CN101160528A

CN101160528A - Il17-f在诊断和治疗气道炎症中的用途

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Publication number: CN101160528A
Application number: CNA200680012541XA
Authority: CN
Inventors: J·K·科尔斯; F·M·麦卡利斯特; B·M·卡雷尼奥; S·J·戈尔德曼
Original assignee: Wyeth LLC; University of Pittsburgh
Current assignee: Wyeth LLC; University of Pittsburgh
Priority date: 2005-02-14
Filing date: 2006-02-14
Publication date: 2008-04-09
Also published as: BRPI0608210A2; US20100322897A1; WO2006088925A2; US20060257930A1; AU2006214384A1; CA2596986A1; MX2007009810A; WO2006088925A3; US7704503B2; EP1849011A2; JP2008532493A

Abstract

本发明涉及下述发现，即IL－17F－介导的气道炎症可能通过经由人呼吸道上皮细胞的基底外侧表面上的IL－17R的信号传递来介导。因而，本发明提供了分离的和纯化的IL－17F或IL－17R多核苷酸和多肽。本发明还涉及筛选能抑制(即，降低，限制，阻断或减少)IL－17F生物活性的测试化合物的新方法，和诊断、预后和监测与IL－17F生物活性相关的病症的进展的方法，例如，与IL－17F结合IL－17R对气道炎症的作用有关的病症(例如，囊性纤维化患者的气道炎症，包括囊性纤维化患者中细菌感染引起的肺症状加重)。本发明还涉及新的治疗剂和治疗靶，和干预(治疗)和预防所述与IL－17F生物活性有关的病症的方法。

Description

IL17-F在诊断和治疗气道炎症中的用途

相关背景技术

IL-17A是一种促炎细胞因子，它调节粒细胞生成和中性粒细胞向炎症部位的募集(Yao等(1995)J.Immunol.155：5483-86；Ye等(2001)J.Exp.Med.194：519-28；Kolls等(2003)Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.28：9-11；Laan等(1999)J.Immunol.162：2347-52；Lindén等(2000)Eur.Respir.J.15：973-77)。这部分地归因于IL-17A诱导CXC趋化因子的释放和调节G-CSF(一种关键的粒细胞生成生长因子)的表达的能力(Laan，同上；Moseley等(2003)Cytokine Growth Factor Rev.14：1 55-74；Jones和Chan(2002)Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.26：748-53；Ye等(2001)Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.25：335-40；Ye等(2001)J.Exp.Med.194：519-28)。具有IL-17A的受体(即IL-17受体(IL-17R))的纯合缺失的小鼠，对实验性革兰氏阴性肺炎具有提高的致死率、有缺陷的中性粒细胞募集、和降低的粒细胞生成(Ye等(2001)J.Exp.Med.194：519-28)。但是，它们对单核细胞增生性利斯特菌(Listeria monocytogenes)或结核分支杆菌(Mycobacteria tuberculosis)(未公开的发现)造成的细胞内感染不具有提高的易感性。宿主防御的该缺陷可能部分地由于，与对照小鼠相比，IL-17R-缺陷型小鼠中反应于革兰氏阴性细菌攻击的G-CSF减少了超过90％，并且对感染的反应显著减弱(Ye等(2001)J.Exp.Med.194：519-28)。

最近，已经将除了IL-17A以外的5种其它蛋白鉴别为IL-17蛋白家族的成员；IL-17F与IL-17A具有最密切的序列同源性(在蛋白水平58％)，以及类似的CXC趋化因子诱导和类似的中性粒细胞-动员谱(Moseley等，同上；Li等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：773-78；Starnes等(2001)J.Immunol.167：4137-40；Starnes等(2002)J.Immunol.169：642-46；Hurst等(2002)J.Immunol.169：443-53；Aggarwal和Gurney(2002)J.Leukoc.Biol.71：1-8；Hymowitz等(2001)EMBO J.20：5332-41)。IL-17A和IL-17F在小鼠染色体1和人染色体6上彼此紧挨着，两种细胞因子都由T细胞反应于IL-23而生成(Chmiel等(2002)Clin.Rev.Allergy Immunol.23：5-27；Aggarwal等(2003)J.Biol.Chem.278(3)：1910-14；Happel等(2003)J.Immunol.170：4432-36；Kolls等(2004)Immunity21：467-76)。此外，IL-17A和IL-17F在实验性革兰氏阴性肺炎的肺中以类似的时间进展诱导(未公开的发现)。尽管相对于IL-17A的数量级，IL-17F具有更低的对IL-17R的亲和力，已经提出一些关于IL-17A和IL-17F是否都通过IL-17R发出信号的推测，因为这两种蛋白具有类似的生物活性(Hymowitz等，同上)。

迄今为止，尚未表征IL-17F和IL-17R之间的相互作用。因此，尚未明确证实IL-17F介导的信号传递和气道炎症之间的直接关联。本发明提供了该关联。更具体地，本发明提供的关联使得能够通过检测IL-17F的方法，诊断、预后、监测和/或治疗气道炎症，例如，囊性纤维化患者的气道炎症，包括囊性纤维化患者中细菌感染引起的肺症状加重。

发明简述

公开了筛选能抑制(例如，降低，限制，阻断或减少)IL-17F-介导的气道炎症的测试化合物的方法。并且，公开了诊断、预后、监测和/或治疗气道炎症(例如，囊性纤维化患者的气道炎症，包括囊性纤维化患者中细菌感染引起的肺症状加重)的方法，其包含检测IL-17F。

发明人已经证实，在人肺中，IL-17R在呼吸道上皮细胞中表达，与顶端表面相比，在基底外侧表面上的表达更高。另外，IL-17R在呼吸道上皮细胞基底外侧表面上的表达增强，与基底外侧供给的IL-17F比顶端供给的IL-17F更强地诱导生长因子(例如，IL-1β，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-10，IL-12p70，IL-13，IL-17，G-CSF，GM-CSF，IFN-γ，MCP-1，MIP-1β，TNF-α，GRO-α，等)这一事实相关。在这些被诱导的生长因子中，GRO-α，G-CSF，IL-6，和IL-8在来自所有测试供体(n＞7)的HBE细胞中表现出表达的最强诱导。另外，发明人证实，抑制性抗IL-17R抗体会显著减弱IL-17F-介导的细胞因子/趋化因子生产的诱导，这进一步证实了IL-17F会通过结合IL-17R，诱导HBE细胞中的细胞因子/趋化因子生产。发明人还证实，在也经受肺症状加重的囊性纤维化患者住院首日收集的所有测试样品中，都可以检出IL-17F。另外，发明人证实，从这些患者收集的样品中IL-17F水平的显著下降与肺症状加重的治疗相关。

因此，在一个方面，本发明提供了筛选能抑制(例如，降低，限制，阻断或减少)IL-17F和IL-17R之间的相互作用的测试化合物的方法。本文公开的方法包含下述步骤：使含有IL-17F和IL-17R的样品接触化合物，和确定样品中IL-17F与IL-17R的相互作用相对于未接触该化合物的样品中IL-17F与IL-17R的相互作用是否降低，由此，接触该化合物的样品中IL-17F与IL-17R的相互作用的降低，将该化合物鉴别为抑制IL-17F与IL-17R的相互作用的化合物。在本发明的一个实施方案中，将IL-17F与IL-17R的相互作用的降低检测为IL-17F-介导的细胞因子、趋化因子和/或生长因子表达的诱导的降低。

在另一个方面，本发明另外描述了诊断、预后和/或监测受试者的IL-17F相关病症的方法，其包含下述步骤：检测受试者样品中IL-17F基因产物的测试量；和对比该测试量与对照样品中IL-17F基因产物的正常量，由此，明显超过正常量的测试量提供了诊断IL-17F相关病症的阳性指示。在本发明的一个实施方案中，所述方法针对诊断、预后和/或监测气道炎症，例如，导致肺症状加重的气道炎症，由感染因子造成的气道炎症，囊性纤维化患者的气道炎症，等。在其它实施方案中，本发明的方法涉及检测IL-17F蛋白，例如，使用抗IL-17F抗体。

在另一个方面，本发明提供了治疗具有患气道炎症(例如，囊性纤维化患者的气道炎症，包括囊性纤维化患者中细菌感染引起的肺症状加重)危险中、或诊断出患有该气道炎症的受试者的方法。本文公开的治疗方法包含给受试者施用治疗有效量的IL-17F拮抗剂的步骤。

在一个实施方案中，本发明提供了诊断受试者的IL-17F相关病症的方法，其包含下述步骤：检测受试者样品中IL-17F基因产物的测试量；和对比该测试量与对照样品中IL-17F基因产物的正常量，由此，明显超过正常量的测试量提供了诊断IL-17F相关病症的阳性指示。在另一个实施方案中，所述IL-17F相关病症是气道炎症。在另一个实施方案中，所述受试者是诊断出囊性纤维化的患者。在另一个实施方案中，所述受试者正在经受肺症状加重。在另一个实施方案中，所述肺症状加重是由于感染因子。在另一个实施方案中，所述IL-17F基因产物是IL-17F蛋白。在另一个实施方案中，用抗IL-17F抗体检测IL-17F蛋白。

在另一个实施方案中，本发明提供了筛选能抑制IL-17F结合IL-17R的化合物的方法，其包含下述步骤：使含有IL-17F和IL-17R的样品接触化合物；和确定接触测试化合物的样品中IL-17F与IL-17R的结合相对于未接触该化合物的样品中IL-17F与IL-17R的结合是否降低，由此，接触该化合物的样品中IL-17F与IL-17R的结合的降低，将该化合物鉴别为抑制IL-17F结合IL-17R的化合物。

在另一个实施方案中，本发明提供了治疗具有患IL-17F相关病症的危险、或诊断出患有IL-17F相关病症的受试者的方法，其包含给受试者施用治疗有效量的IL-17F拮抗剂的步骤。在另一个实施方案中，所述IL-17F相关病症是气道炎症。在另一个实施方案中，所述受试者是诊断出患有囊性纤维化的患者。在另一个实施方案中，所述受试者正在经受肺症状加重。在另一个实施方案中，所述肺症状加重是由于感染因子。在另一个实施方案中，所述IL-17F拮抗剂选自：抑制性抗IL-17F抗体，抑制性抗IL-17R抗体，可溶的IL-17R，含有IL-17R的融合蛋白，含有IL-17R的IL-17F结合片段的融合蛋白，拮抗性小分子，反义IL-17F核酸分子，反义IL-17R核酸分子，siRNA IL-17F核酸分子，和siRNA IL-17R核酸分子。在另一个实施方案中，本发明还包含，给受试者施用治疗有效量的至少一种其它治疗剂。在另一个实施方案中，所述至少一种其它治疗剂选自：细胞因子抑制剂，生长因子抑制剂，免疫抑制剂，抗炎剂，代谢抑制剂，酶抑制剂，细胞毒性剂，和细胞抑制剂。在另一个实施方案中，所述至少一种其它治疗剂选自：TNF拮抗剂，抗TNF剂，IL-12拮抗剂，IL-15拮抗剂，IL-17拮抗剂，IL-18拮抗剂，IL-22拮抗剂，T细胞消除剂，B细胞消除剂，环孢菌素，FK-506，CCI-779，依那西普(etanercept)，英夫单抗，利妥希玛，阿达木单抗(adalimumab)，泼尼松龙，硫唑嘌呤，金，柳氮磺胺吡啶，氯喹，羟氯喹，米诺环素，阿那白滞素(anakinra)，阿巴他塞(abatacept)，甲氨蝶呤，来氟米特，雷帕霉素，雷帕霉素类似物，Cox-2抑制剂，cPLA2抑制剂，NSAIDs，p38抑制剂，B7.1、B7.2、ICOSL、ICOS和/或CD28的拮抗剂，和CTLA4激动剂。

在另一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含IL-17F拮抗剂和药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，所述IL-17F拮抗剂选自：抑制性抗IL-17F抗体，抑制性抗IL-17R抗体，可溶的IL-17R，含有IL-17R的融合蛋白，含有IL-17R的IL-17F结合片段的融合蛋白，拮抗性小分子，反义IL-17F核酸分子，反义IL-17R核酸分子，siRNAIL-17F核酸分子，和siRNA IL-17R核酸分子。

在另一个实施方案中，本发明提供了疫苗佐剂，其包含IL-17F拮抗剂和细菌抗原。在另一个实施方案中，所述IL-17F拮抗剂选自：抑制性抗IL-17F抗体，抑制性IL-17R抗体，可溶的IL-17R，含有IL-17R的融合蛋白，含有IL-17R的IL-17F结合片段的融合蛋白，拮抗性小分子，反义IL-17F核酸分子，反义IL-17R核酸分子，siRNA IL-17F核酸分子，和siRNA IL-17R核酸分子。

附图简述

在图1(左图)中显示了从用1ng/ml、10ng/ml、或100ng/ml(x-轴)的IL-17A(■)或IL-17F(□)处理24小时的原代人支气管上皮(HBE)细胞收集的基底外侧培养基中GRO-α、G-CSF和MCP-1蛋白水平的浓度(相对于对照培养基的变化倍数；y-轴)。在图1(右图)中显示了从用10ng/ml的IL-17A(■)或IL-17F(□)刺激4、8、16或24小时(x-轴)的HBE细胞收集的基底外侧培养基中GRO-α、G-CSF和MCP-1的浓度(pg/ml；y-轴)。将结果表达为来自一个代表性试验的三份样品的平均值±SEM。

在图2中显示了，A)从用下述4种条件之一(x-轴)处理的原代HBE细胞收集的基底外侧培养基中GRO-α的浓度(相对于对照培养基的变化倍数；y-轴)：IL-17F(10ng/ml)，TNF-α(1ng/ml)，IL-17F(10ng/ml)+TNF-α(1ng/ml)，或与抗IL-17R mAb预温育的IL-17F+TNF-α，B)从用下述4种条件之一(x-轴)处理的原代HBE细胞收集的基底外侧培养基中G-CSF的浓度(相对于对照培养基的变化倍数；y-轴)：IL-17F(10ng/ml)，TNF-α(1ng/ml)，IL-17F(10ng/ml)+TNF-α(1ng/ml)，与IL-17R-Fc(1μg/ml)预温育的IL-17F+TNF-α或与抗IL-17R mAb预温育的IL-17F+TNF-α，或C)从用下述4种条件之一(x-轴)处理的原代HBE细胞收集的基底外侧培养基中G-CSF的浓度(相对于对照培养基的变化倍数；y-轴)：IL-17A(10ng/ml)，TNF-α(1ng/ml)，IL-17A(10ng/ml)+TNF-α(1ng/ml)，与IL-17R-Fc(1μg/ml)预温育的IL-17A+TNF-α，或与抗IL-17R mAb预温育的IL-17F+TNF-α。将结果表达为3个分开的试验的平均值±SEM(^*代表通过ANOVA确定p＜0.05)。

图3显示了从在用10ng/ml的IL-17A或IL-17F温育24小时之前，用2μg/ml IL-17受体抗体(抗IL-17R)预处理30分钟(每个图中的第2条和第4条)或未处理(第1条和第3条)从原代HBE细胞收集的顶端或基底外侧培养基中A)GRO-α和B)G-CSF的浓度(相对于对照培养基的变化倍数；y-轴)。将结果表达为3个分开的试验的平均值±SEM(^*代表通过ANOVA确定p＜0.05)。

图4显示了原代HBE细胞中DEFB 104的比较表达水平(y-轴)，它通过实时PCR进行分析，相对定量成18s表达水平，并用对照标准化而测定的，所述原代HBE细胞A)用1ng/ml、10ng/ml、或100ng/ml(x-轴)的IL-17A(■)或IL-17F(□)刺激24小时，B)用抗IL-17R抗体预温育，然后将IL-17A或IL-17F加入培养基，或C)用单独的IL-17A、单独的IL-17F、单独的TNF-α、或TNF-α与IL-17A或IL-17F温育。将结果表达为3个分开的试验的平均值±SEM(^*代表通过ANOVA确定p＜0.05)。

图5显示了向基底外侧或顶端表面加入10ng/ml的IL-17A或IL-17F后，原代HBE细胞生成的G-CSF(■)和GRO-α(□)浓度(相对于对照的变化倍数；y-轴)。将结果表达为来自一个代表性试验的三份样品的平均值±SEM(^*代表通过ANOVA确定p＜0.05)。

图6显示了G-CSF的浓度(相对于对照培养基的变化倍数；y-轴)，所述G-CSF是在：A)从用10ng/ml IL17F和/或10ng/ml TNF-α(x-轴)处理24小时的原代HBE细胞收集的顶端或基底外侧培养基中，B)从在用10ng/ml IL-17F和/或10ng/ml TNF-α温育24小时之前2小时，用抗-人TNF-RI和/或TNF-RII:Fc嵌合体(0.5μg/ml)预处理的原代HBE细胞收集的基底外侧培养基中，或C)从在用10ng/mlIL-17A和/或10ng/mlTNF-α温育24小时之前2小时，用抗人TNF-RI和/或TNF-RII:Fc嵌合体(0.5μg/ml)预处理的原代HBE细胞收集的基底外侧培养基中。将结果表达为3个分开的试验的平均值±SEM(^*代表过ANOVA确定p＜0.05)。

图7显示了在治疗前(治疗前)、抗生素治疗(ATB)后10天、或ATB后20天，从经受肺症状加重的囊性纤维化患者得到的痰样品中，A)IL-17A和IL-17F的浓度(pg/ml；y-轴)，和B)(上图)IL-8，和(下图)IL-6、GM-CSF、G-CSF，MCP-1，MIP-1β，IL-1β，和TNF-α的浓度(pg/ml；y-轴)。

发明详述

本发明部分地基于下述发现：1)IL-17R以最高水平在呼吸道上皮细胞的基底外侧表面上表达，2)与顶端供给相比，当从基底外侧供给呼吸道上皮细胞时，IL-17F能更有效地刺激炎性细胞因子、趋化因子和/或生长因子的表达，3)抑制性抗IL-17R抗体显著减弱IL-17F介导的细胞因子、趋化因子和/或生长因子的诱导，和4)IL-17F表达水平与气道炎症(例如，囊性纤维化患者的气道炎症，包括细菌感染引起的肺症状加重)的进展相关。这些发现有力地支持了IL-17F和它随后通过IL-17R的信号传递在呼吸道系统炎性病症中的作用。

这样，本发明涉及IL-17F和IL-17R多核苷酸和多肽，及其应用。这样的应用包括、但不限于，制备特异性的抗体，它们然后可以用于筛选能抑制(即，降低，限制，阻断或减少)IL-17F结合IL-17R的方法，监测样品或受试者中表达水平的方法(例如，诊断，预后和/或监测)，和治疗气道炎症(例如，囊性纤维化患者的气道炎症，包括囊性纤维化患者中细菌感染引起的肺症状加重)的方法。

IL-17F和IL-17R的多核苷酸和多肽

本领域已知且提供了IL-17F核苷酸和氨基酸序列。人IL-17F的核苷酸序列显示为SEQ ID NO：1。与前述核苷酸序列相对应的全长IL-17F蛋白的氨基酸序列显示为SEQ ID NO：2。成熟IL-17F的氨基酸序列对应着从SEQ ID NO：2的约氨基酸31处开始的蛋白(参见，例如，美国专利申请号10/102,080，在本文中整体引作参考)。

本领域已知且提供了IL-17R核苷酸和氨基酸序列。人IL-17R的核苷酸序列显示为SEQ ID NO：3，它包含一个聚(A)尾。与前述核苷酸序列相对应的全长IL-17R蛋白的氨基酸序列显示为SEQ ID NO：4。

本发明的核酸可以包含DNA或RNA，且可以是完全或部分地合成的。本文所述的核苷酸序列包括具有指定序列的DNA分子，且包括具有指定序列的RNA分子，其中U取代为T，除非上下文另有要求。

本发明的分离的多核苷酸可以用作杂交探针和引物，用于鉴别和分离具有与本文公开的多核苷酸的编码序列相同或类似的序列的核酸。用于鉴别和分离核酸的杂交方法包括聚合酶链式反应(PCR)、DNA印迹杂交、原位杂交和RNA印迹杂交，且是本领域技术人员众所周知的。

杂交反应可以在不同严格性条件下进行。杂交反应的严格性包括任意两种核酸分子彼此杂交的难度。优选地在降低的严格条件，更优选严格条件，最优选高度严格的条件下，每个杂交多核苷酸与它的对应多核苷酸杂交。严格条件的实例显示在下面的表1中：高度严格的条件是至少像例如条件A-F一样严格的那些；严格的条件至少像例如条件G-L一样严格；降低的严格条件至少象例如条件M-R一样严格。

