DE68924464T2

DE68924464T2 - Interferon-gamma bindende Proteine.

Info

Publication number: DE68924464T2
Application number: DE68924464T
Authority: DE
Inventors: Dina G Fischer; Yves Mory; Daniela Novick; Michel Revel; Menachem Rubinstein
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1988-11-14
Filing date: 1989-11-14
Publication date: 1996-03-28
Anticipated expiration: 2009-11-15
Also published as: IL88378A; IL88378A0; JP3104187B2; ATE128728T1; US5763210A; CA2002833A1; EP0369413A2; AU620466B2; AU4469889A; DE68924464D1; JPH02291269A; EP0369413B1; ES2080060T3; EP0369413A3; CA2002833C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Proteine mit Interferon γ (IFN-γ) bindender Aktivität, Proteine, die im wesentlichen homolog dazu sind oder Fragmente davon, DNA-Moleküle, insbesondere cDNA-Moleküle, die diese Proteine oder Fragmente davon kodieren, und monoklonale Antikörper gegen den humanen Interferon γ-Rezeptor, die für die Isolierung der cDNA-Klone verwendet werden. Die Erfindung betrifft weiterhin die Klonierung der humanen Interferon γ bindenden Proteine und ihre Herstellung durch rekombinante DNA-Techniken und pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese umfassen.
Interferon γ ist ein Lymphokin, das von aktivierten T- Lymphozyten hergestellt wird. Es zeigt antivirale Aktivität, einen wachstumshemmenden Effekt und mehrere immunregulatorische Aktivitäten auf eine Vielzahl von Zelltypen und ist von potentiellem klinischen Wert. Jedoch ist von Interferon γ gezeigt worden, daß es zusammen mit seinen positiven biologischen Aktivitäten unerwünschte Wirkungen hervorruft, und daß es an der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen beteiligt ist. Somit war Interferon γ bei neu diagnostizierten diabetischen Kindern und in Muskelbiopsien von Patienten mit Polymyositis vorhanden. Es wurde auch gefunden, daß es Autoimmunerkrankungen, wie Multiple Sklerose und Psoriasis, verschlimmert.
Es ist deshalb wünschenswert, Wege zu finden, um die unerwünschten Aktivitäten oder Wirkungen von Interferon γ, das endogen im Überschuß gebildet wird oder exogen verabreicht wird, zu eliminieren oder diesen entgegen zu wirken, und insbesondere um seine Wirkung zu blockieren zum Kontrollieren des Fortschreitens von Autoimmunvorgängen.
In der europäischen Patentanmeldung Nr. 240975 des gleichen Anmelders wurden Interferon γ-Rezeptoren mit verschiedenen Molekulargewichtsbereichen aus verschiedenen Zellen durch Extraktion isoliert, gefolgt von Affinitätschromatographie auf einer immobilisierten Interferon γ-Säule. In der gleichen Anmeldung wurden polyklonale Antikörper gegen die Interferon γ-Rezeptoren beschrieben.
Calderon et al. offenbart in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 85, Seiten 4837-4848 (1988) die Reinigung eines humanen Interferon γ-Rezeptorproteins aus humaner Placenta. Der gereinigte Rezeptor besaß ein scheinbares Molekulargewicht von 90 Kd, und der Rezeptor schien 17 Kd an N-verknüpftem Kohlenhydrat zu enthalten.
Das Journal of Immunology, Bd. 140, Seiten 4231-4237 offenbart Interferon γ-Rezeptor spezifische Maus-mAk, die die Bindung von ¹²&sup5;Jod-Interferon γ an humane Placentamembranen vollständig hemmen können.
Auget et al. offenbarten in Cell, Bd. 55, Seiten 273-280 (1988) die Isolierung einer cDNA, die den humanen Interferon γ- Rezeptor kodiert, aus einer Expressionsbank von humanen Raji- Zellen unter Verwendung eines polyklonalen Antirezeptorserums. Zwei der erhaltenen cDNA-Klone wurden miteinander verknüpft, um die vollständige cDNA-Sequenz wie auch eine daraus gefolgerte Aminosäuresequenz bereitzustellen.
Die Aufgabe, die der vorliegenden Erfindung zugrundelag, bestand in der Bereitstellung von weiteren Interferon γ bindenden Proteinen, einem DNA-Molekül, das dieses kodiert, und von monoklonalen Antikörpern, die an das weitere Interferon γ bindende Protein binden können.
Diese Aufgaben werden gelöst durch die Proteine nach Ansprüchen 8 und 9, das DNA-Molekül nach Anspruch 1 und den Antikörper nach Anspruch 23.
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung monoklonale Antikörper gegen humanen Interferon γ-Rezeptor, insbesondere den Interferon γ-Rezeptor von Nicht-Immunzellen, z. B. WISH-, HeLa- oder FS-11-Zellen, mit einem Molekulargewicht von ungefähr 90 000 Da, wobei die Antikörper auch an ein Interferon γ bindendes Protein binden, das kein Interferon γ-Rezeptor ist.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Proteine mit Interferon γ bindender Aktivität oder Proteine, die im wesentlichen homolog dazu sind, oder Fragmente davon, wobei die Proteine die Aminosäuresequenz, gezeigt in Fig. 9 oder Fig. 13, umfassen. Die Erfindung umfaßt größere Proteine, worin diese Aminosäuresequenzen einen Teil der Gesamtsequenz des Proteinmoleküls darstellen, wie auch Fragmente, umfassend im wesentlichen nur einen Teil der Aminosäuresequenzen. Homologe Proteine oder Fragmente davon werden ebenfalls von der Erfindung umfaßt, vorausgesetzt, daß sie die gleiche biologische Aktivität der erfindungsgemäßen Proteine zeigen.
Die Erfindung betrifft weiterhin DNA-Moleküle, umfassend ein rekombinantes DNA-Molekül oder cDNA-Molekül, das die Nukleotidsequenz umfaßt, die für die erfindungsgemäßen Proteine oder Fragmente davon kodiert, replizierbare Expressionsvehikel, umfassend diese, und Wirtszellen transformiert damit, und ein Verfahren zum Herstellen der Proteine oder Fragmente davon durch Kultivieren der transformierten Zellen in einem geeigneten Kulturmedium und Ernten des Proteins oder eines Fragments davon entweder aus den Zellen oder aus dem Kulturüberstand.
Gemäß der Erfindung wurden cDNA-Klone, die einen Teil der humanen Interferon γ bindenden Proteine kodieren, isoliert mit der Hilfe von monoklonalen Antikörpern gegen den humanen Interferon-γ-Rezeptor. Diese Antikörper waren charakterisiert durch ihre Fähigkeit, die Bindung von ¹²&sup5;J-Interferon γ an seinen Rezeptor auf humanen Zellen zu blockieren. Eine cDNA-Expressionsbank aus HeLa in Lambda gt11 wurde mit den Antikörpern abgesucht und 5 positive Klone wurden aus 10&sup6; Rekombinanten erhalten. 4 der Klone besaßen ein Insert von 0,5 kb, und eines betrug 0,7 kb. Die 0,5 kb-Fragmente kreuzhybridisierten aber hybridisierten nicht an den 0,7 kb-Klon, wie durch Southern Blots ermittelt. Die Inserts wurden mit einem Bluescript-Plasmidvektor ligiert, und kompetente E. coli TG1-Bakterien wurden transformiert. Kolonien, die die Inserts von 2 der Klone (0,5 kb und 0,7 kb) enthielten, wurden weiter kultiviert, und die einzelsträngige DNA, die erhalten wurde mit der Hilfe eines Helfervirus, wurde zum Sequenzieren verwendet. Bei dem Sequenzieren wurde ein offener Leseraster gefunden, und es wurde keine signifikante Homologie zu bekannten DNA-Sequenzen beobachtet. Fig. 9 zeigt die Nukleotidsequenz von Klon 15-21-1 mit 0,5 kb, und Fig. 10 zeigt die Nukleotidsequenz des komplementären Stranges von Klon 18-4-3 von 0,7 kb.
Die durch die Inserts kodierten Proteine wurden isoliert und charakterisiert. Lysogene wurden hergestellt und die induzierten Proteine wurden mit einem Anti-Interferon γ-Rezeptor- Immunadsorbenz gereinigt. Die Größe der Proteine in den eluierten Fraktionen wurde durch SDS-PAGE gefolgt von Silberfärbung und Western-Blotten ermittelt. Das fusionierte Protein, das von dem 0,5 kb-Klon stammte, besaß ein Mr von ungefähr 130 000 (Mr von β-Galactosidase = 114 000). Die Bindung von ¹²&sup5;Jod-Interferon γ an das fusionierte Protein wurde in Lösung gezeigt und wurde durch einen Überschuß an nicht markiertem Interferon γ gehemmt. Ein solche Bindung wurde mit β-Galactosidase alleine nicht beobachtet. In Vernetzungsexperimenten von ¹²&sup5;Jod-Interferon γ an das fusionierte Protein, gefolgt von Immunpräzipitation führten zu einem Komplex von Mr = 155 000 (Mr von Interferon γ = 25 000), wie sichtbar gemacht durch SDS-PAGE und Autoradiographie. Dies zeigt an, daß das 0,5 kb-cDNA-Fragment zumindest für einen Teil der Liganden bindenden Domänen eines humanen Interferon γ bindenden Proteins kodiert.
Proben (probes) wurden von den 0,5 kb- und 0,7 kb-Inserts hergestellt, und eine humane Placenta-cDNA-Bank in Lambda gt11 wurde abgesucht. 10 positive Klone wurden aus 10&sup6; Rekombinanten erhalten. 9 der Klone besaßen eine Insertgröße von 1,15 bis 2,3 kb, und sie kreuzhybridisierten alle, während einer der Klone eine Insertgröße von 1,8 kb besaß, und er hybridisierte nur mit sich selbst. 2 Klone von 1,8 kb und 2,3 kb wurden an Expressionsvehikel gebunden, in Bakterienzellen transfektiert, und die von ihnen kodierten Proteine wurden exprimiert.
Andere Proben können von den erfindungsgemäßen cDNA-Sequenzen hergestellt werden und zum Absuchen einer beliebigen cDNA-Bank, z. B. einer Dickdarm-, Leber- oder Nierenbank oder zum Isolieren der genomischen DNA, die für die erfindungsgemäßen Proteine kodiert, durch bekannte Verfahren, z. B. durch Koloniehybridisierungstechniken unter stringenten Bedingungen verwendet werden. Positive Klone werden dann in geeignet konstruierte Expressionsvektoren durch bekannte Techniken eingefügt. Doppelsträngige cDNA wird mit Plasmidvektoren durch homopolymere Endverlängerung (homopolymeric tailing) oder durch Restriktionsverknüpfung unter Verwendung von synthetischen DNA-Linkern oder Ligierung von stumpfen Enden verknüpft. DNA-Ligasen werden verwendet zum Ligieren der DNA-Moleküle, und eine unerwünschte Verknüpfung wird verhindert durch die Behandlung mit alkalischer Phosphatase.
Um ein gewünschtes Protein exprimieren zu können, sollte ein Expressionsvektor auch spezifische Nukleotidsequenzen umfassen, die transkriptions- und translationsregulierende Information enthalten, die mit der DNA, die für das gewünschte Protein kodiert, in einer solchen Weise verknüpft sind, daß sie die Genexpression und Produktion des Proteins erlauben. Dem Gen muß ein Promotor vorangestellt sein, damit es transkribiert wird. Es sind eine Vielzahl solcher Promotoren in Gebrauch, die mit unterschiedlichen Effizienzen arbeiten (starke und schwache Promotoren).
Das DNA-Molekül, das die Nukleotidsequenz, die für ein erfindungsgemäßes Protein oder für ein Fragment davon kodiert, der eine Nukleotidsequenz für ein Signalpeptid und die funktionsfähig verknüpften transkriptions- und translationsregulierenden Signale vorangestellt sind, umfaßt, wird in einen Vektor eingeführt, der die gewünschte Gensequenz in das Wirtszellchromosom integrieren kann. Die Zellen, die die eingeführte DNA stabil in ihre Chromosomen integriert haben, können selektiert werden ebenfalls durch Einbringen von einem oder mehreren Markern, die die Selektion auf Wirtszellen erlauben, die den Expressionsvektor enthalten.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das eingebrachte DNA-Molekül in einen Plasmid- oder viralen Vektor integriert, der in dem Empfängerwirt autonom replizieren kann. Faktoren von Bedeutung bei der Auswahl eines bestimmten Plasmid- oder viralen Vektors umfassen die Einfachheit, mit der die Empfängerzellen, die den Vektor enthalten, erkannt werden und ausgewählt werden können aus den Empfängerzellen, die den Vektor nicht enthalten; der Anzahl der Kopien des Vektors, die in einem speziellen Wirt gewünscht sind, und ob es wünschenswert ist, den Vektor zwischen Wirtszellen verschiedener Arten hin und her zu überführen (Shuttle vector). Sobald der Vektor oder die DNA- Sequenz, enthaltend das bzw. die Konstrukt(e) für die Expression hergestellt worden ist, kann das bzw. die DNA-Konstrukt(e) in eine geeignete Wirtszelle durch ein beliebiges von einer Vielzahl von geeigneten Mitteln eingeführt werden: Transformation, Transfektion, Konjugation, Protoplastfusion, Elektroporation, Calciumphosphatpräzipitation, direkte Mikroinjektion usw.
Wirtszellen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können entweder prokaryotischer oder eukaryotischer Natur sein. Bevorzugte prokaryotische Wirte umfassen Bakterien wie E. coli. Unter solchen Bedingungen wird das Protein nicht glycosyliert. Der prokaryotische Wirt muß mit dem Replikon und den Kontrollsequenzen des Expressionsplasmids kompatibel sein.
Bevorzugte eukaryotische Wirte sind Säugerzellen, z. B. humane, Affen-, Maus- und Ovarienzellen des chinesischen Hamsters (CHO), da sie posttranslationale Modifikationen für Proteinmoleküle bereitstellen, einschließlich dem richtigen Falten und der Glycosylierung an den richtigen Stellen. Auch Hefe- und Insektenzellen können posttranslationale Peptidmodifikationen durchführen, einschließlich Glycosylierung. Es gibt eine Vielzahl an rekombinanten DNA-Strategien, die starke Promotorsequenzen und eine hohe Kopienzahl an Plasmiden verwenden, die verwendet werden können zum Herstellen der gewünschten Proteine in Hefe. Hefe erkennt die Leader-Sequenzen von klonierten Säugergenprodukten und sezerniert Peptide, die Leader-Sequenzen tragen (d. h. Präpeptide).
Nach dem Einbringen des Vektors werden die Zellen in einem Selektivmedium kultiviert, das das Wachstum von Vektor enthaltenden Zellen begünstigt. Die Expression der klonierten Gensequenz(en) führt zu der Produktion des gewünschten Proteines oder eines Fragments davon. Das exprimierte Protein wird dann isoliert und mit Hilfe eines herkömmlichen Verfahrens gereinigt, umfassend Extraktion, Präzipitation, Chromatographie, Elektrophorese o. a.
Die monoklonalen Antikörper gegen den humanen Interferon γ- Rezeptor, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, sind nützlich bei der Reinigung des Rezeptors und bei der Isolierung der erfindungsgemäßen cDNA-Klone. Sie binden an Interferon γ und hemmen dessen biologische Aktivität, wobei sie sich somit von den monoklonalen Antikörpern des Standes der Technik unterscheiden (Auget M. und Merlin G. (1987) J. Exp. Med. 165, Seiten 988-999), von denen nicht berichtet wurde, das sie die biologische Aktivität von Interferon γ hemmen.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper gegen den humanen Interferon γ-Rezeptor wurden erzeugt durch Einspritzen einer Präparation des Rezeptors, der gereinigt worden war aus solubilisierten Placentamembranen durch Ligandenaffinitätschromatographie, in Mäuse. 3 Antikörper wurden identifiziert durch ihre Fähigkeit, die Bindung von ¹²&sup5;J-Interferon γ an seinen Rezeptor auf HeLa-Zellen bei 4ºC zu blockieren. Einer dieser Antikörper blockierte mehrere biologische Eigenschaften von Interferon γ, einschließlich seiner antiviralen Aktivität, seiner Fähigkeit, HLA-DR-Oberflächenantigene zu induzieren und seiner Fähigkeit, Zellen vor der NK-zellvermittelten Cytotoxizität zu schützen.
Dieser Antikörper zeigte eine höhere Bindungskapazität an Zellen bei 37ºC und war deutlich schwieriger zu verdrängen durch einen Überschuß an Interferon γ, im Vergleich zu den beiden anderen Antikörpern. Immunaffinitätschromatographie von solubilisierten rohen Placentamembranpräparationen ergab einen gereinigten Rezeptor, der ein Molekulargewicht von ungefähr 88 000 zeigte. Der gereinigte Rezeptor behielt seine Fähigkeit, ¹²&sup5;J- Interferon γ in Lösung zu binden, bei.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert, ohne darauf beschränkt zu sein:

