DE3587360T2

DE3587360T2 - Verfahren zur Herstellung von chimärischen monoklonalen Antikörpern.

Info

Publication number: DE3587360T2
Application number: DE19853587360
Authority: DE
Inventors: Yoshikazu Lions Mansi Kurosawa; Kou-Zou Sugita; Masaru Taniguchi
Original assignee: Research Development Corp of Japan
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1984-08-15
Filing date: 1985-03-08
Publication date: 1993-10-14
Anticipated expiration: 2005-03-09
Also published as: CA1339201C; EP0171496A3; EP0171496A2; JPH0373280B2; DE3587360D1; EP0171496B1; JPS6147500A; DE171496T1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von chimeren monoclonalen Antikörpern. Insbesondere betrifft diese Erfindung die Herstellung von chimeren monoclonalen Antikörpern, deren Nebenwirkungen, wie Anaphylaxie und Serumallergie, stark reduziert sein sollen, insbesondere wenn sie einem Menschen verabreicht werden.
Ein monoclonaler Antikörper mit Monospezifität erhielt einen großen Einfluß in der Immunologie, und seine Nützlichkeit wurde bereits in solchen Wissenschaften, wie der Biologie, der Pharmakologie, der Chemie und anderen nachgewiesen.
Was ihr Herstellungsverfahren betrifft, so gelang die Durchführung 1975 Köhler und Milstein durch Fusion von Mausmilzzellen, die mit Schaferythrocyten sensibilisiert worden waren, und Mausmelanomzellen (vergleiche Nature; 256, 495-497 (1975)). Abgesehen davon gibt es ein anderes Verfahren, bei dem das Epstein-Barr-Virus verwendet wird (vergleiche offengelegte japanische Patentpublikation Nr. sho 58-201723).
Da sich jedoch die meisten monoclonalen Antikörper von Tieren, ausgenommen des Menschen, ableiten, nimmt man an, daß sie solche Nebenwirkungen wie Anaphylaxie oder Serumkrankheit bei Verabreichung an den Menschen verursachen, weil heterologe Proteine in einen menschlichen Körper injiziert werden. Folglich wurden bis jetzt verschiedene Versuche unternommen, um vom Menschen abgeleitete monoclonale Antikörper unter Verwendung von menschlichen Hybridomen herzustellen. Unter diesen sind die japanischen Patentpublikation Nr. sho 57-126424, sho 57-502090, sho 58-90517, sho 58- 128323 und sho 57-50209 beispielsweise.
Diese Versuche besagen, daß die Herstellung von, von- einem Menschen abgeleiteten, monoclonalen Antikörpern mit Sicherheit möglich ist, aber immer noch unzureichend angesichts dessen Reproduzierbarkeit und anderer Gesichtspunkte ist (vergleiche Nature; 300, 316-317 (1982)). Zusätzlich besteht ein Nachteil dahingehend, daß die Immunisierung des Menschen mit irgendeinem gewünschten Antigen unmöglich ist, obwohl die Immunisierung von Tieren, wie Mäusen, mit verschiedenen Antigenen möglich ist.
In dieser Hinsicht wurde ein Versuch unternommen, coliforme Bakterien zur Erzeugung eines vom Menschen abgeleiteten monoclonalen Antikörpers durch Insertion einer komplementären DNA in das Plasmid pBR 322 zu veranlassen. Diese cDNA wurde durch u-Ketten spezifische mRNA, erhalten aus Mensch-Maus- Hybridomen, die menschliche monoclonale Antikörper erzeugen, erhalten. Da es jedoch unmöglich ist, den Menschen mit verschiedenen Antigenen, soweit gewünscht, zu immunisieren, muß gesagt werden, daß hier noch ein Problem besteht.
Die EP-A-0 125 023 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von chimeren Antikörpern bzw. Immunglobulinen, die solchen, die normalerweise in vertebraten Systemen gefunden werden, analog sind. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 81, Seiten 3273-3277, Juni 1984, beschreibt die Konstruktion von Plasmiden aus H- und/oder L-Ketten von CEA-Antikörpern, die direkt in E. coli erzeugt werden.
