JP3104187B2 - インターフエロン―ガンマ結合蛋白 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、インターフェロン−ガンマ（IFN−ガン
マ）結合活性を有する蛋白、それと実質的に相同性を有
する蛋白もしくはその断片、これらの蛋白もしくはその
断片をコードするDNA分子特にcDNA分子、及び該CDNAク
ローンの単離に用いるヒトIFN−ガンマレセプターに対
するモノクローナル抗体に関する。更に本発明は、該ヒ
トIFN−ガンマ結合蛋白のクローニング、組換えDNA技術
によるその製造法、及びそれを含有する薬学的組成物に
関する。

インターフェロン−ガンマは活性化Ｔ−リンパ球によ
って産生されるリンホカインの１種であり、抗ウィルス
活性、成長抑制活性、及び各種の細胞における免疫調節
活性を示し、臨床的に重要な価値を有するものである。
しかしながら、IFN−ガンマは、ポジティブな生物学的
活性とともに、望ましくない効果も有し自己免疫疾患の
進行に関与していることが明らかにされている。また、
IFN−ガンマは若年糖尿病患者においても関与してお
り、多発性筋炎患者の筋肉切除組織中にも存在している
ことが明らかにされている。更には、多発性硬化症、乾
癬などの自己免疫疾患の悪化にIFN−ガンマが関与して
いることも明らかにされている。

従って、内因的に過剰にIFN−ガンマが形成された場
合あるいは過剰に外因的に投与された場合のIFN−ガン
マの望ましくない活性もしくは効果を除去しあるいは中
和する方法、特にIFN−ガンマの作用をブロックする方
法を開発することが、自己免疫疾患の進行をコントロー
ルするために特に望まれている。

本件特許出願と同じ出願人による欧州特許出願No.240
975明細書には、本件発明とは相違する細胞からIFN−ガ
ンマ固定化カラムを用いたアフィニティークロマトグラ
フィーによって本件発明とは相違する分子量範囲を有す
るIFN−ガンマレセプターが単離されたことが記載され
ている。更に、IFN−ガンマレセプターに対するポリク
ローナル抗体についても記載されている。

本発明は、ヒトIFN−ガンマレセプター、特にWISH H
eLa,FS−11細胞などの非免疫細胞の分子量約90,000Daの
IFN−ガンマレセプターに対するモノクローナル抗体に
関する。

更に本発明は、IFN−ガンマ結合活性を有し第９図ま
たは第13図に示すアミノ酸配列を含む蛋白、それと実質
的に相同性を有する蛋白あるいはその断片に関する。こ
れらのアミノ酸配列が蛋白分子の全配列の１部であるよ
り大きな蛋白、及びこれらのアミノ酸配列の１部のみを
本質的に有する断片も本発明に包含される。相同性蛋白
及びその断片も、それらが本発明の蛋白と同じ生物学的
活性を示す限り、本発明に包含される。

更に本発明は、本発明の蛋白もしくはその断片をコー
ドするヌクレオチド配列を含む組換えDNA分子もしくはc
DNA分子を含有するDNA分子；それを含む複製可能な発現
ビークル並びにそれで形質転換された宿主細胞；及び該
形質転換細胞を適当な培養培地中で培養し、該細胞ある
いは培養上清から蛋白もしくはその断片を採取すること
からなる蛋白もしくはその断片の製造法に関する。

本発明によれば、ヒトIFN−ガンマレセプターに対す
るモノクローナル抗体により、ヒトIFN−ガンマ結合蛋
白の１部をコードするcDNAクローンが単離される。この
モノクローナル抗体は、ヒト細胞のIFN−ガンマレセプ
ターに¹²⁵I−IFN−ガンマが結合するのをブロックする
能力を有する。ラムダgt1のcDNAHeLa発現ライブラリー
をこのモノクローナル抗体でスクリーニングし、10⁶個
の組換え体から５個のポジティブクローンを得た。この
クローンのうち４個は0.5Kbの挿入断片を有し、他の１
個は0.7kbの挿入断片を有していた。サザンブロット分
析により分析した所、0.5Kb断片はクロスハイブリダイ
スしたが、0.7Kbクローンとはハイブリダイズしなかっ
た。これらの挿入断片をBluescriptプラスミドベクター
に連結し、E.coli TG1コンピテントバクテリアに導入
した。２つのクローンの挿入断片（0.5Kb及び0.7Kb断
片）を含有するコロニーを生育せしめ、次いでヘルパー
ウィルスにより１本鎖DNAを得、これを配列決定に用い
た。１つのオープンリーディングフレームが見出された
が、公知のDNA配列に対する相同性は見られなかった。
第９図に0.5Kb断片のクローン15−21−１のヌクレオチ
ド配列が示されており、第10図に0.7Kb断片のクローン1
8−４−３の相補性DNA鎖のヌクレオチド配列が示されて
いる。

挿入断片によってコードされる蛋白を単離しその特性
を調べた。溶原体を調製し、誘導された蛋白を抗IFN−
ガンマレセプター免疫吸着剤により精製した。溶出分画
中の蛋白のサイズを、SDS−PAGE、銀染色次いでウェス
タンブロット分析により求めた。0.5Kbクローンから得
られる融合蛋白は約130,000のMr（β−ガラクトシダー
ゼのMr＝114,000）を示した。この融合蛋白への¹²⁵I−I
FN−ガンマの結合が溶液中で観察され、また非ラベル化
IFN−ガンマを過剰に加えることによってこの結合が抑
制された。β−ガラクトシダーゼ単独ではこのような結
合は観察されなかった。融合蛋白に対する¹²⁵I−IFN−
ガンマの交差実験、それに続く免疫沈降により、SDS−P
AGE及びオートラジオグラフィーで調べた所、Mr155,000
の複合体が形成された（IFN−ガンマのMrは25,000）。
これにより、0.5Kb cDNA断片はヒトIFN−ガンマ結合蛋
白の結合リガンド領域の少なくとも１部をコードしてい
ることが判明した。

0.5Kb及び0.7Kb挿入断片からプローブを調製し、ラム
ダgt11のヒト胎盤cDNAライブラリーについてスクリーニ
ングした。10⁶個の組換え体から10個のポジティブクロ
ーンを得た。そのうちの９個が1.15−2.3Kbのサイズの
挿入断片を有し、これらすべては交差ハイブリダイスし
た。他の１個のクローンは1.8Kbのサイズの挿入断片を
有しそれ自身とのみハイブリダイズした。1.8Kbと2.3Kb
の２つのクローンを発現ビークルに連結し、バクテリア
細胞にトランスフェクトし、それらによってコードされ
る蛋白を発現させた。

他のプローブを本発明のcDNA配列から調製し、結腸、
肝、腎ライブラリーなどのcDNAライブリーのスクリーニ
ングに用い、あるいはストリンジェント条件下でのコロ
ニーハイブリダイゼーションなどの公知の方法による本
発明の蛋白をコードするゲノムDNAの単離に用いた。次
いで、ポジティブクローンを、周知の方法により適当に
構築された発現ベクターに挿入した。２本鎖cDNAを、ホ
モポリマーテーリング、あるいは合成DNAリンカーもし
くはブラント末端リゲーションを用いた制限酵素連結に
より、プラスミドベクターに連結した。DNAリガーゼを
用いてDNA分子を連結させ、またアルカリホスファター
ゼ処理によって望ましくない連結を回避した。

目的とする蛋白を発現できるためには、発現ベクター
中には、転写調節及び翻訳調節情報を含む特定のヌクレ
オチド配列が、遺伝子を発現し目的とする蛋白を産生す
るように目的とする蛋白をコードするDNAに連結されて
いなければならない。転写を誘導するためにはプロモー
ターが上流に存在しなければならない。プロモーターに
は、強力プロモーター、弱いプロモーターなどの種々の
効率を有する各種のプロモーターがある。

本発明の蛋白またはその断片をコードするヌクレオチ
ド配列及びその上流にシグナルペプチドのヌクレオチド
配列並びに作動可能なように連結した転写及び翻訳調節
シグナルを含むDNA分子を、目的とする遺伝子配列を宿
主細胞のクロモゾームに組み込むことのできるベクター
に挿入する。そのクロモゾームにDNAが安定に組み込ま
れた宿主細胞は、当該発現ベクターを含む宿主細胞の選
択を可能にする１つもしくはそれ以上のマーカーを当該
発現ベクター中に導入することによって選択することが
できる。