Beispiel 1

Immunisierung von Mäusen und Zellfusion

BALB/c-Mäuse wurden subkutan immunisiert mit einer Präparation von humanem Interferon γ-Rezeptor, erhalten aus Placentamembranen. Diese Präparation wurde gereinigt mit Interferon γ, gekuppelt auf Affigel 10, dann mit Sephacryl 5-300 (Novick, D. et al. (1987) J. Biol. Chem. 262, Seite 8483), und schließlich an Agarosekügelchen, an die monoklonale Anti-Interferon γ-Antikörper gekuppelt waren, adsorbiert (Novick, D. et al. (1983) EMBO J. 2, Seite 1527). Es wurden 2 Injektionen in vollständigem Freund's Adjuvanz verabreicht und die beiden anderen wurden in Intervallen von einer Woche ohne Adjuvanz verabreicht. Jede Maus erhielt rund 30 ug des affinitätsgereinigten Rezeptors pro Injektion. Die letzte Auffrischung (boost) wurde intraperitoneal 4 Tage vor der Fusion verabreicht. Die Seren wurden auf ihre Fähigkeit, die Bindung von ¹²&sup5;J-Interferon γ an HeLa-Zellen zu blockieren, wie im folgenden beschrieben, untersucht. Milzzellen (200 · 10&sup6;) aus einer Maus, die in diesem Test einen Titer von 1 : 500 zeigte, wurden fusioniert mit 40 · 10&sup6; NSO/1-Myelomzellen. Hydromas wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium, das ergänzt war mit 1 mM Pyruvat, 2 mM Glutamin, Penicillin (10 Einheiten/ml), Streptomycin 20 ug/ml, Fungizon 250 ug/ml, 10% fötalem Rinderserum (FBS) und enthaltend HAT, selektiert. Hybridome, von denen gefunden wurde, daß sie Anti-Interferon-γ-Rezeptor-Antikörper sezernieren, wurden kloniert durch das Verfahren der begrenzten Verdünnung (limiting dilution).