Unter diesen Umständen führten die genannten Erfinder verschiedene Studien durch, um die vorstehenden Nachteile zu beseitigen und führten schließlich diese Erfindung aus. Das heißt, die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von chimeren monoclonalen Antikörpern, bestehend aus einer, von einer Maus abgeleiteten, variablen Region und einer vom Menschen abgeleiteten konstanten Region, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) in einen Expressionsvektor die aktiven VH- und VL-Gene isoliert, von Hybridomen als Antikörper-erzeugenden Zellen der Maus, und die aktiven Gene CH und CL, isoliert aus menschlicher DNA, insertiert und dann (b) einen Expressionsvektor aus (a) in Lymphomazellen als gezüchtete tierische Zellen einbringt.
Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von chimeren monoclonalen Antikörpern bereitzustellen, deren Nebenwirkungen, wie anaphylaktischer Schock und Serumkrankheit, stark reduziert sind, indem eine variable Region, abgeleitet von einer Maus und eine konstante Region, abgeleitet von einem Menschen kombiniert werden, weil die meisten herkömmlichen monoclonalen Antikörper sich ausschließlich von Tieren, ausgenommen des Menschen ableiten und so vermutlich eine Ursache für solche Nebenwirkungen, wie anaphylaktischer Schock und Serumkrankheit bei Verabreichung an einen menschlichen Körper aufgrund der Tatsache, daß sie heterologe Proteine sind, sind.
Dieses Herstellungsverfahren kann leicht mit reduzierten Kosten und Sicherheit industrialisiert werden.
Die vorstehenden und anderen Aufgaben und Besonderheiten dieser Erfindung gehen nachher deutlicher aus einer Betrachtung der folgenden Beschreibung zusammen mit den beigefügten Zeichnungen, worin ein Beispiel als Beispiel angegeben ist, hervor.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine Röntgenphotographie, die das Ergebnis der Southern Hybridisierung zeigt, die durchgeführt wurde, um aktives Maus-V-Gen und menschliches C-Gen zu isolieren und der mRNA Northern-Blotting-Analyse davon; Fig. 1B erläutert schematisch die verschiedenen Clone, die aus Hybridomen und einer menschlichen Gen-Bank isoliert wurden, worin (a) den Clon VJχ 14, (b) den Clon VJH 243, (c) den Clon HCχ 2, und (d) den Clon HG 163 erläutert.
Fig. 2 zeigt Plasmidstrukturen, die zur Verwendung für die DNA-Transformation gebildet wurden, worin (a) die Struktur des Plasmids pSV2-HCKVD10 und (b) die Struktur des Plasmids pSV2-HGIVD10 zeigt;
Fig. 3 zeigt Diagramme einer FACS-Analyse, und
Fig. 4A ist eine Röntgenphotographie, die das Ergebnis der DNA Southern Hybridisierung mit HMH-Zellen zeigt; Fig. 4B ist eine Röntgenphotographie, die das Ergebnis der mRNA Northern-Blotting-Analyse zeigt.
Der hier verwendete Ausdruck "aktive VH- und VL-Gene", bedeutet funktionelle Gene, die die Struktur V-D-J hinsichtlich VH und die Struktur V-J hinsichtlich VL besitzen, mit der Maßgabe, daß VH und VL durch die DNA-Anordnung in Antikörper-erzeugenden Zellen gebildet werden.
Hybridome, clonierte B-Zellen und B-Zellen, die mit dem Epstein-Barr-Virus transformiert sind, werden bevorzugt als die Antikörper-erzeugenden Zellen verwendet; und die Vektoren pSV2-gpt, pSV2-neo und SV40 werden bevorzugt als die "Expressionsvektoren" verwendet.
Jedoch können beliebige Zellen ausgewählt aus Lymphomazellen, Nierenzellen, L-Zellen, COS-Zellen und HeLa-Zellen abgeleitet von einer Maus als "gezüchtete tierische Zellen" verwendet werden.
Mittlerweile sind erfindungsgemäß Mäuse so leicht zu immunisieren, daß jeder beliebige chimere monoclonale Antikörper erhalten werden kann. Zur gleichen Zeit wird natürlicherweise erwartet, daß die Antigenizität der heterologen Immunglobulinproteine stark bei der Verwendung der erfindungsgemäßen chimeren monoclonalen Antikörper, verglichen mit anderen, die sich nur von Tieren ableiten, verringert wird.