表1.严格条件

严格条件	多核苷酸杂交体	杂交体长度(bp)¹	杂交温度和缓冲液²	洗涤温度和缓冲液²
严格条件	多核苷酸杂交体	杂交体长度(bp)¹	杂交温度和缓冲液²	洗涤温度和缓冲液²	A	DNA:DNA	＞50	65℃；1xSSC-或-42℃；1xSSC，50％甲酰胺	65℃；0.3xSSC
B	DNA:DNA	＜50	T_B ^*；1xSSC	T_B ^*；1xSSC	A	DNA:DNA	＞50	65℃；1xSSC-或-42℃；1xSSC，50％甲酰胺	65℃；0.3xSSC
B	DNA:DNA	＜50	T_B ^*；1xSSC	T_B ^*；1xSSC	C	DNA:RNA	＞50	67℃；1xSSC-或-45℃；1xSSC，50％甲酰胺	67℃；0.3xSSC
D	DNA:RNA	＜50	T_D ^*；1xSSC	T_D ^*；1xSSC	C	DNA:RNA	＞50	67℃；1xSSC-或-45℃；1xSSC，50％甲酰胺	67℃；0.3xSSC
D	DNA:RNA	＜50	T_D ^*；1xSSC	T_D ^*；1xSSC	E	RNA:RNA	＞50	70℃；1xSSC-或-50℃；1xSSC，50％甲酰胺	70℃；0.3xSSC
F	RNA:RNA	＜50	T_F ^*；1xSSC	T_F ^*；1xSSC	E	RNA:RNA	＞50	70℃；1xSSC-或-50℃；1xSSC，50％甲酰胺	70℃；0.3xSSC
F	RNA:RNA	＜50	T_F ^*；1xSSC	T_F ^*；1xSSC	G	DNA:DNA	＞50	65℃；4xSSC-或-42℃；4xSSC，50％甲酰胺	65℃；1xSSC
H	DNA:DNA	＜50	T_H ^*；4xSSC	T_H ^*；4xSSC	G	DNA:DNA	＞50	65℃；4xSSC-或-42℃；4xSSC，50％甲酰胺	65℃；1xSSC
H	DNA:DNA	＜50	T_H ^*；4xSSC	T_H ^*；4xSSC	I	DNA:RNA	＞50	67℃；4xSSC-或-45℃；4xSSC，50％甲酰胺	67℃；1xSSC
J	DNA:RNA	＜50	T_J ^*；4xSSC	T_J ^*；4xSSC	I	DNA:RNA	＞50	67℃；4xSSC-或-45℃；4xSSC，50％甲酰胺	67℃；1xSSC
J	DNA:RNA	＜50	T_J ^*；4xSSC	T_J ^*；4xSSC	K	RNA:RNA	＞50	70℃；4xSSC-或-50℃；4xSSC，50％甲酰胺	67℃；1xSSC
L	RNA:RNA	＜50	T_L ^*；2xSSC	T_L ^*；2xSSC	K	RNA:RNA	＞50	70℃；4xSSC-或-50℃；4xSSC，50％甲酰胺	67℃；1xSSC
L	RNA:RNA	＜50	T_L ^*；2xSSC	T_L ^*；2xSSC	M	DNA:DNA	＞50	50℃；4xSSC-或-40℃；6xSSC，50％甲酰胺	50℃；2xSSC
N	DNA:DNA	＜50	T_N ^*；6xSSC	T_N ^*；6xSSC	M	DNA:DNA	＞50	50℃；4xSSC-或-40℃；6xSSC，50％甲酰胺	50℃；2xSSC
N	DNA:DNA	＜50	T_N ^*；6xSSC	T_N ^*；6xSSC	O	DNA:RNA	＞50	55℃；4xSSC-或-42℃；6xSSC，50％甲酰胺	55℃；2xSSC
P	DNA:RNA	＜50	T_P ^*；6xSSC	T_P ^*；6xSSC	O	DNA:RNA	＞50	55℃；4xSSC-或-42℃；6xSSC，50％甲酰胺	55℃；2xSSC
P	DNA:RNA	＜50	T_P ^*；6xSSC	T_P ^*；6xSSC	Q	RNA:RNA	＞50	60℃；4xSSC-或-45℃；6xSSC，50％甲酰胺	60℃；2xSSC
R	RNA:RNA	＜50	T_R ^*；4xSSC	T_R ^*；4xSSC	Q	RNA:RNA	＞50	60℃；4xSSC-或-45℃；6xSSC，50％甲酰胺	60℃；2xSSC

1：杂交体长度是杂交多核苷酸的杂交区域的预期长度。当多核苷酸与未知序列的靶多核苷酸杂交时，假定杂交体长度是杂交多核苷酸的长度。当已知序列的多核苷酸杂交时，可以通过比对多核苷酸序列和鉴别最佳序列互补性的一个或多个区域，确定杂交体长度。

2：SSPE(1xSSPE是0.15M NaCl，10mM NaH₂PO₄，和1.25mM EDTA，pH 7.4)可以替代杂交和洗涤缓冲液中的SSC(1xSSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；在杂交结束后，洗涤15分钟。

T_B ^*-T_R ^*：预期长度小于50碱基对的杂交体的杂交温度应当比杂交体的解链温度(T_m)低5-10℃，其中T_m根据下述方程确定。对于长度小于18碱基对的杂交体，T_m(℃)＝2(A+T碱基数)+4(G+C碱基数)。对于长度为18-49碱基对的杂交体，T_m(℃)＝81.5+16.6(log₁₀Na⁺)+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是杂交体中的碱基数，Na⁺是杂交缓冲液中钠离子的浓度(1xSSC的Na⁺＝0.165M)。

多核苷酸杂交的严格条件的其它实例参见Sambrook，J.，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，chapters 9和11，和Current Protocols in Molecular Biology，1995，F.M. Ausubel等，编，John Wiley&Sons，Inc.，sections 2.10和6.3-6.4，在本文中引作参考。

本发明的分离的多核苷酸可以用作杂交探针和引物，用于鉴别和分离具有公开的多核苷酸的等位基因变体的编码序列的DNA。等位基因变体是公开的多核苷酸的天然存在的替代形式，它们编码与公开的多核苷酸编码的多肽相同或具有显著相似性的多肽。优选地，等位基因变体与公开的多核苷酸具有至少90％序列同一性(更优选地，至少95％同一性；最优选地，至少99％同一性)。或者，当核酸区段在选择性杂交条件(例如，高度严格的杂交条件)下与公开的多核苷酸杂交时，存在显著相似性。

本发明的分离的多核苷酸还可以用作杂交探针和引物，用于鉴别和分离具有与公开的多核苷酸同源的多肽的编码序列的DNA。这些同源物是从与公开的多肽和多核苷酸不同的物种或相同的物种内分离的多核苷酸和多肽，但是与公开的多核苷酸和多肽具有显著的序列相似性。优选地，多核苷酸同源物与公开的多核苷酸具有至少50％序列同一性(更优选地，至少75％同一性；最优选地，至少90％同一性)，而多肽同源物与公开的多肽具有至少30％序列同一性(更优选地，至少45％同一性；最优选地，至少60％同一性)。优选地，公开的多核苷酸和多肽的同源物是从哺乳动物物种分离的那些。

如下计算2个序列之间的“同源性”或“序列同一性”(这2个术语在本文中互换使用)。为了最佳比较目的，比对序列(例如，为了最佳比对，可以在第1个和第2个氨基酸或核酸序列中的一个或两个中导入空位，为了比较目的，可以忽略非同源序列)。在一个优选的实施方案中，用于比较目的而进行比对的参照序列的长度是参照序列长度的至少30％，优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，80％，90％，100％。然后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第1个序列中的位置被与第2个序列中的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的(本文使用的氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。2个序列之间的同一性百分比，随序列共有的相同位置数而变化，并考虑空位数和每个空位的长度，所述空位在2个序列的最佳比对中需要导入。

使用数学算法，可以实现2个序列之间的序列对比和序列同一性百分比的确定。在一个优选的实施方案中，使用Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48：444-53)算法，确定2个氨基酸序列之间的同一性百分比，该算法已经整合进GCG软件包的GAP程序(下载地址www.gcg.com)，其中使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，空位权重为16，14，12，10，8，6，或4，长度权重为1，2，3，4，5，或6。在另一个优选的实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(下载地址www.gcg.com)，确定2个核苷酸序列之间的同一性百分比，其中使用NWSgapdna.CMP矩阵，空位权重为40，50，60，70，或80，长度权重为1，2，3，4，5，或6。一个特别优选的参数集合(如果操作人员不确定应当使用哪个参数来确定分子是否在本发明的序列同一性或同源性界限内，应当使用该参数集合)是，Blossum 62评分矩阵，其空位罚分为12，空位延伸罚分为4，并且移码空位罚分为5。还可以使用Meyers和Miller((1989)CABIOS 4：11-17)的算法，确定2个氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分比，该算法已经整合进ALIGN程序(2.0版)，其中使用PAM120加权余数表，空位长度罚分为12，并且空位罚分为4。

本发明的分离的多核苷酸还可以用作杂交探针和引物，用于鉴别表达本发明多肽的细胞和组织，和它们的表达条件。

另外，通过使用编码多肽的多核苷酸，改变(即增强、减少、或修饰)细胞或生物体中本发明的多核苷酸的对应基因的表达，可以直接检查本发明的多肽的功能。这些“对应基因”是本发明涉及的基因组DNA序列，它们转录生成mRNA，从这些mRNA得到本发明的多核苷酸。

通过使用不同的抑制性多核苷酸，例如反义多核苷酸和结合和/或切割从本发明相关基因转录的mRNA的核酶，可以改变细胞或生物体中本发明相关基因的表达(参见，例如，Galderisi等(1999)J.Cell Physiol.181：251-57；Sioud(2001)Curr.Mol.Med.1：575-88)。例如，IL-17F和/或IL-17R的抑制性多核苷酸，可以用作拮抗剂，例如抑制IL-17F结合IL-17R。结果，这样的抑制性多核苷酸可以用于预防或治疗与IL-17F结合IL-17R相关的病症，例如，气道炎症(例如，囊性纤维化患者的气道炎症，包括囊性纤维化患者中细菌感染引起的肺症状加重)。

本发明涉及的反义多核苷酸或核酶可以与本发明相关基因的整个编码链互补，或仅与其一部分互补。或者，反义多核苷酸或核酶可以与本发明相关基因的编码链的非编码区互补。使用本领域众所周知的规程，可以使用化学合成和酶连接反应，构建反义多核苷酸或核酶。可以修饰化学合成的多核苷酸的核苷键，以增强它们抗核酸酶-介导的降解的能力，以及增加它们的序列特异性。这样的键修饰包括、但不限于，硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，磷酸酰胺，硼酸磷酸酯，吗啉代，和肽核酸(PNA)键(Galderisi等，同上；Heasman(2002)Dev.Biol.243：209-14；Micklefield(2001)Curr.Med.Chem.8：1157-79)。或者，使用其中已经以反义(即，反)方向亚克隆进本发明多核苷酸的表达载体，可以生物生产这些分子。

本发明的抑制性多核苷酸还包括形成三链体的寡核苷酸(TFO)，它们以高特异性和亲和力结合在双链DNA的大沟中(Knauert和Glazer(2001)Hum.Mol.Genet.10：2243-51)。通过靶定与本发明相关基因的调控区(即启动子和/或增强子序列)互补的TFO，形成阻止这些基因的转录的三螺旋结构，可以抑制本发明相关基因的表达。

在本发明的一个实施方案中，本发明的抑制性多核苷酸是短干扰RNA(siRNA)分子。这些siRNA分子是较短的(优选19-25个核苷酸；最优选19或21个核苷酸)、双链RNA分子，它们会造成目标mRNA的序列特异性的降解。该降解称作RNA干扰(RNAi)(参见，例如，Bass(2001)Nature 411：428-29)。最初在低等生物中鉴别出的RNAi已经有效地应用于哺乳动物细胞，最近已经证实在用靶定Fas mRNA的siRNA分子处理的小鼠中预防暴发性肝炎(Song等(2003)Nature Med.9：347-51)。另外，最近已经报道，鞘内递送的siRNA在2个大鼠模型(激动剂诱导的疼痛模型和神经性疼痛模型)中阻断疼痛反应(Dorn等(2004)Nucleic Acids Res.32(5)：e49)。

通过将2个互补的单链RNA分子退火在一起(其中的一个与目标mRNA的一部分匹配)(Fire等，美国专利号6,506,559)，或通过使用折叠回自身、形成必要的双链部分的单个发夹RNA分子(Yu等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：6047-52)，可以制备本发明的siRNA分子。siRNA分子可以化学合成(Elbashir等(2001)Nature 411：494-98)，或使用单链DNA模板，通过体外转录生成(Yu等，同上)。或者，siRNA分子可以使用含有有义和反义siRNA序列的表达载体，短暂地(Yu等，同上；Sui等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：5515-20)或稳定地(Paddison等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：1443-48)生物生成。最近，使用表达发夹RNA(它被进一步加工成siRNA)的腺病毒载体，证实了原代人细胞中目标mRNA水平的有效的且序列特异性方式的减少(Arts等(2003)Genome Res.13：2325-32)。

可以基于本领域众所周知的标准，设计靶定本发明的多核苷酸的siRNA分子(例如，Elbashir等(2001)EMBO J.20：6877-88)。例如，目标mRNA的目标区段优选地应当从AA(最优选的)，TA，GA，或CA开始；siRNA分子的GC比优选地应当是45-55％；siRNA分子优选地不应当在一行中含有3个相同的核苷酸；siRNA分子优选地不应当在一行中含有7个混合的G/C；目标区段优选地应当在目标mRNA的ORF区中，且优选地应当在起始ATG之后至少75bp和终止密码子之前至少75bp。基于这些标准或其它已知标准(例如，Reynolds等(2004)NatureBiotechnol.22：326-30)，本领域普通技术人员可以设计靶定本发明的mRNA多核苷酸的本发明的siRNA分子。

还可以通过制备基因组中已经导入了本发明多核苷酸的非人转基因动物，实现本发明相关基因在生物体中的改变表达。这样的转基因动物包括具有多个拷贝的本发明基因(即转基因)的动物。可以将组织特异性的调节序列可操作地连接到转基因上，以指导本发明的多肽在特定细胞或特定发育阶段的表达。通过胚胎操作和显微注射制备转基因动物(更具体地，小鼠等动物)的方法，已经成为常规技术，且是本领域众所周知的(例如，Bockamp等，Physiol.Genomics 11：115-32(2002))。

还可以通过制备动物，该动物与本发明多核苷酸相对应的内源基因已经通过插入外来多核苷酸序列而破坏(即敲除的动物)，实现本发明相关基因在生物体中的改变表达。可以破坏内源基因的编码区，从而制备无功能的蛋白。或者，可以破坏或用不同的调控元件替换内源基因的上游调控区，导致仍然有功能的蛋白的改变表达。制备敲除的动物的方法包括同源重组，且是本领域众所周知的(例如，Wolfer等，Trends Neurosci.25：336-40(2002))。

本发明的分离的多核苷酸还可以可操作地连接到表达控制序列上，和/或连接进用于重组生产本发明多肽(包括其活性片段和/或融合多肽)的表达载体中。表达重组蛋白的一般方法是本领域众所周知的。

本文使用的表达载体意在指核酸分子，其能运送已经与之连接的另一个核酸。一类载体是质粒，它指环状双链DNA环，其中可以连接额外的DNA区段。另一类载体是病毒载体，其中可以将额外的DNA区段连接进病毒基因组中。某些载体能在它们导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体，和附加的哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加的哺乳动物载体)可以在导入宿主细胞后整合进宿主细胞的基因组中，从而随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能指导它们可操作地连接的基因的表达。这样的载体在本文中称作重组表达载体(或简称为表达载体)。一般而言，在重组DNA技术中使用的表达载体经常是质粒形式。在本说明书中，质粒和载体可以互换地使用，因为质粒是最常用的载体形式。但是，本发明意在包括起相同功能的其它形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒，腺病毒和腺伴随病毒)。

在一个实施方案中，本发明的多核苷酸用于制备重组IL-17F激动剂，例如，基于至少一个“IL-17F受体结合基序”的存在可以鉴别出的那些。本文使用的术语“IL-17F受体结合基序”包括对于IL-17F与它的必要受体的结合而言重要的氨基酸序列或残基。IL-17F激动剂的实例包括重组IL-17F，和/或其片段，例如，其IL-17R结合片段。在另一个实施方案中，本发明的多核苷酸用于制备IL-17F拮抗剂(例如，IL-17F和/或IL-17R抑制性多核苷酸；可溶的IL-17R多肽(包括其片段(例如，IL-17F结合片段)和/或融合蛋白)；抑制性抗IL-17F或抗IL-17R抗体；和/或拮抗性小分子，等)。

本领域众所周知制备融合多肽的方法，即将第一个多肽部分连接到第二个多肽部分。例如，IL-17F多肽或IL-17R多肽(包括其片段)可以融合到第二个多肽部分，例如，免疫球蛋白或其片段(例如，其Fc结合片段)。在有些实施方案中，第一个多肽部分包括，例如，全长IL-17F或IL-17R多肽。或者，第一个多肽可以包含小于全长IL-17F或IL-17R多肽。另外，例如IL-17F或IL-17R的可溶形式可以通过″接头″序列融合到免疫球蛋白的Fc部分上。还可以使用其它融合蛋白，例如含有谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、Lex-A、硫氧还蛋白(TRX)或麦芽糖结合蛋白(MBP)的那些。

第二个多肽部分优选是可溶的。在有些实施方案中，第二个多肽部分能够增加连接的多肽的半衰期(例如，血清半衰期)。在有些实施方案中，第二个多肽部分包括促进融合多肽与第二种IL-17F或IL-17R多肽的缔合的序列。在优选的实施方案中，第二个多肽至少包括免疫球蛋白多肽的一个区域。免疫球蛋白融合多肽是本领域已知的，且记载在，例如，美国专利号5,516,964；5,225,538；5,428,130；5,514,582；5,714,147；和5,455,165，它们都在本文引作参考。融合蛋白可以另外包含接头序列，后者将第一个多肽部分(例如，IL-17F或IL-17R，包括其片段)连接到第二个部分上。这样的接头序列的应用是本领域众所周知的。例如，融合蛋白可以包含肽接头，例如，长度为约2-20、更优选小于10个氨基酸的肽接头。在一个实施方案中，肽接头的长度可以是2个氨基酸。

在另一个实施方案中，重组蛋白在它的N-末端包括异源信号序列(即不存在于IL-17F或IL-17R核酸编码的多肽中的多肽序列)。例如，来自另一种蛋白的信号序列可以与IL-17F或IL-17R多肽(包括其片段和/或融合蛋白)相融合。在某些宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)中，通过使用异源信号序列，可以增加重组蛋白的表达和/或分泌。可以包含在融合蛋白中的信号肽是蜂毒肽信号肽MKFLVNVALVFMVVYISYIYA(SEQ ID NO：5)。

本发明的融合蛋白可以通过标准的重组DNA技术来生产。例如，根据常规技术，使用例如平端的或突出端的末端进行连接、限制酶消化，以提供适宜末端，根据需要补平粘端，碱性磷酸酶处理，以避免不希望的连接和酶连接，可以将编码不同多肽序列的DNA片段符合读框地连接到一起。在另一个实施方案中，通过常规技术，包括自动化DNA合成仪，可以合成融合基因。或者，可以使用锚定引物，对基因片段进行PCR扩增，所述锚定引物产生2个相邻基因片段之间的互补突出物，它们可以随后退火和再扩增，以制备嵌合基因序列(参见，例如，Ausubel等(编)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，1992)。此外，可商业上得到许多编码融合部分(例如，免疫球蛋白重链的Fc区)的表达载体。IL-17F或IL-17R编码核酸可以克隆进这样的表达载体，从而将融合部分符合读框地连接到免疫球蛋白上。在有些实施方案中，IL-17F或IL-17R融合多肽作为寡聚体(例如二聚体或三聚体)存在。

本发明的重组表达载体可以携带额外的序列，例如调节载体在宿主细胞中的复制的序列(例如，复制起点)和选择标记基因。选择标记基因有助于选择已经导入了该载体的宿主细胞。例如，通常选择标记基因会赋予已经导入了该载体的宿主细胞对药物(例如G418，潮霉素或甲氨蝶呤)的抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于甲氨蝶呤选择/扩增dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。