好ましい態様においては、DNA分子は宿主中にて自己
複製可能なプラスミドベクターもしくはウィルスベクタ
ー中に挿入される。特定のウィルスベクターまたはプラ
スミドベクターを選択する際の重要な要素としては、当
該ベクターを含有する宿主が当該ベクターを含有してい
ない宿主から容易に区別できて選択できること；宿主中
での当該ベクターのコピー数が高いこと；異なる宿主間
において当該ベクターが複製可能であることなどが挙げ
られる。目的とする構成を有するベクターまたはDNA配
列が発現用として調製されると、次いで、適当な各種の
手段、例えば形質転換、トランスフェクション、接合、
プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リン酸
カルシウム沈殿、直接注入などの手段によって適当な宿
主細胞中に導入される。

本発明で用いることのできる宿主細胞は原核細胞また
は真核細胞のいずれでもよい。好ましい原核宿主細胞と
しては、E.coliなどのバクテリアが挙げられる。このよ
うな場合には、産生される蛋白はグリコシル化されてい
ない。また原核宿主細胞は、発現プラスミド中のレプリ
コーン及びコントロール配列と親和性を有するものでな
ければならない。

好ましい真核宿主細胞としては、ヒト細胞、サル細
胞、マウス細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞など
の哺乳動物細胞が挙げられる。これらの細胞は、翻訳後
の蛋白分子を修正することが出来、例えば正しい部位で
のグリコシレーション化、正しいホールディングなどが
行なわれる。酵母及び昆虫細胞によってもグリコシレー
ション化などの翻訳後の修正が行なわれる。強力プロモ
ーター配列及び酵母での目的蛋白の産生に用いることの
できる高コピー数プラスミドなどを利用した多くの組換
えDNA技術が知られている。酵母は、クローン化哺乳動
物遺伝子のリーダー配列を認識し、リーダー配列を有す
るペプチド（即ち、プレペプチド）を分泌することがで
きる。

ベクターの導入後に、ベクターを含有する細胞のみが
生育する選択培地中で宿主細胞を生育させる。クローン
化遺伝子の発現により目的とする蛋白もしくはその断片
が産生される。次いで、抽出、沈降、クロマトグラフィ
ー、電気泳動などの慣用的方法により発現蛋白を単離し
精製することができる。

本発明により提供されるヒトIFN−ガンマレセプター
に対するモノクローナル抗体は、該レセプターの精製に
有用であり、また本発明のcDNAクローンの単離に有用で
ある。このモノクローナル抗体はIFN−ガンマに結合し
てその生物学的活性を抑制する。従って、本発明のモノ
クローナル抗体は、IFN−ガンマの生物学的活性を抑制
することについて報告されていない従来公知のモノクロ
ーナル抗体［Aguet,M.and Merlin,G.（1987）,J.Exp.Me
d.165,pp.988−999］とは相違する。

本発明のヒトIFN−ガンマレセプターに対するモノク
ローナル抗体は、リガンドアフィニティクロマトグラフ
ィーによって溶解胎盤膜から精製されるレセプター調製
物をマウスに注射することによって誘導される。HeLa細
胞のレセプターに¹²⁵I−IFN−ガンマが結合するのを４
℃でブロックする３つのモノクローナル抗体が同定され
た。このうちの１つの抗体が、IFN−ガンマの生物学的
活性、例えば抗ウィルス活性、HLA−DR表面抗原誘導
能、HK−細胞仲介細胞毒性に対する保護作用などの生物
学的活性をブロックした。この抗体は37℃で細胞に対す
るより高い結合能を示し、他の２つの抗体に比べて、過
剰のIFN−ガンマを加えた場合でもIFN−ガンマとより置
換しにくかった。溶解胎盤粗調製物のイムノアフィニテ
ィークロマトグラフィーにより、分子量約88,000の精製
レセプターが得られた。この精製レセプターは、溶液中
において¹²⁵I−IFN−ガンマとの結合能を保持してい
た。

本発明を以下の例により説明するがこれらに限定され
るものではない。

例１ マウスの免疫化及び細胞融合 胎盤膜から得られるヒトIFN−ガンマレセプター調製
物をBALB/cマウスに皮下注射して免疫した。この調製物
は、IFN−ガンマを結合したAffigel 10、次いでSephacr
yl S−300［Novick,D.et al（1987）J.Biol.Chem.262,
p.8483］で精製し、最後に抗IFN−ガンマモノクローナ
ル抗体［Novick,D.et al（1983）EMBO J.2,p.1527］を
結合したアガロースビーズに吸着させた。完全フロイン
トアジュバントとともに２回注射し、他の２回はアジュ
バントなしで１週間毎に注射した。最後のブーストは融
合を行なう４日前に腹腔内投与した。それぞれのマウス
に、１回当り〜30μｇの調製物を投与した。血清につい
て、¹²⁵I−IFN−ガンマのHeLa細胞への結合をブロック
する能力をチェックした。このアッセイで1:500の力価
を示すマウスの脾細胞（200×10⁶）をNSO/1ミエローマ
細胞（４×10⁶）と融合した。1mMピルベート、2mMグル
タミン、ペニシリン（10ユニット/ml）、ストレプトマ
イシン20μg/ml、フンギゾン250μg/ml及び10％牛血清
（FBS）を添加しHATを含有するダルベッコの修正イーグ
ル培地でハイブリドーマを選択した。抗IFN−ガンマレ
セプター抗体をを分泌するハイブリドーマを限界希釈法
によりクローン化した。

例２ ハイブリドーマ上清のスクリーニング ハイブリドーマの上清について、¹²⁵I−IFN−ガンマ
のHeLa細胞への結合競争抑制及びWISH細胞でのIFN−ガ
ンマの抗ウィルス活性の中和作用により、抗IFN−ガン
マレセプター抗体の存在をテストした。

（ａ）抗IFN−ガンマレセプター抗体による¹²⁵I−IFN−
ガンマの細胞への結合の抑制 デキサメタゾン（10^-6M）存在下の96−ウェルマイク
ロプレート（50,000セル／ウェル）にHeLa細胞（ATCC
H229,CCL2.1）を接種した。24時間後に培地を除去し、C
a²⁺,Ng²⁺（PBS）及びナトリウムアジド（0.02％）を含
む氷冷リン酸緩衝化生理食塩水で細胞を洗浄した。ハイ
ブリドーマ上清（50μl/ウェル）を加え、プレートを４
℃で２時間放置した。２％FBS及び0.02％ナトリウムア
ジド（PBS−２％）を含む氷冷PBSで２回洗浄後、CHO細
胞からアフィニティクロマトグラフィーによって精製さ
れクロラミン−Ｔ法によってラベル化された¹²⁵I−IFN
−ガンマをそれぞれのウェルに加え（50μｌ、200,000c
pm）、プレートを４℃で２時間放置した。次いでプレー
トをPBS2％で４回洗浄し、NaOH（0.75M,125μｌ）とと
もに採取し、それぞれのウェルの内容物についてカウン
トした。

24−ウェルプレート（Costar）中でHeLa細胞に対する
結合競争抑制アッセイを実施した（250,000セル／ウェ
ル、デキサメタゾンなし）。用いた容量［ハイブリドー
マ上清希釈液250μｌ、¹²⁵I−IFN−ガンマ（200,000cp
m）250μｌ］以外は、96−ウェルの場合と同様にしてア
ッセイを実施した。トリプシン（250μ）とともに細
胞を採取し、ウェルをPBS（２×150μ）で洗浄し、細
胞と洗浄液を集め、カウントした。

（ｂ）IFN−ガンマ活性の中和 96−ウェルプレート中のWISH細胞（ATCC CCL25）の
培養液にハイブリドーマ上清（50μ）を加え、37℃で
２時間インキュベートし、次いでIFN−ガンマ（20V/m
l、50μ）を加えた。37℃で１晩プレートをインキュ
ベートし、水疱性口内炎ウィルスを加え、更にプレート
を１晩インキュベートし、クリスタルバイオレットによ
る染色法［Rubinstein et al.（1981）J.Virol.37,p.75
5］により細胞変性効果の程度を測定した。中和力価測
定用として、中和アッセイを行なう前にハイブリドーマ
上清（または腹水）を希釈した。IFN−ガンマの１ユニ
ットを中和するに十分な抗体の量を中和１ユニットと定
義した。全てのアッセイにおいて、IFN−ガンマGg23−9
01−503のN1H対照スタンダートを用いた。