Die vorliegende Erfindung wird anhand des folgenden Beispiels näher erläutert.

Beispiel

Isolierung des Maus-V-Gens

Das Hybridom D10, früher als M2590 bezeichnet, ist die fusionierte Zelle zwischen der aufnehmenden Tumorzelle P3U1 und der, von der C57BL/6 Maus abgeleiteten Milzzelle, die mit einer B-16 Melanomzelle, die spontan in einer C57BL/6 Maus erzeugt wurde, immunisiert wurde. D10 scheidet den Antikörper, der mit den Melanomzellen selektiv reagiert, aus. Die Art dieses Antikörpers ist IgM für die schwere Kette und Kappa für die leichte Kette.
Zuerst wird DNA aus D10, P3U1 bzw. C57BL/6 Mausnieren isoliert (vergleiche Cell; 24, 353-356 (1981)). Als nächstes werden 10 ug DNA mit dem Restriktionsenzym Hind III und EcoRI abgebaut. D10, P3U1 und die von der C57BL/6 Maus abgeleitete DNA, welche mit Hind III abgebaut wurden, werden in einem 0,9%igen Agarosegel entwickelt und auf Nitrocellulosemembran überführt (siehe Schleicher and Schvell; J. Mol. Biol., 98, 503-515 (1975)). Andererseits wird die Hybridisierung mit einer Jχ-Sonde (10&sup7; cpm/0,1 ug DNA), die dem 2,7 Kb Hind III-Hind III-Fragment, das die Jχ-Region enthält, welches von Mr. Susumu Tonegawa (vergleiche Nature; 280, 288-294 (1979)) zur Verfügung gestellt wurde, entspricht, durchgeführt. Das Ergebnis ist in Fig. 1A(a) gezeigt.
Wie aus Fig. 1A(a) hervorgeht, existieren drei neu angeordnete Banden bei 6,5, 6,3 und 6,1 Kb in der D10 DNA. Die zwei Banden bei 6,3 und 6,1 Kb sind die gleichen wie die, die in der P3U1 DNA gefunden wird. Die Bande bei 6,5 Kb ist ein aktives Gen, das die Vχ-Jχ-Struktur enthält. Dieses Gen ist für dessen Antigenspezifität verantwortlich. Die Größe der DNA wird unter Verwendung des λ-Phagen als Marker für Hind III abgeschätzt. Die DNA-Fragmente, die dieser Größe entsprechen, werden mittels Agarosegel-Elektrophorese isoliert, in den λ-Phagen-Hind III Vektor λ 788 insertiert, der von Mr. K. Murray der Edingburgh University zur Verfügung gestellt wurde (vergleiche Mole. Gen. Genet.; 150, 53- 61 (1977)) und dann in λ-Phagen verpackt. Die coliformen Bakterien BHB 2688 und BHB 2690 werden als Verpackungsgemisch verwendet (vergleiche Hohn. B. Meth. Enzymol.; 68, 299-309 (1979)). Als nächstes wird die Plaque-Hybridisierung gemäß dem Benton-Davis-Verfahren (Science, 196, 180-182 (1977)) unter Verwendung einer Jχ-Sonde zum Absuchen durchgeführt. Der Clon VJχ-14 wird isoliert. Die Restriktionskarte des Clons ist in Tabelle 1B(a) angegeben.
Das mit Hind III insertierte VJχ-Fragment wird isoliert, um die Northern Hybridisierung durchzuführen. Die Gesamt-RNA wird aus D10 nach dem Guanidinium-Thiocyanat-Verfahren isoliert (Biochemistry; 18, 5294-5299 (1979)); danach wird Poly-A-haltige mRNA aus den Fraktionen, die durch die Oligo-dT-Cellulosesäule gelaufen sind, erhalten. Die Fig. 1A(b) zeigt die Northern Hybridisierung von mRNA plus dem Hind III-insertierten Clon VJχ-14-Fragment oder der mRNA plus Cχ-Sonde, die dem 3Kb Hind III-BamHI-Fragment, enthaltend die Cχ-Region entspricht, welches von Mr. Susumu Tonegawa zur Verfügung gestellt wurde (vergleiche Nature; 280, 288-294 (1979)). Eine Bande wird bei 1,2 Kb mit den zwei Sonden Jχ und Cχ beobachtet. Der Clon VJχ14 enthält die funktionelle Vχ-Jχ-Struktur. Wie die Northern Hybridisierung durchzuführen ist, ist in Immunological Experimental Procedures XII (1983) beschrieben.
