KR100835786B1 - Ｉｌ-１７ａ／ｆ 이종 폴리펩티드 및 그의 치료 용도 - Google Patents

Ｉｌ-１７ａ／ｆ 이종 폴리펩티드 및 그의 치료 용도 Download PDF

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필립 하스
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얀 후
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

본 발명은 본원에서 인터루킨 17A/F (IL-17A/F)로 지칭되는 인터루킨-17 및 인터루킨-17F의 이종이량체로 구성된 신규한 자연 발생 인간 사이토카인에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 이종 폴리펩티드 서열에 융합된 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드 분자, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 특이적인 항체, 및 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 퇴행성 연골 장애 및 다른 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
사이토카인, 인터루킨 17A/F, 퇴행성 연골 장애, 염증성 질환

Description

ＩＬ-１７Ａ／Ｆ 이종 폴리펩티드 및 그의 치료 용도 {IL-17A/F HETEROLOGOUS POLYPEPTIDES AND THERAPEUTIC USES THEREOF}
본 발명은 일반적으로 본원에서 인터루킨-17A/F (IL-17A/F)로 지칭되는 신규한 인간 사이토카인의 동정 및 단리에 관한 것이다.
세포외 단백질은 다른 무엇보다도 다세포 생물체의 형성, 분화 및 유지에 있어서 중요한 역할을 수행한다. 다수의 개별 세포의 운명, 예를 들어, 증식, 이동, 분화, 또는 다른 세포와의 상호작용은 통상적으로 다른 세포 및(또는) 주위 환경으로부터 수용된 정보에 의해 좌우된다. 이러한 정보는 종종 분비된 폴리펩티드 (예를 들어, 유사분열 촉진 인자, 생존 인자, 세포독성 인자, 분화 인자, 신경펩티드 및 호르몬)에 의해 전달되며, 다양한 세포 수용체 또는 막결합 단백질이 이 정보를 수용하여 판독한다. 이들 분비된 폴리펩티드 또는 신호전달 분자는 보통 세포의 분비 경로를 통해서 세포외 환경 중에 존재하는 그들의 작용 부위에 도달한다.
분비된 단백질에는 의약품, 진단제, 바이오센서 및 생물반응기 등을 비롯한 다양한 산업적 용도가 있다. 현재 이용가능한 대부분의 단백질 약물, 예컨대 혈전용해제, 인터페론, 인터루킨, 에리트로포이에틴, 콜로니 자극 인자 및 각종 다른 사이토카인은 분비 단백질이다. 이들의 수용체는 막 단백질이며, 이들 역시 치료 제 또는 진단제로서의 잠재력을 지닌다.
막결합 단백질 및 수용체는 다른 무엇보다도 다세포 생물체의 형성, 분화 및 유지에 있어서 중요한 역할을 수행할 수 있다. 다수의 개별 세포의 운명, 예를 들어, 증식, 이동, 분화, 또는 다른 세포와의 상호작용은 통상적으로 다른 세포 및(또는) 주위 환경으로부터 수용된 정보에 의해 좌우된다. 이러한 정보는 종종 분비된 폴리펩티드 (예를 들어, 유사분열 촉진 인자, 생존 인자, 세포독성 인자, 분화 인자, 신경펩티드 및 호르몬)에 의해 전달되며, 다양한 세포 수용체 또는 막결합 단백질이 이 정보를 수용하여 판독한다. 이러한 막결합 단백질 및 세포 수용체로는 사이토카인 수용체, 수용체 키나아제, 수용체 포스파타제, 세포-세포 상호작용에 관여하는 수용체 및 셀렉틴 및 인테그린 등과 같은 세포의 어드헤신 분자 등이 있으나 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어, 세포 성장 및 분화를 조절하는 신호의 도입은 부분적으로는 각종 세포 단백질의 인산화를 통해 조절된다. 이러한 과정을 촉매하는 효소인 단백질 티로신 키나아제는 성장 인자 수용체로 작용할 수도 있다. 이의 예로는 섬유아세포 성장 인자 수용체 및 신경 성장 인자 수용체 등이 있다.
분비된 단백질과 유사하게, 막결합 단백질 및 수용체 분자에는 의약품 및 진단제 등을 비롯한 다양한 산업적 용도가 있다. 예를 들어, 수용체 이뮤노어드헤신은 수용체-리간드 상호작용을 차단하는 치료제로 사용될 수 있다. 막결합 단백질은 관련 수용체/리간드 상호작용의 잠재적인 펩티드 억제제 또는 소분자 억제제의 스크리닝에 사용될 수도 있다.
산업계와 학술계 모두가 새로운 천연 분비 단백질 및 천연 수용체 또는 막결합 단백질을 확인하고자 하는 노력을 기울이고 있다. 이러한 노력들 대개가 신규한 분비 단백질에 대한 코딩 서열을 확인하고자 포유동물 재조합 DNA 라이브러리를 스크리닝하는데 집중되어 있다. 스크리닝 방법과 기술의 예는 문헌 (예를 들어, [Klein et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., 93:7108-7113 (1996)], 미국 특허 제5,536,637호 참조)에 기재되어 있다.
이와 관련하여, 본 발명은 면역-매개 질환 및 염증성 질환과 관련이 있는 것으로 밝혀진 인터루킨-17 (IL-17) 족의 신규한 분비 폴리펩티드의 동정에 관한 것이다. 면역 관련 질환 및 염증성 질환은 정상적인 생리 상태에서는 매우 복잡하고, 종종 복합적으로 상호연관되어 있는 생물학적 경로들의 징후 또는 결과이며, 이러한 경로들은 손상 또는 상처에 대한 반응, 손상 또는 상처의 복구 개시 및 외래 생물체에 대한 선천성 또는 후천성 방어의 개시에 매우 중요하다. 이러한 정상적인 생리적 경로들이 반응의 강도에 직접적으로 연관된 것으로서, 비정상적인 조절 또는 과도한 자극의 결과로서, 자가(self)에 대한 반응으로서 또는 이들의 조합으로서 추가의 손상 또는 상처를 초래하는 경우에는 질환 또는 질병이 발생한다.
이러한 질환의 발생에는 종종 다단계 경로 및 종종 복합적인 여러가지 다른 생물학적 시스템/경로가 관여하지만, 이들 경로 중 하나 이상의 중요 지점에 개입함으로써 개선 효과 또는 치료 효과를 발생시킬 수 있다. 치료적 개입은 유해한 과정/경로의 길항작용 또는 유익한 과정/경로의 자극에 의해 일어날 수 있다.
다수의 면역 관련 질환들이 공지되어 있으며 광범위하게 연구되어 왔다. 이 러한 질환으로는, 면역-매개 염증성 질환 (예를 들어, 류마티스성 관절염, 면역-매개 신장 질환, 간담즙성 질환, 염증성 장 질환 (IBD), 건선 및 천식), 비-면역-매개 염증성 질환, 감염성 질환, 면역결핍 질환, 신생물(neoplasia) 등이 있다.
T 림프구 (T 세포)는 포유동물 면역 반응의 중요 성분이다. T 세포는 주조직 적합성 복합체 (MHC) 내의 유전자에 의해 코딩되는 자가 분자와 결합된 항원을 인식한다. 이 항원은 항원 제시 세포, 바이러스로 감염된 세포, 암세포, 이식편(移植片) 등의 표면에서 MHC 분자와 함께 제시될 수 있다. T 세포 시스템은 숙주 포유동물에 건강상 위협을 주는 이들 변형된 세포들을 제거한다. T 세포에는 헬퍼 T 세포 및 세포독성 T 세포가 있다. 헬퍼 T 세포는 항원 제시 세포상의 항원-MHC 복합체를 인식한 후에 광범위하게 증식한다. 또한, 헬퍼 T 세포는 B 세포, 세포독성 T 세포 및 면역 반응에 관여하는 기타의 다양한 세포들을 활성화시키는데 중추적 역할을 하는 각종 사이토카인, 즉 림포카인을 분비한다.
체액성 면역 반응과 세포 매개성 면역 반응 모두에서의 중추적 사건은 헬퍼 T 세포의 활성화 및 클론 증식이다. 헬퍼 T 세포의 활성화는 T 세포 수용체 (TCR)-CD3 복합체와 항원 제시 세포 표면상의 항원-MHC의 상호작용에 의해 개시된다. 이러한 상호작용은 휴지기의 헬퍼 T 세포가 세포 주기로 들어가도록 (G0에서 G1으로의 전이) 유도하는 생화학적 사건의 케스케이드를 매개하며, 그 결과로 IL-2 및 때때로 IL-4에 대한 고친화성 수용체가 발현된다. 활성화된 T 세포는 세포 주기를 거치면서 증식하고 분화하여 기억 세포 또는 이펙터(effector) 세포가 된다.
T 세포의 활성화에는 TCR을 통해 매개되는 신호 뿐만이 아니라 항원 제시 세 포에 의해 분비되는 사이토카인에 의해 유도되거나 또는 항원 제시 세포상의 막결합 분자와 T 세포와의 상호작용을 통해 유도되는 추가의 동시자극도 관련되어 있다. 사이토카인 IL-1 및 IL-6은 동시자극 신호를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 항원 제시 세포의 표면상에서 발현된 B7 분자와 T 세포의 표면상에서 발현된 CD28 및 CTLA-4 분자 사이의 상호작용은 T 세포 활성화에 영향을 미친다. 활성화된 T 세포는 ICAM-1, 인테그린, VLA-4, LFA-1, CD56 등과 같은 세포 어드헤신 분자를 더 많이 발현한다.
혼합 림프구 배양 또는 혼합 림프구 반응 (MLR)에 있어서의 T 세포 증식은 면역계 자극 능력을 보유한 화합물에 대한 지표로 정립되어 있다. 다수의 면역 반응에서는 염증성 세포가 상처 또는 감염 부위로 침윤한다. 이동하는 세포는 호중구, 호산구, 단핵구 또는 림프구일 수 있으며, 이는 침윤된 조직의 조직학적 검사에 의해 결정될 수 있다 (문헌 [Current Protocols in Immunology, ed. John E. Coligan, 1994, John Wiley ＆ Sons, Inc.]).
면역 관련 질환은 면역 반응을 저해함으로써 치료할 수 있다. 면역 자극 활성을 갖는 분자를 억제하는 중화 항체를 사용하는 것은 면역-매개 질환 및 염증성 질환의 치료에 유익하다. 면역 반응을 억제하는 분자는 면역 반응을 억제하여 면역 관련 질환을 호전시키는데 이용될 수 있다 (단백질을 직접 억제하거나 항체 효능제를 사용함).
인터루킨-17 (IL-17)은 T 세포로부터 유래된 전염증성 분자로서, 상피 세포, 내피 세포 및 섬유아세포를 자극하여 IL-6, IL-8, G-CSF 및 MCP-1 등을 비롯한 다 른 염증성 사이토카인 및 케모카인을 생성한다 (문헌 [Yao, Z. et al., J. Immunol., 122(12):5483-5486 (1995)], [Yao, Z. et al., Immunity, 3(6):811-821 (1995)], [Fossiez, F., et al., J. Exp . Med ., 183(6):2593-2603 (1996)], [Kennedy, J., et al., J. Interferon Cytokine Res., 16(8):611-7 (1996)], [Cai, X. Y., et al., Immunol . Lett , 62(1):51-8(1998)], [Jovanovic, D. V., et al., J. Immunol ., 160(7):3513-21 (1998)], [Laan, M., et al., J. Immunol ., 162(4):2347-52 (1999)], [Linden, A., et al., Eur Respir J, 15(5):973-7 (2000)] 및 [Aggarwal, S. and Gurney, A. L., J Leukoc Biol , 71(1):1-8 (2002)]). IL-17은 또한 TNF-α 및 IL-1β 등을 비롯한 다른 사이토카인과 상승작용을 하여 케모카인 발현을 추가로 유도한다 (문헌 [Chabaud, M., et al., J. Immunol. 161(1):409-14 (1998)]). 인터루킨 17 (IL-17)은 각종 유형의 세포에 대하여 다각적인 생물학적 활성을 발휘한다. IL-17은 또한 ICAM-1 표면 발현, T 세포의 증식, 및 CD34+ 인간 조상 세포의 호중구로의 성장과 분화를 유도하는 능력도 지니고 있다. IL-17은 또한 골 대사에도 관련이 있고, 활성화된 T 세포의 존재 및 TNF-α 생성을 특징으로 하는 병리 상태, 예컨대 류마티스성 관절염 및 골 이식물의 유리(loosening)에 있어서도 중요한 역할을 한다고 제안되었다 (문헌 [Van Bezooijen et al., J. Bone Miner. Res., 14:1513-1521 (1999)]). 류마티스성 관절염 환자에서 유래한 활액 조직의 활성화된 T 세포는 정상적인 개인이나 골관절염 환자에서 유래한 것에 비해 IL-17를 더 다수의 양으로 분비함이 밝혀졌다 (문헌 [Chabaud et al., Arthritis Rheum., 42:963-970 (1999)]. 이러한 전염증성 사이토카인은 류마티스성 관절염에서의 활액 염증에 크게 기여한다고 제안되었다. IL-17은 그의 전염증성 역할과는 별도로 또다른 메카니즘을 통해 류마티스성 관절염의 병리상태에도 기여한다고 여겨진다. 예를 들어, IL-17은 골모세포에서 파골세포 분화 인자 (ODF) mRNA의 발현을 유도하는 것으로 나타났다 (문헌 [Kotake et al., J. Clin . Invest., 103:1345-1352 (1999)]. ODF는 조상 세포가 골 재흡수에 관여하는 세포인 파골세포로 분화하는 것을 자극한다. IL-17의 수준이 류마티스성 관절염 환자의 활액에서 유의하게 증가하는 점으로 볼 때, IL-17로 유도되는 파골세포 형성이 류마티스성 관절염에서의 골 재흡수에서 중대한 역할을 수행하는 것으로보인다. 또한, IL-17은 다발성 경화증 (문헌 [Matusevicius et al., Mult . Scler., 5:101-104 (1999)], [Kurasawa, K., et al., Arthritis Rheu 43(11):2455-63 (2000)]) 및 건선 (문헌 [Teunissen, M. B., et al., J Invest Dermatol 111(4):645-9 (1998)], [Albanesi, C., et al., J Invest Dermatol 115(1):81-7 (2000)] 및 [Homey, B., et al., J. Immunol . 164(12:6621-32 (2000)]) 등과 같은 특정한 다른 자가면역 장애에 있어서도 매우 중대한 역할을 수행한다고 믿어진다.
추가로, IL-17은 인간 대식세포에서 세포내 신호전달을 통해 Ca2 +의 유입 및 [cAMP]i의 감소를 자극하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Jovanovic et al., J. Immunol., 160:3513 (1998)]). IL-17로 처치한 섬유아세포는 NF-κB의 활성화를 유도하며 (문헌 [Yao et al., Immunity, 3:811 (1995)], [Jovanovic et al., 상기 문헌]), IL-17로 처치한 대식세포는 NF-κB, 및 유사분열 촉진 인자로 활성화되는 단백질 키나아제를 활성화시킨다 (문헌 [Shalom-Barek et al., J. Biol . Chem ., 273:27467 (1998)]). 또한, IL-17은 골과 연골의 성장에 관여하는 포유동물 사이토카인-유사 인자 7과 서열 유사성을 공유한다. IL-17 폴리펩티드가 서열 유사성을 공유하는 다른 단백질은 인간 배아 유래의 인터루킨-관련 인자 (EDIRF) 및 인터루킨-20이다.
IL-17의 광범위한 효과와 일치하게, IL-17에 대한 세포 표면 수용체는 다수의 유형의 조직과 세포에서 광범위하게 발현되는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Yao et al., Cytokine , 9:794 (1997)]). 인간 IL-17 수용체 (IL-R)의 아미노산 서열 (866개 아미노산)은 단일 막횡단 도메인 및 525개 아미노산을 갖는 장쇄의 세포내 도메인을 보유하는 단백질로 예측되지만, 상기 수용체 서열은 독특하며 사이토카인/성장 인자 수용체 족의 어떠한 수용체의 서열과도 유사하지 않다. 이것은 IL-17 그 자체에는 다른 공지된 단백질과 유사성이 없다는 사실과 더불어, IL-17 및 그의 수용체가 신규한 족의 신호전달 단백질 및 수용체의 일부일 수 있음을 가리킨다. 기존의 연구를 통해 T 세포와 IL-17 수용체 폴리펩티드의 가용성 형태와의 접촉이 PHA, 콘카나발린 A 및 항-TCR 모노클로날 항체에 의해 유도된 T 세포 증식 및 IL-2 생성을 억제하는 것으로 나타나서 (문헌 [Yao et al., J. Immunol ., 155:5483-5486 (1995)]), IL-17 활성은 그의 독특한 세포 표면 수용체 (본원에서 인간 IL-17R이로 지칭됨)에 대한 결합을 통해 매개된다는 것이 입증되었다. 이와 같이, 공지된 사이토카인 수용체, 구체적으로는 IL-17 수용체에 상동성이 있는 신규 폴리펩티드를 동정하고 특성화하는데 상당한 관심이 있다.
인터루킨 17은 현재 새로운 사이토카인 족의 원형(prototype) 구성원으로서 인식되고 있다. 인간 및 다른 척추동물 게놈에 대해여 행해진 대규모 서열분석은, IL-17과 관련이 있다는 것이 명백한 단백질을 코딩하는 추가의 유전자가 존재함을 밝혀내고 이러한 새로운 사이토카인 족을 규명하였다. 인간 및 마우스에는 IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E 및 IL-17F를 비롯한 적어도 6종의 IL-17 족 구성원 뿐만이 아니라 신규 수용체 IL-17RH1, IL-17RH2, IL-17RH3 및 IL-17RH4가 있다 (2001년 6월 28일자로 공개된 WO 01/46420 참조). 이러한 IL-17 구성원 중 하나 (IL-17F로 지칭함)가 인간 IL-17 수용체 (IL-17R)에 결합한다는 것이 입증되었다 (문헌 [Yao et al., Cytokine , 9(11):794-800 (1997)]. 초기의 특성화는, 새로이 동정된 이들 여러 분자가 IL-17과 유사하게 면역 기능을 조정하는 능력을 보유한다는 것을 시사한다. 이들 인자 중 여러 종에 대하여 확인된 강력한 염증 작용 및 이들과 중요 인간 질환과의 연관성이 밝혀진 것은, 이들 단백질이 염증 과정에 있어서 유의한 역할을 수행할 수 있으며 치료적 개입의 기회를 제공할 수 있음을 시사한다.
인간 IL-17F를 코딩하는 유전자는 IL-17에 인접하여 위치한다 (문헌 [Hymowitz, S. G., et al., Embo J, 20(19):5332-41 (2001)]). IL-17 및 IL-17F는 44％의 아미노산 동일성을 공유하는 반면, IL-17 족의 다른 구성원은 더 제한적인 15 내지 27％의 아미노산 동일성을 공유하며, 이는 IL-17 및 IL-17F가 IL-17 족에 속하는 별개의 아족(subgroup)을 구성함을 시사한다 (문헌 [Starnes, T., et al., J Immunol , 167(8):4137-40(2001)], [Aggarwal, S. and Gurney, A. L., J. Leukoc Biol, 71(1):1-8 (2002)]). IL-17F는 IL-17과 유사한 생물학적 작용을 한다고 여겨지고, 매우 다양한 세포로부터 IL-6, IL-8 및 G-CSF가 생성되는 것을 촉진시킬 수 있다. IL-17F는 IL-17과 유사하게 연골 매트릭스 방출을 유도하고 새로운 연골 매트릭스 합성을 억제할 수 있다 (2002년 11월 28일자로 공개된 US-2002-0177188-A1 참조). 따라서, IL-17F는 IL-17과 유사하게 염증성 장애의 병리상태에 잠재적으로 기여할 수 있다. 최근, 이들 저자들은 IL-17과 IL-17F 모두가 인터루킨-23 (IL-23)의 작용에 의해 T 세포에서 유도되는 것을 관찰하였다 (문헌 [Aggarwal, S., et al., J. Biol . Chem ., 278(3):1910-4 (2003)]). IL-17 및 IL-17F가 염색체상의 위치가 유사하고 유의한 서열 유사성을 공유한다는 관찰 결과 및 IL-17 및 IL-17F가 특정 자극에 대한 반응으로 동일 세포 집단에서 유도되는 것으로 보이는 관찰 결과는, IL-17과 IL-17F가 공유결합된 이종이량체 (본원에서는 IL-17A/F로 지칭함)로 구성된 새로운 인간 사이토카인을 동정하기에 이르렀다. 인간 IL-17A/F는 인간 IL-17 및 IL-17F와는 단백질 구조면에서도, 세포기재의 활성 분석을 통해서도 구별될 수 있는 명백하게 새로운 사이토카인이다. 정제된 재조합 인간 IL-17A/F를 표준물로서 이용한 인간 IL-17AF-특이적 ELISA가 개발되어 왔다. 이러한 특수한 ELISA를 사용함으로써 인간 IL-17A/F의 발현 유도가 검출되어, IL-17A/F가 배양물 중의 활성화된 인간 T 세포로부터 천연적으로 생성된 것임이 확인되었다. 따라서, IL-17A/F는 명백하게 새로운 사이토카인이며, 단리되고 활성화된 인간 T 세포의 천연 생성물로서 검출될 수 있으며, 이것의 재조합 형태는 단백질 구조와 세포기재의 분석 모두에 있어서 관련 사이토카인과는 상이하며 구별될 수 있는 것으로서 특성화되었다. 따라서, 이들 연구는 이전에는 면역학적으로 활성이 아니었을 수 있는 특정 항원에 면역계가 반응하도록 할 수 있는 신규 면역 자극원 (즉, IL-17A/F)을 제공하며 확인한다. 이와 같이, 상기 새로이 확인된 신규 면역 자극원은 임상적 적용에 있어서 중요하다. 따라서, 이러한 새로운 IL-17A/F 사이토카인 또는 그의 효능제는 면역 자극원으로서의 실용적 유용성을 지니며, IL-17A/F 활성을 억제하는 분자 (길항제)는 면역 반응의 억제를 원하는 경우, 예를 들어, 자가면역 질환에 있어서 실용적 유용성을 지닐 것이라고 기대된다. 구체적으로, 이러한 신규 사이토카인에 대한 항체가 IL-17A/F의 면역학적 활성을 모방하거나 (효능제 항체) 또는 억제하는 (길항제 항체) 경우, 이것은 치료 성능을 보유할 것이다. 또한, 이러한 신규 사이토카인의 활성을 억제하는 작용을 하는 소분자 역시 잠재적 치료 용도를 갖는다.
발명의 요약
A. 실시양태
본 발명은 인간을 비롯한 포유동물에서 면역 관련 질환의 진단 및 치료에 유용한 조성물 및 상기 방법에 관한 것이다. 본 발명은 포유동물에서의 면역 반응을 자극하거나 억제하는 단백질 (효능제 항체 및 길항제 항체)의 확인을 기초로 한다. 면역 관련 질환은 면역 반응을 저해하거나 증대시킴으로써 치료할 수 있다. 면역 반응을 증대시키는 분자는 항원에 대한 면역 반응을 자극하거나 강화시킨다. 면역 반응을 자극하는 분자는 면역 반응의 증대가 유익한 경우에 치료용으로 사용될 수 있다. 별법으로, 면역 반응을 저해하는 분자는 항원에 대한 면역 반응을 감쇠시키거나 감소시켜서 (예를 들어, 중화 항체), 면역 반응의 감쇠가 유익한 경우 (예를 들어, 염증)에 치료용으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 IL-17A/F 폴리펩티드 및 그의 효능제 및 길항제는 면역 관련 질환 및 염증성 질환의 치료용 약제 및 의약의 제조에도 유용하다. 특정 측면에서, 이러한 약제 및 의약은 치료상 유효량의 IL-17A/F 폴리펩티드, 그의 효능제 또는 길항제 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 바람직하게는, 상기 혼합물은 멸균된 것이다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 IL-17A/F 폴리펩티드를 후보 분자와 접촉시키는 단계 및 상기 IL-17A/F 폴리펩티드에 의해 매개되는 생물학적 활성을 모니터링하는 단계를 포함하는, IL-17A/F 폴리펩티드에 대한 효능제 또는 길항제를 확인하는 방법에 관한 것이다. IL-17A/F 폴리펩티드는 천연 서열 IL-17A/F 폴리펩티드인 것이 바람직하다. 특정 측면에서, IL-17A/F 효능제 또는 길항제는 항-IL-17A/F 항체이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 IL-17A/F 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드에 결합하는 효능제 또는 길항제 항체를 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 조성물에 관한 것이다. 한 측면에서, 상기 조성물은 치료상 유효량의 상기 폴리펩티드 또는 항체를 포함한다. 또다른 측면에서, 상기 조성물이 면역 자극 분자를 포함하는 경우, 상기 조성물은 (a) 그를 필요로 하는 포유동물의 조직으로 염증 세포의 침윤을 증대시키는데, (b) 그를 필요로 하는 포유동물에서 면역 반응을 자극하거나 증대시키는데, (c) 항원에 대한 반응으로 그를 필요로 하는 포유동물에서 T-림프구 의 증식을 증가시키는데, (d) T-림프구의 활성을 자극하는데, 또는 (e) 혈관 투과성을 증가시키는데 유용하다. 추가의 측면에서, 상기 조성물이 면역 억제 분자를 포함하는 경우, 상기 조성물은 (a) 그를 필요로 하는 포유동물의 조직으로 염증 세포의 침윤을 감소시키는데, (b) 그를 필요로 하는 포유동물에서 면역 반응을 억제하거나 감소시키는데, (c) T-림프구의 활성을 감소시키는데, 또는 (d) 항원에 대한 반응으로 그를 필요로 하는 포유동물에서 T-림프구의 증식을 감소시키는데 유용하다. 또다른 측면에서, 상기 조성물은 추가의 활성 성분, 예를 들어, 추가의 항체, 세포독성제 또는 화학요법제를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 조성물은 멸균된 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 포유동물에게 치료상 유효량의 IL-17A/F 폴리펩티드, 그의 효능제 또는 그에 대한 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 면역 관련 장애의 치료를 필요로 포유동물에서 상기 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 측면에서, 상기 면역 관련 장애는 전신성 홍반 루푸스, 류마티스성 관절염, 골관절염, 유년형 만성 관절염, 척추관절증, 전신성 경화증, 특발성 염증성 근병증, 쇼그렌 증후군, 전신성 맥관염, 유육종증, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 혈소판 감소증, 갑상선염, 진성 당뇨병, 면역-매개 신부전증, 중추 및 말초 신경계의 탈수초성 질환, 예컨대 다발성 경화증, 특발성 탈수초성 다발성 신경병증 또는 길랑-바레 증후군, 및 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 간담즙성 질환, 예컨대 감염성 자가면역 만성 활성 간염, 원발성 담즙 간경변, 육아종성 간염 및 경화성 담관염, 염증성 장 질환, 글루텐 민감성 장질환, 및 휘플병, 자가면역 또는 면역-매개 피부 질환, 예컨대 수포성 피부 질환, 다형성 홍반 및 접촉성 피부염, 건선, 알레르기성 질환, 예컨대 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 음식물 과민증 및 두드러기, 폐의 면역 질환, 예컨대 호산구성 폐렴, 특발성 폐섬유증 및 과민성 폐렴, 이식 관련 질환, 예컨대 이식편 거부반응 및 이식편 대 숙주 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 또는 하기 기재된 임의의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 임의로, 상기 항체는 모노클로날 항체, 인간화 항체, 항체 단편 또는 단일쇄 항체이다. 한 측면에서, 본 발명은 IL-17A/F 폴리펩티드에 결합하는 단리된 항체에 관한 것이다. 또다른 측면에서, 상기 항체는 IL-17A/F 폴리펩티드의 활성을 모방하거나 (효능제 항체), 반대로 상기 항체는 IL-17A/F 폴리펩티드의 활성을 억제 또는 중화시킨다 (길항제 항체). 또다른 측면에서, 상기 항체는 바람직하게는 비인간 상보성 결정 영역 (CDR) 잔기 및 인간 프레임워크 (framework) 영역 (FR) 잔기를 갖는 모노클로날 항체이다. 상기 항체는 표지된 것일 수 있고, 고체 지지체 상에 고정화될 수 있다. 추가의 측면에서, 상기 항체는 항체 단편, 모노클로날 항체, 단일쇄 항체, 또는 항-이디오타입 (anti-idiotype) 항체이다. 또다른 측면에서, 상기 항체 단편 또는 단일쇄 항체는 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 및 서열 42로서 도 6에 도시된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 Fab 단편을 포함하고, 상기 Fab 단편은 서열 9 내지 42의 아미노산 잔기 7 내지 16으로 이루어진 CDR-H1, 서열 9 내지 42의 아미노산 잔기 30 내지 46으로 이루어진 CDR-H2, 및 서열 9 내지 42의 아미노산 잔기 78 내지 적어도 아미노산 잔기 96으로 이루어진 CDR-H3을 함유하는 3가지의 중쇄 가변 영역을 추가로 포함하며, 상기 Fab 단편은 IL-17A/F와 결합할 수 있다. 또다른 측면에서, 상기 항체 단편 또는 단일쇄 항체는 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 및 서열 42로서 도 6에 도시된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 Fab 단편을 포함하고, 상기 Fab 단편은 적어도 서열 9 내지 42의 아미노산 잔기 7 내지 16으로 이루어진 CDR-H1, 및 서열 9 내지 42의 아미노산 잔기 30 내지 46으로 이루어진 CDR-H2를 함유하는 중쇄 가변 영역을 추가로 포함하며, 상기 Fab 단편은 IL-17A/F와 결합할 수 있다. 또다른 측면에서, 상기 항체 단편 또는 단일쇄 항체는 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 및 서열 42로서 도 6에 도시된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 Fab 단편을 포함하고, 상기 Fab 단편 은 적어도 서열 9 내지 42의 아미노산 잔기 7 내지 16으로 이루어진 CDR-H1, 및 서열 9 내지 42의 아미노산 잔기 78 내지 적어도 아미노산 잔기 96으로 이루어진 CDR-H3을 함유하는 중쇄 가변 영역을 추가로 포함하며, 상기 Fab 단편은 IL-17A/F와 결합할 수 있다. 또다른 측면에서, 상기 항체 단편 또는 단일쇄 항체는 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 및 서열 42로서 도 6에 도시된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 Fab 단편을 포함하고, 상기 Fab 단편은 적어도 서열 9 내지 42의 아미노산 잔기 30 내지 46으로 이루어진 CDR-H2, 및 서열 9 내지 42의 아미노산 잔기 78 내지 적어도 아미노산 잔기 96으로 이루어진 CDR-H3을 함유하는 중쇄 가변 영역을 추가로 포함하며, 상기 Fab 단편은 IL-17A/F와 결합할 수 있다. 또다른 측면에서, 상기 항체 단편 또는 단일쇄 항체는 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 및 서열 42로서 도 6에 도시된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 Fab 단편을 포함하고, 상기 Fab 단편은 적어도 서열 9 내지 42의 아미노산 잔기 7 내지 16으로 이루어진 CDR-H1, 서열 9 내지 42의 아미노산 잔기 30 내지 46으로 이루어진 CDR- H2, 또는 서열 9 내지 42의 아미노산 잔기 78 내지 적어도 아미노산 잔기 96으로 이루어진 CDR-H3을 함유하는 중쇄 가변 영역을 추가로 포함하며, 상기 Fab 단편은 IL-17A/F와 결합할 수 있다. 또다른 측면에서, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41 또는 서열 42의 상기 CDR-H1 영역은 적어도 아미노 서열 GFTI (본원에서 서열 77로 지정됨)에 상응하는 아미노산 잔기 7 내지 10을 포함하며, 상기 서열 77은 IL-17A/F와 결합할 수 있다. 또다른 측면에서, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41 또는 서열 42의 상기 CDR-H2 영역은 적어도 아미노산 서열 YADSVK (본원에서 서열 78로 지정됨)에 상응하는 아미노산 잔기 41 내지 46을 포함하며, 상기 서열 78은 IL-17A/F와 결합할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 서열 48, 서열 49, 서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55, 서열 56, 서열 57, 서열 58, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 63, 서열 64, 서열 65, 서열 66, 서열 67, 서열 68, 서열 69, 서열 70, 서열 71, 서열 72, 서열 73, 서열 74, 서열 75 및 서열 76의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 단리된 핵산 분자에 관한 것으로, 상기 핵산 분자는 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41 또는 서열 42로 도시된 상기 Fab 단편을 코딩하며, 상기 Fab 단편은 IL-17A/F와 결합할 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 상기 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 IL-17A/F와 결합할 수 있는 단리된 Fab 단편을 제공한다. 본원에는 상기 Fab 단편의 발현에 적합한 조건하에 적절한 코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 세포 배양물로부터의 상기 Fab 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 상기 Fab 단편을 제조하는 방법 또한 기재되어 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 항-IL-17A/F 항체를 제약상 허용되는 담체와 함께 포함하는 조성물을 제공한다. 한 측면에서, 상기 조성물은 치료상 유효량의 항체를 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 멸균된 것이다. 상기 조성물은 보관 안정성이 연장되도록 보존될 수 있는 액상 제약 제제의 형태로 투여될 수 있다. 별볍으로, 상기 항체는 모노클로날 항체, 항체 단편, 인간화 항체, 또는 단일쇄 항체이다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은
(a) IL-17A/F 폴리펩티드 또는 그의 효능제, 길항제, 또는 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 조성물;
(b) 상기 조성물을 함유하는 용기; 및
(c) 면역 관련 질환의 치료에 상기 IL-17A/F 폴리펩티드 또는 그의 효능제 또는 길항제를 사용하는 방법에 관해 상기 용기에 부착된 라벨 또는 상기 용기에 포함된 포장 삽입물을 포함하는 제조 용품에 관한 것이다. 상기 조성물은 치료상 유효량의 IL-17A/F 폴리펩티드 또는 그의 효능제 또는 길항제를 포함할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 포유동물로부터 입수한 조직 세포의 시험 샘플에서, 및 (b) 동일한 세포 유형의 공지된 정상 조직 세포의 대조군 샘플에서 IL-17A/F 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출하는 단계를 포함하며, 대조군 샘플에 비해 높거나 낮은 시험 샘플에서의 발현 수준은 시험 조직 세포가 입수된 포유동물에서 면역 관련 질환의 존재의 지표가 되는, 포유동물에서 면역 관련 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 항-IL-17A/F 항체와 포유동물로부터 입수한 조직 세포의 시험 샘플을 접촉시키는 단계, 및 (b) 상기 시험 샘플에서 상기 항체와 IL-17A/F 폴리펩티드의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 복합체의 형성은 면역 질환의 존재 또는 부재의 지표가 되는, 포유동물에서 면역 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다. 상기 검출은 정성적 또는 정량적일 수 있으며, 동일한 세포 유형의 공지된 정상 조직 세포의 대조군 샘플에서 복합체 형성을 모니터링한 것과 비교함으로써 수행할 수 있다. 시험 샘플에서 형성된 더 다수의 양의 복합체는 시험 조직 세포가 입수된 포유동물에서 면역 질환의 존재 또는 부재의 지표가 된다. 상기 항체는 바람직하게는 검출가능한 표지를 담지한다. 복합체 형성은 예를 들어, 광학 현미경법, 유동 세포계측법, 형광분석법, 또는 당업계에 공지된 다른 기술에 의해 모니터링할 수 있다. 상기 시험 샘플은 보통 면역계에 결함 또는 이상이 있는 것으로 의심되는 개체로부터 입수한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 IL-17A/F 폴리펩티드를 함유하는 것으로 의심되는 세포의 시험 샘플을 항-IL-17A/F 항체에 노출시키는 단계, 및 상기 세포 샘플에 대한 상기 항체의 결합을 측정하는 단계를 포함하는, 샘플 중 IL-17A/F 폴리펩티드의 존재를 측정하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 상기 샘플은 IL-17A/F 폴리펩티드를 함유하는 것으로 의심되는 세포를 포함하고, 상기 항체는 상기 세포에 결합한다. 상기 항체는 바람직하게는 검출가능하게 표지되고(되거나) 고체 지지체에 결합된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 적합한 포장물 중에 항-IL-17A/F 항체 및 담체를 포함하는, 면역-관련 질환 진단 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 바람직하게는 IL-17A/F 폴리펩티드의 존재를 검출하기 위해 상기 항체를 사용하는 방법에 관한 지침서를 함유한다. 바람직하게는, 상기 담체는 제약상 허용가능하다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 적합한 포장물 중에 항-IL-17A/F 항체를 함유하는 진단 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 바람직하게는 IL-17A/F 폴리펩티드를 검출하기 위해 상기 항체를 사용하는 방법에 관한 지침서를 함유한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 포유동물로부터 입수한 조직 세포의 시험 샘플에서 IL-17A/F 폴리펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 시험 샘플 중 IL-17A/F 폴리펩티드의 존재 또는 부재는 상기 포유동물에서 면역-관련 질환의 존재의 지표가 되는, 포유동물에서 면역-관련 질환을 진단하는 방법을 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) IL-17A/F 폴리펩티드에 의해 정상적으로 유도되는 세포 반응을 유도하기에 적합한 조건하에 스크리닝하고자 하는 시험 화합물과 세포를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 세포 반응의 유도를 측정하여, 상기 시험 화합물이 효과적인 효능제인지를 결정하는 단계를 포함하며, 상기 세포 반응의 유도는 상기 시험 화합물이 효과적인 효능제임의 지표가 되는, IL-17A/F 폴리펩티드의 효능제를 확인하는 방법에 관한 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 후보 화합물과 IL-17A/F 폴리펩티드가 상호작용하도록 하는 조건하에 및 그에 충분한 시간 동안 상기 두 성분을 접촉시키는 단계, 및 IL-17A/F 폴리펩티드의 활성이 억제되는지를 측정하는 단계를 포함하는, IL-17A/F 폴리펩티드의 활성을 억제할 수 있는 화합물을 확인하는 방법에 관한 것이다. 특정 측면에서, 상기 후보 화합물 또는 IL-17A/F 폴리펩티드 중 하나는 고체 지지체 상에 고정화된다. 또다른 측면에서, 고정화되지 않은 성분은 검출가능한 표지를 담지한다. 바람직한 측면에서, 상기 방법은 (a) IL-17A/F 폴리펩티드의 존재하에 IL-17A/F 폴리펩티드에 의해 정상적으로 유도되는 세포 반응의 유도에 적합한 조건하에 스크리닝하고자 하는 시험 화합물과 세포를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 세포 반응의 유도를 측정하여, 상기 시험 화합물이 효과적인 길항제인지 를 결정하는 단계를 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 세포와 시험 화합물을 접촉시키는 단계, 및 IL-17A/F 폴리펩티드의 발현이 억제되는지를 측정하는 단계를 포함하는, IL-17A/F 폴리펩티드를 정상적으로 발현하는 세포에서 IL-17A/F 폴리펩티드의 발현을 억제하는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다. 바람직한 측면에서, 상기 방법은 (a) IL-17A/F 폴리펩티드를 발현시키기에 적합한 조건하에 스크리닝하고자 하는 시험 화합물과 세포를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 폴리펩티드의 발현의 억제를 측정하는 단계를 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) IL-17A/F 폴리펩티드, (b) IL-17A/F 폴리펩티드의 효능제 또는 (c) IL-17A/F 폴리펩티드의 길항제를 코딩하는 핵산 분자를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 효능제 또는 길항제가 항-IL-17A/F 항체일 수 있는, 면역 관련 장애를 앓고 있는 포유동물에서 상기 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 포유동물은 인간이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 핵산은 생체외 유전자 치료제로 투여된다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 상기 핵산은 벡터, 더욱 바람직하게는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터 내에 포함된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 프로모터; (a) IL-17A/F 폴리펩티드, (b) IL-17A/F 폴리펩티드의 효능제 폴리펩티드, 또는 (c) IL-17A/F 폴리펩티드의 길항제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산; 및 상기 폴리펩티드의 세포 분비를 위한 신호 서열을 필수적으로 포함하는 바이러스 벡터를 포함하며, 상기 바이러스 벡터가 바이러스 구조 단백질과 연결된 것인, 재조합 바이러스 입자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 신호 서열은 포유동물로부터, 예컨대 천연 IL-17A/F 폴리펩티드로부터 입수된다.
또다른 추가의 실시양태에서, 본 발명은 프로모터; (a) IL-17A/F 폴리펩티드, (b) IL-17A/F 폴리펩티드의 효능제 폴리펩티드, 또는 (c) IL-17A/F 폴리펩티드의 길항제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산; 및 상기 폴리펩티드의 세포 분비를 위한 신호 서열을 필수적으로 포함하는 레트로바이러스 벡터를 포함하며, 레트로바이러스 구조 단백질을 발현하는 핵산 구조물을 포함하는 세포외 생산자 세포에 관한 것이며, 상기 생산자 세포는 상기 구조 단백질과 연결된 레트로바이러스 벡터를 포장하여 재조합 레트로바이러스 입자를 제조한다.
또다른 추가의 실시양태에서, 본 발명은 포유동물에게 (a) IL-17A/F 폴리펩티드 또는 (b) IL-17A/F 폴리펩티드의 효능제를 투여하는 단계를 포함하며, 상기 포유동물에서 혈관계로부터의 염증 세포의 침윤이 증대되는 것인, 혈관계로부터 포유동물의 조직으로의 염증 세포의 침윤을 증대시키는 방법을 제공한다.
또다른 추가의 실시양태에서, 본 발명은 포유동물에게 (a) IL-17A/F 폴리펩티드 또는 (b) IL-17A/F 폴리펩티드의 길항제를 투여하는 단계를 포함하며, 상기 포유동물에서 혈관계로부터의 염증 세포의 침윤이 감소되는 것인, 혈관계로부터 포유동물의 조직으로의 염증 세포의 침윤을 감소시키는 방법을 제공한다.
또다른 추가의 실시양태에서, 본 발명은 포유동물에게 (a) IL-17A/F 폴리펩 티드 또는 (b) IL-17A/F 폴리펩티드의 효능제를 투여하는 단계를 포함하며, 상기 포유동물에서 T-림프구의 활성이 증가되는 것인, 포유동물에서 T-림프구의 활성을 증가시키는 방법을 제공한다.
또다른 추가의 실시양태에서, 본 발명은 포유동물에게 (a) IL-17A/F 폴리펩티드 또는 (b) IL-17A/F 폴리펩티드의 길항제를 투여하는 단계를 포함하며, 상기 포유동물에서 T-림프구의 활성이 감소되는 것인, 포유동물에서 T-림프구의 활성을 감소시키는 방법을 제공한다.
