方法。
  54. 【請求項５４】 ＭＲＰ−８に対して特異的であり且つ
    ＭＲＰ−１４及び他の蛋白質と交叉反応しないモノクロ
    ーナル抗体を分泌することを特徴とするハイブリドーマ
    セルライン。
  55. 【請求項５５】 ＣＮＣＮ、パスツール研究所（パリ）
    にそれぞれＥ−６９０及びＩ−６８９として寄託されて
    おり、８−５Ｃ２及び８−１０Ｄ７と称する請求項５４
    に記載のハイブリドーマセルライン。
  56. 【請求項５６】 ＭＲＰ−８に対して特異的であり且つ
    ＭＲＰ−１４及び他の蛋白質と交叉反応しないモノクロ
    ーナル抗体を分泌するハイブリドーマセルラインの製造
    方法において、適当な哺乳類をＭＲＰ−８により免疫
    し、該哺乳類の抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合せ
    しめ、該融合により得られたハイブリッド細胞をクロー
    ニングし、そして所望の抗体を分泌する細胞クローンを
    選択する、ことを特異的とする方法。
  57. 【請求項５７】 ＭＲＰ−８に対して特異的であり且つ
    ＭＲＰ−１４及び他の蛋白質と交叉反応しないモノクロ
    ーナル抗体を使用することを特徴とする、ヒトマクロフ
    ァージ遊走阻止因子関連ペプチドの定量的又は定性的測
    定方法。
  58. 【請求項５８】 ヒトマクロファージ遊走阻止因子関連
    ペプチドの免疫学的測定方法において、ＭＲＰ−８に対
    して特異的であり且つＭＲＰ−１４及び他の蛋白質と交
    叉反応しないモノクローナル抗体により固体抗体をコー
    トし、測定すべきペプチドを含有する溶液と共にインキ
    ュベートし、次にＭＲＰ−８に対して特異的であり且つ
    ＭＲＰ−１４及び他の蛋白質と交叉反応しないモノクロ
    ーナル抗体であって前記のモノクローナル抗体とは異る
    もの又はその誘導体と共にインキュベートし、そして前
    記抗体に結合した前記第２の抗体の量を酵素基質反応に
    より測定する、ことを特徴とする方法。
  59. 【請求項５９】 ヒトマクロファージ遊走阻止因子関連
    ペプチドの免疫学的測定のためのキットであって、ＭＲ
    Ｐ−８に対して特異的であり且つＭＲＰ−１４及び他の
    蛋白質と交叉反応しないモノクローナル抗体及び／又は
    その誘導体、並びに場合によっては他のモノクローナル
    抗体もしくはポリクローナル抗体及び／又は付加物を含
    んで成るキット。
  60. 【請求項６０】 慢性炎症状態の診断方法において、Ｍ
    ＲＰ−８に対して特異的であり且つＭＲＰ−１４及び他
    の蛋白質と交叉反応しないモノクローナル抗体又はその
    誘導体を使用して組織中のＭＲＰ−８の発現の量及びパ
    ターンを測定することを特徴とする方法。
  61. 【請求項６１】 嚢胞性線維症の診断方法において、Ｍ
    ＲＰ−８に対して特異的であり且つＭＲＰ−１４及び他
    の蛋白質と交叉反応しないモノクローナル抗体又はその
    誘導体を用いて、嚢胞性線維症においてホモ接合性又は
    ヘテロ接合性であると予想される、それ以外では健康な
    対象者の血漿サンプル中のＭＲＰ−８の量を測定するこ
    とを特徴とする方法。
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