例３ ハイブリドーマのスクリーニング ハイブリドーマ上清について、上記したようにして抗
IFN−ガンマレセプター抗体の存在をスクリーニングし
た。スクリーニングした468個のハイブリドーマのうち
３個のハイブリドーマ上清が¹²⁵I−IFN−カンマのHeLa
の細胞への結合を抑制し、そのうちの１個は中和アッセ
イについてもポジティブであった。このポジティブクロ
ーンを更に生育させてサブクローン化し、次いでマウス
に注射して腹水を得た。マウスでの免疫応答、組織培養
液及び腹水液中での抗体産生及び抗体スクリーニング
は、結合アッセイ（表Ｉ）及び中和アッセイ（表II）に
よって行なった。

ヒトIFN−ガンマレセプターに対する３個のモノクロ
ーナル抗体のうち、抗体No.177とその全てのサブクロー
ンは、溶解IFN−ガンマレセプターに特異的に結合し、
¹²⁵I−IFN−ガンマの細胞への結合を抑制し（４℃）、I
FN−ガンマの抗ウィルス活性及びIFN−ガンマによるHLA
−DR誘導をブロックし、IFN−ガンマによるNK−CMCに対
する耐性誘導を阻止することが明らかになった。他の２
つのモノクローナル抗体（No.37とNo.183）は¹²⁵I−IFN
−ガンマの細胞への結合を４℃で抑制したが、IFN−ガ
ンマの生物学的活性をブロックすることはできなかっ
た。全ての生物学的活性は37℃で測定した。レセプター
への結合は生物学的活性にとって必須であると考えられ
るので、抗体No.177が他の２つの抗体に比べてレセプタ
ーに対してより高い親和性を有しているか否かをテスト
し、またIFN−ガンマが37℃でレセプターに結合してい
る抗体を追い出すことができるか否かをテストした。

他の２つの抗体は過剰なIFN−ガンマを加えることに
よって細胞表面から追い出されたが、抗体No.177の場合
にはそのようなことは観察されなかった。IFN−ガンマ
の非存在下に細胞とインキュベートした場合には、いず
れの抗体も抗ウィルス活性またはHLA−DR誘導活性を示
さなかったことは注目に値する。

ハイブリドーマ177からサブクローン化されたハイブ
リドーマ177−１を1988年11月14日にフランスのパリのC
ollection Nationale de Cultures de Microorganismes
（CNCM）に寄託しCNCM Ｉ−814の受託番号が付与され
た。

例４ 抗IFN−ガンマレセプターモノクローナル抗体の細胞へ
の結合 ３つのモノクローナル抗体No.37,No.177及びNo.183が
４℃で¹²⁵I−IFN−ガンマの細胞への結合を抑制した。
例２（ａ）で記載したと同様にしてテストを実施した。
結果は表Ｉに示した。しかしながら、抗体No.177−１の
みがIFN−ガンマの生物学的活性を抑制した。従って、
結合能の比較実験はインターナリゼーションを防ぐため
にナトリウムアジドの存在下で37℃で実施した。抗体17
7−１が、他の２つの抗体に比べて有意に高い細胞に対
する結合能を示した。これは第１図に示されており、第
１図では、NaN₃の存在下で37℃でHeLa細胞をモノクロー
ナル抗体No.37−１ No.183〜２ 及びNo.177−１ とインキュベートし、次いで¹²⁵I−ヤギ抗マウス血清を
加えたテストの結果が示されている。抗IFN−ガンマレ
セプター抗体非存在下でのバックグランド カウント
（200cpm）は差し引かれている。４℃での各種抗体の20
μg/mlとの結合がよく示されている。

続いてIFN−ガンマを添加することによって、細胞に
結合していた抗体No.37−１とNo.183−２とが有意に追
い出され、中和抗体No.177−１のみがほんのわずかしか
追い出されなかった。37℃でのIFN−ガンマによる抗IFN
−ガンマレセプターモノクローナル抗体の結合抑制を第
２図に示した。第２図では、各種濃度のIFN−ガンマと
ともにHeLa細胞を抗体No.37−１ No.183−２ またはNo.177−１ とインキュベートし、次いで細胞を洗浄し、更に¹²⁵I−
ヤギ抗マウス血清でインキュベートしてテストした結果
が示されている。最大結合は3500cpmであった。抗IFN−
ガンマレセプターモノクローナル抗体非存在下でのバッ
クグランドカウント（250cpm）は差し引いた。

例５ モノクローナル抗体による抗ウィルス活性及びIFN−ガ
ンマ誘導HLA−DR発現のブロック 抗体No.177の全てのサブクローンはIFN−ガンマの活
性をブロックした。各種サブクローンの中和力価は4000
−30,000ユニット/mlであった。他の２つの抗体につい
てはこのようなブロック活性は観察されなかった。結果
は表IIに示した。コントロール実験ではこれらの抗体の
いずれもがIFN−ガンマの抗ウィルス活性をブロックし
なかった。抗体のいずれもが、細胞において抗ウィルス
状態を誘導する能力を本来有していなかった。抗IFN−
ガンマレセプターモノクローナル抗体について、IFN−
ガンマによるHeLa細胞でのNLA−DR抗原誘導のブロック
能をテストした。抗体No.177−１ が高いブロック活性を示し（第３図）、1:20,000希釈腹
水液で50％抑制が観察された。抗体No.37−１ 及びNo.183−２ はわずかのブロック活性しか示さなかった（第３図）。
IFN−ガンマの非存在下でHeLa細胞と抗体とをインキュ
ベートした場合には、いずれの抗体の場合にもHLA−DR
抗原は誘導されなかった。ポジティブコントロールとし
て、Novick,D.et al（1983）EMBO J.2,p.1527に記載さ
れた抗IFN−ガンマモノクローナル抗体No.166−５ を用いた。この抗体は、IFN−ガンマ誘導HLA−DR発現を
抑制したが、Novick,D.et al（1982）J.Immunol.129,p.
2244に記載された抗IFN−ガンマモノクローナル抗体No.
7ではこのような抑制は観察されなかった（示されてい
ない）。抗体の非存在下でのHLA−DRの最大誘導は2700
±100cpmであった。IFNガンマ非存在下での基本レベル
は200cpmであり、この値は全ての測定値から差し引い
た。

抗IFN−ガンマ レセプターモノクローナル抗体によ
るIFN−ガンマ誘導クラスII MHC抗原（HLA−DR）の抑制
を次のようにしてテストした。HeLa細胞（５×10⁴セル
／ウェル）を96−ウェルプレートに接種し、RPM11640培
地（100μ、１％FBS含有、RPMI−１％）中で37℃で３
時間インキュベートした。各種のモノクローナル抗体を
一連の２倍希釈液として加え（50μRPMI−１％）、更
にプレートを37℃で３時間インキュベートした。次いで
IFN−ガンマ（60ユニット/ml、50μ RPMI−１％）を
加え、プレートを37℃で40時間インキュベートした。次
いでプレートを冷PBS（３×100μ）で洗浄し、ホルム
アルデヒド（3.5％PBS、100μ）で０℃で30分間固定
化した。次いでプレートを冷PBSでリンスし、BSAの溶液
（100μ、5mM Tris−HCl、150mM NaCl、pH7.5の0.5
％溶液）とともに０℃で30分間インキュベートした。次
いでプレートを冷PBSでリンスし、抗HLA−DRモノクロー
ナル抗体（0.1％BSA及び0.1％ナトリウムアジドを含有
する50μRPMI−1640培地で1:500に希釈したＬ−243腹
水液）とともに室温で１時間インキュベートした。プレ
ートをPBSでリンスし、¹²⁵I−プロティンＡ（0.1％BSA
及び0.1％ナトリウムアジドを含有する50μRPMI−164
0培地を含むウェル１個当り10⁵cpm）とともに室温で30
分間インキュベートした。0.05％Tween20を含むPBS（３
×200μ）で過剰の放射活性物質を除去した。次いでN
aOH（0.75Nm 200μ）で細胞を溶解しカウントした。