可以选择或构建合适的载体，其含有适当的调控序列，包括启动子序列，终止子序列，聚腺苷酸化序列，增强子序列，标记基因和其它序列，例如，在适当时调控载体在宿主细胞中的复制(例如，复制起始)的序列。根据需要，载体可以是质粒或病毒的，例如，噬菌体或噬菌粒。其它细节参见，例如，Molecular Cloning：a Laboratory Manual：第2版，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。操纵核酸的许多已知技术和方法，例如，在核酸构建体的制备、诱变、测序、DNA向细胞中的导入和基因表达、以及蛋白的分析中，详细记载在Currentprotocols in Molecular Biology，第2版，Ausubel等编，John Wiley&Sons，1992。

因而，本发明的另一个方面提供了宿主细胞，其包含本文公开的核酸。另一个方面提供了一种方法，其包含将这样的核酸导入宿主细胞中。所述导入可以采用任何可用的技术。对于真核细胞，合适的技术可以包括磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖，电穿孔，脂质体-介导的转染，和使用逆转录病毒或其它病毒(例如，痘苗病毒，或对于昆虫细胞而言的杆状病毒)的转导。就细菌细胞而言，合适的技术可以包括氯化钙转化，电穿孔和使用噬菌体的转染。导入之后可以造成或允许核酸的表达，例如，通过在基因表达条件下培养宿主细胞。

许多细胞系可以作为适用于重组表达本发明多肽的宿主细胞。哺乳动物宿主细胞系包括，例如，COS细胞，CHO细胞，293细胞，A431细胞，3T3细胞，CV-1细胞，HeLa细胞，L细胞，BHK21细胞，HL-60细胞，U937细胞，HaK细胞，Jurkat细胞，以及源自原代组织和原代外植体的体外培养物的细胞株。

或者，可以在低等真核生物(例如酵母)或原核生物中重组生产本发明的多肽。可能合适的酵母菌株包括啤酒糖酵母，裂殖酵母，克鲁维酵母菌株，和假丝酵母菌株。可能合适的细菌菌株包括大肠杆菌，枯草芽孢杆菌和鼠伤寒沙门菌。如果在酵母或细菌中制备本发明的多肽，可能必须修饰它们，例如，通过适当位点的磷酸化或糖基化，以便得到功能性。这样的共价结合可以使用众所周知的化学方法或酶方法来实现。

在细菌中的表达可能导致掺入重组蛋白的包涵体的形成。因而，可能需要重新折叠重组蛋白，以便生产有活性的或更高活性的物质。几种从细菌包涵体得到正确折叠的异源蛋白的方法，是本领域已知的。这些方法通常包含，溶解来自包涵体的蛋白，然后使用离液剂使蛋白完全变性。当蛋白的一级氨基酸序列中存在半胱氨酸残基时，经常需要在允许正确形成二硫键的环境(氧化还原系统)中实现重新折叠。重新折叠的一般方法公开在Kohno(1990)Meth.Enzymol.185：187-95。EP 0433225，和美国专利号5,399,677描述了其它适当的方法。

通过将本发明的分离的多核苷酸可操作地连接到一种或多种昆虫表达载体(例如杆状病毒载体)的合适控制序列上，并使用昆虫细胞表达系统，还可以重组生产本发明的多肽。用于杆状病毒/Sf9表达系统的材料核方法，可以试剂盒形式商购(例如，MaxBac^试剂盒，Invitrogen，Carlsbad，CA)。

在适当宿主细胞中重组表达后，然后可以使用已知的纯化方法，例如凝胶过滤和离子交换层析，从培养基或细胞提取物中纯化本发明的重组多肽。例如，IL-17F或IL-17R蛋白(包括其片段和/或融合蛋白)可以从条件培养基中纯化。膜结合形式的例如IL-17R，可以如下纯化：从表达细胞制备全膜级分，并且用非离子去污剂(例如Triton X-100)提取膜。使用可商业上得到的蛋白浓缩过滤器，例如，AMICON^或MilliporePELLICON^超滤设备，可以浓缩本发明的多肽。浓缩步骤之后，可以将浓缩物应用于纯化基质，例如凝胶过滤介质上。或者，可以使用阴离子交换树脂，例如，具有悬垂的二乙基氨基乙基(DEAE)或聚乙烯亚胺(PEI)基团的基质或底物。基质可以是丙烯酰胺，琼脂糖，葡聚糖，纤维素或常用于蛋白纯化中的其它类型。或者，可以使用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换剂包括各种包含磺丙基或羧甲基的不溶基质。磺丙基是优选的(例如，S-Sepharose^柱)。从培养上清液纯化重组蛋白还可以包括一个或多个柱步骤，后者是在伴刀豆球蛋白A-琼脂糖、肝素-TOYOPEARL^(Toyo Soda Manufacturing Co.，Ltd.，Japan)或Cibacrom blue 3GASepharose^(Tosoh Biosciences，San Francisco，CA)等亲和树脂上进行；或通过疏水相互作用层析，使用苯基醚、丁基醚或丙基醚等树脂；或通过免疫亲合层析。最后，可以使用一个或多个反相高效液相层析(RP-HPLC)步骤，使用疏水RP-HPLC培养基，例如，具有悬垂的甲基或其它脂族基团的硅胶，进一步纯化重组蛋白。还可以在根据已知方法的纯化中，使用包含抗体(例如，使用本文方法描述的那些)的亲和层析柱。有些或全部前述纯化步骤，以不同组合或与其它已知方法一起，还可以用于提供基本上纯化的分离的重组蛋白。优选地，纯化分离的重组蛋白，使它基本上不含有其它哺乳动物蛋白。另外，这些纯化操作还可以用于纯化来自其它来源(包括天然来源)的本发明多肽。例如，可以如上所述纯化本发明的多肽，例如，IL-17F或IL-17R多肽(包括其片段和/或融合蛋白)，它们表达为转基因动物的产物，例如，作为转基因母牛、山羊、猪或绵羊的乳汁的组分。

或者，还可以以有利于纯化的方式重组表达多肽。例如，多肽可以表达为与麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或硫氧还蛋白(TRX)等蛋白的融合体。用于表达和纯化这样的融合蛋白的试剂盒可分别从New England BioLabs(Beverly，MA)、Pharmacia(Piscataway，NJ)、和Invitrogen购得。还可以用小表位标记重组蛋白，随后使用该表位的特异性抗体鉴别或纯化。优选的表位是FLAG表位，它可从Eastman Kodak(New Haven，CT)购得。

本发明的多肽还可以通过已知的常规化学合成来制备。化学合成这样的多肽的方法，是本领域技术人员众所周知的。这样的化学合成的多肽可以与天然的纯化多肽具有共同的生物性质，因而可以用作天然多肽的生物活性的或免疫学的替代物。

本发明的多肽还包括结构上与公开的多肽不同(例如，具有轻微改变的序列)，但是基本上具有与公开的多肽相同的生化性质的分子(例如，变化仅在于功能非必需的氨基酸残基)。这样的分子包括天然存在的等位基因变体和有意工程化的含有改变、取代、替换、插入或缺失的变体。这样的改变、取代、替换、插入或缺失的技术，是本领域技术人员众所周知的。在有些实施方案中，多肽部分提供为变体多肽，其具有在天然存在的序列(野生型)中的突变，产生更抗蛋白水解的序列(相对于未突变的序列)。

IL-17F或IL-17R多肽，及其片段和/或融合多肽，可以用于筛选能结合IL-17F和/或抑制IL-17F生物活性的试剂，即拮抗剂。这样的拮抗剂，例如，抑制性多核苷酸，多肽(包括片段及其融合蛋白)，抗体，小化合物，等，可以例如通过抑制IL-17F结合IL-17R而抑制IL-17F生物活性。使用固定的或未固定的所需结合蛋白的结合测定，是本领域众所周知的，可以用于本发明多肽(包括IL-17R)的该目的。基于纯化的细胞的或基于蛋白的(无细胞的)筛选测定可以用于鉴别这样的试剂。例如，IL-17F蛋白可以以纯化形式固定到载体上，且可以测量潜在配体与纯化的IL-17F的结合。

抗体

发明人使用特异性地结合IL-17F的抗IL-17F抗体(即完整抗体及其抗原结合片段)来检测从还经受肺症状加重的囊性纤维化患者收集的痰样品中的IL-17F。另外，发明人使用对IL-17R特异性的单克隆抗体来拮抗IL-17F-介导的炎性细胞因子(例如，GRO-α和G-CSF)的生产。因而，在本发明的一个实施方案中，拮抗性的抗IL-17F或抗IL-17R抗体可以用于诊断、预后、监测和/或治疗与IL-17F相关的病症，例如，气道炎症(例如，囊性纤维化患者的气道炎症，包括囊性纤维化患者中细菌感染引起的肺症状加重)。所述抗体可以是人的、人源化的、嵌合的或体外制备的抗体。

本领域技术人员会认识到，本文使用的术语“抗体”指包含至少1个、优选2个重(H)链可变区(在本文中缩写为VH)，和至少1个、优选2个轻(L)链可变区(在本文中缩写为VL)的蛋白。VH和VL区可以进一步细分成称作“互补决定区”(“CDR”)的超变区，其中散布着称作“构架区”(“FR”)的更保守的区域。已经精确地定义了FR和CDR的范围(参见，Kabat等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242；和Chothia等(1987)J.Mol.Biol.196：901-917，它们在本文引作参考)。每个VH和VL由3个CDR和4个FR组成，从氨基端至羧基端的排列次序是：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。

抗体还可以包括重链和轻链恒定区，从而分别形成重和轻免疫球蛋白链。在一个实施方案中，抗体是2个重免疫球蛋白链和2个轻免疫球蛋白链的四聚体，其中所述重和轻免疫球蛋白链通过例如二硫键相连接。重链恒定区包含3个结构域，CH1，CH2和CH3。轻链恒定区包含1个结构域，CL。重轻和链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。

免疫球蛋白指由基本上由免疫球蛋白基因编码的一种或多种多肽组成的蛋白。公知的人免疫球蛋白基因包括κ，λ，α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)、δ，ε和μ恒定区基因，以及众多的免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白“轻链”(约25Kd，或214个氨基酸)由在NH₂-末端的可变区基因(约110个氨基酸)和在COOH-末端的κ或λ恒定区基因编码。全长免疫球蛋白“重链”(约50Kd，或446个氨基酸)类似地由可变区基因(约116个氨基酸)和其它前述恒定区基因之一(例如γ(编码约330氨基酸))编码。免疫球蛋白重链恒定区基因编码抗体类别，即同种型(例如，IgM或IgG1)。本文使用的抗体的抗原结合片段(或简称为“抗体部分”或“片段”)指全长抗体的一个或多个片段，其保留特异性地结合抗原(例如，CD3)的能力。包含在术语抗体的“抗原结合片段”中的结合片段的实例包括，(i)Fab片段，即由VL，VH，CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)₂片段，即包含2个在铰链区通过二硫键连接的Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单个臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等(1989)Nature 341：544-46)，它由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的2个结构域(VL和VH)由分开的基因编码，它们可以使用重组方法，通过合成的接头连接到一起，所述接头能使它们成为单个蛋白链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称作单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等(1988)Science 242：423-26；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-83)。这样的单链抗体也包含在术语抗体的“抗原结合片段”中。可以使用本领域技术人员已知的常规技术得到这些抗体片段，并以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。

通过本领域技术人员众所周知的方法，可以制备本发明多肽的抗体分子，例如，IL-17F或IL-17R的抗体。例如，通过根据已知方法制备杂交瘤，可以生产单克隆抗体。然后使用标准方法，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)，筛选以该方式形成的杂交瘤，以鉴别产生特异性地结合本发明多肽的抗体的一个或多个杂交瘤。例如，本发明的IL-17F蛋白还可以用于免疫动物，以得到多克隆和单克隆抗体，它们可以与IL-17F蛋白反应。类似地，IL-17R蛋白可以用于得到多克隆和单克隆抗体，它们与IL-17R特异性地反应。肽免疫原另外可以含有在羧基端的半胱氨酸残基，且可以缀合到半抗原上，例如匙孔血蓝蛋白(KLH)。通过用硫酸化的酪氨酸残基替代酪氨酸残基，可以制备其它的肽免疫原。合成这样的肽的方法是本领域众所周知的，例如，参见Merrifield(1963)J.Amer.Chem.Soc.85：2149-54；Krstenansky等(1987)FEBS Lett.211：10。本发明的全长多肽可以用作免疫原，或者，可以使用多肽的抗原性肽片段。本发明多肽的抗原性肽包含至少7个连续氨基酸残基，且包括表位，以便针对该肽产生的抗体与该多肽形成特定免疫复合物。优选地，抗原性肽包含至少10个氨基酸残基，更优选至少15个氨基酸残基，更优选至少20个氨基酸残基，最优选至少30个氨基酸残基。

通过重组DNA技术领域的人员已知的其它方法，可以制备单克隆抗体。作为制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的替代方案，通过用本发明的多肽(例如，IL-17F或IL-17R)筛选重组的组合免疫球蛋白文库(例如，抗体噬菌体展示文库)，从而鉴别和分离本发明多肽的单克隆抗体，从而分离结合本发明多肽的免疫球蛋白文库成员。用于制备和筛选噬菌体展示文库的技术和可商业上得到的试剂盒是本领域技术人员众所周知的。另外，可以在文献中找到特别适用于制备和筛选抗体展示文库的方法和试剂的实例。例如，“组合抗体展示”方法是众所周知的，并被用于鉴别和分离具有特定抗原特异性的抗体片段，且可以用于制备单克隆抗体(关于组合抗体展示的描述，参见，例如，Sastry等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5728；Huse等(1989)Science 246：1275；Orlandi等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：3833)。用本文所述免疫原免疫动物后，克隆得到的B-细胞库的抗体所有组成成分。使用寡聚体引物的混合物和PCR，得到各种免疫球蛋白分子群体的可变区DNA序列的方法，是公知的。例如，混合的与5’前导(信号肽)序列和/或构架1(FR1)序列相对应的混合寡核苷酸引物，以及保守的3’恒定区的引物，可以用于PCR扩增来自许多鼠抗体的重轻和链可变区(Larrick等(1991)BioTechniques 11：152-56)。类似的策略还已经用于扩增来自人抗体的人重轻和链可变区(Larrick等(1991)Mehthods ：Companion to Mehthods in Enzymology 2：106-10)。

通过用本发明多肽免疫合适的受试者，可以制备多克隆血清和抗体。通过标准技术，例如使用固定的蛋白的ELISA，可以随时间监测免疫的受试者的抗体效价。如果需要，可以从受试者或培养基分离本发明多肽的抗体分子，并通过众所周知的技术(例如蛋白A层析)进一步纯化，以得到IgG级分。

根据本领域众所周知的方法，通过切割抗体，可以制备本发明多肽的抗体的片段。例如，通过用酶例如胃蛋白酶处理蛋白，可以制备免疫活性的Fab和F(ab’)₂片段。

另外，使用修饰成反应于抗原攻击而生产全人抗体(而不是动物内源抗体)的转基因非人动物，可以制备人抗体(参见，例如，PCT公开WO 94/02602)。已经使在非人宿主中编码重和轻免疫球蛋白链的内源基因丧失能力，并将有活性的编码人重轻和链免疫球蛋白的基因座插入宿主基因组。使用例如含有必要人DNA区段的酵母人工染色体，整合人基因。然后，通过使含有比修饰的完全互补序列少的中间转基因动物杂交，得到提供所有需要的修饰的动物后代。这样的非人动物的优选实施方案是小鼠，并称作XENOMOUSE^TM，如在PCT公开WO 96/33735和WO96/34096中披露的。该动物生产分泌全人免疫球蛋白的B细胞。可以在用目标免疫原免疫后从动物直接得到抗体，例如，在多克隆抗体的制备中，或者从源自动物的永生化B细胞(例如生产单克隆抗体的杂交瘤)得到抗体。另外，可以回收编码含有人可变区的免疫球蛋白的基因，并表达，以直接得到抗体，或可以进一步修饰，以得到抗体类似物，例如单链Fv分子。

另外，使用标准的重组DNA技术和/或重组组合免疫球蛋白文库，可以制备包含人和非人部分的本发明多肽的嵌合的、人源化的、和单链抗体。使用不能表达内源免疫球蛋白重轻和链基因、但是可以表达人重轻和链基因的转基因小鼠，还可以制备人源化的抗体。例如，使用携带人免疫球蛋白基因(而不是鼠免疫球蛋白基因)的转基因小鼠，可以制备抗例如IL-17F的人单克隆抗体(mAb)。来自用目标抗原免疫的这些转基因小鼠的脾细胞，然后可以用于生产杂交瘤，后者会分泌对人蛋白表位具有特异性亲和力的人mAb(参见，例如，Wood等，国际申请号WO91/00906；Kucherlapati等，WO 91/10741；Lonberg等WO 92/03918；Kay等，WO 92/03917；Lonberg等(1994)Nature 368：856-59；Green等(1994)Nat.Genet.7：13-21；Morrison等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-55；Bruggeman(1993)Year Immunol7：33-40；Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：3720-24；Bruggeman等(1991)Eur.J.Immunol.21：1323-26)。

通过本领域已知的重组DNA技术，可以制备嵌合抗体，包括嵌合免疫球蛋白链。例如，用限制酶消化编码鼠(或其它物种)单克隆抗体分子的Fc恒定区的基因，以去除编码鼠Fc的区域，并取代编码人Fc恒定区的基因的等同部分(参见Robinson等，国际专利公开PCT/US86/02269；Akira等，欧洲专利申请184,187；Taniguchi，欧洲专利申请171,496；Morrison等，欧洲专利申请173,494；Neuberger等，WO 86/01533；Cabilly等，美国专利号4,816,567；Cabilly等，欧洲专利申请125,023；Better等(1988)Science 240：1041-43；Liu等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-43；Liu等(1987)J.Immunol.139：3521-26；Sun等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：214-18；Nishimura等(1987)Cancer Res.47：999-1005；Wood等(1985)Nature 314：446-49；和Shaw等(1988)J.Natl.Cancer Inst.80：1553-59)。

通过本领域已知的方法，可以人源化抗体或免疫球蛋白链。通过用人Fv可变区的等同序列替换不直接参与抗原结合的Fv可变区序列，可以制备人源化的抗体，包括人源化的免疫球蛋白链。制备人源化的抗体的一般方法，参见Morrison(1985)Science 229：1202-07；Oi等(1986)BioTechniques 4：214；Queen等，美国专利号5,585,089；5,693,761；5,693,762，它们的内容都在本文引作参考。这些方法包括分离、操作和表达核酸序列，该核酸序列编码来自重链或轻链中的至少一个的全部或一部分免疫球蛋白Fv可变区。这样的核酸序列的来源是本领域技术人员众所周知的，例如，可以从生产抗预定目标的抗体的杂交瘤得到。然后，可以将编码人源化的抗体或其片段的重组DNA克隆进适当表达载体。

通过CDR移植或CDR取代，其中可以替换免疫球蛋白链的1、2或所有CDR，可以制备人源化的或CDR-移植的抗体分子或免疫球蛋白。参见，例如，美国专利号5,225,539；Jones等(1986)Nature 321：552-25；Verhoeyan等(1988)Science 239：1534；Beidler等(1988)J.Immunol.141：4053-60；Winter，美国专利号5,225,539，它们的内容都在本文引作参考。Winter描述了一种CDR-移植方法，其可以用于制备本发明的人源化的抗体(英国专利申请GB 2188638A；Winter，美国专利号5,225,539)，它们的内容都在本文引作参考。可以用非人CDR的至少一部分，替换特定人抗体的所有CDR，或者可以用非人CDR替换仅仅一部分CDR。只需要替换人源化抗体与预定抗原的结合所需的CDR数量。