또다른 추가의 실시양태에서, 본 발명은 포유동물에게 (a) IL-17A/F 폴리펩티드 또는 (b) IL-17A/F 폴리펩티드의 효능제를 투여하는 단계를 포함하며, 상기 포유동물에서 T-림프구의 증식이 증가되는 것인, 포유동물에서 T-림프구의 증식을 증가시키는 방법을 제공한다.
또다른 추가의 실시양태에서, 본 발명은 포유동물에게 (a) IL-17A/F 폴리펩티드 또는 (b) IL-17A/F 폴리펩티드의 길항제를 투여하는 단계를 포함하며, 상기 포유동물에서 T-림프구의 증식이 감소되는 것인, 포유동물에서 T-림프구의 증식을 감소시키는 방법을 제공한다.
또다른 추가의 실시양태에서, 본 발명은 IL-17A/F 폴리펩티드, 또는 그의 효능제 또는 길항제 (예를 들어, 항-IL-17A/F)에 대해 반응성인 증상의 치료에 유용한 의약의 제조에 있어서, IL-17A/F 폴리펩티드, 또는 상기 기재된 그의 효능제 또는 길항제, 또는 항-IL-17A/F 항체의 용도에 관한 것이다. 특정 측면에서, 본 발명은 퇴행성 연골 장애의 치료 방법에 있어서, IL-17A/F 폴리펩티드, 또는 그의 효 능제 또는 길항제의 용도에 관한 것이다.
또다른 추가의 실시양태에서, 본 발명은 퇴행성 연골 장애를 앓고 있는 포유동물에게 치료상 유효량의 IL-17A/F 폴리펩티드 또는 그의 효능제 또는 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 퇴행성 연골 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
또다른 추가의 실시양태에서, 본 발명은 퇴행성 연골 장애의 치료에 있어서, IL-17A/F 폴리펩티드 또는 그의 효능제 또는 길항제를 제약상 허용되는 담체와 함께 포함하는 조성물; 상기 조성물을 함유하는 용기; 및 상기 용기에 부착되어 있으며 상기 조성물의 용도를 언급하는 라벨을 포함하는 키트에 관한 것이다.
B. 추가의 실시양태
본 발명의 다른 실시양태에서, 본 발명은 IL-17A/F 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
한 측면에서, 단리된 핵산 분자는 (a) 본원에 개시된 전장 아미노산 서열, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 아미노산 서열, 또는 본원에 개시된 바와 같이 전장 아미노산 서열의 특별하게 정의된 임의의 다른 단편을 갖는 IL-17A/F 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자, 또는 (b) 상기 DNA 분자 (a)의 상보체와의 핵산 서열 동일성이 약 80％ 이상, 다르게는 약 81％ 이상, 다르게는 약 82％ 이상, 다르게는 약 83％ 이상, 다르게는 약 84％ 이상, 다르게는 약 85％ 이상, 다르게는 약 86％ 이상, 다르게는 약 87％ 이상, 다르게는 약 88％ 이상, 다르게는 약 89％ 이상, 다르게는 약 90％ 이상, 다르게는 약 91％ 이상, 다르게는 약 92％ 이 상, 다르게는 약 93％ 이상, 다르게는 약 94％ 이상, 다르게는 약 95％ 이상, 다르게는 약 96％ 이상, 다르게는 약 97％ 이상, 다르게는 약 98％ 이상, 및 다르게는 약 99％ 이상인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다른 측면에서, 단리된 핵산 분자는 (a) 본원에 개시된 전장 IL-17A/F 폴리펩티드 cDNA의 코딩 서열, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 IL-17A/F 폴리펩티드의 코딩 서열, 또는 본원에 개시된 바와 같이 전장 아미노산 서열의 특별하게 정의된 임의의 다른 단편의 코딩 서열을 포함하는 DNA 분자, 또는 (b) 상기 DNA 분자 (a)의 상보체와의 핵산 서열 동일성이 약 80％ 이상, 다르게는 약 81％ 이상, 다르게는 약 82％ 이상, 다르게는 약 83％ 이상, 다르게는 약 84％ 이상, 다르게는 약 85％ 이상, 다르게는 약 86％ 이상, 다르게는 약 87％ 이상, 다르게는 약 88％ 이상, 다르게는 약 89％ 이상, 다르게는 약 90％ 이상, 다르게는 약 91％ 이상, 다르게는 약 92％ 이상, 다르게는 약 93％ 이상, 다르게는 약 94％ 이상, 다르게는 약 95％ 이상, 다르게는 약 96％ 이상, 다르게는 약 97％ 이상, 다르게는 약 98％ 이상, 및 다르게는 약 99％ 이상인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 (a) 본원에 개시된 바와 같이 ATCC에 기탁된 임의의 인간 단백질 cDNA에 의해 코딩된 동일한 성숙한 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자, 또는 (b) 상기 DNA 분자 (a)의 상보체와의 핵산 서열 동일성이 약 80％ 이상, 다르게는 약 81％ 이상, 다르게는 약 82％ 이상, 다르게는 약 83％ 이상, 다르게는 약 84％ 이상, 다르게는 약 85％ 이상, 다르게는 약 86％ 이상, 다르게는 약 87％ 이상, 다르게는 약 88％ 이상, 다르게는 약 89％ 이상, 다르게는 약 90％ 이 상, 다르게는 약 91％ 이상, 다르게는 약 92％ 이상, 다르게는 약 93％ 이상, 다르게는 약 94％ 이상, 다르게는 약 95％ 이상, 다르게는 약 96％ 이상, 다르게는 약 97％ 이상, 다르게는 약 98％ 이상, 및 다르게는 약 99％ 이상인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.
또다른 실시양태는, 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드 프로브로서, 또는 임의로 항-IL-17A/F 항체에 대한 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 IL-17A/F 폴리펩티드의 코딩 단편에 대한 혼성화 프로브로서 사용될 수 있는 IL-17A/F 폴리펩티드 코딩 서열 또는 그의 상보체의 단편에 관한 것이다. 이러한 핵산 단편은 일반적으로 길이가 뉴클레오티드 약 20개 이상, 다르게는 약 30개 이상, 다르게는 약 40개 이상, 다르게는 약 50개 이상, 다르게는 약 60개 이상, 다르게는 약 70개 이상, 다르게는 약 80개 이상, 다르게는 약 90개 이상, 다르게는 약 100개 이상, 다르게는 약 110개 이상, 다르게는 약 120개 이상, 다르게는 약 130개 이상, 다르게는 약 140개 이상, 다르게는 약 150개 이상, 다르게는 약 160개 이상, 다르게는 약 170개 이상, 다르게는 약 180개 이상, 다르게는 약 190개 이상, 다르게는 약 200개 이상, 다르게는 약 250개 이상, 다르게는 약 300개 이상, 다르게는 약 350개 이상, 다르게는 약 400개 이상, 다르게는 약 450개 이상, 다르게는 약 500개 이상, 다르게는 약 600개 이상, 다르게는 약 700개 이상, 다르게는 약 800개 이상, 다르게는 약 900개 이상, 다르게는 약 1000개 이상이며, 이 때 본 문맥에서 용어 "약"은 언급한 뉴클레오티드 서열 길이 ± 언급한 길이의 10％를 의미한다. IL-17A/F 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 신규 단편은, 잘 알 려진 다수의 서열 정렬 프로그램 중 임의의 것을 사용하여 이러한 IL-17A/F 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 다른 공지된 뉴클레오티드 서열과 함께 정렬시키고, 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 단편(들)의 어떤 것이 신규한 것인지를 결정함으로써 일상적인 방식으로 결정할 수 있음을 유의한다. 본원에서는 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 모두가 고려된다. 또한 상기 뉴클레오티드 분자 단편에 의해 코딩된 폴리펩티드 단편, 바람직하게는 항-IL-17A/F 항체에 대한 결합 부위를 포함하는 IL-17A/F 폴리펩티드 단편들도 고려된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 동정된 단리된 임의의 핵산 서열에 의해 코딩된 단리된 IL-17A/F 폴리펩티드를 제공한다.
특정 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 전장 아미노산 서열, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 아미노산 서열, 또는 본원에 개시된 바와 같이 전장 아미노산 서열의 특별하게 정의된 임의의 다른 단편을 갖는 IL-17A/F 폴리펩티드와의 아미노산 서열 동일성이 약 80％ 이상, 다르게는 약 81％ 이상, 다르게는 약 82％ 이상, 다르게는 약 83％ 이상, 다르게는 약 84％ 이상, 다르게는 약 85％ 이상, 다르게는 약 86％ 이상, 다르게는 약 87％ 이상, 다르게는 약 88％ 이상, 다르게는 약 89％ 이상, 다르게는 약 90％ 이상, 다르게는 약 91％ 이상, 다르게는 약 92％ 이상, 다르게는 약 93％ 이상, 다르게는 약 94％ 이상, 다르게는 약 95％ 이상, 다르게는 약 96％ 이상, 다르게는 약 97％ 이상, 다르게는 약 98％ 이상, 다르게는 약 99％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 단리된 IL-17A/F 폴리펩티드에 관한 것이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이 ATCC에 기탁된 임의의 인간 단백질 cDNA에 의해 코딩된 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성이 약 80％ 이상, 다르게는 약 81％ 이상, 다르게는 약 82％ 이상, 다르게는 약 83％ 이상, 다르게는 약 84％ 이상, 다르게는 약 85％ 이상, 다르게는 약 86％ 이상, 다르게는 약 87％ 이상, 다르게는 약 88％ 이상, 다르게는 약 89％ 이상, 다르게는 약 90％ 이상, 다르게는 약 91％ 이상, 다르게는 약 92％ 이상, 다르게는 약 93％ 이상, 다르게는 약 94％ 이상, 다르게는 약 95％ 이상, 다르게는 약 96％ 이상, 다르게는 약 97％ 이상, 다르게는 약 98％ 이상, 다르게는 약 99％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 단리된 IL-17A/F 폴리펩티드에 관한 것이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 전장 아미노산 서열, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 아미노산 서열, 또는 본원에 개시된 바와 같이 전장 아미노산 서열의 특별하게 정의된 임의의 다른 단편을 갖는 IL-17A/F 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교해서 약 80％ 이상, 다르게는 약 81％ 이상, 다르게는 약 82％ 이상, 다르게는 약 83％ 이상, 다르게는 약 84％ 이상, 다르게는 약 85％ 이상, 다르게는 약 86％ 이상, 다르게는 약 87％ 이상, 다르게는 약 88％ 이상, 다르게는 약 89％ 이상, 다르게는 약 90％ 이상, 다르게는 약 91％ 이상, 다르게는 약 92％ 이상, 다르게는 약 93％ 이상, 다르게는 약 94％ 이상, 다르게는 약 95％ 이상, 다르게는 약 96％ 이상, 다르게는 약 97％ 이상, 다르게는 약 98％ 이상 및 다르게는 약 99％ 이상의 포지티브 스코어링을 기록하는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 IL-17A/F 폴리펩티드에 관한 것이다.
특정 측면에서, 본 발명은 상기 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되며 N-말단 신호 서열 및(또는) 개시 메티오닌을 갖지 않는 단리된 IL-17A/F 폴리펩티드를 제공한다. 또한 상기한 단리된 IL-17A/F 폴리펩티드의 제조 방법도 본원에 기재되어 있으며, 이 방법은 적절한 코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 IL-17A/F 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계, 및 세포 배양물로부터 IL-17A/F 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 천연 IL-17A/F 폴리펩티드의 효능제 및 길항제에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 효능제 또는 길항제는 항-IL-17A/F 항체 또는 소분자이다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 IL-17A/F 폴리펩티드를 후보 분자와 접촉시키는 단계, 상기 IL-17A/F 폴리펩티드에 의해 매개되는 생물학적 활성을 모니터링하는 단계를 포함하는, IL-17A/F 폴리펩티드에 대한 효능제 또는 길항제를 동정하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, IL-17A/F 폴리펩티드는 천연 IL-17A/F 폴리펩티드이다.
또다른 추가의 실시양태에서, 본 발명은 IL-17A/F 폴리펩티드, 또는 본원에 기재된 IL-17A/F 폴리펩티드의 효능제 또는 길항제, 또는 항-IL-17A/F 항체를 담체와 함께 포함하는 조성물에 관한 것이다. 임의로, 담체는 제약상 허용되는 담체이다.
본 발명의 다른 실시양태는 IL-17A/F 폴리펩티드 또는 그의 효능제 또는 길 항제, 또는 항-IL-17A/F 항체에 반응성인 증상의 치료에 유용한 의약의 제조에 있어서, IL-17A/F 폴리펩티드 또는 상기 기재된 그의 효능제 또는 길항제, 또는 항-IL-17A/F 항체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 제공한다. 이러한 임의의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다. 예를 들어, 숙주 세포는 CHO 세포, 이. 콜라이(E. coli), 효모 또는 배큘로바이러스-감염된 곤충 세포일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드를 제조하는 과정이 추가로 제공되며, 이 과정은 숙주 세포를 원하는 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계, 및 세포 배양물로부터 원하는 폴리펩티드를 회수하는 딘계를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 제공한다. 이러한 키메라 분자의 예는 이뮤노글로불린의 에피토프 태그 서열 또는 Fc 영역에 융합된 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드를 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 또는 하기 기재된 임의의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 임의로, 항체는 모노클로날 항체, 인간화 항체, 항체 단편 또는 단일쇄 항체이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 게놈 및 cDNA 뉴클레오티드 서열을 단리하는데 유용하거나 안티센스 프로브로서 유용한 올리고뉴클레오티드 프로브를 제공하며, 이들 프로브는 상기 또는 하기 기재된 임의의 뉴클레오티드 서열로부터 유래될 수 있다.
도 1은 신규 인간 사이토카인 지정된 IL-17A/F를 발현시키고 단리한 결과를 나타낸다. 인간 293 신장 세포를, 도 1A 및 도 1B에 나타낸 바와 같이, 인간 IL-17 및 IL-17F를 코딩하는 cDNA 발현 벡터를 단독으로 또는 이들을 조합하여 형질감염시켰다. 형질감염된 세포로부터의 조건화 배지를, 도 1A 및 도 1B에 나타낸 바와 같이, IL-17 (레인 1-5) 또는 IL-17F (레인 6-10)를 인식할 수 있는 항체를 사용하여 면역침전(IP)시켰다. 도 1A의 레인 8 및 도 1B의 레인 3에서 이량체 IL-17A/F 복합체의 존재를 입증하는 웨스턴 블롯 분석이 나타났다. 이량체 IL-17A/F 복합체의 크기는 IL-17의 하나의 폴리펩티드 쇄와 IL-17F의 하나의 폴리펩티드 쇄로 구성된 공유결합성 이종이량체 종의 크기와 일치한다.
도 2는 재조합 IL-17A/F의 정제를 나타낸다. 도 2A는 S-세파로스 컬럼 상에서의 IL-17A/F의 초기 분획화로부터 얻어진 단백질 분획의 은 염색된 SDS-PAGE 수행 결과를 나타낸다. 분획 31 및 32는 IL-17A/F와 일치하는 대략 33 kD의 겉보기 분자 질량을 갖는 단백질을 함유한다. 도 2B는 비닥 (Vydac) C4 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 IL-17A/F를 추가로 정제한 결과를 나타낸다. 214 nm 및 280 nm에서 측정된 용출 단백질의 크로마토그래프가 나타나 있다. 도 2C는, 비닥 C4 정제 컬럼으로부터의 정제된 IL-17A/F 단백질 분획이 TK-10 세포에서 IL-8 생산을 유도한다는 것을 입증한다.
도 3은 IL-17A/F의 아미노산 서열 분석 결과를 나타낸다. 도 3A는 정제된 IL-17A/F의 비-환원성 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 분리된 단백질을 PVDF 막으로 전달하고, 쿠마시 블루 (Coomassie blue) 단백질 염료로 염색하였다. 분자량 마커의 위치는 우측에 나타나 있다. 도 3B는 단리된 IL-17A/F의 N-말단 서열 분석 결과를 나타낸다 (도 3A에 나타낸 밴드의 N-말단 서열 분석으로부터 검출된 아미노산 잔기). 서열 분석 결과, 두 개의 N-말단 서열이 밝혀졌다 (1 서열 및 2 서열은 각각 서열 1 및 서열 2로 지정됨). 도 3C는 인간 IL-17의 아미노산 서열 (도 3C 및 도 8 둘 다에서 나타나며 서열 3으로 지정됨) 및 인간 IL-17F의 아미노산 서열 (도 3C 및 도 10 둘 다에서 나타나며 서열 4로 지정됨)을 나타낸다. IL-17 및 IL-17F의 신호 서열에는 밑줄이 그어져 있다. IL-17A/F에 존재하는 두 개의 N-말단 펩티드 서열 (서열 1 및 서열 2)에 대해 동일성을 갖는 서열은 나타낸 IL-17 및 IL-17F 폴리펩티드 서열에서 굵은 글씨로 강조해서 나타냈다.
도 4는 IL-17A/F의 질량분광법 분석을 나타낸다. 도 4A는 성숙한 IL-17A/F 이종이량체의 쇄간 및 쇄내 디술피드 결합을 갖는 아미노산 서열 (서열 77)을 나타내는 개략도이다. 디술피드 결합에 관여하는 시스테인은 작은 원모양(ㆍ) 및 잔기 번호로 표시하였다. 디술피드 결합은 결합된 시스테인을 연결하는 흑색선으로 표시하였다. 쇄간 디술피드 결합을 형성하는 이러한 디술피드 결합은 굵은 흑색선으로 강조해서 나타냈다. 도 4B는 트립신으로 IL-17A/F를 분해하여 생성된 것으로 예상되는 IL-17 쇄 및 IL-17F 쇄 사이의 디술피드 결합을 함유하는 IL-17A/F 펩티드단편 #1 및 #2의 개략도를 나타낸다 (IL-17A/F 디술피드 결합 단편 #1 및 IL-17A/F 디술피드 결합 단편 #2는 각각 서열 7 및 서열 8로 지정함). 이들 단편내에 함유된 아미노산을 각 쇄의 개시 메티오닌에 대해 상대적으로 나타내고 번호를 부여하였다. 또한, 질량분광법에 의해 관찰된 것으로 예상되는 상기 단편들의 계산된 대략적인 분자 질량을 나타냈다. 도 4C는 IL-17A/F의 매트릭스-보조된 레이저 이탈/이온화 비행시간 질량분광법 (MALDI-TOF) 펩티드 맵을 나타낸다. 생성된 펩티드 맵은 디술피드 연결된 펩티드와 일치하는 [M+H]+ = 2420.12 Da 및 3410.60 Da을 갖는 피크를 함유한다. 도 4D는 액체-크로마토그래피 전자분무 이온화 이온 트랩 질량분광법 (LC-ESI-MS)에 의한 IL-17A/F의 비-환원된 샘플의 추가 특성화를 입증한다. 이온 크로마토그램은 IL-17A/F 디술피드 결합 단편 #2 [M+2H]2+ 및 IL-17A/F 디술피드 결합 단편 #1 [M+2H]3+의 재구성된 이온 크로마토그램 (RIC)인 총 이온 크로마토그램을 나타낸다 (상부부터 하부까지). 두 이종이량체와 일치하는 피크가 관찰되었지만, 동종이량체 펩티드에 대한 예상된 질량에서 배경 화학적 노이즈(noise)를 상회하는 피크는 관찰되지 않았다.
도 5A는 IL-17A/F, IL-17 및 IL-17F에 의해 유도된 전염증성 반응을 비교한 투여량 반응 곡선을 나타낸다. IL-17A/F, IL-17 및 IL-17F를 지시된 농도에서 24시간 동안 TK-10 세포와 함께 인큐베이션하였다. IL-17A/F는 nM 이하 농도에서도 실질적인 활성이 나타나는 강력한 IL-8 유도 활성을 갖는 것으로 나타났다. 도 5B는 IL-17A/F, IL-17 및 IL-17F에 의한 IL-6 유도를 비교한 투여량 반응 곡선을 나타낸다. IL-17A/F, IL-17 및 IL-17F를 지시된 농도에서 24시간 동안 TK-10 세포와 함께 인큐베이션하였다. TK-10 조건화 배지를 수집하고, IL-6 ELISA에 의해 분석하였다.
도 6은 IL-17A/F에 결합하는 Fab로부터의 CDR H1 내지 H3을 함유하는 중쇄 가변 영역의 영역 아미노산 서열을 나타낸다. IL-17A/F에 결합할 수 있는 독특한 항체 중쇄 서열을 코딩하는 34개의 클론 (각각 서열 9 내지 서열 42)의 예측된 아미노산 서열의 영역 배열이 나타나 있다. 3개의 중쇄 CDR 영역 (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3)은 쉐이딩되어 있다.
도 7은 천연 서열 IL-17 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 5)을 나타낸다.
도 8은 도 7에 나타낸 서열 5의 코딩 서열로부터 유래된 아미노산 서열 (서열 3)을 나타낸다.
도 9는 천연 서열 IL-17F cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 6)을 나타낸다.
도 10은 도 9에 나타낸 서열 6의 코딩 서열로부터 유래된 아미노산 서열 (서열 4)을 나타낸다.
도 11은 항-CD3/항-CD28 활성화된 인간 T-세포로부터 생산된 IL-17A/F의 IL-17A/F ELISA 측정을 나타낸다.
도 12는 동시에 분석된 #31 내지 #33의 3개의 분획이 거의 동량의 IL-17A/F를 함유하는 것으로 나타난 IL-17A/F ELISA의 특이성을 나타낸다 (IL-17A 및 IL-17F는 대조군으로 사용되었음).
I. 정의
"천연 서열 IL-17A/F 폴리펩티드"는 자연으로부터 유래한 상응하는 IL-17A/F 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 천연 서열 IL-17A/F 폴리펩티드는 자연으로부터 단리될 수도, 또는 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조될 수도 있다. 용어 "천연 서열 IL-17A/F 폴리펩티드"는 특히 특정 IL-17A/F 폴리펩티드의 자연발생적 말단 절단된 (truncated) 형태 또는 분비된 형태 (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 이러한 폴리펩티드의 자연발생적 변이체 형태 (예를 들어, 다르게 스플라이싱된 형태) 및 자연발생적 대립유전자 변이체를 포함한다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 본원에 개시된 천연 서열 IL-17A/F 폴리펩티드는 첨부된 도면에 나타낸 전장 아미노산 서열을 포함하는 성숙한 또는 전장 천연 서열 폴리펩티드이다. 개시 및 정지 코돈은 도면에서 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된다. 그러나, 첨부된 도면에 개시된 IL-17A/F 폴리펩티드는 도면에서 아미노산 위치 1로 지정된 메티오닌 잔기로 시작하는 것으로 나타나 있지만, 도면에서 아미노산 위치 1로부터 상류 또는 하류에 위치한 다른 메티오닌 잔기가 IL-17A/F 폴리펩티드의 출발 아미노산 잔기로 이용될 수 있음을 생각할 수 있으며 또한 가능하다.
본원에 개시된 다양한 IL-17A/F 폴리펩티드의 "신호 펩티드"의 대략적인 위치는 본 명세서 및(또는) 첨부된 도면에 나타나 있다. 그러나 염두에 두어야 할 것은, 신호 펩티드의 C-말단 경계가 달라질 수 있지만, 대부분은 본원에서 처음 확인된 신호 펩티드 C-말단의 어느쪽 경계면이든지 아미노산은 약 5개 이하라는 점이며, 여기서 신호 펩티드의 C-말단 경계는 당업계에서 아미노산 서열 요소의 유형을 확인하는데 통상적으로 이용되는 기준에 따라 확인될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Nielsen et al., Prot . Eng . 10: 1-6 (1997)] 및 [von Heinje et al., Nucl . Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986)] 참조). 또한, 몇몇 경우에는 분비된 폴리펩티드로부터의 신호 서열의 절단이 전체적으로 동일하지 않아 1 종 이상의 분비된 폴리펩티드를 생성시킨다고 인지된다. 본 발명에서는 본원에서 확인된 신호 펩티드의 C-말단의 어느쪽 경계면이든지에 있는 약 5개 이하의 아미노산 범위 내에서 신호 펩티드가 절단된 이들 성숙한 폴리펩티드, 및 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 고려한다.
"IL-17A/F 폴리펩티드 변이체"는 본원에 개시된 전장 천연 서열 IL-17A/F 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 IL-17A/F 폴리펩티드 서열, 또는 본원에 개시된 바와 같이 전장 IL-17A/F 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 단편과의 아미노산 서열 동일이 약 80％ 이상인, 본원의 상기 또는 하기에 정의된 활성 IL-17A/F 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 IL-17A/F 폴리펩티드 변이체로는, 예를 들어, 전장 천연 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 하나 이상의 아미노산 잔기가 부가되거나 결실된 IL-17A/F 폴리펩티드가 포함된다. 통상, IL-17A/F 폴리펩티드 변이체는 본원에서 개시된 전장 천연 서열 IL-17A/F 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 IL-17A/F 폴리펩티드 서열, 또는 본원에 개시된 바와 같이 전장 IL-17A/F 폴리펩티드 서열의 특별하게 정의된 임의의 다른 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80％ 이상, 다르게는 약 81％ 이상, 다르게는 약 82％ 이상, 다르게는 약 83％ 이상, 다르게는 약 84％ 이상, 다르게는 약 85％ 이상, 다르게는 약 86％ 이상, 다르게는 약 87％ 이상, 다르게는 약 88％ 이상, 다르게는 약 89％ 이상, 다르게는 약 90％ 이상, 다르게는 약 91％ 이상, 다르게는 92％ 이상, 다르게는 약 93％ 이상, 다르게는 약 94％ 이상, 다르게는 약 95％ 이상, 다르게는 약 96％ 이상, 다르게는 약 97％ 이상, 다르게는 약 98％ 이상, 다르게는 약 99％ 이상일 것이다. 통상적으로, IL-17A/F 변이체 폴리펩티드의 길이는, 아미노산 약 10개 이상, 다르게는 약 20개 이상, 다르게는 약 30개 이상, 다르게는 약 40개 이상, 다르게는 약 50개 이상, 다르게는 약 60개 이상, 다르게는 약 70개 이상, 다르게는 약 80개 이상, 다르게는 약 90개 이상, 다르게는 약 100개 이상, 다르게는 약 150개 이상, 다르게는 약 200개 이상, 다르게는 약 300개 이상, 또는 그 이상이다.
본원에서 확인된 IL-17A/F 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 (％)"은 서열을 정렬하고, 필요한 경우 서열 동일성 퍼센트의 최대치를 얻기 위해 갭을 도입한 후 어떠한 보존적 치환도 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 상태에서 특정 IL-17A/F 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열의 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 (％)을 측정하기 위한 정렬은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대로 정렬시키기 위해 필요한 임의의 연산법을 비롯하여 정렬을 측정하기에 적절한 파라미터를 정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상 아미노산 서열 동일성 값 (％)은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 얻을 수 있는데, 상기 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 원시 코드는 하기 표 1에 기재되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크사 (Genenctech, Inc.)가 개발하였으며, 하기 표 1에 나타낸 원시 코드는 미국 저작권청 (미국 20559 워싱톤 D.C. 소재)에 사용자 문서와 함께 제출되었으며 미국 저작권 등록 제TXU510087호로서 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크사 (미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코 소재)를 통해 공개적으로 입수할 수 있거나, 하기 표 1에 기재된 원시 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영체제, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 컴파일되어 이용되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변경되지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 경우, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 (％) (또는 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 특정 아미노산 서열 동일성 (％)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
X/Y ×100
여기서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에 있는 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 (％)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 (％)와 같지 않을 것임을 인지해야 할 것이다. 이 방법을 이용한 아미노산 서열 동일성 계산의 예로서, 표 2 및 표 3은 관심있는 가정의 아미노산 서열에 대한 "비교 단백질"로 지칭하는 아미노산 서열의 아미노산 서열 동일성 (％)을 계산하는 방법을 나타내며, 여기서, "비교 단백질"은 관심있는 폴리펩티드와 비교될 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내고, "X", "Y" 및 "Z"는 각각 상이한 가정의 아미노산 잔기를 나타낸다.
달리 구체적으로 언급하지 않는 한, 본원에 이용된 모든 아미노산 서열 동일성 값 (％)은 바로 앞선 단락에 기재된 바와 같이 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 얻는다. 그러나, 아미노산 서열 동일성 값 (％)은 하기한 바와 같이 WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램 (문헌 [Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-80 (1996)])을 이용하여 얻을 수도 있다. WU-BLAST-2 검색 파라미터 대부분은 디폴트값으로 설정된다. 디폴트값으로 설정하지 않은 것들 즉, 조정가능한 파라미터는 다음 값으로 설정된다: 오버랩 스팬 = 1, 오버랩 분율 = 0.125, 워드 한계 (T) = 11, 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62. WU-BLAST-2를 이용하면 아미노산 서열 동일성 값 (％)은, (a) 천연 폴리펩티드로부터 유도된 서열을 갖는 관심있는 폴리펩티드의 아미노산 서열과 관심있는 비교 아미노산 서열 (즉, 관심있는 폴리펩티드와 비교되는 서열로서 IL-17A/F 변이체 폴리펩티드일 수 있음)과의 사이에 매치되는 동일한 아미노산 잔기의 수를 WU-BLAST-2로 결정하여 얻고, 이를 (b) 관심있는 폴리펩티드의 아미노산 총 잔기수로 나누어 결정한다. 예를 들어, "아미노산 서열 B와 80％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 A를 포함하는 폴리펩티드"라는 말에서, 아미노산 서열 A는 비교하는 관심있는 아미노산 서열이고 아미노산 서열 B는 관심있는 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
아미노산 서열 동일성 (％)은 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST-2를 이용하여 결정할 수도 있다 (문헌 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)]). 상기 NCBI-BLAST-2 서열 비교 프로그램은 웹 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 다운로드 받거나 미국 메릴랜드주 베데스다 소재의 미국립보건원에서 얻을 수 있다. NCBI-BLAST-2는 여러 가지 검색 파라미터를 이용하는데, 이러한 모든 검색 파라미터는 디폴트값으로 설정되며, 예를 들어, 언마스크 = 예, 가닥 = 모두, 기대 발생 = 10, 최소 저복합성 길이 = 15/5, 다중-통과 e-값 = 0.01, 다중-통과에 대한 상수 = 25, 최종 갭 정렬에 대한 드롭오프 = 25 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62이다.
NCBI-BLAST-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 경우, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 (％) (주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 특정 아미노산 서열 동일성 (％)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
X/Y ×100
여기서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 NCBI-BLAST-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에 있는 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 (％)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 (％)과 같지 않을 것임을 인지해야 할 것이다.
"IL-17A/F 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "IL-17A/F 변이체 핵산 서열"은 아래 정의된 바와 같은 활성 IL-17A/F 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로서, 본원에 기재된 바와 같은 전장 천연 서열 IL-17A/F 폴리펩티드 서열, 본원에 기재된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 전장 천연 서열 IL-17A/F 폴리펩티드 서열, 또는 본원에 기재된 바와 같이 전장 IL-17A/F 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80％ 이상인 핵산 분자이다. 통상, IL-17A/F 변이체 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같은 전장 천연 서열 IL-17A/F 폴리펩티드 서열, 본원에 기재된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 전장 천연 서열 IL-17A/F 폴리펩티드 서열, 또는 본원에 기재된 바와 같이 전장 IL-17A/F 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 단편을 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80％ 이상, 다르게는 약 81％ 이상, 다르게는 약 82％ 이상, 다르게는 약 83％ 이상, 다르게는 약 84％ 이상, 다르게는 약 85％ 이상, 다르게는 약 86％ 이상, 다르게는 약 87％ 이상, 다르게는 약 88％ 이상, 다르게는 약 89％ 이상, 다르게는 약 90％ 이상, 다르게는 약 91％ 이상, 다르게는 약 92％ 이상, 다르게는 약 93％ 이상, 다르게는 약 94％ 이상, 다르게는 약 95％ 이상, 다르게는 약 96％ 이상, 다르게는 약 97％ 이상, 다르게는 약 98％ 이상, 다르게는 약 99％ 이상일 것이다. 변이체는 천연 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다.
통상적으로, IL-17A/F 변이체 폴리뉴클레오티드의 길이는 뉴클레오티드 약 30개 이상, 다르게는 약 60개 이상, 다르게는 약 90개 이상, 다르게는 약 120개 이상, 다르게는 약 150개 이상, 다르게는 약 180개 이상, 다르게는 약 210개 이상, 다르게는 약 240개 이상, 다르게는 약 270개 이상, 다르게는 약 300개 이상, 다르게는 약 450개 이상, 다르게는 약 600개 이상, 다르게는 약 900개 이상, 또는 그 이상이다.
본원에서 확인된 IL-17A/F 코딩 핵산 서열에 대한 "핵산 서열 동일성 (％)"은 서열을 정렬시키고, 필요한 경우 서열 동일성의 최대치를 얻기 위해 갭을 도입한 후 관심있는 IL-17A/F 핵산 서열의 뉴클레오티드와 동일한, 후보 서열의 뉴클레오티드의 비율로서 정의된다. 핵산 서열 동일성 (％)을 측정하기 위한 정렬은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상 핵산 서열 동일성 값 (％)은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 얻을 수 있는데, 상기 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 원시 코드는 하기 표 1에 기재되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크사가 개발하였으며, 표 1에 나타낸 원시 코드는 미국 저작권청 (미국 20559 워싱톤 D.C. 소재)에 사용자 문서와 함께 제출되었으며, 미국 저작권 등록 제TXU510087호로서 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크사 (미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코 소재)를 통해 공개적으로 입수할 수 있거나, 하기 표 1에 기재된 원시 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 운영체제, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 컴파일되어 이용되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램으로 설정되며 변경되지 않는다.
ALIGN-2가 핵산 서열 비교를 위해 사용되는 경우, 주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 주어진 핵산 서열 C (또한, 주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 특정 핵산 서열 동일성(％)을 갖거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C라는 어구로 달리 표현할 수 있음)의 핵산 서열 동일성(％)은 하기와 같이 계산한다:
W/Z ×100
여기서, W는 C와 D의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D에 있는 뉴클레오티드의 총 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 같지 않은 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성(％)은 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성(％)과 같지 않을 것임을 인지해야 할 것이다. 이 방법을 이용한 핵산 서열 동일성(％) 계산의 예로서, 표 4 및 표 5는 "IL-17A/F-DNA"로 지칭되는 핵산 서열에 대한 "비교 DNA"로 지칭되는 핵산 서열의 핵산 서열 동일성(％)을 계산하는 방법을 나타내며, 여기서 "IL-17A/F-DNA"는 관심있는 가정의 IL-17A/F-코딩 핵산 서열을 나타내고, "비교 DNA"는 관심있는 "IL-17A/F-DNA" 핵산 분자와 비교될 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 나타내며, "N", "L" 및 "V"는 각각 상이한 가정의 뉴클레오티드를 나타낸다.
달리 명시하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 핵산 서열 동일성(％) 값은 바로 앞선 단락에 기재된 바와 같이 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 얻는다. 그러나, 핵산 서열 동일성 값 (％)은 하기한 바와 같이 WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램 (문헌 [Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-80 (1996)])을 이용하여 얻을 수도 있다. WU-BLAST-2 검색 파라미터 대부분은 디폴트값으로 설정된다. 디폴트값으로 설정하지 않은 것들 즉, 조정가능한 파라미터는 다음 값으로 설정된다: 오버랩 스팬 = 1, 오버랩 분획 = 0.125, 워드 한계 (T) = 11, 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62. WU-BLAST-2를 이용하면 핵산 서열 동일성 값 (％)은, (a) 천연 IL-17A/F 폴리펩티드-코딩 핵산 서열로부터 유도된 서열을 갖는 관심있는 IL-17A/F 폴리펩티드-코딩 핵산 분자의 핵산 서열과 관심있는 비교 핵산 분자 (즉, 관심있는 IL-17A/F 폴리펩티드-코딩 핵산 분자와 비교되는 서열로서 IL-17A/F 폴리뉴클레오티드 변이체일 수 있음)와의 사이에 매치되는 동일한 뉴클레오티드의 수를 WU-BLAST-2로 결정하여 얻고, 이를 (b) 관심있는 IL-17A/F 폴리펩티드-코딩 핵산 분자의 뉴클레오티드의 총 수로 나누어 결정한다. 예를 들어, "핵산 서열 B와 80％ 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 서열 A를 포함하는 단리된 핵산 분자"라는 말에서, 핵산 서열 A는 비교하는 관심있는 핵산 분자이고 핵산 서열 D는 관심있는 IL-17A/F 폴리펩티드-코딩 핵산 분자의 핵산 서열이다.
핵산 서열 동일성 (％)은 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST-2를 이용하여 결정할 수도 있다 (문헌 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)]). 상기 NCBI-BLAST-2 서열 비교 프로그램은 웹 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)로부터 다운로드 받거나 미국 메릴랜드주 베테스다 소재의 미국립보건원에서 얻을 수 있다. NCBI-BLAST-2는 여러 가지 검색 파라미터를 이용하는데, 이러한 모든 검색 파라미터는 디폴트값으로 설정되며, 예를 들어, 언마스크 = 예, 가닥 = 모두, 기대 발생 = 10, 최소 저복합성 길이 = 15/5, 다중-통과 e-값 = 0.01, 다중-통과에 대한 상수 = 25, 최종 갭 정렬에 대한 드롭오프 = 25 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62이다.
NCBI-BLAST-2가 서열 비교에 사용되는 경우, 주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 주어진 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 (％) (주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 특정 핵산 서열 동일성 (％)을 갖거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다:
W/Z ×100
여기서, W는 C와 D의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 NCBI-BLAST-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D에 있는 뉴클레오티드의 총 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 같지 않은 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 (％)은 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 (％)과 같지 않을 것임을 인지해야 할 것이다.
다른 실시양태에서 IL-17A/F 변이체 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 전장 IL-17A/F 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 (바람직하게는 엄격한 혼성화 및 세척 조건에서) 혼성화될 수 있는 활성 IL-17A/F 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자이다. IL-17A/F 변이체 폴리펩티드는 IL-17A/F 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있다.
"단리된"이 본원에 개시된 다양한 폴리펩티드를 기재하기 위해 사용되는 경우, 이는 천연 환경 성분으로부터 동정 및 분리 및(또는) 회수된 폴리펩티드를 의미한다. 통상적으로, 상기 폴리펩티드의 천연 환경의 오염 성분은 상기 폴리펩티드가 진단 또는 치료에 사용되는 것을 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 (1) 스피닝 컵 시쿼네이터 (spinning cup sequenator)의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기를 15개 이상 얻기에 충분한 정도로, 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비-환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 하나의 밴드만 나타날 정도로 정제한다. 단리된 폴리펩티드는 재조합 세포내에서 계내 폴리펩티드를 포함하는데, 이는 IL-17A/F 폴리펩티드 천연 환경 성분이 1성분 이상 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로 단리된 폴리펩티드는 하나 이상의 정제 단계를 통해 제조될 것이다.
"단리된" IL-17A/F 폴리펩티드-코딩 핵산 또는 기타 폴리펩티드-코딩 핵산은 상기 폴리펩티드-코딩 핵산의 천연 공급원 내에서 통상적으로 결합되는 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 동정 및 분리된 핵산 분자이다. 단리된 폴리펩티드-코딩 핵산 분자는 자연계에서 발견되는 형태 또는 환경과는 다르게 존재한다. 따라서, 단리된 폴리펩티드-코딩 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 특정 폴리펩티드-코딩 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 단리된 폴리펩티드-코딩 핵산 분자는, 예를 들어, 천연 세포의 경우와 상이한 염색체 위치에 존재하는 폴리펩티드를 통상적으로 발현하는 세포에 함유된 폴리펩티드-코딩 핵산 분자를 포함한다.
용어 "조절 서열"은 특정 숙주 생물체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 의미한다. 원핵생물에 적합한 조절 서열은, 예를 들어, 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열, 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 공지되어 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 전서열 (presequence) 또는 분비 리더의 DNA는 해당 폴리펩티드가 그의 분비에 관여하는 전단백질 (preprotein)로서 발현되는 경우 상기 폴리펩티드의 DNA에 작동가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 해당 폴리펩티드의 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 코딩 서열의 번역을 촉진하도록 배치될 때 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 통상적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우에는 인접하여 위치하면서 동일한 리딩 상 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접하여 위치할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서의 라이게이션을 통해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에는 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상적인 관행에 따라 사용한다.
혼성화 반응의 "엄격도"는 당업자가 용이하게 측정할 수 있으며, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따라 달라지는 실험적 계산값이다. 일반적으로, 프로브의 길이가 길수록, 적절한 어닐링에 요구되는 온도가 더 높고, 프로브의 길이가 짧을수록, 요구되는 온도가 더 낮다. 일반적으로, 혼성화는 상보적 가닥이 자신들의 융점보다 낮은 환경에 존재할 때 리어닐링되는 변성된 DNA의 능력에 따라 달라진다. 프로브와 혼성화가능한 서열 사이의 원하는 상동성의 정도가 높을수록, 사용할 수 있는 상대적인 온도가 높아진다. 결과적으로, 상대적 온도가 높아질수록 반응 조건은 더욱 엄격해지는 반면, 상대적 온도가 낮을수록 반응 조건은 덜 엄격해진다. 혼성화 반응의 엄격도와 관련한 더 상세한 정보 및 설명은 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995)]을 참조한다.
본원에서 정의된 바와 같은 "엄격 조건" 또는 "고엄격 조건"은 (1) 세척시 이온 농도가 낮고 온도가 높은 조건, 예를 들어, 50℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1％ 나트륨 도데실 술페이트를 사용하거나, (2) 혼성화시에 42℃에서 포름아미드, 예를 들어, 0.1％ 소혈청 알부민/0.1％ 피콜/0.1％ 폴리비닐피롤리돈/750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨이 함유된 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5)을 함유하는 50％ (v/v) 포름아미드와 같은 변성제를 사용하거나, 또는 (3) 42℃에서 50％ 포름아미드, 5 ×SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1％ 피로인산나트륨, 5 ×덴하르트 (Denhardt's) 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/ml), 0.1％ SDS 및 10％ 덱스트란 술페이트를 사용하고, 42℃에서 0.2 ×SSC (염화나트륨/시트르산나트륨) 및 55℃에서 포름아미드에서 세척한 후에, 55℃에서 EDTA가 함유된 0.1 ×SSC를 이용하여 고엄격 세척을 수행하는 조건이다.