37℃での抗IFN−ガンマレセプターモノクローナル抗
体の細胞への結合及びIFN−ガンマによる競争結合を次
のようにして調べた。HeLa細胞を24−ウエルプレートに
接種し、37℃で24時間生育させた。培地を除去し、各種
濃度の抗IFN−ガンマレセプターモノクローナル抗体（1
0％FBS及び0.04％ナトリウムアジドを含有するRPMI培地
溶液250μとして）をIFN−ガンマ（０−６μg/ml）と
ともに加え、プレートを３時間インキュベートした。PB
S−２％で２回洗浄後、¹²⁵I−ヤギ抗マウス血清（250μ
、100,000cpm）を加えた。プレートを室温で５時間放
置し、PBS−２％（３×1ml）で洗浄し、トリプシンとと
もに採取してカウントした。

例６ 抗IFN−ガンマレセプターモノクローナル抗体によるIFN
−ガンマ誘導抗NK効果の抑制 抗体No.177−１から調製したＦ（ab′）_２フラグメン
トとターゲット細胞Ｖ−937（ATCC CRL1593）とをIFN
−ガンマとともにインキュベーションすることによっ
て、IFN−ガンマによって誘導されるナチュラルキラー
細胞仲介細胞毒性（NK−CMC）に対する抵抗性が抑制さ
れた。

この抑制効果は用量依存性であって、エフェクター細
胞（Ｅ）とターゲット細胞（Ｔ）との比（E:T）が２、
３種の値の時に明らかな抑制効果を示した。抗体No.37
−１またはそのＦ（ab′）_２フラグメントとターゲット
細胞とをインキュベートした時にはこのような抑制効果
は観察されなかった。NKエフェクター細胞をIFN−アル
ファとともにインキュベーションして活性化した場合に
も、抗IFN−ガンマレセプターモノクローナル抗体No.17
7−１によりIFN−ガンマ処理ターゲット細胞Ｕ−937が
同程度に抑制された（データは示されていない）。IFN
−ガンマ誘導抗NK効果の抗IFN−ガンマレセプターモノ
クローナル抗体による抑制効果の結果を第４図に示し
た。第４図では、Ｕ−937細胞を抗体No.37−１ またはNo.177−１ とプレインキュベートし、あるいは抗体なしでプレイン
キュベートし 次いでIFN−ガンマを加えた。コントロール細胞はIFN−
ガンマで処理しなかった 次いで細胞を［⁵¹Cr］−Na₂CrO₄でラベル化し、各種の
割合い（E:T）でエフェクター細胞と混合した。自然に
細胞毒性が６％以下になった。

NK細胞仲介細胞毒性に対するIFN−ガンマ誘導抵抗性
の抗IFN−ガンマレセプターモノクローナル抗体による
ブロック効果を以下のようにして調べた。Ｕ−937ター
ゲット（Ｔ）細胞（3.5×10⁵）を抗IFN−ガンマレセプ
ターモノクローナル抗体（10％FBS含有RPMI培地750μ
中に50−100ngの量）とともに、あるいは抗体なしで37
℃で３時間プレインキュベートした。IFN−ガンマ（250
μ培地中に1000ユニットの量）を加え、更に９時間イ
ンキュベートした。次いで細胞を⁵¹［Cr］Na₂CrO₄（0.5
mCi,1.5hr）でラベル化し、洗浄して、次いでエフェク
ター（Ｅ）細胞（ナイロンウール非粘着末梢血単核細胞
100μ／ウェル）と各種の割合い（E:T）で37℃で４時
間インキュベートした（10⁴セル、50μ／ウェル）。
次いで細胞をスピンし上清をカウント（Ｃ）した。ター
ゲット細胞単独の上清中の自然レリース（Ｓ）（トータ
ルcpmの６％まで）を測定し、ラベル化ターゲット細胞
へTriton X−100（１％,100μ）を加えてトータルcpm
（Ｔ）を測定した。細胞毒性％を以下の式から求めた。

例７ 免疫吸着剤の調製及び胎盤IFN−ガンマレセプター調製
物のイムノアフィニティークロマトグラフィー 本発明のハイブリドーマ（例えばハイブリドーマ177
または183）から分泌されたモノクローナル抗体を投与
したマウスの腹水のイムノグロブリン分画から免疫吸着
剤を調製した。腹水液を硫酸アンモニウム（最終濃度50
％飽和）で４℃で沈殿せしめた。遠心により沈殿物を集
め、水に再溶解し、生理食塩水に対して透析した。約10
mgのイムノグロブリンをポリアクリルヒドラジドアガロ
ース（Biomaker）に結合した。

溶解した胎盤膜調製物を４℃で流速0.2ml/minで抗体
カラムに付した。カラムは0.1％Triton Ｘ−100（40m
l）を含むPBSで洗浄し、0.05％Triton Ｘ−100及び0.0
2％ナトリウムアジドを含有するクエン酸（50mM,pH2）
を溶出した。溶出分画をHerpesバッファー（1M,pH8.5）
で中和し４℃に保持した。カラムを放射ラベル化IFN−
ガンマの結合によりモニターし、ワンステップにより42
50倍に精製された（表III）。精製されたレセプター調
製物を還元条件下で7.5％ポリアクリルアミドゲルを用
いたSDS−PAGEで分析した所、分子量約88,000に対応す
る主要バンドが表われた。この精製IFN−ガンマレセプ
ターはIFN−ガンマ結合活性を保持していた。

イムノアフィニティークロマトグラフィーにて精製し
たIFN−ガンマレセプターのSDS−PAGEの分析結果を第５
図に示した。第５図においては、溶解した胎盤膜レセプ
ターのアリコート（レーンC,0.9μｇ）、イムノアフィ
ニティークロマトグラフィーにより精製したレセプター
（レーンB,0.6μｇ）、サンプル培地単独（レーンＤ）
及び分子量マーカー（レーンA,ホスホリラーゼ94,000;
牛血清アルブミン67,000;オボアルブミン43,000及びカ
ルボニックヒドラーゼ30,000）を、β−メルカプトエタ
ノールの存在下でポリアクリルアミドゲル中に電気泳動
した。銀染色により蛋白バンドを視覚化した。

レセプターを精製する際のモニターとして用いたレセ
プターへの放射ラベル化IFN−ガンマの結合は以下のよ
うにして調べた。各種の精製工程から得たレセプターの
アリコート（20−40μ）を、0.1％BSA含有PBS（200μ
）中のラベル化IFN−ガンマ（100,000ユニット）とと
もにあるいはこのラベル化IFN−ガンマなしで、¹²⁵I−I
FN−ガンマ（250ユニット）と混合した。混合物を４℃
で２時間インキュベートし、ラビットIGg（0.1％のPBS
溶液,0.5ml）を加え、次いでPEG−8000（22％のPBS溶
液、0.5ml）を加えた。混合物を４℃で10分間放置し、
次いで0.45μフィルター（25mm HAWP、Millipore）に
通した。濾液を冷PEG−8000溶液（８％PBS溶液）で洗浄
してカウントした。過剰の非ラベル化IFN−ガンマの存
在下でバックグランドカウントを求め、これを差し引い
た。レセプターへのIFN−ガンマの結合は¹²⁵I−IFN−ガ
ンマのpmole数で示した。

例８ ウェスタンブロットによる分析 アフィニティークロマトグラフィーによって精製した
レセプターのサンプル（500ng/スロット）を還元条件下
でSDS−PAGEにより分析し、60ボルト、250mAで、25mM
Tris HCl/10mMグリシンバッファー（pH8.5）/20％メタ
ノール中で４℃で２時間ニトロセルロースシート（BA
85,Schleicher and Schuell）上にエレクトロブロット
した。エレクトロブロットの後、ニトロセルロースシー
トを、0.05％Tween−20と0.02％ナトリウム アジドを
含むPBS（ブロックバッファー）に溶解した５％非脂肪
ミルクとともに１晩インキュベートした。次いでニトロ
セルロースシートを、３つの抗IFN−ガンマレセプター
モノクローナル抗体（ブロックバッファーで1:150に希
釈した腹水液のイムノグロブリン分画10mg/ml）の混合
物とともに室温で２時間インキュベートした。0.05％Tw
een−20のPBS溶液で洗浄後、ニトロセルロースシート
を、¹²⁵I−ヤギ抗マウス血清（0.7×10⁶cpm/ml,ブロッ
クバッファー溶液）とともに室温で３時間インキュベー
トした。次いでシートを洗浄し、乾燥してオートラジオ
グラフィーに付した。