已经通过例如缺失、添加或取代抗体的其它部分(例如，恒定区)修饰的单克隆的、嵌合的和人源化的抗体，也在本发明范围内。作为非限制性实例，可以如下修饰抗体：通过缺失恒定区，通过用另一个恒定区(例如，用于增加抗体的半衰期、稳定性或亲和力的恒定区，或来自另一物种或抗体类别的恒定区)替代恒定区，和通过修饰恒定区中的一个或多个氨基酸，以改变例如糖基化位点的数目、效应细胞功能、Fc受体(FcR)结合、补体固定等。改变抗体恒定区的方法是本领域已知的。通过用不同残基替换抗体恒定部分的至少1个氨基酸残基(参见，例如，EP 388,151A1，美国5,624,821和美国5,648,260，它们的内容都在本文引作参考)，可以制备具有改变的功能(例如，改变的对效应配体(例如细胞上的FcR或补体的C1组分)的亲和力)的抗体。可以应用鼠(或其它物种的)免疫球蛋白的类似类型的改变，减少或消除这些功能。这样的改变是本领域已知的。例如，通过用在侧链上具有适当功能性的残基替代指定的残基，或通过导入带电荷的官能团(例如谷氨酸或天冬氨酸)或芳族非极性残基(例如苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸或丙氨酸)(参见，例如，美国5,624,821)，可以改变抗体(例如，IgG，例如人IgG)的Fc区对FcR(例如，FcγR1)或C1q的结合亲和力。本发明的抗IL-17F或抗IL-17R抗体可以用于分别分离、纯化和/或检测在上清液、细胞裂解物中或在细胞表面上的IL-17F或IL-17R多肽。另外，本领域技术人员可以认识到将IL-17F或IL-17R的抗体用于下述筛选方法中的方法。本发明公开的抗体还可以在诊断上用于监测例如IL-17F蛋白水平，作为临床测试过程的一部分，或在临床上用于将治疗调控剂靶定于包含该抗体的抗原的细胞或组织。例如，可以将治疗剂(例如小分子)或本发明的其它治疗剂连接到抗IL-17F或抗IL-17R抗体上，以便将治疗剂靶定于分别表达IL-17F或IL-17R的细胞或组织。或者，IL-17F或IL-17R的抗体可以用作抑制性抗体，即拮抗剂，用于降低、限制、阻断或减少IL-17F结合IL-17R。

除了用于本发明的抗体以外，其它分子还可以用于调控IL-17F同二聚体、IL-17A同二聚体、和/或IL-17F/IL-17A同二聚体的活性。这样的分子包括小模块免疫药物(SMIP^TM)(Trubion Pharmaceuticals，Seattle，WA)。SMIP是一种单链多肽，由相关结构(例如抗原，反受体等)的结合结构域、具有1个或没有半胱氨酸残基的铰链区多肽、和免疫球蛋白CH2和CH3结构域组成(也参见www.trubion.com)。SMIP和它们的用法和用途，公开在例如，美国公开专利申请号2003/0118592,2003/0133939，2004/0058445，2005/0136049，2005/0175614，2005/0180970，2005/0186216，2005/0202012，2005/0202023，2005/0202028，2005/0202534，和2005/0238646，及其相关专利家族成员中，它们都在本文中整体引作参考。

筛选测定

本发明的相关多核苷酸和多肽(包括其抗体)可以用于鉴别药理学试剂或试剂的先导化合物(包括其抗体)的筛选测定中，所述试剂能调控细胞或生物体中的IL-17F活性，因而是炎症反应的潜在调节剂。例如，可以使含有IL-17F(天然的或重组的)的样品接触许多种测试化合物(生物试剂或小有机分子)中的一种，并将每种处理样品中的IL-17F的生物活性与未处理样品或接触不同测试化合物的样品中的IL-17F的生物活性相对比。这样的对比会确定任一种测试化合物是否会导致：1)IL-17F表达或生物活性的水平显著降低，从而指示着IL-17F的拮抗剂，或2)IL-17F表达或生物活性的水平显著增加，从而指示着IL-17F的激动剂。在一个实施方案中，使用高流通量筛选测定，例如BIACORE^(BiacoreIntemational AB，Uppsala，Sweden)、BRET(生物发光共振能转移)、和FRET(荧光共振能转移)测定，以及ELISA和基于细胞的测定，鉴别能调控IL-17F活性的测试化合物。

小分子

还可以通过使用拮抗(即抑制)IL-17F活性的小分子(通常是有机小分子)，在患有IL-17F相关病症(或具有患所述病症的危险)(例如，气道炎症，例如，囊性纤维化患者的气道炎症，包括囊性纤维化患者中细菌感染引起的肺症状加重，等)的生物体(或受试者)中、或来自经受这样的病症的生物体(或受试者)的细胞中，实现IL-17F活性的降低。通过上述的筛选方法，可以鉴别出新的拮抗性小分子，并可以用于下文所述的本发明的治疗方法中。

术语小分子指不是大分子的化合物(参见，例如，Karp(2000)Bioinformatics Ontology 16：269-85；Verkman(2004)AJP-Cell Physiol.286：465-74)。因而，小分子经常视作例如小于1000道尔顿的那些化合物(例如，Voet和Voet，Biochemistry，第2版，编者N.Rose，Wiley和Sons，New York，14(1995))。例如，Davis等(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA102：5981-86使用短语小分子来指代叶酸盐、甲氨蝶呤和神经肽，而Halpin和Harbury(2004)PLos Biology 2：1022-30使用该短语来指代小分子基因产物，例如，DNA，RNA和肽。天然小分子的实例包括但不限于，胆固醇，神经递质，适体，和siRNA；合成的小分子包括、但不限于，在许多可商业上得到的小分子数据库中列出的各种化学物质，例如，FCD(精细化学物质数据库)、SMID(小分子相互作用数据库)、ChEBI(生物利益的化学实体)、和CSD(Cambridge结构数据库)(参见，例如，Alfarano等(2005)Nuc.Acids Res.Datebase Issue 33：D416-24)。

诊断、预后和监测IL-17F相关病症的进展的方法

本发明提供了通过检测IL-17F活性的上调，例如，通过检测IL-17F的上调，包括但不限于在人受试者中使用这样的方法，诊断、预后和监测受试者中IL-17F相关病症(例如，直接或间接涉及IL-17F生物活性的增加的病症)的进展的方法。这些方法可以例如使用预包装的试剂盒来实现，所述试剂盒包含下述的至少一种：IL-17F或IL-17R多核苷酸(或其片段)；IL-17F或IL-17R多肽(或其片段和/或融合蛋白)；IL-17F或IL-17R多肽的抗体(或其衍生物)；或IL-17F或IL-17R多核苷酸和/或本文所述多肽的调控剂，它们可以方便地用于例如临床环境中。另外，本领域技术人员会认识到，间接方法也可以用于检测例如IL-17F的上调，例如计数免疫细胞(例如，中性粒细胞)的数目。

“诊断的”或“诊断”指鉴别病理学状况的存在与否。诊断方法包括，通过确定来自受试者(人或非人哺乳动物)的生物样品中IL-17F的基因产物(例如，RNA，cDNA，或多肽，包括其片段)的测试量，和对比该测试量与正常量或范围(即来自已知没有经受IL-17F相关的病症的个体的量或范围)，检测IL-17F生物活性的上调。尽管特定诊断方法可能没有提供IL-17F相关的病症的确定诊断，如果该方法提供辅助诊断的阳性指示就足够了。

本发明还提供了通过检测例如IL-17F活性的上调，例如，通过检测IL-17F的上调，对这样的病症进行预后的方法。“预后的”或“预后”指预测病理学状况的可能发展和/或严重性。预后方法包括，确定来自受试者的生物样品中IL-17F的基因产物的测试量，和对比该测试量与IL-17F基因产物的预测量或范围(即来自具有不同严重性的IL-17F相关病症的个体的量或范围)。测试样品中IL-17F基因产物的不同量，与IL-17F相关病症的某些预后相一致。在特定预后水平的IL-17F基因产物量的检测，提供了受试者的预后。

本发明还提供了通过检测例如IL-17F活性的上调，例如，通过检测IL-17F的上调，监测这样的IL-17F相关的病症的进展或过程的方法。监测方法包括，确定在第一和第二时间从受试者采集的生物样品中IL-17F的基因产物的测试量，和对比这些测试量。第一和第二时间之间IL-17F基因产物的量的变化，指示着IL-17F相关病症的过程的变化，其中量的降低指示着这样的病症的缓解。这样的监测测定还可以用于评价特定治疗干预在待治疗自身免疫病的患者中的功效。

可以在许多种生物样品中检测上述方法中的增强的IL-17F，所述生物样品包括体液(例如，全血，血浆和尿)，细胞(例如，全细胞，细胞级分和细胞提取物)和其它组织。生物样品还包括组织切片，例如活组织检查和为组织学目的制备的冷冻切片。优选的生物样品包括血液，血浆，淋巴，组织活检物，尿，CSF(脑脊液)、滑液和BAL(支气管肺泡灌洗液)。应当明白，生物样品的分析不一定需要从受试者取出细胞或组织。例如，可以将适当标记的、结合IL-17F基因产物(例如，抗体，核酸)的试剂施用给受试者，并使用标准的成像技术(例如，CAT，NMR(MRI)、和PET)观察(当结合到目标上时)。

在本发明的诊断和预后测定中，检测和定量IL-17F基因产物，以生成测试量。然后将测试量与正常量或范围相对比。明显超过正常量或范围的量，是诊断IL-17F相关的病症的阳性指征。下面描述了检测和定量IL-17F基因产物的具体方法。

对于任何特定样品类型和群体，可以确定IL-17F基因产物的正常量或基线水平。通常，通过测量来自正常(即健康)受试者的生物样品类型中IL-17F蛋白或mRNA各自的量，确定IL-17F蛋白或mRNA的基线(正常)水平。或者，通过测量从与采集病变的(或可能病变的)测试细胞或组织相同的受试者采集的健康细胞或组织中的量，可以确定IL-17F基因产物的正常值。可以以每个细胞、每个总蛋白或单位体积为基础，确定或表示IL-17F基因产物的量(正常量或测试量)。为了确定样品的细胞量，可以测量在采集生物样品的细胞类型中组成型表达的基因产物或以已知水平表达的其它基因产物的水平。

应当明白，本发明的测定方法不一定需要测量IL-17F基因产物的绝对值，因为相对值对于这些方法的许多用途是足够的。还应当明白，除了IL-17F基因产物的量或丰度以外，通过对比正常基因产物和表达图谱，可以鉴别变体或异常IL-17F基因产物或它们的表达模式(例如，突变的转录物，截短的多肽)。

两种样品中的特定基因或蛋白的表达是否显著类似或显著不同，例如，显著超过或显著低于给定水平，取决于基因本身，尤其是它在不同个体或不同样品中表达的变异性。确定表达水平是否显著类似或不同，属于本领域常识。当确定两种样品之间例如IL-17F和/或IL-17R的表达水平是否显著类似或显著不同，例如显著超过给定水平时，可以考虑例如个体、物种、器官、组织、或细胞之间IL-17F和/或IL-17R表达水平的遗传变异等因素(在必要的时间和场合)。作为个体、物种、器官、组织或细胞之间基因表达的天然异质性的结果，“显著类似”或“显著高于”等短语不能定义为精确百分比或值，然而可以由本领域技术人员在实施本发明后判定。

本发明的诊断、预后和监测测定包括检测和定量生物样品中的IL-17F基因产物。IL-17F基因产物包括mRNA和多肽，二者可以使用本领域技术人员众所周知的方法测量。

例如，使用基于杂交的测定，例如RNA印迹杂交、原位杂交、点和狭线印迹，以及寡核苷酸阵列，可以直接检测mRNA。基于杂交的测定是指使探针核酸与目标核酸杂交的测定。在有些形式中，将靶、探针或二者固定。固定的核酸可以是DNA，RNA，或另一种寡核苷酸或多核苷酸，且可以包含天然或非天然存在的核苷酸、核苷酸类似物或主链。选择用于本发明的核酸探针序列(基于IL-17F的核酸序列)的方法是本领域众所周知的。

或者，可以在检测和定量之前扩增mRNA。这样的基于扩增的测定是本领域众所周知的，包括聚合酶链式反应(PCR)、逆转录-PCR(RT-PCR)、PCR-酶联免疫吸附测定(PCR-ELISA)，和连接酶链式反应(LCR)。本领域技术人员基于IL-17F的核酸序列，无需过度试验，可以容易地设计和制备出用于制备和检测扩增的IL-17F基因产物(例如，mRNA或cDNA)的引物和探针。可以直接分析扩增的IL-17F基因产物，例如，通过凝胶电泳；通过与探针核酸的杂交；通过测序；通过检测荧光信号、磷光信号或放射性信号；或通过许多众所周知的方法中的任一种。另外，本领域技术人员已知用于增加扩增靶核酸序列产生的信号的方法。本领域技术人员可以认识到，无论使用哪种扩增方法，如果需要定量基因产物，可以使用本领域已知的许多定量方法(例如，定量PCR)。

使用各种众所周知的免疫测定，采用如上制备的各个抗IL-17F抗体，可以检测IL-17F多肽(或其片段)。免疫测定是指利用特异性地结合例如IL-17F多肽(或其片段)的抗体(例如，多克隆的，单克隆的，嵌合的，人源化的，scFv，和/或其片段)的测定。适用于实施本发明的这种众所周知的免疫测定包括ELISA，放射免疫测定(RIA)，免疫沉淀，免疫荧光，荧光激活的细胞挑选(FACS)，和蛋白印迹。普通技术人员还会认识到，可以使用标记的IL-17R多肽，检测IL-17F多肽。

本领域技术人员可以理解，前述方法可以应用于IL-17F相关的病症，包括、但不限于，气道炎症(例如，囊性纤维化患者的气道炎症，包括囊性纤维化患者中细菌感染引起的肺症状加重，等)。

IL-17F拮抗剂在治疗中的应用

发明人认为他们首先认识到，IL-17F对IL-17R的结合是与气道炎症(例如，囊性纤维化患者的气道炎症，包括囊性纤维化患者中细菌感染引起的肺症状加重)有关。这样，本发明公开了使用IL-17F拮抗剂治疗气道炎症(例如，囊性纤维化患者的气道炎症，包括囊性纤维化患者中细菌感染引起的肺症状加重)的方法。

可以体外、离体地使用本文公开的IL-17F拮抗剂，包括使用上述方法鉴别出的IL-17F或IL-17R多核苷酸和/或多肽活性的调控剂，或掺入药物组合物中并体内施用给个体，以治疗例如气道炎症(例如，囊性纤维化患者的气道炎症，包括囊性纤维化患者中细菌感染引起的肺症状加重)，其中施用IL-17F拮抗剂(例如，IL-17F和/或IL-17R抑制性多核苷酸；可溶的IL-17R多肽(包括其片段和/或融合蛋白)；抑制性抗IL-17F或抗IL-17R抗体；和/或拮抗性小分子，等)。在确定是否施用IL-17F拮抗剂时要考虑的几种药物基因组学方案是本领域技术人员众所周知的，包括基因组范围的关联，候选基因方案，和基因表达图谱绘制。将本发明的药物组合物配制成与它们的预期给药途径相容(例如，口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体)。给药途径的其它非限制性实例包括肠胃外的(例如，静脉内的)、皮内的、皮下的、口服的(例如，吸入)、经皮的(局部的)、经粘膜的和直肠的给药。与每种预期途径相容的药物组合物是本领域众所周知的。

当与药学上可接受的载体相组合时，IL-17F拮抗剂可以用作药物组合物。除了IL-17F拮抗剂和载体之外，这样的组合物可以含有各种稀释剂、填充剂、盐、缓冲液、稳定剂、增溶剂和本领域众所周知的其它材料。术语“药学上可接受的”指不会妨碍活性成分的生物活性的有效性的无毒材料。载体的特征取决于给药途径。

本发明的药物组合物还可以含有细胞因子、淋巴因子或其它造血因子，例如M-CSF，GM-CSF，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-14，IL-15，G-CSF，干细胞因子，和促红细胞生成素。药物组合物还可以包括下面更详细地描述的抗细胞因子抗体。药物组合物可以含有溶血栓的或抗血栓形成的因子，例如纤溶酶原激活剂和因子VIII。药物组合物还可以含有下面更详细地描述的其它抗炎剂。这样的其它的因子和/或试剂可以包含在药物组合物中，以与IL-17F拮抗剂产生协同作用，或使IL-17F拮抗剂造成的副作用最小化。反之，IL-17F拮抗剂可以包含在特定细胞因子、淋巴因子、其它造血因子、溶血栓的或抗血栓形成的因子、或抗炎试剂的制剂中，以使细胞因子、淋巴因子、其它造血因子、溶血栓的或抗血栓形成的因子、或抗炎试剂的副作用最小化。

本发明的药物组合物可以是脂质体形式，其中IL-17F拮抗剂与其它药学上可接受的载体以及两亲试剂相组合，所述两亲试剂例如脂类，它们以作为胶束的聚集形式、不溶单层、液晶或在含水溶液中的片层存在。适用于脂质体制剂的脂类包括但不限于，甘油一酯，甘油二酯，硫脂，溶血卵磷脂，磷脂，皂苷，胆酸，等。这样的脂质体制剂的制备，属于本领域常识，公开在例如，美国专利号4,235,871；美国专利号4,501,728；美国专利号4,837,028；和美国专利号4,737,323，它们都在本文引作参考。

本文使用的术语“治疗有效量”指药物组合物或方法中每种活性组分的总量，其足以表现出有意义的患者益处，例如，这样的状况的症状的缓解、治愈或治愈速率的提高。当应用于单独施用的单一活性成分时，该术语指单独的成分。当应用于组合时，该术语指产生治疗作用的活性成分的组合量，无论组合地、先后地还是同时地施用。

在实施本发明的治疗方法或用途时，将治疗有效量的IL-17F拮抗剂施用给受试者，例如，哺乳动物(优选人)。可以根据本发明的方法单独地或与其它治疗组合地施用IL-17F拮抗剂，所述其它治疗例如采用细胞因子、淋巴因子或其它造血因子、或抗炎剂的治疗。当与一种或多种试剂共同施用时，可以与第二种试剂同时或先后施用IL-17F拮抗剂。如果先后施用，主治医师会决定施用例如IL-17R多肽(或其融合蛋白)和/或抑制性抗体与其它试剂的组合的适当次序。

当口服施用治疗有效量的IL-17F拮抗剂时，粘合剂是片剂、胶囊、粉剂、溶液或酏剂的形式。当以片剂形式施用时，本发明的药物组合物可以另外含有固体载体，例如明胶或佐剂。片剂、胶囊和粉剂含有约5-95％的粘合剂，优选约25-90％粘合剂。当以液体形式施用时，可以加入液体载体，例如水，石油，动物或植物来源的油，例如花生油(但需要注意人群中的花生变态反应的频率)，矿物油，大豆油，或芝麻油，或合成油。液体形式的药物组合物还可以含有生理盐水溶液，葡萄糖或其它糖溶液，或甘油，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。当以液体形式施用时，药物组合物含有约0.5-90重量％的粘合剂，和优选约1-50重量％的粘合剂。

当通过静脉内、表皮或皮下注射施用治疗有效量的IL-17F拮抗剂时，IL-17F拮抗剂是无热原的肠胃外可接受的含水溶液形式。这样的肠胃外可接受的具有适当pH、等渗性、稳定性等的蛋白溶液的制备，属于本领域普通常识。用于静脉内、表皮或皮下注射的优选药物组合物应当含有IL-17F拮抗剂以及等渗介质，例如氯化钠注射液、林格注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、乳酸化林格注射液或本领域已知的其它介质。本发明的药物组合物还可以含有稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂或本领域技术人员已知的其它添加剂。

IL-17F拮抗剂在本发明药物组合物中的量，取决于待治疗的状况的性质和严重性，和患者已经接受的先前治疗的性质。最后，主治医师会决定治疗每位单个患者的IL-17F拮抗剂的量。开始时，主治医师将施用低剂量的IL-17F拮抗剂，并观察患者的反应。可以施用更大剂量的IL-17F拮抗剂，直到获得患者的最佳治疗效果，此时剂量通常不再进一步增加。预见到用于实践本发明方法的不同药物组合物含有每kg体重约0.1□g-约100mg的IL-17F拮抗剂，例如，重组IL-17R(包括其融合蛋白)。

使用本发明药物组合物静脉内(i.v.)治疗的持续时间可以随待治疗的疾病的严重性、每位单个患者的状况和潜在特应性反应而变化。预见到，连续静脉内施用IL-17F拮抗剂的每次应用的持续时间可以是在12-24小时的范围内。还预见到使用本发明药物组合物的皮下(s.c.)治疗。这些治疗可以每天、每周或更优选每2周或每月施用。还预见到，当IL-17F拮抗剂是小分子(例如，口服递送)时，治疗可以每天1次、每天2次、每天3次等施用。最后，主治医师会决定使用本发明的药物组合物静脉内或皮下治疗，或使用小分子治疗的适当持续时间，和施用治疗的时机。