"중간 정도의 엄격 조건"은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기재된 바와 같이 확인할 수 있으며, 상기한 것보다 덜 엄격한 세척 용액 및 혼성화 조건 (예를 들어, 온도, 이온 농도 및 SDS의 비율(％))의 사용을 포함한다. 중간 정도의 엄격 조건의 예는 20％ 포름아미드, 5 ×SSC (150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 ×덴하르트 용액, 10％ 덱스트란 술페이트 및 20 mg/ml의 연어 정자의 절단된 변성 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 필터를 약 37 내지 50℃에서 1 ×SSC로 세척하는 조건이다. 당업자라면, 프로브 길이 등과 같은 인자에 맞춰 필요한 온도, 이온 농도 등을 조절하는 방법을 인지할 것이다.
본원에 사용된 용어 "에피토프 태그가 부착된"은 "태그 폴리펩티드"에 융합된 IL-17A/F-DNA 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 의미한다. 태그 폴리펩티드는 항체가 만들어질 수 있을 정도의 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 갖지만 융합될 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 정도로 충분히 짧다. 또한, 태그 폴리펩티드는 자신에 대한 항체가 다른 에피토프와는 실질적으로 가교반응하지 않도록 아주 독특한 것이 바람직하다. 일반적으로, 적합한 태그 폴리펩티드의 아미노산 잔기는 6개 이상이며, 보통은 약 8 내지 50개 (바람직하게는 약 10 내지 20개)이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "이뮤노어드헤신"은 이뮤노글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 이종 단백질 ("어드헤신")의 결합 특이성을 겸비한 항체 유사 분자를 지칭한다. 구조적으로, 이뮤노어드헤신은 항체의 항원 인식 부위 및 항원 결합 부위가 아닌, 원하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열 (즉, "이종")과 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열의 융합체를 포함한다. 이뮤노어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 통상적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접 핵산 서열이다. 이뮤노어드헤신 중 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열은 IgG-1, IgG-2, IgG-3 또는 IgG-4 서브타입, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM과 같은 임의의 이뮤노글로불린으로부터 얻을 수 있다.
용어 "길항제"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 본원에 개시된 천연 IL-17A/F 폴리펩티드의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 임의의 분자를 포함한다. 이와 유사한 방식으로, 용어 "효능제"도 가장 넓은 의미로 사용되며, 본원에 개시된 천연 IL-17A/F 폴리펩티드의 생물학적 활성을 모방하는 임의의 분자를 포함한다. 적합한 효능제 또는 길항제 분자로는 구체적으로 효능제 또는 길항제의 항체 또는 항체 단편, 천연 IL-17A/F 폴리펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변이체, 펩티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 유기 소분자 등이 있다. IL-17A/F 폴리펩티드의 효능제 또는 길항제를 확인하는 방법은 IL-17A/F 폴리펩티드를 후보 효능제 분자 또는 후보 길항제 분자와 접촉시키는 단계, 및 IL-17A/F 폴리펩티드와 정상적으로 관련된 하나 이상의 생물학적 활성에서 검출가능한 변화를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
"치료"란 치료적 처치 및 예방적 처치 둘 다를 지칭하며, 그 목적은 표적 질병 상태 또는 장애를 예방하거나 경감 (감소)시키는 것이다. 치료를 필요로 하는 대상은 이미 장애를 앓고 있는 대상 뿐만 아니라, 장애를 경험한 대상 또는 장애를 예방하고자 하는 대상까지도 포함한다.
"만성" 투여는 초기 치료 효과 (활성)가 연장된 기간 동안 유지되도록 급성 방식과 반대로 연속 방식으로 작용제(들)을 투여하는 것을 의미한다. "간헐적" 투여는 중단하지 않고 연속해서 수행하는 것이라기 보다는 주기적으로 수행하는 요법이다.
치료를 위한 "포유동물"은 인간, 가축 및 축산용 동물, 동물원 동물, 경기용 동물 또는 애완용 동물, 예를 들어, 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 토끼 등을 비롯한 포유동물로 분류되는 임의의 동물을 의미한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
1종 이상의 추가의 치료제와 "병용" 투여는 동시 (함께) 투여하는 것 및 임의의 순서로 연속 투여하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 "담체"에는 사용된 투여량 및 농도에서 그에 노출된 세포 또는 포유동물에 무독성인 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제가 포함된다. 종종 생리학적으로 허용되는 담체는 pH 완충 수용액이다. 생리학적으로 허용되는 담체의 예로는 인산, 시트르산 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산을 비롯한 항산화제; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이팅제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알콜; 나트륨과 같은 염-형성 카운터 이온; 및(또는) TWEEN (상표명), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 PLURONICS (상표명)과 같은 비이온성 계면활성제가 포함된다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로는, 예를 들어, 원하는 생물학적 또는 면역학적 활성을 나타내는 한 단일 항-IL-17A/F 모노클로날 항체 (효능제, 길항제 및 중화 항체 포함), 폴리에피토프 특이성을 갖는 항-IL-17A/F 항체 조성물, 폴리클로날 항체, 단일쇄 항-IL-17A/F 항체 및 항-IL-17A/F 항체의 단편 (하기 참조)을 포함한다. 용어 "이뮤노글로불린" (Ig)은 본원에서 "항체"와 상호교환 가능하게 사용된다.
"단리된 항체"는 천연 환경의 성분으로부터 동정 및 분리 및(또는) 회수된 항체이다. 천연 환경의 오염 성분은 항체가 진단 또는 치료에 사용되는 것을 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리 (Lowry) 방법으로 측정시 항체의 95 중량％를 초과하는 정도, 가장 바람직하게는 99 중량％를 초과하는 정도로, (2) 스피닝 컵 시쿼네이터 사용에 의해 N-말단 또는 내부 핵산 서열의 잔기 15개 이상을 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비-환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 하나의 밴드만 나타날 정도로 정제한다. 단리된 항체에는 재조합 세포내의 계내 항체가 포함되는데, 이는 항체 천연 환경 성분이 1성분 이상 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 1회 이상의 정제 단계를 통해 제조될 것이다.
기본적인 4-쇄 항체 단위는 두 개의 동일한 경쇄 (L)와 두 개의 동일한 중쇄 (H)로 구성되는 이종사량체 당단백질이다 (IgM 항체는 J쇄라 불리는 추가의 폴리펩티드와 함께 5개의 기본적인 이종사량체 단위로 구성되어 있으므로 10개의 항원 결합 부위를 함유하지만, 분비되는 IgA 항체는 중합되어 J쇄와 함께 기본적인 4-쇄 단위를 2 내지 5개 포함하는 다가 조립체를 형성할 수 있음). IgG의 경우, 4-쇄 단위는 대체적으로 약 150,000 달톤이다. 각 L쇄는 하나의 공유결합성 디술피드 결합에 의해 H쇄에 연결되어 있지만, 두 개의 H쇄는 H쇄 이소타입 (isotype)에 따라 하나 이상의 디술피드 결합에 의해 서로와 연결되어 있다. 또한, 각 H쇄 및 L쇄에는 일정한 간격을 두고 떨어져 있는 쇄내 디술피드 가교도 존재한다. 각 H쇄의 N-말단에는 가변 도메인 (VH)가 있고, 이 도메인 다음에는 α및 γ쇄 각각의 경우에는 3개의 불변 도메인 (CH)이 있고, μ및 ε이소타입의 경우에는 4개의 CH 도메인이 있다. 각 L쇄의 N-말단에는 가변 도메인 (VL)이 있고, 반대쪽 말단에는 불변 도메인 (CL)이 있다. VL은 VH와 정렬되어 있고, CL은 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)과 정렬되어 있다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이의 경계면을 형성하는 것으로 여겨진다. VH와 VL의 페어링 (pairing)은 함께 단일 항원-결합 부위를 형성한다. 상이한 클래스에 속하는 항체의 구조 및 성질에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton ＆ Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6]을 참조한다.
임의의 척추동물 종의 L쇄는 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 카파 및 람다로 불리는 명백히 다른 2가지 유형 중 하나일 수 있다. 이뮤노글로불린은 중쇄의 불변 도메인 (CH)의 아미노산 서열에 따라 다양한 클래스 또는 이소타입으로 분류될 수 있다. 5가지 클래스의 이뮤노글로불린, 즉 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭되는 중쇄가 있는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있다. γ 및 α클래스는 CH 서열 및 기능에 있어서의 상대적으로 작은 차이점을 기초로 하여 서브클래스로 더 분류되는데, 예를 들어, 인간은 서브클래스 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2를 발현한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 단편들이 항체들 사이에서 광범위한 서열 상이성을 나타낸다는 사실을 의미한다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 한정한다. 그러나, 이러한 가변성이 가변 도메인의 110개 아미노산 전반에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 대신에, V 영역은 길이가 9 내지 12개 아미노산이며 가변성이 극도로 높아 "초가변 영역"으로 불리는 보다 짧은 영역에 의해 분리되어 있는, 15 내지 30개 아미노산으로 구성된 프레임워크 영역 (framework region, FR)으로 불리는 비교적 불변성인 스트레치로 구성된다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 주로 β-쉬이트 구조를 취하며 3개의 초가변 영역으로 연결되어 있는 4개의 FR을 포함하는데, 상기 FR은 β-쉬이트 구조를 연결하고, 몇몇 경우에는 상기 β-쉬이트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 쇄에서의 초가변 영역들은 FR에 의해 서로 근접하게 위치되어 있고, 다른 쇄로부터의 초가변 영역은 항체의 항원-결합 부위 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는 데는 직접 관여하지 않지만, 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)에 항체가 참여하는 것과 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역"은 항원-결합을 담당하는, 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 일반적으로, 이러한 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, VL 내의 잔기 약 24 내지 34 (L1), 50 내지 56 (L2) 및 89 내지 97 (L3) 부근 및 VH 내의 잔기 약 1 내지 35 (H1), 50 내지 65 (H2) 및 95 내지 102 (H3) 부근 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]) 및(또는) "초가변 루프"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, VL 내의 잔기 26 내지 32 (L1), 50 내지 52 (L2) 및 91 내지 96 (L3) 및 VH 내의 잔기 26 내지 32 (H1), 53 내지 55 (H2) 및 96 내지 101 (H3) [Chothia and Lesk J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987)])를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 의미하는데, 즉 이러한 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생적인 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원성 부위에 대해 고도로 특이적이다. 또한, 여러 결정인자 (에피토프)에 대해 지시된 여러 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 이러한 특이성 이외에도, 모노클로날 항체는 이들이 다른 항체에 의해 오염되지 않은 채로 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 수식어구 "모노클로날"은 임의의 특정한 방법을 통한 항체 제조가 필요하다는 의미로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 유용한 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 처음으로 기재되었던 하이브리도마 방법으로 제조할 수 있거나, 또는 박테리아, 진핵동물 또는 식물 세포에서 재조합 DNA 방법 [예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조]으로 제조할 수 있다. 또한, "모노클로날 항체"는, 예를 들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol . Biol., 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 파지 (phage) 항체 라이브러리로부터 단리할 수도 있다.
본원에서의 모노클로날 항체에는 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되었거나 특정한 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성이 있으며, 상기 쇄의 나머지 부분은 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 다른 종으로부터 유래되었거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 뿐만 아니라, 상기 항체 단편의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성이 있는 "키메라" 항체가 포함된다 (미국 특허 제4,816,567호; 및 문헌 [Morrison et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81:6851-6855 (1984)] 참조). 본원에서 대상 키메라 항체로는 비-인간 영장류 (예를 들어, 구세계 원숭이, 유인원 등)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화" 항체가 있다.
"온전한" 항체는 항원 결합 부위뿐만 아니라 CL 및 적어도 중쇄 불변 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 항체이다. 이러한 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 온전한 항체는 하나 이상의 이펙터 기능을 갖는 것이 바람직하다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 일부, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 영역 또는 그의 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디 (diabody); 선형 항체 (미국 특허 제5,641,870호의 실시예 2, [Zapata et al., Protein Eng . 8(10):1057-1062 (1995)] 참조); 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편들로부터 형성된 다중 특이적 항체가 있다.
항체를 파파인으로 절단하면 "Fab" 단편이라고 불리는 두 개의 동일한 항원-결합 단편 및 나머지 "Fc" 단편 (이러한 명칭은 용이하게 결정화되는 능력을 반영함)이 생성된다. Fab 단편은 H쇄의 가변 영역 도메인 (VH) 및 한 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)과 L쇄 전체로 구성된다. 각 Fab 단편은 항원 결합에 대해 1가, 즉 단일 항원-결합 부위를 갖는다. 항체의 펩신 처리는 2가 항원-결합 활성을 나타내는, 2개의 디술피드 결합된 Fab 단편에 대충 상응하며, 항원을 여전히 가교결합할 수 있는 커다란 단일 F(ab')2 단편을 생성시킨다. 또한, Fab' 단편은 항체 힌지 (hinge) 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인이 존재하는 것을 비롯하여 CH1 도메인의 카르복시-말단에 수개의 잔기가 추가로 부가되어 있다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. 본원에서, Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기에 유리 티올 기를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래, Fab' 단편들 사이에 힌지 시스테인이 있는, Fab' 단편들의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 기타 화학적 커플링 또한 공지되어 있다.
Fc 단편은 디술피드 결합에 의해 함께 결합되어 있는 H쇄 두개 모두의 카르복시-말단 부분을 포함한다. 항체의 이펙터 기능은 Fc 영역의 서열에 의해 결정되는데, 이 영역은 특정 유형의 세포에서 발견되는 Fc 수용체 (FcR)에 의해 인식되는 부위이기도 하다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 부위 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 단편은 1개의 중쇄 가변 영역 도메인과 1개의 경쇄 가변 영역 도메인이 비공유결합으로 서로 단단하게 연결되어 있는 이량체로 구성된다. 이들 두 도메인이 폴딩되어 6개의 초가변 루프 (H쇄 및 L쇄로부터 각각 3개의 루프)가 형성되는데, 상기 루프는 항원 결합을 위한 아미노산 잔기를 제공하고 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 1개의 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 CDR을 단지 3개만 포함하는 Fv의 절반)일지라도 전체 결합 부위보다 친화성이 낮긴 하지만 항원을 인식하고 결합할 수 있는 능력을 갖고 있다.
"sFv" 또는 "scFv"로도 약칭되는 "단일쇄 Fv"는 단일 폴리펩티드 쇄로 연결되어 있는 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. sFv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있도록 해주는, VH 도메인과 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. sFv의 개관을 위해서는 문헌 [Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)] 및 [Borrebaeck 1995, 하기 문헌]을 참조한다.
용어 "디아바디"는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 짧은 링커 (약 5 내지 10개의 잔기)가 있는 sFv 단편 (상기 단락 참조)을 제작하여 V 도메인들의 쇄내 페어링이 아닌 쇄간 페어링을 형성시킴으로써 2가 단편, 즉 2개의 항원-결합 부위가 있는 단편을 생성시켜 제조한 작은 항체 단편을 의미한다. 이중특이적 디아바디는 2개 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인이 상이한 폴리펩티드 쇄에 존재하는 2개의 "가교" sFv 단편으로 구성된 이종이량체이다. 디아바디는 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:6444-6448 (1993)]에 더욱 상세하게 기재되어 있다.
비-인간 (예를 들어, 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 항체로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역의 잔기가 원하는 항체 특이성, 친화성 및 능력을 보유하는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류 등의 비-인간 종 (공여 항체)의 초가변 영역의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용 항체)이다. 몇몇 경우에서는, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체한다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체 또는 공여 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더 증대시킨다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 통상적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것인데, 여기서 전체 또는 실질적으로 전체 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 초가변 루프에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 FR이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc) 중 적어도 일부, 통상적으로는 인간 이뮤노글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)], [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)] 및 [Presta, Curr . Op. Struct . Biol . 2:593-596 (1992)]을 참조한다.
"종-의존성 항체", 예를 들어, 포유동물 항-인간 IgE 항체는 제1 포유동물 종으로부터의 항원에 대한 결합 친화성이 제2 포유동물 종으로부터의 항원의 상동체에 대한 결합 친화성 보다 더 강한 항체이다. 통상적으로, 종-의존성 항체는 인간 항원에 "특이적으로 결합" (즉, 결합 친화성 (Kd) 값이 단지 약 1 ×10-7 M, 바람직하게는 단지 약 1 ×10-8 M, 가장 바람직하게는 단지 약 1 ×10-9 M임)하지만, 제2의 비-인간 포유동물 종으로부터의 항원의 상동체에 대한 결합 친화성은 인간 항원에 대한 결합 친화성 보다 약 50배 이상 또는 약 500배 이상 또는 약 1,000배 이상 더 약하다. 종-의존성 항체는 상기에서 정의된 바와 같은 다양한 유형의 항체 중 임의의 항체일 수 있으나, 바람직하게는 인간화 항체 또는 인간 항체이다.
"IL-17A/F 결합 올리고펩티드"는 본원에 기재한 바와 같은 IL-17A/F 폴리펩티드에, 바람직하게는 특이적으로 결합하는 올리고펩티드이다. IL-17A/F 결합 올리고펩티드는 공지된 올리고펩티드 합성법을 사용하여 화학적으로 합성할 수도 있고 또는 재조합 기술을 사용하여 제조 및 정제할 수도 있다. 통상적으로, IL-17A/F 결합 올리고펩티드의 길이는 아미노산 약 5개 이상, 다르게는 약 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 76개, 77개, 78개, 79개, 80개, 81개, 82개, 83개, 84개, 85개, 86개, 87개, 88개, 89개, 90개, 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개 또는 100개 이상이며, 이러한 올리고펩티드는 본원에 기재한 바와 같은 IL-17A/F 폴리펩티드에, 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있다. IL-17A/F 결합 올리고펩티드는 공지된 기술을 사용하여 과도한 실험 없이 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고펩티드에 대한 올리고펩티드 라이브러리의 스크리닝 기술이 당업계에 공지되어 있음을 주지한다 (예를 들어, 미국 특허 제5,556,762호, 동 제5,750,373호, 동 제4,708,871호, 동 제4,833,092호, 동 제5,223,409호, 동 제5,403,484호, 동 제5,571,689호, 동 제5,663,143호, PCT 공개공보 WO 84/03506 및 W0 84/03564, [Geysen et al., Proc . Natl. Acad . Sci . U.S.A., 81:3998-4002 (1984)], [Geysen et al., Proc . Natl . Acad. Sci . U.S.A., 82:178-182 (1985)], [Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)], [Geysen et al., J. Immunol . Meth ., 102:259-274 (1987)], [Schoofs et al., J. Immunol ., 140:611-616 (1988)], [Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 87:6378], [Lowman, H. B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832], [Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352:624], [Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol . Biol ., 222:581], [Kang, A. S. et al. (1991) Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 88:8363] 및 [Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol ., 2:668] 참조).
"IL-17A/F 결합 유기 분자"는 본원에 기재한 바와 같은 IL-17A/F 폴리펩티드에, 바람직하게는 특이적으로 결합하는, 본원에서 정의한 바와 같은 올리고펩티드 또는 항체가 아닌 유기 분자이다. IL-17A/F 결합 유기 분자는 공지된 방법을 이용하여 확인하고 화학적으로 합성할 수 있다 (예를 들어, PCT 공개공보 WO 00/00823 및 WO 00/39585 참조). 통상적으로, IL-17A/F 결합 유기 분자의 크기는 약 2,000 달톤 미만, 다르게는 약 1,500 달톤, 750 달톤, 500 달톤, 250 달톤 또는 200 달톤 미만이며, 본원에 기재한 바와 같은 IL-17A/F 폴리펩티드에 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있는 이러한 유기 분자는 공지된 기술을 사용하여 과도한 시행착오 없이 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 결합할 수 있는 분자에 대한 유기 분자 라이브러리를 스크리닝하는 기술은 당업계에 공지되어 있음을 주지한다 (예를 들어, PCT 공개공보 WO 00/00823 및 WO 00/39585 참조).
대상 항원, 예를 들어, 종양-관련 폴리펩티드 항원 표적에 "결합"하는 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자는 상기 항원에 충분한 친화성으로 결합하여, 상기 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자는 상기 항원을 발현하는 세포 또는 조직의 표적화에 진단제 및(또는) 치료제로서 유용하고 다른 단백질과 유의하게 가교반응하지 않는다. 이러한 실시양태에서, 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자와 "비-표적" 단백질과의 결합 정도는 형광 활성화 세포 분류법 (FACS) 분석 또는 방사성면역침전법 (RIA)으로 측정한 상기 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자와 그의 특정 표적 단백질과의 결합의 약 10％ 미만일 것이다. 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자의 표적 분자로의 결합과 관련하여, 용어 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 대한 "특이적 결합," "그에 특이적으로 결합하는" 또는 "그에 특이적인"은 비-특이적 상호작용과 측정가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어, 분자의 결합을 일반적으로 결합 활성을 보유하지 않는 유사한 구조의 분자인 조절 분자의 결합과 비교하여 결정함으로써 측정할 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적, 예를 들어, 과량의 비표지된 표적과 유사한 조절 분자와의 경쟁에 의해 측정할 수 있다. 이 경우에, 프로브에 대한 표지된 표적의 결합이 과량의 비표지된 표적에 의해 경쟁적으로 억제되는 경우에 특이적 결합이 나타난다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상의 에피토프에 대한 "특이적 결합," "그에 특이적으로 결합하는" 또는 "그에 특이적인"은 예를 들어, 표적에 대한 Kd가 약 10-4 M 이상, 다르게는 약 10-5 M 이상, 다르게는 약 10-6 M 이상, 다르게는 10-7 M 이상, 다르게는 약 10-8 M 이상, 다르게는 약 10-9 M 이상, 다르게는 약 10-10 M 이상, 다르게는 약 10-11 M 이상, 다르게는 약 10-12 M 이상, 또는 그 이상인 분자에 의해 나타낼 수 있다. 한 실시양태에 있어서, 용어 "특이적 결합"은 분자가 임의의 다른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 에피토프에 대해 실질적으로 결합하지 않으면서 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 결합을 의미한다.
"IL-17A/F 폴리펩티드를 발현하는 종양 세포의 성장을 억제하는" 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자 또는 "성장억제" 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자는 적절한 IL-17A/F 폴리펩티드를 발현하거나 과발현하는 암세포에 결합하여 측정가능하게 성장을 억제하는 것이다. 바람직한 성장억제성 항-IL-17A/F 항체, 올리고펩티드 또는 유기 분자는 적절한 대조군에 비해 IL-17A/F-발현 종양 세포의 성장을 20％ 초과, 바람직하게는 약 20％ 내지 약 50％, 훨씬 더 바람직하게는 50％ 초과 (예를 들어, 약 50％ 내지 약 100％) 억제하며, 여기서 대조군은 통상적으로 시험될 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자로 처치하지 않은 종양 세포이다. 한 실시양태에서, 성장억제는 세포 배양물 중에서 약 0.1 내지 30 ㎍/ml 또는 약 0.5 nM 내지 200 nM의 항체 농도에서 측정할 수 있는데, 이때 성장억제는 종양 세포를 항체에 노출시키고 1 내지 10일 후 측정한다. 생체내 종양 세포의 성장억제는 다양한 방법으로 측정할 수 있다. 체중 1 kg 당 약 1 ㎍ 내지 약 100 mg의 항-IL-17A/F 항체를 투여했을 때 항체의 1차 투여로부터 약 5일 내지 3개월, 바람직하게는 약 5일 내지 30일 이내에 종양 크기 또는 종양 세포의 증식이 감소되는 경우, 상기 항체는 생체내에서 성장억제 효과를 나타낸다고 한다.
"아폽토시스 (apoptosis)를 유도하는" 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자는 아넥신 V의 결합, DNA의 단편형성 (fragmentation), 세포 수축, 소포체의 팽창, 세포 단편형성 및(또는) 막 소포 (아폽토시스체로 불림)의 형성으로 측정되는 바와 같이 계획된 세포 사멸을 유도하는 것이다. 통상적으로, 이러한 세포는 IL-17A/F 폴리펩티드를 과발현하는 세포이다. 바람직하게는, 상기 세포는 종양 세포, 예를 들어, 전립선 종양 세포, 유방 종양 세포, 난소 종양 세포, 위 종양 세포, 자궁내막 종양 세포, 폐 종양 세포, 신장 종양 세포, 결장 종양 세포, 방광 종양 세포이다. 다양한 방법을 이용하여 아폽토시스와 연관된 세포 반응을 평가할 수 있다. 예를 들어, 포스파티딜 세린 (PS) 전위는 아넥신 결합에 의해 측정할 수 있고, DNA 단편형성은 DNA 래더링 (laddering)을 통해 평가할 수 있으며, DNA 단편형성과 함께 일어나는 핵/염색질 응집은 하이포디플로이드 (hypodiploid) 세포의 임의의 증가에 의해서 확인할 수 있다. 바람직하게는, 아폽토시스를 유도하는 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자는 아넥신 결합 분석에서 비처리 세포에 비해 아넥신 결합을 약 2 내지 50배, 바람직하게는 약 5 내지 50배, 가장 바람직하게는 약 10 내지 50배만큼 유도하는 것이다.
항체의 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 말하고, 항체 이소타입에 따라 달라진다. 항체 이펙터 기능의 예로는 C1q 결합; 보체-의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 대식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절 및 B 세포 활성화가 있다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정한 세포독성 세포 (예를 들어, 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)에 결합된 분비 Ig가 이들 세포독성 이펙터 세포가 항원을 보유하는 표적 세포에 특이적으로 결합한 후, 상기 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성 형태를 의미한다. 항체는 세포독성 세포의 "무기"이고 이러한 세포 사멸에 절대적으로 필요하다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII 만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu . Rev. Immunol . 9:457-92 (1991)]의 464쪽의 표 3에 요약되어 있다. 대상 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, 미국 특허 제5,500,362호 또는 동 제5,821,337호에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 분석을 수행할 수 있다. 이러한 분석에 유용한 이펙터 세포에는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포가 포함된다. 별법으로 또는 추가로, 대상 분자의 ADCC 활성은 문헌 [Clynes et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA. 95:652-656 (1998)] 등에 개시된 바와 같은 동물 모델 등에서 생체내 평가할 수 있다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역과 결합되는 수용체를 의미한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체와 결합하는 수용체 (감마 수용체)이고, 이것으로는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체가 포함되는데, 이는 이들 수용체의 대립유전자 변이체와 다르게 스플라이싱된 형태를 포함한다. FcγRII 수용체에는 주로 그의 세포질 도메인이 여러가지 유사한 아미노산 서열을 갖는, FcγRIIA ("활성화 수용체")와 FcγRIIB ("억제 수용체")가 포함된다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기재의 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기재의 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 (개관을 위해서는 문헌 [M. Daeron, Annu . Rev. Immunol . 15:203-234 (1997)]을 참조). FcR에 대한 개관을 위해서는 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu . Rev. Immunol . 9:457-492 (1991)], [Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)] 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin . Med . 126:330-41 (1995)]을 참조한다. 추후로 확인될 것을 포함하는 기타 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포함된다. 상기 용어에는 모체 IgG를 태아에게 전달시키는 신생아 수용체 FcRn도 포함된다 ([Guyer et al., J. Immunol . 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol . 24:249 (1994)]).
"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 이러한 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하고 ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예로는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 있지만, PBMC와 NK 세포가 바람직하다. 이펙터 세포는 천연 공급원, 예를 들어, 혈액으로부터 단리할 수 있다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재하에서의 표적 세포의 용해를 의미한다. 고전적인 보체 활성화 경로는 보체의 동종 항원과 결합한 (적절한 서브클래스의) 항체에 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)이 결합됨으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, 예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 분석을 수행할 수 있다.
본원에 사용된 단어 "표지"는 항체에 직접 또는 간접적으로 접합되어 "표지된" 항체를 생성시키는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체가 검출가능한 것 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지)일 수 있거나 효소 표지의 경우 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변화를 촉매할 수 있다.
"고상 (solid phase)"은 본 발명의 항체가 접착될 수 있는 비수성 매트릭스를 의미한다. 본원에 포함되는 고상의 예로는 부분적으로 또는 완전하게 유리 (예를 들어, 조절된 공극 유리)로 형성된 고상, 다당류 (예를 들어, 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘이 포함된다. 특정 실시양태에서, 내용에 따라 고상은 분석용 플레이트의 웰을 포함할 수 있으며, 다른 실시양태에서 고상은 정제용 컬럼 (예를 들어, 친화성 크로마토그래피 컬럼)이다. 이 용어는 또한 미국 특허 제4,275,149호에 기재된 것과 같은 별개 입자의 비연속적 고상도 포함한다.
"리포좀"은 약물 (예를 들어, IL-17A/F 폴리펩티드 또는 그에 대한 항체)을 포유동물에게 전달하는데 유용한 여러 유형의 지질, 인지질 및(또는) 계면활성제로 구성된 소형 소포이다. 통상적으로, 리포좀의 성분들은 생체막의 지질 배열과 유사한 이중층 형태로 배열되어 있다.
"소분자"는 본원에서 분자량이 약 500 달톤 미만인 것으로 정의된다.
용어 "조절하다"는 신호전달 경로의 수준에 영향을 미치는 것 (예를 들어, 상향조절하거나, 하향조절하거나, 또는 다른 방식으로 제어하는 것)을 의미한다. 신호전달의 제어하의 세포 프로세스에는 특정 유전자의 전사, 정상 세포 기능, 예를 들어, 대사, 증식, 분화, 접착, 아팝토시스 및 생존 뿐만 아니라, 비정상적 프로세스, 예를 들어, 형질전환, 분화의 차단 및 전이가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원의 목적상, "활성의" 또는 "활성"은 천연 또는 자연 발생적인 IL-17A/F 폴리펩티드의 생물학적 및(또는) 면역학적 활성을 보유하는 IL-17A/F 폴리펩티드의 형태(들)를 의미하는데, 여기서 "생물학적" 활성이란 천연 또는 자연 발생적인 IL-17A/F 폴리펩티드에 있는 항원성 에피토프에 대한 항체 제조를 유도하는 능력이 아니라, 천연 또는 자연 발생적인 IL-17A/F 폴리펩티드에 의한 생물학적 기능 (억제 기능 또는 자극 기능)을 말하며, "면역학적" 활성이란 천연 또는 자연 발생적인 IL-17A/F 폴리펩티드에 있는 항원성 에피토프에 대한 항체 제조를 유도하는 능력을 의미한다. 한 바람직한 생물학적 활성은 NF의 활성화 및 전염증성(proinflammatory) 케모카인 IL-8 및 IL-6의 제조의 자극을 유도하는 것을 포함한다. 또다른 바람직한 생물학적 활성은 말초혈 단핵 세포 또는 CD4+ 세포의 자극을 포함한다. 또다른 바람직한 생물학적 활성은 T-림프구의 증식을 자극시키는 것을 포함한다. 또다른 바람직한 생물학적 활성은, 예를 들어, THP1 세포로부터 TNF-α의 방출을 포함한다. 또다른 활성은 관절 연골에서 매트릭스 합성의 향상을 포함한다. 별법으로, 또다른 활성은 관절 연골 매트릭스의 파괴를 증대시키는 것 뿐만 아니라, 매트릭스 합성을 억제하는 것을 포함한다. 또다른 바람직한 생물학적 활성은 염증성 장 질환의 경도에서 중증도로의 단계 동안 또는 뇌졸중 동안 인터루킨-17 신호전달 경로의 수준을 조절하는 것을 포함한다.
"면역학적" 활성이란 단지 천연 또는 자연 발생적인 IL-17A/F 폴리펩티드에 있는 항원성 에피토프에 대한 항체 제조를 유도하는 능력을 의미한다.
"퇴행성 연골 장애"는 주로 연골 매트릭스의 파괴에 의해 특성화된 장애의 군을 의미한다. 추가의 병상으로는 산화질소 생산 및 상승된 프로테오글리칸 파괴를 포함한다. 이러한 정의에 포함되는 대표적인 장애로는, 예를 들어, 관절염 (예를 들어, 골관절염, 류마티스성 관절염, 건선 관절염)을 들 수 있다.
용어 "면역 관련 질환"은 포유동물의 면역체계 성분이 포유동물에서 이환상태를 야기시키거나, 매개하거나 또는 다른 방식으로 기여하는 질환을 의미한다. 또한, 상기 질환에는 면역 반응의 자극 또는 개입이 질환의 진행에 대해 개선 효과를 갖는 질환이 포함된다. 이러한 용어에는 면역-매개 염증성 질환, 비-면역-매개 염증성 질환, 감염성 질환, 면역결핍 질환, 종양 등이 포함된다.
용어 "T 세포-매개 질환"은 T 세포가 포유동물에서 이환상태를 직접 또는 간접적으로 매개하거나, 다른 방식으로 기여하는 질환을 의미한다. T 세포-매개 질환은 세포 매개 작용, 림포카인 매개 작용 등, 및 심지어 B 세포가 예를 들어, T 세포에 의해 분비된 림포카인에 의해 자극될 경우 B 세포와 관련된 작용과도 관련이 있을 수 있다.
본 발명에 따라 치료될 수 있고, 그들 중 일부는 면역 또는 T 세포-매개 면역 관련 및 염증성 질환의 예로는 전신성 홍반 루푸스, 류마티스성 관절염, 유년형 만성 관절염, 척추관절증, 전신성 경화증 (경피증), 특발성 염증성 근병증 (피부근염, 다발성근염), 쇼그렌 증후군, 전신성 맥관염, 유육종증, 자가면역 용혈성 빈혈 (면역성 범혈구 감소증, 발작성 야간혈색소뇨증), 자가면역 혈소판 감소증 (특발성 혈소판감소자반증, 면역-매개 저혈소판증), 갑상선염 (그레이브병, 하시모토 갑상선염, 유년형 림프구성 갑상선염, 위축성 갑상선염), 진성 당뇨병, 면역-매개 신장 질환 (사구체신염, 세뇨관간질신염), 중추 및 말초 신경계의 탈수초성 질환, 예를 들어, 다발성 경화증, 특발성 탈수초성 다발성 신경병증 또는 길랑-바레 증후군, 및 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 간담즙성 질환, 예를 들어, 감염성 간염 (A, B, C, D, E형 간염 및 다른 비-간친화성 바이러스), 자가면역 만성 활성 간염, 원발성 담즙 간경변, 육아종성 간염, 및 경화성 담관염, 염증성 장 질환 (궤양성 대장염, 크론병), 글루텐 민감성 장질환, 및 휘플병, 수포성 피부 질환, 다형성 홍반 및 접촉성 피부염을 비롯한 자가면역 또는 면역-매개 피부 질환, 건선, 알레르기성 질환, 예를 들어, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 음식물 과민증 및 두드러기, 폐의 면역 질환, 예를 들어, 호산구성 폐렴, 특발성 폐섬유증 및 과민성 폐렴, 이식편 거부반응 및 이식편 대 숙주 질환을 비롯한 이식 관련 질환을 들 수 있다. 또한 바이러스성 질환, 예를 들어, AIDS (HIV 감염), A, B, C, D 및 E형 간염, 허피스 등, 세균성 감염, 진균 감염, 원충 감염 및 기생충 감염을 비롯한 감염성 질환이 포함된다. 용어 "유효량"은 특정 언급된 목적을 수행하기 위한 IL-17A/F 폴리펩티드 및(또는) 효능제/길항제의 농도 또는 양이다. IL-17A/F 폴리펩티드 또는 그의 효능제 또는 길항제의 "유효량"은 실험적으로 결정될 수 있다. 또한, "치료상 유효량"은 언급한 치료적 효과를 수행하기에 효과적인 IL-17A/F 폴리펩티드 및(또는) 효능제/길항제의 농도 또는 양이다. 이러한 양 또한 실험적으로 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방해하고(하거나) 세포의 파괴를 유발하는 물질을 의미한다. 이러한 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, I131, I125, Y90 및 Re186), 화학요법제 및 독소, 예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물에서 기원된 효소 활성 독소 또는 이들의 단편을 포함한다.
"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예로는 아드리아마이신, 독소루비신, 에피루비신, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노시드 ("Ara-C"), 시클로포스파미드, 티오테파, 부술판, 시톡신, 탁소이드류, 예를 들어, 파클리탁셀 (탁솔 (Taxol), 미국 뉴저지주 프린스톤 소재의 브리스톨마이어스 스퀴브 온콜로지 (Bristol-Myers Squibb Oncology) 제품) 및 독세탁셀 (탁소테레 (Taxotere), 프랑스 앙토니 소재 롱플랑 로레아 (Rhone-Poulenc Rorer) 제품), 톡소테레, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포시드, 이포스파미드, 미토마이신 C, 미톡크산트론, 빈크리스틴, 비노렐빈, 카르보플라틴, 테니포시드, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신, 에스페라미신 (미국 특허 제4,675,187호 참조), 멜팔란 및 다른 관련 질소 머스타드류가 포함된다. 또한, 타목시펜 및 오나프리스톤과 같이 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 호르몬 제제도 상기 화학요법제의 정의에 포함된다.
본원에서 사용된 "성장억제제"는 시험관내 또는 생체내에서 세포, 특히 본원에서 확인된 임의의 유전자를 발현하는 암세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 따라서, 성장억제제는 S-기에서의 이러한 유전자 발현 세포의 비율(％)을 상당히 감소시키는 것일 수 있다. 성장억제제의 예로는 세포 주기 진행을 (S-기 이외의 시기에서) 차단하는 작용제, 예를 들어, G1 정지 및 M-기 정지를 유도하는 작용제가 있다. 종래의 M-기 차단제로는 빈카스 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁솔 및 토포 II 억제제, 예를 들어, 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신이 있다. G1 정지 여파로 S-기 정지를 초래하는 작용제의 예로는 DNA 알킬화제, 예를 들어, 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로르에타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C가 있다. 보다 자세한 정보는 문헌 [Murakami et al., The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" (WB Saunders: Philadelphia, 1995), Chapter 1, 특히 13쪽]에서 찾을 수 있다.
용어 "사이토카인"은 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 일반 용어로서 다른 세포 상에서 세포간 매개자로서 작용한다. 이러한 사이토카인의 예는 림포킨, 모노킨 및 통상적인 폴리펩티드 호르몬이다. 사이토카인으로는 성장 호르몬, 예를 들어, 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예를 들어, 여포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 및 황체형성 호르몬 (LH); 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프롤락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-α및 -β; 뮬러리안-억제 물질; 마우스 생식선자극호르몬 관련 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장 인자, 예를 들어, NGF-β; 혈소판-성장 인자; 형질전이 성장 인자 (TGF), 예를 들어, TGF-α및 TGF-β; 인슐린 유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도성 인자; 인터페론, 예를 들어, 인터페론-α, -β 및 -γ; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어, 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터루킨 (IL), 예를 들어, IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 또는 IL-17; 종양 괴사 인자, 예를 들어, TNF-α및 TNF-β; 및 백혈병 억제 인자 (LIF) 및 키트 리간드 (KL)를 비롯한 기타 폴리펩티드 인자가 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 사이토카인은 천연 공급원으로부터 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 천연 서열 사이토카인의 생물학적 활성 등가물을 포함한다.
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II. 본 발명의 조성물 및 방법
A. 전장 IL-17A/F 폴리펩티드
본 발명은 본원에서 IL-17A/F 폴리펩티드로 지칭된 폴리펩티드를 코딩하는, 새로이 동정되고 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 하기 실시예에 보다 상세하게 개시한 바와 같이, 다양한 IL-17A/F 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 동정하고 단리하였다.
B. IL-17A/F 폴리펩티드 변이체
본원에 기재된 전장 천연 서열 IL-17A/F 폴리펩티드 외에도, IL-17A/F 변이체를 제조할 수 있는 것으로 생각된다. IL-17A/F 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 IL-17A/F DNA에 도입하고(거나) 원하는 IL-17A/F 폴리펩티드를 합성함으로써 제조될 수 있다. 당업자라면 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변화 또는 막 앵커링 특성의 변화와 같은 아미노산 변화가 IL-17A/F의 번역후 프로세싱을 변화시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본원에 기재된 전장 천연 서열 IL-17A/F 또는 IL-17A/F의 다양한 도메인에서의 변이는, 예를 들어, 미국 특허 제5,364,934호에 개시된 보존적 및 비보존적 돌연변이화에 대한 기술 및 안내를 이용하여 제조할 수 있다. 변이는 IL-17A/F를 코딩하는 하나 이상의 코돈을 치환, 결실 또는 삽입함으로써 천연 서열 IL-17A/F과 비교시 IL-17A/F의 아미노산 서열을 변화시키는 것일 수 있다. 임의로는, 변이는 IL-17A/F의 하나 이상의 도메인 내에서 하나 이상의 아미노산을 임의의 다른 아미노산으로 치환함으로써 생성된다. 원하는 활성에 유해한 영향을 끼치지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는 아미노산 잔기는, IL-17A/F의 서열을 공지된 상동성 단백질 분자의 서열과 비교하여 상동성이 높은 영역에서 생성된 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 결정할 수 있다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조 및(또는) 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환한 것 (예컨대, 류신을 세린으로 치환함), 즉 보존적 아미노산 치환의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 임의로 약 1 내지 5개 범위의 아미노산에서 발생할 수 있다. 허용되는 변이는 서열 내에 아미노산을 체계적으로 삽입, 결실 또는 치환시켜 생성된 변이체를 전장 또는 성숙한 천연 서열에 의해 나타났던 활성에 대해 시험함으로써 결정할 수 있다.
본원은 IL-17A/F 폴리펩티드 단편들을 제공한다. 예를 들어, 전장 천연 단백질과 비교하는 경우, 이 단편들은 N-말단 또는 C-말단이 절단되거나 내부 잔기가 결손된 것일 수 있다. 특정 단편은 IL-17A/F 폴리펩티드의 원하는 생물학적 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 결손되어 있다.
IL-17A/F 단편은 다수의 통상적인 기술 중 어느 하나에 의해 제조될 수 있다. 원하는 펩티드 단편은 화학적으로 합성될 수 있다. 다른 접근법으로는 효소에 의한 분해, 예를 들어 이 단백질을 특정 아미노산 잔기에 의해 지정된 부위에서 단백질을 절단하는 것으로 알려진 효소로 처리함으로써, 또는 이 DNA를 적합한 제한 효소로 잘라 원하는 단편을 단리함으로써 IL-17A/F 단편을 생성하는 단계를 포함한다. 또다른 적합한 기술은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 원하는 폴리펩티드 단편을 코딩하는 DNA 단편을 단리하고 증폭하는 단계를 포함한다. DNA 단편의 원하는 말단부를 지정하는 올리고뉴클레오티드는 PCR에서 5' 및 3' 프라이머로 사용된다. 바람직하게는, IL-17A/F 폴리펩티드 단편은 본원에서 개시된 천연 IL-17A/F 폴리펩티드와 하나 이상의 생물학적 및(또는) 면역학적 활성을 공유한다.