ロードフラクション、流出液及び溶出液のウェスタン
ブロット分析を実施した。溶解胎盤膜を含むロードフラ
クションのウエスタン ブロット分析の結果、分子量8
8,000の単一バンドが現われた。この胎盤膜調製物をイ
ムノアフィニティークロマトグラフィーに通した所、分
子量88,000のバンドは流出液中には検出されなかった。

例９ HeLa細胞cDNAライブラリーからの、IFN−ガンマ結合蛋
白をコードするcDNAクローンの単離 ラムダgt11のcDNA HeLaライブラリー（Clontech Lab
oratories,Inc.U.S.A.）から得た異なる挿入断片の１×
10⁶個の組換え体について、抗IFN−ガンマレセプターモ
ノクローナル抗体によりスクリーニングした。ファージ
をE.coli株Y1090に吸着させ、25,000p.f.u.の密度で9cm
ペトリ皿にプレートし、42℃で４時間生育せしめた。プ
レートを37℃にして30分後に、あらかじめ10mMイソプロ
ピルチオガラクトシダーゼ（IPTG）に浸漬しておいたニ
トロセルロースフィルターをプラーク上に置き、更に37
℃で６時間インキュベートし、その後第２のフィルター
を10時間適用した。

フィルターをマークし、10％低脂肪ミルク（１％）及
び0.05％Tween20を含むPBSにブロックのために室温で２
時間移した。２つのフィルターのセットを0.05％Tween2
0含有PBSで洗浄し、例３で得た抗IFN−ガンマレセプタ
ーモノクローナル抗体（好ましくは抗体177−1;ブロッ
ク溶液に20μg/mlで溶解した）とともに室温で３時間イ
ンキュベートした。フィルターをPBS−Tweenで５回洗浄
し、ポジティブクローンを¹²⁵I−ヤギ抗マウスＦ（ab）
_２（ブロック溶液７×10⁵cpm/ml）で同定し、４℃で１
晩インキュベートし、次いでPBS−Tweenでよく洗浄し
た。ポジティブクローンを、クロロホルム100μ含有1
mlTMG（10mT Tris−HCl,pH7.5,1mM MgSO₄、0.02％ゼ
ラチン）に取り、上記したと同様にしてファージを更に
サブクローン化した。第6A図にはcDNA HeLa発現ライブ
ラリーのスクリーニング結果が、第6B図にはポジティブ
クローンのサブクローニングが示されている。ポジティ
ブファージで感染した500mlE.coli 1088からDNAストッ
クを調製した。DNAはCsClグラジェント次いでフェノー
ル−クロロホルム抽出により精製した。

例10 HeLa細胞のcDNAライブラリーから単離したクローンの特
徴付け ポジティブcDNAクローンを含む精製したラムダgt11
DNAをEcoR Iで消化し、１％アガロースゲルでサイズ分
画した。４つのクローンが0.5Kbのサイズの挿入断片を
有し、１つのクローンが0.7Kbのサイズの挿入断片を有
していた。マルチプライムDNAラベルシステムキット（A
MERSHAM）を用いて、0.5Kbクローンの１つ（15−21−
１）及び0.7Kbクローン（18−４−３）からプローブを
調製した。この方法は、その長さにそって多くの部位で
変性テンプレートDNA上のDNA合成をプライムするために
ランダム配列ヘキサヌクレオチドを使用する方法である
［Feinberg A.P.and Vogelstein B.,DNA制限酵素断片を
ラベル化するための技術、Anal.Biochem.（1983）132:6
−13及び（1984）137:266］。上記したプローブを用い
たサザンブロッティングによりクローン間の交差ハイブ
リダイゼーションをチェックした。0.5Kbプローブは４
つの全ての0.5Kbクローンとハイブリダイズしたが0.7Kb
クローンとはハイブリダイズしなかった。0.7Kbプロー
ブは0.7Kbクローンとのみハイブリダイズした。

0.5Kbクローン15−21−１のEcoR I挿入断片をBluescr
iptベクター中でサブクローン化し、E.coli TG1コンピ
テントバクテリアに導入した。この形質転換バクテリア
を1988年11月14日に、フランスのパリのCollection Nat
ionale de Cultures de Microorganisms（C.N.C.M.）に
ブタベスト条約に基いて寄託し、受託番号C.N.C.M.I−8
15が付与された。

例11 DNAプローブによるヒト胎盤cDNAライブラリーのスクリ
ーニング ラムダgt11（Clontech Laboratories Inc.,U.S.A.）
のヒト胎盤cDNAライブラリーから得た１×10⁶個の組換
え体について、0.5Kb及び0.7Kbクローン（例10）から調
製した上記のDNAプローブを用いてスクリーニングし
た。ファージをE.coli株41088に吸着せしめ、25,000p.
f.uの密度で9cmペトリ皿にプレートし、37℃で１晩生育
させた。ニトロセルロースフィルターセットを上に置
き、DNA変性溶液を含むトレーに浸漬した。フィルター
を洗浄し、固定化し、次いでプレハイブリダイズして非
特異的部位が非ラベル化DNAによって飽和されるように
した。次いでフィルターを³²P−ラベル化プローブと67
℃でハイブリダイズさせ、洗浄し、次いでオートラジオ
グラフィーに付した。10個のポジティブクローンが得ら
れた。ポジティブクローンから得たDNAをCsCl次いでフ
ェノールクロロホルム抽出により精製した。

例12 ヒト胎盤cDNAライブラリーから単離したクローンの特徴
付け ポジティブcDNAクローンを含有する精製したラムダgt
11 DNAを、EcoR Iで消化し次いで１％アガロースゲル
でサイズ分画した。0.7Kbプローブによって単離された
クローンのうちの９個が1.15−2.3Kbのサイズの挿入断
片を有しており、これらはすべて交差ハイブリダイズし
た。一方、0.5Kbプローブによって単離されたクローン
のうちの１個が1.8Kbのサイズの挿入断片を有しそれ自
身とのみバイブリダイズした。交差ハイブリダイゼーシ
ョンはサザンブロット分析により行なった。

更に、制限酵素消化によってクローンの特徴付けを行
なった。1.8Kbフラグメント（No.39）を、第７図の制限
酵素地図に示したようにして制限酵素で切断した。ラム
ダgt11のEcoR I部位（左側末端から19.6Kb）から1.1Kb
離れた所にKpn I部位が見出された。ラムダgt11のEcoR
I部位から0.6Kbの所にSac I部位が見出された。1.8Kbフ
ラグメントをKpn Iで切断しゲルに付し0.5Kbのフラグメ
ント（15−21−１）をプローブとして用いたサザンブロ
ット分析から、この0.5KbフラグメントはそのKpn I部位
がラムダgt11の右側末端の近くに来るように位置してい
ることが推定された。

2.3Kbフラグメント（No.76）を、第８図の制限地図に
示したようにして制限酵素で切断した。2.3Kb挿入断片
の中間にSal部位が見出された。ラムダgt11のEcoR I部
位（右側末端から19.6Kb）の直ぐ近くにXba I部位が見
出された。