预期本发明的多核苷酸和蛋白会表现出下面鉴别出的一种或多种用途或生物活性(包括与本文引用的测定有关的那些)。通过施用或使用这样的蛋白，或通过施用或使用编码这样的蛋白的多核苷酸(例如，在基因治疗中，或适用于导入DNA的载体)，可以提供本发明蛋白的所述用途或活性。

IL-17F拮抗剂的减少气道炎症的用途

在一个方面，本发明描述了减少气道炎症(例如，囊性纤维化患者的气道炎症，包括囊性纤维化患者中细菌感染引起的肺症状加重)的方法。该方法可以包含，使细胞群体接触IL-17F拮抗剂(例如，IL-17F和/或IL-17R抑制性多核苷酸；可溶的IL-17R多肽(包括其片段和/或融合蛋白)；抑制性抗IL-17F或抗IL-17R抗体；和/或拮抗性小分子，等)，其量足以抑制细胞或群体的IL-17F活性。

这些方法至少部分地基于下述发现，即IL-17F结合IL-17R(实施例4)，且囊性纤维化患者的痰中的IL-17F浓度与肺症状加重程度直接相关(实施例7)。因此，IL-17F拮抗剂，即抑制IL-17F活性的分子(例如，抗IL-17F抗体)，可以用于减少气道炎症(例如，囊性纤维化患者的气道炎症，包括囊性纤维化患者中细菌感染引起的肺症状加重)。

使用IL-17F拮抗剂的方法还可以用于抑制IL-17F炎性活性，因而可以用于治疗或预防许多免疫病症。可以治疗或预防的病症的非限制性实例包括但不限于，移植排斥，自身免疫病(包括，例如，糖尿病，关节炎(包括类风湿关节炎，青少年类风湿关节炎，骨关节炎，银屑病关节炎)，多发性硬化，脑脊髓炎，重症肌无力，系统性红斑狼疮，自身免疫性甲状腺炎，皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎)，银屑病，干燥综合征，克隆氏病，口疮性溃疡，虹膜炎，结膜炎，角结膜炎，溃疡性结肠炎，脊柱关节病，强直性脊柱炎，内源性哮喘，变应性哮喘，皮肤红斑狼疮，硬皮病，阴道炎，直肠炎，药疹，麻风病逆转反应，麻风结节性红斑，自身免疫性葡萄膜炎，变应性脑脊髓炎，急性坏死性出血性脑病，特发性双侧进展性感觉神经性耳聋，再生障碍性贫血，单纯红细胞性贫血，特发性血小板减少症，多软骨炎，韦格纳肉芽肿病，慢性活动性肝炎，史蒂文斯-约翰逊综合征，特发性口炎性腹泻，扁平苔藓，格雷夫斯病，结节病，原发性胆汁性肝硬变，后葡萄膜炎，和间质性肺纤维化)、移植物抗宿主病，以及变态反应，例如特应性变态反应。使用包含施用IL-17F拮抗剂(例如，抑制性IL-17F抗体)的方法可以治疗的优选病症包括气道炎症(例如，囊性纤维化患者的气道炎症，包括囊性纤维化患者中细菌感染引起的肺症状加重)。

使用IL-17F拮抗剂(例如，IL-17F和/或IL-17R抑制性多核苷酸；可溶的IL-17R多肽(包括其片段和/或融合蛋白)；抑制性抗IL-17F或抗IL-17R抗体；和/或拮抗性小分子，等)，可以以许多方式调控免疫应答。下调可以是抑制或阻断进展中的炎症反应的形式，或可以包含预防炎症反应的诱发。

在一个实施方案中，在组合疗法中施用IL-17F拮抗剂，包括其药物组合物，即与可以用于治疗病理性状况或病症(例如免疫病症和炎性疾病(包括气道炎症))的其它试剂，例如治疗剂相组合。本上下文中的术语“相组合”指，所述试剂基本上同时、同时或先后施用。如果先后施用，在开始施用第二种化合物时，两种化合物中的第一种优选地在治疗部位仍然可以以有效浓度检测到。

例如，组合治疗可以包括一种或多种IL-17F拮抗剂(例如，IL-17F和/或IL-17R抑制性多核苷酸；可溶的IL-17R多肽(包括其片段和/或融合蛋白)；抑制性抗IL-17F或抗IL-17R抗体；和/或拮抗性小分子，等)，它们与一种或多种其它治疗剂共同配制和/或共同施用，所述其它治疗剂例如，一种或多种细胞因子和生长因子抑制剂，免疫抑制剂，抗炎剂，代谢抑制剂，酶抑制剂，和/或细胞毒性剂或细胞抑制剂，如下面详述。此外，一种或多种本文所述的IL-17F拮抗剂可以与2种或多种本文所述的治疗剂组合使用。这样的组合治疗可以有利地使用更低剂量的给药治疗剂，从而避免与各种单一疗法有关的可能的毒性或并发症。此外，本文公开的治疗剂可以作用于与IL-17F信号传递途径不同的途径，因而预期会增强和/或协同IL-17F拮抗剂的作用。

与IL-17F拮抗剂组合使用的优选治疗剂是干扰炎症反应(包括气道炎症)的不同阶段的那些试剂。在一个实施方案中，可以将一种或多种本文公开的IL-17F拮抗剂与一种或多种其它试剂共同配制和/或共同施用，所述其它试剂例如其它细胞因子或生长因子拮抗剂(例如，可溶的受体，肽抑制剂，小分子，配体融合体)；或结合其它靶的抗体或其抗原结合片段(例如，结合其它细胞因子或生长因子的抗体，它们的受体，或其它细胞表面分子)；和抗炎细胞因子或其激动剂。因而，本文所述的一种或多种IL-17F拮抗剂可以与一种或多种下述物质组合使用：细胞因子抑制剂，生长因子抑制剂，免疫抑制剂，抗炎剂，代谢抑制剂，酶抑制剂，细胞毒性剂，和细胞抑制剂。可以与本文所述IL-17F拮抗剂组合使用的试剂的非限制性实例包括但不限于，一种或多种白介素(IL)或它们的受体的拮抗剂，例如，IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-21和IL-22的拮抗剂；细胞因子或生长因子或它们的受体的拮抗剂，例如肿瘤坏死因子(TNF)、LT、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF。IL-17F拮抗剂还可以与抑制剂相组合，例如，细胞表面分子的抗体，所述细胞表面分子例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD20(例如，CD20抑制剂利妥希玛(RITUXAN^))，CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD90、或它们的配体，包括CD154(gp39或CD40L)，或LFA-1/ICAM-1和VLA-4/VCAM-1(Yusuf-Makagiansar等(2002)Med. Res.Rev 22：146-67)。可以与本文所述IL-17F拮抗剂组合使用的优选拮抗剂包括IL-1、IL-12、TNFα、IL-15、IL-18、和IL-22的拮抗剂。

那些试剂的实例包括：IL-12拮抗剂，例如嵌合的、人源化的、人的或体外产生的抗体(或其抗原结合片段)，它们结合IL-12(优选人IL-12)，例如，在WO 00/56772中公开的抗体；IL-12受体抑制剂，例如，人IL-12受体的抗体；和IL-12受体(例如，人IL-12受体)的可溶片段。IL-15拮抗剂的实例包括抗IL-15或其受体的抗体(或其抗原结合片段)，例如，人IL-15或其受体的嵌合的、人源化的、人的或体外产生的抗体，IL-15受体的可溶片段，和IL-15-结合蛋白。IL-18拮抗剂的实例包括人IL-18的抗体，例如，嵌合的、人源化的、人的或体外产生的抗体(或其抗原结合片段)，IL-18受体的可溶片段，和IL-18结合蛋白(IL-18BP，Mallat等(2001)Circ.Res.89：e41-45)。IL-1拮抗剂的实例包括白介素-1转化酶(ICE)抑制剂，例如Vx740，IL-1拮抗剂，例如，IL-1RA(阿那白滞素，KINERET^TM，Amgen)、sIL1RII(Immunex)、和抗IL-1受体抗体(或其抗原结合片段)。

TNF拮抗剂的实例包括TNF(例如，人TNFα)的嵌合的、人源化的、人的或体外产生的抗体(或其抗原结合片段)，例如HUMIRA^TM(D2E7，人TNFα抗体，美国专利号6,258,562)、CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356(人源化的抗TNFα抗体；Celltech/Pharmacia)、cA2(嵌合的抗TNFα抗体；REMICADE^，Centocor)；抗TNF抗体片段(例如，CPD870)；TNF受体的可溶片段，例如，p55或p75人TNF受体或其衍生物，例如，75kdTNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，ENBREL^TM；Immunex)、p55kdTNFR-IgG(55kD TNF受体-IgG融合蛋白(LENERCEPT^)；酶拮抗剂，例如，TNFα转化酶(TACE)抑制剂(例如，α-磺酰基异羟肟酸衍生物，WO 01/55112，和N-羟基甲酰胺TACE抑制剂GW 3333，-005，或-022)；和TNF-bp/s-TNFR(可溶的TNF结合蛋白)。优选的TNF拮抗剂是TNF受体的可溶片段，例如，p55或p75人TNF受体或其衍生物，例如，75kdTNFR-IgG和TNFα转化酶(TACE)抑制剂。

在其它实施方案中，本文所述IL-17F拮抗剂可以与下述物质中的一种或多种组合施用：IL-13拮抗剂，例如，可溶的IL-13受体(sIL-13)和/或抗IL-13的抗体；IL-2拮抗剂，例如，DAB 486-IL-2和/或DAB 389-IL-2(IL-2融合蛋白，Seragen)，和/或IL-2R的抗体，例如，抗-Tac(人源化的抗IL-2R，Protein Design Labs)。另一种组合包括IL-17F拮抗剂(例如，IL-17F和/或IL-17R抑制性多核苷酸；可溶的IL-17R多肽(包括其片段和/或融合蛋白)；抑制性抗IL-17F或抗IL-17R抗体；和/或拮抗性小分子，等)，其与下述试剂的组合：非消除性的抗-CD4抑制剂(IDEC-CE9.1/SB210396；非消除性的灵长类动物化的抗-CD4抗体；IDEC/SmithKline)。其它优选的组合包括共刺激途径CD80(B7.1)或CD86(B7.2)的拮抗剂，包括抗体，可溶的受体或拮抗性配体；以及p-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL)，抗炎细胞因子，例如，IL-4(DNAX/Schering)；IL-10(SCH 52000；重组IL-10DNAX/Schering)；IL-13和TGF-β，及其激动剂(例如，激动剂抗体)。

在其它实施方案中，一种或多种IL-17F拮抗剂可以与一种或多种抗炎药物、免疫抑制剂、或代谢或酶抑制剂共同配制和/或共同施用。可以与本文所述IL-17F拮抗剂组合使用的药物或抑制剂的非限制性实例包括但不限于下述物质中的一种或多种：非甾体类抗炎药(NSAIDs)、例如，布洛芬，替尼达普，萘普生，美洛昔康，吡罗昔康，双氯芬酸，和茚甲新；柳氮磺胺吡啶；皮质类固醇，例如泼尼松龙；细胞因子抑制性抗炎药(CSAIDs)；核苷酸生物合成抑制剂，例如，嘌呤生物合成抑制剂，叶酸拮抗剂(例如，甲氨蝶呤(N-[4-[[(2，4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]甲基氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸)；和嘧啶生物合成抑制剂，例如，二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)抑制剂(例如，来氟米特)。与IL-17F拮抗剂组合施用的优选治疗剂包括NSAIDs，CSAIDs，(DHODH)抑制剂(例如，来氟米特)，和叶酸拮抗剂(例如，甲氨蝶呤)。

其它抑制剂的实例包括下述物质中的一种或多种：皮质类固醇(口服的、吸入的和局部注射剂)；免疫抑制剂，例如，环孢菌素，他克莫司(FK-506)；和mTOR抑制剂，例如，西罗莫司(雷帕霉素-RAPAMUNE^TM或雷帕霉素衍生物，例如，可溶的雷帕霉素衍生物(例如，酯雷帕霉素衍生物，例如，CCI-779)(Elit(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3(8)：1249-53；Huang等(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3(2)：295-304)；干扰促炎细胞因子的信号传递的试剂，例如TNFα或IL-1(例如IRAK，NIK，IKK，p38或MAP激酶抑制剂)；COX2抑制剂，例如，塞来考昔，罗非克西，及其变体；磷酸二酯酶抑制剂，例如，R973401(IV型磷酸二酯酶抑制剂)；磷脂酶抑制剂，例如，胞质溶胶磷脂酶2(cPLA2)的抑制剂(例如，三氟甲酮类似物(美国专利号6,350,892))；血管内皮细胞生长因子或生长因子受体抑制剂，例如，VEGF抑制剂和/或VEGF-R抑制剂；和血管发生抑制剂。与IL-17F拮抗剂组合使用的优选治疗剂是：免疫抑制剂，例如，环孢菌素，他克莫司(FK-506)；mTOR抑制剂，例如，西罗莫司(雷帕霉素)或雷帕霉素衍生物，例如，可溶的雷帕霉素衍生物(例如，酯雷帕霉素衍生物，例如，CCI-779)；COX2抑制剂，例如，塞来考昔和其变体；和磷脂酶抑制剂，例如，胞质溶胶磷脂酶2(cPLA2)的抑制剂，例如，三氟甲酮类似物。

可以与IL-17F拮抗剂相组合的治疗剂的其它实例包括下述物质的一种或多种：6-巯基嘌呤(6-MP)；硫唑嘌呤；柳氮磺胺吡啶；美沙拉秦；奥沙拉秦；氯喹/羟氯喹(PLAQUENIL^)；青霉胺；aurothiornalate(肌肉内和口服)；硫唑嘌呤；秋水仙素；β-2肾上腺素受体激动剂(柳丁氨醇，特布他林，沙美特罗)；黄嘌呤(茶碱，氨茶碱)；色甘酸酯；奈多罗米；酮替芬；异丙托铵和oxitropium；麦考酚酸莫酯；腺苷激动剂；抗血栓形成剂；补体抑制剂；和肾上腺素能药。

在下面进一步详细讨论了本文公开的IL-17F拮抗剂与其它治疗剂的组合用于治疗或预防IL-17F相关的特定病症的用途。

可以与IL-17F拮抗剂相组合的用于治疗或预防关节炎病症(例如，类风湿关节炎，炎性关节炎，类风湿关节炎，青少年类风湿性关节炎，骨关节炎和银屑病关节炎)的试剂的非限制性实例包括下述物质中的一种或多种：本文所述的IL-12拮抗剂；NSAIDs；CSAIDs；TNF，例如，TNFα，本文所述的拮抗剂；本文所述的非消除性的抗-CD4抗体；本文所述的IL-2拮抗剂；抗炎细胞因子，例如，IL-4，IL-10，IL-13和TGFα，或其激动剂；本文所述的IL-1或IL-1受体拮抗剂；本文所述的磷酸二酯酶抑制剂；本文所述的Cox-2抑制剂；伊洛前列素：甲氨蝶呤；沙利度胺和沙利度胺相关药物(例如，Celgen)；来氟米特；纤溶酶原激活抑制剂，例如，氨甲环酸；细胞因子抑制剂，例如，T-614；前列腺素E1；硫唑嘌呤；白介素-1转化酶(ICE)的抑制剂；zap-70和/或lck抑制剂(酪氨酸激酶zap-70或lck的抑制剂)；本文所述的血管内皮细胞生长因子或血管内皮细胞生长因子受体的抑制剂；本文所述的血管发生抑制剂；皮质类甾醇抗炎药(例如，SB203580)；TNF-转化酶抑制剂；IL-11；IL-13；IL-17抑制剂；金；青霉胺；氯喹；羟氯喹；苯丁酸氮芥；环磷酰胺；环孢菌素；全淋巴辐照；抗胸腺细胞球蛋白；CD5-毒素；口服肽和胶原；氯苯扎利二钠；细胞因子调节剂(CRA)HP228和HP466(Houghten Pharmaceuticals，Inc.)；ICAM-1反义硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸(ISIS 2302；IsisPharmaceuticals，Inc.)；可溶的补体受体1(TP10；T Cell Sciences，Inc.)；泼尼松；奥古蛋白；糖胺聚糖多硫酸盐；米诺环素(MINOCIN^)；抗IL2R抗体；海洋生物和植物脂类(鱼和植物种子脂肪酸)；金诺芬；保泰松；甲氯芬那酸；氟芬那酸；静脉内免疫球蛋白；弃白通；麦考酚酸(RS-61443)；他克莫司(FK-506)；西罗莫司(雷帕霉素)；阿普劳特(therafectin)；克拉屈滨(2-氯脱氧腺苷)；和阿扎立平。优选的组合包括一种或多种IL-17F拮抗剂(例如，IL-17F和/或IL-17R抑制性多核苷酸；可溶的IL-17R多肽(包括其片段和/或融合蛋白)；抑制性抗IL-17F或抗IL-17R抗体；和/或拮抗性小分子，等)与甲氨蝶呤或来氟米特的组合，且在中等或严重类风湿性关节炎情况下，与环孢菌素相组合。

可与IL-17F拮抗剂组合治疗关节炎病症的抑制剂的优选实例包括TNF拮抗剂(例如，嵌合的、人源化的、人的或体外产生的抗体，或其抗原结合片段，它们结合TNF；TNF受体的可溶片段，例如，p55或p75人TNF受体或其衍生物，例如，75kdTNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，ENBREL^TM)，p55kD TNF受体-IgG融合蛋白；TNF酶拮抗剂，例如，TNFα转化酶(TACE)抑制剂)；IL-12，IL-15，IL-18，IL-22的拮抗剂；T细胞和B细胞消除剂(例如，抗-CD4或抗-CD22抗体)；小分子抑制剂，例如，甲氨蝶呤和来氟米特；西罗莫司(雷帕霉素)和其类似物，例如，CCI-779；cox-2和cPLA2抑制剂；NSAIDs；p38抑制剂，TPL-2，Mk-2和NFκB抑制剂；RAGE或可溶的RAGE；P-选择蛋白或PSGL-1抑制剂(例如，小分子抑制剂，其抗体，例如，P-选择蛋白的抗体)；雌激素受体β(ERB)激动剂或ERB-NFkB拮抗剂。可以与一种或多种IL-17F拮抗剂(例如，IL-17F和/或IL-17R抑制性多核苷酸；可溶的IL-17R多肽(包括其片段和/或融合蛋白))；抑制性抗IL-17F或抗IL-17R抗体；和/或拮抗性小分子，等)共同施用和/或共同配制的最优选其它治疗剂包括下述物质中的一种或多种：TNF受体的可溶片段，例如，p55或p75人TNF受体或其衍生物，例如，75kdTNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，ENBREL^TM)；甲氨蝶呤，来氟米特，或西罗莫司(雷帕霉素)或其类似物，例如，CCI-779。

可以与IL-17F拮抗剂相组合的用于治疗或预防多发性硬化的试剂的非限制性实例包括以下物质：干扰素，例如，干扰素-α1a(例如，AVONEX^TM；Biogen)和干扰素-1b(BETASERON^TM Chiron/Berlex)；共聚物1(Cop-1；COPAXONE^TM Teva Pharmaceutical Industries，Inc.)；高压氧；静脉内免疫球蛋白；克拉屈滨；本文所述的TNF拮抗剂；皮质类固醇；泼尼松龙；甲基泼尼松龙；硫唑嘌呤；环磷酰胺；环孢菌素；环孢菌素A，甲氨蝶呤；4-氨基吡啶；和替扎尼定。可以与IL-17F拮抗剂相组合的其它拮抗剂包括：其它人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂，所述人细胞因子或生长因子例如，TNF，LT，IL-1，IL-2，IL-6，IL-7，IL-8，IL-12IL-15，IL-16，IL-18，EMAP-11，GM-CSF，FGF，和PDGF。本文所述的IL-17F拮抗剂可以与细胞表面分子的抗体相组合，所述细胞表面分子例如CD2，CD3，CD4，CD8，CD25，CD28，CD30，CD40，CD45，CD69，CD80，CD86，CD90或它们的配体。IL-17F拮抗剂还可以与下述试剂相组合：例如甲氨蝶呤，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，麦考酚酸莫酯，来氟米特，NSAIDs，例如，布洛芬，皮质类固醇，例如泼尼松龙，磷酸二酯酶抑制剂，腺苷激动剂，抗血栓形成剂，补体抑制剂，肾上腺素能试剂，干扰本文所述致炎细胞因子的信号传递的试剂，IL-Ib转化酶抑制剂(例如，Vx740)、抗-P7s，PSGL，TACE抑制剂，T-细胞信号传递抑制剂，例如激酶抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，柳氮磺吡啶，氮胸苷，6-巯基嘌呤，血管紧张素转化酶抑制剂，可溶的细胞因子受体和其衍生物，如本文所述，和抗炎细胞因子(例如IL-4，IL-10，IL-13和TGF)。