특정 실시양태에서, 관심 대상의 보존적 치환은 바람직한 치환이라는 표제로 표 6에 나타내었다. 이와 같은 치환에 의해 생물학적 활성이 변화하는 경우에는, 하기 표 6에서 치환예로서 명명되거나 아미노산 클래스에 대해서 하기에 보다 상세하게 설명한 바와 같은 보다 실질적인 변화를 도입하고 생성물을 스크리닝하였다.
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IL-17A/F 폴리펩티드의 기능 또는 면역학적 동일성의 실질적인 변형은 (a) 치환 영역에서의 폴리펩티드 주쇄의 구조를, 예를 들어 시트 또는 나선 형태로 유지하거나, (b) 표적 부위에서 분자의 전햐량 또는 소수성을 유지하거나, 또는 (c) 측쇄의 용적을 유지하는데 끼치는 효과가 유의하게 상이한 치환을 선택함으로써 수행된다. 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성을 기준으로 다음과 같은 군으로 분류한다:
(1) 소수성: 노르류신 (norleucine), met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 쇄 배위에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족; trp, tyr, phe.
비보존적 치환은 상기 한 클래스의 구성원을 다른 클래스의 것으로 교환하는 것이다. 또한, 이와 같이 치환되는 잔기는 보존적 치환 부위에 도입될 수 있거나, 보다 바람직하게는 나머지 (비보존) 부위에 도입될 수 있다.
변이는 올리고뉴클레오티드 매개된 (부위 지정 (site-directed)) 돌연변이 유발법, 알라닌 스캐닝법 (scanning) 및 PCR 돌연변이 유발법과 같은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 부위 지정 돌연변이 유발법 (문헌 [Carter et al., Nucl . Acids Res., 13:4331 (1986)]; [Zoller et al., Nucl . Acids Res., 10:6487 (1987)]), 카세트 돌연변이 유발법 (문헌 [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)]), 제한 선택 돌연변이 유발법 (문헌 [Wells et al., Philos . Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)]) 또는 다른 공지의 기술을 클로닝된 DNA 상에서 실시하여 IL-17A/F 변이체 DNA를 제조할 수 있다.
또한, 스캐닝 아미노산 분석법을 이용하여 인접 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을 확인할 수 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산은 비교적 작은 중성 아미노산이다. 이러한 아미노산으로는 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인이 있다. 통상적으로, 이 중에서 알라닌이 베타-탄소 밖의 측쇄를 제거하고 변이체의 주쇄 배치를 변화시킬 가능성이 적기 때문에 바람직한 스캐닝 아미노산이다 (문헌 [Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]). 또한, 알라닌은 통상적으로 가장 흔한 아미노산이기 때문에 바람직하다. 또한, 알라닌은 함입된 위치 및 노출된 위치 모두에서 흔히 발견된다 (문헌 [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman ＆ Co., N.Y.)]; [Chothia, J. Mol . Biol ., 150:1 (1976)]). 알라닌 치환이 적당한 양의 변이체를 생성시키지 않으면, 동배체 (isoteric) 아미노산을 사용할 수 있다.
C. IL-17A/F의 변형
IL-17A/F의 공유결합적 변형은 본 발명의 범위에 포함된다. 공유결합적 변형의 한 유형은 IL-17A/F 폴리펩티드의 선택된 측쇄 또는 N-말단 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 IL-17A/F 폴리펩티드의 표적화된 아미노산 잔기를 반응시키는 것을 포함한다. 이관능성 제제를 사용한 유도체화는 예를 들어, 항-IL-17A/F 항체의 정제 방법에 사용하기 위한 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 IL-17A/F를 가교결합시키거나 그 반대로 가교결합시키는데 유용하다. 공통적으로 사용되는 가교결합제로는, 예를 들어 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어, 4-아지도살리실산과의 에스테르, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 포함하는 동종이관능성 이미도에스테르, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이관능성 말레이미드 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 제제가 있다.
다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화 (문헌 [T.E. Creighton, Proteins:Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman ＆ Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)]), N-말단 아민의 아세틸화 및 C-말단 카르복실기의 아미드화를 포함한다.
본 발명의 범위에 포함되는 IL-17A/F 폴리펩티드의 공유결합적 변형의 다른 유형은 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴의 변화를 포함한다. 본원의 목적상 "천연 글리코실화 패턴의 변화"는 천연 서열 IL-17A/F에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실 (밑줄친 글리코실화 부위를 제거하거나 화학적 및(또는) 효소에 의한 수단에 의해 글리코실화를 결실시킴) 및(또는) 천연 서열 IL-17A/F에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 첨가를 의미한다. 또한, 이 어구는 존재하는 다양한 탄수화물 잔기의 특성 및 비율의 변화를 비롯한 천연 단백질의 글리코실화에 있어서의 질적인 변화를 포함한다.
IL-17A/F 폴리펩티드에 대한 글리코실화 부위의 첨가는 아미노산 서열을 변화시킴으로써 달성될 수 있다. 이러한 변화는 예를 들어, 천연 서열 IL-17A/F에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 첨가 또는 치환시켜 이루어질 수 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우). 임의로, IL-17A/F 아미노산 서열은 특히 원하는 아미노산으로 번역되는 코돈이 생성되도록 IL-17A/F 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 미리 선택된 염기에서 돌연변이화시킴으로써, DNA 수준의 변화를 통해 변화시킬 수 있다.
IL-17A/F 폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 잔기의 수를 증가시키는 다른 수단은 글리코시드를 폴리펩티드에 화학적으로 또는 효소에 의한으로 커플링시키는 것이다. 이러한 방법은 예를 들어, 1987년 9월 11일자로 공개된 WO 87/05330 및 문헌 [Aplin and Wriston, CRC Crit . Rev. Biochem ., pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.
IL-17A/F 폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 잔기의 제거는 화학적으로 또는 효소에 의한으로 달성되거나 글리코실화에 대한 표적으로 사용하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이에 의한 치환으로 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys ., 259:52 (1987)] 및 [Edge et al., Anal. Biochem ., 118:131 (1981)]에 기재되어 있다. 폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 잔기의 효소에 의한 절단은 문헌 [Thotakura et al., Meth . Enzymol ., 138:350 (1987)]에 기재된 바와 같이 다양한 엔도글리코시다제 및 엑소글리코시다제를 사용하여 달성할 수 있다.
IL-17A/F의 공유결합적 변형의 다른 유형은 미국 특허 제4,640,835호, 동 제4,496,689호, 동 제4,301,144호, 동 제4,670,417호, 동 제4,791,192호 또는 동 제4,179,337호에 기재된 방식으로 다양한 비-단백질성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중의 하나에 IL-17A/F 폴리펩티드를 연결시키는 것을 포함한다.
또한, 본 발명의 IL-17A/F는 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 IL-17A/F를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방법으로 변형될 수도 있다.
한 실시양태에서, 이러한 키메라 분자는 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 IL-17A/F의 융합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 IL-17A/F의 아미노-말단 또는 카르복실-말단에 위치한다. 이와 같이 에피토프 태그가 부착된 형태의 IL-17A/F 폴리펩티드의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 도입하면 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 다른 유형의 친화성 매트릭스를 사용하는 친화성 정제법으로 IL-17A/F를 용이하게 정제할 수 있게 된다. 여러 가지 태그 폴리펩티드 및 이들의 각각의 항체는 당업계에 공지되어 있다. 그 예로는 폴리-히스티딘 (폴리-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (폴리-his-gly) 태그, flu HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5 (문헌 [Field et al., Mol . Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]), c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 (문헌 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3636 (1985)]) 및 허피스 단순 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체 (문헌 [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]) 등이 있다. 다른 태그 폴리펩티드로는 Flag-펩티드 (문헌 [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]), KT3 에피토프 펩티드 (문헌 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]), α-튜불린 에피토프 펩티드 (문헌 [Skinner et al., J. Biol . Chem ., 266:15163-15166 (1991)]) 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그 (문헌 [Lutz-Freyermuth et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 87:6393-6397 (1990)])가 있다.
다른 실시양태에서, 키메라 분자는 IL-17A/F와 이뮤노글로불린 또는 이뮤노글로불린의 특정 영역과의 융합체를 포함할 수 있다. 키메라 분자의 2 가 형태 ("이뮤노어드헤신"으로 지칭되기도 함)의 경우, 이러한 융합체는 IgG 분자의 Fc 영역과의 융합체일 수 있다. 상기 Ig 융합체는 바람직하게는 Ig 분자내에 존재하는 하나 이상의 가변 영역 위치에 IL-17A/F 폴리펩티드의 가용성 (결실 또는 불활성화된 막횡단 도메인) 형태가 치환되어 있는 것을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 이뮤노글로불린 융합체는 IgG1 분자의 힌지 (hinge), CH2 및 CH3 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 이뮤노글로불린 융합체를 생성하는 방법에 대해서는 1995년 6월 27일자로 허여된 미국 특허 제5,428,130호를 참조한다.
또다른 추가의 실시양태에서, 본 발명의 IL-17A/F 폴리펩티드는 류신 지퍼 (zipper)에 융합된 IL-17A/F 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방법으로 변형될 수도 있다. 다양한 류신 지퍼 폴리펩티드가, 예를 들어, 문헌 [Landschulz et al., Science, 240:1759 (1988)], WO 94/10308, 문헌 [Hoppe et al., FEBS Letters, 344:1991 (1994)] 및 문헌 [Maniatis et al., Nature, 341:24 (1989)]에 기재되어 있다. 용액 중의 가용성 IL-17A/F 폴리펩티드의 이량체화 및 삼량체화를 보조하기 위해, IL-17A/F 폴리펩티드에 융합된 류신 지퍼를 사용하는 것이 바람직할 수 있는 것으로 믿어진다. 당업자라면 류신 지퍼가 IL-17A/F 분자의 N-말단 또는 C-말단 중 어느 하나에 융합될 수 있음을 이해할 것이다.
D. IL-17A/F의 제조
하기의 설명은 주로 IL-17A/F 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염시킨 세포를 배양함으로써 IL-17A/F를 제조하는 방법에 관한 것이다. 물론, 당업계에 공지된 다른 방법을 이용하여 IL-17A/F를 제조할 수도 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, IL-17A/F 서열 또는 그의 부분들은 고상 기술을 이용하는 직접 펩티드 합성법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)], [Merrifield, J. Am. Chem . Soc ., 85:2149-2154 (1963)] 참조). 시험관내 단백질 합성은 수동 기술을 이용하거나 자동화에 의해 수행될 수 있다. 자동 합성법은, 예를 들어, 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems; 미국 캘리포니아주 포스터시티 소재)사의 펩티드 합성기를 제조업자의 지침에 따라 사용하여 수행할 수 있다. IL-17A/F의 다양한 부분들을 별도로 화학적으로 합성한 후, 화학적 또는 효소에 의한 방법을 이용하여 조합함으로써 전장 IL-17A/F를 제조할 수 있다.
1. IL-17A/F를 코딩하는 DNA의 단리
IL-17A/F를 코딩하는 DNA는 IL-17A/F mRNA를 보유하여 그를 검출가능한 수준으로 발현할 것이라 믿어지는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 그러므로, 하기 실시예에 기재된 바와 같이 인간의 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 인간 IL-17A/F DNA를 편리하게 얻을 수 있다. 또한, IL-17A/F 코딩 유전자는 게놈 라이브러리로부터 얻거나 공지된 합성 방법 (예를 들어, 자동 핵산 합성법)으로 얻을 수도 있다.
라이브러리는 관심 유전자 또는 그에 의해 코딩되는 단백질을 확인하기 위해 고안된 프로브 (예를 들어, IL-17A/F에 대한 항체 또는 약 20 내지 80개 이상의 염기로 구성된 올리고뉴클레오티드)로 스크리닝될 수 있다. 선택된 프로브를 사용하는 cDNA 또는 게놈 라이브러리의 스크리닝은, 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual (New York:Cold Spring Haror Laboratory Press, 1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법을 이용하여 수행될 수 있다. IL-17A/F 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 단리하기 위한 다른 방법은 PCR 방법을 이용하는 것이다 ([Sambrook et al., 상기 문헌]; [Dieffenbach et al., PCR Primer:A Laboratory Manual (Cold Spring Haror Laboratory Press, 1995)]).
하기 실시예는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 기술을 설명한다. 가양성 (flase positive) 결과를 최소화하기 위해서는, 프로브로서 선택된 올리고뉴클레오티드 서열이 충분한 길이를 갖고 충분히 분명한 서열이어야 한다. 올리고뉴클레오티드는 스크리닝되는 라이브러리에서 DNA와의 혼성화 시에 검출될 수 있도록 표지되는 것이 바람직하다. 표지 방법은 당업계에 공지되어 있고, 32P 표지된 ATP와 같은 방사성 표지, 비오틴화 또는 효소 표지의 사용을 포함한다. 중간정도의 엄격도 및 고엄격도를 비롯한 혼성화 조건은 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에서 제공된다.
이러한 라이브러리 스크리닝 방법에서 확인된 서열은 진뱅크 (GenBank)와 같은 공공 데이타베이스 또는 다른 민간 서열 데이타베이스에 등록되어 있고 입수가능한 다른 공지된 서열과 비교하고 정렬시킬 수 있다. 분자의 지정된 영역 내 또는 전장 서열에 걸친 서열 동일성 (아미노산 또는 뉴클레오티드 수준에서의 동일성)은 당업계에 공지된 방법 및 본원에 기재된 방법을 이용하여 결정될 수 있다.
단백질 코딩 서열을 갖는 핵산은 먼저 본원에 개시된 바와 같은 추정된 아미노산 서열을 사용하여 (또한, 필요하다면 전구체를 검출하기 위해 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 기재된 바와 같은 통상적인 프라이머 신장법을 이용함) 선별된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하고, cDNA로 역전사되지 않았을 수도 있는 mRNA의 중간체를 프로세싱하여 얻을 수 있다.
2. 숙주 세포의 선택 및 형질전환
숙주 세포는 IL-17A/F의 생산을 위해 본원에 기재된 발현 벡터나 클로닝 벡터로 형질감염 또는 형질전환되어, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭하는데 적절하도록 변형시킨 통상적인 영양 배지 중에서 배양된다. 당업자라면 과도한 시행착오 없이 배지, 온도, pH 등과 같은 배양 조건을 선택할 수 있다. 일반적으로, 세포 배양물의 생산성을 최대화하기 위한 원칙, 프로토콜 및 실시되는 기술은 문헌 [Mammalian Cell Biotechnology:A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991)] 및 [Sambrook et al., 상기 문헌]에서 찾아볼 수 있다.
진핵 세포의 형질감염 방법 및 원핵 세포의 형질전환 방법 (예를 들어, CaCl2, CaPO4, 리포좀-매개법 및 전기영동법)은 당업자에게 공지되어 있다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 이러한 세포에 적절한 표준 기술을 이용하여 수행된다. 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 기재된 바와 같이 염화칼슘을 사용하는 칼슘 처리법 또는 전기영동법은 일반적으로 원핵 세포에 대해 사용된다. 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 사용한 감염은 문헌 [Shaw et al., Gene, 23:315 (1983)] 및 1989년 6월 29일자로 공개된 WO 89/05859에 기재된 바와 같이 특정 식물 세포의 형질전환에 이용된다. 이러한 세포벽이 없는 포유동물 세포의 경우에는 문헌 [Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)]의 인산칼슘 침전법을 이용할 수 있다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질감염의 일반적인 측면은 미국 특허 제4,399,216호에 기재되어 있다. 효모로의 형질전환은 통상적으로 문헌 [Van Solingen et al., J. Bact ., 130:949 (1977)] 및 [Hsiao et al., Proc . Natl . Acad . Sci . (USA), 76:3829 (1979)]의 방법에 따라 수행된다. 그러나, 세포에 DNA를 도입시키기 위한 다른 방법, 예를 들어, 핵내 미세주입, 전기영동법, 온전한 세포와 박테리아 프로토플라스트와의 융합, 또는 고분자 양이온 (polycation), 예를 들어, 폴리브렌, 폴리오르니틴을 사용할 수도 있다. 포유동물 세포를 형질전환 시키기 위한 여러 기술에 대해서는 문헌 [Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)] 및 [Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988)]을 참조한다.
본원에서 클로닝하거나 벡터에서 DNA를 발현시키기에 적합한 숙주 세포는 원핵 세포, 효모 또는 고등 진핵 세포이다. 적합한 원핵 세포는 진정 박테리아, 예를 들어, 그람-음성 또는 그람-양성 생물체 (예를 들어, 이. 콜라이와 같은 엔테로박테리아세애 (Enterobacteriaceae))을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 다양한 이. 콜라이 균주, 예를 들어, 이. 콜라이 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 이. 콜라이 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)는 용이하게 입수가능하다. 다른 적합한 원핵 숙주 세포는 에쉐리히아 (Esherichia)와 같은 엔테로박테리아세애, 예를 들어, 이. 콜라이, 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무리움 (typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스 (marcescans) 및 시겔라 (Shigella) 및 바실러스 (Bacillus), 예를 들어, 비. 서브틸리스 (B. subtilis) 및 비. 리체니포르미스 (B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일자로 공개된 DD 266,710호에 개시된 비. 리체니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들어, 피. 애루기노사 (P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 이러한 예는 설명을 위한 것이며 이에 제한되는 것은 아니다. 균주 W3110은 재조합 IL-17A/F 생성물 발효를 위한 공통적인 숙주 균주이기 때문에 특히 바람직한 숙주 또는 모 숙주의 하나이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소량의 단백질 가수 분해 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110을 변형시켜 숙주의 내인성 단백질을 코딩하는 유전자에서 유전적 돌연변이가 일어나도록 할 수 있으며, 이러한 숙주의 예는 완전한 유전자형 tonA를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 1A2, 완전한 유전자형 tonA ptr3을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 9E4, 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 ( argF - lac )169 degP ompT kan r 를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244), 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 ( argF -lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan r 를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 37D6, 비-카나마이신 내성 degP 결실 돌연변이를 갖는 균주 37D6인 이. 콜라이 W3110 균주 40B4 및 1990년 8월 7일자로 허여된 미국 특허 제4,946,783호에 개시된 주변세포질 프로테아제 돌연변이체를 갖는 이. 콜라이 균주를 포함한다. 별법으로, 시험관내 클로닝 방법, 예를 들어, PCR 또는 다른 핵산 중합효소 반응이 적합하다.
원핵 세포 이외에도, 섬유상 진균 또는 효모와 같은 진핵 미생물도 IL-17A/F-코딩 벡터를 위한 클로닝 또는 발현 숙주로서 적합하다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)가 통상 사용되는 하등 진핵 숙주 미생물이다. 다른 미생물에는 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) (문헌 [Beach and Nurse, Nature, 290:140 (1989)], 1985년 5월 2일자로 공개된 EP 139,383), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주 (미국 특허 제4,943,529호; 문헌 [Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)]), 예를 들어, 케이. 락티스 (K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574; 문헌 [Louvencourt et al., J. Baceriol., 154(2):737-742 (1983)]), 케이. 프라길리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 윅케라미 (K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이 (K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophilarum) (ATCC 36,906; 문헌 [Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), 케이. 써모톨레란스 (K. thermotolerans) 및 케이. 막시아누스 (K. marxianus)); 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070; 문헌 [Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 (1988)]); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa) (문헌 [Case et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 76:5259-5263 (1979)]); 시와니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어, 시와니오마이세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis) (1990년 10월 31일자로 공개된 EP 394,538) 및 섬유상 진균, 예를 들어, 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) (1991년 1월 10일자로 공개된 WO 91/00357) 및 아스퍼길러스 (Aspergillus) 숙주, 예컨대 에이. 니둘란스 (A. nidulans) (문헌 [Ballance et al,, Biochem . Biophys . Res. Commun ., 112:284-289 (1983)]; [Tilburn et al., Gene, 26:205-221 (1983)]; [Yelton et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 81:1470-1474 (1984)]) 및 에이. 니게르 (A. niger) (문헌 [Kelly and Hynes, EMBO J., 4:475-479 (1985)])가 포함된다. 본 발명에서는 메틸 영양 요구성 효모가 적합하고, 한세눌라 (Hansenula), 칸디다 (Candida), 클로엑케라 (Kloeckera), 피치아 (Pichia), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 토룰롭시스 (Torulopsis) 및 로도토룰라 (Rhodotorula)로 구성된 속으로부터 선택된, 메탄올에서 성장할 수 있는 효모를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 이런 클래스의 효모를 예시하는 구체적인 종의 목록은 문헌 [C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)]에서 찾을 수 있다.
글리코실화된 IL-17A/F의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 생물체로부터 유래한다. 무척추동물 세포의 예는 드로소필라 (Drosophila) S2 및 스포도프테라 (Spodoptera) Sf9 또는 스포도프테라 하이 5 (Spodoptera High 5) 세포와 같은 곤충 세포 뿐만 아니라 식물 세포를 포함한다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 및 COS 세포를 포함한다. 보다 구체적인 예는 SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651), 인간 배아의 신장 세포주 (293 세포 또는 현탁 배양물 중에서 성장하도록 서브클로닝된 293 세포; 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol ., 36:59 (1997)]), 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO; 문헌 [Urlaub and Chasin, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 77:4216 (1980)]), 마우스 세르톨리 세포 (TM4; 문헌 [Mather, Biol . Reprod ., 23:243-251 (1980)]), 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75), 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065) 및 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51)을 포함한다. 당업자라면 적절한 숙주 세포를 용이하게 선택할 수 있다.
3. 복제가능 벡터의 선별 및 사용
IL-17A/F를 코딩하는 핵산 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)을 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능 벡터에 삽입할 수 있다. 다양한 벡터들을 용이하게 입수할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파지 형태일 수 있다. 적절한 핵산 서열은 다양한 절차에 의해 벡터 내에 삽입될 수 있다. 일반적으로, 당업계에 공지된 기술을 이용하여 DNA를 적절한 제한 효소 부위(들) 내에 삽입한다. 벡터 성분은 일반적으로 하나 이상의 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 성분을 하나 이상 함유하는 적합한 벡터의 구축은 당업자에게 공지된 표준 라이게이션 기술을 이용한다.
IL-17A/F는 재조합 방법에 의해 직접 생산될 수 있을 뿐만 아니라 성숙한 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드 또는 신호 서열일 수 있는 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 생산될 수도 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나 벡터 내로 삽입되는 IL-17A/F-코딩 DNA의 일부일 수 있다. 신호 서열은 예를 들어, 알칼리 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열안정성 엔테로톡신 II 리더로 구성된 군으로부터 선택된 원핵 생물 신호 서열일 수 있다. 효모 분비를 위해, 신호 서열은 예를 들어, 효모 인버타제 리더, 알파 인자 리더 (사카로마이세스 및 클루이베로마이세스 α-인자 리더를 포함하며, 클루이베로마이세스 α-인자 리더는 미국 특허 제5,010,182호에 기재되어 있음) 또는 산 포스파타제 리더인 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더 (1990년 4월 4일자로 공개된 EP 362,179) 또는 1990년 11월 15일자로 공개된 WO 90/13646에 기재된 신호일 수 있다. 포유동물 세포 발현시에, 포유동물 신호 서열 (예컨대, 동일하거나 관련된 종의 분비된 폴리펩티드로부터의 신호 서열 및 바이러스 분비 리더)을 사용하여 단백질의 분비를 지시할 수 있다.
발현 벡터와 클로닝 벡터 모두가 그 벡터를 1 종 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제가능하게 하는 핵산 서열을 함유한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대개의 그람-음성 박테리아에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서 벡터를 클로닝하는데 유용하다.
발현 벡터와 클로닝 벡터는 통상적으로 선별 유전자 (선별가능한 마커라고도 지칭됨)를 함유할 것이다. 통상적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 내성을 부여하는 단백질을 코딩하거나, (b) 영양 요구성 결함을 보충하는 단백질을 코딩하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용할 수 없는 중요한 영양 물질을 공급하는 단백질을 코딩 (예를 들어, 바실러스 (Bacillus)의 경우 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자)한다.
포유동물 세포에 적합한 선별가능한 마커의 예는 IL-17A/F-코딩 핵산을 수용할 수 있는 세포 성분의 확인을 가능하게 하는 것, 예컨대 DHFR 또는 티미딘 키나아제이다. 야생형 DHFR이 이용될 경우에 적절한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결핍된 CHO 세포주이며, 문헌 [Urlaub et al, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 77:4216 (1980)]에 기재된 바와 같이 제조되고 증식된다. 효모에서 사용되기에 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (문헌 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)]; [Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979)]; [Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]). trp1 유전자는 트립토판에서의 성장능이 없는 효모의 돌연변이체 균주 (예를 들어, ATCC 44076 또는 PEP4-1)에 대한 선별 마커를 제공한다 (문헌 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)]).
발현 벡터와 클로닝 벡터는 mRNA 합성을 유도하는, IL-17A/F-코딩 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유하는 것이 보통이다. 여러 가능한 숙주 세포에 의해 인식되는 프로모터는 공지되어 있다. 원핵 생물 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템 (문헌 [Chang et al., Nature, 275:615 (1978)]; [Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)]), 알칼리 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 (문헌 [Goeddel, Nucleic acid Res., 8:4057 (1980)]; EP 36,776) 및 하이브리드 프로모터, 예컨대 tac 프로모터 (문헌 [deBoer et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 80:21-25 (1983)])를 포함한다. 또한, 박테리아계에서 사용하기 위한 프로모터는 IL-17A/F를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno (S.D.)) 서열도 포함할 것이다.
효모 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나아제 (문헌 [Hitzeman et al., J. Biol . Chem ., 255:2073 (1980)]) 또는 다른 당분해 효소 (문헌 [Hess et al., J. Adv . Enzyme Reg ., 7:149 (1968)]; [Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)]), 예컨대 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나아제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프룩토키나아제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타아제, 피루베이트 키나아제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나아제에 대한 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 조절되는 추가의 전사 이점을 갖는 유도가능한 프로모터인 다른 효모 프로모터로는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사에 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 및 말토스와 갈락토스의 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이 있다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기재되어 있다.
포유동물 숙주 세포에 있는 벡터로부터의 IL-17A/F 전사는 바이러스, 예컨대 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스 (1989년 7월 5일자로 공개된 UK 2,211,504호), 아데노바이러스 (예컨대, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈; 이종 포유동물 프로모터, 예컨대 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터; 및 열-충격 프로모터로부터 얻어진 프로모터들이 숙주 세포계와 상용성이라면, 이들 프로모터에 의해 조절된다.
고등 진핵 세포에 의한 IL-17A/F 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가될 수 있다. 인핸서는 DNA의 시스-액팅 요소로서 보통 약 10 내지 300 bp 길이이며 프로모터에 작용하여 그의 전사를 증가시킨다. 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터의 다수의 인핸서 서열이 현재 공지되어 있다. 그러나, 통상적으로는 진핵 세포 바이러스로부터 유래한 인핸서를 사용할 것이다. 그 예로는 복제 기점 뒷쪽에 있는 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 뒷쪽에 있는 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서가 포함된다. 인핸서는 IL-17A/F 코딩 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터로 스플라이싱될 수 있지만, 프로모터의 5' 부위에 위치하는 것이 바람직하다.
또한, 진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 생물체로부터의 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열도 함유할 것이다. 이러한 서열은 공통적으로 진핵 세포나 바이러스의 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때로는 3'의 비번역 영역에서 입수할 수 있다. 이들 영역은 IL-17A/F를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화된 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 절편을 함유한다.
재조합 척추동물 세포 배양시에 IL-17A/F의 합성에 적용하기에 적합한 또다른 방법, 벡터 및 숙주 세포는 문헌 [Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981)], [Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979)], EP 117,060 및 EP 117,058에 기재되어 있다.
4. 유전자 증폭/발현의 검출
유전자 증폭 및(또는) 발현은 예를 들어, 통상적인 서던 블롯팅, mRNA의 전사를 정량하기 위한 노던 블롯팅 (문헌 [Thomas, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 77:5201-5205 (1980)]), 도트 (dot) 블롯팅 (DNA 분석) 또는 본원에서 제공된 서열을 기초로 적절하게 표지된 프로브를 사용하는 계내 (in situ) 혼성화에 의해 샘플에서 직접 측정할 수 있다. 별법으로, DNA 이중나선, RNA 이중나선 및 DNA-RNA 하이브리드 이중나선 또는 DNA-단백질 이중나선을 비롯한 특정 이중나선을 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다. 이후에는, 상기 항체를 표지한 후에 상기 이중나선이 표면에 결합하는 분석법을 수행할 수 있는데, 이때 표면상에 이중나선이 형성된 후에는 이중나선에 결합한 항체의 존재를 검출할 수 있다.
별법으로, 유전자 발현은 세포 또는 조직 섹션의 면역조직화학적 염색과 같은 면역학적 방법 및 유전자 생성물의 발현을 직접 정량하기 위한 세포 배양물 또는 체액의 분석법에 의해 측정할 수 있다. 면역조직화학적 염색 및(또는) 샘플 유체의 분석에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있고, 임의의 포유동물에서 제조할 수 있다. 편리하게는, 천연 서열 IL-17A/F 폴리펩티드 또는 본원에서 제공되는 DNA 서열을 기초로 한 합성 펩티드 또는 IL-17A/F DNA에 융합되어 특정 항체 에피토프를 코딩하는 외인성 서열에 대한 항체를 제조할 수 있다.
5. 폴리펩티드의 정제
여러 형태의 IL-17A/F는 배양 배지 또는 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. 막 결합 형태라면, 적절한 디터전트 (detergent) 용액 (예를 들어, Triton-X 100)을 사용하거나 효소에 의한 절단시킴으로써 막에서 방출시킬 수 있다. IL-17A/F의 발현에 사용된 세포는 동결-해동 주기, 초음파 처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제와 같은 여러 가지 물리적 또는 화학적 수단으로 파괴할 수 있다.
재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 IL-17A/F를 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 정제 방법의 예로는 이온 교환 컬럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전법, 역상 HPLC, 실리카 또는 양이온 교환 수지 (예컨대, DEAE) 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전법, 예를 들어, 세파덱스 (Sephadex) G-75를 사용하는 겔 여과법, IgG와 같은 오염물질을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 컬럼 및 IL-17A/F의 에피토프 태그가 부착된 형태를 결합시키기 위한 금속 킬레이트 컬럼 등이 있다. 다양한 단백질 정제 방법을 이용할 수 있고, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990)], [Scopes, Protein Purification:Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]에 기재되어 있다. 정제 단계(들)의 선택은 예를 들어, 사용되는 생산 방법 및 생산되는 특정 IL-17A/F의 특성에 따라 달라질 것이다.
E. IL-17A/F의 용도
IL-17A/F를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (또는 그의 상보체)은 분자생물학 분야에서 혼성화 프로브로서의 용도를 비롯하여 염색체 및 유전자 맵핑 프로브, 및 안티센스 RNA 및 DNA 프로브의 제조에 있어서 다양한 용도를 갖는다. 또한, IL-17A/F 핵산은 본원에 기재된 재조합 기술에 의한 IL-17A/F 폴리펩티드의 제조에도 유용할 것이다.
전장 천연 서열 IL-17A/F 유전자 또는 그의 일부는 본원에 개시된 IL-17A/F 서열에 대해 원하는 서열 동일성을 갖는 전장 IL-17A/F cDNA 또는 다른 cDNA (예를 들어, IL-17A/F의 자연 발생적인 변이체 또는 다른 종으로부터의 IL-17A/F를 코딩하는 유전자)를 단리하기 위한 cDNA 라이브러리에 대한 혼성화 프로브로서 사용될 수 있다. 임의로, 프로브는 염기 약 20개 내지 약 50개의 길이일 것이다. 혼성화 프로브는 전장 천연 뉴클레오티드 서열의 적어도 부분적으로는 신규한 영역 (여기서, 이 영역은 과도한 시행착오 없이 결정할 수 있음) 또는 천연 서열 IL-17A/F의 프로모터, 인핸서 요소 및 인트론을 포함하는 게놈 서열로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 스크리닝 방법은 공지된 DNA 서열을 사용하여 IL-17A/F 유전자의 코딩 영역을 단리함으로써 약 40개 염기의 선택된 프로브를 합성하는 단계를 포함할 것이다. 혼성화 프로브는 32P 또는 35S와 같은 방사성 뉴클레오티드, 또는 아비딘/비오틴 커플링 시스템을 통해 상기 프로브에 커플링된 알칼리성 포스파타제 등과 같은 효소 표지를 비롯한 다양한 표지로 표지할 수 있다. 본 발명의 IL-17A/F 유전자의 서열에 상보적인 서열을 갖는 표지된 프로브를 사용하여 인간 cDNA, 게놈 DNA 또는 mRNA의 라이브러리를 스크리닝함으로써 상기 라이브러리 중에서 프로브가 혼성화되어 있는 구성원을 결정할 수 있다. 혼성화 기술은 하기의 실시예에 보다 상세하게 기재되어 있다.
본원에 개시된 방법을 이용하여, 본원에 개시된 임의의 EST 서열을 프로브로서 유사하게 사용할 수 있다.
IL-17A/F 핵산의 다른 유용한 단편에는 표적 IL-17A/F mRNA (센스) 또는 IL-17A/F-DNA (안티센스) 서열에 결합할 수 있는 단일-가닥 핵산 서열 (RNA 또는 DNA)을 포함하는 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 본 발명에 있어서, 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 IL-17A/F DNA의 코딩 영역의 단편을 포함한다. 이러한 단편은 일반적으로 약 14개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 14개 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함한다. 주어진 단백질을 코딩하는 cDNA 서열에 기초하여 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 유도하는 능력은, 예를 들어, 문헌 [Stein and Cohen, Cancer Res. 48:2659, (1988)] 및 [van der Krol et al., BioTechniques , 6:958, (1988)]에 기재되어 있다.
안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 서열의 결합은 이중나선의 분해 증대, 전사 또는 번역의 조기 종결 등을 비롯한 여러가지 수단 중 하나 또는 다른 수단에 의해 표적 서열의 전사 또는 번역을 차단하는 이중나선을 형성한다. 따라서, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하여 IL-17A/F 단백질의 발현을 차단할 수 있다. 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드는 변형된 당-포스포디에스테르 주쇄 (또는 다른 당 연결부, 예컨대 WO 91/06629에 기재된 당 연결부)를 갖는 올리고뉴클레오티드를 더 포함하며, 여기서 이러한 당 연결부는 내인성 뉴클레아제에 대한 내성이 있다. 내성이 있는 당 연결부를 갖는 이러한 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 안정 (즉, 효소 분해에 대해 내성이 있음)하지만, 표적 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있는 서열 특이성을 보유한다.
센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 다른 예로는 유기 잔기, 예를 들어, WO 90/10048에 기재된 잔기, 및 표적 핵산 서열에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화성을 증가시키는 다른 잔기, 예를 들어, 폴리-(L-리신)과 공유결합적으로 연결된 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 있다. 또한, 엘립티신과 같은 인터칼레이팅제, 및 알킬화제 또는 금속 착제를 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 부착하여 표적 뉴클레오티드 서열에 대한 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드의 결합 특이성을 변형시킬 수 있다.
예를 들어, CaPO4-매개 DNA 형질감염법, 전기영동법을 비롯한 임의의 유전자 전달 방법을 이용하거나 엡스타인-바 (Epstein-Barr) 바이러스와 같은 유전자 전달 벡터를 사용함으로써 표적 핵산 서열을 함유하는 세포에 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 도입할 수 있다. 바람직한 한 방법에서, 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드를 적합한 레트로바이러스 벡터에 삽입한다. 표적 핵산 서열을 함유하는 세포를 생체내 또는 생체외에서 재조합 레트로바이러스 벡터와 접촉시킨다. 적합한 레트로바이러스 벡터로는 쥐 레트로바이러스 M-MuLV, N2 (M-MuLV로부터 유래된 레트로바이러스), 또는 DCT5A, DCT5B 및 DCT5C (WO 90/13641 참조)로 지칭되는 이중 카피 벡터로부터 유래된 레트로바이러스 벡터 등이 있으나 이에 한정되지는 않는다.
또한, WO 91/04753에 개시된 바와 같이, 리간드 결합 분자와 접합체를 형성함으로써 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 세포에 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 도입할 수도 있다. 적합한 리간드 결합 분자로는 세포 표면 수용체, 성장 인자, 다른 사이토카인, 또는 세포 표면 수용체에 결합하는 다른 리간드 등이 있으나 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는, 리간드 결합 분자의 접합은, 리간드 결합 분자가 그의 상응하는 분자 또는 수용체에 결합하는 능력을 실질적으로 방해하지 않거나, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 그의 접합 형태의 세포내 진입을 실질적으로 차단하지 않는다.
별법으로, WO 90/10448에 기재된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드-지질 복합체를 형성함으로써 표적 핵산 서열을 함유하는 세포에 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 도입할 수 있다. 이러한 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드-지질 복합체는 세포내에서 내인성 리파아제에 의해 바람직하게 해리된다.
일반적으로, 안티센스 또는 센스 RNA 또는 DNA 분자의 길이는 염기 약 5개 이상, 약 10개 이상, 약 15개 이상, 약 20개 이상, 약 25개 이상, 약 30개 이상, 약 35개 이상, 약 40개 이상, 약 45개 이상, 약 50개 이상, 약 55개 이상, 약 60개 이상, 약 65개 이상, 약 70개 이상, 약 75개 이상, 약 80개 이상, 약 85개 이상, 약 90개 이상, 약 95개 이상, 약 100개 이상이다.
또한, 프로브를 PCR 기술에 사용하여 밀접하게 관련된 IL-17A/F 코딩 서열의 확인을 위한 서열 풀 (pool)을 생성시킬 수도 있다.
또한, IL-17A/F를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 사용하여 IL-17A/F를 코딩하는 유전자의 맵핑 및 유전적 장애를 앓고 있는 개체의 유전자 분석을 위한 혼성화 프로브를 구축할 수도 있다. 본원에서 제공되는 뉴클레오티드 서열은 계내 혼성화, 공지된 염색체 마커에 대한 연관성 분석, 및 라이브러리를 사용한 혼성화 스크리닝 등과 같은 공지된 기술로 염색체 및 염색체의 특정 영역에 맵핑시킬 수 있다.
IL-17A/F에 대한 코딩 서열이 또다른 단백질에 결합하는 단백질을 코딩하는 경우 (예를 들어, 단백질이 수용체인 경우), 단백질은 이러한 결합 상호작용에 관여하는 다른 단백질 또는 분자를 확인하기 위한 분석에 사용될 수 있다. 이러한 방법에 의해, 수용체/리간드 결합 상호작용의 억제제도 확인할 수 있다. 또한, 상기 결합 상호작용에 관여하는 단백질을 사용하여 상기 결합 상호작용의 펩티드 또는 소분자 억제제 또는 효능제를 스크리닝할 수도 있다. 또한, 수용체 단백질을 사용하여 상관 관계가 있는 리간드(들)을 단리할 수도 있다. 스크리닝 분석을 고안하여 천연 IL-17A/F 또는 IL-17A/F에 대한 수용체의 생물학적 활성을 모방하는 리드 화합물을 밝혀낼 수 있다. 이러한 스크리닝 분석은 화학물질 라이브러리에 대한 고처리 스크리닝 분석을 포함하며, 특히 소분자의 약물 후보물질 확인에 적합할 것이다. 고려되는 소분자는 합성 유기 또는 무기 화합물을 포함한다. 상기 분석은 당업계에 특성화된 단백질-단백질 결합 분석, 생화학적 스크리닝 분석, 면역분석 및 세포 기재 분석 등을 비롯한 다양한 포맷으로 수행될 수 있다.
또한, IL-17A/F 또는 그의 변형된 형태를 코딩하는 핵산을 사용하여 치료학적으로 유용한 시약의 개발 및 스크리닝에 유용한 트랜스제닉 동물 또는 "낙 아웃 (knock out)" 동물을 발생시킬 수 있다. 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스 또는 래트)은 트랜스진 (transgene)을 함유하는 세포를 보유하는 동물인데, 트랜스진은 태아기, 예를 들어, 배아 단계에서 상기 동물 또는 상기 동물의 조상에 도입된다. 트랜스진은 세포의 게놈내로 통합되는 DNA이며, 이 세포로부터 트랜스제닉 동물이 발생한다. 한 실시양태에서, IL-17A/F를 코딩하는 cDNA를 사용하여 확립된 기술에 따라 IL-17A/F를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있고, 이 게놈 서열을 사용하여 IL-17A/F를 코딩하는 DNA를 발현하는 세포를 함유하는 트랜스제닉 동물을 제조할 수 있다. 특히, 마우스 또는 래트 등과 같은 트랜스제닉 동물을 발생시키는 방법은 당업계에 통상적인 것이 되었으며, 예를 들어, 미국 특허 제4,736,866호 및 동 제4,870,009호에 기재되어 있다. 통상적으로, 조직 특이적 인핸서를 갖춘 IL-17A/F 트랜스진의 혼입에는 특정 세포가 표적이 된다. 배아 단계에서 동물의 배선에 도입된 IL-17A/F를 코딩하는 한 카피의 트랜스진을 포함하는 트랜스제닉 동물을 사용하여 IL-17A/F를 코딩하는 DNA의 발현 증가 효과를 조사할 수 있다. 이러한 동물은, 예를 들어, IL-17A/F의 과발현과 관련된 병리학적 증상으로부터 보호할 것으로 여겨지는 시약에 대한 시험 동물로서 사용할 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에 따라, 동물에게 상기 시약을 처치하면, 트랜스진을 보유하는 미처치 동물에 비해 병리학적 증상의 발생이 저하되며, 이는 상기 병리학적 증상에 대해 잠재적으로 치료학적 개입한 것임을 나타낸다.
별법으로, IL-17A/F의 비-인간 상동체를 사용하여 IL-17A/F를 코딩하는 내인성 유전자와 이 동물의 배아 줄기세포에 도입된, IL-17A/F를 코딩하는 변경된 게놈 DNA 사이의 상동성 재조합의 결과로서 IL-17A/F를 코딩하는 결함 또는 변형 유전자를 갖는 IL-17A/F "낙 아웃" 동물을 구축할 수 있다. 예를 들어, IL-17A/F를 코딩하는 cDNA를 사용하여 확립된 기술에 따라 IL-17A/F를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있다. IL-17A/F를 코딩하는 게놈 DNA의 일부는 결실되거나, 통합을 모니터링하는데 사용될 수 있는 선별가능한 마커를 코딩하는 유전자와 같은 또다른 유전자로 대체될 수 있다. 통상적으로, 벡터내에는 수천개의 염기의 비-변형된 인접 DNA (5' 및 3' 말단 모두에서)가 포함된다 (예를 들어, 상동성 재조합 벡터에 대한 문헌 [Thomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987)] 참조). 상기 벡터는 (예를 들어, 전기영동법에 의해) 배아 줄기세포주에 도입되고, 도입된 DNA 및 내인성 DNA가 상동성 재조합된 세포를 선별한다 (예를 들어, 문헌 [Li et al., Cell, 69:915 (1992)] 참조). 그 후에, 선별된 세포를 동물 (예를 들어, 마우스 또는 래트)의 배반포에 주사하여 군집 (aggregation) 키메라를 형성시킨다 (예를 들어, 문헌 [Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152] 참조). 그 후에, 키메라 배아를 적합한 가임신 대리모 동물에게 이식하여 "낙 아웃" 동물을 발생시킬 수 있다. 생식 세포내에 상동성 재조합된 DNA를 보유하는 자손을 표준 기술로 확인하고, 이 자손을 사용하여 모든 세포가 상동성 재조합된 DNA를 함유하는 동물을 사육할 수 있다. 낙 아웃 동물은, 예를 들어, 특정한 병리학적 증상에 대한 방어 능력 및 IL-17A/F 폴리펩티드의 부재로 인한 병리학적 증상의 발생을 특징으로 할 수 있다.