Fig. 1A(c) zeigt die Southern Hybridisierung der JH-Sonde, die dem Xbal-EcoRI-Fragment bei 0,9 Kb entspricht (Cell.; 24, 353-365 (1981)) und die mit EcoRI abgebaute DNA.
Aus dem vorstehend erwähnten Grund wird die DNA bei 5,5 Kb, die sich nur in D10, das ein funktionelles Gen in der variablen Region der H-Kette enthält, findet, in den λ-Phagen EcoRI-Vektor λgt WES-λB, (vergleiche P. Leader, Science; 196, 175-177 (1977)) cloniert, und der Clon VJH243 wird erhalten. Der Clon VJH243 und die Cu-Sonde, die dem 10 Kb EcoRI-Fragment von MEP 203 entspricht (Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 77, 2138-2142 (1980)) werden verwendet, um die Northern-Blotting-Analyse mit mRNA von D10 durchzuführen. Als Ergebnis wird eine Bande bei 2,4 Kb gefunden (siehe Figur 1A(d)). Das V-Gen, das in den Clonen VJλ 14 und VJH243 enthalten ist, steht im Bezug zu ihrer antigenen Spezifität.

Isolierung von menschlichem C-Gen

Das C-Gen der IgG&sub1;-Klasse, die die Hauptimmunglobulinklasse im menschlichen Blutserum ist, wird isoliert. Insofern als die Nucleotidsequenz in Genen von menschlichem Immunglobulin eine große Ähnlichkeit zu der von Maus-Immunglobulin besitzt, sollen die Cχ- und Cγ1-Gene, die in den menschlichen Genomen vorhanden sind, unter Verwendung der entsprechenden Mausgene als Sonde isoliert werden. Das heißt, Hind III-BamHI-Fragmente (3 Kb) aus dem Clon Ig 146 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 78, 474-478 (1981)) werden als Sonde zur Isolierung von Fragmenten verwendet, die das Cχ-Gen zusammen mit einer Enhancer-Region aus der Hae III-Alu-I-Genbank in dem λ-Charon 4A enthalten (T. Maniatis, Cell.; 15, 1157-1174 (1978)). Die Cγ1-Gene werden durch Abbau der DNA aus menschlichen fötalen Leberzellen mit Hind III, Fraktionieren der so erhaltenen DNA-Fragmente durch Agarosegel-Elektrophorese nach ihrer Größe, Insertieren eines Fragments bei 5,9 Kb in λ788 und abschließende Clonierung mit der vorstehenden Sonde erhalten. Die isolierten Clone sind HCχ2, wie in Fig. 1B(c) gezeigt und HG 163, wie in Fig. 1B(d) gezeigt.
Herstellung des Plasmids pSV2-HCχV&sub1;&sub0;, enthaltend das Maus-Vχ -Gen und das menschliche Cχ-Gen.
Das P Pvu II Fragment bei 1,9 Kb, das Enhancerelemente und das menschliche Cχ-Gen enthält, wird aus dem Clon HCχ2, der in Fig. 1B(c) gezeigt ist, isoliert.
Nachdem ein 50/50 Gemisch des Hind III- und BamHI-Linkers (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) damit ligiert wurde, wird das so aufgebaute Produkt mit Hind III abgebaut. Das so erhaltene Fragment wird mit einem Hind III-insertierten Fragment bei 6,5 Kb, das aus VJχ14 isoliert wurde, ligiert, und dann wird das so erhaltene Produkt mit BamHI in Fragmente, die fraktioniert werden, abgebaut. Ein Fragment bei 5,9 Kb wird mittels Agarosegel-Elektrophorese isoliert. Das isolierte Fragment wird in pSV2gpt an der BamHI-Stelle insertiert. Die Richtung des insertierten Gens wird durch die Restriktionskarte (vergleiche pSV2-HCχVD10 in Fig. 2(a)) bestimmt.