可以与IL-17F拮抗剂相组合的用于多发性硬化的治疗剂的优选实例包括：干扰素-β，例如，IFNβ-1a和IFNβ-1b；copaxone，皮质类固醇，IL-I抑制剂，TNF抑制剂，CD40配体和CD80二者的抗体，IL-12拮抗剂。

可以与IL-17F拮抗剂(例如，IL-17F和/或IL-17R抑制性多核苷酸；可溶的IL-17R多肽(包括其片段和/或融合蛋白)；抑制性抗IL-17F或抗IL-17R抗体；和/或拮抗性小分子，等)相组合的用于治疗或预防炎性肠病(例如，克隆氏病，溃疡性结肠炎)的非限制性实例包括：布地奈德；表皮生长因子；皮质类固醇；环孢菌素；柳氮磺吡啶；氨基水杨酸盐；6-巯基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝哒唑；脂肪氧化酶抑制剂；美沙拉秦；奥沙拉秦；巴柳氮；抗氧化剂；血栓素抑制剂；IL-1受体拮抗剂；抗IL-1单克隆抗体；抗IL-6单克隆抗体；生长因子；弹性酶抑制剂；吡啶基-咪唑化合物；本文所述的TNF拮抗剂；IL-4，IL-10，IL-13和/或TGFβ细胞因子或其激动剂(例如，激动剂抗体)；IL-11；葡萄糖醛酸苷-或葡聚糖-缀合的泼尼松龙、地塞米松或布地奈德的前药；ICAM-1反义硫代磷酸化寡脱氧核苷酸(ISIS 2302；Isis Pharmaceuticals，Inc.)；可溶的补体受体1(TP10；T Cell Sciences，Inc.)；缓释美沙拉嗪；甲氨蝶呤；血小板激活因子(PAF)的拮抗剂；环丙沙星；和利多卡因。

在一个实施方案中，IL-17F拮抗剂(例如，IL-17F和/或IL-17R抑制性多核苷酸；可溶的IL-17R多肽(包括其片段和/或融合蛋白))；抑制性抗IL-17F或抗IL-17R抗体；和/或拮抗性小分子，等)可以与一种或多种靶定其它靶的抗体组合使用，所述其它靶参与调节免疫应答，例如，移植排斥。可以与本发明的IL-17F拮抗剂相组合的用于治疗或预防免疫应答的试剂的非限制性实例包括：其它细胞表面分子的抗体，所述其它细胞表面分子包括但不限于CD25(白介素-2受体-a)、CD11a(LFA-1)、CD54(ICAM-1)、CD4、CD45、CD28/CTLA4(CD80(B7.1)，例如，CTLA4Ig-阿巴他塞(ORENCIA^))，ICOSL，ICOS和/或CD86(B7.2)。在另一个实施方案中，IL-17F拮抗剂与一种或多种普通免疫抑制剂(例如环孢菌素A或FK506)组合使用。

在其它实施方案中，IL-17F拮抗剂用作抗炎性疾病例如气道炎症(例如，囊性纤维化患者的气道炎症，包括囊性纤维化患者中细菌感染引起的肺症状加重)的疫苗佐剂。用于治疗这些类型的病症的佐剂的组合，适用于与许多抗原相组合。所述抗原可以包含源自蛋白的肽或多肽，以及下述任一种物质的片段：糖，蛋白，多核苷酸或寡核苷酸，自身抗原，淀粉样蛋白肽蛋白，移植物抗原，变应原，或其它大分子组分。在有些情况下，在抗原组合物中包含超过一种抗原。

例如，需要的含有本发明的佐剂组合、用于调控脊椎动物宿主中对变应原的反应的疫苗包括含有变应原或其片段的那些。这样的变应原的实例记载在美国专利号5,830,877和公开的国际专利申请号WO99/51259，它们在本文中整体引作参考，其包括花粉，昆虫毒液，动物皮屑，真菌孢子和药物(例如青霉素)。疫苗干扰IgE抗体的生产，这是变态反应的一个已知原因。在另一个实例中，需要的含有本发明的佐剂组合、用于预防或治疗脊椎动物宿主的特征在于淀粉样蛋白沉积的疾病的疫苗包括含有淀粉样蛋白肽蛋白(APP)的部分的那些。该疾病分别称作阿尔茨海默病，淀粉样变性病或产生淀粉样蛋白的疾病。因而，本发明的疫苗包括本发明的佐剂组合+Aβ肽，以及Aβ肽的片段、和Aβ肽或其片段的抗体。

本领域众所周知：1)下调抗原呈递细胞功能的方法；和2)控制免疫抑制的组合治疗的方法(参见，例如，Xiao等(2003)BioDrugs 17：103-11；Kuwana(2002)Hum.Immunol.63：1156-63；Lu等(2002)Transplantation 73：S19-S22；Rifle等(2002)Transplantation 73：S1-S2；Mancini等(2004)Crit.Care.Nurs.Q.27：61-64)。

因此，本发明的另一个方面涉及试剂盒，其用于施用IL-17F拮抗剂(例如，IL-17F或IL-17R抑制性多核苷酸；可溶的IL-17R多肽(包括其片段和/或融合蛋白；抑制性抗IL-17F或抗IL-17R抗体；和/或拮抗性小分子，等)。在一个实施方案中，所述试剂盒包含一种或多种配制在药用载体中的粘合剂和至少一种根据需要配制在一种或多种分开的药物制剂中试剂(例如，治疗剂)。

在本申请中引用的所有参考文献、专利、和公开的专利申请的完整内容，都在本文引作参考。

实施例

下面的实施例提供了本发明的解释性实施方案，但是不以任意方式限制本发明。本领域普通技术人员会认识到，在本发明的范围内包括许多其它的实施方案。

实施例1：材料和方法

实施例1.1：来自人气道组织的原代细胞培养物

如以前所述(Devor等(2000)Am.J.Physiol.-Cell Physiol.279：C461-79)，从移植物受体的天然肺或供体肺的未使用部分分离人支气管上皮(HBE)细胞。从周围外膜组织切离气道，置于冰冷的HEPES-缓冲的含有青霉素、链霉素和两性霉素B的基本必需培养基中。用冷却的Hanks平衡盐溶液(HBSS)洗涤多次后，纵向切开软骨气道区段，在4℃在0.1％蛋白酶XIV(Sigma，St.Louis，MO)中温育过夜。通过用钝头镊子轻刮上皮，得到气道上皮细胞。将回收的细胞置于IV型人胎盘胶原(Sigma)包被的组织培养平板中的支气管上皮生长培养基(BEGM；Clonetics Corp.，San Diego，CA)和角质形成细胞-无血清培养基(K-SFM；Invitrogen Corp.)的1∶1混合物中。在这些条件下5-7天后，用胰蛋白酶处理细胞，在HBSS中洗涤，接种到IV型人胎盘胶原包被的Corning/CoStar Transwell滤膜上，在BEGM/K-SFM中100％汇合。24小时后，通过从Transwell滤膜去除顶端培养基，使细胞处于气液界面，将基底外侧培养基替换为含有2％UltroSer G(BioSepra)的DMEM/F12(Invitrogen Corp.)，以促进分化。在两相培养条件下，观察到具有纤毛形成和粘液分泌颗粒的粘膜纤毛上皮。在开始细胞因子处理之前24小时，给培养物去除血清。

实施例1.2：细胞因子和抗体处理

将IL-17A和IL-17F(R&D Systems，Minneapolis，MN)溶于F12/DMEM，以0，1，10或100ng/ml的终浓度，直接加入原代HBE培养物的顶端和/或基底表面。以1ng/ml的终浓度，使用TNF-α(BiosourceInternational，Camarillo，CA)。为了测试单克隆抗-人IL-17受体抗体(R&DSystems)对IL-17F生物活性的抑制作用，将抗体以2μg/ml的终浓度加入培养物，该浓度比ED50高10倍，并测定人真皮成纤维细胞分泌的细胞因子、趋化因子和/或生长因子。以1μg/ml使用重组人IL-17R:Fc嵌合体(R&D Systems)。在TNF受体中和研究中，在10μg/ml的浓度使用抗-人TNF-RI(Biosource International)，和/或在0.5μg/ml的浓度使用重组的人TNF-RII:Fc嵌合体(R&D Systems)。

实施例1.3：RNA分离/DEFB4基因表达的RT-PCR分析

根据生产商的规程，使用TriZOL LS试剂(Invitrogen)，从温育24小时后的培养物提取RNA。进行Taqman PCR，以在ABI PRISM 7700序列检测系统(Applied Biosystems)上检查逆转录和扩增之后的人β防卫素-4(DEFB 104)基因表达。DEFB 104的基因-特异性引物购自AppliedBiosystems。在96孔光学反应平板中进行PCR反应，每个孔含有50μl反应混合物，后者含有25μl SYBR Green PCR主混合物、0.5μl每种引物(终浓度：900nM)、19μl水和5μl cDNA样品。阈循环(Ct)值反映了在反应中产生的荧光超过2个标准差的循环数。基于Ct与管家基因18s的Ct的比较，计算每个样品的相对mRNA量。将结果表示为比较表达水平(2-^ΔΔCT)。对于每个样品，进行一式三份的实时PCR，计算平均值。在至少3个独立试验中，进行该操作。

实施例1.4：Bio-Plex和ELISA测量

根据推荐的程序，进行Bio-Plex人细胞因子测定(BIO-RAD)，用于同时定量顶端和基底外侧培养基中的IL-1β，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-10，IL-12p70，IL-13，IL-17、G-C SF、GM-CSF，IFN-γ，MCP-1，MIP-1β和TNF-α。按照生产商的说明书，使用分开的ELISA试剂盒(R&D Systems)，测量G-CSF和GRO-α。使用Wyeth(Cambridge，MA)提供的抗体，测量人IL-17F。

实施例1.5：免疫组织化学

使用抗-人IL-17R抗体(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)表征来自人肺组织切片的呼吸道上皮细胞上的IL-17受体表达。使用Cy-3缀合的兔抗-山羊抗体作为第二抗体(Sigma)，使用fluoromount G作为封固介质，进行染色。使用兔血清阻断预染色。使用连接到Olympus Provis荧光显微镜上的照相机，捕获染色图像，用Olympus软件(Olympus，Melville，NY)进一步分析图像。

为了表征在气液界面上生长的极化HBE细胞上的TNF受体I(TNF-RI)和II(TNF-RII)表达，使用小鼠抗-人TNF-RI和TNF-RII单克隆抗体(R&D Systems)作为第一抗体，使用Alexa 488山羊抗体(MolecularProbes，Eugene，OR)作为第二抗体。使用具有DAPI(Molecular Probes)的Prolong Gold antifade作为封固剂。使用连接到Axioplan 2通用成像显微镜上的照相机，捕获图像，用Slidebook 4.0软件(来自Intelligent ImagingInnovations，Denver，CO)和Metamorph软件(Universal Imaging Corp.，Downingtown，PA)进一步分析。

实施例1.6：人受试者

在研究中登记需要住院治疗的正在经历肺症状加重的寄生了铜绿假单胞菌的囊性纤维化成年患者(平均年龄22岁)，以测量在住院治疗的第1天和开始抗生素和强化呼吸道治疗后10和20天，痰中的炎症生物标志物。使用Sputolysin(Behring Diagnostics，Somerville，NJ)处理痰样品。简而言之，每1mg痰加入1ml 10％Sputolysin，在剧烈摇动下，将样品在37℃温育5min，并用移液管剧烈混合。然后，在4℃、在2000rpm离心样品5min，并通过Bio-Plex和ELISA测定上清液。

实施例1.7：蛋白印迹分析

在SDS-PAGE上分离来自加工过的痰的蛋白印迹样品(12.4μg蛋白/泳道)。将在凝胶上分离的蛋白转移到140mA的Immobilon-P膜(Millipore，Bedford，MA)上1h。使用含有5％BSA的PBS，在4℃封闭膜过夜。用兔抗-人-p19抗体在室温将印迹染色1小时，通过用第二种碱性磷酸酶缀合的山羊抗-兔IgG(Bio-Rad)和BCIP/NBT试剂(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)温育而显色。

实施例1.8：统计分析

使用StatView统计软件(Brainpower Inc.，Calabasas，CA)分析数据。使用斯氏t-检验，对比数据正常分布的组，并通过方差分析，对比多个组或非参数数据。使用Scheffe检验作为post hoc检验。使用Mann-Whitney检验或Wilcoxon成对样品检验，进行次序对比。在p值＜0.05时认为具有显著性。

实施例2：IL-17F上调人支气管上皮细胞的G-CSF、GRO-α和MCP-1表达

使用实施例1.1所述的Bio-Plex和ELISA测定，筛选顶端和基底外侧培养基的细胞因子、趋化因子和/或生长因子，它们在生长在气液界面处的人原代支气管上皮细胞中受IL-17A和IL-17F的调节(参见实施例1)。除了IL-8和IL-6以外，已经报道IL-17A诱导2种因子(数据未显示)，在用IL-17A和IL-17F处理的原代HBE细胞中，在24h时检查到G-CSF、GRO-α和MCP-1分泌的显著诱导(表2)。因为不同气道供体分泌的生长因子的绝对量的变异性，将数据绘制成倍数诱导图。这些作用是剂量依赖性的(图1A；表2)，在100ng/ml的浓度观察到最高效应。在重量/重量基础上，在24h时IL-17A能比IL-17F更有效地诱导G-CSF、GRO-α和MCP-1。用10ng/ml的IL-17A和IL-17F进行的时间过程证实，IL-17A和IL-17F对G-CSF、GRO-α和MCP-1的作用是时间依赖性的(图1B)，在24h时观察到最高效应。基于这些动力学研究，使用10ng/ml的IL-17A或IL-17F和24h的温育时间，进行下述的大部分试验。

表2：用IL-17A和IL-17F进行HBE刺激24小时后，基底外侧培养基中G-CSF、GRO-α和MCP-1的浓度

IL-17A	G-CSF	GRO-α	MCP-1
IL-17A	G-CSF	GRO-α	MCP-1	0ng/ml	401.2±32.24	2012.1±102.34	22.01±1.98
1ng/ml	829.56±128.38	8412.1±503.02	82.8±6.6	0ng/ml	401.2±32.24	2012.1±102.34	22.01±1.98
1ng/ml	829.56±128.38	8412.1±503.02	82.8±6.6	10ng/ml	2029.3±192.57	11144.7±643.87	98.83±6.16
100ng/ml	3546.24±296.88	15140.7±1026.17	118.5±8.8	10ng/ml	2029.3±192.57	11144.7±643.87	98.83±6.16

IL-17F	G-CSF	GRO-α	MCP-1
IL-17F	G-CSF	GRO-α	MCP-1	0ng/ml	401.2±32.24	2012.1±102.34	22.01±1.98
1ng/ml	655.4±44.13	5798.1±382.30	46.75±2.64	0ng/ml	401.2±32.24	2012.1±102.34	22.01±1.98
1ng/ml	655.4±44.13	5798.1±382.30	46.75±2.64	10ng/ml	1482±112.33	9729.2±804.84	43.36±4.13
100ng/ml	2236±164.49	14175.4±865.20	68.5±6.61	10ng/ml	1482±112.33	9729.2±804.84	43.36±4.13

实施例3：IL-17F与TNF-α协同诱导G-CSF和GRO-α分泌

由于已经报道了IL-17A与TNF-α的协同作用，测定了IL-17F(10ng/ml)和TNF-α(1ng/ml)的组合上调原代HBE细胞分泌G-CSF和GRO-α的作用。在以前的试验中，已经确定了细胞因子的最佳浓度(数据未显示)。当IL-17F与TNF-α组合24h时，HBE细胞表现出G-CSF和GRO-α分泌的协同作用(图2A和2B)。通过用抗IL-17R mAb预温育刺激细胞因子混合物，会抑制该协同作用，但是可溶的IL-17R:Fc嵌合体蛋白或同种型匹配的对照Ab却不能(同种型数据未显示)。但是，抗IL-17R mAb和可溶IL-17R:Fc蛋白都能有效地抑制IL-17A-诱导的G-CSF的增加(图2C)。这些数据有力地表明，IL-17R对于IL-17A和IL-17F诱导的G-CSF应答是关键的。

实施例4：抗IL-17受体Ab降低由IL-17A和IL-17F诱导的GRO-α和G-CSF分泌

为了确定反应于IL-17A和IL-17F的GRO-α和G-CSF分泌的极化，用IL-17A和IL-17F刺激原代HBE细胞24h，测定顶端或基底外侧液体中的GRO-α和G-CSF。GRO-α和G-CSF二者都在顶端和基底外侧分泌，GRO-α表现出比G-CSF更大的基底外侧分泌的诱导(图3)。用抗IL-17R Ab预温育会显著消除顶端和基底外侧培养基中由IL-17A和IL-17F介导的GRO-α和G-CSF分泌的诱导(图3)。这些结果支持了下述观点，即IL-17R是HBE细胞上的IL-17A或IL-17F活性所必需的，以诱导G-CSF和GRO-α生产。

实施例5：IL-17A和IL-17F上调DEFB104表达

将IL-17A和IL-17F(都是10ng/ml)加入HBE培养基，24小时后提取RNA，通过实时RT-PCR，分析人β防卫素-4mRNA表达(DEFB104基因)，并标准化成18s核糖体RNA。IL-17A和IL-17F二者都以剂量依赖性的方式上调DEFB 104(图4A)，但是在10ng/ml、24小时，IL-17A具有比IL-17F更大的倍数诱导(ΔΔCT：分别是-3.34+0.44SEM和-2.23+0.31)。用2μg/ml抗IL-17R抗体预温育会部分地抑制100ng/mlIL-17A和100ng/mlIL-17F的作用，分别降低62.5％和77.6％，表明IL-17受体信号传递也是两种细胞因子上调DEFB104所必需的(图4B)。最后，评估了将IL-17A(1ng/ml)和IL-17F(10ng/ml)与TNF-α(1ng/ml)相组合对DEFB104诱导的作用。使用IL-17A和TNF-α的组合、或IL-17F和TNF-α的组合时，发现了累加效应(图4C)。IL-17A和IL-17F的组合还对DEFB104诱导产生了累加效应(图4C)。

实施例6：IL-17受体在呼吸道上皮细胞的基底外侧表面上功能性地表达

在冷冻的人肺标本切片上进行IL-17受体的免疫组织化学染色。与没有表现出非特异性染色的对照切片不同，发现IL-17R在呼吸道上皮细胞以及肺实质细胞中表达，且主要定位在呼吸道上皮细胞的基底外侧表面(数据未显示)。为了确认该免疫组织化学发现，设计了一个试验，其中用在基底外侧或顶端培养基中的IL-17A或IL-17F温育HBE细胞24h。测定条件基底外侧培养基的G-CSF和GRO-α，发现当在基底外侧培养基应用IL-17A和IL-17F时，会上调两种生长因子。但是，当在顶端应用IL-17A或IL-17F时，没有观察到GRO-α或G-CSF的诱导(图5)。总之，这些数据有力地表明，通过经由HBE细胞基底外侧上的IL-17R的信号传递，发生IL-17F生物活性。

实施例7：TNF受体I和II在呼吸道上皮细胞的基底外侧表面上结构性地和功能性地表达

使用抗-人TNF-RI和抗-人TNF-RII单克隆抗体，对在Transwell膜上生长的极化的原代HBE细胞的TNF受体I(TNF-RI)和II(TNF-RII)进行免疫组织化学染色。发现两种受体都在HBE细胞中表达(数据未显示)。作为阴性对照，仅用第二抗体对滤膜染色，它没有表现出非特异性染色(数据未显示)。此外，ZX-轴重建表明，TNF-RI和TNF-RII位于紧密接合处下面的HBE细胞的外测膜(数据未显示)。

为了确认该免疫组织化学发现，设计了一个试验，其中用在基底外侧或顶端培养基中的IL-17F和/或TNF-α温育HBE细胞24h。测定条件基底外侧培养基。当在基底外侧培养基应用IL-17F和/或TNF-α时，会上调G-CSF，但是当在顶端应用IL-17F和/或TNF-α时，没有观察到G-CSF的诱导(图6A)。总之，这些数据提示，在HBE细胞的基底外侧，发生导致IL-17F和TNF-α之间的协同作用的信号传递。