IL-17A/F 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 또한 유전자 요법에도 사용될 수 있다. 유전자 요법의 적용시에, 유전자는 세포내로 도입되어 치료상 효과적인 유전자 생성물의 생체내 합성을 달성하며, 예를 들어, 결함있는 유전자를 대체한다. "유전자 요법"은 1회 처치에 의해 효과가 지속되는 통상적인 유전자 요법, 및 치료상 효과적인 DNA 또는 mRNA의 1회 또는 반복 투여를 포함하는 유전자 치료제의 투여를 모두 포함한다. 안티센스 RNA 및 DNA는 생체내에서 특정 유전자의 발현을 차단하기 위한 치료제로서 사용될 수 있다. 세포막을 통한 짧은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 흡수는 한계가 있어서 이러한 올리고뉴클레오티드의 세포내 농도가 낮음에도 불구하고, 이들이 세포내로 도입되어 억제제로 작용할 수 있음이 이미 밝혀져 있다 (문헌 [Zamecnik et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 83:4143-4146 (1986)]). 이러한 올리고뉴클레오티드를 변형시킴으로써, 예를 들어, 이들의 음으로 대전된 포스포디에스테르기를 비대전 기로 치환함으로써 이들의 흡수를 증대시킬 수 있다.
핵산을 살아있는 세포로 도입하는데 사용될 수 있는 다양한 기술이 있다. 이 기술은 핵산이 배양된 세포로 시험관내 전달되는가 또는 의도된 숙주의 세포로 생체내 전달되는가에 따라 달라진다. 핵산을 포유동물의 세포로 시험관내 전달하는데 적합한 기술은 리포좀, 전기영동, 미세주입, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전 등의 사용을 포함한다. 현재 바람직한 생체내 유전자 전달 기술로는 바이러스 (통상적으로는 레트로바이러스) 벡터를 사용한 형질감염 및 바이러스 코트 단백질-리포좀 매개 형질감염이 있다 (문헌 [Dzau et al., Trends in Biotechnology, 11:205-210 (1993)]). 어떤 경우에는, 표적 세포를 표적화하는 제제, 예를 들어, 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등을 핵산 공급원에 제공하는 것이 바람직하다. 리포좀이 사용되는 경우에는, 세포내이입에 관련된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질을 사용하여 표적화하고(하거나) 흡수를 용이하게 할 수 있으며, 이러한 단백질의 예로는 특정 세포 유형에 대해 친화성을 나타내는 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 순환시 내재화가 일어나는 단백질에 대한 항체, 세포내 국소화를 표적으로 하고 세포내 반감기를 증대시키는 단백질 등이 있다. 수용체-매개 세포내이입 기술은, 예를 들어, 문헌 [Wu et al., J. Biol . Chem , 262:4429-4432 (1987)] 및 [Wagner et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 87:3410-3414 (1990)]에 기재되어 있다. 유전자 마킹 및 유전자 요법 프로토콜에 관해 검토하기 위해서는 문헌 [Anderson et al., Science, 256:808-813 (1992)]을 참조하기 바란다.
본원에 기재된 IL-17A/F 폴리펩티드는 또한 단백질 전기영동 목적을 위한 분자량 마커로서 사용할 수 있으며, 단리된 핵산 서열은 이들 마커를 재조합적으로 발현하는 데 사용할 수 있다.
본원에 기재된 IL-17A/F 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산 분자는 염색체의 확인에 유용하다. 이와 관련하여, 계속해서 새로운 염색체 마커를 확인할 필요가 있는데, 이는 실제 서열 데이타에 기초하는 사용가능한 염색체 마킹 시약이 현재로서는 비교적 적기 때문이다. 본 발명의 IL-17A/F 핵산 분자 각각은 염색체 마커로 사용될 수 있다.
본 발명의 IL-17A/F 폴리펩티드 및 핵산 분자는 조직 타이핑 (tissue typing)에 진단용으로 사용할 수도 있으며, 이 때 본 발명의 IL-17A/F 폴리펩티드는 다른 조직에 비해 한 조직에서, 바람직하게는 동일한 조직 유형의 정상 세포에 비해 환부 조직에서 차별적으로 발현될 수 있다. IL-17A/F 핵산 분자는 PCR, 노던 분석, 서던 분석 및 웨스턴 분석용 프로브를 제조하는데 사용될 것이다.
본원에 기재된 IL-17A/F 폴리펩티드는 또한 치료제로서 사용될 수 있다. 본 발명의 IL-17A/F 폴리펩티드는 제약상 유용한 조성물을 제조하기 위한 공지된 방법에 따라 제제화될 수 있어, 그의 IL-17A/F 생성물은 제약상 허용되는 담체 매개체와의 혼합물로 조합된다. 치료제는, 원하는 순도의 활성 요소를 임의의 생리적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합함으로써, 동결건조된 제제 또는 수용액 형태로 보관되도록 제조한다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량과 농도에서 수용자에게 무독성이고, 인산염, 시트르산염 및 기타 유기 산 등의 완충액; 아스코르브산을 비롯한 항산화제; 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 폴리비닐피롤리돈 등의 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신 등의 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA 등의 킬레이팅제; 만니톨 또는 소르비톨 등의 당 알콜; 나트륨 등의 염-형성 카운터이온; 및(또는) TWEEN (등록상표), PLURONICS (등록상표) 또는 PEG 등의 비이온성 계면활성제 등이 있다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 반드시 멸균되어야 한다. 이는 후속 동결건조 및 재구성 전에, 멸균 여과막을 통해 여과함으로써 용이하게 수행된다.
본원에서 치료용 조성물은 일반적으로 멸균된 입구를 갖는 용기, 예를 들어, 피하 주사용 바늘이 관통할 수 있는 마개가 있는 갖는 정맥내 투여용 용액제 백 또는 바이알에 담겨진다.
투여 경로는 공지된 방법, 예컨대 정맥내, 복강내, 뇌내, 근육내, 안구내, 동맥내 또는 병변내 경로에 의한 주사 또는 주입, 국소 투여, 또는 서방형 시스템에 의한 주사 또는 주입에 따른다.
본 발명의 제약 조성물의 투여량 및 원하는 약물 농도는 계획된 특정 용도에 따라 달라질 수 있다. 적절한 투여량 또는 투여 경로의 결정은 숙련의의 재량이다. 동물 실험은 인체 치료에 효과적인 투여량을 결정하는데 신뢰성있는 지침을 제공한다. 효과적인 투여량의 종간 스케일링은 문헌 [Mordenti, J. and Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96]에 주장된 원리에 따라 수행될 수 있다.
IL-17A/F 폴리펩티드 또는 그의 효능제 또는 길항제를 생체내 투여하는 경우, 정상 투여량은 투여 경로에 따라 하루에 포유동물의 체중당 약 10 ng/kg 내지 100 mg/kg 이하, 바람직하게는 약 1 μg/kg/일 내지 10 mg/kg/일로 달라질 수 있다. 특정 투여량 및 전달 방법에 대한 지침은 문헌, 예컨대 미국 특허 제4,657,760호, 동 제5,206,344호 또는 동 제5,225,212호에 제공되어 있다. 상이한 제제는 상이한 치료 화합물 및 상이한 장애에 효과적일 것이며, 예를 들어, 투여 표적화된 기관 또는 조직은 다른 기관 또는 조직과는 상이한 방식으로 전달할 필요가 있을 수 있다는 것이 예상된다.
IL-17A/F 폴리펩티드의 투여를 요하는 임의의 질환 또는 장애의 치료에 적합한 방출 특성을 갖는 제제에 IL-17A/F 폴리펩티드의 서방형 투여가 바람직한 경우, IL-17A/F 폴리펩티드의 마이크로캡슐화가 고려된다. 서방형 재조합 단백질의 마이크로캡슐화는 인체 성장 호르몬(rhGH), 인터페론-(rhIFN-), 인터루킨-2 및 MN rgp 120을 사용하여 성공적으로 수행되어 왔다 (문헌 [Johnson et al., Nat. Med ., 2:795-799 (1996)], [Yasuda, Biomed . Ther ., 27:1221-1223 (1993)], [Hora et al., Bio/Technology, 8:755-758 (1990)], [Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems, "in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462], WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399 및 미국 특허 제5,654, 010호].
이러한 단백질의 서방형 제형은 생체적합성 및 광범위한 생체분해적 특성에 기인하여 폴리-락트산-코글리콜산 (PLGA) 중합체를 사용하여 개발된다. PLGA의 분해 생성물인 락트산 및 글리콜산은 인간 신체 내에서 신속하게 제거될 수 있다. 또한, 상기 중합체의 분해성 (degradability)은 그의 분자량 및 조성에 따라 수개월 내지 수년에 걸쳐 조정될 수 있다 (문헌 [Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer," in: M. Chasin and R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41]).
본 발명은 IL-17A/F 폴리펩티드를 모방하는 화합물 (효능제)을 확인하거나 IL-17A/F 폴리펩티드의 효과를 저해하기 위한 화합물 (길항제)을 스크리닝하는 방법을 포함한다. 길항제 약물 후보물질에 관한 스크리닝 분석법을 고안하여 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩되는 IL-17A/F 폴리펩티드와 결합하거나 복합체를 형성하거나, 또는 코딩된 폴리펩티드와 다른 세포내 단백질의 상호작용을 방해한다. 이러한 스크리닝 분석법은 화학물질 라이브러리에 대해 고처리량 스크리닝할 수 있는 분석법을 포함하며, 이는 소분자 약물 후보물질의 확인에 특히 적합할 것이다.
상기 분석법은 당업계에서 특성화된 단백질-단백질 결합 분석법, 생화학적 스크리닝 분석법, 면역분석법 및 세포기재 분석법을 비롯한 다양한 포맷으로 수행될 수 있다.
길항제에 관한 모든 분석법의 공통점은 약물 후보물질과 본원에서 동정된 핵산에 의해 코딩되는 IL-17A/F 폴리펩티드의 2가지 성분이 상호작용하기에 충분한 조건 및 시간 동안 이들을 접촉시켜야한다는 점이다.
결합 분석법에서, 상호작용은 결합하는 것이며, 형성된 복합체는 반응 혼합물에서 단리하거나 검출할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩되는 IL-17A/F 폴리펩티드 또는 약물 후보물질은 공유결합적 부착 또는 비공유결합적 부착을 통해 고상, 예를 들어, 미량역가 플레이트에 고정된다. 비공유결합적 부착은 일반적으로 고체 표면을 IL-17A/F 폴리펩티드 용액으로 코팅하고 건조시킴으로써 달성된다. 별법으로, 고정될 IL-17A/F 폴리펩티드에 특이적인 고정된 항체, 예를 들어, 모노클로날 항체를 사용하여 그를 고체 표면에 앵커링할 수 있다. 상기 분석은 검출가능한 표지로 표지될 수 있는 고정되지 않은 성분을 고정된 성분, 예를 들어, 앵커링된 성분을 함유하는 코팅된 표면에 첨가함으로써 수행된다. 반응이 종결되었을 때, 반응하지 않은 성분은 예를 들어, 세척을 통해 제거하고, 고체 표면에 앵커링된 복합체를 검출한다. 고정되지 않은 성분이 검출가능한 표지를 원래 보유하는 경우, 표면상에 고정된 표지의 검출은 복합체가 형성되었음을 나타낸다. 고정되지 않은 성분이 표지를 원래 보유하지 않는 경우, 예를 들어 고정된 복합체에 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용하여 복합체 형성 여부를 검출할 수 있다.
후보 화합물이 본원에서 동정된 유전자에 의해 코딩되는 특정 IL-17A/F 폴리펩티드와 상호작용은 하지만 결합하지는 않는 경우, 후보 화합물과 이 폴리펩티드의 상호작용은 단백질-단백질 상호작용을 검출하는 공지된 방법으로 분석할 수 있다. 이러한 분석법에는 통상적인 접근법, 예를 들어, 가교결합법, 동시면역침전법 및 구배 또는 크로마토그래피 컬럼을 통한 동시정제법이 포함된다. 또한, 단백질-단백질 상호작용은 문헌 [Fields and Song, Nature (London), 340:245-246 (1989)], [Chien et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 88:9578-9582 (1991)], [Chevray and Nathans, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89:5789-5793 (1991)])에 기재된 효모-기재의 유전자 시스템을 사용하여 모니터링할 수 있다. 다수의 전사 활성자, 예를 들어 효모 GAL4는 물리적으로 구별되는 2개의 모듈형 도메인으로 구성되어 있는데, 한 도메인은 DNA-결합 도메인으로 작용하고, 나머지 한 도메인은 전사-활성화 도메인으로 기능한다. 상기 간행물에 기재된 효모 발현 시스템 (일반적으로, "2-하이브리드 시스템"이로 지칭함)은 이러한 성질의 이점을 이용하며, 2종의 하이브리드 단백질을 사용하는데, 이 중 하나는 표적 단백질이 GAL4의 DNA-결합 도메인과 융합된 것이며, 다른 하나는 후보물질 활성화 단백질이 활성화 도메인과 융합된 것이다. GAL4-활성화된 프로모터의 조절하에서의 GAL1-lacZ 리포터 유전자 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4 활성의 재구성에 따라 달라진다. 상호작용하는 폴리펩티드들을 함유하는 콜로니는 β-갈락토시다제에 대한 발색 기질을 사용하여 검출한다. 2-하이브리드 기술을 사용하여 2종의 특정 단백질들 사이의 단백질-단백질 상호작용을 확인하는 완성형 키트 (MATCHMAKER (등록상표))는 클론테크 (Clontech)에서 구입할 수 있다. 또한, 이 시스템을 확대 적용하여 특정 단백질 상호작용에 관여하는 단백질 도메인을 맵핑할 수 있을 뿐 아니라, 이러한 상호작용에 중대한 아미노산 잔기를 정확하게 알아낼 수 있다.
본원에서 동정된 IL-17A/F 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 다른 세포내 또는 세포외 성분과의 상호작용을 방해하는 화합물은 다음과 같이 시험할 수 있다: 일반적으로, 상기 유전자 생성물과 세포내 또는 세포외 성분을 함유하는 반응 혼합물을 이들 두 생성물의 상호작용 및 결합을 허용하는 조건 및 시간하에 제조한다. 결합을 억제하는 후보 화합물의 능력을 시험하기 위해, 시험 화합물의 존재 및 부재하에 반응을 수행한다. 또한, 제3의 반응 혼합물에 양성 대조군으로서 기능하는 위약을 첨가할 수 있다. 혼합물에 존재하는 시험 화합물과 세포내 또는 세포외 성분 사이의 결합 (복합체 형성)을 상기 기재된 바와 같이 모니터링한다. 대조 반응물에서는 복합체가 형성되었으나 시험 화합물을 포함하는 반응 혼합물에서는 복합체가 형성되지 않은 것은 시험 화합물이 시험 화합물과 그의 반응 파트너와의 상호작용을 방해하였음을 나타낸다.
길항제를 분석하기 위해, IL-17A/F 폴리펩티드를 특정 활성에 대해 스크리닝할 화합물과 함께 세포에 첨가할 수 있으며, IL-17A/F 폴리펩티드의 존재하에 대상 활성을 억제하는 화합물의 능력은 이 화합물이 IL-17A/F 폴리펩티드에 대한 길항제임을 나타낸다. 별법으로, 경쟁 억제 분석에 적절한 조건하에 IL-17A/F 폴리펩티드 및 잠재적인 길항제를 막-결합 IL-17A/F 폴리펩티드 수용체 또는 재조합 수용체와 혼합함으로써 길항제를 검출할 수 있다. IL-17A/F 폴리펩티드를 예를 들어, 방사성 표지하여, 수용체에 결합하는 IL-17A/F 폴리펩티드 분자의 수를 이용하여 잠재적인 길항제의 효과를 측정할 수 있다. 당업자에게 공지된 여러 방법, 예를 들어, 리간드 패닝법 (panning) 및 FACS 분류법을 통해 수용체를 코딩하는 유전자를 확인할 수 있다 (문헌 [Coligan et al., Current Protocols in Immun ., 1(2): Chapter 5 (1991)]). 바람직하게는 발현 클로닝법이 사용되는데, 여기서 폴리아데닐화된 RNA는 IL-17A/F 폴리펩티드에 대해 반응성인 세포로부터 제조되며, 이 RNA로부터 생성된 cDNA 라이브러리를 풀로 나누고, 이를 사용하여 IL-17A/F 폴리펩티드에 대해 반응하지 않는 COS 세포 또는 다른 세포를 형질감염시킨다. 유리 슬라이드에서 성장시킨 형질감염된 세포를 표지된 IL-17A/F 폴리펩티드에 노출시킨다. 요오드화 또는 부위-특이적 단백질 키나아제에 관한 인식 부위의 도입을 비롯한 여러 방법을 통해 IL-17A/F 폴리펩티드를 표지할 수 있다. 슬라이드를 고정시키고 인큐베이션한 후에 자기방사법으로 분석한다. 양성 풀을 확인하여 서브-풀을 제조하고, 상호작용성 서브-풀 및 재스크리닝 방법을 이용하여 다시 형질감염시킴으로써, 결국 추정된 수용체를 코딩하는 단일 클론을 얻는다.
수용체를 확인하는 다른 방법에서, 표지된 IL-17A/F 폴리펩티드는 수용체 분자를 발현하는 세포막 또는 추출물 제제와 광친화적으로 연결될 수 있다. PAGE를 통해 가교결합된 물질을 분해하고 X-선 필름에 노출시킨다. 수용체를 함유하는 표지된 복합체를 절단하고 펩티드 단편으로 분해하여 단백질 미세서열분석 (microsequencing)을 수행할 수 있다. 미세서열분석으로부터 얻은 아미노산 서열을 사용하여 다의성 (degenerate) 올리고뉴클레오티드 프로브 한 세트를 고안함으로써 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여 추정된 수용체를 코딩하는 유전자를 확인한다.
다른 길항제 분석법에서, 후보 화합물의 존재하에 수용체를 발현하는 포유동물의 세포 또는 막 제제를 표지된 IL-17A/F 폴리펩티드와 함께 인큐베이션한다. 그 후에, 상기 상호작용을 증대시키거나 차단하는 화합물의 능력을 측정할 수 있다.
잠재적인 길항제의 더욱 구체적인 예로는 이뮤노글로불린과 IL-17A/F 폴리펩티드의 융합체에 결합하는 올리고뉴클레오티드 및 특히 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 및 항체 단편, 단일쇄 항체, 항-이디오타입 항체 및 이러한 항체 또는 그의 단편의 키메라 형태 또는 인간화 형태 뿐 아니라 인간 항체 및 항체 단편을 비롯한 항체 등이 있으나 이에 한정되지는 않는다. 별법으로, 잠재적인 길항제는 밀접하게 관련된 단백질, 예를 들어, 수용체를 인식하지만 영향을 미치지 않아서 IL-17A/F 폴리펩티드의 작용을 경쟁적으로 억제하는 IL-17A/F 폴리펩티드의 돌연변이화된 형태일 수 있다.
또다른 잠재적인 IL-17A/F 폴리펩티드 길항제는 안티센스 기술을 사용하여 제조한 안티센스 RNA 또는 DNA 구조물인데, 예를 들어 이러한 안티센스 RNA 또는 DNA 분자는 표적화된 mRNA와 혼성화하여 단백질 번역을 방해함으로써 mRNA의 번역을 직접 차단하는 작용을 한다. 안티센스 기술을 사용하여 삼중나선 형성 또는 안티센스 DNA 또는 RNA를 통한 유전자 발현을 제어할 수 있는데, 이 방법들 모두가 폴리뉴클레오티드와 DNA 또는 RNA의 결합에 기초한다. 예를 들어, 본원에서 성숙한 IL-17A/F 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 코딩 부분을 사용하여 약 10 내지 40개 염기쌍 길이의 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 고안한다. DNA 올리고뉴클레오티드는 전사에 관여하는 유전자 영역에 대해 상보적이도록 고안하여 (삼중나선 - 문헌 [Lee et al., Nucl . Acids Res., 6:3073 (1979)], [Cooney et al,, Science, 241:456 (1988)], [Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)] 참조) 전사 및 IL-17A/F 폴리펩티드의 생산을 방지한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 mRNA와 혼성화하여 mRNA 분자의 IL-17A/F 폴리펩티드로의 번역을 차단한다 (안티센스 - 문헌 [Okano, Neurochem ., 56:560 (1991)], [Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)] 참조). 또한, 상기 기재된 올리고뉴클레오티드를 세포에 전달하여 안티센스 RNA 또는 DNA가 생체내에서 발현될 수 있도록 함으로써 IL-17A/F 폴리펩티드의 생산을 억제할 수 있다. 안티센스 DNA를 사용하는 경우, 전사-개시 부위, 예를 들어 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 약 -10 위치와 +10 위치 사이로부터 유래된 올리고데옥시리보뉴클레오티드가 바람직하다.
잠재적인 길항제에는 활성 부위, 수용체 결합 부위 또는 IL-17A/F 폴리펩티드의 성장 인자 결합 부위 또는 다른 관련 결합 부위와 결합하여 IL-17A/F 폴리펩티드의 정상적인 생물학적 활성을 차단하는 소분자가 포함된다. 소분자의 예로는 작은 펩티드 또는 펩티드-유사 분자, 바람직하게는 가용성 펩티드 및 합성 비-펩티드 유기 또는 무기 화합물 등이 포함되나 이에 한정되지는 않는다.
리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매할 수 있는 효소 RNA 분자이다. 리보자임은 상보적인 표적 RNA와 서열-특이적으로 혼성화한 후에 이를 엔도뉴클레아제에 의해 절단하는 작용을 한다. 공지된 기술로 잠재적인 RNA 표적내의 특이적인 리보자임 절단 부위를 확인할 수 있다. 보다 상세한 내용은 예를 들어, 문헌 [Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994)] 및 PCT 공개 WO 97/33551 (1997년 9월 18일자로 공개됨)을 참조한다.
전사 억제에 사용되는 삼중나선 형태의 핵산 분자는 단일-가닥이어야 하며, 데옥시뉴클레오티드로 구성되어야 한다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 그가 훅스틴 (Hoogsteen) 염기쌍 형성 규칙을 통해 삼중나선 형성을 촉진하도록 고안되어 있는데, 이 때 통상적으로 이중나선 중 한쪽 가닥에 상당한 크기의 퓨린 또는 피리미딘 스트레치가 필요하다. 보다 상세한 내용은, 예를 들어 상기한 PCT 공개 WO 97/33551을 참조한다.
이들 소분자들은 상기에서 논의한 임의의 한가지 이상의 스크리닝 분석법 및(또는) 당업자에게 공지된 임의의 다른 스크리닝 기술을 통해 확인할 수 있다.
또한, 본원에 개시된 분자의 진단 및 치료 용도는 하기에 개시되고 기재되는 양성 기능적 분석법에 기초할 수 있다.
F. 조직 분포
IL-17A/F를 발현하는 조직의 위치는 다양한 인간 조직에서 mRNA 발현을 측정함으로써 확인될 수 있다. 이러한 유전자의 위치는 어떠한 조직이 IL-17A/F 폴리펩티드를 자극하고 억제하는 활성에 의해 가장 많이 영향을 받을 것인지에 대한 정보를 제공한다. 또한, 특정 조직에서의 유전자 위치는 하기 논의된 활성 차단 분석을 위한 샘플 조직을 제공한다.
상기 언급한 바와 같이, 여러 조직에서의 유전자 발현은 통상적인 서던 블롯팅, mRNA의 전사를 정량하기 위한 노던 블롯팅 (문헌 [Thomas, Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)]), 도트 블롯팅 (DNA 분석), 또는 본원에 제공된 서열을 기초로 적절하게 표지된 프로브를 사용하는 계내 혼성화에 의해 측정할 수 있다. 별법으로, DNA 이중나선, RNA 이중나선 및 DNA-RNA 하이브리드 이중나선 또는 DNA-단백질 이중나선 등을 비롯한 특정 이중나선을 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다.
별법으로, 여러 조직에서의 유전자 발현은 조직 섹션의 면역조직화학적 염색과 같은 면역학적 방법 및 유전자 생성물의 발현을 직접 정량하기 위한 세포 배양물 또는 체액 분석에 의해 측정할 수 있다. 면역조직화학적 염색 및(또는) 샘플 유체의 분석에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있고, 임의의 포유동물에서 제조할 수 있다. 편리하게는, IL-17A/F 폴리펩티드의 천연 서열 또는 IL-17A/F 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 기초로 한 합성 펩티드에 대한 항체를 제조할 수 있고, 또는 IL-17A/F 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및 특이적인 항체 에피토프를 코딩하는 DNA에 융합된 외인성 서열에 대한 항체를 제조할 수 있다. 항체 제조에 관한 일반적 기술 및 노던 블롯팅 및 계내 혼성화에 관한 구체적인 프로토콜은 하기에 제공된다.
G. 항체 결합 연구
추가로, IL-17A/F 폴리펩티드의 활성은 항-IL-17A/F 항체가 조직 세포에 대한 IL-17A/F 폴리펩티드들 각각의 효과를 억제하는 능력을 시험하는 항체 결합 연구로 확인될 수 있다. 항체의 예로는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간화 항체, 이중특이적 항체 및 이종접합체 항체 등이 있고, 이들의 제조 방법을 하기에 기재할 것이다.
항체 결합 연구는 경쟁적 결합 분석법, 직접 및 간접 샌드위치 분석법 및 면역침전 분석법 등의 공지된 임의의 분석법으로 수행될 수 있다 (문헌 [Zola, Monoclonal Antibodies:A Manual of Technique, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)] 참조).
경쟁적 결합 분석법은 제한된 양의 항체와의 결합에 대해 시험 샘플 분석물과 경쟁하는 표지된 표준 물질의 능력에 따라 달라진다. 시험 샘플에 있는 표적 단백질의 양은 항체에 결합하게 되는 표준 물질의 양에 반비례한다. 결합하게 되는 표준 물질의 양을 용이하게 결정하기 위해서, 바람직하게는 경쟁 이전 또는 이후에 항체를 불용화시켜, 항체에 결합된 표준 물질 및 분석물을 결합되지 않은 상태로 있는 표준 물질 및 분석물로부터 편리하게 분리해 낼 수 있다.
샌드위치 분석법은 검출될 단백질의 상이한 면역원 부분 또는 에피토프에 각각 결합할 수 있는 2 가지 항체의 사용을 포함한다. 샌드위치 분석법에서, 시험 샘플 분석물이 고체 지지체 상에 고정화된 제1 항체와 결합된 후에 상기 분석물에 제2 항체가 결합하여 불용성인 3-부분 복합체가 형성된다. 예를 들어, 미국 특허 제4,376,110호를 참조한다. 제2 항체 그 자체를 검출가능한 부분으로 표지할 수도 있고 (직접 샌드위치 분석법) 또는 검출가능한 부분으로 표지된 항-이뮤노글로불린 항체를 사용하여 이를 측정할 수도 있다 (간접 샌드위치 분석법). 예를 들어, 샌드위치 분석의 한 가지 유형이 ELISA 분석법이고, 이 경우에서 검출가능한 부분은 효소이다.
면역조직화학법의 경우, 조직 샘플은 신선한 것이거나 동결된 것일 수 있고, 또는 파라핀에 함입된 포르말린 등의 보존제로 고정시킬 수 있다.
H. 세포기재 분석
면역 관련 질환을 위한 세포기재 분석 및 동물 모델을 이용하여 본원에서 확인된 유전자와 폴리펩티드 사이의 관계 및 면역 관련 질환의 발병 및 발병기전을 추가로 이해할 수 있다.
다른 접근법에서, 특정 면역 관련 질환에 관여하는 것으로 공지된 세포 유형의 세포를 본원에 기재된 cDNA로 형질감염시켜, 상기 cDNA가 면역 기능을 자극 또는 억제하는 능력을 분석한다. 적합한 세포를 원하는 유전자를 형질감염시키고, 면역 기능 활성을 모니터링할 수 있다. 이어서, 이와 같이 형질감염된 세포주를 사용하여 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체 또는 항체 조성물이 T-세포 증식 또는 염증 세포 침윤 조정 등의 면역 기능을 자극 또는 억제하는 능력을 시험할 수 있다. 본원에서 확인된 유전자의 코딩 서열로 형질감염시킨 세포를 사용하여 면역 관련 질환의 치료를 위한 약물 후보물질을 확인할 수도 있다.
또한, 안정한 세포주가 바람직하지만, 트랜스제닉 동물 (하기 기재된 바와 같음)에서 유도된 초대 배양물도 본원의 세포기재 분석에 사용할 수 있다. 트랜스제닉 동물로부터 연속 세포주가 유래되도록 하는 기술은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Small et al., Mol . Cell. Biol ., 5, 642-648 (1985)] 참조).
한가지 적합한 세포 기재 분석법은 혼합 림프구 반응 (MLR)이다 (문헌 [Current Protocols in Immunology, unit 3.12; National Institutes of Health의 J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Marglies, E. M. Shevach, W. Strober 편저, John Wiley ＆ Sons, Inc. 발행] 참조). 상기 분석법에서는, 시험 화합물이 활성화된 T 세포의 증식을 자극 또는 억제하는 능력을 분석한다. 반응자 T 세포의 현탁액을 동종 자극 인자 세포와 함께 배양하고, T 세포의 증식을 삼중수소화된 티미딘의 흡수로 측정한다. 상기 분석법은 T 세포 반응성에 관한 일반적 측정법이다. 대부분의 T 세포가 IL-2에 반응하여 활성화 후에 IL-2를 생성하기 때문에, 상기 분석법에서의 반응성 차이는 부분적으로 반응하는 세포에 의한 IL-2 생성 차이를 반영한다. MLR 결과는 표준 림포카인 (IL-2) 검출 분석법으로 확인될 수 있다 (상기 문헌 [Current Protocols in Immunology, 3.15, 6.3] 참조).
MLR 분석법에서 증식 T 세포 반응은 분석된 분자의 직접적인 유사분열 촉진 성질 또는 외부 항원으로 유도된 활성화에 기인할 수 있다. IL-17A/F 폴리펩티드의 T 세포 자극 활성은 동시 자극 분석법에 의해 추가로 확인될 수 있다. T 세포 활성화에는 T 세포 수용체 (TCR)를 통해 매개되는 항원 특이적 신호 및 제2 리간드 결합 상호작용, 예를 들어, B7 (CD80, CD86)/CD28 결합 상호작용을 통해 매개되는 동시 자극 신호가 필요하다. CD28 가교결합은 활성화된 T 세포에 의한 림포카인 분비를 증가시킨다. T 세포 활성화는 음성 또는 양성 효과를 갖는 리간드의 결합을 통해 음성 및 양성 조절된다. CD28 및 CTLA-4는 B7에 결합하는 Ig 거대족의 관련 당단백질이다. B7에 결합한 CD28은 T 세포 활성화에 양성 동시 자극 효과를 가지며, 반대로, B7에 결합한 CTLA-4는 음성 T 세포 불활성화 효과를 갖는다 (문헌 [Chamners, C. A. and Allison, J. P., Curr . Opin . Immunol . (1997) 9:396], [Schwartz, R. H., Cell (1992) 71:1065], [Linsey, P. S. and Ledbetter, J. A., Annu. Rev. Immunol . (1993) 11:191], [June, C. H. et al., Immunol . Today (1994) 15:321], [Jenkins, M. K., Immunity (1994) 1:405] 참조). 동시 자극 분석법에서, IL-17A/F 폴리펩티드를 T 세포 동시 자극 또는 억제 활성에 대해 분석한다.
T 세포 증식의 자극 인자 (동시 자극 인자)이고, MLR 및 동시 자극 분석법에 의해 결정되는 바와 같이 효능제, 예를 들어, 효능제 항체인 IL-17A/F 폴리펩티드 및 본 발명의 다른 화합물은 예를 들어, 열악하고 최적 이하이거나 부적합한 면역 기능을 특징으로 하는 면역 관련 질환의 치료에 유용하다. 이들 질환은 T 세포의 증식 및 활성화 (및 T 세포-매개 면역성)를 자극시키고, 자극성 IL-17A/F 폴리펩티드와 같은 자극 화합물을 투여하여 포유동물에서의 면역 반응을 강화시킴으로써 치료된다. 자극성 폴리펩티드는 예를 들어, IL-17A/F 폴리펩티드 또는 이의 효능제 항체일 수 있다.
본 발명에서와 같은 자극 화합물의 직접적 용도는 프라이밍된 T 세포 상에서 발현된 리간드 (4-1BBL)에 결합하고, T 세포의 활성화 및 성장에 신호를 전달하는, 종양괴사인자 수용체 족의 한 구성원인 4-1BB 당단백질을 사용한 실험으로 검증되었다 (문헌 [Alderson, M. E. et al., J. Immunol . 24:2219 (1994)] 참조).
또한, 효능제 자극 화합물의 용도가 실험적으로 검증되었다. 효능제 항-4-1BB항체 처리에 의한 4-1BB의 활성화는 종양 근절을 증대시킨다 (문헌 [Hellstrom, I. and Hellstrom, K. E., Crit . Rev. Immunol . 18:1 (1998)] 참조). 하기에 더욱 상세히 기재된, 종양 치료를 위한 면역보강제 요법은 본 발명의 자극 화합물 용도의 또다른 예이다.
또한, 면역 자극 또는 증대 효과는 MLR 분석에서 억제하는 것으로 나타났던 IL-17A/F의 활성을 길항하거나 차단함으로써 달성될 수도 있다. 화합물의 억제 활성을 없애는 것은 순 (net) 자극 효과를 생성한다. 적합한 길항제/차단 화합물은 억제 단백질을 인식하고 결합하여, 단백질과 그의 수용체의 효과적인 상호작용을 차단하고 수용체를 통한 신호전달을 억제하는 항체 또는 그의 단편이다. 이러한 효과는 T 세포 증식을 증대시키는 항-CTLA-4 항체를 사용한 실험으로 검증된 바 있으며, CTLA-4 결합에 의해 야기된 억제 신호 제거에 의해서일 것이라 추측된다 (문헌 [Waluna, Y. L. et al., Immunity 1:405 (1994)] 참조).
별법으로, 면역 촉진 또는 증대 효과는 혈관 투과성 증대 특성을 갖는 IL-17A/F 폴리펩티드의 투여에 의해 달성될 수 있다. 증대된 혈관 투과성은 면역 세포 (예를 들어, 단핵구, 호산구, PMN)및 염증의 국소 침윤에 의해 감쇠될 수 있는 장애에 유리할 것이다.
한편, IL-17A/F 폴리펩티드 및 본 발명의 다른 화합물은 T 세포 증식/활성화, 림포카인 분비 및(또는) 혈관 투과에 대한 직접적인 억제제이며, 면역 반응 저해에 직접 사용될 수 있다. 이들 화합물은 면역 반응의 정도 완화 및 과반응성, 과최적화 (superoptimal) 또는 자가면역 반응을 특징으로 하는 면역 관련 질환의 치료에 유용하다. 본 발명의 화합물의 이러한 용도는 수용체 B7에 결합한 CTLA-4가 T 세포를 불활성화시키는 상기 기재된 실험에 의해 검증되었다. 본 발명의 직접적인 억제 화합물은 유사한 방식으로 기능한다. 혈관 투과성을 억제하는 화합물을 사용하는 것은 염증을 감소시킬 것이라 기대된다. 이러한 사용은 과도한 염증과 관련된 증상의 치료에 유익할 것이다.
별법으로, 자극성 IL-17A/F 폴리펩티드에 결합하고 이들 분자의 자극 효과를 차단하는 화합물, 예를 들어, 항체는 순 (net) 억제 효과를 생성하고, T 세포 증식/활성화 및(또는) 림포카인 분비를 억제함으로써 T 세포-매개 면역 반응의 저해에 사용될 수 있다. 상기 폴리펩티드의 자극 효과 차단은 포유동물의 면역 반응을 억제한다. 이러한 용도는 항-IL2 항체를 사용한 실험에서 검증되었다. 이 실험에서, 상기 항체는 IL2에 결합하고 IL2의 수용체에 대한 IL2의 결합을 차단하여 T 세포 억제 효과가 달성되었다.
I. 동물 모델
세포 기재 시험관내 분석 결과는 생체내 동물 모델 및 T 세포 기능 분석을 사용하여 추가로 확인되었다. 공지된 여러가지 동물 모델을 사용하여 면역 관련 질환의 발병 및 병원에 있어서 본원에서 동정된 유전자의 역할을 더욱 잘 이해할 수 있고, 항체 및 소분자 길항제 등의 천연 폴리펩티드의 다른 길항제를 비롯한 후보 치료제의 효능을 시험할 수 있다. 이러한 모델들의 생체내 성질은 인간 환자에서의 반응을 예견하게 한다. 면역 관련 질환의 동물 모델에는 비-재조합 및 재조합 (트랜스제닉) 동물 둘 다가 포함된다. 비-재조합 동물 모델로는, 예를 들어, 뮤린 (murine) 모델 등의 설치류 등이 있다. 이러한 모델은 예를 들어, 피하 주사, 꼬리 정맥 주사, 비장 이식, 복강내 이식, 신피막 하로의 이식 등과 같은 표준 기술을 이용하여 동계 마우스로 세포를 도입함으로써 생성될 수 있다.
면역적격 세포를 면역억제 또는 내성 환자에게 이식하는 경우, 이식편 대 숙주질환이 발생한다. 공여 세포는 숙주 항원을 인식하고 이에 반응한다. 이 반응은 생명을 위협하는 중증의 염증에서부터 설사 및 체중 감소의 경미한 경우까지 다양할 수 있다. 이식편 대 숙주 질환 모델은 MHC 항원 및 소수의 이식 항원에 대한 T 세포 반응성을 평가하는 수단을 제공한다. 적합한 방법은 상기 문헌 [Current Protocols, in Immunology, unit 4.3]에 상세히 기재되어 있다.
피부 동종이계이식 거부반응에 대한 동물 모델은 T 세포가 생체내 조직 파괴를 매개하는 능력을 시험하고, 이식 거부반응에서의 역할을 측정하는 수단이다. 가장 공통적으로 수용되는 모델은 뮤린 꼬리-피부 이식을 사용한다. 반복 실험으로 피부 동종이계이식 거부반응이 T 세포, 헬퍼 T 세포 및 킬러-이펙터 T 세포에 의해 매개되는 것이며 항체에 의한 것이 아님을 알아내었다 (문헌 [Auchincloss, H. Jr. and Sachs, D. H., Fundamental Immunology, 2nd ed., W. E. Paul ed., Raven Press, NY,, 889-992 (1989)] 참조). 적합한 방법은 상기 문헌 [Current Protocols in Immunology, unit 4.4]에 기재되어 있다. 본 발명의 화합물 시험에 사용할 수 있는 다른 이식 거부반응 모델은 문헌 [Tanabe, M.. et al., Transplantation 58:23 (1994)] 및 [Tinubu, S. A. et al., J. Immunol . 4330-4338 (1994)]에 기재된 동종 심장 이식 모델이다.
지연형 과민증 동물 모델 역시 세포-매개 면역 기능에 관한 분석법을 제공한다. 지연형 과민성 반응은 항원을 투여하고 얼마간의 시간이 경과된 후에 최고조에 이르지 못하는 염증을 특징으로 하는 T 세포-매개 생체내 면역 반응이다. 또한, 이러한 반응은 다발성 경화증 (MS) 및 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE, MS를 위한 모델) 등의 조직 특이적 자가면역 질환에서 발생한다. 적합한 방법은 상기 문헌 [Current Protocols in Immunology,, unit 4.5]에 상세히 기재되어 있다.
EAE는 T 세포 및 단핵세포 염증 및 이후에 중추신경계에서 엑손의 탈수초화를 특징으로 하는 T 세포-매개 자가면역 질환이다. EAE는 일반적으로 인간의 MS와 관련된 동물 모델인 것으로 간주한다 (문헌 [Bolton, C., Multiple Sclerosis 1:143 (1995)] 참조). 급성 및 재발-이장 (relapsing-remitting) 모델이 개발되었다. 본 발명의 화합물은 상기 문헌 [Current Protocols in Immunology, unit 15.1 and 15.2]에 기재된 프로토콜을 사용하여 면역-매개 탈수초화 질환에 대한 T 세포 자극 또는 억제 활성에 대해 시험될 수 있다. 또한, 희소돌기아교세포 또는 쉬반 (schwann) 세포가 문헌 [Duncan, I. D. et al., Molec . Med . Today 554-561 (1997)]에 기재된 바와 같이 중추신경계로 이식되는 수초 질환에 관한 모델을 참조한다.
접촉성 과민증은 세포-매개 면역 기능을 생체내 분석하는 단순한 지연형 과민증이다. 상기 방법에서, 지연형 과민성 반응을 일으키는 외인성 합텐에 대한 피부 노출을 측정하고 정량했다. 접촉 민감성은 처음의 감응기에 이어 유발기를 포함한다. 유발기는 T 림프구가 이들이 이전에 접촉했던 항원을 만날 때 일어난다. 팽윤 및 염증이 발생하는데, 이는 인간 알레르기성 접촉 피부염의 우수한 모델이 된다. 적합한 방법은 문헌 [Current Protocols in Immunology, J. E. Cologan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, John Wiley ＆ Sons, Inc., unit 4.2 (1994)]에 상세히 기재되어 있다. 또한, 문헌 [Grabbe, S. and Schwartz, T., Immun . Today 19(1):37-44 (1998)]을 참조한다.