例13 クローンの配列決定 CsClラジエントによって精製された0.5Kb,0.7kb,1.8K
b及び2.3KbポジティブクローンのDNAをEcoR Iで切断し
た。Stratagene Cloning System（San Diego,Californi
a）のBluescripプラスミドベクターのDNAをEcoR Iによ
って同様に切断し、次いでデホスホリル化し分離用アガ
ロースゲルに付した。フェノール−クロロホルム抽出に
よりゲルからDNAバンドを抽出した。クローンとベクタ
ーの両者がT4リガーゼによって連結できるようになっ
た。連結されたベクターを用いてE.coli（TG1）コンピ
テントバクテリアを形質転換した。４℃でこのバクテリ
アにベクターを加え、熱ショック（42℃）を与え、氷に
移し、次いで室温更に37℃にした。最後にバクテリアを
LBアンピシリン（Amp）上にプレートした。コロニーを
採取し、LB＋Amp中で生育させた。配列決定用に以下の
ようにして１本鎖DNAを調製した。連結ベクターで形質
転換されたE.coli TG1バクテリアを2T培地及びアンピ
シリン中で生育し、次いでヘルパーウィルスを加えた。
ポリエチレングリコールでDNAを沈殿させ、フェノール
−クロロホルムで抽出した。最後に、DNAをTris−EDTA
に懸濁させて、Sequence Kit（USB）による配列決定用
に供した。第９図に、0.5KbcDNAセグメンのヌクレオチ
ド配列とその翻訳アミノ酸配列が示されている。第10図
に、0.7Kb cDNAセグメントの相補性鎖とその翻訳アミノ
酸配列が示されている。第11図に、1.8Kb cDNAセグメン
トの２つの部分ヌクレオチド配列及びそれらの翻訳アミ
ノ酸配列が示されている。第12図に、2.3Kb cDNAの部分
ヌクレオチド配列が示されている。第13図にその部分翻
訳アミノ酸配列が示されている。

例14 溶原体の蛋白溶解物のHeLa細胞からの分離 DNA Cloning,A Practical Approach,Vol.1.Ch.2.Ed.
D.M.Glover,IRLプレスに記載されている技術を用いた。

（１）E.coli Y1089でのラムダgt11組換え溶原体の作
成： E.coli Y1089細胞を飽和するまで生育させ、上記し
た0.5Kbクローン（15−21−１）を含有するラムダgt11
組換えファージで32℃で感染させた。細胞をプレートし
32℃で感染させた。細胞をプレートし32℃でインキュベ
ートした（この温度で、温度感受性ファージレセプター
は機能する）。シングルコロニーについて、42℃で温度
感受性をテストした。シングルコロニーから得た細胞を
２つのプレートにスポットした。１つのプレートを42℃
でインキュベートし、他のプレートは32℃でインキュベ
ートした。32℃で生育するが42℃では生育しないコロニ
ーが溶原体（lysogen）である。

（２）ラムダgt11組換え溶原体からの粗溶解物の調製： E.coli Y108組換え溶原体のシングルコロニー（15−
21−１）をＬ培地に接種し、32℃で生育させた。培養液
の光学密度で600nmになった時に、温度を急激に42℃ま
で上昇させ、42℃で20分間インキュベートした。次いで
終濃度10mMでIPTGを加え、37℃で75分間インキュベート
した。遠心により細胞を採取し、蛋白バッファー（10mM
Hepes,150mM NaCl,0.1％Triton X−100,1mM PMSF及
び20TIアプロチニン）に懸濁し、液体窒素で凍結した。
最初に溶融させた後に、終濃度0.3mg/mlでライソザイム
を加え、濃濃度５−10μg/mlでDNaseを加えた。急激な
溶融と凍結を３回繰り返し、溶原体の完全な溶解物を得
た。得られる粗抽出物をスピンしてイムノアフィニティ
ーカラムに適用した。

例15 粗溶解物のイムノアフィニティークロマトグラフィー 例７と同様にして免疫吸着剤を調製した。例14で得ら
れた粗E.coli抽出物（溶原体100mg）をスピンし（10,00
0xg）、得られる上清を抗体カラム（3mgIgG/0.3mアガロ
ース）に４℃で適用した。0.1％Triton X−100を含有す
るPBSでカラムを洗浄し、0.05％Triton X−100と0.02％
ナトリウムアジトを含有するクエン酸（50mM,pH2）で溶
出した。５つの0.5mlフラクションをHEPESバッファー
（1M,pH8.5）に集め、４℃に保持した。フラクションN
o.1と２が溶出蛋白の75％を含有していた。精製した溶
解物を還元条件下でSDS−PAGEに付し銀染色して分析し
た所、分子量約130,000に対応する主要バンドが現われ
た（β−ガラクトシダーゼの分子量は114,000であ
る）。結果は第14図に示した。レーンＡはβ−ガラクト
シダーゼ；レーンＢは溶解物溶出フラクション；レーン
Ｃはロードフラクション（粗溶原体）；及びレーンＤは
分子量マーカーである。

例16 ウエスタンブロット分析 誘導された融合蛋白（100μg/スロット）を含む粗E.c
oli抽出物あるいはアフィニティークロマトグラフィー
で精製した融合蛋白（１μg/スロツト）のサンプルを、
還元条件下でSDS−PAGEにより分析し、次いで60ボルト
で250mAで、25mM Tris HCl10m グリシンバッファー
（pH8.5）/20％メタノール中で４℃で２時間ニトロセル
ロースシートに電気ブロットした。エレクトロブロット
後に、0.05％Tween−20と0.02％ナトリウムアジドを含
むPBS（ブロックバッファー）に溶解した10％非脂肪ミ
ルクとともに１晩インキュベートした。ニトロセルロー
スシートを抗IFN−ガンマレセプターモノクローナル抗
体（ブロックバッファーで1:500に希釈した腹水のイム
ノグロブリンフラクション10mg/ml）とともに室温で２
時間インキュベートした。0.05％Tween−20含有PBSで洗
浄後、¹²⁵I−ヤギ抗マウス血清（ブロックバッファーに
0.7×10⁶cpm/mlで溶解）とともに４℃で１晩ニトロセル
ロースシートをインキュベートした。次いでシートを洗
浄し、乾燥してオートラジオグラフィーに付した。第15
図に示したように、粗抽出物とアフィニティークロマト
グラフィーで精製したものとの両者において約130,000
のMrのバンドが現われた。第15図では、レーンＡは分子
量マーカー；レーンＢではイムノアフィニティークロマ
トグラフィーで精製した溶原体；及びレーンＣは粗溶原
体を示す。

例17 放射ラベル化¹²⁵I−IFN−ガンマの融合蛋白への交差結
合 アフィニティークロマトグラフィーで精製した融合蛋
白（５μｇ）または純粋なβ−ガラクトシダーゼの調製
物を、非ラベル化IFN−ガンマ（1000倍）の存在下もし
くは非存在下で、¹²⁵I−IFN−ガンマ（1000ユニット、
５×10⁵cpm）と混合し、得られる混合物を室温で２時間
放置した。Di Succinyl Suberate（DSS）を終濃度0.3mM
で加えた。15分後に４℃で1M Tris−HClバッファーを
加えて交差結合をストップさせた。混合物をラビット抗
−β−ガラクトシダーゼ血清で免疫沈降させ（1:200,室
温で２時間）、次いでProt A Sepharoseビーズを加え
た。0.05％Tween20を含有するPBSでビーズを２回洗浄し
次いでPBSで１回洗浄し、サンプルバッファーに懸濁
し、上清をSDS−PAGEで分析し、次いでオートラジオグ
ラフィーに付した。第16図のレーンＥに示されるよう
に、0.5Kbクローンによってコードされる融合蛋白と¹²⁵
I−IFN−ガンマとが交差結合した場合にM.W.155,000の
複合体が得られた。過剰の非ラベル化IFN−ガンマを加
えた場合にはのこのバンドは消えた（レーンＤ）。純粋
なβ−ガラクトシダーゼ自身と交差結合を行なった時に
はこのようなバンドは観察されなかった（レーンＦ）。
第16図では、レーンＡは分子量マーカー；レーンＢとＣ
は、それぞれ過剰の非ラベル化IFN−ガンマの存在下及
び非存在下で¹²⁵I−IFN−ガンマと交差結合した純粋な
溶原体（0.7Kb）；レーンＤとＥは、それぞれ過剰の非
ラベル化IFN−ガンマの存在下及び非存在下で¹²⁵I−IFN
−ガンマと交差結合した純粋な溶原体（0.5Kb）；及び
レーンＦは¹²⁵I−IFN−ガンマに交差結合した純粋なβ
−ガラクトシダーゼである。