为了研究TNF受体I和II对IL-17F和TNF-α之间的协同作用所需的信号传递的重要性，用抗-人TNF-RI和重组人TNF-RII:Fc嵌合体中的任一种或两种预温育HBE细胞。抗-人TNF-RI和重组TNF-RII:Fc嵌合体都会阻断组合IL-17F和TNF-α之后对G-CSF分泌的协同作用(图6B)。意外地，在有抗-人TNF-RI或TNF-RII:Fc嵌合体存在下反应于IL-17F和TNF-α的组合由HBE细胞分泌的G-CSF的水平低于反应于IL-17F刺激由HBE细胞分泌的G-CSF的水平(图6B)，这提示甚至当单独将IL-17F应用于HBE培养基时，它也具有协同作用，这通过与这些细胞大量分泌的TNF-α相互作用来实现。只有用TNFRII:Fc嵌合体温育，会将HBE细胞的G-CSF分泌减少至大约等同于HBE细胞反应于IL-17A刺激而分泌的G-CSF的水平的水平(图6C)。

实施例8：在经受肺症状加重的囊性纤维化患者中提高IL-17A和IL-17F水平

囊性纤维化(CF)是一种肺疾病，其特征在于持续的支气管内感染和中性粒细胞性肺炎(Karp等(2004)Nat.Immunol.5：388-92)以及高痰CXCL8水平(Smountas等(2004)Clin.Biochem 37：1031-36；Sagel等(2001)Am.J.Respir.Crit.Care Med.164：1425-31)。由于Ye及其同事((2001)J.Exp.Med.194：519-527)以前证实，IL-17R信号传递对于反应于革兰氏阴性感染鼠肺中的CXCL2表达是关键的，推测IL-17A和IL-17F会在经受肺症状加重的CF患者的痰中上调。作为该推测的基础，初步研究证实了接受支气管窥镜检查的肺症状加重的CF患者中的IL-17A水平高于由于哮喘或胃食管返流疾病造成的慢性咳嗽对照(数据未显示)。由于这些样品可能发生选择偏倚(这归因于临床上进行支气管窥镜检查的决定)，选择检查来自8位经受肺症状加重(需要住院治疗和静脉内抗生素)的成年CF患者(平均年龄：22)的痰样品中的IL-17A，IL-17F和邻近的介质IL-23(p19)。在住院治疗的第1天，当与从4位没有诊断出CF的受试者收集的痰样品相比较时，可以容易地检测出IL-17A和IL-17F水平的升高(对于IL-17A，分别是59.58pg/ml±5.22(S.E.M.)和4.17±2.13；对于IL-17F，分别是84.67±10.87和20.1±3.25)。在抗生素治疗过程中，收集痰并连续分析。在第20天之前，IL-17A和IL-17F浓度急剧降低(图7A)，达到类似于没有诊断出CF的受试者的水平。使用Luminex细胞因子珠，测量这些患者痰中的18种其它细胞因子组，发现在住院治疗的第1天，IL-8、IL-6、G-CSF、GRO-α、MCP-1、MIP-1β、TNF-α、GM-CSF和IL-1β也增加，且在第20天之前显著降低(参见，例如，图7B)，这证实了类似于对IL-17A和IL-17F观察到的总图谱。无论是否将细胞因子/趋化因子浓度针对总蛋白含量进行校正，都观察到类似的表达图谱。最后，由于IL-23(巨噬细胞和树突细胞大量产生的一种产物)是IL-17A和IL-17F的邻近调节剂，进行痰样品[在即将开始抗生素治疗之前(住院治疗的第1天)和抗生素治疗20天后，从3位经受肺症状加重的囊性纤维化患者得到]的蛋白印迹分析，以检测IL-23p19蛋白的存在。在所有3位经受肺症状加重的CF患者中都检测到IL-23；在2/3患者中，在住院治疗第1天的IL-23水平更高，在第20天之前下降(数据未显示)。

实施例9：讨论

IL-17A和IL-17F是反应于感染性(Ye等(2001)Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.25：335-40)和抗原性刺激(Hellings等(2003)Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.28：42-50)，由激活的T细胞产生的产物(Moseley(2003)CytokineGrowth Factor Rev.14：155-74)。革兰氏阴性细菌的脂多糖似乎会通过TLR4-依赖性的和IL-23-依赖性的途径诱导IL-17A和IL-17F(Happel等(2003)J.Immunol.170：4432-36；Aggarwal等(2003)J.Biol.Chem.278：1910-14；Lindén和Adachi(2002)Allergy 57：769-75)。IL-17A或IL-17F在肺中的超量表达，会导致CXC趋化因子的诱导和中性粒细胞募集(Ye等(2001)Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.25：335-40；Hurst等(2002)J.Immunol.169：443-53)。通过基因靶定造成的IL-17R信号传递的缺陷，会导致对有粒细胞生成和肺中性粒细胞募集缺陷的革兰氏阴性细菌肺感染的易感性增强(Ye等(2001)J.Exp.Med.194：519-28)。还已经报道，抑制IL-17A会减少脂多糖诱导的肺中性粒细胞募集(Laan等(1999)J.Immunol.162：2347-52；Ferretti等(2003)J.Immunol.170：2106-12.)。IL-17R敲除小鼠中粒细胞生成的缺陷，与G-CSF释放减少了90％以上相关(Ye等(2001)J.Exp.Med.194：519-28)。此外，IL-17A的系统性超量表达，会导致粒细胞生成的显著减少，这部分地依赖于G-CSF(Schwarzenberger等(1998)J.Immunol.161：6383-89；Schwarzenberger等(2000)J.Immunol.164：4783-89)。

为了更好地说明IL-17A和IL-17F在调节肺中G-CSF和CXC趋化因子GRO-α中的作用，检查了肺组织中的IL-17受体表达，且发现了基底呼吸道上皮细胞中IL-17R的显著表达。用IL-17A和IL-17F温育极化的HBE细胞，会导致细胞因子反应的类似谱，这可以通过使用G-CSF和GRO-α以及IL-8和IL-6诱导Bio-Plex来测量(数据未显示)。还证实，IL-17F会与TNF-α协同作用，以进一步诱导从人肺分离的支气管上皮细胞的G-CSF和GRO-α生产。与这些发现不同，Numasaki和coworkers((2004)Immunol.Lett.95：97-104)报道，IL-17F对TNF-α-诱导的G-CSF分泌具有抑制作用。但是，Numasaki研究是在肺微血管内皮细胞中进行，其可能在该反应中不同。

IL-17A和IL-17F似乎在调节GRO-α和G-CSF分泌时涉及IL-17受体，因为对IL-17R特异性的单克隆抗体会显著减弱反应于IL-17A和IL-17F的这些细胞因子的释放。但是，由于该受体的低配体效率(Hymowitz等(2001)EMBO J.20：5332-41)，不能排除IL-17F参与信号传递的共同受体的可能性(Kolls和Linden(2004)Immunity21：467-76)。最近已经体外证实，IL-17F在体外结合IL-17RC(Kuestner等(2005)KeystoneSymposia：Cytokines，Disease，and Therapeutic Intervention，49(摘要))。作为这些数据的基础，可溶的IL-17R能有效地抑制HBE细胞中的IL-17A生物活性，但是不能抑制IL-17F。这些数据提示，IL-17F的结合对于细胞膜受体是不同的，或包含IL-17R的共同受体复合物是IL-17F反应所必需的。另一种可能是mAb与IL-17RC的交叉反应性；但是，这是不太可能的，因为IL-17RC与IL-17R的同源性仅仅是15％(Kolls(2004)Immunity21：467-76))。此外，当基底外侧应用配体时，IL-17A、IL-17F、和TNF-α的生物活性最大，提示可能通过气道上皮细胞的基底外侧表面发生功能性IL-17A、IL-17F和TNF-α信号传递。该受体定位具有目的意义，因为IL-17A和IL-17F的优势潜在来源是激活的T细胞，后者可以位于粘膜下层间隙(Kolls和Linden(2004)Immunity21：467-76)。实际上，Langrish及其同事最近已经定义了可以共表达IL-17A和IL-17F以及TNF-α的ThIL-17细胞群体(Langrish等(2005)J.Exp.Med.201(2)：233-40)。因而，ThIL-17细胞可以代表关键的细胞群体，其可以与介导炎症反应的人支气管上皮细胞相互作用。使用可溶的TNF-α，证实了TNF-RI对于与IL-17A和IL-17F的协同作用是关键的。但是，由于HBE细胞还表达TNF-RII，这些细胞还可以对在ThIL-17上表达的细胞表面TNF作出反应，后者优先通过TNF-RII结合和发出信号(Grell等(1995)Cell 83：793-802)。注意到下述事实，即用于在HBE细胞中引起G-CSF和GRO-α反应的浓度(参见图7)比在痰中检测到的浓度高约10-100倍。这可能反映了下述事实，即在肺中的局部组织浓度可能高于痰(它富含蛋白酶)，或IL-17A和IL-17F可能需要协同性细胞因子，例如TNF-α，以在pg/ml浓度发出信号(Kolls(2004)Immunity21：467-76)。尚未完全阐明TNF-α与IL-17A和IL-17F的协同作用的机理，但是一种机理可能涉及协同诱导转录因子，例如C/EBPδ，它驱动后续的基因转录(Shen等(2005)J.Leukoc.Biol.77：388-99)。

已经报道IL-17A在许多炎性自身免疫病中上调，包括类风湿性关节炎(Lubberts(2003)Curr.Opin.Investig.Drugs 4：572-77)、多发性硬化(Lock等Nat.Med.8：500-08)和炎性肠病(Fujino等(2003)Gut 52：65-70)。最近已经证实，T细胞衍生的IL-17A和IL-17F受到巨噬细胞和树突细胞上的TLR4和这些细胞随后的IL-23生产的调节。此外，IL-17A和IL-17F具有类似的染色体定位，并且可能源自基因复制事件。基于这些数据，IL-17A和IL-17F介导肺中性粒细胞增多的能力(Laan等(1999)J.Immunol.162：2347-52)，和CF中的慢性炎症主要是中性粒细胞性的事实，IL-17A和IL-17F可能在慢性革兰氏阴性细菌感染(例如支气管扩张或囊性纤维化(CF))场合的气道炎症中起作用。

为此目的，发现IL-17A和IL-17F都在经受肺症状加重的成年CF患者的痰中升高。此外，IL-17A和IL-17F水平的升高，与以前鉴别出的炎性介质相关，所述炎性介质例如IL-8(Sagel等(2001)Am.J.Respir.Crit.Care Med.164：1425-31)和G-CSF(Schuster等(1995)Eur.Arch.Otorhinolaryngol.252(suppl.1)：S59-S60)，这提示这些IL-17家族成员可能在中性粒细胞向这些患者气道中的募集中起作用。此外，推测IL-17A和IL-17F可以调节CF患者中CXC趋化因子和G-CSF释放。另外，在浓缩的痰中检测到接近100ng/ml的水平的IL-23p19，该水平在影响人T细胞生产IL-17的范围内(Eijnden等(2005)Eur.J.Immunol.35：469-75)。

相信这些数据首次测量了临床样品中的IL-17F。由于认为慢性炎症对于囊性纤维化场合的肺功能丧失是关键的，本文的数据提示，IL-17A和IL-17F是代表拮抗中性粒细胞介导的炎症的优良治疗靶的两个IL-17家族成员。此外，拮抗IL-17R信号传递的策略，可能会阻断IL-17A和IL-17F的作用。

序列表

<110>Wyeth

University of Pittsburgh

<120>IL-17F和IL-17r相互作用的表征

<130>01997.039300

<150>60/653,186

<151>2005-02-14

<160>5

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>492

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(492)

<400>1

atg aca gtg aag acc ctg cat ggc cca gcc atg gtc aag tac ttg ctg 48

Met Thr Val Lys Thr Leu His Gly Pro Ala Met Val Lys Tyr Leu Leu

1 5 10 15

ctg tcg ata ttg ggg ctt gcc ttt ctg agt gag gcg gca gct cgg aaa 96

Leu Ser Ile Leu Gly Leu Ala Phe Leu Ser Glu Ala Ala Ala Arg Lys

20 25 30

atc ccc aaa gta gga cat act ttt ttc caa aag cct gag agt tgc ccg 144

Ile Pro Lys Val Gly His Thr Phe Phe Gln Lys Pro Glu Ser Cys Pro

35 40 45

cct gtg cca gga ggt agt atg aag ctt gac att ggc atc atc aat gaa 192

Pro Val Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Asp Ile Gly Ile Ile Asn Glu

50 55 60

aac cag cgc gtt tcc atg tca cgt aac atc gag agc cgc tcc acc tcc 240

Asn Gln Arg Val Ser Met Ser Arg Asn Ile Glu Ser Arg Ser Thr Ser

65 70 75 80

ccc tgg aat tac act gtc act tgg gac ccc aac cgg tac ccc tcg gaa 288

Pro Trp Asn Tyr Thr Val Thr Trp Asp Pro Asn Arg Tyr Pro Ser Glu

85 90 95

gtt gta cag gcc cag tgt agg aac ttg ggc tgc atc aat gct caa gga 336

Val Val Gln Ala Gln Cys Arg Asn Leu Gly Cys Ile Asn Ala Gln Gly

100 105 110

aag gaa gac atc tcc atg aat tcc gtt ccc atc cag caa gag acc ctg 384

Lys Glu Asp Ile Ser Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Thr Leu

115 120 125

gtc gtc cgg agg aag cac caa ggc tgc tct gtt tct ttc cag ttg gag 432

Val Val Arg Arg Lys His Gln Gly Cys Ser Val Ser Phe Gln Leu Glu

130 135 140

aag gtg ctg gtg act gtt ggc tgc acc tgc gtc acc cct gtc atc cac 480

Lys Val Leu Val Thr Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Val Ile His

145 150 155 160

cat gtg cag taa 492

His Val Gln

<210>2

<211>163

<212>PRT

<213>人

<400>2

Met Thr Val Lys Thr Leu His Gly Pro Ala Met Val Lys Tyr Leu Leu

1 5 10 15

Leu Ser Ile Leu Gly Leu Ala Phe Leu Ser Glu Ala Ala Ala Arg Lys

20 25 30

Ile Pro Lys Val Gly His Thr Phe Phe Gln Lys Pro Glu Ser Cys Pro

35 40 45

Pro Val Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Asp Ile Gly Ile Ile Asn Glu

50 55 60

Asn Gln Arg Val Ser Met Ser Arg Asn Ile Glu Ser Arg Ser Thr Ser

65 70 75 80

Pro Trp Asn Tyr Thr Val Thr Trp Asp Pro Asn Arg Tyr Pro Ser Glu

85 90 95

Val Val Gln Ala Gln Cys Arg Asn Leu Gly Cys Ile Asn Ala Gln Gly

100 105 110

Lys Glu Asp Ile Ser Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Thr Leu

115 120 125

Val Val Arg Arg Lys His Gln Gly Cys Ser Val Ser Phe Gln Leu Glu

130 135 140

Lys Val Leu Val Thr Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Val Ile His

145 150 155 160

His Val Gln

<210>3

<211>3420

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(134)..(2734)