관절염의 동물 모델은 콜라겐-유도 관절염이다. 이 모델은 인간의 자가면역 류마티스성 관절염에 관한 임상적, 조직학적 및 면역학적 특성을 공유하며, 인간의 자가면역 관절염에 관한 허용되는 모델이다. 마우스 및 래트 모델은 활막염, 연골 및 연골하골의 침식을 특징으로 한다. 본 발명의 화합물은 상기 문헌 [Current Protocols in Immunology, unit 15.5]에 기재된 프로토콜을 사용하여 자가면역 관절염에 대한 활성을 시험할 수 있다. 또한, 문헌 [Issekutz, A. C. et al., Immunology 88:569 (1996)]에 기재된 CD18 및 VLA-4 인테그린에 대한 모노클로날 항체를 사용한 모델을 참조한다.
난알부민으로 동물을 감작시킨 후에 그 동물에 동일 단백질을 에어로졸로 투여함으로써 항원 유도 기도 과반응성, 폐 호산구증대증 및 염증을 유도한 천식 모델이 기재된 바 있다. 몇몇 동물 모델 (기니아 피그, 래트, 비-인간 영장류)에서는 에어로졸 항원을 투여한 후에 인간에서의 아토피성 천식과 유사한 증후가 나타났다. 뮤린 모델은 인간 천식의 특징을 많이 갖는다. 천식 치료에서의 활성 및 효과에 대해 본 발명의 화합물을 시험하기에 적합한 방법은 문헌 [Wolyniec, W. W. et al., Am. J. Respir . Cell Mol . Biol . 18:777 (1998)] 및 이 문헌에 인용된 참고 문헌에 기재되어 있다.
또한, 본 발명의 화합물을 건선류 질환의 동물 모델상에서 시험할 수도 있다. 건선에 대한 T 세포 병원을 시사하는 증거가 있다. 본 발명의 화합물은 문헌 [Schon, M. P. et al., Nat. Med . 3:183 (1997)]에 기재된 scid/scid 마우스 모델에서 시험될 수 있고, 여기서 마우스는 건선과 유사한 조직병리학적 피부 병변을 설명한다. 다른 적합한 모델로는 문헌 [Nickoloff, B. J. et al., Am. J. Path. 146:580 (1995)]에 기재된 바와 같이 제조된 인간 피부/scid 마우스 키메라가 있다.
재조합 (트랜스제닉) 동물 모델은 트랜스제닉 동물 제조를 위한 표준 기술을 이용하여 본원에서 동정된 유전자의 코딩 부분을 대상 동물의 게놈에 도입시킴으로써 조작될 수 있다. 트랜스제닉 조작을 위한 표적으로 사용할 수 있는 동물로는 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 양, 염소, 돼지 및 비-인간 영장류, 예를 들어, 비비원숭이, 침팬지 및 원숭이 등이 있으나 이에 한정되지는 않는다. 트랜스진을 상기 동물에 도입하기 위한 당업계에 공지된 기술로는 전핵 미세주입법 (Hoppe and Wanger, 미국 특허 제4,873,191호), 배선으로의 레트로바이러스 매개된 유전자 전달법 (예를 들어, 문헌 [Van der Putten et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 82:6148-615 (1985)] 참조), 배아 줄기세포에서의 유전자 표적법 (Thompson et al., Cell, 56:313-32 (1989)), 배아의 전기영동법 (Lo, Mol. Cell. Biol ., 3:1803-1814 (1983)); 정자 매개 유전자 전달법 (Lavitrano et al., Cell. 57:717-73 (1989)) 등이 있다. 검토를 위해, 예를 들어 미국 특허 제4,736,866호를 참조한다.
본 발명의 목적상, 트랜스제닉 동물에는 세포의 일부에만 트랜스진을 지니고 있는 동물 ("모자이크 (mosaic) 동물")이 포함된다. 트랜스진은 단일 트랜스진으로서 통합되거나, 또는 콘카타머 (concatamer)로서 예컨대 머리-머리 또는 머리-꼬리 배열로 통합될 수 있다. 또한, 트랜스진의 특정 세포형으로의 선택적 도입은 예를 들어, 문헌 [Lasko et al., Proc . Natl . Acd . Sci . USA. 89:6232-636 (1992)]의 기술에 의해 가능하다.
트랜스제닉 동물에서의 트랜스진 발현은 표준 기술을 이용하여 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 서던 블롯팅 분석 또는 PCR 증폭을 사용하여 트랜스진의 통합을 확인할 수 있다. 이어서, mRNA 발현량을 계내 혼성화, 노던 블롯팅 분석, PCR 또는 면역세포화학과 같은 기술을 이용하여 분석할 수 있다.
동물에서는 예를 들어, 조직학적 조사로 면역 질환 병리의 신호를 추가로 조사하여 특정한 조직으로의 면역 세포 침윤을 측정할 수 있다. 또한, 트랜스제닉 동물을 본 발명의 화합물로 처리하여 상기 화합물의 T 세포 증식 자극 또는 억제 정도를 측정하는 차단 실험을 수행할 수도 있다. 이들 실험에서는 상기 기재된 바와 같이 제조된, IL-17A/F 폴리펩티드에 결합하는 차단 항체를 동물에게 투여하여 면역 기능에 대한 효과를 측정한다.
별법으로, 폴리펩티드를 코딩하는 내인성 유전자와 그 동물의 배아 세포에 도입된 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 변화된 게놈 DNA 사이에서 상동성 재조합이 일어나, 본원에서 동정된 폴리펩티드를 코딩하는 결함 또는 변이 유전자를 갖는 "낙 아웃" 동물을 제작할 수 있다. 예를 들어, 특정 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 사용하여 확립된 기술에 따라 그 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있다. 특정 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA의 일부는 결실되거나, 통합을 모니터링하는데 사용될 수 있는 선별가능한 마커를 코딩하는 유전자와 같은 다른 유전자로 치환될 수 있다. 일반적으로, 수천 개 염기의 비변형된 인접 DNA (5' 및 3' 말단 모두에서)가 벡터에 포함된다 (예를 들어, 상동성 재조합 벡터에 대해서는 문헌 [Thomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987)] 참조). 상기 벡터를 배아 줄기세포주에 도입 (예를 들어, 전기영동법에 의해 도입함)하고, 도입된 DNA와 내인성 DNA 사이에 상동성 재조합이 일어난 세포를 선별한다 (예를 들어, 문헌 [Li et al., Cell, 69:915 (1992)] 참조). 이어서, 선택된 세포를 동물 (예를 들어, 마우스 또는 래트)의 배반포에 주입하여 응집 키메라를 형성한다 (예를 들어, 문헌 [Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152] 참조). 이어서, 키메라 배아를 적합한 가임신 대리모 동물에 이식할 수 있으며 이 배아가 "낙 아웃" 동물을 생성하게 된다. 생식 세포내에 상동성 재조합된 DNA를 보유하는 자손을 표준 기술로 확인할 수 있고, 이를 사용하여 모든 세포가 상동성 재조합된 DNA를 함유하는 동물을 사육할 수 있다. 낙 아웃 동물은 예를 들어, 특정 병리학적 증상에 대한 방어 능력 및 폴리펩티드의 부재로 인한 병리학적 증상의 발병을 특징으로 할 수 있다.
J. 면역보강제 요법
한 실시양태에서, 본 발명의 면역 자극 화합물을 종양 (암) 치료를 위한 면역보강제 요법에 사용할 수 있다. T 세포가 인간의 종양 특이적 항원을 인식함은 잘 확립되어 있다. MAGE, BAGE 및 GAGE 유전자 족에 의해 코딩된, 한 군의 종양 항원은 모든 성인 정상 조직에서는 침묵하지만, 흑색종, 폐암, 두암, 경부암 및 방광암과 같은 종양에서는 현저한 양으로 발현된다 (문헌 [DeSmet, C. et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 93:7149 (1996)] 참조). 시험관내 및 생체내 모두에서 T 세포의 동시 자극이 종양 퇴행 및 항종양 반응을 유도하는 것으로 나타났다 (문헌 [Melero, I. et al., Nature Medicine 3:682 (1997)], [Kwon, e. D., et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA 94:8099 (1997)], [Lynch, D. H. et al., Nature Medicine 3:625 (1997)], [Finn, O. J. and Lotze, M. T., J. Immunol . 21:114 (1998)] 참조). 본 발명의 자극 화합물은 T 세포 증식/활성화 및 종양 항원에 대한 항종양 반응을 자극하기 위한 면역보강제로서 단독으로 투여될 수도 있고, 또는 성장조절제, 세포독성제 또는 화학요법제와 함께 투여될 수도 있다. 성장조절제, 세포독성제 또는 화학요법제는 공지된 투여 방법을 이용하여 통상적인 양으로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물에 의한 면역 자극 활성은 성장조절제, 세포독성제 또는 화학요법제의 양을 감소시켜 환자에 대한 독성을 잠재적으로 저하시킨다.
K. 약물 후보물질의 스크리닝 분석법
약물 후보물질의 스크리닝 분석법은 본원에서 동정된 유전자가 코딩하는 폴리펩티드 또는 그의 생물학적 활성 단편에 결합하거나 이들과 복합체를 이루는 화합물, 또는 상기 코딩된 폴리펩티드와 다른 세포내 단백질과의 상호작용을 방해하는 화합물을 확인하기 위해서 고안된 것이다. 이러한 스크리닝 분석법은 화학물질 라이브러리에 대해 고처리량 스크리닝을 할 수 있는 분석법을 포함하며, 이는 소분자의 약물 후보물질을 확인하는데 특히 적합할 것이다. 고려되는 소분자에는 펩티드, 바람직하게는 가용성 펩티드, (폴리)펩티드-이뮤노글로불린 융합체 및 특히 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 및 항체 단편, 단일쇄 항체, 항-유전자형 항체 및 키메라 항체 또는 상기 항체 또는 단편의 인간화 항체 및 인간 항체 및 항체 단편을 포함하지만 이에 한정되지 않는 항체 등을 비롯한 합성 유기 또는 무기 화합물이 포함된다. 상기 분석법은 당업계에서 잘 특성화된 단백질-단백질 결합 분석법, 생화학적 스크리닝 분석법, 면역분석법 및 세포기재 분석법 등의 다양한 포맷으로 수행할 수 있다. 모든 분석법의 공통점은 약물 후보물질과 본원에서 동정된 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드가 상호작용하기에 충분한 조건 및 시간 동안 상기 2 가지 성분들의 접촉이 요구된다는 점이다.
결합 분석법에서, 상호작용은 결합하는 것이며, 반응 혼합물에서 형성된 복합체를 단리하거나 검출할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에서 동정된 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드 또는 약물 후보물질은 공유결합적 부착 또는 비공유결합적 부착을 통해 고상, 예를 들어 미량역가 플레이트에 고정된다. 비공유결합적 부착은 일반적으로 고체 표면을 폴리펩티드의 용액으로 코팅하고 건조시킴으로써 달성된다. 별법으로, 고정화 항체, 예를 들어, 고정된 폴리펩티드에 특이적인 모노클로날 항체를 사용하여 그를 고체 표면에 앵커링할 수 있다. 이 분석은 검출가능한 표지로 표지될 수 있는 고정되지 않은 성분을 고정된 성분, 예를 들어, 앵커링된 성분을 함유하는 코팅된 표면에 첨가함으로써 수행된다. 반응이 종결되었을 때, 반응하지 않은 성분을 예를 들어, 세척에 의해 제거하고, 고체 표면에 앵커링된 복합체를 검출한다. 고정되지 않는 성분이 검출가능한 표지를 원래 보유하고 있는 경우, 표면상에 고정된 표지의 검출은 복합체가 형성되었음을 나타낸다. 고정되지 않는 성분이 표지를 원래 보유하지 않는 경우, 예를 들어 고정된 복합체와 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용하여 복합체 형성 여부를 검출할 수 있다.
후보 화합물이 본원에서 동정된 유전자에 의해 코딩되는 특정 단백질과 상호작용하지만 결합하지는 않는 경우, 후보 화합물과 이 단백질의 상호작용은 단백질-단백질 상호작용을 검출하는 공지된 방법으로 분석할 수 있다. 이러한 분석법에는 통상적인 방법, 예를 들어, 가교결합법, 동시면역침전법 및 구배 또는 크로마토그래피 컬럼을 통한 동시정제법이 포함된다. 또한, 단백질-단백질 상호작용은 문헌 ([Fields and Song, Nature (London), 340:245-246 (1989)], [Chien et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 88:9578-9582 (1991)], [Chevray and Nathans, Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 89:5789-5793 (1991)])에 기재된 효모-기재의 유전자 시스템을 사용하여 모니터링할 수 있다. 다수의 전사 활성자, 예를 들어, 효모 GAL4는 물리적으로 구별되는 2개의 모듈형 도메인으로 구성되어 있는데, 한 도메인은 DNA-결합 도메인으로 작용하고, 나머지 한 도메인은 전사-활성화 도메인으로 기능한다. 상기 문헌에 기재된 효모 발현 시스템 (통상적으로, "2-하이브리드 시스템"이로 지칭함)은 이러한 성질의 이점을 이용하며, 2종의 하이브리드 단백질을 사용하는데, 이 중 하나는 표적 단백질이 GAL4의 DNA-결합 도메인과 융합된 것이며, 다른 하나는 후보 활성화 단백질이 활성화 도메인과 융합된 것이다. GAL4-활성화된 프로모터의 조절하에서의 GAL1-lacZ 리포터 유전자 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4 활성의 재구성에 따라 달라진다. 상호작용하는 폴리펩티드들을 함유하는 콜로니는 β-갈락토시다제에 대한 발색 기질을 사용하여 검출한다. 2-하이브리드 기술을 사용하여 2종의 특정 단백질들 사이의 단백질-단백질 상호작용을 확인하는 완성형 키트 (MATCHMAKER (등록상표))는 클론테크에서 구입할 수 있다. 또한, 이 시스템을 확대 적용하여 특정 단백질 상호작용에 관여하는 단백질 도메인을 맵핑할 수 있을 뿐 아니라, 이러한 상호작용에 중대한 아미노산 잔기를 정확하게 알아낼 수 있다.
본원에서 동정된 유전자와 다른 세포내 또는 세포외 성분과의 상호작용을 방해하는 화합물을 찾기 위해, 일반적으로 상기 유전자 생성물과 세포내 또는 세포외 성분을 함유하는 반응 혼합물을 이들 두 생성물의 상호작용 및 결합을 허용하는 조건 및 시간하에 제조한다. 결합을 억제하는 후보 화합물의 능력을 시험하기 위해, 시험 화합물의 존재 및 부재하에 반응을 수행한다. 또한, 제3의 반응 혼합물에 양성 대조군으로서 기능하는 위약을 첨가할 수 있다. 혼합물에 존재하는 시험 화합물과 세포내 또는 세포외 성분 사이의 결합 (복합체 형성)을 상기 기재된 바와 같이 모니터링한다. 대조 반응물에서는 복합체가 형성되었으나 시험 화합물을 포함하는 반응 혼합물에서는 복합체가 형성되지 않은 것은 시험 화합물이 시험 화합물과 그의 반응 파트너와의 상호작용을 방해하였음을 나타낸다.
L. 면역 관련 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법
면역 관련 질환의 치료에 유용한 조성물은, 면역 기능, 예를 들어, T 세포 증식/활성화, 림포카인 방출 또는 면역 세포 침윤을 저해 또는 자극하는 단백질, 항체, 유기 소분자, 펩티드, 포스포펩티드, 안티센스 및 리보자임 분자, 삼중나선 분자 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
예를 들어, 안티센스 RNA 또는 DNA 분자는 표적화된 mRNA와 혼성화하여 단백질 번역을 방해함으로써 mRNA의 번역을 직접 차단하는 작용을 한다. 안티센스 DNA를 사용하는 경우, 전사-개시 부위, 예를 들어, 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 약 -10 위치와 +10 위치 사이로부터 유래된 올리고데옥시리보뉴클레오티드가 바람직하였다.
리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매할 수 있는 효소 RNA 분자이다. 리보자임은 상보적인 표적 RNA와 서열-특이적으로 혼성화한 후에 이를 엔도뉴클레아제에 의해 절단하는 작용을 한다. 공지된 기술로 잠재적인 RNA 표적내의 특이적인 리보자임 절단 부위를 확인할 수 있다. 보다 상세한 내용은 예를 들어, 문헌 [Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994)] 및 PCT 공개 WO 97/33551 (1997년 9월 18일자로 공개됨)을 참조한다.
전사 억제에 사용되는 삼중나선 형태의 핵산 분자는 단일-가닥이어야 하며, 데옥시뉴클레오티드로 구성되어야 한다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 그가 훅스틴 염기쌍 형성 규칙을 통해 삼중나선 형성을 촉진하도록 고안되어 있는데, 이때 통상적으로 이중나선 중 한쪽 가닥에 상당한 크기의 퓨린 또는 피리미딘 스트레치가 필요하다. 보다 상세한 내용은 예를 들어, 상기한 PCT 공개 WO 97/33551을 참조한다.
이들 분자들은 상기에서 논의한 임의의, 또는 임의의 조합된 스크리닝 분석법 및(또는) 당업자에게 공지된 임의의 다른 스크리닝 기술을 통해 확인할 수 있다.
M. 항-IL-17A/F 항체
한 실시양태에서, 본 발명은 본원에서 치료제 및(또는) 진단제로서 사용할 수 있는 항-IL-17A/F 항체를 제공한다. 항체의 예로는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간화 항체, 이중특이적 항체 및 이종접합체 항체 등이 있다.
1. 폴리클로날 항체
폴리클로날 항체는 관련 항원과 면역보강제를 피하 (sc) 또는 복강내 (ip)로 수회 주사함으로써 동물에서 제조하는 것이 바람직하다. 면역화될 종에서 면역원성을 나타내는 단백질에 관련 항원 (특히, 합성 펩티드가 사용된 경우)을 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어, 이관능성 물질 또는 유도체화제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통함), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2 또는 R1N=C=NR (여기서, R 및 R1은 상이한 알킬기임)을 사용하여, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 혈청 알부민, 소의 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 관련 항원을 접합시킬 수 있다.
예를 들어, 상기 단백질 또는 접합체 100 ㎍ 또는 5 ㎍ (각각 토끼 또는 마우스에 대한 용량임)을 3 용적의 프로인트 (Freund's) 완전 면역보강제와 혼합한 다음 이 용액을 여러 부위에 피내 주사함으로써, 동물을 상기 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화시킨다. 1개월 후, 프로인트 완전 면역보강제에 포함된 펩티드 또는 접합체의 최초 양의 1/5 내지 1/10을 여러 부위에 피하 주사함으로써 상기 동물을 부스팅한다. 7일 내지 14일 후에, 상기 동물을 채혈하여 혈청의 항체 역가를 분석한다. 역가가 안정화될 때까지 동물을 부스팅한다. 접합체는 또한 재조합 세포 배양물에서 단백질 융합체로서 만들 수도 있다. 또한, 백반과 같은 응집제를 적합하게 사용하여 면역 반응을 증대시킨다.
2. 모노클로날 항체
모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조하거나 재조합 DNA 방법 (미국 특허 제4,816,567호 참조)으로 제조할 수 있다.
하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 기타 적절한 숙주 동물 (예를 들어, 햄스터)을 상기 기재된 바와 같이 면역화시켜, 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합될 항체를 생성시키거나 생성시킬 수 있는 림프구를 유도한다. 별법으로, 림프구를 시험관내 면역화시킬 수도 있다. 면역화 후, 림프구를 단리한 후에 적합한 융합화제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]).
이로써 생성된 하이브리도마 세포를 바람직하게는 융합되지 않은 모(母) 골수종 세포 (융합 파트너로도 불림)의 성장이나 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에 접종하여 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 없는 경우에는, 상기 하이브리도마용 선별 배양 배지는 통상적으로, HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제하는 물질인 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이다.
바람직한 융합 파트너인 골수종 세포는 효율적으로 융합되고, 선별된 항체 생성 세포에 의한 항체의 안정한 고수준 생성을 지지하는 세포이며, 융합되지 않은 모 세포로부터 상기 골수종 세포를 선별하는 선별 배지에 민감하다. 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예를 들어, MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것 (미국 캘리포니아주 샌 디에고에 소재하는 설크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center)로부터 입수가능함) 및 SP-2 및 유도체인 X63-Ag8-653 세포 (미국 버지니아주 매나서스에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)으로부터 입수 가능함)이다. 인간 모노클로날 항체를 제조하기 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주 또한 문헌 ([Kozbor, J. Immunol ., 133:3001 (1984)] 및 [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)])에 기재되어 있다.
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 대상으로 하여, 상기 항원에 대해 유도된 모노클로날 항체의 생성에 대해 분석한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전법으로 측정하거나, 또는 시험관내 결합 분석법, 예를 들어, 방사성면역분석법 (RIA) 또는 효소 결합 면역 흡착 분석법 (ELISA)으로 측정한다.
모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어, 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]에 기재된 스캐챠드 분석법 (Scatchard analysis)으로 측정할 수 있다.
일단 원하는 특이성, 친화성 및(또는) 활성의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 확인하면, 클론을 제한 희석 방법으로 서브클로닝하고 표준 방법으로 성장시킬 수 있다 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]). 이러한 목적에 적합한 배양 배지의 예로는 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지 등이 있다. 또한, 예를 들어, 하이브리도마 세포를 마우스에 복강내 주사함으로써 하이브리도마 세포를 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장시킬 수 있다.
상기 서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 종래의 항체 정제 방법, 예를 들어, 친화성 크로마토그래피 (예를 들어, 단백질 A-세파로스 또는 단백질 G-세파로스를 사용함), 이온 교환 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 등을 통해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 분리시키는 것이 적합하다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 방법 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄와 경쇄를 코딩하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함)을 이용하여 용이하게 단리 및 서열분석한다. 상기 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터내로 위치시킨 다음, 숙주 세포, 예를 들어, 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 달리 항체 단백질을 생성시키지 않는 골수종 세포를 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성할 수 있다. 항체를 코딩하는 DNA를 박테리아에서 재조합 발현하는 것에 관해 살펴보기 위해서는 문헌 [Skerra et al., Curr . Opinion in Immunol ., 5:256-262 (1993)] 및 [Plueckthun, Immunol . Revs., 130:151-188 (1992)]을 참조한다.
추가의 실시양태에서, 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기재된 기술을 이용하여 제조한 항체 파지 라이브러리로부터 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 단리할 수 있다. 문헌 ([Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol . Biol ., 222:581-597 (1991)])에는 파지 라이브러리를 사용하여 뮤린 항체와 인간 항체를 각각 분리하는 방법이 기재되어 있다. 이후에 간행된 문헌에는 체인 셔플링 (chain shuffling)에 의한 고 친화성 (nM 범위) 인간 항체의 제조 (문헌 [Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)]) 뿐만 아니라 매우 큰 파지 라이브러리를 제작하기 위한 전략으로서의 생체내 재조합과 조합 감염법이 기재되어 있다 (문헌 [Waterhouse et al., Nuc . Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)]). 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체를 단리하기 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 이용가능한 대안이다.
항체를 코딩하는 DNA는 예를 들어, 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄와 경쇄 불변 도메인 (CH 및 CL) 서열로 대체하거나 (미국 특허 제4,816,567호 및 문헌 [Morrison et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81:6851 (1984)]), 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드 (이종 폴리펩티드)에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 이뮤노글로불린 코딩 서열에 융합함으로써 키메라 또는 융합 항체 폴리펩티드를 생산하도록 변형시킬 수 있다. 항체의 불변 도메인을 이러한 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드 서열로 대체시키거나, 또는 항체의 한 항원-결합 부위의 가변 도메인을 이들 폴리펩티드로 대체시켜, 항원에 대한 특이성을 나타내는 한 항원-결합 부위, 및 상이한 항원에 대한 특이성을 나타내는 다른 항원-결합 부위를 포함하는 2가 키메라 항체를 제조할 수 있다.
3. 인간 및 인간화 항체
또한, 본 발명의 항-IL-17A/F 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체를 포함할 수 있다. 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 인간화 형태는 키메라 이뮤노글로불린, 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 이뮤노글로불린쇄 또는 그의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 하위서열)이다. 인간화 항체는, 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 종 (공여 항체)의 CDR로부터 유래된 잔기로 치환시킨 인간 이뮤노글로불린 (수용 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체에서도 발견되지 않고, 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 통상적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 통상적으로는 2개 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 이뮤노글로불린의 영역에 상응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 컨센서스 (consensus) 서열의 영역에 해당한다. 또한, 인간화 항체는 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 통상적으로는 인간 이뮤노글로불린 영역의 적어도 일부를 포함하는 것이 가장 적합할 것이다 (문헌 [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988)] 및 [Presta, Curr . Op. Struct . Biol . 2:593-596 (1992)]).
비인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로, 인간화 항체에는 비-인간 공급원으로부터 유래된 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입되어 있다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 흔히 "임포트 (import)" 잔기로 언급되며, 통상적으로는 "임포트" 가변 도메인으로부터 얻는다. 인간화는 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 치환함으로써 본질적으로 윈터 (Winter) 및 공동 연구자의 방법 (문헌 [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988)], [Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)])에 따라 수행할 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 온전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 서열이 비-인간 종 유래의 상응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화 항체는 통상적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기를 설치류 항체의 유사한 부위로부터 유래된 잔기로 치환시킨 인간 항체이다.
경쇄 및 중쇄 가변 도메인 중에서 안간화 항체 제조에 사용하고자 하는 인간 가변 도메인을 선택하는 것은 항체가 인간 치료용으로 사용될 때 항원성 및 HAMA 반응 (인간 항-마우스 항체)을 감소시키는 데 매우 중요하다. 소위 "베스트-피트 (best-fit)" 방법에 따라, 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리를 대상으로 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 스크리닝한다. 설치류의 V 도메인 서열과 매우 유사한 인간 V 도메인 서열을 확인하고, 이 서열내의 인간 프레임워크 영역 (FR)은 인간화 항체에 수용된다 (문헌 [Sims et al., J. Immunol . 151:2296 (1993)], [Chothia et al., J. Mol . Biol ., 196:901 (1987)]). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군에 속하는 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정한 프레임워크 영역을 사용한다. 이와 동일한 프레임워크를 여러가지 상이한 인간화 항체를 만드는 데 사용할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 89:4285 (1992)], [Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)]).
또한, 항원에 대한 높은 결합 친화성 및 다른 유리한 생물학적 성질을 보유하도록 항체를 인간화하는 것도 중요하다. 이 목적을 달성하기 위해, 바람직한 방법에 따라, 모 서열 및 인간화 서열의 3차원적 모델을 이용하여 모 서열 및 다양한 이상적 인간화 생성물의 분석 방법으로 인간화 항체를 제조한다. 3차원적 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 당업자에게 이용되고 있고 공지되어 있다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원적 입체구조를 설명하고 보여주는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이 디스플레이의 정밀검사는 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능화에 있어서 잔기의 가능한 역할 분석, 즉 후보 이뮤노글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 허용한다. 이러한 방법을 통해, FR 잔기는 원하는 항체 특성이 얻어지도록, 예를 들어, 표적 항원에 대한 친화성이 증가되도록 수용 서열과 임포트 서열로부터 선별 및 조합될 수 있다. 통상적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합에 영향을 주는 데 있어서 직접적으로 및 대부분 실질적으로 관여한다.
인간화 항-IL-17A/F 항체의 다양한 형태도 고려된다. 예를 들어, 인간화 항체는 임의로 1종 이상의 세포독성제와 접합되어 면역접합체를 생성시키는 항체 단편, 예를 들어, Fab일 수 있다. 별법으로, 인간화 항체는 온전한 IgG1 항체와 같은 온전한 항체일 수 있다.
인간화에 대한 대안으로서, 인간 항체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 면역화시킬 때, 내인성 이뮤노글로불린 생성의 부재하에서 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있는 형질전환 동물 (예를 들어, 마우스)을 제조하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 배선 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자를 동종접합 결실시키면 내인성 항체 생성이 완전히 억제된다고 기재된 바 있다. 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자 배열을 이러한 배선 돌연변이 마우스에 도입하면 항원이 들어왔을 때 인간 항체가 생성될 것이다. 문헌 [Jakobovits et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90:2551 (1993)], [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)], [Bruggemann et al., Year in Immuno . 7:33 (1993)], 미국 특허 제5,545,806호, 동 제5,569,825호, 동 제5,591,669호 (모두 겐파름(GenPharm)의 특허임), 동 제5,545,807호 및 WO 97/17852를 참조한다.
별법으로, 파지 디스플레이 기술 (문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)])을 이용하여 면역화되지 않은 공여자로부터의 이뮤노글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내 제조할 수 있다. 이 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자를 M13 또는 fd와 같은 섬유상 박테리오파지의 주요 또는 부수적 코트 단백질 유전자 내에 프레임에 맞게 클로닝하여 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로서 디스플레이한다. 섬유상 입자가 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능성을 기초로 한 선별은 또한 이 기능성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자를 선별되게 한다. 따라서, 파지는 B-세포의 성질 중 일부 성질을 모방한다. 파지 디스플레이는 예를 들어, 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]에 기재된 바와 같이 다양한 형식으로 수행할 수 있다. V-유전자 단편의 여러 공급원을 파지 디스플레이에 사용할 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]에는 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 랜덤한 조합 라이브러리로부터 다양한 항-옥사졸론 항체 배열을 단리하였다. 면역화되지 않은 인간 공여자로부터 유래된 V 유전자의 레퍼토리를 제작할 수 있고, 다양한 항원 배열 (자가 항원을 포함함)에 대한 항체를 문헌 [Marks et al., J. Mol . Biol . 222:581-597 (1991)] 또는 [Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 기재된 기술에 따라 본질적으로 단리할 수 있다. 또한, 미국 특허 제5,565,332호 및 동 제5,573,905호를 참조한다.
상기 논의된 바와 같이, 인간 항체는 시험관내 활성화된 B 세포에 의해서도 생성될 수도 있다 (미국 특허 제5,567,610호 및 동 제5,229,275호 참조).
4. 항체 단편
특정 환경에서는 온전한 항체보다는 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 보다 작은 크기의 단편은 빠른 제거(clearance)를 허용하고 충실성 종양에 대한 접근을 개선할 수 있다.
항체 단편을 제조하기 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 온전한 항체의 단백질분해성 분해를 통해 유도된 것이었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)] 및 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생성될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두 이. 콜라이에서 발현되어 이. 콜라이로부터 분비될 수 있으므로, 이들 항체 단편을 용이하게 대량으로 제조할 수 있다. 항체 단편은 상기에서 논의한 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 별법으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수할 수 있고, 화학적으로 커플링시켜 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]). 다른 접근법에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리할 수 있다. 샐비지 (salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하며 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편은 미국 특허 제5,869,046호에 기재되어 있다. 항체 단편을 제조하기 위한 기타 기술은 당업자에게는 명백할 것이다. 다른 실시양태에서, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185, 미국 특허 제5,571,894호 및 동 제5,587,458호를 참조한다. Fv 및 sFv는 불변 영역이 없고 온전한 조합 부위가 있는 유일한 단편이므로, 생체내에서 사용되는 동안의 비특이적 결합을 감소시키는데 적합하다. sFv 융합 단백질은 sFv의 아미노-말단 또는 카르복시-말단에서 이펙터 단백질의 융합이 일어나도록 제작할 수 있다. 상기 문헌 [Antibody Engineering, ed. Borrebaeck]을 참조한다. 또한, 이러한 항체 단편은 예를 들어, 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같이 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이적이거나 이중특이적일 수 있다.
5. 이중특이적 항체
이중특이적 항체는 2종 이상의 상이한 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적 이중특이적 항체는 본 명세서에 기재된 IL-17A/F 단백질의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이러한 항체들 중 다른 것들에서는 IL-17A/F 결합 부위가 다른 단백질에 대한 결합 부위와 함께 조합될 수 있다. 별법으로, 항-IL-17A/F 아암(arm)은 T-세포 수용체 분자 (예를 들어, CD3)와 같은 백혈구 상의 유발 분자, 또는 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)와 같은 IgG에 대한 Fc 수용체 (FcγR)에 결합하는 아암과 조합되어 세포의 방어 메카니즘을 IL-17A/F-발현 세포에 집중시키고 국소화시킬 수 있다. 이중특이적 항체를 사용하여 IL-17A/F를 발현하는 세포에 세포독성제를 국소화시킬 수도 있다. 이들 항체들은 IL-17A/F-결합 아암, 및 세포독성제 (예를 들어, 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 라이신 (ricin) A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)에 결합하는 아암을 갖는다. 이중 특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중특이적 항체)으로 제조할 수 있다.
WO 96/16673에는 이중특이적 항-ErbB2/항-FcγRIII 항체가 기재되어 있고, 미국 특허 제5,837,234호에는 이중특이적 항-ErbB2/항-FcγRI 항체가 개시되어 있다. 이중특이적 항-ErbB2/Fcα항체는 WO98/02463에 기재되어 있다. 미국 특허 제5,821,337호에는 이중특이적 항-ErbB2/항-CD3 항체가 교시되어 있다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 통상적인 제조는 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시발현을 바탕으로 하며, 여기서 2개의 쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (문헌 [Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)]). 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 랜덤한 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10가지 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생성시키며, 이중 하나만이 올바른 이중특이적 구조를 갖는다. 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계를 통한 올바른 분자의 정제는 다소 번거롭고, 생산 수율이 낮다. 유사한 방법이 WO 93/08829 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
다른 접근법에 따라, 원하는 결합 특이성을 갖는 항체의 가변 도메인 (항체-항원 결합 부위)을 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 Ig 중쇄 불변 도메인과의 융합이 바람직하다. 융합체 중 적어도 하나에 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 존재하는 것이 바람직하다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합체를 코딩하는 DNA, 및 원한다면 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별도의 발현 벡터에 삽입하고, 적합한 숙주 세포에 동시에 형질감염시킨다. 이것은 제작에 사용되는 3종의 폴리펩티드 쇄의 동일하지 않은 비율이 원하는 이중특이적 항체의 최적 수율을 제공하는 실시양태에서 3종의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조절하는 데 있어서 보다 높은 유연성을 제공한다. 그러나, 비율이 같은 2종 이상의 폴리펩티드 쇄가 높은 수율로 발현되거나 상기 비율이 원하는 폴리펩티드 쇄 조합의 수율에 별로 영향을 주지 않는 경우, 2종 또는 모든 3종의 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 단일 발현 벡터에 삽입할 수 있다.
이러한 방법의 바람직한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 한 아암에 있는, 제1 결합 특이성을 나타내는 혼성화 이뮤노글로불린 중쇄, 및 다른 아암에 있는 (제2의 결합 특이성을 제공하는) 혼성화 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍으로 구성되어 있다. 이중특이적 분자의 절반에만 이뮤노글로불린 경쇄가 존재하면 용이하게 분리되기 때문에, 이러한 비대칭 구조는 원치않는 이뮤노글로불린쇄 조합으로부터 원하는 이중특이적 화합물을 용이하게 분리할 수 있게 한다는 것이 밝혀졌다. 이 방법은 WO 94/04690에 기재되어 있다. 이중특이적 항체를 제조하기 위한 보다 상세한 내용은 예를 들어, 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymmology, 121: 210 (1986)]을 참조한다.
미국 특허 제5,731,168호에 기재된 다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 사이의 경계면을 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 비율(％)을 최대화할 수 있다. 바람직한 경계면은 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서는 제1 항체 분자의 경계면으로부터 1개 이상의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체한다. 큰 아미노산 측쇄를 작은 아미노산 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 큰 측쇄(들)에 대해 동일하거나 유사한 크기의 보충 "공동(cavity)"을 제2 항체 분자의 경계면에 생성시킨다. 이는 이종이량체의 수율을 동종이량체와 같은 다른 원치 않는 최종-생성물의 수율 보다 증가시키는 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체에는 가교결합된 항체 또는 "이종접합체" 항체가 포함된다. 예를 들어, 이종접합체 항체들 중 하나는 아비딘에 커플링되고 다른 하나는 비오틴에 커플링될 수 있다. 이러한 항체들은 예를 들어, 면역계 세포를 원치않는 세포에 표적화시키는 데 사용하도록 제안된 바 있고 (미국 특허 제4,676,980호), HIV 감염의 치료용으로도 제안된 바 있다 (WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 03089). 이종접합체 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교결합제는 당업계에 공지되어 있고, 다수의 가교결합 기술과 함께 미국 특허 제4,676,980에 기재되어 있다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 제조하는 기술은 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 화학적 결합을 이용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science 229:81 (1985)]에는 온전한 항체를 단백질 가수분해시켜 F(ab')2 단편을 제조하는 방법이 기재되어 있다. 이러한 단편은 디티올 착화제인 나트륨 아르세니트의 존재하에 환원되어 인접한 디티올을 안정화하고 분자간 디술피드 형성을 방해한다. 그 후에, 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시켰다. 그 후에, Fab'-TNB 유도체 중 하나를 머캅토에틸아민을 사용하여 환원시킴으로써 Fab'-티올로 재전환시키고 동몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시켰다. 생성된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 물질로 사용할 수 있다.
과학기술의 발전으로 인해 이. 콜라이로부터 Fab'-SH 단편을 직접 회수하여 화학적으로 결합시킴으로써 이중특이적 항체를 형성시킬 수 있게 되었다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)]에는 완전한 인간화 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 제조에 대해 기재되어 있다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 별도 분비되었으며 시험관내 지정된 화학적 커플링 방법을 통해 이중특이적 항체를 형성시켰다. 이와 같이 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상적인 인간 T 세포와 결합할 수 있을 뿐 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 유발할 수도 있었다. 또한, 재조합 세포 배양물로부터 이중특이적 항체 단편을 직접 만들고 단리하는 다양한 기술이 기재된 바 있다. 예를 들어, 류신 지퍼를 사용하여 이중 특이적 항체를 제조하였다 (문헌 [Kostelny et al., J. Immunol . 148(5):1547-1553 (1992)]). 유전자 융합을 통해, Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드를 2종의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결하였다. 항체 동종이량체의 힌지 영역을 환원시켜 단량체를 형성한 다음, 다시 산화시켜 항체 이종이량체를 형성시켰다. 또한, 이 방법은 항체 동종이량체를 제조하기 위한 방법으로 이용할 수도 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디 (diabody)" 기술은 이중특이적 항체 단편을 제조하는 다른 메카니즘을 제공한다. 이 단편은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는데, 이 링커는 너무 짧아서 동일한 쇄 상의 상기 두 도메인을 페어링시킬 수 없다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인은 또다른 단편의 상보적인 VH 및 VL 도메인과 쌍을 이루어, 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 만드는 다른 전략도 보고되었다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol . 152:5368 (1994)]를 참조한다.
2가를 초과하는 항체도 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체도 제조할 수 있다 (문헌 [Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)]).
6. 이종접합체 항체
이종접합체 항체도 본 발명의 범위에 포함된다. 이종접합체 항체는 2개의 공유결합적으로 연결된 항체로 구성된다. 이러한 항체는 예를 들어, 면역계 세포를 원하지 않는 세포에 표적화시키기 위해서 (미국 특허 제4,676,980호), 및 HIV 감염의 치료를 위해 (WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 03089) 제안되었다. 상기 항체는 가교결합제를 사용하는 방법을 포함하여 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 이용하여 시험관내에서 제조할 수 있는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드 교환 반응을 이용하거나 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 제작할 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트, 및 미국 특허 제4,676,980호 등에 개시된 시약 등이 있다.
7. 다가 항체
다가 항체는 2가 항체보다 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 더 빠르게 내재화될 수 있고(있거나) 이화될 수 있다. 본 발명의 항체는 항원 결합 부위가 3개 이상인 다가 항체 (IgM 클래스 이외의 다른 클래스; 예를 들어, 4가 항체)일 수 있으며, 이러한 다가 항체는 항체의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 발현을 통해 용이하게 생성될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역으로 구성되어 있다 (또는 이를 포함함). 이 시나리오에서, 항체는 Fc 영역, 및 Fc 영역의 아미노-말단에 있는 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 본원의 바람직한 다가 항체는 3개 내지 약 8개, 바람직하게는 4개의 항원 결합 부위로 구성되어 있다 (또는 이를 포함함). 상기 다가 항체는 1개 이상의 폴리펩티드 쇄 (바람직하게는 2개의 폴리펩티드 쇄)를 포함하며, 여기서 상기 폴리펩티드 쇄(들)는 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드(쇄) 쇄는 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc를 포함할 수 있으며, 여기서 VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 한 폴리펩티드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1이다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)는 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 쇄; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄를 포함할 수 있다. 본원의 다가 항체는 바람직하게는 2개 이상 (바람직하게는 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 본원의 다가 항체는 예를 들어, 약 2개 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로는 CL 도메인을 추가로 포함한다.
8. 이펙터 기능 조작
이펙터 기능에 대해 본 발명의 항체를 변형하여, 예를 들어, 항체의 항원-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및(또는) 상보체-의존성 세포독성 (CDC)를 강화시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 항체의 Fc 영역에 1개 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역에 도입하여 이 영역내 쇄간 디술피드 결합을 형성시킬 수 있다. 이와 같이 제조된 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력 및(또는) 증가된 상보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 가질 수 있다. 문헌 ([Caron et al., J. Exp Med ., 176:1191-1195 (1992)] 및 [Shopes, B. J. Immunol., 148:2918-2922 (1992)])을 참조한다. 또한, 문헌 [Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993)]에 기재된 이종이관능성 가교-링커를 사용하여 항종양 활성이 증대된 동종이량체 항체를 제조할 수 있다. 별법으로, 이중 Fc 영역을 갖는 항체를 조작하여 상보체에 의한 용해성 및 ADCC 능력을 증대시킬 수 있다. 문헌 [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989)]을 참조한다. 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 샐비지 수용체 결합 에피토프를 예를 들어, 미국 특허 제5,739,277호에 기재된 바와 같이 항체 (특히, 항체 단편)에 혼입시킬 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "샐비지 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 역할을 하는 IgG 분자 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 의미한다.
9. 면역접합체
또한, 본 발명은 세포독성제, 예를 들어, 화학요법제, 성장억제제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소와 접합된 항체 (즉, 방사성접합체)를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다.
상기 면역접합체의 생성에 유용한 화학요법제는 상기에 기재되어 있다. 사용될 수 있는 효소에 의한으로 활성인 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래), 라이신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테세네스가 포함된다. 여러 방사성핵종을 방사성접합된 항체의 제조에 사용할 수 있다. 그 예에는 212Bi, 131I, 131In, 90Y 및 186Re가 포함된다. 다양한 이관능성 단백질-커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 항체와 세포독성제의 접합체를 만든다. 예를 들어, 문헌 [Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 라이신 면역독소를 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성핵종과 항체를 접합시키는 예시적인 킬레이팅제이다. WO 94/11026을 참조한다.
항체와 1종 이상의 소분자 독소 (예컨대, 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 트리코텐 및 CC1065, 및 독소 활성을 나타내는 이들 독소의 유도체)로의 접합체도 본원에서 고려된다.