Beispiel 2

Tests zum Absuchen von Hybridomüberständen

Hybridomüberstände wurden auf die Anwesenheit von Anti- Interferon γ-Rezeptor-Antikörpern getestet, sowohl durch die kompetitive Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;J-Interferon γ an HeLa- Zellen wie auch durch Neutralisation von antiviraler Aktivität von Interferon γ auf WISH-Zellen.
a) Hemmung der ¹²&sup5;J-Interferon γ-Bindung an Zellen durch Anti- Rezeptor-Antikörper: HeLa-Zellen (ATCC H229, CCL2.1) wurden in 96-Loch-Mikrotiterplatten ausplattiert (50 000 Zellen/Loch) in der Anwesenheit von Dexamethason (10&supmin;&sup6;M). Nach 24 Stunden wurde das Medium verworfen, die Zellen wurden mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung enthaltend Ca²&spplus;, Mg²&spplus; (PBS) und Natriumazid (0,02%) gewaschen. Hybridomüberstände (50 ul/Loch) wurden zugesetzt, und die Platten wurden für 2 Stunden bei 4ºC aufbewahrt. Folgend auf zweimaliges Waschen mit eiskaltem PBS enthaltend 2% FBS und 0,02% Natriumazid (PBS-2%) wurde ¹²&sup5;J-Interferon γ, erzeugt von CHO-Zellen, gereinigt durch Affinitätschromatographie und markiert durch das bekannte Chloramin-T-Verfahren, jedem Loch zugesetzt (50 ul, 200 000 cpm), und die Platten wurden für 2 Stunden bei 4ºC aufbewahrt. Die Platten wurden dann 4 mal mit PBS-2% gewaschen, abgeerntet mit NaOH (0,75 M, 125 ul), und der Gehalt eines jeden Lochs wurde ausgezählt.
Eine kompetetive Hemmung der Bindung wurde durchgeführt in 24-Loch-Platten (Costar) auf HeLa-Zellen (250 000 Zellen pro Loch ohne Dexamethason). Der Test wird auf die gleiche Weise durchgeführt wie beschrieben für den Test mit den 96-Loch- Mikrotiterplatten, außer den Volumina (250 ul von serienmäßig verdünnten Hybridomüberständen und 250 ul ¹²&sup5;J-Interferon γ, 200 000 cpm). Die Zellen wurden mit Trypsin geerntet (250 ul), die Zellen wurden weiterhin gewaschen mit PBS (2 · 150 ul), und die vereinigten Zellen und die Waschlösungen wurden ausgezählt.
b) Neutralisierung der Interferon γ-Aktivität: Hybridomüberstände (50 ul) wurden Kulturen von WISH-Zellen (ATCC CCL25) in 96-Loch-Platten zugesetzt, inkubiert für 3 Stunden bei 37ºC und gefolgt von einem Zusatz von Interferon γ (20 Einheiten/ml, 50 ul). Die Platten wurden über Nacht inkubiert bei 37ºC, vesikuläres Stomatitisvirus wurde zugesetzt, die Platten wurden weiterhin über Nacht inkubiert, und das Ausmaß des cytopathischen Effekts wurde ermittelt durch Anfärben mit Kristallviolett (Rubinstein. (1981) J. Virol. 37, Seiten 755). Zum Bestimmen des neutralisierenden Titers wurden die Hybridomüberstände (oder Ascitisflüssigkeiten) serienmäßig verdünnt vor dem Neutralisationsassay. Eine neutralisierende Einheit ist definiert als die Menge an Antikörper, die ausreicht zum Neutralisieren einer Einheit an Interferon γ. Der NIH-Referenzstandard für Interferon γ Gg23- 901-503 wurde in sämtlichen Assays verwendet.

Beispiel 3

Absuchen der Hybridome

Hybridomüberstände wurden abgesucht auf die Anwesenheit von Anti-Interferon γ-Rezeptor-Antikörpern, wie oben beschrieben. Von 3 aus 468 abgesuchten Hybridomen wurde gefunden, daß sie die Bindung ¹²&sup5;J-Interferon γ an HeLa-Zellen hemmen, und eines der 3 war auch positiv in dem Neutralisationsassay. Die positiven Klone wurden weiter kultiviert und subkloniert, und die Zellen wurden in Mäuse eingespritzt zum Erzeugen von Ascitisflüssigkeiten. Die Immunantwort in Mäusen, das Absuchen und das Ausmaß der Antikörperproduktion in Gewebekultur und Ascititsflüssigkeiten wurde verfolgt sowohl anhand des Bindungsassays (Tabelle I) wie auch anhand des Neutralisationsassays (Tabelle II).
Von den 3 hier entwickelten monoklonalen Antikörpern gegen den humanen Interferon γ-Rezeptor wurde Antikörper Nr. 177 und sämtliche seiner Subklone charakterisiert durch ihre Fähigkeit, spezifisch an einen solubilisierten Interferon γ-Rezeptor zu binden, die Bindung von ¹²&sup5;J-Interferon γ an Zellen (bei 4ºC) zu hemmen, die antivirale Aktivität von Interferon γ und die Induktion von HLA-DR durch Interferon γ zu blockieren und die Induktion einer Resistenz gegen NK-CMC durch Interferon γ zu verhindern. Zwei andere monoklonale Antikörper (Nrn. 137 und 138) hemmten die Bindung von ¹²&sup5;J-Interferon γ an Zellen bei 4ºC, aber sie konnten die biologischen Aktivitäten von Interferon γ nicht blockieren. Sämtliche biologischen Aktivitäten wurden bei 37ºC untersucht. Da die Bindung eine Voraussetzung für die biologische Aktivität ist, wurde Antikörper Nr. 177 getestet, um herauszufinden, ob er eine höhere Affinität für den Rezeptor besaß im Vergleich mit den zwei anderen Antikörpern und ob Interferon γ die Antikörper von dem Rezeptor bei 37ºC verdrängen könnte. Tabelle I Hemmung von ¹²&sup5;J-Interferon γ auf HeLa-Zellen durch Anti-Rezeptor-Antikörper Hemmung in Mikrotiterplatten Hemmung in 24-Loch-Platten Analysenprobe Antikörperverdünnung cpm % Antikörperverdünnung Immunserum (Maus) Neg. Kontrollserum Hybridom unverdünnt Negatives Hybridom Ascitisflüssigk. 183-2 Immunglobuline (16 mg/ml)
Hybridomüberstände aus dem ersten Absuchen wurden einmal in Mikrotiterplatten getestet, während Überstände von positiven Klonen, die in größeren Mengen kultiviert wurden, in 3-facher Ausfertigung in 24-Loch-Platten getestet wurden. In letzterem Fall lagen die Zählwerte in dem Bereich ± 15%.
Tatsächlich wurde gefunden, daß die zwei anderen Antikörper von der Zelloberfläche durch einen Überschuß an Interferon γ verdrängt werden konnten, während fast keine solche Verdrängung von Antikörper Nr. 177 beobachtet wurde. Es ist bemerkenswert, daß keiner der Antikörper antivirale Aktivität oder HLA-DR induzierende Aktivität zeigte, wenn er mit Zellen in der Anwesenheit von Interferon γ inkubiert wurde.
Hybridom 177-1, subkloniert von Hybridom 177, wurde am 14.11.1988 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Paris, Frankreich, hinterlegt und besitzt die identifizierenden Eigenschaften CNCM I-814.

Beispiel 4

Bindung von Anti-Rezeptor-Antikörpern an Zellen

Die drei monoklonalen Antikörper Nrn. 37, 177 und 183 hemmten die Bindung von ¹²&sup5;J-Interferon γ an Zellen bei 4ºC. Der Test wurde durchgeführt wie in Beispiel 2a beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle I gezeigt. Jedoch hemmte nur Antikörper 177-1 die biologischen Aktivitäten von Interferon γ. Deshalb wurden vergleichende Bindungsstudien durchgeführt bei 37ºC in der Anwesenheit von Natriumazid (um die Internalisierung zu verhindern). Antikörper 177-1 besaß eine signifikant höhere Bindungskapazität an Zellen im Vergleich mit den zwei anderen Antikörpern. Dies ist in Fig. 1 gezeigt, wo HeLa-Zellen inkubiert wurden bei 37ºC (in der Anwesenheit von NaN&sub3;) mit monoklonalem Antikörper Nr. 37-1 ( ), 183-2 ( ) und 177-1 ( ); gefolgt von ¹²&sup5;J-Ziege-Anti-Mausserum. Hintergrundzählwerte (in der Abwesenheit von Anti-Rezeptor-Antikörper, 200 cpm) wurden subtrahiert. Die Bindung bei 4ºC mit 20 ug/ml der verschiedenen Antikörper ist ebenfalls gezeigt.
Der anschließende Zusatz von Interferon γ verursachte eine signifikante Verdrängung der gebundenen Antikörper Nr. 37-1 und 183-2 und nur eine minimale Verdrängung des neutralisierenden Antikörpers Nr. 177-1. Die Hemmung der Bindung der Anti- Rezeptor-Antikörper durch Interferon γ bei 37ºC ist in Fig. 2 gezeigt, wo HeLa-Zellen inkubiert wurden mit Anti-Rezeptor- Antikörpern Nr. 37-1 ( 30 ug/ml), 183-2 ( 30 ug/ml) oder 177-1 ( , 1,6 ug/ml), zusammen mit verschiedenen Konzentrationen an Interferon γ. Die Zellen wurden dann gewaschen und inkubiert mit ¹²&sup5;J-Ziege-Anti-Mausserum. Eine maximale Bindung ergab 3500 cpm. Die Hintergrundzählwerte (in der Abwesenheit von Anti-Rezeptor-Antikörpern, 200 cpm) wurden subtrahiert.