例18 クローン39cDNAの発現 ヒト胎盤cDNAライブラリーから0.5Kbプローブにより
単離されたラムダgt11クローンNo.39の1.8Kb挿入断片
（例12）をEcoR Iで切断し、Stratagene Cloning Syste
m（La Jolla,Cal）から得たKS Bluescriptベクター（B
S）のEcoR I部位に挿入した。得られるBS−39cDNAにお
いては、1.8Kb挿入断片（第７図）のセンスストランド
の３′末端側のAha III部位はBSベクターのHind III部
位とT3 RNAポリメラーゼプロモーターに接近してお
り、一方、５′末端はBSベクターのBamH I部位とT7 RN
Aポリメラーゼプロモーターに接近している（第17
図）。発現ベクターとして、Chernajovsky Y.,et al.,B
iochemical Engineering III,Annals,N.Y.Acad.Sci.,Vo
l413,pp88−96、1983に記載されたプラスミドTL−IFN−
αＣを用いた。このプラスミドはtrp−lacプロモーター
及びリボソーム結合部位それに続くEcoR I部位を有して
おり、このベクターをEcoR IとHind IIIで切断し、EcoR
I−BamH I合成リンカー（イニシェーターATGを含む）
を用いてBS−39cDNAのBamH I−Hind IIIフラグメントに
連結し、プラスミドTL−39cDNAを得た（第17図）。この
構築体においては、39cDNAフラグメントのコード配列に
９個のコドンが付加されている。TL−39cDNAプラスミド
をE.coli JM101 i9にトランスフェクトし、Chernajov
sky Y.,et al（上記と同じ）に記載されたようにしてイ
ソプロピルチオガラクトシダーゼ（IPTG）で誘導した。
例14−17と同様にして、細胞の採取及び蛋白の抽出、イ
ムノアフィニティークロマトグラフィー、ウエスタンブ
ロット分析及び¹²⁵I−IFN−ガンマの交差結合をそれぞ
れ実施した。¹²⁵I−IFN−ガンマの交差結合のために、
ラビット抗IFN−ガンマ血清またはマウス抗IFN−ガンマ
レセプターモノクローナル抗体を免疫沈降用に用いた。

第18図では、レーンＡは分子量マーカー；レーンＢは
非誘導バクテリアNo.39の粗抽出物；レーンＣとＤは、
それぞれ誘導60分後および45分後のIPTG誘導バクテリア
No.39の粗抽出物；レーンＥ−ＨはレーンＡ−Ｄと同様
に抗体No.177−１とインキュベートした場合；レーンＩ
−ＬはレーンＡ−Ｄと同様に抗体No.183とインキュベー
トした場合であり；ネガティブコントロールは抗IFN−
ガンマ抗体とインキュベートした場合である。

第18図に示されているように、ブロックを抗体No.177
−１とインキュベートした場合にはMr32,000のシングル
バンドが現われる（レーンＣとＤ）。ブロットを抗体N
o.183とインキュベートした場合には、Mr32,000の主要
バンドとMR17,000のマイナーバンドが現われる（レーン
ＧとＨ）。39cDNAの断片を用いたので、39cDNAの天然生
成物のサイズよりも得られる蛋白のサイズは小さい。こ
の蛋白は第11図に示した配列を含有している。フラグメ
ントBal I−Kpn Iの配列（第11B図）は第９図の配列を
含有している。

例19 クローン76cDNAの発現 ヒト胎盤cDNAライブラリーから0.7Kbプローブを用い
て単離した（例12と同様）ラムダgt11クローンNo.76の
2.3Kb挿入断片をEcoR Iで切断し、KS Bluescriptベクタ
ーのEcoR I部位に挿入した。2.3Kb挿入断片（第８図）
のセンスストランドの３′末端側のXba I部位はBSベク
ターのBamH I部位及びT7RNAポリメラーゼプロモーター
に接近しており、一方、５′末端はBSベクターのHind I
II部位とT3RNAポリメラーゼプロモーターに接近してい
た。発現プラスミドTL−IFN−αｃをEcoR IとHind III
で切断し、EcoR I−Hind III合成リンカーに再連結した
（第19図）。得られるプラスミドを再びHind IIIとBamH
Iで切断し、上記のBSクローン76cDNAから切り出したHi
nd III−BamH I 2.3Kb cDNAに連結した（第19図）。
このプラスミドをE.coli JM101i9にトランスフェクト
し、IPTGで誘導した。イムノブロットのモノクローナル
抗体No.183と反応するMr34,000の蛋白とMr17,000の蛋白
を同定した（第20図）。この蛋白は第13図に示した配列
を含有している。細胞培養液からの抽出、イムノアフィ
ニティ−クロマトグラフィー、ウエスタンブロット分析
及び¹²⁵I−IFN−ガンマ交差結合は上記したと同様にし
て実施した。

第20図では、レーンＡとＢは、それぞれ誘導120分後
及び180分後のIPTG誘導バクテリアNo.76の粗抽出物；レ
ーンＣは非誘導バクテリアNo.76の粗抽出物；及びレー
ンＤは分子量マーカーである。ブロットは抗体No.177−
１と183の混合物とインキュベートした。

第20図に示したように、ブロットを抗体No.177−１と
183の混合物とインキュベートした場合には、Mr17,000
と32,000の蛋白が得られた（レーンＡとＢ）。

有用性と組成物 本発明のIFN−ガンマ結合蛋白、それと実質的に相同
性を有する蛋白またはその断片は、全身的にあるいは局
所的に投与されたIFN−ガンマの活性を調節しそしてIFN
−ガンマの有害な効果から保護するために、単独である
いは一緒に用いることができる。これらの蛋白は、IFN
−ガンマが内因的に過剰に形成された場合あるいは外因
的に過剰に投与された場合の症状を処置するために用い
ることができる。内因的にIFN−ガンマが望ましくなく
産生された場合には、リウマチ性関節炎、多発性硬化
症、若年性糖尿病初期、多発性筋炎、ベーチット病、甲
状腺炎、エリテマトーデス、皮膚炎などの各種自己免疫
疾患及び炎症疾患あるいは敗血性ショックにおいて生じ
るような局所炎症あるいは全身炎症が起こり、このよう
な場合にIFN−ガンマ結合蛋白によるIFN−ガンマの活性
の調節が有用である。IFN−ガンマ結合蛋白によるIFN−
ガンマの活性の調節は、IFN−ガンマを過剰に投与した
時あるいは患者がIFN−ガンマに対して感受性を有する
と診断された時に有用である。あるいは、内因的及び外
因的IFN−ガンマの抗ウィルス活性、抗炎症活性、抗細
胞活性（anticellular）及び他のいずれの活性を延長さ
せあるいは促進させるためにIFN−ガンマ結合蛋白を用
いることができる。

本発明の蛋白は、公知の方法により、薬学的に許容し
得る担体との混合物として薬学的に有用な組成物に製剤
化することができる。適当な担体及び製剤は、例えばRe
mington' Pharmaceutical Sciences,E.W.Martinに記載
されている。