메이탄신 및 메이탄시노이드
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항-IL-17A/F 항체 (전장 또는 단편)는 하나 이상의 메이탄시노이드 분자에 접합된다.
메이탄시노이드는 튜불린 중합체화를 억제함으로써 작용을 하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카산 관목 메이테누스 세라타(Maytenus serrata)로부터 처음 단리되었다 (미국 특허 제3,896,111호). 그 후, 특정 미생물도 역시 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르와 같은 메이탄시노이드를 생산하는 것으로 밝혀졌다 (미국 특허 제4,151,042호). 합성 메이탄시놀, 그의 유도체 및 유사체는 예를 들어, 미국 특허 제4,137,230호; 동 제4,248,870호; 동 제4,256,746호; 동 제4,260,608호; 동 제4,265,814호; 동 제4,294,757호; 동 제4,307,016호; 동 제4,308,268호; 동 제4,308,269호; 동 제4,309,428호; 동 제4,313,946호; 동 제4,315,929호; 동 제4,317,821호; 동 제4,322,348호; 동 제4,331,598호; 동 제4,361,650호; 동 제4,364,866호; 동 제4,424,219호; 동 제4,450,254호; 동 제4,362,663호; 및 동 제4,371,533호 (이들 특허의 내용은 이 거명을 통해 본 명세서에 포함되는 것으로 함)에 기재되어 있다.
메이탄시노이드 -항체 접합체
메이탄신 및 메이탄시노이드의 치료율을 향상시키기 위한 시도로서, 메이탄신 및 메이탄시노이드를 종양 세포 항원과 특이적으로 결합하는 항체에 접합시켰다. 메이탄시노이드를 함유하는 면역접합체 및 그의 치료 용도는, 예를 들어, 미국 특허 제5,208,020호; 동 제5,416,064호; 및 유럽 특허 0 425 235 B1호에 기재되어 있고, 이들 특허의 내용은 이 거명을 통해 본 명세서에 포함되는 것으로 한다. 문헌 [Liu et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:8618-8623 (1996)]에는 인간 결장직장암에 대한 모노클로날 항체 C242에 연결된 메이탄시노이드 (DM1로 명명됨)를 포함하는 면역접합체가 기재되어 있다. 이러한 접합체는 배양된 결장암 세포에 대해 강력한 세포독성을 나타내는 것으로 밝혀졌고, 생체내 종양 성장 분석에서 항종양 활성을 나타냈다. 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]에는 메이탄시노이드가 디술피드 링커를 통하여, 인간 결장암 세포주 상의 항원에 결합하는 뮤린 항체 A7을 통해 접합되어 있거나, 또는 HER-2/neu 종양유전자와 결합하는 또다른 뮤린 모노클로날 항체 TA.1에 접합되어 있는 면역접합체가 기재되어 있다. 이러한 TA.1-메이탄시노이드 접합체의 세포독성은, 세포 당 3 x 105개의 HER-2 표면 항원을 발현하는 인간 유방암 세포주 SK-BR-3에 대해 시험관내 시험하였다. 이러한 약물 접합체는 메이탄시노이드 무함유 약물과 유사한 정도의 세포독성을 나타내었고, 이때 세포독성은 항체 분자 당 메이탄시노이드 분자의 수를 증가시킴으로써 강화시킬 수 있었다. A7-메이탄시노이드 접합체는 마우스에서 낮은 전신 세포독성을 보였다.
항-IL-17A/F 폴리펩티드 항체- 메이탄시노이드 접합체 (면역접합체)
항-IL-17A/F 항체-메이탄시노이드 접합체는 상기 항체나 메이탄시노이드 분자의 생물학적 활성을 그다지 저하시키지 않으면서 항-IL-17A/F 항체를 메이탄시노이드 분자에 화학적으로 결합시킴으로써 제조한다. 한 분자의 독소/항체조차도 메이탄시노이드가 결합되어 있지 않은 항체를 사용할 때보다 세포독성을 상승시킬 것으로 예상되었다 하더라도, 항체 당 결합되어 있는 평균 3-4개의 메이탄시노이드 분자는 항체의 기능 또는 용해성에 부정적인 영향을 주지 않으면서 표적 세포의 세포독성을 상승시키는 효과를 나타내었다. 메이탄시노이드는 당업계에 널리 공지되어 있고, 공지된 기술에 의해 합성되거나 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 적합한 메이탄시노이드는 예를 들어, 미국 특허 제5,208,020호, 및 위에서 언급한 다른 특허 및 비특허 공보에 기재되어 있다. 바람직한 메이탄시노이드는 메이탄시놀, 및 방향족 고리 변형되거나 메이탄시놀 분자의 다른 위치에서 변형된 메이탄시놀 유사체, 예를 들어, 각종 메이탄시놀 에스테르이다.
항체-메이탄시노이드 접합체를 제조하는 것으로 당업계에 공지된 다수의 연결 기가 있으며, 이 연결기에는, 예를 들어, 미국 특허 제5,208,020호 또는 EP 특허 제0 425 235 B1호 및 문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]에 기재된 것이 포함된다. 이러한 연결 기에는 상기 언급된 특허에 기재된 바와 같은, 디술피드 기, 티오에테르 기, 산 불안정 기, 광불안정 기, 펩티다제 불안정 기 또는 에스테라제 불안정 기가 포함되는데, 디술피드 및 티오에테르 기가 바람직하다.
상기 항체와 메이탄시노이드의 접합체는 각종 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들어, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 만들 수 있다. 특히 바람직한 커플링제에는 디술피드 연결을 제공해주는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP) (문헌 [Carlsson et al., Biochem . J. 173:723-737 (1978)]) 및 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트 (SPP)가 포함된다.
링커는 연결 유형에 따라서, 각종 위치에서 메이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들어, 에스테르 연결은 통상적인 커플링 기술을 이용하여, 히드록실기와 반응시켜 형성할 수 있다. 이 반응은 히드록실기가 있는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록실기로 변형된 C-15 위치, 및 히드록실기가 있는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 바람직한 실시양태에서는, 이러한 연결은 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.
칼리케아미신
또다른 대상 면역접합체는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 접합되어 있는 항-IL-17A/F 항체를 포함한다. 항생제 중 칼리케아미신 군은 피코몰 이하의 농도에서 이중 가닥 DNA를 절단할 수 있다. 칼리케아미신 군의 접합체를 제조하는 것에 대해서는 미국 특허 제5,712,374호, 동 제5,714,586호, 동 제5,739,116호, 동 제5,767,285호, 동 제5,770,701호, 동 제5,770,710호, 동 제5,773,001호, 동 제5,877,296호 (모두 아메리칸 시아나미드사 (American Cyanamid)의 특허임)을 참조한다. 사용될 수 있는, 칼리케아미신의 구조적 유사체에는 γ1 I, α2 I, α3 I, N-아세틸-γ1 I, PSAG 및 θI 1이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다 (문헌 [Hinman et al. Cancer Research 53: 3336-3342 (1993)], [Lode et al. Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)]; 상기 미국 특허는 모두 아메리칸 시아나미드사의 특허임). 항체와 접합시킬 수 있는 또다른 항-종양 약물은 안티폴레이트인 QFA이다. 칼리케아미신과 QFA 둘 다에는 세포내 작용 부위가 있고, 이들은 원형질막을 용이하게 통과하지 못한다. 그러므로, 항체에 의해 매개되는 내재화를 통해 이들 약물을 세포내로 흡수시키면 이들의 세포독성 효과가 크게 상승된다.
기타 세포독성제
본 발명의 항-IL-17A/F 항체에 접합시킬 수 있는 다른 항종양제에는 BCNU, 스트렙토조이신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 미국 특허 제5,053,394호, 제5,770,710호에 기재된, 총체적으로 LL-E33288 복합체로 공지된 제제 족뿐만 아니라 에스페라미신 (미국 특허 제5,877,296호)이 포함된다.
사용할 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 애루기노사 유래), 라이신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테세네스가 포함된다 (1993년 10월 28일 공개된 WO 93/21232 참조).
본 발명은 항체와, 핵분해 활성을 나타내는 화합물 (예를 들어, 리보뉴클레아제, 또는 데옥시리보뉴클레아제와 같은 DNA 엔도뉴클레아제; DNase) 사이에 형성된 면역접합체도 고려한다.
종양의 선별적 파괴를 위해, 항체는 방사성이 높은 원자를 포함할 수 있다. 각종 방사성 동위원소를 사용하여 방사성 동위원소와 결합된 항-IL-17A/F 항체를 제조할 수 있다. 방사성 동위원소의 예에는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다. 접합체를 진단에 사용하는 경우, 접합체는 신티그램 촬영 연구용 방사성 원자, 예를 들어, tc99m 또는 I123, 또는 핵자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화 (MRI)로도 공지되어 있음)용 스핀 표지, 예컨대, 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
방사성 표지 또는 기타 표지는 공지된 방법으로 접합체에 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 생합성하거나, 예컨대 수소 대신에 불소-19를 수반하는 적당한 아미노산 전구체를 사용하는 화학적 아미노산 합성법으로 합성할 수 있다. tc99m 또는 I123, Re186, Re188 및 In111과 같은 표지는 시스테인 잔기를 통해 펩티드에 부착할 수 있다. 이트륨-90은 라이신 잔기를 통해 부착할 수 있다. IODOGEN 방법 (문헌 [Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57])을 이용하여 요오드-123을 도입시킬 수 있다. 다른 방법은 문헌 ["Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)]에 자세히 기재되어 있다.
항체와 세포독성제로 구성된 접합체는 각종 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들어, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 만들 수 있다. 예를 들어, 라이신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체와 방사성 뉴클레오티드의 접합을 위한 예시적인 킬레이트제이다 (WO 94/11026 참조). 링커는 세포내에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산 불안정 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광-불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드 함유 링커가 사용될 수 있다 (문헌 [Chari et al. Cancer Research 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 제5,208,020호).
별법으로, 항-IL-17A/F 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은, 예를 들어, 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. DNA의 길이는 서로 인접해 있는 접합체의 두 부위, 또는 접합체의 원하는 성질을 파괴하지 못하는 링커 펩티드를 코딩하는 영역에 의해 분리되어 있는 접합체의 두 부위를 코딩하는 각 영역을 포함할 수 있다.
또다른 실시양태에서는, 항체를 종양 예비표적화에 이용하기 위하여 "수용체" (예컨대, 스트렙타비딘)에 접합시킬 수 있는데, 이러한 항체-수용체 접합체를 환자에게 투여한 다음, 킬레이팅제를 사용하여 순환계로부터 결합되어 있지 않은 접합체를 제거한 후, 세포독성제 (예컨대, 방사성 뉴클레오티드)에 접합되는 "리간드" (예컨대, 아비딘)를 투여한다.
10. 이뮤노리포좀
본원에 개시된 항-IL-17A/F 항체를 이뮤노리포좀으로 제제화할 수도 있다. "리포좀"은 약물을 포유동물에게 전달하는 데 유용한 다양한 유형의 지질, 인지질 및(또는) 계면활성제로 구성된 작은 소포체이다. 리포좀의 구성성분은 통상적으로 생물막의 지질 배열과 유사한 이중층 형태로 배열되어 있다. 상기 항체를 함유하는 리포좀은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 문헌 [Epstein et al., Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 82:3688 (1985)]; [Hwang et al., Proc . Natl Acad . Sci . USA, 77:4030 (1980)]; 및 미국 특허 제4,485,045호 및 동 제4,544,545호; 및 1997년 10월 23일 공개된 WO 97/38731에 기재된 방법으로 제조할 수 있다. 순환 시간이 증가된 리포좀은 미국 특허 제5,013,556호에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 함유하는 지질 조성물을 사용하여 역상 증발법에 의해 제조할 수 있다. 정해진 공극 크기의 필터를 통해 리포좀을 밀어내어 원하는 직경을 갖는 리포좀을 수득한다. 문헌 [Martin et al., J. Biol . Chem ., 257:286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 디술피드-상호교환 반응을 통해 본 발명의 항체의 Fab' 단편을 리포좀에 접합시킬 수 있다. 임의로, 화학요법제를 리포좀내에 포함시킨다 (문헌 [Gabizon et al., J. National Cancer Inst ., 81(19):1484 (1989)] 참조).
N. IL-17A/F 결합 올리고펩티드
본 발명의 IL-17A/F 결합 올리고펩티드는 바람직하게는 특히 본원에 기재된 IL-17A/F 폴리펩티드에 결합하는 올리고펩티드이다. IL-17A/F 결합 올리고펩티드는 공지된 올리고펩티드 합성 방법을 이용하여 화학적으로 합성하거나 재조합 기술을 이용하여 제조 및 정제할 수 있다. IL-17A/F 결합 올리고펩티드는 통상적으로 아미노산 약 5개 이상의 길이, 또는 아미노산 약 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 76개, 77개, 78개, 79개, 80개, 81개, 82개, 83개, 84개, 85개, 86개, 87개, 88개, 89개, 90개, 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개 또는 100개 이상의 길이이며, 이 올리고펩티드는 바람직하게는 특히 본원에 기재된 IL-17A/F 폴리펩티드에 결합할 수 있다. IL-17A/F 결합 올리고펩티드는 익히 공지된 기술을 이용하여 과도한 실험 없이 확인할 수 있다. 이에 대하여, 당업계에 익히 공지된 폴리펩티드 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고펩티드에 대하여 올리고펩티드 라이브러리를 스크리닝하는 기술을 유의한다 (예를 들어, 미국 특허 제5,556,762호, 동 제5,750,373호, 동 제4,708,871호, 동 제4,833,092호, 동 제5,223,409호, 동 제5,403,484호, 동 제5,571,689호, 동 제5,663,143호; 및 PCT 공개 번호 WO 84/03506 및 WO 84/03564; 문헌 [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984)]; [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985)]; [Geysen et al., in Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)]; [Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987)]; [Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988)], [Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378]; [Lowman, H. B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832]; [Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624]; [Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581]; [Kang, A. S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363] 및 [Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668] 참조).
이와 관련하여, 박테리오파지 (파지) 디스플레이는 익히 공지된 기술이며, 이 기술로 큰 규모의 올리고펩티드 라이브러리를 스크리닝하여 폴리펩티드 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 라이브러리의 구성원을 확인할 수 있다. 파지 디스플레이는 변이체 폴리펩티드가 박테리오파지 입자의 표면상의 코트 단백질에 대한 융합 단백질로서 나타나는 기술이다 (문헌 [Scott, J.K. and Smith, G. P. (1990) Science 249: 386]). 파지 디스플레이의 유용성은 선택적으로 랜덤화된 단백질 변이체 (또는 랜덤하게 클로닝된 cDNA)의 큰 라이브러리가 높은 친화성을 갖는 표적 분자에 결합하는 서열들에 대하여 빠르고 효과적으로 정렬될 수 있다는 사실에 있다. 파지상의 펩티드 (문헌 [Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378]) 또는 단백질 (문헌 [Lowman, H. B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832]; [Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624]; [Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581]; [Kang, A. S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363]) 라이브러리의 디스플레이는 특이적인 결합 특성을 갖는 것에 대하여 수백만의 폴리펩티드 또는 올리고펩티드를 스크리닝하기 위해 사용되어 왔다 (문헌 [Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668]). 랜덤 돌연변이의 파지 라이브러리를 정렬시키는 것은 다수의 변이체를 제조하여 증식시키는 전략, 표적 수용체를 사용하여 친화성 정제하는 방법, 및 결합 증가의 결과를 평가하는 수단을 필요로 한다 (미국 특허 제5,223,409호, 동 제5,403,484호, 동 제5,571,689호 및 동 제5,663,143호).
대부분의 파지 디스플레이 방법이 섬유상 파지를 사용하지만, 람다형 파지 디스플레이 시스템 (WO 95/34683; 미국 특허 제5,627,024호), T4 파지 디스플레이 시스템 (문헌 [Ren, Z-J. et al. (1998) Gene 215:439]; [Zhu, Z. (1997) CAN 33: 534]; [Jiang, J. et al. (1997) can 128:44380]; [Ren, Z-J. et al. (1997) CAN 127:215644]; [Ren, Z-J. (1996) Protein Sci. 5:1833]; [Efimov, V. P. et al. (1995) Virus Genes 10:173]) 및 T7 파지 디스플레이 시스템 (문헌 [Smith, G. P. and Scott, J. K. (1993) Methods in Enzymology, 217, 228-257]; 미국 특허 제5,766,905호)이 또한 공지되어 있다.
현재까지 기본적인 파지 디스플레이 개념에 대한 다수의 다른 개선 및 변형이 개발되어 왔다. 이러한 개선은 선택된 표적 분자에 결합하는 펩티드 라이브러리를 스크리닝하는 디스플레이 시스템의 능력 및 원하는 특성에 대하여 이러한 단백질을 스크리닝하는 능력으로 기능성 단백질을 나타내는 능력을 증대시켰다. 파지 디스플레이 반응에 대한 조합 반응 장치가 개발되었으며 (WO 98/14277), 파지 디스플레이 라이브러리를 이용하여 이분자 상호작용 (WO 98/20169; WO 98/20159) 및 억제된 나선 펩티드의 특성 (WO 98/20036)을 분석 및 조절하였다. WO 97/35196에는 파지 디스플레이 라이브러리를, 리간드가 표적 분자에 결합하는 제1 용액과 친화성 리간드가 표적 분자에 결합하지 않는 제2 용액과 접촉시켜 친화성 리간드를 단리함으로써 결합 리간드를 선택적으로 단리하는 방법이 기재되어 있다. WO 97/46251에는 친화성 정제된 항체를 사용하여 랜덤 파지 디스플레이 라이브러리를 바이오패닝 (biopanning)한 다음, 결합 파지를 단리하고, 이어서 마이크로플레이트 웰을 이용하여 마이크로패닝 방법으로 고 친화성 결합 파지를 단리하는 방법이 기재되어 있다. 친화성 태그로서 스태필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 단백질 A를 사용하는 것이 보고되어 있다 (문헌 [Li et al. (1998) Mol Biotech., 9:187]). WO 97/47314에는 파지 디스플레이 라이브러리일 수 있는 조합 라이브러리를 사용하여 효소 특이성을 구별하는 기질 제외 라이브러리의 사용이 기재되어 있다. 파지 디스플레이를 이용하여 디터전트로 사용하기에 적합한 효소를 선택하는 방법은 WO 97/09446에 기재되어 있다. 특이적 결합 단백질을 선택하는 다른 방법은 미국 특허 제5,498,538호, 동 제5,432,018호, 및 WO 98/15833에 기재되어 있다.
펩티드 라이브러리를 제조하고 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 방법은 또한 미국 특허 제5,723,286호, 동 제5,432,018호, 동 제5,580,717호, 동 제5,427,908호, 동 제5,498,530호, 동 제5,770,434호, 동 제5,734,018호, 동 제5,698,426호, 동 제5,763,192호 및 동 제5,723,323호에 개시되어 있다.
O. IL-17A/F 결합 유기 분자
IL-17A/F 결합 유기 분자는 바람직하게는 특이적으로 본원에 기재된 IL-17A/F 폴리펩티드에 결합하는, 본원에 정의된 올리고펩티드 또는 항체와는 다른 유기 분자이다. IL-17A/F 결합 유기 분자는 공지된 방법을 이용하여 확인하고, 화학적으로 합성할 수 있다 (예를 들어, PCT 공개 제WO 00/00823호 및 동 제WO 00/39585호 참조). IL-17A/F 결합 유기 분자는 일반적으로 크기가 약 2,000 달톤 미만이거나, 약 1,500,750,500,250 또는 200 달톤 미만이며, 잘 알려진 기술을 이용하여 과도한 실험 없이도, 바람직하게는 특이적으로 본원에 기재된 IL-17A/F 폴리펩티드에 결합할 수 있는 유기 분자를 확인할 수 있다. 이에 대하여, 폴리펩티드 표적에 결합할 수 있는 분자에 대하여 유기 분자 라이브러리를 스크리닝하는 기술이 당업계에 잘 알려져 있음을 유의한다 (예를 들어, PCT 공개 제WO 00/00823호 및 동 제WO 00/39585호 참조). IL-17A/F 결합 유기 분자는 예를 들어, 알데히드, 케톤, 옥심, 히드라존, 세미카르바존, 카르바지드, 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민, N-치환된 히드라진, 히드라지드, 알콜, 에테르, 티올, 티오에테르, 디술피드, 카르복실산, 에스테르, 아미드, 우레아, 카르바메이트, 카르보네이트, 케탈, 티오케탈, 아세탈, 티오아세탈, 아릴 할라이드, 아릴 술포네이트, 알킬 할라이드, 알킬 술포네이트, 방향족 화합물, 헤테로시클릭 화합물, 아닐린, 알켄, 알킨, 디올, 아미노 알콜, 옥사졸리딘, 옥사졸린, 티아졸리딘, 티아졸린, 엔아민, 술폰아미드, 에폭시드, 아지리딘, 이소시아네이트, 술포닐 클로라이드, 디아조 화합물 또는 산 클로라이드 등일 수 있다.
P. 원하는 특성을 갖는 항-IL-17A/F 항체, IL-17A/F 결합 올리고펩티드 및 IL-17A/F 결합 유기 분자의 스크리닝
IL-17A/F 폴리펩티드에 결합하는 항체, 올리고펩티드 및 유기 분자의 제조 기술은 상기에 기재되어 있다. 원한다면, 특정한 생물학적 특징을 나타내는 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자를 추가로 선별할 수 있다.
본 발명의 항-IL-17A/F 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자의 성장억제 효과는 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어, IL-17A/F 폴리펩티드를 내재적으로 발현하거나 IL-17A/F 유전자로의 형질감염 후 IL-17A/F 폴리펩티드를 발현하는 세포를 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 적당한 종양 세포주 및 IL-17A/F-형질감염 세포를 다양한 농도의 본 발명의 항-IL-17A/F 모노클로날 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자로 수 일 (예컨대, 2-7일) 동안 처리하고 크리스탈 바이올렛 또는 MTT로 염색하거나 다른 몇몇 비색 측정 분석법으로 분석할 수 있다. 증식을 측정하는 또다른 방법은 본 발명의 항-IL-17A/F 항체, IL-17A/F 결합 올리고펩티드 또는 IL-17A/F 결합 유기 분자가 존재하거나 부재하는 조건 하에서 처리된 세포에 의한 3H-티미딘 흡수를 비교하는 것이다. 처리 후, 세포를 모으고 DNA로 혼입된 방사활성량을 섬광계수기로 정량한다. 적당한 양성 대조군에는 선택된 세포주의 성장을 억제하는 것으로 알려진 성장억제 항체로 처리된 세포주가 포함된다. 생체내 종양 세포의 성장억제는 당업계에 알려진 다양한 방식으로 측정할 수 있다. 바람직하게는, 종양 세포는 IL-17A/F 폴리펩티드를 과발현하는 세포이다. 바람직하게는, 항-IL-17A/F 항체, IL-17A/F 결합 올리고펩티드 또는 IL-17A/F 결합 유기 분자는 약 0.5 내지 30 ㎍/ml의 항체 농도에서 처리되지 않은 종양 세포와 비교할 때 약 25-100％, 보다 바람직하게는 약 30-100％, 훨씬 더 바람직하게는 약 50-100％ 또는 70-100％만큼 시험관내 또는 생체내에서 IL-17A/F-발현 종양 세포의 세포 증식을 억제할 것이다. 성장억제는 세포 배양물 중에서 약 0.5 내지 30 ㎍/ml 또는 약 0.5 nM 내지 200 nM의 항체 농도에서 측정할 수 있는데, 이때 상기 성장억제는 종양 세포를 항체에 노출시키고 1-10일 후 측정한다. 체중 1 kg 당 약 1 ㎍ 내지 약 100 mg의 항-IL-17A/F 항체가 투여될 때 항체의 1차 투여로부터 약 5일 내지 3개월, 바람직하게는 약 5일 내지 30일 이내에 종양 크기 또는 종양 세포의 증식이 감소되는 경우, 항체가 생체내에서 성장억제 효과를 나타낸다고 한다.
세포 사멸을 유도하는 항-IL-17A/F 항체, IL-17A/F 결합 올리고펩티드 또는 IL-17A/F 결합 유기 분자를 선별하기 위해서, 예를 들어, 프로피디움 요오다이드 (PI), 트립판 블루 또는 7AAD 흡수에 의해 나타나는 바와 같이, 막의 일체성이 손상된 정도를 대조군과 비교하여 평가할 수 있다. PI 흡수 분석은 보체 및 면역 이펙터 세포의 부재 하에 수행할 수 있다. IL-17A/F 폴리펩티드-발현 종양 세포는 배지 단독과 인큐베이션하거나, 예를 들어, 약 10 ㎍/ml의 적당한 항-IL-17A/F 항체, IL-17A/F 결합 올리고펩티드 또는 IL-17A/F 결합 유기 분자를 함유하는 배지와 인큐베이션한다. 상기 세포를 3일 동안 인큐베이션시킨다. 각 처리를 수행한 후, 세포를 세정하고 35 ㎜ 스트레이너-캡핑된 (strainer-capped) 12 x 75 튜브내로 등분하여 (튜브 당 1 ml, 처리 그룹 당 3 튜브) 세포 덩어리를 제거한다. 이어서, 튜브에 PI (10 ㎍/ml)를 넣는다. 팩스캔(FACSCAN) (등록상표) 유동 세포계수기와 (팩스컨버트)FACSCONVERT (등록상표) CellQuest 소프트웨어 (벡톤 디킨슨사; Becton Dickinson)를 사용하여 샘플을 분석할 수 있다. PI 흡수에 의해 측정된 바와 같이 통계학적 유의적 수준의 세포 사멸을 유도하는 항-IL-17A/F 항체, IL-17A/F 결합 올리고펩티드 또는 IL-17A/F 결합 유기 분자를 세포 사멸 유도 항-IL-17A/F 항체, IL-17A/F 결합 올리고펩티드 또는 IL-17A/F 결합 유기 분자로서 선별할 수 있다.
원하는 항체에 의해 결합된 IL-17A/F 폴리펩티드 상의 에피토프에 결합하는 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자를 스크리닝하기 위해, 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 바와 같은 통상적인 가교-차단 분석을 수행할 수 있다. 이 분석은 시험 항체, 올리고펩티드 또는 다른 유기 분자가 공지된 항-IL-17A/F 항체와 동일한 부위 또는 에피토프에 결합하는지를 알아보는 데 사용할 수 있다. 별법으로, 또는 추가적으로, 에피토프 맵핑은 당업계에 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체 서열은 알라닌 스캐닝과 같은 방법으로 돌연변이화시켜 접촉 잔기를 확인할 수 있다. 돌연변이 항체는 먼저 폴리클로날 항체와의 결합에 대해 시험하여 적절하게 폴딩되는지를 확인한다. 다른 방법에서, IL-17A/F 폴리펩티드의 여러 영역에 상응하는 펩티드는 시험 항체와 함께, 또는 특성화된 에피토프 또는 공지된 에피토프가 있는 항체 및 시험 항체와 함께 경쟁 분석에 사용할 수 있다.
Q. 제약 조성물
면역 관련 질환의 치료를 위해 본 발명의 활성 IL-17A/F 분자 (예를 들어, IL-17A/F 폴리펩티드, 항-IL-17A/F 항체 및(또는) 각각의 변이체) 및 상기 개시된 스크리닝 분석법으로 확인된 기타 분자들을 제약 조성물 형태로 투여할 수 있다.
활성 IL-17A/F 분자, 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체의 치료제는 보관을 위해서, 원하는 수준의 순도를 갖는 활성 분자를 임의의 제약적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합하여 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 제조한다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이고, 인산, 시트르산 및 기타 유기산과 같은 완충액, 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 산화방지제, 보존제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜, 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 시클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸), 저분자량 (약 10개 잔기 미만)의 폴리펩티드, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린과 같은 단백질, 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산, 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물, EDTA와 같은 킬레이트제, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당, 나트륨과 같은 염-형성 카운터 이온, 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물) 및(또는) 트윈(TWEEN) (상표명), 플루로닉스(PLURONICS) (상표명) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비-이온성 계면활성제가 포함된다.
본원에 개시된 스크리닝 분석법으로 확인된 화합물들은 당업계에 공지된 표준 기술을 이용하여 유사한 방식으로 제제화될 수 있다.
리포펙션 또는 리포좀을 사용하여 IL-17A/F 분자를 세포에 전달할 수도 있다. 항체 단편이 사용되는 경우에는, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 최소의 억제 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변 영역 서열에 기초하여, 표적 단백질 서열과의 결합력을 지닌 펩티드 분자를 고안할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성되고(되거나) 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Marasco et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90:7889-7893 (1993)] 참조).
또한, 본원의 제제는 특정 증상을 치료하는데 필요한 1 종 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 악영향을 주지 않는 상보적인 활성을 지닌 화합물들을 함유할 수도 있다. 별법으로 또는 추가로, 상기 조성물은 세포독성제, 사이토카인 또는 성장억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합물에 존재하는 것이 적합하다.
활성 IL-17A/F 분자는 예를 들어, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 거대에멀젼 중에서 예를 들어, 코아세르베이션(coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 각각에 포획될 수도 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
생체내 투여용으로 사용될 제제는 멸균처리되어야 한다. 이것은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 수행된다.
서방형 제제 또는 IL-17A/F 분자를 제조할 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 성형품 형태 (예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐)의 반투과성 매트릭스를 포함한다. 서방형 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어, 루프론 데포트(LUPRON DEPOT) (상표명) (락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤리드 아세테이트로 구성된 주입가능한 미소구) 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산 등이 있다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100 일 초과 동안 분자를 방출할 수 있지만, 특정 히드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 항체가 오랫 동안 체내에 남아있는 경우, 이것들은 37 ℃에서 수분에 노출됨으로써 변성 또는 응집되어 생물학적 활성이 손실되고 면역원성이 변화될 수 있다. 관련된 메카니즘에 따라 합리적인 안정화 전략을 고안해낼 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 상호교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진다면, 술프히드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량 조절, 적절한 첨가제 사용 및 특이적인 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 안정화를 달성할 수 있다.
R. 치료 방법
본 발명의 폴리펩티드, 항체 및 기타 활성 화합물을 사용하여 염증 세포의 조직으로의 침윤, T 세포 증식의 자극, T 세포 증식의 억제, 혈관 투과성의 증가 또는 감소 또는 이의 억제를 특징으로 하는 질환을 포함하는 T 세포-매개 질환 등의 다양한 면역 관련 질환 및 상태를 치료할 수 있다고 여겨진다.
본 발명의 폴리펩티드, 항체 및 기타 화합물로 치료되는 증상 또는 장애의 예로는 전신성 홍반 루푸스, 류마티스성 관절염, 유년형 만성 관절염, 골관절염, 척추관절증, 전신성 경화증 (경피증), 특발성 염증성 근병증 (피부근염, 다발성근염), 쇼그렌 증후군, 전신성 맥관염, 유육종증, 자가면역 용혈성 빈혈 (면역성 범혈구 감소증, 발작성 야간혈색소뇨증), 자가면역 혈소판 감소증 (특발성 혈소판감소성자반증, 면역-매개 저혈소판증), 갑상선염 (그레이브병, 하시모토 갑상선염, 유년형 림프구성 갑상선염, 위축성 갑상선염), 진성 당뇨병, 면역-매개 신장 질환 (사구체신염, 세뇨관간질신염), 다발성 경화증, 특발성 탈수초성 다발성 신경병증 또는 길랑-바레 증후군 및 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증과 같은 중추 및 말초 신경계의 탈수초성 질환, 감염성 간염 (A, B, C, D, E형 간염 바이러스 및 기타 비-간친화성 바이러스), 자가면역 만성 활성 간염, 원발성 담즙 간경변, 육아종성 간염 및 경화성 담관염과 같은 간담즙성 질환, 염증성 장질환 (궤양성 대장염, 크론병), 글루텐 민감성 장질환 및 휘플병, 수포성 피부 질환, 다형성 홍반 및 접촉성 피부염 등과 같은 자가면역 또는 면역-매개 피부 질환, 건선, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 음식물 과민증 및 두드러기와 같은 알레르기성 질환, 호산구성 폐렴, 특발성 폐섬유증 및 과민성 폐렴과 같은 폐의 면역 질환, 이식편 거부반응 및 이식편 대 숙주 질환 등의 이식 관련 질환 등이 있으나 이에 한정되지는 않는다.
전신성 홍반 루푸스에서, 질환의 주요 매개인자는 자가 단백질/조직에 대한 자가반응성 항체의 생성 및 그 이후의 면역-매개 염증의 발생이다. 항체는 직접 또는 간접적으로 조직 손상을 매개한다. T 림프구가 조직 손상에 직접 관여하는 것으로 나타나지 않더라도, T 림프구는 자가반응성 항체 생성에 필요하다. 그러므로, 상기 질환의 발병은 T 림프구에 의존적이다. 신장, 폐, 근골격계, 피부점막, 눈, 중추신경계, 심혈관계, 위장관, 골수 및 혈액 등의 여러 조직 및 계가 임상적으로 영향을 받는다.
류마티스성 관절염 (RA)은 관절 연골의 손상과 함께 여러 관절의 활막이 주로 관련된 만성 전신성 자가면역 염증성 질환이다. 병원은 T 림프구 의존성이고, 류마티스성 인자, 자가 IgG 에 대한 자가항체의 생성과 관련되어 있으며, 결과적으로 면역 복합체가 형성되어 관절액 및 혈액에 높은 수준으로 존재하게 된다. 관절내에서 이러한 복합체는 림프구 및 단핵세포가 활막으로 현저하게 침윤되도록 한 후에 활막에서 상당한 변화가 일어나도록 유도할 수 있다 (수다수의 호중구가 추가되면서 유사한 세포들이 침윤하면 관절 공간/유액이 변화함). 영향을 받는 조직은 주로 관절이며, 흔히 대칭적인 패턴으로 나타난다. 그러나, 관절외 질환도 2 가지 주요 형태로 발생한다. 한 형태는 진행성 관절 질환이 진행중인 관절외 병변 및 폐섬유증, 맥관염 및 피부 궤양의 전형적 병변의 발생이다. 다른 한 형태의 관절외 질환은 이후에 때때로 RA 질환 과정의 후기, 때로는 관절 질환이 사라진 후에 발생하는 소위 펠티 증후군이며, 호중구 감소증, 혈소판 감소증 및 비종대의 존재를 포함한다. 이는 여러 기관에서 맥관염을 수반할 수 있으며, 경색증, 피부 궤양 및 괴저의 형성을 동반한다. 또한, 환자들에서는 흔히, 영향을 받은 관절 바로 위쪽의 피하 조직에서 류마티스성 결절이 일어나고, 결절 후기 단계에서는 혼합 염증 세포 침윤물로 둘러싸인 괴사 중심을 갖게 된다. RA에서 발생할 수 있는 다른 증상은 다음을 포함한다: 심막염, 흉막염, 관상 동맥염, 폐섬유증을 동반한 간질성 폐렴, 건성각결막염 및 류마티스성 결절.
유년형 만성 관절염은 흔히 16 세 미만에 시작하는 만성 특발성 염증성 질환이다. 이 표현형은 RA와 몇 가지 유사성이 있다: 류마티스성 인자가 양성인 몇몇 환자들은 유년형 류마티스성 관절염으로서 분류된다. 이 질환은 소수관절성, 다관절성 및 전신성의 3 가지 주요 범주로 더욱 분류된다. 관절염은 중증일 수 있고 보통 파괴적이며, 관절 강직 및 성장 지연을 초래한다. 다른 증상으로는 만성 전포도막염 및 전신성 유전분증을 포함할 수 있다.
척추관절증은 HLA-B27 유전자 생성물의 발현과 몇몇 공통적인 임상적 특징 및 공통된 관련성을 갖는 장애군이다. 이 장애는 다음을 포함한다: 강직성 척추염, 라이터 증후군 (반응성 관절염), 염증성 장질환과 관련된 관절염, 건선과 관련된 경화증, 유년형 척추관절증 및 비분화 척추관절증. 구별되는 특징으로는 척추염이 있거나 없는 천장골염; 염증성 비대칭 관절염; HLA-B27과의 관련성 (클래스 I MHC의 HLA-B 좌의 혈청학적으로 한정된 대립유전자); 안구 염증, 및 다른 류마티스성 질환과 관련된 자가항체의 부재가 포함된다. 질환 유도의 핵심으로 가장 많이 관련된 세포는 CD8+ T 림프구이고, 이 세포는 클래스 I MHC 분자가 표출하는 항원을 표적으로 한다. CD8+ T 세포는 클래스 I MHC 대립유전자 HLA-B27에 대해서 MHC 클래스 I 분자에 의해 발현된 외래 펩티드인 것처럼 반응할 수 있다. HLA-B27의 에피토프는 박테리아 또는 다른 미생물의 항원성 에피토프를 모방할 수 있어서 CD8+ T 세포 반응을 유도할 수 있음이 가설로 되어 있다.
전신성 경화증 (경피증)의 병인은 알려져있지 않다. 이 질환의 징후는 피부 경화이고, 이는 활성 염증 과정에 의해 유도되기 쉽다. 경피증은 국소적 또는 전신적일 수 있다; 혈관 병변은 공통적이고, 미소혈관계에서의 내피세포 손상이 전신성 경화증의 발생의 주요한 초기 사건이며, 혈관 손상은 면역-매개일 수 있다. 피부 병변에서의 단핵세포 침윤물 존재 및 다수의 환자에서의 항-핵 항체의 존재로 면역학적 근거가 암시된다. ICAM-1은 흔히 피부 병변에 있는 섬유아세포의 세포 표면상에서 상승조절되며, 이것은 이들 세포와 T 세포와의 상호작용이 질환의 병원에 역할을 할 수 있음을 시사한다. 기타의 관련 기관은 다음을 포함한다: 위장관 (비정상적인 연동운동/운동성을 초래하는 섬유증 및 평활근 위축); 신장 (소궁상동맥 및 소엽간동맥에 영향을 주어 결과적으로 신장 피질 혈류를 감소시키는 동심성 내피하층의 내막 증식은 단백뇨, 질소혈증 및 고혈압을 초래함); 골격근 (위측, 간질성 섬유증, 염증); 폐 (간질성 폐렴 및 간질성 섬유증); 및 심장 (수축 밴드 괴사, 반흔형성/섬유증).
피부근염, 다발성 근염 등을 비롯한 특발성 염증성 근장애는 근육 약화를 유발하는 병인 불명의 만성 근육 염증성 장애이다. 근육 손상/염증은 흔히 대칭적이며 진행성이다. 자가항체는 대부분의 형태와 연관이 있다. 이러한 근염-특이적 자가항체는 단백질 합성에 관여하는 성분, 단백질 및 RNA에 대항하여 이들의 기능을 억제한다.
쇼그렌 증후군은 면역-매개 염증성 및 후속의 눈물샘 및 침샘의 기능적 파괴에서 비롯된다. 상기 질환은 염증성 결합 조직 질환과 관련되거나 그와 동반될 수 있다. 이 질환은 Ro 및 La 항원 (둘 다 작은 RNA-단백질 복합체임)에 대한 자가항체 생성과 관련되어 있다. 병변은 담즙성 간경변, 말초 또는 감각 신경병증 및 촉지성 자반병을 비롯한 다른 증상 또는 관련 질환과 함께 건성각결막염, 구강건조증을 유발한다.
전신성 맥관염은 1차 병변이 염증, 및 감염된 혈관에 의해 공급되는 조직의 허혈/괴사/퇴행 및 일부 경우에서 결과적으로 말단 기관 기능부전을 초래하는 후속의 혈관 손상인 질환이다. 또한, 맥관염은 류마티스성 관절염, 전신성 경화증 등의 다른 면역 염증 매개성 질환, 특히 면역 복합체 형성과도 관련된 질환의 2차 병변 또는 후유증으로서 발생할 수 있다. 원발성 전신성 맥관염 군에 속하는 질환으로는 전신성 괴사성 맥관염: 결절성 다발 동맥염, 알레르기성 맥관염 및 육아종증, 다발성 맥관염; 베게너 육아종증; 림프종양 육아종증; 및 거대세포 동맥염이 포함된다. 그밖의 맥관염으로는 피부점막 림프절 증후군 (MLNS 또는 가와사키병), 단리성 CNS 맥관염, 베헤트병, 폐색성 혈전맥관염 (뷔르거병) 및 피부 괴사성 정맥염이 포함된다. 열거된 맥관염 유형 중 대부분의 병원성 메카니즘은 주로 혈관벽에서의 이뮤노글로불린 복합체의 침착 및 후속의 ADCC 또는 보체 활성화, 또는 둘 다를 통한 염증 반응의 유도에서 비롯된 것으로 여겨진다.
유육종증은 체내 거의 모든 조직에서의 상피양 육아종증의 존재를 특징으로 하는 병인 불명의 증상이며, 폐가 관련된다는 점이 가장 공통적이다. 병인에는 질환 부위에서 활성화된 대식세포 및 림프양세포의 존재가, 이들 세포 유형에 의해 방출된 국소적 및 전신적 활성 생성물의 방출로부터 야기되는 후속의 만성 후유증과 함께 포함된다.
자가면역 용혈성 빈혈, 면역성 범혈구감소증 및 발작성 야간혈색소뇨증을 비롯한 자가면역 용혈성 빈혈은 적혈구 (일부 경우에는 혈소판을 비롯한 다른 혈구) 표면에 발현된 항원과 반응하는 항체가 생성되어 야기된 결과이며, 상보체 매개성 용해작용 및(또는) ADCC/Fc-수용체 매개 메카니즘을 통해 이러한 항체-코팅 세포를 제거한 결과이다.
다른 임상 환경에서의 혈소판감소성자반병 및 면역-매개 혈소판감소증을 비롯한 자가면역 혈소판감소증에서, 혈소판 파괴/제거는 혈소판에 부착된 항체 또는 상보체 및 후속의 상보체 용해작용, ADCC 또는 Fc-수용체 매개 메카니즘에 의한 제거의 결과로서 발생한다.
그레이브병, 하시모토 갑상선염, 유년형 림프구성 갑상선염 및 위축성 갑성선염을 비롯한 갑상선염은 갑상선에 존재하고 흔히 갑상선에 특이적인 단백질과 반응하는 항체를 생성하는, 갑상선 항원에 대한 자가면역 반응의 결과이다. 자발적 모델 (래트 (BUF 및 BB 래트) 및 치킨 (비만계 치킨)); 유도가능한 모델 (티로글로불린, 갑상선 미소체 항원 (갑상선 과산화효소)을 이용한 동물의 면역화)을 비롯한 실험 모델이 존재한다.