Beispiel 5

Die antivirale Aktivität und die Interferon γ induzierte HLA- DR-Expression werden durch die monoklonalen Antikörper blokkiert

Sämtliche Subklone von Antikörper Nr. 177 blockierten die antivirale Aktivität von Interferon γ. Der neutralisierende Titer der verschiedenen Subklone reichte von 4000 bis 30 000 Einheiten/ml. Keine solche blockierende Aktivität wurde beobachtet bei den beiden anderen Antikörpern. Die Ergebnisse sind in Tabelle II gezeigt. In einer Kontrolluntersuchung wurde von keinem dieser Antikörper gefunden, daß er die antivirale Aktivität von Interferon γ blockiert. Keiner dieser Antikörper besaß eine intrinsische Fähigkeit hin, um einen antiviralen Status in den Zellen hervorzurufen. Die monoklonalen Anti-Rezeptor-Antikörper wurden auf ihre Fähigkeit, die Induktion von HLA-DR-Antigenen in HeLa-Zellen durch Interferon γ zu blockieren, untersucht. Wieder einmal zeigte Antikörper Nr. 177-1 ( ) eine starke blockierende Aktivität, und 50% Hemmung wurde beobachtet bei einer Ascitisflüssigkeitverdünnung von 1 : 20 000. Antikörper 37-1 ( ) und 183-2 ( ) zeigten nur eine marginale blockierende Wirkung (Fig. 3). Die Inkubation von HeLa-Zellen mit einem der drei Antikörper in der Abwesenheit von Interferon γ induzierte nicht HLA-DR-Antigene. Als eine Positivkontrolle wurde der neutralisierende monoklonale Anti-Interferon γ-Antikörper Nr. 166-5 ( ), beschrieben in Novick D. et al. (1983) EMBO J. 2, S. 1527, verwendet. Er hemmte das Interferon γ induzierte HLA-DR, während eine solche Hemmung nicht beobachtet wurde mit einem monoklonalen Anti-Interferon γ-Antikörper Nr. 7, beschrieben in Novick D. et al. (1982) J. Immunol. 129, S. 2244 (nicht gezeigt). Die maximale Induktion von HLA-DR (in der Abwesenheit von Antikörpern) betrug 2700 ± 100 cpm. Der Basalspiegel (in Abwesenheit von Interferon γ) betrug 200 cpm und wurde von sämtlichen Werten subtrahiert.

Tabelle II

Neutralisation von Interferon γ-Aktivität in WISH- Zellen durch Anti-Rezeptor-Antikörper

Analysenprobe Titer (Einheiten/ml)
Immunserum (Maus) 35 000
Kontrollserum < 60
Hybridom 37 < 60
Hybridom 177 2000
Hybridom 177-1 4000
Hybridom 177-10 30 000
Hybridom 183 < 60
Ascitisflüssigkeit 177-10 60 000
Ein Subklon von Antikörper Nr. 177.
Die Hemmung der Interferon γ Klasse-II-MHC-Antigene (HLA-DR) durch Antirezeptorantikörper wurde wie folgt durchgeführt: He- La-Zellen (5 · 10&sup4; Zellen/Loch) wurden ausplattiert in 96-Loch- Platten und für 3 Stunden bei 37ºC in RPMI-1640-Medium (100 ul, enthaltend 1% FBS, RPMI-1%) inkubiert. Verschiedene monoklonale Antikörper wurden in serienmäßigen zweifachen Verdünnungen (mit 50 ul RPMI-1%) zugesetzt, und die Platten wurden weiter inkubiert bei 37ºC für 3 Stunden. Interferon γ (60 Einheiten/ml, 50 ul RPMI-1%) wurde dann zugesetzt, und die Platten wurden weiter inkubiert für 40 Stunden bei 37ºC. Die Platten wurden dann gewaschen mit kaltem PBS (3 · 100 ul) und fixiert mit Formaldehyd (3,5% in PBS, 100 ul) für 30 Minuten bei 0ºC. Die Platten wurden dann mit kaltem PBS abgespült und inkubiert mit einer Lösung von BSA (100 ul, 0,5% in 5 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5) für 30 Minuten bei 0ºC. Die Platten wurden dann mit kaltem PBS abgespült und für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit monoklonalem Anti-HLA-DR (L-243-Ascitesflüssigkeit 1 : 500 verdünnt in 50 ul RPMI-1640-Medium enthaltend 0,1% BSA und 0,1% Natriumazid) inkubiert. Die Platten wurden dann in PBS abgespült und inkubiert für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit ¹²&sup5;J-Protein A (10&sup5; cpm/Loch in 50 ul RPMI-1640-Medium enthaltend 0,1% BSA und 0,1% Natriumazid). Ein Überschuß an Radioaktivität wurde entfernt durch Waschen mit PBS, enthaltend 0,05% Tween 20 (3 · 200 ul). Die Zellen wurden dann solubilisiert mit NaOH (0,75 Nm 200 ul) und ausgezählt.
Die Bindung von Anti-Rezeptor-Antikörpern an Zellen bei 37ºC und die Verdrängung durch Interferon γ wurde wie folgt durchgeführt: HeLa-Zellen (3 · 10&sup5;/Loch) wurden ausplattiert und für 24 Stunden bei 37ºC in 24-Loch-Platten kultiviert. Das Medium wurde verworfen, verschiedene Konzentrationen an Anti-Rezeptor- Antikörpern (250 ul, in RPMI enthaltend 10% FBS und 0,04% Natriumazid) wurden zugesetzt zusammen mit Interferon γ (0-6 ug/ml), und die Platten wurden für 3 Stunden inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS-2%, wurde ¹²&sup5;J-Ziege-Anti-Mausserum (250 ul, 100000 cpm) zugesetzt. Die Platten wurden für 5 Stunden bei Raumtemperatur belassen, mit PBS-2% (3 · 1 ml) gewaschen, geerntet mit Trypsin und ausgezählt.

Beispiel 6

Hemmung des Interferon γ induzierten Anti-NK-Effekts durch Anti-Rezeptor-Antikörper

Die Widerstandsfähigkeit gegenüber der von natürlichen Killerzellen vermittelten Cytotoxizität (NK-CMC), induziert durch Interferon γ, wurde verhindert durch Inkubation der Zielzellen U- 937 (ATCC CRL1593) mit F(ab')&sub2;-Fragmenten, hergestellt von Antikörper Nr. 177-1, zusammen mit Interferon γ.
Die Hemmung war dosisabhängig und war sichtbar bei mehreren Verhältnissen von Effektorzelle: Zielzelle (E:T). Eine solche Hemmung wurde nicht beobachtet, wenn Antikörper 37-1 oder sein F(ab')&sub2;-Anteil mit den Zielzellen inkubiert wurde. Ein ähnliches Ausmaß der Hemmung der Interferon γ behandelten U-937- Zielzellen durch die Anti-Rezeptor-Antikörper (177-1) wurde erhalten, wenn die NK-Effektorzellen durch Vorinkubation mit Interferon α (Daten nicht gezeigt) aktiviert worden waren. Die Ergebnisse der Hemmung des Interferon γ induzierten Anti-NK- Effekts durch Anti-Rezeptor-Antikörper sind in Fig. 4 gezeigt, wo U-937-Zellen vorinkubiert wurden mit Anti-Rezeptor- Antikörper Nr. 37-1 ( ), 177-1 ( ) oder keinem Antikörper ( ) gefolgt vom Zusatz von Interferon γ. Kontrollzellen wurden nicht mit Interferon γ behandelt ( ). Die Zellen wurden dann mit [&sup5;¹Cr]-Na&sub2;Cro&sub4; markiert und mit Effektorzellen bei den angegebenen E:T-Verhältnissen gemischt. Die spontane Cytotoxizität betrug weniger als 6%.
Das Blockieren der Interferon γ induzierten Widerstandsfähigkeit gegenüber der NK-zellvermittelten Cytotoxizität durch Anti-Rezeptor-Antikörper wurde wie folgt getestet: U-937-Zielzellen (T) (3,5 · 10&sup5;) wurden für 3 Stunden bei 37ºC mit oder ohne monoklonale Anti-Rezeptor-Antikörper (50-100 ng in 750 ul RPMI 1640-Medium, enthaltend 10% FBS) vorinkubiert. Interferon γ (1000 Einheiten in 250 ul Medium) wurden zugesetzt, und die Inkubation wurde für weitere 9 Stunden fortgesetzt. Die Zellen wurden dann mit &sup5;¹[Cr]Na&sub2;Cro&sub4; (0,5 mCi, 1,5 Stunden) markiert, gewaschen und in dreifacher Ausfertigung inkubiert (10&sup4; Zellen, 50 ul/Loch) für 4 Stunden bei 37ºC mit den Effektorzellen (E, nicht an Nylonwolle haftende periphäre mononukleare Blutzellen, 100 ul/Loch) bei den angegebenen E:T-Verhältnissen. Die Zellen wurden dann zentrifugiert und der Überstand wurde ausgezählt (C). Die spontane Freisetzung (S; bis zu 6% der Gesamt-cpm) wurde in Überständen der Zielzellen alleine gemessen, und die Gesamt-cpm (T) wurden gemessen durch Zusatz von Triton® X-100 (1%, 100 ul) zu den markierten Zielzellen. Die Prozent Cytotoxizität wurden gemäß der folgenden Formel ermittelt:
%-Cytotoxizität = 100 · C-S/T-S

Beispiel 7

Herstellung eines Immunadsorptionsmittels und Immunaffinitätschromatographie mit Interferon γ-Rezeptorpräparationen aus Placenta