Herstellung des Plasmids pSV2-HG1VD10, enthaltend das Maus- VH-Gen und das menschliche Cγ1Gen
Das Fragment mit der 8,2 Kb Hind III-Insertion wird aus dem Clon HG 163 isoliert. Seine beiden Enden werden in glatte Enden mit dem Klenow-Enzym umgewandelt und mit einem EcoRI- Linker (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) abgebaut. Danach wird das Fragment mit EcoRI und BamHI abgebaut und in das EcoRI- und BamHI-geschnittene Plasmid pSV2-gpt insertiert. Auf diese Art wird der Clon pSV2-HG14, enthaltend das menschliche Cγ1-Gen, erhalten. Das 5,5 Kb EcoRI-Fragment wird aus dem Clon VJH243 isoliert und in die EcoRI- Schnittstelle pSV2-HG14 insertiert. Die Orientierung des insertierten Gens wird mittels der Restriktionskarte bestimmt. (vergleiche pSV2-HGIVD10 in Fig. 2(b)).
Transformation von einem Plasmacytom mittels der Plasmide pSV2-CHχVD10 und pSV2-HC&sub1;VD10
Die beiden DNAs pSV2-HCχVD10 und pSV2-HGIVD10 werden in das Maus-Plasmacytom P3U1 mittels des Calciumphosphat-Copräzipitationsverfahrens (Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 76, 1373-1376 (1979)) eingeführt. Das Verfahren umfaßt die folgenden Schritte.
(1) Die Lösung A wird zu der gleichen Menge der Lösung 2·HeBS tropfenweise zugegeben.
(2) Das Gemisch wird 30 Minuten lang bei Raumtemperaturen inkubiert.
(3) Das Plasmacytom P3U1 wird mit Trypsin, so weit es in seine Stücke dissoziiert, behandelt. Danach wird das Kulturmedium RPMI 1640, das 10% fötales Kälberserum enthält, dazugegeben, um die Trypsinbehandlung zu beenden.
(4) Das Kulturmedium wird bei 1500 UpM 5 Minuten lang zentrifugiert, um die Zellen zu gewinnen.
(5) Die Zellen (2·10&sup7;) werden dem Kulturmedium ohne fötales Kälberserum tropfenweise zugesetzt.
(6) Das Gemisch wird bei 1500 UpM 5 Minuten lang zentrifugiert.
(7) Die Zellen werden in der in dem ersten Schritt hergestellten Lösung suspendiert.
(8) Das so erhaltene Gemisch wird bei 37ºC 30 Minuten lang inkubiert.
(9) 5 ml davon werden in ein anderes Reagenzglas überführt.
(10) Das Kulturmedium RPMI 1640, das 10% fötales Kälberserum (45 ml) enthält, wird in das Reagenzglas gegeben.
(11) Die Zellsuspension (0,1 ml) wird in die 96 Cavitäten einer Microtiterplatte, in der die Zellen zu 2·10&sup4;, bezogen auf die Anzahl, aufgeteilt werden können, gegeben.
(12) Die Zellen werden 72 Stunden mit dem Kulturmedium RPMI 1640, das 10% fötales Kälberserum enthält, gezüchtet.
(13) Das Kulturmedium wird durch das Kulturmedium RPMI 1640, das 5 ug/ml Mycophenolsäure und 250 ug/ml Xanthin enthält, zusammen mit 10% fötalem Kälberserum ersetzt, um die transformierten Zellen auszuwählen.
Die Lösung A und die Lösung 2·HeBS haben die folgende Zusammensetzung: Lösung A (enthaltend 200 ul des Plasmids) (sterilisiert in einem Autoklaven) Redestilliertes H&sub2;O
Lösung 2·HeBS pH 7,05
HEPES 10 g/l
NaCl 16 g/l
KCl 0,74 g/l
Na&sub2;HPO&sub4;H&sub2;O 0,25 g/l
Dextrose 2 g/l
Auswahl einer transformierten Zelle, die einen chimeren monoclonalen Antikörper erzeugt.