本発明の薬学的組成物は、蛋白と生理学的に許容し得
る担体、安定剤及び賦形剤とを混合することによって調
製することができ、またバイアル中に凍結乾燥すること
によって投与形態に調製することができる。活性成分の
投与量は、投与ルート、疾患、患者の症状等によって変
動し得る。投与法は、同様の薬剤の投与方法と同じ方法
が採用され、処置すべき症状によって変動する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、HeLa細胞と抗IFN−ガンマレセプターモノク
ローナル抗体との結合を表わしたグラフを示す。 第２図は、IFN−ガンマによる抗IFN−ガンマレセプター
モノクローナル抗体の結合抑制を表わすグラフを示す。 第３図は、IFN−ガンマによるHeLa細胞でのHLA−DR抗原
誘導に対する抗IFN−ガンマレセプターモノクローナル
抗体のブロック能を表わすグラフを示す。 第４図は、IFN−ガンマ誘導抗NK効果の抗IFN−ガンマレ
セプターモノクローナル抗体による抑制効果を表わすグ
ラフを示す。 第５図は、アフィニティークロマトグラフィーにて精製
した。IFN−ガンマレセプターのSDS−PAGEの分析結果を
示す写真である。 第６図は、cDNA HeLa発現ライブラリーのスクリーニン
グ結果及びポジティブクローンのサブクローニングの結
果を示す写真である。 第７図は、1.8Kbフラグメントの制限酵素地図を示す。 第８図は、2.3Kbフラグメントの制限酵素地図を示す。 第９図は、0.5Kb cDNAセグメントのヌクレオチド配列と
その翻訳アミノ酸配列を示す。 第10図は、0.7Kb cDNAセグメントの相補性鎖とその翻訳
アミノ酸配列を示す。 第11A図及び第11B図は、1.8Kb cDNAセグメントの２つの
部分ヌクレオチド配列及びそれらの翻訳アミノ酸配列を
示す。 第12図は、2.3Kb cDNAの部分ヌクレオチド配列を示す。 第13図は、2.5Kb cDNAの部分ヌクレオチド配列の翻訳ア
ミノ酸配列を示す。 第14図は、HeLa細胞から得た溶原体の蛋白溶解物をSDS
−PAGEに付して分析した結果を示す写真である。 第15図は、誘導された融合蛋白を含む粗E.coli抽出物及
びアフィニティークロマトグラフィーで精製した融合蛋
白をウェスタンブロット分析した結果を示す写真であ
る。 第16図は、融合蛋白への放射ラベル化¹²⁵I−IFN−ガン
マの交差結合をSDS−PAGEにより分析した結果を示す写
真である。 第17図は、プラスミドTL−39cDNAの構築を示す。 第18図は、クローン39cDNAの発現のウエスタンブロット
分析の結果を示す写真である。 第19図は、プラスミドTL−76cDNAの構築を示す。 第20図は、クローン76cDNAの発現のウエスタンブロット
分析の結果を示す写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/66 Ｃ１２Ｒ 1:19） 1:91） (72)発明者 イブズ モリィ イスラエル国 レホボット，モスコビッ ツ ストリート 15／３ (72)発明者 ディナ ジー．フイッシャー イスラエル国 レホボット，ゴロデスキ ー，ストリート 12 (72)発明者 ミシェル レベル イスラエル国 レホボット，ウェイズマ ン インスチチユート オブ サイエン ス，ヘッド ブラジル ５ (72)発明者 メナケム ルビンスティン イスラエル国 ギバット シュムエル, ハットマー ストリート 16 (56)参考文献 特開 昭63−17699（ＪＰ，Ａ) Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ，Ｖｏｌ．262，Ｎｏ．18（1987）ｐ 8483−8487 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉ ｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏ ｌ．165（1987）ｐ．988−999

Claims (27)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】IFN−ガンマ結合活性を有しかつ以下に示
   すアミノ酸配列を含む蛋白、またはIFN−ガンマ結合活
   性を有しかつ以下に示すアミノ酸配列において１個もし
   くは数個のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加した
   アミノ酸配列を含む蛋白をコードするDNA分子。
2. 【請求項２】以下に示すヌクレオチド配列を含む組換え
   DNA分子またはcDNA分子である請求項１のDNA分子。
3. 【請求項３】0.5kb cDNAまたは1.8kb cDNAであって、該
   1.8kb cDNAの制限酵素地図は以下に示す通りであって、
   該0.5kb cDNAはこの制限酵素地図中に含まれており、 更に、該1.8kb cDNAは以下に示すスヌクレオチド配列
   ａ）及びｂ）を含み、該0.5kb cDNAは以下に示すヌクレ
   オチド配列ｂ）を含むものである、請求項２のcDNA分
   子。
4. 【請求項４】IFN−ガンマ結合活性を有しかつ以下に示
   すアミノ酸配列を含む蛋白、またはIFN−ガンマ結合活
   性を有しかつ以下に示すアミノ酸配列において１個もし
   くは数個のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加した
   アミノ酸配列を含む蛋白をコードするDNAの発現を引き
   起こすことのできるDNA配列と作動可能なように連結し
   ている組換えDNA分子である、請求項１から３のいずれ
   かのDNA分子。
5. 【請求項５】IFN−ガンマ結合活性を有しかつ以下に示
   すアミノ酸配列を含む蛋白、またはIFN−ガンマ結合活
   性を有しかつ以下に示すアミノ酸配列において１個もし
   くは数個のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加した
   アミノ酸配列を含む蛋白をコードするDNA分子。
6. 【請求項６】以下に示すヌクレオチド配列を含む組換え
   DNA分子またはcDNA分子である請求項５のDNA分子。
7. 【請求項７】IFN−ガンマ結合活性を有しかつ以下に示
   すアミノ酸配列を含む蛋白、またはIFN−ガンマ結合活
   性を有しかつ以下に示すアミノ酸配列において１個もし
   くは数個のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加した
   アミノ酸配列を含む蛋白をコードするDNAの発現を引き
   起こすことのできるDNA配列と作動可能なように連結し
   ている組換えDNA分子である、請求項５または６のDNA分
   子。
8. 【請求項８】IFN−ガンマ結合活性を有しかつ以下に示
   すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列
   を含む蛋白。
9. 【請求項９】IFN−ガンマ結合活性を有しかつ以下に示
   すアミノ酸配列を含む蛋白、またはIFN−ガンマ結合活
   性を有しかつ以下に示すアミノ酸配列において１個もし
   くは数個のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加した
   アミノ酸配列を含む蛋白である、請求項８の蛋白。
10. 【請求項１０】以下に示すアミノ酸配列を含む蛋白であ
    る、請求項８または９の蛋白。
11. 【請求項１１】更に、ARG−GLY−ASN−SERから開始する
    以下に示すアミノ酸配列を含む、請求項10の蛋白。
12. 【請求項１２】IFN−ガンマ結合活性を有しかつ以下に
    示すアミノ酸配列を含む蛋白、またはIFN−ガンマ結合
    活性を有しかつ以下に示すアミノ酸配列において１個も
    しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加し
    たアミノ酸配列を含む蛋白。
13. 【請求項１３】IFN−ガンマ結合活性を有しかつ以下に
    示すヌクレオチド配列によってコードされる蛋白。
14. 【請求項１４】請求項４のDNA分子を含む複製可能な発
    現ビークルであって、形質転換宿主細胞中にて請求項８
    から11のいずれかの蛋白を発現することのできる上記発
    現ビークル。
15. 【請求項１５】請求項７のDNA分子を含む複製可能な発
    現ビークルであって、形質転換宿主細胞中にて請求項12
    または13のいずれかの蛋白を発現することのできる上記
    発現ビークル。
16. 【請求項１６】請求項14の複製可能な発現ビークルで形
    質転換された宿主細胞。
17. 【請求項１７】請求項15の複製可能な発現ビークルで形
    質転換された宿主細胞。
18. 【請求項１８】請求項16または17の原核宿主細胞。
19. 【請求項１９】請求項16または17の真核宿主細胞。
20. 【請求項２０】請求項８から13のいずれかの蛋白を製造
    する方法であって、 （ａ）請求項16または17の形質転換宿主細胞を適当な培
    養培地中で培養する工程；及び （ｂ）該蛋白を単離する工程 からなる上記方法。
21. 【請求項２１】IFN−ガンマがそのレセプターに結合す
    るのをブロックし、IFN−ガンマの生物学的活性を抑制
    し、請求項８から13のいずれかの蛋白に結合することの
    できる抗ヒトIFN−ガンマレセプターモノクローナル抗
    体。
22. 【請求項２２】CNCM Ｉ−814（No.177−１）の受託番
    号を有するハイブリドーマによって産生される請求項21
    の抗ヒトIFN−ガンマレセプターモノクローナル抗体。
23. 【請求項２３】請求項21の抗ヒトIFN−ガンマレセプタ
    ーモノクローナル抗体を産生するCNCM Ｉ−814（No.17
    7.1）の受託番号を有するハイブリドーマ。
24. 【請求項２４】薬学的に許容し得る担体と共に、活性成
    分として請求項８から13のいずれかの蛋白を含有する、
    動物におけるIFN−ガンマの有害効果から保護するため
    の薬学的組成物。
25. 【請求項２５】IFN−ガンマが過剰に内因的に形成され
    た状態または過剰に外因的に投与された状態を処置する
    ための請求項24の薬学的組成物。
26. 【請求項２６】自己免疫疾患におけるIFN−ガンマの作
    用から保護するための請求項24の薬学的組成物。
27. 【請求項２７】IFN−ガンマの効果を調節するための請
    求項24の薬学的組成物。