Ein Immunadsorptionsmittel wurde hergestellt aus einer Immunglobulinfraktion von Ascitesflüssigkeiten von Mäusen, enthaltend monoklonale Antikörper, die von den erfindungsgemäßen Hybridomen (z. B. Hybrodome 177 oder 183) sezerniert werden. Die Ascitesflüssigkeiten wurden mit Ammoniumsulfat bei 4ºC (Endkonzentration 50% Sättigung) präzipitiert. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation gesammelt, erneut in Wasser aufgelöst und gegen Kochsalzlösung dialysiert. Ungefähr 10 mg Immunglobuline wurden an Polyacrylhydrazid-Agarose (Biomakor) gebunden.
Eine solubilisierte Placentamembranpräparation wurde auf die Antikörpersäule bei 4ºC mit einer Flußrate von 0,2 ml/min geladen. Die Säule wurde mit PBS, enthaltend 0,1% Triton® X-100, (40 ml) gewaschen und eluiert mit Zitronensäure (50 mM, pH 2), enthaltend 0,05% Triton® X-100 und 0,02% Natriumazid. Eluierte Fraktionen wurden neutralisiert mit Hepespuffer (1 M, pH 8,5) und bei 4ºC aufbewahrt. Die Säule wurde untersucht durch Binden von radiomarkiertem Interferon γ und ein Reinigungsfaktor von 4250 wurde in einem Schritt erzielt (Tabelle III). Eine Analyse der gereinigten Rezeptorpräparation durch SDS-PAGE unter Verwendung eines 7,5% Polyacrylamidgels unter reduzierenden Bedingungen und Silberfärbung zeigten die Anwesenheit einer Hauptbande entsprechend einem Molekulargewicht von ungefähr 88 000. Dieser gereinigte Interferon γ-Rezeptor behielt seine Bindungsaktivität bei.
Die Ergebnisse der SDS-PAGE des immunaffinitätsgereinigten Interferon γ-Rezeptors sind in Fig. 5 gezeigt, wo Aliquots von solubilisiertem Membranrezeptor (Spur C, ug), immunaffinitätsgereinigter Rezeptor (Spur B, ug), Analysenprobenmedium alleine (Spur D) und Molekulargewichtsmarker (Spur A, Phosphorylase 94 000; Rinderserumalbumin 67 000; Ovalbumin 43 000 und Carbonatdehydrase 30 000) elektrophoretisiert wurden in der Anwesenheit von β-Mercaptoethanol in einem Polyacrylamidgel. Proteinbanden wurden sichtbar gemacht durch Silberfärbung. Tabelle III Immunaffinitätschromatographie mit Interferon γ-Rezeptor aus Placenta Schritt Protein (mg) ¹²&sup5;J-IFN-γ-Bindung (pmol) Spezif. Aktivität (pmol/mg) Reinigung (Faktor) Solubilisierte Membranen Eluate (Fraktionen 1-3)
Die Bindung von radiomarkiertem Interferon γ an einen löslichen Rezeptor für die Aufzeichnung des Reinigungsverfahrens wurde wie folgt durchgeführt: Aliquots (20-40 ul) des solubilisierten Rezeptors aus verschiedenen Reinigungsschritten wurden gemischt mit ¹²&sup5;J-Interferon γ (250 Einheiten) entweder mit oder ohne markiertem Interferon γ (100 000 Einheiten) in PBS, enthaltend 0,1% BSA (200 ul). Die Mischung wurde für 2 Stunden bei 4ºC inkubiert, Kaninchen-IgG (0,1% in PBS, 0,5 ml) wurde dann zugesetzt gefolgt von PEG-8000 (22% in PBS, 0,5 ml). Die Mischung wurde für 10 Minuten bei 4ºC belassen und dann durch ein 0,45 u- Filter (25 mm HAWP, Millipore) geleitet. Die Filter wurden mit kalter PEG-8000-Lösung (8% in PBS) gewaschen und ausgezählt. Die Hintergrundzählwerte wurden ermittelt in der Anwesenheit eines Überschusses an nicht markiertem Interferon γ und wurden subtrahiert. Die Bindung wird ausgedrückt in Picomolen ¹²&sup5;J- Interferon γ.

Beispiel 8

Analyse durch Western-Blotten

Analysenproben von affinitätsgereinigtem Rezeptor (500 ng/Tasche) wurden analysiert durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen und durch ein Elektroblotverfahren auf Nitrozellulosefolien (BA 85, Schleicher und Schuell) bei 60 Volt, 250 mA in 25 mM Tris Hcl/10 mM Glycinpuffer (pH 8,5)/20% Methanol für 2 Stunden bei 4ºC übertragen. Nach dem Elektroblottverfahren wurden die Nitrozellulosefolien über Nacht inkubiert mit 5% fettfreier Milch in PBS, enthaltend 0,05% Tween®-20 und 0,02% Natriumazid (Blockierpuffer). Die Nitrozellulose wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert mit einer Mischung der drei monoklonalen Anti-Interferon γ-Rezeptor-Antikörper (Immunglobulinfraktion der Ascitesflüssigkeiten, 10 mg/ml, 1 : 150 verdünnt in dem Blockierpuffer). Folgend auf die Waschvorgänge in 0,05% Tween®-20 in PBS wurde der Nitrozellulosefilter für 3 Stunden bei Raumtemperatur mit ¹²&sup5;J-Ziege-Anti-Mausserum (0,7 · 10&sup6; cpm/ml, in dem Blockierpuffer) inkubiert. Die Folie wurde dann gewaschen, getrocknet und autoradiographiert.
Western-Blotten der aufgeladenen Fraktion, des Durchlaufs und des Eluates wurde durchgeführt. Die Analyse eines Aliquots der aufgeladenen Fraktion, die aus solubilisierten Placentamembranen bestand, zeigte eine einzige Bande mit Molekulargewicht 88 000. Wenn diese Membranpräparation auf die Immunaffinitätssäule gegeben wurde, konnte die 88 000-Bande in der Durchlauffraktion nicht nachgewiesen werden.

Beispiel 9

Isolierung von cDNA-Klonen, die Interferon γ bindende Proteine kodieren, aus einer cDNA-Bank von HeLa-Zellen

1 · 10&sup6; Rekombinante von verschiedenen Inserts einer HeLa-cDNA- Bank in Lambda gt11 (Clontech Laboratories, Inc. USA) wurden mit der Hilfe von monoklonalen Anti-Interferon γ-Antikörpern abgesucht. Die Phagen wurden an Escherichia coli Stamm Y1090 adsorbiert, mit einer Dichte von 25 000 p.f.u./9 cm Petri- Schale ausplattiert und bei 42ºC für 4 Stunden kultiviert. 30 Minuten nach dem Transfer der Platten in 37ºC wurden Nitrozellulosefilter, die zuvor in 10 mM Isopropylthiogalactosidase (IPTG) eingetaucht worden waren, auf die Plaques aufgebracht und weiter inkubiert für 6 Stunden bei 37ºC, wonach ein zweiter Filter für 10 Stunden aufgebracht wurde.
Die Filter wurden markiert und in 10% Niedrigfettmilch (1%), 0,05% Tween®-20 in PBS zum Blockieren eingebracht (2 Stunden bei Raumtemperatur). Die zwei Filtersätze wurden in PBS, enthaltend 0,05% Tween®-20 gewaschen und mit monoklonalen Anti- Interferon γ-Rezeptor-Antikörpern, erhalten in Beispiel 3 (monoklonaler Antikörper 177-1 wurde vorzugsweise verwendet) (20 ug/ml in Blockierlösung), für 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Filter wurden 5 · mit PBS-Tween® gewaschen, und positive Klone wurden indentifiziert durch ¹²&sup5;J-Ziege-Anti- Maus-F(ab)&sub2; (7 · 10&sup5; cpm/ml in Blockierlösung) gefolgt von einer Übernachtinkubation bei 4ºC und ausgiebigem Waschen mit PBS-Tween®. Positive Klone wurden abgenommen in 1 ml TMG (10 mM Tris HCl, pH 7,5, l mM Magnesiumsulfat, 0,02% Gelatine), enthaltend 100 ul Chloroform, und die Phagen wurden weiter subkloniert mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens. In Fig. 6 zeigt die Fig. 6A das Absuchen einer HeLa-cDNA-Expressionsbank, und Fig. 6B zeigt das Subklonieren eines positiven Klons. DNA-Stocks wurden hergestellt aus 500 ml E. coli 1088, infiziert mit positiven Phagen. Die DNA wurde durch einen CsCl- Gradienten gereinigt, gefolgt von einer Phenol- Chloroformextration.

Beispiel 10

Charakterisierung der aus der cDNA-Bank von HeLa-Zellen isolierten Klone

Die gereinigten Lambda gt11 enthaltenden positiven cDNA-Klone wurden mit EcoRI gespalten und auf 1% Agarosegel größenfraktioniert. Vier der Klone besaßen eine Insertgröße von 0,5 kb und einer von 0,7 kb. Proben wurden hergestellt von einem der 0,5 kb-Klone (15-21-1) und von dem 0,7 kb-Klon (18-4-3), unter Verwendung des Multiprime-DNA-Markierungssystemkits (AMERSHAM). Die Technik basiert auf der Verwendung einer zufälligen Hexanukleotidsequenz, um die DNA-Synthese an denaturierter Matrizen- DNA an verschiedenen Stellen entlang ihrer Länge zu starten (Feinberg A.P. und Vogelstein B., A Technique for Radioabelling DNA Restriction Endonuclease Fragments to High Specific Activity, Anal. Biochem. (1983) 132: 6-13 und (1984) 137: 266). Kreuzhybridisierung zwischen den Klonen wurden untersucht durch Southern-Blots unter Verwendung der oben erwähnten Proben. Die 0,5 kb-Probe hybridisierte an alle vier 0,5 kb-Klone, aber nicht an den 0,7 kb-Klon, während die 0,7 kb-Probe nur an den 0,7 kb-Klon hybridisierte.
Das EcoRI-Insert des 0,5 kb-Klons 15-21-1 wurde in einem Bluescript-Vektor subkloniert, und E. coli TGI kompetente Bakterien wurden damit transformiert. Diese transformierten Bakterien wurden hinterlegt bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C.N.C.M.), Paris, Frankreich am 14.11.88 unter dem Budapester Vertrag, und besitzen die identifizierende Eigenschaft C.N.C.M. I-815.