Um eine transformierte Zelle, die einen chimeren monoclonalen Antikörper erzeugt, auszuwählen, werden das Enzym-gekoppelte Antikörperverfahren und die Analyse mittels eines Zellsortierers FACS (ein Produkt von Beckton-Dickinson Co., Ltd.) verwendet. 18 Clone der transformierten Zellen wurden unter Verwendung eines selektiven Kulturmediums, das Mycophenolsäure enthält, ausgewählt. Das Plasmacytom P3U1 und die 18 Clone der transformierten Zellen werden am Wachsen bis zur vollen Größe in einer Platte, die das selektive Kulturmedium enthält, gehalten. Der Überstand dieser Kulturmedien wird dem Enzym-gekoppelten Antikörperverfahren (Meth. Enzymol.; 70, 419-439 (1980)) unterworfen, um ihre Fähigkeit zur Antikörpererzeugung zu überprüfen. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Antikörper Zelle Kaninchen Anti-Mensch IgGFc-Antikörper CK-Antikörper
Es ist klar, daß 1·10&sup7; HMH-S7 Zellen etwa 100 ng/ml an chimerem monoclonalem Maus-Mensch-Antikörper in 10 ml des Überstandes ihres Kulturmediums ausscheiden.
Zellsorteranalyse der HMH-Zellen und P3U1 unter Verwendung von Anti-Mensch-IgG
HMH-Zellen und das Plastocytom P3U1 werden zweimal in Hanks ausgeglichener Salzlösung (Gibco) gewaschen. Die Zellen (10&sup7;) werden in eine Lösung aus 750 ul Anfärbepufferlösung und 250 ul Kaninchen Anti-Mensch-Immunglobulin-Antikörper oder 1 ug/ml normalem Kaninchen-IgG gegeben. Die Lösung wird bei Raumtemperaturen eine Stunde lang inkubiert. Danach werden die Zellen dreimal in Hanks ausgeglichener Salzlösung gewaschen. Die nachstehenden Verfahren sind die gleichen, die in dem Avidin-Biotin-Kit, der von Vector Laboratory Co., Ltd. auf den Markt gebracht wird, beschrieben sind.
In der Kürze, die Zellen werden in 250 ul eines 1/200 menschlichen IgG-behandelten Biotin-konjugierten Anti-Kaninchen-IgG (1,5 mg/ml) gegeben und bei Raumtemperatur 1 Stunde lang inkubiert. Anschließend wird dreimal mit Hank's Lösung gewaschen, in 250 ul einer 1/20 Avidin FITC-Lösung (5 mg/ml) überführt, und dann bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert.
Wieder wird dreimal mit Hank's Lösung gewaschen. Schließlich werden 10&sup6; Zellen in 1 ml eines Kulturmediums gegeben und der Analyse mittels eines Fluoreszenz-aktivierten Zellsorters (FACS IV), ausgestattet mit einem logarithmischen Verstärker, der von Beckton-Dickinson Co., Ltd. hergestellt wird, unterworfen. Das Ergebnis ist in Fig. 3 gezeigt.
In der FACS-Analyse werden HMH-Zellen als Zielzellen und Kaninchen-IgG als Kontrolle verwendet. Das heißt, in Fig. 3, (a) sind die HMH-Zellen gezeigt, die mit Kaninchen Anti- Mensch-Ig-Antikörper reagiert haben, (b) die mit Kaninchen Anti-Mensch-χ-Antikörper reagiert haben und (c) die mit Kaninchen Anti-Mensch-IgGFc-Antikörper reagiert haben. Auf ähnliche Weise zeigt (d) die FITC-Profile der zusammengesetzten HMH-Zellen (R) und von P3U1 (L), das mit einem Kaninchen Anti-Mensch-Ig-Antikörper, (e) mit einem Kaninchen Anti-Mensch-χ-Kettenantikörper und (f) mit Kaninchen Anti- Mensch IgGFc-Antikörper behandelt wurden.