<400>3

ggctggaagc cggaagcgag caaagtggag ccgactcgaa ctccaccggc acgagggcgg 60

aaaagaaagc ctcagaacgt tcgctcgctg cgtccccagc cggggccgag ccctccgcga 120

cgccacccgg gcc atg ggg gcc gca cgc agc ccg ccg tcc gct gtc ccg 169

Met Gly Ala Ala Arg Ser Pro Pro Ser Ala Val Pro

1 5 10

ggg ccc ctg ctg ggg ctg ctc ctg ctg ctc ctg ggc gtg ctg gcc ccg 217

Gly Pro Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Leu Ala Pro

15 20 25

ggt ggc gcc tcc ctg cga ctc ctg gac cac cgg gcg ctg gtc tgc tcc 265

Gly Gly Ala Ser Leu Arg Leu Leu Asp His Arg Ala Leu Val Cys Ser

30 35 40

cag ccg ggg cta aac tgc acg gtc aag aat agt acc tgc ctg gat gac 313

Gln Pro Gly Leu Asn Cys Thr Val Lys Asn Ser Thr Cys Leu Asp Asp

45 50 55 60

agc tgg att cac cct cga aac ctg acc ccc tcc tcc cca aag gac ctg 361

Ser Trp Ile His Pro Arg Asn Leu Thr Pro Ser Ser Pro Lys Asp Leu

65 70 75

cag atc cag ctg cac ttt gcc cac acc caa caa gga gac ctg ttc ccc 409

Gln Ile Gln Leu His Phe Ala His Thr Gln Gln Gly Asp Leu Phe Pro

80 85 90

gtg gct cac atc gaa tgg aca ctg cag aca gac gcc agc atc ctg tac 457

Val Ala His Ile Glu Trp Thr Leu Gln Thr Asp Ala Ser Ile Leu Tyr

95 100 105

ctc gag ggt gca gag tta tct gtc ctg cag ctg aac acc aat gaa cgt 505

Leu Glu Gly Ala Glu Leu Ser Val Leu Gln Leu Asn Thr Asn Glu Arg

110 115 120

ttg tgc gtc agg ttt gag ttt ctg tcc aaa ctg agg cat cac cac agg 553

Leu Cys Val Arg Phe Glu Phe Leu Ser Lys Leu Arg His His His Arg

125 130 135 140

cgg tgg cgt ttt acc ttc agc cac ttt gtg gtt gac cct gac cag gaa 601

Arg Trp Arg Phe Thr Phe Ser His Phe Val Val Asp Pro Asp Gln Glu

145 150 155

tat gag gtg acc gtt cac cac ctg ccc aag ccc atc cct gat ggg gac 649

Tyr Glu Val Thr Val His His Leu Pro Lys Pro Ile Pro Asp Gly Asp

160 165 170

cca aac cac cag tcc aag aat ttc ctt gtg cct gac tgt gag cac gcc 697

Pro Asn His Gln Ser Lys Asn Phe Leu Val Pro Asp Cys Glu His Ala

175 180 185

agg atg aag gta acc acg cca tgc atg agc tca ggc agc ctg tgg gac 745

Arg Met Lys Val Thr Thr Pro Cys Met Ser Ser Gly Ser Leu Trp Asp

190 195 200

ccc aac atc acc gtg gag acc ctg gag gcc cac cag ctg cgt gtg agc 793

Pro Asn Ile Thr Val Glu Thr Leu Glu Ala His Gln Leu Arg Val Ser

205 210 215 220

ttc acc ctg tgg aac gaa tct acc cat tac cag atc ctg ctg acc agt 841

Phe Thr Leu Trp Asn Glu Ser Thr His Tyr Gln Ile Leu Leu Thr Ser

225 230 235

ttt ccg cac atg gag aac cac agt tgc ttt gag cac atg cac cac ata 889

Phe Pro His Met Glu Asn His Ser Cys Phe Glu His Met His His Ile

240 245 250

cct gcg ccc aga cca gaa gag ttc cac cag cga tcc aac gtc aca ctc 937

Pro Ala Pro Arg Pro Glu Glu Phe His Gln Arg Ser Asn Val Thr Leu

255 260 265

act cta cgc aac ctt aaa ggg tgc tgt cgc cac caa gtg cag atc cag 985

Thr Leu Arg Asn Leu Lys Gly Cys Cys Arg His Gln Val Gln Ile Gln

270 275 280

ccc ttc ttc agc agc tgc ctc aat gac tgc ctc aga cac tcc gcg act 1033

Pro Phe Phe Ser Ser Cys Leu Asn Asp Cys Leu Arg His Ser Ala Thr

285 290 295 300

gtt tcc tgc cca gaa atg cca gac act cca gaa cca att ccg gac tac 1081

Val Ser Cys Pro Glu Met Pro Asp Thr Pro Glu Pro Ile Pro Asp Tyr

305 310 315

atg ccc ctg tgg gtg tac tgg ttc atc acg ggc atc tcc atc ctg ctg 1129

Met Pro Leu Trp Val Tyr Trp Phe Ile Thr Gly Ile Ser Ile Leu Leu

320 325 330

gtg ggc tcc gtc atc ctg ctc atc gtc tgc atg acc tgg agg cta gct 1177

ValGly Ser Val Ile Leu Leu Ile Val Cys Met Thr Trp Arg Leu Ala

335 340 345

ggg cct gga agt gaa aaa tac agt gat gac acc aaa tac acc gat ggc 1225

Gly Pro Gly Ser Glu Lys Tyr Ser Asp Asp Thr Lys Tyr Thr Asp Gly

350 355 360

ctg cct gcg gct gac ctg atc ccc cca ccg ctg aag ccc agg aag gtc 1273

Leu Pro Ala Ala Asp Leu Ile Pro Pro Pro Leu Lys Pro Arg Lys Val

365 370 375 380

tgg atc atc tac tca gcc gac cac ccc ctc tac gtg gac gtg gtc ctg 1321

Trp Ile Ile Tyr Ser Ala Asp His Pro Leu Tyr Val Asp Val Val Leu

385 390 395

aaa ttc gcc cag ttc ctg ctc acc gcc tgc ggc acg gaa gtg gcc ctg 1369

Lys Phe Ala Gln Phe Leu Leu Thr Ala Cys Gly Thr Glu Val Ala Leu

400 405 410

gac ctg ctg gaa gag cag gcc atc tcg gag gca gga gtc atg acc tgg 1417

Asp Leu Leu Glu Glu Gln Ala Ile Ser Glu Ala Gly Val Met Thr Trp

415 420 425

gtg ggc cgt cag aag cag gag atg gtg gag agc aac tct aag atc atc 1465

Val Gly Arg Gln Lys Gln Glu Met Val Glu Ser Asn Ser Lys Ile Ile

430 435 440

gtc ctg tgc tcc cgc ggc acg cgc gcc aag tgg cag gcg ctc ctg ggc 1513

Val Leu Cys Ser Arg Gly Thr Arg Ala Lys Trp Gln Ala Leu Leu Gly

445 450 455 460

cgg ggg gcg cct gtg cgg ctg cgc tgc gac cac gga aag ccc gtg ggg 1561

Arg Gly Ala Pro Val Arg Leu Arg Cys Asp His Gly Lys Pro Val Gly

465 470 475

gac ctg ttc act gca gcc atg aac atg atc ctc ccg gac ttc aag agg 1609

Asp Leu Phe Thr Ala Ala Met Asn Met Ile Leu Pro Asp Phe Lys Arg

480 485 490

cca gcc tgc ttc ggc acc tac gta gtc tgc tac ttc agc gag gtc agc 1657

Pro Ala Cys Phe Gly Thr Tyr Val Val Cys Tyr Phe Ser Glu Val Ser

495 500 505

tgt gac ggc gac gtc ccc gac ctg ttc ggc gcg gcg ccg cgg tac ccg 1705

Cys Asp Gly Asp Val Pro Asp Leu Phe Gly Ala Ala Pro Arg Tyr Pro

510 515 520

ctc atg gac agg ttc gag gag gtg tac ttc cgc atc cag gac ctg gag 1753

Leu Met Asp Arg Phe Glu Glu Val Tyr Phe Arg Ile Gln Asp Leu Glu

525 530 535 540

atg ttc cag ccg ggc cgc atg cac cgc gta ggg gag ctg tcg ggg gac 1801

Met Phe Gln Pro Gly Arg Met His Arg Val Gly Glu Leu Ser Gly Asp

545 550 555

aac tac ctg cgg agc ccg ggc ggc agg cag ctc cgc gcc gcc ctg gac 1849

Asn Tyr Leu Arg Ser Pro Gly Gly Arg Gln Leu Arg Ala Ala Leu Asp

560 565 570

agg ttc cgg gac tgg cag gtc cgc tgt ccc gac tgg ttc gaa tgt gag 1897

Arg Phe Arg Asp Trp Gln Val Arg Cys Pro Asp Trp Phe Glu Cys Glu

575 580 585

aac ctc tac tca gca gat gac cag gat gcc ccg tcc ctg gac gaa gag 1945

Asn Leu Tyr Ser Ala Asp Asp Gln Asp Ala Pro Ser Leu Asp Glu Glu

590 595 600

gtg ttt gag gag cca ctg ctg cct ccg gga acc ggc atc gtg aag cgg 1993

Val Phe Glu Glu Pro Leu Leu Pro Pro Gly Thr Gly Ile Val Lys Arg

605 610 615 620

gcg ccc ctg gtg cgc gag cct ggc tcc cag gcc tgc ctg gcc ata gac 2041

Ala Pro Leu Val Arg Glu Pro Gly Ser Gln Ala Cys Leu Ala lle Asp

625 630 635

ccg ctg gtc ggg gag gaa gga gga gca gca gtg gca aag ctg gaa cct 2089

Pro Leu Val Gly Glu Glu Gly Gly Ala Ala Val Ala Lys Leu Glu Pro

640 645 650

cac ctg cag ccc cgg ggt cag cca gcg ccg cag ccc ctc cac acc ctg 2137

His Leu Gln Pro Arg Gly Gln Pro Ala Pro Gln Pro Leu His Thr Leu

655 660 665

gtg ctc gcc gca gag gag ggg gcc ctg gtg gcc gcg gtg gag cct ggg 2185

Val Leu Ala Ala Glu Glu Gly Ala Leu Val Ala Ala Val Glu Pro Gly

670 675 680

ccc ctg gct gac ggt gcc gca gtc cgg ctg gca ctg gcg ggg gag ggc 2233

Pro Leu Ala Asp Gly Ala Ala Val Arg Leu Ala Leu Ala Gly Glu Gly

685 690 695 700

gag gcc tgc ccg ctg ctg ggc agc ccg ggc gct ggg cga aat agc gtc 2281

Glu Ala Cys Pro Leu Leu Gly Ser Pro Gly Ala Gly Arg Asn Ser Val

705 710 715

ctc ttc ctc ccc gtg gac ccc gag gac tcg ccc ctt ggc agc agc acc 2329

Leu Phe Leu Pro Val Asp Pro Glu Asp Ser Pro Leu Gly Ser Ser Thr

720 725 730

ccc atg gcg tct cct gac ctc ctt cca gag gac gtg agg gag cac ctc 2377

Pro Met Ala Ser Pro Asp Leu Leu Pro Glu Asp Val Arg Glu His Leu

735 740 745

gaa ggc ttg atg ctc tcg ctc ttc gag cag agt ctg agc tgc cag gcc 2425

Glu Gly Leu Met Leu Ser Leu Phe Glu Gln Ser Leu Ser Cys Gln Ala

750 755 760

cag ggg ggc tgc agt aga ccc gcc atg gtc ctc aca gac cca cac acg 2473

Gln Gly Gly Cys Ser Arg Pro Ala Met Val Leu Thr Asp Pro His Thr

765 770 775 780

ccc tac gag gag gag cag cgg cag tca gtg cag tct gac cag ggc tac 2521

Pro Tyr Glu Glu Glu Gln Arg Gln Ser Val Gln Ser Asp Gln Gly Tyr

785 790 795

atc tcc agg agc tcc ccg cag ccc ccc gag gga ctc acg gaa atg gag 2569

Ile Ser Arg Ser Ser Pro Gln Pro Pro Glu Gly Leu Thr Glu Met Glu

800 805 810

gaa gag gag gaa gag gag cag gac cca ggg aag ccg gcc ctg cca ctc 2617

Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gln Asp Pro Gly Lys Pro Ala Leu Pro Leu

815 820 825

tct ccc gag gac ctg gag agc ctg agg agc ctc cag cgg cag ctg ctt 2665

Ser Pro Glu Asp Leu Glu Ser Leu Arg Ser Leu Gln Arg Gln Leu Leu

830 835 840

ttc cgc cag ctg cag aag aac tcg ggc tgg gac acg atg ggg tca gag 2713

Phe Arg Gln Leu Gln Lys Asn Ser Gly Trp Asp Thr Met Gly Ser Glu

845 850 855 860

tca gag ggg ccc agt gca tga gggcggctcc ccagggaccg cccagatccc 2764

Ser Glu Gly Pro Ser Ala

865

agctttgaga gaggagtgtg tgtgcacgta ttcatctgtg tgtacatgtc tgcatgtgta 2824

tatgttcgtg tgtgaaatgt aggctttaaa atgtaaatgt ctggatttta atcccaggca 2884

tccctcctaa cttttctttg tgcagcggtc tggttatcgt ctatccccag gggaatccac 2944

acagcccgct cccaggagct aatggtagag cgtccttgag gctccattat tcgttcattc 3004

agcatttatt gtgcacctac tatgtggcgg gcatttggga taccaagata aattgcatgc 3064

ggcatggccc cagccatgaa ggaacttaac cgctagtgcc gaggacacgt taaacgaaca 3124

ggatgggccg ggcacggtgg ctcacgcctg taatcccagc acactgggag gccgaggcag 3184

gtggatcact ctgaggtcag gagtttgagc cagcctggcc aacatggtga aaccccatct 3244

ccactaaaaa tagaaaaatt agccgggcat ggtgacacat gcctgtagtc ctagctactt 3304

gggaggctga ggcaggagaa ttgcttgaat ctgggaggca gaggttgcag tgagccgaga 3364

ttgtgccatt gcactgcagc ctggatgaca gagcgagact ctatctcaaa aaaaaa 3420

<210>4

<211>866

<212>PRT

<213>人

<400>4

Met Gly Ala Ala Arg Ser Pro Pro Ser Ala Val Pro Gly Pro Leu Leu

1 5 10 15

Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Leu Ala Pro Gly Gly Ala Ser

20 25 30

Leu Arg Leu Leu Asp His Arg Ala Leu Val Cys Ser Gln Pro Gly Leu

35 40 45

Asn Cys Thr Val Lys Asn Ser Thr Cys Leu Asp Asp Ser Trp Ile His

50 55 60

Pro Arg Asn Leu Thr Pro Ser Ser Pro Lys Asp Leu Gln Ile Gln Leu

65 70 75 80

His Phe Ala His Thr Gln Gln Gly Asp Leu Phe Pro Val Ala His Ile

85 90 95

Glu Trp Thr Leu Gln Thr Asp Ala Ser Ile Leu Tyr Leu Glu Gly Ala

100 105 110

Glu Leu Ser Val Leu Gln Leu Asn Thr Asn Glu Arg Leu Cys Val Arg

115 120 125

Phe Glu Phe Leu Ser Lys Leu Arg His His His Arg Arg Trp Arg Phe

130 135 140

Thr Phe Ser His Phe Val Val Asp Pro Asp Gln Glu Tyr Glu Val Thr

145 150 155 160

Val His His Leu Pro Lys Pro Ile Pro Asp Gly Asp Pro Asn His Gln

165 170 175

Ser Lys Asn Phe Leu Val Pro Asp Cys Glu His Ala Arg Met Lys Val

180 185 190

Thr Thr Pro Cys Met Ser Ser Gly Ser Leu Trp Asp Pro Asn Ile Thr

195 200 205

Val Glu Thr Leu Glu Ala His Gln Leu Arg Val Ser Phe Thr Leu Trp

210 215 220

Asn Glu Ser Thr His Tyr Gln Ile Leu Leu Thr Ser Phe Pro His Met

225 230 235 240

Glu Asn His Ser Cys Phe Glu His Met His His Ile Pro Ala Pro Arg

245 250 255

Pro Glu Glu Phe His Gln Arg Ser Asn Val Thr Leu Thr Leu Arg Asn

260 265 270

Leu Lys Gly Cys Cys Arg His Gln Val Gln Ile Gln Pro Phe Phe Ser

275 280 285

Ser Cys Leu Asn Asp Cys Leu Arg His Ser Ala Thr Val Ser Cys Pro

290 295 300

Glu Met Pro Asp Thr Pro Glu Pro Ile Pro Asp Tyr Met Pro Leu Trp

305 310 315 320

Val Tyr Trp Phe Ile Thr Gly Ile Ser Ile Leu Leu Val Gly Ser Val

325 330 335

Ile Leu Leu Ile Val Cys Met Thr Trp Arg Leu Ala Gly Pro Gly Ser

340 345 350

Glu Lys Tyr Ser Asp Asp Thr Lys Tyr Thr Asp Gly Leu Pro Ala Ala

355 360 365

Asp Leu Ile Pro Pro Pro Leu Lys Pro Arg Lys Val Trp Ile Ile Tyr

370 375 380

Ser Ala Asp His Pro Leu Tyr Val Asp Val Val Leu Lys Phe Ala Gln

385 390 395 400

Phe Leu Leu Thr Ala Cys Gly Thr Glu Val Ala Leu Asp Leu Leu Glu

405 410 415

Glu Gln Ala Ile Ser Glu Ala Gly Val Met Thr Trp Val Gly Arg Gln

420 425 430

Lys Gln Glu Met Val Glu Ser Asn Ser Lys Ile Ile Val Leu Cys Ser

435 440 445

Arg Gly Thr Arg Ala Lys Trp Gln Ala Leu Leu Gly Arg Gly Ala Pro

450 455 460

Val Arg Leu Arg Cys Asp His Gly Lys Pro Val Gly Asp Leu Phe Thr

465 470 475 480

Ala Ala Met Asn Met Ile Leu Pro Asp Phe Lys Arg Pro Ala Cys Phe

485 490 495

Gly Thr Tyr Val Val Cys Tyr Phe Ser Glu Val Ser Cys Asp Gly Asp

500 505 510

Val Pro Asp Leu Phe Gly Ala Ala Pro Arg Tyr Pro Leu Met Asp Arg

515 520 525

Phe Glu Glu Val Tyr Phe Arg Ile Gln Asp Leu Glu Met Phe Gln Pro

530 535 540

Gly Arg Met His Arg Val Gly Glu Leu Ser Gly Asp Asn Tyr Leu Arg

545 550 555 560

Ser Pro Gly Gly Arg Gln Leu Arg Ala Ala Leu Asp Arg Phe Arg Asp

565 570 575

Trp Gln Val Arg Cys Pro Asp Trp Phe Glu Cys Glu Asn Leu Tyr Ser

580 585 590

Ala Asp Asp Gln Asp Ala Pro Ser Leu Asp Glu Glu Val Phe Glu Glu

595 600 605

Pro Leu Leu Pro Pro Gly Thr Gly Ile Val Lys Arg Ala Pro Leu Val

610 615 620

Arg Glu Pro Gly Ser Gln Ala Cys Leu Ala Ile Asp Pro Leu Val Gly

625 630 635 640

Glu Glu Gly Gly Ala Ala Val Ala Lys Leu Glu Pro His Leu Gln Pro

645 650 655

Arg Gly Gln Pro Ala Pro Gln Pro Leu His Thr Leu Val Leu Ala Ala

660 665 670

Glu Glu Gly Ala Leu Val Ala Ala Val Glu Pro Gly Pro Leu Ala Asp

675 680 685

Gly Ala Ala Val Arg Leu Ala Leu Ala Gly Glu Gly Glu Ala Cys Pro

690 695 700

Leu Leu Gly Ser Pro Gly Ala Gly Arg Asn Ser Val Leu Phe Leu Pro

705 710 715 720

Val Asp Pro Glu Asp Ser Pro Leu Gly Ser Ser Thr Pro Met Ala Ser

725 730 735

Pro Asp Leu Leu Pro Glu Asp Val Arg Glu His Leu Glu Gly Leu Met

740 745 750

Leu Ser Leu Phe Glu Gln Ser Leu Ser Cys Gln Ala Gln Gly Gly Cys

755 760 765

Ser Arg Pro Ala Met Val Leu Thr Asp Pro His Thr Pro Tyr Glu Glu

770 775 780

Glu Gln Arg Gln Ser Val Gln Ser Asp Gln Gly Tyr Ile Ser Arg Ser

785 790 795 800

Ser Pro Gln Pro Pro Glu Gly Leu Thr Glu Met Glu Glu Glu Glu Glu

805 810 815

Glu Glu Gln Asp Pro Gly Lys Pro Ala Leu Pro Leu Ser Pro Glu Asp

820 825 830

Leu Glu Ser Leu Arg Ser Leu Gln Arg Gln Leu Leu Phe Arg Gln Leu

835 840 845

Gln Lys Asn Ser Gly Trp Asp Thr Met Gly Ser Glu Ser Glu Gly Pro

850 855 860

Ser Ala

865

<210>5

<211>21

<212>PRT

<213>Apis mellifera

<400>5

Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile

1 5 10 15

Ser Tyr Ile Tyr Ala

20

Claims

1.诊断受试者中的IL-17F相关病症的方法，其包含下述步骤：

检测受试者样品中IL-17F基因产物的测试量；和和对比该测试量与对照样品中IL-17F基因产物的正常量，

由此，明显超过正常量的测试量提供了诊断IL-17F相关病症的阳性指示。

2.权利要求1的方法，其中IL-17F相关病症是气道炎症。

3.权利要求2的方法，其中所述受试者是诊断出囊性纤维化的患者。

4.权利要求3的方法，其中所述受试者正在经受肺症状加重。

5.权利要求4的方法，其中所述肺症状加重是由于感染因子。

6.权利要求1的方法，其中所述IL-17F基因产物是IL-17F蛋白。

7.权利要求6的方法，其中用抗IL-17F抗体检测IL-17F蛋白。

8.筛选能抑制IL-17F结合IL-17R的化合物的方法，其包含下述步骤：

使含有IL-17F和IL-17R的样品接触化合物；和

确定接触测试化合物的样品中IL-17F与IL-1 7R的结合相对于未接触该化合物的样品中IL-17F与IL-17R的结合是否降低，

由此，接触该化合物的样品中IL-17F与IL-17R的结合的降低，将该化合物鉴别为能抑制IL-17F结合IL-17R的化合物。

9.治疗具有患IL-17F相关病症的危险或诊断出患有IL-17F相关病症的受试者的方法，其包含给该受试者施用治疗有效量的IL-17F拮抗剂。

10.权利要求9的方法，其中所述IL-17F相关病症是气道炎症。

11.权利要求10的方法，其中所述受试者是诊断出囊性纤维化的患者。

12.权利要求11的方法，其中所述受试者正在经受肺症状加重。

13.权利要求12的方法，其中所述肺症状加重是由于感染因子。

14.权利要求9的方法，其中所述IL-17F拮抗剂选自：抑制性抗IL-17F抗体，抑制性抗IL-17R抗体，可溶的IL-17R，含有IL-17R的融合蛋白，含有IL-17R的IL-17F结合片段的融合蛋白，拮抗性小分子，反义IL-17F核酸分子，反义IL-17R核酸分子，siRNA IL-17F核酸分子和siRNA IL-17R核酸分子。

15.权利要求9的方法，其还包含给该受试者施用治疗有效量的至少一种其它治疗剂。

16.权利要求15的方法，其中所述至少一种其它治疗剂选自：细胞因子抑制剂，生长因子抑制剂，免疫抑制剂，抗炎剂，代谢抑制剂，酶抑制剂，细胞毒性剂和细胞抑制剂。

17.权利要求15的方法，其中所述至少一种其它治疗剂选自：TNF拮抗剂，抗TNF剂，IL-12拮抗剂，IL-15拮抗剂，IL-17拮抗剂，IL-18拮抗剂，IL-22拮抗剂，T细胞消除剂，B细胞消除剂，环孢菌素，FK-506，CCI-779，依那西普，英夫单抗，利妥希玛，阿达木单抗，泼尼松龙，硫唑嘌呤，金，柳氮磺胺吡啶，氯喹，羟氯喹，米诺环素，阿那白滞素，阿巴他塞，甲氨蝶呤，来氟米特，雷帕霉素，雷帕霉素类似物，Cox-2抑制剂，cPLA2抑制剂，NSAIDs，p38抑制剂，B7.1、B7.2、ICOSL、ICOS和/或CD28的拮抗剂和CTLA4激动剂。

18.药物组合物，其包含IL-17F拮抗剂和药学上可接受的载体。

19.权利要求18的药物组合物，其中所述IL-1 7F拮抗剂选自：抑制性抗IL-17F抗体，抑制性抗IL-17R抗体，可溶的IL-17R，含有IL-17R的融合蛋白，含有IL-1 7R的IL-17F结合片段的融合蛋白，拮抗性小分子，反义IL-17F核酸分子，反义IL-17R核酸分子，siRNA IL-17F核酸分子和siRNA IL-17R核酸分子。

20.疫苗佐剂，其包含IL-17F拮抗剂和细菌抗原。

21.权利要求20的疫苗佐剂，其中所述IL-17F拮抗剂选自：抑制性抗IL-17F抗体，抑制性抗IL-17R抗体，可溶的IL-17R，含有IL-17R的融合蛋白，含有IL-17R的IL-17F结合片段的融合蛋白，拮抗性小分子，反义IL-17F核酸分子，反义IL-17R核酸分子，siRNA IL-17F核酸分子和siRNA IL-17R核酸分子。