Beispiel 11

Absuchen einer humanen Placenta-cDNA-Bank mit DNA-Proben

1 · 10&sup6; Rekombinante aus einer humanen Placenta-DNA-Bank in Lambda gt11 (Clontech Laboratories Inc., USA) wurden abgesucht mit Hilfe der oben erwähnten DNA-Proben, hergestellt aus den 0,5 kb- und 0,7 kb-Klonen (Beispiel 10). Phagen wurden an E.
coli Stamm 41088 adsorbiert, ausplattiert in einer Dichte von 25000 p.f.u/9 cm-Petrischale und bei 37ºC über Nacht kultiviert. Zwei Sätze an Nitrozellulosefiltern wurden aufgelegt und in ein Gefäß eingetaucht, enthaltend DNA-denaturierende Lösung. Die Filter wurden gewaschen, fixiert und vorhybridisiert, damit unspezifische DNA-Stellen durch die unmarkierte DNA abgesättigt werden konnten. Dann wurden die Filter hybridisiert mit ³²P- markierten Proben über Nacht bei 67ºC, gewaschen und autoradiographiert. 10 positive Klone wurden erhalten und abgenommen. DNA von den positiven Klonen wurde durch CsCl gereinigt und gefolgt von Phenol-Chloroformextraktion.

Beispiel 12

Charakterisierung der aus der humanen Placenta-DNA-Bank isolierten Klone

Die gereinigten Lambda gt11 DNA enthaltenden positiven cDNA- Klone wurden gespalten mit EcoRI und größenfraktioniert auf einem 1% Agarosegel. 9 der mit der 0,7 kb-Probe isolierten Klone besaßen eine Insertgröße von 1,15 bis 2,3 kb, und sie hybridisierten alle kreuz, während einer der mit der 0,5 kb-Probe isolierten Klone eine Insertgröße von 1,8 kb besaß und nur mit sich selbst hybridisierte. Die Kreuzhybridisierung wurde durch Southern Blots ermittelt.
Die Klone wurden weiter charakterisiert durch Spaltung mit Restriktionsenzymen. Das 1,8 kb-Fragment (Nr. 39) wurde durch die Restriktionsenzyme geschnitten, wie in der Restriktionskarte in Fig. 7 gezeigt. Eine KpnI-Stelle wurde in einem Abstand von 1,1 kb von der EcoRI-Stelle des Lambda gt11 gefunden (19,6 kb vom linken Ende). Eine SacI-Stelle wurde in einem Abstand von 0,6 kb von der EcoRI-Stelle des Lambda gt11 gefunden. Aus einem Southern-Blot-Experiment, bei dem das 1,8 kb-Fragment durch KpnI geschnitten und auf einem Gel laufengelassen wurde und die Probe das 0,5 kb-Fragment (15-21-1) war, wurde geschlossen, daß dieses 0,5 kb-Fragment in einer Weise angeordnet ist, daß seine KpnI-Stelle nahe dem rechten Ende des Lambda gt11 ist.
Das 2,3 kb-Fragment (Nr. 76) wurde geschnitten durch Restriktionsenzyme, wie in der Restriktionskarte in Fig. 8 gezeigt. Eine SalI-Stelle wurde in der Mitte des 2,3 kb-Inserts gefunden. Eine XbaI-Stelle wurde nahe der EcoRI-Stelle des Lambda gt11 gefunden (19,6 kb vom rechten Ende).

Beispiel 13

Sequenzieren der Klone

DNA der positiven 0,5 kb-, 0,7 kb-, 1,8 kb- und 2,3 kb-Klone, gereinigt auf einem CsCl-Gradienten, wurde durch das Restriktionsenzym EcoRI geschnitten. DNA des Bluescript Plasmidvektors von Stratagene Cloning System (San Diego, Kalifornien) wurde ebenfalls mit EcoRI geschnitten, dann dephosphoryliert und auf einem präparativen Agarosegel laufengelassen. Die DNA-Bande wurden aus dem Gel durch Phenol-Chloroform-Extraktionen extrahiert. Sowohl der Klon wie auch der Vektor waren jetzt fertig zur Ligierung mit Hilfe von T4-Ligase. E. coli (TG1) kompetente Bakterien wurden zur Transformation mit dem ligierten Vektor verwendet. Vektor wurde den Bakterien bei 4ºC zugesetzt, gefolgt von einem Hitzeschock (42ºC), auf Eis gegeben, dann bei Raumtemperatur und bei 37ºC aufbewahrt. Schließlich wurden die Bakterien ausplattiert auf LB + Ampicillin (Amp). Kolonien wurden abgenommen und in LB + Amp kultiviert. Zum Sequenzieren wurde eine einzelsträngige DNA wie folgt hergestellt: Eine Vorkultur von E. coli TG1 mit dem ligierten Vektor transformierte Bakterien wurde in 2TY-Medium und Ampicillin kultiviert, gefolgt von dem Zusatz eines Helfervirus. Die DNA wurde präzipitiert durch Polyethylenglycol und extrahiert durch Phenol- Chloroform. Schließlich wurde die DNA in Tris-EDTA suspendiert und war fertig zum Sequenzieren mit der Hilfe des Sequenase- Kits (USB).
Fig. 9 zeigt die Nukleotidsequenz des 0,5 kb-cDNA-Segments und seine translatierte Aminosäuresequenz. Fig. 10 zeigt den komplementären Strang des 0,7 kb-cDNA-Segments und seine translatierte Aminosäuresequenz. Fig. 11 zeigt zwei partielle Nukleotid- und translatierte Aminosäuresequenzen des 1,8 kb-cDNA- Segments. Fig. 12 zeigt eine partielle Nukleotidsequenz der 2,3 kb-cDNA und Fig. 13 eine partielle, translatierte Aminosäuresequenz davon.

Beispiel 14

Herstellung von Proteinlysaten der Lysogene (aus HeLa-Zellen)

Die verwendete Technik ist beschrieben in DNA Cloning, A Practical Approach, Band 1, Kapitel 2, herausgegeben von D.M. Glover, IRL Press.
1) Erzeugen eines rekombinanten Lambda-gt11-Lysogens in E. coli Y1089.
E. coli Y1089-Zellen wurden bis zur Sättigung kultiviert und mit dem rekombinanten Lambda-gt11-Phagen, enthaltend den oben beschriebenen 0,5 kb-Klon (15-21-1), bei 32ºC infiziert. Die Zellen wurden ausplattiert und bei 32ºC inkubiert (bei dieser Temperatur ist der temperatursensitive Phagenrezeptor funktionsfähig). Einzelne Kolonien wurden auf ihre Temperatursensitivität bei 42ºC getestet. Zellen aus einzelnen Kolonien wurden auf zwei Platten aufgetupft: Eine Platte wurde bei 42ºC inkubiert und die zweite bei 32ºC. Klone, die bei 32ºC aber nicht bei 42ºC wachsen sind Lysogene.
2) Herstellen eines Rohlysats aus dem rekombinanten Lambdagt11-Lysogen.
LB-Medium wurde inockuliert mit einer einzelnen Kolonie des E. coli Y1089 rekombinanten Lysogens (15-21-1) und bei 32ºC kultiviert. Wenn die optische Dichte der Kultur bei 600 nm 0,5 betrug, wurde die Temperatur rasch auf 42ºC gesteigert und bei 42ºC für 20 Minuten inkubiert. Dann wurde IPTG auf eine Endkonzentration von 10 mM zugesetzt, und die Kultur wurde für 75 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, in einem Proteinpuffer (10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0,1% Triton® X-100, 1 mM PMSF und 20 TIU Aprotinin) suspendiert und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Auf das erste Auftauen folgend wurde Lysozym zugesetzt auf eine Endkonzentration von 0,3 mg/ml, und DNase wurde zugesetzt auf eine Endkonzentration von 5 bis 10 ug/ml. Durch Wiederholen von raschem Auftauen und Einfrieren, dreimal, wurde eine komplette Lyse des induzierten Lysogens erhalten. Der erhaltene Rohextrakt wurde zentrifugiert bevor er auf eine Immunaffinitätssäule gegeben wurde.

Beispiel 15

Immunaffinitätschromatographie der Rohlysate

Ein Immunadsorbenz wurde hergestellt wie in Beispiel 7. Der rohe E. coli-Extrakt, erhalten in Beispiel 14 (100 mg des Lysogens) wurde zentrifugiert (10 000 xg), und der Überstand wurde auf die Antikörpersäule (3 mg Igs/0,3 ml Agarose) bei 4ºC gegeben. Die Säule wurde mit PBS, enthaltend 0,1% Triton® X-100 gewaschen und eluiert durch Zitronensäure (50 mM, pH 2), enthaltend 0,05% Triton® X-100 und 0,02% Natriumazid. Fünf 0,5 ml- Fraktionen wurden gesammelt in HEPES-Puffer (1 M, pH 8,5) und bei 4ºC aufbewahrt. Fraktionen Nr. 1 und Nr. 2 enthielten 75% des eluierten Proteins. Analyse der gereinigten Lysatpräparation durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen und Silberfärbung zeigte die Anwesenheit einer Hauptbande entsprechend einem Molekulargewicht von ungefähr 130 000 (das Molekulargewicht von β-Galaktosidase beträgt 114 000). Die Ergebnisse sind in Fig. 14 gezeigt: Spur A - β-Galaktosidase; Spur B - Lysatelutionsfraktion; Spur C - aufgetragene Fraktion (Rohlysogen); Spur D - Molekulargewichtsmarker.