Analyse der DNA, die in die HMH-Zellen eingeführt wurde
Gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren werden DNA und Poly-A-haltige RNA aus HMH-Zellen isoliert. Wie die aus HMH-Zellen isolierte DNA wird die aus C57BL/6 Mausnierenzellen und P3U1 Zellen isolierte DNA mit BamHI abgebaut und einer Southern Hybridisierung mittels einer Maus-Jχ-Sonde, einer menschlichen Cχ-Sonde, einer Maus-JH-Sonde, und einer menschlichen Cγ-Sonde unterworfen. Das Ergebnis ist in den Fig. 4(a), (b), (c) und (d) gezeigt.
Hinsichtlich der menschlichen Cχ und Maus-Jχ-Sonden wird eine 5,9 Kb-Bande, die der Größe eines BamHI-insertierten pSV2-HC VD10 entspricht, in aus HMH-Zellen isolierte DNA detektiert. Hinsichtlich der Maus JH-Sonde wird eine 5,5 Kb-Bande, die der Größe eines EcoRI-insertierten-Fragments, das das VH-Gen enthält, entspricht, in der DNA aus den HMH- Zellen detektiert. Hinsichtlich der menschlichen Cγ1-Sonde wird ein EcoRI-BamHI-insertiertes- pSV2-HGIVD10-Fragment, das das Cγ1-Gen enthält, in der DNA aus den HMH-Zellen detektiert.
Gemäß diesen Tatsachen ist offensichtlich, daß die HMH-Zellen die intakten chimeren Gene sowohl für die schwere als auch die leichte Kette im Genom besitzen.
Poly-A-haltige mRNAs, die aus HMH-Zellen und P3U1 isoliert wurden, werden zur Durchführung eines Northern Blots mit einer VJχ14-Sonde, einer menschlichen Cχ-Sonde, einer VJH243-Sonde bzw. einer menschlichen Cγ1Sonde verwendet. Mit Hilfe der VJχ14-Sonde und der menschlichen Cχ-Sonde wird eine 1,2 Kb-Bande, die vermutlich die gleiche Größe wie die χ-Ketten-erzeugenden Zellen besitzt, als mRNA der L-Kette in dem chimeren Antikörper detektiert.
Eine 5 Kb-Bande wird als mRNA-Primärtranskript detektiert, dessen Intron nicht entfernt ist, weil das Splicing noch nicht eingetreten war (siehe Fig. 4B(a) und (b)). Zwei Banden werden bei 3,5 und 7 Kb mit Hilfe von VJH 243 und C&sub1;-Sonden hinsichtlich der mRNA der HMH-Zellen detektiert. Ausgedrückt als Dimension entspricht das zuerst genannte der mRNA der Membran-ständigen γ-Kette vom Typ H und die zuletzt genannte der mRNA, deren Intron noch nicht entfernt wurde, weil es ein Primärtranskript war.
Wie aus den obigen Ergebnissen sehr gut hervorgeht, ist offensichtlich, daß in den Teilen der primärtranskriptierten RNA ein Splicing zwischen von der Maus abgeleiteten V-(D)- J-Exons und von den vom Menschen abgeleiteten Exons in HMH- Zellen eintritt.
Obwohl diese Erfindung in ihrer bevorzugten Ausführungsform mit einem gewissen Ausführlichkeitsgrad beschrieben wurde, ist zu verstehen, daß die vorliegende Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform in den Konstruktionsfeinheiten und der Kombination und der Anordnung der Teile verändert werden kann, ohne vom Sinn und Umfang der nachstehend beanspruchten Erfindung abzuweichen.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von chimären monoklonalen Antikörpern, bestehend aus einer von einer Maus abgeleiteten variablen Region und einer vorn Menschen abgeleiteten konstanten Region, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) in einen Expressionsvektor die aktiven Gene VH und VL, isoliert aus Hybridomen als Antikörper erzeugende Zellen der Maus, und die Gene CH und CL, isoliert aus menschlicher DNA, insertiert, und dann (b) einen Expressionsvektor aus (a) in ein Lymphom als gezüchtete tierische Zellen einschleust.

2. Verfahren zur Herstellung von chimären monoklonalen Antikörpern nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor pSV2-gpt, pSV2-neo oder SV40 ist.