Beispiel 16

Western-Blotten

Proben von jedem rohen E. coli-Extrakt, enthaltend das induzierte fusionierte Protein (100 ug/Spur), oder von affinitätsgereinigtem fusioniertem Protein (1 ug/Spur) wurden durch SDS- PAGE unter reduzierenden Bedingungen analysiert und per Elektroblotverfahren auf Nitrozellulosefolien bei 60 Volt, 250 mA, in 25 mM Tris-HCl/10 mM Glycinpuffer (pH 8,5) /20% Methanol für 2 Stunden bei 4ºC übertragen. Nach dem Elektroblotverfahren wurde die Nitrozellulosefolie über Nacht mit 10% fettfreier Milch in PBS, enthaltend 0,05% Tween®-20 und 0,02% Natriumazid (Blockierpuffer), inkubiert. Die Nitrozellulose wurde für 3 Stunden bei Raumtemperatur mit monoklonalen Anti-Interferon γ- Rezeptor-Antikörpern (Immunglobulinfraktion von Ascitesflüssigkeit, 10 mg/ml, 1 : 500 verdünnt in dem Blockierpuffer) inkubiert. Folgend auf Waschschritte in 0,05% Tween®-20 in PBS wurde die Nitrozellulosefolie über Nacht bei 4ºC mit ¹²&sup5;J-Ziege-Anti-Mausserum (0,7 · 10&sup6; cpm/ml in dem Blockierpuffer) inkubiert. Die Folie wurde dann gewaschen, getrocknet und autoradiographiert. Wie in Fig. 12 gezeigt, wurde eine Bande von Mr von ungefähr 130 000 sowohl in den rohen wie in den affinitätsgereinigten Fraktionen erhalten. In Fig. 15: Spur A - Molekulargewichtsmarker; Spur B - immunaffinitätsgereinigtes Lysogen; Spur C - rohes Lysogen.

Beispiel 17

Vernetzung von radiomarkiertem ¹²&sup5;J-Interferon γ mit fusioniertem Protein

Präparationen des affinitätsgereinigten fusionierten Proteins (5 ug) oder von reiner β-Galaktosidase wurden mit ¹²&sup5;J-Interferon γ (1000 Einheiten, 5 · 10&sup5; cpm) in der Anwesenheit oder Abwesenheit von unmarkiertem Interferon γ (1000-fach) vermischt, und die Mischung wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt. Disuccinyl-Suberat (DSS) wurde auf eine Endkonzentration von 0,3 mM zugesetzt. Die Vernetzung wurde nach 15 Minuten bei 4ºC durch den Zusatz von 1 M Tris-HCl-Puffer gestoppt. Die Mischung wurde immunpräzipitiert mit Anti-β-Galaktosidase-Kaninchenserum (1 : 200, 2 Stunden bei Raumtemperatur), gefolgt von dem Zusatz von Prot-A-Sepharose-Kügelchen. Die Kügelchen wurden zweimal mit PBS, enthaltend 0,05% Tween®-20, und einmal mit PBS gewaschen, suspendiert in einem Analysenprobenpuffer, und der Überstand wurde analysiert durch SDS-PAGE gefolgt von Autoradiographie. Wie in Fig. 16 gezeigt, Spur E, wurde ein Komplex von M.W. = 155 000 erhalten, wenn das fusionierte Protein, kodiert durch den 0,5 kb-Klon, vernetzt wurde mit ¹²&sup5;J-Interferon γ. Die Bande verschwand durch den Zusatz eines Überschusses an unmarkiertem Interferon γ (Spur D). Eine solche Bande wurde nicht beobachtet, wenn die Vernetzung durchgeführt wurde mit reiner β-Galaktosidase selbst (Spur F). In Fig. 16: Spur A - Molekulargewichtsmarker; Spuren B und C - reines Lysogen (0,7 kb) vernetzt mit ¹²&sup5;J-Interferon γ in der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Überschusses an unmarkiertem Interferon γ; Spuren D und E - reines Lysogen (0,5 kb) vernetzt mit ¹²&sup5;J-Interferon γ in der Abwesenheit oder Anwesenheit eines Überschusses von unmarkiertem Interferon γ; Spur F - reine β- Galaktosidase vernetzt mit ¹²&sup5;J-Interferon γ.

Beispiel 18

Expression von cDNA-Klon 39

Das 1,8 kb Insert des Lambda-gt11-Klons Nr. 39, isoliert aus der humanen Placenta-cDNA-Bank mit der 0,5 kb-Probe (wie in Beispiel 12), wurde durch EcoRI herausgeschnitten und in die EcoRI-Stelle des KS-Bluescript-Vektors (BS) von Statagene Cloning Systems (La Jolla, Cal.) eingefügt. In der erhaltenen BS-39cDNA war die Orientierung so, daß die AhaIII-Stelle an dem 3'-Ende des Sinnstrangs des 1,8 kb-Inserts (Fig. 7) dicht bei der HindIII-Stelle und dem T3-RNA-Polymerase-Promotor des BS- Vektors liegt, während das 5'-Ende nahe der BamHI-Stelle und dem T7-RNA-Polymerase-Promotor des BS-Vektors (Fig. 17) liegt. Als Expressionsvektor verwendeten wir das Plasmid TL-Interferon-αc, beschrieben von Chernajovsky Y., et al. in Biochemical Engineering III, Annals N.Y. Acad. Sci., Band 413, Seiten 88- 96, 1983. Dieses Plasmid, das einen tryp-lac-Promotor und eine ribosomale Bindungsstelle, gefolgt von einer EcoRI-Stelle, enthält, wurde durch EcoRI und HindIII geschnitten und mit einem synthetischen EcoRI-BamHI-Linker (enthaltend den Initiator ATG) an das BamHI-HindIII-Fragment von BS-39cDNA ligiert, um Plasmid TL-39cDNA (Fig. 17) zu ergeben. Dieses Konstrukt fügt der kodierenden Sequenz des 39cDNA-Fragments 9 Kodons bei. Das TL- 39cDNA-Plasmid wurde in E. coli JM101 iq transfektiert, und Kulturen wurden induziert mit Isopropylthiogalaktosidase (IPTG), wie beschrieben von Chernajovsky et al., (s. o.). Ernten der Zellen und Extraktion des Proteins, Immunaffinitätschromatographie, Western Blotting und Vernetzen des ¹²&sup5;J-Interferon γ wurden durchgeführt wie in Beispielen 14 bis 17. Für die Vernetzung von ¹²&sup5;J-Interferon γ wurde entweder Anti-Interferon-γ- Kaninchenserum oder monoklonale Anti-Interferon-γ-Rezeptor- Maus-Antikörper zur Immunpräzipitation verwendet.
In Fig. 18: Spur A - Molekulargewichtsmarker; Spur B - Rohextrakt von nicht induzierten Bakterien Nr. 39. Spur C und D - Rohextrakt von IPTG-induzierten Bakterien Nr. 39 nach 60 Minuten bzw. 45 Minuten der Induktion. Der Blot wurde inkubiert mit Antikörper Nr. 177-1. Spuren E bis H - wie A bis D, aber inkubiert mit Antikörper Nr. 183. Spuren I bis L - wie A bis D, aber inkubiert mit Anti-Interferon γ-Antikörper (Negativkontrolle). Wie in Fig. 18 gezeigt, wurde eine einzige Bande von Mr von 32 000 erhalten, wenn der Blot mit Antikörper Nr. 177-1 (Spuren C und D) inkubiert worden war. Wenn der Blot mit Antikörper Nr. 183 inkubiert worden war, wurde eine Hauptbande von Mr von 32 000 und eine Nebenbande von Mr von 17 000 erhalten (Spuren G und H).
Die Größe des Proteins kann kleiner sein als die des natürlichen Produkts der 39cDNA, da nur ein Fragment dieser DNA in dem Konstrukt verwendet wurde. Dieses Protein umfaßt die in Fig. 11 gezeigten Sequenzen. Die Sequenz des BalI-KpnI-Fragments (Fig. 11B) umfaßt die in Fig. 9 gezeigte Sequenz.

Beispiel 19

Expression von Klon 76cDNA

Das 2,3 kb-Insert des Lambda-gt11-Klons Nr. 76, isoliert aus der humanen Placenta-cDNA-Bank mit der 0,7 kb-Probe (wie in Beispiel 12), wurde mit EcoRI herausgeschnitten und in die Eco- RI-Stelle des KS-Bluescript-Vektors eingefügt, so daß die XbaI- Stelle an dem 3'-Ende des Sinnstrangs des 2,3 kb-Inserts (Fig. 8) nahe an der BamHI-Stelle und dem T7-RNA-Polymerase-Promotor des BS-Vektors liegt, während das 5'-Ende nahe an der HindIII- Stelle und dem T3-RNA-Polymerase-Promotor des Plasmid-BS-Vektors liegt. Das Expressionsplasmid TL-Interferon αc wurde mit EcoRI und HindIII gespalten und erneut ligiert mit einem synthetischen EcoRI-HindIII-Linker (Fig. 19). Das erhaltene Plasmid wurde erneut geschnitten mit HindIII und BamHI und mit der HindIII-BamHI-2,3 kb-cDNA, herausgeschnitten aus dem obigen BS- Klon 76cDNA, ligiert, um TL-76cDNA zu ergeben (Fig. 19). Dieses Plasmid wurde in E. coli JM101 iq transfektiert, und Kulturen wurden mit IPTG induziert. Ein 34 000 und ein 17 000 Mr Proteinprodukt wurde identifiziert, die mit dem monoklonalen Antikörper 183 auf Immunblots reagierten (Fig. 20). Dieses Protein umfaßt die in Fig. 13 gezeigte Sequenz. Extraktion aus der Zellkultur, Immunaffinitätschromatographie, Western-Blotting und die ¹²&sup5;J-Interferon γ-Vernetzung wurde wie oben durchgeführt.
In Fig. 20: Spur A, B - Rohextrakt von IPTG-induzierten Bakterien Nr. 76 nach 120 min bzw. 180 min. Spur C - Rohextrakt von nicht-induzierten Bakterien Nr. 76. Spur D - Molekulargewichtsmarker. Der Blot wurde inkubiert mit einer Mischung von Antikörper Nr. 177-1 und 183.
Wie in Fig. 20 gezeigt, wurden induzierte Proteine mit Mr von 17 000 und 32 000 erhalten, wenn der Blot mit einer Mischung von Antikörper Nr. 177-1 und 183 inkubiert worden war (Spuren A und B).

Brauchbarkeit und Zusammensetzungen

Die erfindungsgemäßen Interferon γ bindenden Proteine, die im wesentlichen dazu homologen Proteine und Fragmente davon können entweder alleine oder zusammen verwendet werden zum Modulieren der Aktivität und zum Schützen vor den schädlichen Wirkungen von Interferon γ durch systemische oder lokale Verabreichung. Sie sind brauchbar bei der Behandlung von Zuständen, bei denen ein Überschuß von Interferon γ endogen gebildet wird oder exogen verabreicht wird. Somit ist die Modulation der Interferonγ-Aktivität durch Interferon γ bindendes Protein vorteilhaft in Fällen von ungewünschter Produktion von endogenem Interferon γ, das erfolgen kann bei lokaler Entzündung, systemischer Entzündung, wie sie bei einem septischen Schock und bei verschiedenen Autoimmun- und entzündlichen Erkrankungen auftritt, einschließlich ohne darauf beschränkt zu sein, rheumatoide Arthritis, multiple Sklerose, juveniler Diabetes bei seinem Beginn, Polymyositis, Behcet Krankheit, Thyroiditis, Lupus erythematosus und Dermatitis. Die Modulation der Interferon γ-Aktivität durch die Interferon γ bindenden Proteine ist auch vorteilhaft in Fällen der Verabreichung von exogenem Interferon γ, jedesmal, wenn Nebenwirkungen aufgrund einer Überdosis oder der Sensitivität des Patienten gegenüber Interferon γ diagnostiziert wird. Alternativ können die Interferon γ bindenden Proteine verwendet werden zum Verlängern oder sogar zum Verstärken der antiviralen, entzündungshemmenden, antizellulären oder jeder beliebigen Aktivität von endogenem und exogenem Interferon γ.
Die erfindungsgemäßen Proteine können nach bekannten Verfahren formuliert werden, um pharmazeutisch brauchbare Zusammensetzungen in einer Mischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägervehikel herzustellen. Geeignete Vehikel und deren Formulierungen sind beschrieben z. B. in Remington's Pharmaceutical Sciences von E.W. Martin.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden hergestellt zur Verabreichung durch Mischen des Proteins mit physiologisch verträglichen Trägern, Stabilisatoren und Hilfsstoffen, und sie werden in dosierbarer Form hergestellt, z. B. durch Lyophilisierung in Dosiergefäßen. Die Menge an zu verabreichendem aktivem Bestandteil hängt ab von dem Weg der Verabreichung, der zu behandelnden Krankheit und dem Zustand des Patienten. Die Art der Verabreichung kann nach jeder beliebigen Methode der Verabreichung für ähnliche Mittel erfolgen und hängt von dem zu behandelnden Zustand ab.

Claims

1. DNA-Molekül, das ein Protein kodiert, umfassend die folgende Aminosäuresequenz:

oder ein Protein, das im wesentlichen homolog dazu ist und das Interferon γ bindende Aktivität besitzt.

2. DNA-Molekül nach Anspruch 1, umfassend ein rekombinantes DNA-Molekül oder ein cDNA-Molekül, wobei das rekombinante DNA- Molekül oder cDNA-Molekül die folgende Nukleotidsequenz umfaßt:

3. cDNA-Molekül nach Anspruch 2 von 0,5 kb oder 1,8 kb, wobei die 1,8 kb-cDNA durch Spaltung mit Restriktionsenzymen die unten gezeigte Restriktionskarte ergibt:

wobei das cDNA-Molekül weiterhin die folgenden Nukleotidsequenzen umfaßt:

4. Rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, funktionsfähig verknüpft mit einer DNA-Sequenz, die die Expression der DNA beeinflussen kann, die ein Protein kodiert, umfassend die folgende Aminosäuresequenz:

5. DNA-Molekül, das ein Protein kodiert, das die folgende Aminosäuresequenz umfaßt:

6. DNA-Molekül nach Anspruch 5, umfassend ein rekombinantes DNA-Molekül oder ein cDNA-Molekül, wobei das rekombinante DNA- Molekül oder cDNA-Molekül die folgende Nukleotidsequenz umfaßt:

7. Rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 5 oder 6, funktionsfähig verknüpft mit einer DNA-Sequenz, die die Expression der DNA beeinflussen kann, die für ein Protein kodiert, umfassend die folgende Aminosäuresequenz:

8. Protein, worin mindestens ein Teil des Proteinmoleküls kodiert wird durch die folgende Nukleotidsequenz:

wobei das Protein Interferon γ bindende Aktivität besitzt.

9. Protein nach Anspruch 8, umfassend die folgende Aminosäuresequenz:

10. Protein nach Anspruch 8 oder 9, umfassend die folgende Aminosäuresequenz:

11. Protein nach Anspruch 10, das weiterhin die Aminosäuresequenz umfaßt, die an der unten gezeigten Arg-Gly-Asn-Ser- Sequenz beginnt:

12. Protein nach einem der Ansprüche 8 bis 11 oder ein Protein, das im wesentlichen homolog dazu ist und das Interferon γ bindende Aktivität besitzt oder ein Fragment davon, das Interferon γ bindende Aktivität besitzt.

13. Protein, umfassend die folgende Aminosäuresequenz:

oder ein Protein, das im wesentlichen homolog dazu ist und das Interferon γ bindende Aktivität besitzt oder ein Fragment davon.

14. Protein, das durch die folgende Nukleotidsequenz kodiert ist:

oder durch einen Teil davon, wobei das Protein Interferon γ bindende Aktivität besitzt.

15. Protein nach Anspruch 13 oder 14 oder ein Protein, das im wesentlichen homolog dazu ist, oder ein Fragment davon mit Interferon γ bindender Aktivität.

16. Replizierbares Expressionsvehikel, umfassend das DNA- Molekül nach Anspruch 4 und das in einer transformierten Wirtszelle ein Protein nach einem der Ansprüche 8 bis 12 exprimieren kann.

17. Replizierbares Expressionsvehikel, umfassend das DNA- Molekül nach Anspruch 7 und das in einer transformierten Wirtszelle ein Protein nach einem der Ansprüche 13 bis 15 exprimieren kann.

18. Wirtszelle transformiert mit dem replizierbaren Expressionsvehikel nach Anspruch 16.

19. Wirtszelle transformiert mit dem replizierbaren Expressionsvehikel nach Anspruch 17.

20. Prokaryotische Wirtszelle nach Anspruch 18 oder 19.

21. Eukaryotische Wirtszelle nach Anspruch 18 oder 19.

22. Verfahren zum Herstellen eines Proteins nach einem der Ansprüche 8 bis 15, umfassend die Schritte:

a) Kultivieren einer transformierten Wirtszelle nach Anspruch 18 oder 19 in einem geeigneten Kulturmedium und

b) Isolieren des Proteins.

23. Monoklonaler Antikörper gegen den humanen Interferon-γ- Rezeptor, der die Bindung von Interferon γ an seinen Rezeptor blockiert und die biologische Aktivität von Interferon γ hemmt, wobei der monoklonale Antikörper gegen den humanen Interferonγ-Rezeptor weiterhin an ein Interferon γ bindendes Protein binden kann, das kein Interferon-γ-Rezeptor ist.

24. Monoklonaler Antikörper gegen humanen Interferon-γ-Rezeptor nach Anspruch 23, wobei der Antikörper hergestellt wird durch Hybridom CNCM 1-814 (Nr. 177-1).

25. Hybridom CNCM I-814 (Nr. 177.1).

26. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Protein nach einem der Ansprüche 8 bis 15 als aktiven Bestandteil zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

27. Protein nach einem der Ansprüche 8 bis 15 zur Verwendung zum Schützen gegen die schädlichen Wirkungen von IFN-γ in Säugern.

28. Protein nach einem der Ansprüche 8 bis 15 zur Verwendung bei der Behandlung von Zuständen, in denen ein Überschuß an IFN-γ endogen gebildet oder exogen verabreicht wird.

29. Protein nach einem der Ansprüche 8 bis 15 zum Schützen gegen die Wirkung von IFN-γ bei Autoimmunerkrankungen.

30. Protein nach einem der Ansprüche 8 bis 15 zur Verwendung beim Modulieren der Wirkungen von IFN-γ.