I형 진성 당뇨병 또는 인슐린-의존성 당뇨병은 이자샘 세포의 자가면역 파괴이며, 이러한 파괴는 자가항체 및 자가반응성 T 세포에 의해 매개된다. 또한, 인슐린 또는 인슐린 수용체에 대한 항체는 인슐린 비반응성의 표현형을 생성할 수 있다.
사구체신염 및 세뇨관간질성신염을 비롯한 면역-매개 신장 질환은 직접적으로 신장 항원에 대한 자가반응성 항체 또는 T 세포의 생성 결과이거나 또는 간접적으로 신장에서 다른 비-신장 항원에 대해 반응성인 항체 및(또는) 면역 복합체 침착의 결과로서, 신장 조직에 대한 항체 또는 T 림프구 매개된 손상의 결과이다. 그러므로, 면역 복합체의 형성을 초래하는 다른 면역-매개 질환은 또한 간접적인 후유증으로 면역-매개 신장 질환을 유도할 수 있다. 직접 및 간접 면역 메카니즘 모두가 신장 조직에서 병변 발생을 생성/유도하는 염증 반응을 초래하여 결과적으로 기관 기능 손상 및 일부 경우에서 신부전으로의 진행을 초래하게 된다. 체액성 및 세포성 면역 메카니즘 모두가 병변의 병인에 관여할 수 있다.
다발성 경화증; 특발성 탈수초성 다발성 신경염 또는 길랑-바레 증후군; 및 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경염을 비롯한 중추 및 말초 신경계의 탈수초성 질환은 자가면역이며, 희소돌기아교세포 또는 마이엘린에 직접 발생된 손상의 결과로서 신경의 탈수초를 유발하는 것으로 여겨진다. MS에서 질환 유도 및 진행은 T 림프구에 의존적임을 나타내는 증거가 존재한다. 다발성 경화증은 T 림프구 의존성이며, 재발-이장 과정 또는 만성 진행성 과정을 갖는 탈수초 질환이다. 병인은 알려져 있지 않으나, 바이러스 감염, 유전적 소인, 환경 및 자가면역 모두가 기여한다. 병변은 주로 T 림프구 매개된, 소교세포 및 침윤성 대식세포의 침윤물을 함유하고, CD4+T 림프구는 병변에서 우세한 세포 유형이다. 희소돌기아교세포의 사망 및 후속의 탈수초 메카니즘은 알려져 있지는 않으나, 거의 T 림프구에 의한 것이다.
호산구성 폐렴, 특발성 폐섬유증 및 과민성 폐렴을 비롯한 염증성 및 섬유성 폐 질환은 조절장애성 면역 염증 반응을 포함할 수 있다. 이러한 반응의 억제는 치료상 이로울 것이다.
수포성 피부 질환, 다형성 홍반 및 접촉성 피부염을 비롯한 자가면역 또는 면역-매개 피부 질환은 자가항체에 의해 매개되며, 이의 병원은 T 림프구 의존성이다.
건선은 T 림프구 매개 염증성 질환이다. 병변은 T 림프구, 대식세포 및 항원 프로세싱 세포 및 특정 호중구의 침윤물을 함유한다.
천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 음식물 과민증 및 두드러기를 비롯한 알레르기성 질환은 T 림프구 의존성이다. 이들 질환은 주로 T 림프구 유도성 염증, IgE 매개 염증 또는 이 둘 모두의 조합에 의해 매개된다.
이식편 거부반응 및 이식편 대 숙주 질환 (GVHD)을 비롯한 이식 관련 질환은 T 림프구 의존성이며, T 림프구 기능을 억제하는 것이 개선적이다.
면역 및(또는) 염증 반응의 개입이 이로운 다른 질환으로는 바이러스 감염 (AIDS, A, B, C, D, E형 간염 및 허피스가 포함되나 이에 한정되는 것은 아님), 박테리아 감염, 진균성 감염, 및 원생동물 감염 및 기생충 감염 (MLR을 자극하는 분자 (또는 유도체/효능제)는 감염제에 대한 면역 반응을 강화시키기 위해 치료적으로 이용될 수 있음), 면역 결핍 질환 (MLR을 자극하는 분자/유도체/효능제는 유전적, 후천적, (HIV 감염에서와 같은) 감염 유도 증상, 또는 의원성 (즉, 화학요법으로 인한) 증상에 대한 면역 반응을 강화시키기 위해 치료적으로 이용될 수 있음), 및 신생물 (이에 한정되는 것은 아님)을 비롯한 감염성 질환이다.
일부 인간 암환자에서는 신생물 세포 상의 항원에 대한 항체 및(또는) T 림프구가 발생하는 것으로 입증되었다. 면역 반응의 증가로 특정 신생물이 거부 또는 퇴행될 수 있음이 신생물 동물 모델에서 나타났다. MLR의 T 림프구 반응을 강화시키는 분자는 생체내에서 신생물에 대한 면역 반응을 강화시키는 데 유용하다. MLR의 T 림프구 증식 반응을 강화시키는 분자 (또는 동일한 수용체에 효능제 방식으로 영향을 주는 소분자 효능제 또는 항체)는 암 치료에 치료적으로 사용될 수 있다. MLR의 림프구 반응을 억제하는 분자는 또한 생체내에서 종양 형성 동안 신생물에 대한 면역 반응을 억제하는 기능을 할 수 있으며, 이러한 분자는 종양 세포 자체에 의해 발현될 수 있거나 또는 이들의 발현은 다른 세포의 신생물에 의해 유도될 수 있다. 상기 억제성 분자 (항체, 소분자 길항제 또는 다른 수단 포함)의 길항작용은 면역-매개 종양 거부를 강화시킨다.
또한, 염증전 특성을 갖는 분자의 억제는 재관류 손상, 졸중, 심근 경색, 아테롬성 동맥경화증, 급성 폐 손상, 출혈성 쇼크, 화상, 패혈증/패혈성 쇼크, 급성 관상 괴사, 자궁내막증, 퇴행성 관절 질환 및 췌장염에서 치료상 이로울 수 있다. 본 발명의 화합물, 예를 들어, 폴리펩티드 또는 항체는 포유동물, 바람직하게는 인간에게 공지된 방법, 예를 들어, 볼루스와 같은 정맥내 주사로 또는 근육내, 복강내, 뇌내 척수, 피하, 관절내, 활액낭내, 경막내, 구강내, 국소 또는 흡입 (비내, 폐내) 경로를 통한 장시간에 걸친 연속 주입으로 투여된다. 폴리펩티드 및 항체의 정맥내 또는 흡입 투여가 바람직하다.
면역보강제 요법에서, 다른 치료 요법, 예를 들어, 항암제 투여는 본 발명의 단백질, 항체 또는 화합물의 투여와 조합될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 면역보강제로 치료받을 환자는 항암제 (화학요법제) 또는 방사선 치료도 받을 수 있다. 이러한 화학요법제를 위한 제제 및 투약 일정은 제조업자의 지침에 따라 또는 숙련의의 경험적 결정에 따라 이용될 수 있다. 이러한 화학 요법을 위한 제제 및 투약 일정은 문헌 [Chemotherapy Service, Ed., M.C. Perry, Williams ＆ Wilkins, Baltimore, MD (1992)]에도 기재되어 있다. 화학요법제는 면역보강제 투여 이전 또는 이후에 투여되거나, 그와 동시에 투여될 수 있다. 또한, 타목시펜 등의 항에스트로겐 화합물 또는 오나프리스톤 (EP 616812 참조) 등의 항프로게스테론은 상기 분자에 대해 공지된 투여량으로 제공될 수 있다.
또한, CD20, CD11a CD18, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 또는 혈관 내피 인자 (VEGF)에 결합하는 항체와 같은, 다른 면역 질환 관련 또는 종양 관련 항원에 대한 항체를 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 본원에 개시된 동일 또는 2종 이상의 여러 항원에 결합하는 2종 이상의 항체를 환자에게 공동 투여할 수 있다. 또한, 때로는 환자에게 1종 이상의 사이토카인을 투여하는 것이 이로울 수 있다. 한 실시양태에서, IL-17A/F 폴리펩티드는 성장 억제제와 공동 투여된다. 예를 들어, 성장 억제제가 우선 투여된 후에 IL-17A/F 폴리펩티드가 투여될 수 있다. 그러나, 동시 투여 또는 우선 투여도 고려된다. 성장 억제제의 적합한 투여량은 현재 사용되고 있는 양이며, 성장 억제제 및 IL-17A/F 폴리펩티드의 상승 작용 (시너지 효과)으로 인해 낮춰질 수 있다.
면역 관련 질환의 치료 또는 중증도 감소를 위해, 본 발명의 화합물의 적절한 투여량은 상기 정의된 바와 같은 치료할 질환의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 작용제가 예방 목적으로 투여되는지 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 요법, 환자의 임상 이력 및 상기 화합물에 대한 반응, 및 담당 의사의 판단에 따라 달라질 것이다. 상기 화합물은 한번에 또는 일련의 처치를 통해 환자에게 적합하게 투여된다.
예를 들어, 질환의 유형 및 중증도에 따라, 폴리펩티드 또는 항체 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1 내지 20 mg/kg)이 예를 들어, 1회 이상의 개별 투여에 의해 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 내지 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여 기간 동안, 질환의 증세가 원하는 정도로 억제될 때까지 상태에 따라 치료를 지속한다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행상태는 통상적인 기술 및 분석법에 의해 용이하게 모니터링된다.
S. 제조품
본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 기재된 장애의 진단 또는 치료에 유용한 물질을 함유하는 (예를 들어, IL-17A/F 분자를 포함하는) 제조품이 제공된다. 상기 제조품은 용기 및 사용설명서를 포함한다. 적합한 용기로는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 및 시험관이 포함된다. 상기 용기는 다양한 재료, 예를 들어, 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 증상의 진단 또는 치료에 효과적인 조성물을 담지하며, 멸균 액세스 포트 (access port)를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사용 바늘이 관통할 수 있는 마개가 있는 정맥내 투여용 용액제 백 또는 바이알일수 있음). 조성물 중의 활성제는 일반적으로 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체이다. 용기 상의 (또는 용기와 관련된) 사용설명서 또는 라벨은 조성물이 선별된 증상의 진단 또는 치료에 사용됨을 명시한다. 제조품은 제약상 허용되는 완충액, 예를 들어, 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 더 포함할 수 있다. 제조품은 상업적 및 사용자적 관점에서 바람직한 다른 물질, 예를 들어, 다른 완충액, 희석제, 여과기, 바늘, 주사기, 및 사용설명서를 담은 패키지 삽입물을 더 포함할 수 있다.
T. 면역 관련 질환의 진단 및 예후
세포 표면 단백질, 예를 들어, 특정 면역 관련 질환에서 과발현된 단백질은 약물 후보물질 또는 질환 치료를 위한 탁월한 표적이다. 면역 관련 질환 상태에서 증폭된 유전자에 의해 코딩되는 분비된 단백질과 함께 동일 단백질이 상기 질환의 진단 및 예후에서도 사용된다. 예를 들어, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환 또는 다른 면역 관련 질환에서 증폭된 유전자의 단백질 생성물에 대항하는 항체가 진단기준 (diagnostic) 또는 예후기준 (prognostic)으로서 사용될 수 있다.
예를 들어, 항체 단편을 비롯한 항체는 증폭되거나 과발현된 유전자에 의해 코딩된 단백질 ("마커 유전자 생성물")의 발현을 정성적으로 또는 정량적으로 검출하는 데 사용될 수 있다. 항체에는 예를 들어, 형광 표지 등의 검출가능한 표지가 장착되는 것이 바람직하고, 광학 현미경법, 유동 세포계측법, 형광측정법, 또는 당업계에 공지된 다른 기술에 의해 결합을 모니터링 할 수 있다. 이들 기술은 과다발현된 유전자가 세포 표면 단백질을 코딩하는 경우에 특히 적합하다. 이러한 결합 분석은 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 수행된다.
마커 유전자 생성물에 결합된 항체의 동일계 검출은 예를 들어, 면역형광법 또는 면역전자 현미경법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 환자로부터 조직학적 표본을 분리하여 바람직하게는 생물학적 샘플 상에 항체를 중첩시킴으로써 표지 항체를 조직학적 표본에 적용한다. 이러한 방법에 의해서 검사 조직에서의 마커 유전자 생성물의 분포도도 측정할 수가 있다. 당업자에게는 광범위한 조직학적 방법이 동일계 검출에서 용이하게 이용될 수 있음이 명백할 것이다.
하기 실시예는 예시를 목적으로만 제공되며, 본 발명의 범주를 어떤 식으로든 제한하려는 것이 아니다.
이로써 본 명세서에 인용된 모든 특허 및 참고문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
하기 실시예에 언급된 시판되는 시약들은 달리 지시되지 않는다면 사용 지침서에 따라 사용하였다. 하기 실시예와 본원 명세서 전반에서 ATCC 기탁 번호로 나타낸 세포들의 입수원은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (미국 버지니아주 매나서스 소 재)이다.
실시예 1
IL-17A/F로 나타낸 신규한 IL-17 사이토카인 의 재조합 발현
IL-17 및 IL-17F를 코딩하는 cDNA 발현 벡터를 사용한 인간 293 신장 세포의 형질감염
인산칼슘 침전법을 이용하여 인간 293 신장 세포를 인간 IL-17, IL-17C 및 IL-17F 유전자를 코딩하는 동일량의 플라스미드로 형질감염시켰다. 각 50％-80％ 전면성장 T-150 플라스크에서, 각각의 플라스미드 50 ㎍을 혼합하여 침전물을 형성시켜 세포 상에 층을 생성하였다. 형질감염 1 일 후, 10％ FCS, 5 mM L-글루타민, 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 50:50 F12:DMEM을 제거하고, 혈청-무함유 PS24 배지로 대체하고, 4 일간 추가로 배양하였다. 4 일 후, 조건화 배지를 원심분리하여 수집하고, 멸균 여과한 후에 정제하였다.
재조합 IL-17A/F의 정제
A. 초기 분획 단계 1:
인간 293 신장 세포 일시적 배양물로부터의 재조합 IL-17A/F 조건화 배지 2.5 l를 10 kD 컷오프 (cutoff) 막을 사용하여 20 mM 나트륨 아세테이트 (pH 5.0), 1 mM 나트륨 아지드 (완충액 A)에 대해 480 ml의 부피로 농축 및 투석한 후, 파마시아 HiLoad S 세파로스 (Pharmacia HiLoad S Sepharose) 26/10 컬럼에 6 ml/분으로 인가하였다. 컬럼을 1％/분의 속도에서 6 ml/분의 유속으로 선형 구배를 사용하여 100％ 완충액 B (20 mM 나트륨 아세테이트, 1 M NaCl, 1 mM 나트륨 아지드, pH 5.0)로 용출하여 분획 12 ml를 수집하였다. 이 컬럼으로부터 수집한 분획물 상에서 SDS PAGE 분석을 수행하였다. 은 염색으로 단백질을 나타냈다. 겔 함유 분획물 25-37 (도 2)에 대해 분자량 마커를 표지하였다. 분획물 31 및 32는 IL-17A/F와 일치하는 약 33 kD의 분자량을 명백히 갖는 단백질을 함유하였다.
B. IL-17A/F의 정제:
분획 32 (도 2) 4 ml를 0.1％ 트리플루오로아세트산으로 산성화시키고, 이어서 0.1％ 트리플루오로아세트산 (완충액 C)에서 평형화된 비닥 C4 컬럼에 0.5 ml/분으로 인가하고, 100％ 완충액 D (100％ 아세토니트릴 중의 0.1％ 트리플루오로아세트산)로 3 단계 구배 (10분에 걸쳐 0-35％ D, 35분에 걸쳐 35-50％ D, 10분에 걸쳐 50-100％ D)를 사용하여 구배 용출하였다. 도 2는 214 nm 및 280 nm에서 측정한 용출된 단백질의 크로마토그래피를 나타낸다. 아세토니트릴 단계 구배는 프로파일 상에 있다. 분획 38의 단백질 농도는 아미노산 분석에 의해 0.536 mg/ml인 것으로 밝혀졌다. 겔, 블롯, 아미노산 서열 및 활성 분석을 이 분획 상에서 수행하였다.
HiLoad S 세파로스 시험으로부터의 분획 31 및 분획 32의 나머지 부피를 모으고, 10 kD 컷오프 막을 사용하여 8 시간 동안 완충액 A에 대해 투석하고, 0.2 ㎛ 필터를 통해 통과시켰다. 이 물질을 완충액 A 중에 평형화된 Mono S 컬럼 상에 유속 1 ml/분으로 적하하고, 3 단계 구배를 사용하여 100％ 완충액 B (10배 컬럼 부피에 걸쳐 0-30％ B, 45배 컬럼 부피에 걸쳐 30-75％ B, 10배 컬럼 부피에 걸쳐 75-100％ B)로 용출하며 1 ml/분획으로 수집하였다. 분획 26-43을 분석하고, 단백 질 농도를 아미노산 분석으로 측정하였다. 분획 31, 32 및 33의 농도는 각각 0.258, 0.359 및 0.291 mg/ml이었다. 겔, 블롯, 아미노산 서열, 질량 광도법 및 활성 분석법을 분획 32 및 33에 대해 우선 수행하였다. 크로마토그래피에 의해 생성된 분획들을 웨스턴 블롯팅으로 IL-17 및 IL-17F 함유물에 대해 분석하였다. IL-17 또는 IL-17F에 대해 결합하는 모노클로날 항체 1 ㎍/ml를 사용하여 샘플 중의 IL-17 또는 IL-17F의 존재를 검출하였다.
IL-17A/F의 질량분광법 분석
성숙한 IL-17A/F의 아미노산 서열 및 쇄간 디술피드 결합을 질량분광법 분석으로 측정하였다 (도 4A 참조;IL-17A/F 이종이량체성 폴리펩티드는 쇄간 및 쇄간 디술피드 연결기를 갖는 것으로 나타남). 2개의 쇄간 디술피드 연결기를 IL-17F 및 IL-17 폴리펩티드 쇄 [각각 잔기 47IL-17F 및 잔기 129IL-17 간에; 및 잔기 1371L-17F 및 잔기 31IL-17 간에] 간에 검출하였다 (도 4A 중에 굵은 흑색선). 또한, 2개의 쇄간 디술피드 결합은 동종이량체 폴리펩티드 쇄 IL-17 [잔기 102 및 152 간에; 및 잔기 107 및 154 간에] 및 IL-17F [잔기 94 및 144 간에; 및 잔기 99 및 146 간에] 각각 형성된다 (도 4A 중에 가는 흑색선). 아미노산은 각각의 전구체 폴리펩티드 쇄 중의 최초 메티오닐에 상대적으로 번호를 부여한다 (도 4A). 도 4B는 트립신으로 IL-17A/F를 절단함으로써 예상되는 IL-17 및 IL-17F 쇄 간의 디술피드 결합을 함유한 IL-17A/F 펩티드 단편의 개략도를 나타낸다 (각각, IL-17A/F 디술피드 결합 단편 #1은 서열 7로서 지정되고; IL-17A/F 디술피드 결합 단편 #2는 서열 8로서 지 정됨). 이들 단편 내에 함유된 아미노산은 각 쇄의 최초 메티오닐에 대해 상대적으로 나타내고, 번호를 부여한다.
질량분광법에 의해 관측될 이들 단편의 계산된 대략적인 분자 질량은 도 4B에 3410.58 Da 및 2420.05 Da [각각, IL-17A/F 디술피드 결합단편 #1 및 #2]으로 나타났다. 매트릭스-보조된 레이저 이탈/이온화 비행시간 질량분광법 (MALDI-TOF) 펩티드 맵핑을 수행하였다 (도 4C). 20 mM NaOAC 완충액 pH 5, 400 mM NaCl 완충액 중의 55 pmol IL-17A/F를 프로메가(Promega) 서열분석 등급 트립신으로 37℃에서 밤새 절단하였다. 매트릭스-보조된 레이저 이탈/이온화 비행시간 질량분광법 (MALDI-TOF)은 2',4',6'-트리히드록시아세토페논 매트릭스를 사용하는 양이온 반사(reflectron) 방식에서 지연된 추출로 수행하였다. 생성된 펩티드 맵은 디술피드 연결된 펩티드가 일관된 단편 #2 및 단편 #1에 대해 각각 [M+H] + = 2420.12 Da 및 3410.60 Da의 피크를 함유하였다 (도 4C). 제2 샘플 분취액을 pH 8에서 절단한 후에, 디티오트레이톨로 디술피드 결합을 환원시키고, 요오도아세트아미드로 술프히드릴기를 알킬화시켰다. 이 샘플의 MALDI-TOF 스펙트럼은 해당 피크가 없고, 디술피드-연결된 그의 배열을 지지하였다. 비환원된 샘플을 액체-크로마토그래피 전자분무 이온화 이온 트랩 질량분광법 (LC-ESI-MS)에 의해 추가로 특성화하였다 (도 4D). 이온 크로마토그램은 총 이온 크로마토그램 (상부부터 하부까지)을 나타내고, IL-17A/F 디술피드 결합 단편 #2 [M+2H]2+, 및 IL-17A/F 디술피드 결합 단편 #1 [M+2H]3+의 이온 크로마토그램 (RIC)을 다시 제조하였다. 모든 이종이량체는 일관된 피크가 관찰된 반면에, 배경 화학적 노이즈 상의 피크는 동종이량체성 펩티 드의 예상 질량에서 관찰되지 않았기 때문에 이는 IL-17 또는 IL-17F 동종이량체의 부재를 나타낸다. 디술피드-연결 이종이량체의 조성물을 일련의 질량분광법에 의해 이어서 확인하였다. m/z 1210.9에서의 이중 하전 전구체의 충돌-유도 해리는 IL-17A/F 디술피드 결합 단편 #2에 상응하고, m/z 1138.0에서의 삼중 하전 전구체는 IL-17A/F 디술피드 결합 단편 #1에 상응하였다. 예상된 b- 및 y-이온 시리즈 단편 피크는 상응하는 스펙트럼에서 관찰되었다.
IL-17A/F에 결합하는 항체에 대한 파지 라이브러리 스크리닝
IL-17A/F에 결합하는 항체를 확인하기 위해, 합성 Fab 항체의 파지 라이브러리를 스크리닝하였다. 독특한 Fab 항체 서열을 코딩하는 34개의 독립 클론을 동정하였다. 이는 IL-17A/F에 대한 결합을 매개할 수 있었다. 인간 항체 서열의 파지 라이브러리를 제조하고, 상기 문헌 [Gerstner, R. B. et al., J. Mol . Biol ., 321(5): 851-62 (2002)]에 기재된 바와 유사한 방식으로 항원 특이적 Fab에 대해 스크리닝하였다. 간략하게, 인간화 모노클로날 항체 4D5인 항-HER2 항체를 골격 (scaffold)으로서 사용하여 파지 디스플레이 Fab 라이브러리를 제작하였다. 이들 Fab는 동종이량체화가능 류신 지퍼에 융합시킴으로써 파지 상에 1 및(또는) 2가적으로 디스플레잉하였다. 라이브러리 다양성을 생성하기 위해, 본 발명자들은 천연 항체 서열의 카바트(Kabat) 데이타베이스에서 고도로 다양화시키는 것으로도 밝혀진 표면 노출 중쇄 CDR 잔기를 랜덤화하고, 근접 패치를 형성하는 것을 선택하였다. 또한, 본 발명자들은 맞춤 다의성 코돈 (tailored degenerate codon)을 사용하는 부위-지정 돌연변이 유발법을 사용하여 CDR 부위 각각에서 천연 면역 레퍼토 리를 모방한 아미노산 다양성을 생성시켰다. 중쇄의 2개의 제1 CDR인 H1 및 H2는 헤르셉틴(Herceptin)으로서 동일한 길이의 제한된 다양성을 허용하는 반면에, H3은 7 내지 19 범위의 길이로 높은 다의성을 가지도록 고안하였다. 초기 라이브러리 선별로부터 생산된 모든 항체는 동일한 경쇄를 가진다. 전장 IgG 또는 Fab는 중쇄 가변 도메인을 벡터 내에 1단계 클로닝하여 원하는 이소타입 특이적 불변 영역 서열을 제공함으로써 생산할 수 있다. 중쇄 라이브러리로부터의 결합체의 친화성을 추가로 개선하기 위해, 경쇄 CDR의 2단계 랜덤화를 사용할 수 있다. IL-17A/F에 결합하는 Fab로부터의 3개의 CDR [H1-H3]을 함유한 중쇄의 가변 도메인의 영역의 아미노산 서열을 도 6에 나타낸다. IL-17A/F에 결합할 수 있는 독특한 항체 중쇄 서열을 코딩하는 34 Fab 클론의 예상 아미노산 서열의 영역의 정렬을 나타낸다. 3개의 중쇄 CDR 영역은 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3으로 나타내고, 각각 음영으로 나타낸다. 각각의 클론에 대한 상응하는 서열 번호는 하기와 같다: 각각 클론 #1 = 서열 9; 클론 #2 = 서열 10; 클론 #3 = 서열 11; 클론 #4 = 서열 12; 클론 #5 = 서열 13; 클론 #6 = 서열 14; 클론 #7 = 서열 15; 클론 #8 = 서열 16; 클론 #9 =서열 17; 클론 #10 = 서열 18; 클론 #11 = 서열 19; 클론 #12 = 서열 20; 클론 #13 = 서열 21; 클론 #14 = 서열 22; 클론 #15 = 서열 23; 클론 #16 = 서열 24; 클론 #17 = 서열 25; 클론 #18 = 서열 26; 클론 #19 = 서열 27; 클론 #20 =서열 28; 클론 #21 = 서열 29; 클론 #22 = 서열 30; 클론 #23 = 서열 31; 클론 #24 = 서열 32; 클론 #25 = 서열 33; 클론 #26 = 서열 34; 클론 #27 = 서열 35; 클론 #28 = 서열 36; 클론 #29 = 서열 37; 클론 #30 = 서열 38; 클론 #31 = 서열 39; 클론 #32 = 서열 40; 클론 #33 = 서열 41; 클론 #34 = 서열 42.
또한, 34개의 클론 각각에 대한 상응하는 코딩 DNA 서열을 하기 표 7에 나타낸다 (각각 서열 43 내지 서열 76).
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세포기재 분석법 - IL-17A/F는 IL-8 및 IL-6의 생산을 유도한다
상기 기재한 비닥 C4 정제 단계 (도 3)로부터 단리한 분획은 IL-8의 생산을 유도하는 IL-17A/F의 능력에 대해 분석하였다. 분획을 TK-10 세포와 24 시간 동안 인큐베이션함으로써 시험하였다 (분획 0.033 ㎕/세포 배양 배지 1 ml). 이어서, 조절된 배지를 이어서 수집하고, IL-8 및 IL-6 농도 측정을 각각의 분획에 대해 ELISA에 의해 수행하였다. 분획 38이 강력한 활성을 가지는 것으로 밝혀졌다. 분획 38의 단백질 농도는 아미노산 분석에 의해 0.536 mg/ml인 것으로 밝혀졌다. 겔, 블롯, 아미노산 서열 및 활성 분석을 이 분획에 대해 수행하였다 (도 3). 달리, HiLoad S 세파로스 시험으로부터의 분획 31 및 분획 32의 잔존 부피를 모으고, 10 kD 컷오프 막을 사용하여 8시간 동안 완충액 A에 대해 투석하고, 0.2 ㎛ 필터를 통해 통과시켰다. 이 물질을 유속 1 ml/분에서 완충액 A 중에 평형화된 Mono S 컬럼 상에 적하하고, 3 단계 구배로 100％ 완충액 B (10배 컬럼 부피에 걸쳐 0-30％ B, 45배 컬럼 부피에 걸쳐 30-75％ B, 10배 컬럼 부피에 걸쳐 75-100％ B)로 용출하며 1 ml/분획으로 수집하였다. 분획 26-43을 분석하고, 단백질 농도를 아미노산 분석으로 측정하였다. 순수한 IL-17A/F를 겉보기 분자 질량 30-35 kD을 갖는 단일 단백질로서 분획 31-33에서 확인하였다. 분획 31, 32 및 33의 농도는 각각 0.258, 0.359 및 0.291 mg/ml이었다. 겔 및 단백질 서열 분석은 이 물질이 C4 컬럼 (상기)에 의해 정제한 IL-17A/F와 동일한 것으로 나타냈다. IL-17A/F, IL-17 및 IL-17F에 의한 IL-8 및 IL-6 유도를 비교하는 투여량 반응 곡선을 도 5에 나타낸다. IL-17A/F, IL-17 및 IL-17F를 표시된 농도에서 24시간 동안 TK-10 세포와 인큐베이션하였다. TK-10 조절된 배지를 수집하고, IL-8 ELISA 및 IL-6 ELISA에 의해 분석하였다.
논의
IL-17 및 IL-17F에 대한 mRNA의 동시발현은 IL-17에 결합할 수 있는 특정 항체 및 IL-17F에 결합할 수 있는 특정 항체 모두에 결합할 수 있는 신규 단백질 종의 분비를 유도한다. 이 신규 단백질 종을 인터루킨-17A/F(IL-17A/F)로서 본원에 나타낸다. 이 종은 인간 신장 293 세포가 단리물에서 IL-17 또는 IL-17F를 발현하도록 하는 경우에 관찰되지 않는다. 형질감염된 세포로부터의 조절된 배지는 도 1A 및 도 1B에 나타난 바와 같이 IL-17 (레인 1-5) 또는 IL-17F (레인 6-10)를 인식할 수 있는 항체를 사용하여 면역침전(IP)시켰다. 면역침전된 단백질을 이어서 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석하고, IL-17 (도 1A) 또한 IL-17F (도 1B)에 대한 항체로 블롯팅하였다. IL-17A/F의 검출은 IL-17F와의 이량체성 복합체로서 IL-17의 존재에 의해 도 1A의 레인 8 및 도 1B의 레인 3에서 나타난다. 이러한 종의 분자 질량은 비-환원성 SDS-PAGE에 의해 측정된 바와 같이 공유결합성 연결기에 의해 연결된 한 분자의 IL-17 및 한 분자의 IL-17F로 이루어진 종과 일치하게 대략 30-35 kD이다. 이 새로운 종 (IL-17A/F)의 존재는 IL-17 또는 IL-17F가 단리물에서 발현되는 경우에 관찰되는 것과는 다른 전기영동 이동성 단백질로서 인식될 수도 있다. 이와 같이, 이 새로운 종은 기타 단백질 검출 방법, 예컨대 통상적 단백질 염색 기술을 사용하여 항체의 사용 없이 가시화될 수도 있다.
또한, IL-17 및 IL-17F의 조-발현에 의해 생산된 신규 단백질 종의 존재는 역상 크로마토그래피로 조절된 배지에 존재하는 분비된 단백질을 분해함으로써 관찰하였다. IL-17 또는 IL-17F를 생산하는 세포로 관찰되는 패턴을 갖는, IL-17 및 IL-17F를 조-발현하는 세포에 의해 생산된 분비 단백질로부터 관찰된 단백질 분획을 비교하여 추가 단백질 종의 존재를 밝혀냈다. 이 단백질 종인 IL-17A/F를 정제하고, 컬럼 크로마토그래피에 의해 균질하게 단리하였다 (도 2 및 3).
정제된 단백질은 비-환원 SDS- PAGE에 의해 측정한 바와 같이 대략 30-35 kD의 단일 밴드로서 주행하였다 (도 3A). 그러나, 환원 조건하에 2개의 명확히 구분되는 밴드는 겉보기 분자 질량이 대략 15-18 kD임을 나타냈다 (나타내지 않음). 따라서, IL-17A/F는 공유결합 이량체이다. 신규 단백질의 조성을 평가하는 독립적 수단인 N-말단 펩티드 서열 분석도 단리된 IL-17A/F가 IL-17 및 IL-17F 펩티드 모두를 함유한다는 것을 명확히 나타냈다 (도 3B). 검출된 펩티드 서열이 IL-17 및 IL-17F의 N-말단 종단부 내에 함유된 서열과 동일하다 (도 3C). 웨스턴 블롯 분석은 이 신규 단백질 종이 IL-17에 결합할 수 있는 항체 및 IL-17F에 결합할 수 있는 항체 모두와 상호작용할 수도 있다는 것을 나타냈다. 신규 단리된 단백질 종 각각에 대한 관찰 결과 및 이들의 상이한 분자 질량은 단리된 단백질 IL-17A/F가 IL-17 및 IL-17F의 공유결합적 연결로 이루어진 신규 단백질 종임을 제안한다.
IL-17A/F의 IL-17 및 IL-17F 쇄를 연결하는 디술피드 결합의 존재 및 위치는 질량분광법의 사용에 의해 추가로 특성화되었다. IL-17A/F 내의 디술피드 연결기의 위치는 도 4A에 개략적으로 나타낸다. 2개의 쇄간 디술피드 결합은 IL-17A/F 중의 IL-17 및 IL-17F 쇄를 연결한다. 트립신을 사용하는 IL-17A/F의 절단은 쇄간 디술피드 결합을 함유하는 2개의 상이한 펩티드 단편 (각각, IL-17A/F 디술피드 결합 단편 #1 및 #2; 서열 7 및 8)을 생산할 것으로 예상된다. 이들 펩티드는 각 예상 분자 질량과 함께 개략적으로 나타낸다 (도 4B). 이들 펩티드는 매트릭스-보조된 레이저 이탈/이온화 비행시간 질량분광법 (MALDI-TOF) (도 4C) 및 액체-크로마토그래피 전자분무 이온화 이온 트랩 질량분광법 (LC-ESI-MS) (도 4D)에 의해 관찰하였다. IL-17 또는 IL-17F의 동종이량체에 상응하는 펩티드 피크는 검출되지 않았으며, 이는 정제된 IL- 17A/F가 IL-17 및 IL-17F 쇄의 공유결합 이종이량체로 이루어지고, IL-17 또는 IL-17F의 검출가능 수준의 동종이량체를 함유하지 않았음을 나타낸다.
또한, IL-17A/F에 결합한 항체는 합성 Fab 항체의 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 동정하였다. 독특한 Fab 항체 서열을 코딩하는 34개의 독립 클론을 동정하였다. 이들은 IL-17A/F에 대한 결합을 매개할 수 있었다. IL-17A/F와 결합하는 Fab로부터 3개의 CDR [H1-H3]을 함유한 중쇄의 가변 도멘인의 영역의 아미노산 서열을 도 6에 나타낸다. IL-17A/F에 결합할 수 있는 독특한 항체 중쇄 서열을 코딩하는 34개의 Fab 클론의 예상 아미노산 서열 영역의 배열을 나타낸다. 3개의 중쇄 CDR 영역을 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3으로 각각 나타내고, 이를 황색으로 강조하였다. 각각의 34개의 클론에 상응하는 아미노산 서열은 서열 9-42와 동일하다. 또한, 각각의 동정된 34개의 클론에 상응하는 코딩 DNA 서열을 하기 표 7에 나타낸다 (각각, 서열 43 내지 서열 76). 따라서, IL-17A/F의 신규 이종이량체성 복합체에 대해 선택적으로 결합하는 특이적 항체는 이 신규 사이토카인의 활성을 조정하기 위해 제공될 수 있는 것으로 확인되었다.
IL-17A/F는 TK-10 인간 신장 세포주를 사용하여 전염증 반응을 자극하는 능력에 대해 분석하였다 (도 5). 이 세포주는 IL-8의 생산에 의해 IL-17 및 IL-17F 모두에 반응한다. IL-17A/F는 이 세포주에서 IL-8 생산을 또한 강력하게 유도하였다 (도 5A). 흥미롭게도, IL-17A/F는 IL-17 또는 IL-17F의 것과는 상이한 독특한 역가를 가지는 것으로 관찰되었다. 활성의 차이는 각 경우에 대략적으로 크기 순에 따라 IL-17 및 IL-17F와는 상이하다. 이 분석에서 IL-17F보다 IL-17A/F가 실질적으로 큰 활성을 가진다는 것은 IL-17A/F가 IL-17F 유전자 생산물로부터 생성된 사이토카인 활성의 중요한 성분을 포함할 수 있다는 것을 제안한다. 이 독특한 역가는 분자가 생체내에서 별개 범위의 작용을 가질 수 있게 할 수 있다. IL-17A/F는 또한 이 세포주로부터의 IL-6의 생산을 유도하였다 (도 5B). 또한, IL-17A/F가 IL-17 또는 IL-17F에 존재하지 않는 추가의 특성을 가질 수 있어서 그의 신규 이종이량체성 조성이 동력학 및 생체내에서 수용체 서브유닛의 사용을 조정할 수 있고, 그 결과 독특한 생물학적 결과를 생성할 수 있다는 가능성이 있다.
실시예 2
활성화된 인간 T 세포에서 생산된 신규한 IL-17 사이토카인의 확인
신규한 인간 IL-17 사이토카인 (본원에서는 인간 IL-17A/F라고 표시함)이 활성화된 인간 T-림프구 세포에서 자연 발생한다는 것이 본원에서 처음 설명되었다. 인간 T-림프구 세포의 단리 및 활성화를 행하고, IL-17A/F 생산을 하기 기재된 바와 같이 IL-17A/F ELISA에 의해 검출하고 정량적으로 측정하였다.
인간 T-세포의 단리 및 활성화
보통의 건강한 공여자로부터의 헤파린처리한 (0.5 ml/50 cc), 신선하게 채혈한 혈액을 생리식염수로 1:1 희석하고, 그 후에 LSM 림프구 분리 배지 (ICN) 상에 층상화하고 제조업자 (ICN)의 조언에 따라 원심분리하였다. 회수된 단핵성 림프구를 조직 배양 플라스크에서 완전 RPMI (RPMI, 10％의 FCS, 2 mM의 L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신 (깁코; GIBCO)) 중에서 1시간 동안 37℃에서 플레이팅하여 단핵구를 고갈시켰다. 배양 상등물을 원심분리하여 잔여 세포를 펠렛화하였다. 그 후에 인간 T 림프구를 CD4+ T 세포 단리 키트 (MACS)를 사용하여 음성 선별에 의해 단리하였다. 단리된 T 림프구를 활성화시키기 위해, 조직 배양 플라스크를 PBS 중 항-CD3 (BD 바이오사이언스(BD Bioscience)) 및 항-CD28 (BD 바이오사이언스) 각각 5 ㎍/ml로 밤새 4℃에서 코팅하였다. 코트 배지를 제거한 후에, 단리된 인간 T 림프구를 완전 RPMI에 대략 배지 ml 당 세포 2백만 개의 밀도로 플레이팅하였다. 배지의 샘플을 플레이팅한 후 여러 시점에서 수집하고 ELISA에 의해 IL-17A/F에 대해 분석하였다. 비-활성화된 대조 상등물은 항-CD3 및 항-CD28로 코팅되지 않은 플라스크로부터의 세포 상등액으로부터 수집한 것이었다.
항- CD3 /항- CD28 활성화된 인간 T 세포에서 인간 IL-17A/F 생산의 ELISA 측정
인간 IL-17A/F 수준을 ELISA로 측정하였다. 마우스의 항-인간 IL-17을 12 내지 15시간 동안 2 내지 8℃에서 코트 완충액 (0.05 M의 탄산나트륨 완충액, pH 9.6)으로 희석하고 96-웰 미량역가 플레이트 (Nunc)에 코팅하였다. 모든 후속 단계는 실온에서 행하였다. 비-특이적 결합은 웰을 비워내고 차단 완충액 (PBS, 0.05％의 BSA, 10 ppm의 프로클린 300)을 첨가함으로써 차단하였다. 1시간 동안 인큐베이션한 후에, 웰을 세척 완충액 (PBS, 0.05％의 트윈 20, 10 ppm의 프로클린 300)으로 세척하였다. 분석 완충액 (PBS, 0.5％의 BSA, 0.05％의 트윈 20, 10 ppm의 프로클린 300)으로 희석한, 인간 IL-17A/F 대조 표준 및 샘플을 그 후에 첨가하였다. 2시간 동안 인큐베이션한 후에, 웰을 세척 완충액으로 세척하였다. 분석 완충액으로 희석한, 비오티닐화된 마우스의 항-인간 IL-17F를 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 세척한 후에, 분석 완충액으로 희석한, 스트렙타비딘-HRP (양고추냉이 퍼옥시다제) (아머샴(Amersham))를 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 세척한 후에, 기질 용액, TMB (테트라 메틸 벤지딘)-퍼옥시다제 (R ＆ D 시스템즈(R ＆ D Systems))를 첨가하였다. 2 N의 황산을 첨가함으로써 발색을 중지시켰다. 그 후에 플레이트를 미량역가 플레이트 판독기 (SLT)로 450 nm에서 판독하며, 540 nm에서의 블랭크를 뺐다. 4-파라미터 커브-핏팅(curve-fitting) 프로그램을 사용하여 표준 곡선을 생성하였고, 샘플 농도를 곡선의 직선 부분으로부터 내삽법에 의해 유도하였다. IL-17A 및 IL-17F가 ELISA에서 대조군으로서 포함되어 IL-17A/F에 대한 분석 특이성을 입증하였다 (도 12).
결과:
IL-17A/F 생산의 ELISA 측정 결과를 도 11에 나타내었다. 이들 연구는 IL-17A/F의 생산이 검출되지 않은 비-활성화 인간 T-세포와 비교하여, 항-CD3/항-CD28 활성화된 인간 T 림프구 세포로부터 신규한 사이토카인 IL-17A/F의 생산을 설명하였다. 이들 결과로부터 인간 T 림프구의 활성화에 반응하여 생산되고 방출된 신규한 사이토카인의 자연 발생을 처음으로 알 수 있었다. 또한, ELISA 분석법의 특이성이 병행하여 분석하였을 때 3개의 샘플 (#31-#33)에서 IL-17A/F가 거의 동등한 양으로 관찰된다는 것으로부터 설명되었다. 무시할 정도의 양의 IL-17A 또는 IL-17F가 이러한 IL-17A/F 특이적 ELISA에서 검출되었다 (도 12).
본원 실시예 1 및 실시예 2에 기재되어 있는 연구는 재조합 인간 IL-17A/F가 단백질 구조와 세포기재 활성 분석법 둘 다에 있어서 인간 IL-17 및 IL-17F와 구별할 수 있는, 명백하게 신규한 사이토카인이라는 것을 확인하였다. 표준으로서 정제된 재조합 인간 IL-17A/F를 사용함으로써, 인간 IL-17AF-특이적 ELISA가 개발되었다 (도 11에 도시됨). 이러한 특이적 ELISA를 사용함으로써, 인간 IL-17A/F의 유도 발현이 검출되었고, 이로부터 IL-17A/F가 배양물 내 활성화된 인간 T 세포로부터 자연 생산된다는 것을 확인하였다. 따라서, IL-17A/F는 단리된 활성화 인간 T 세포의 자연 생성물로서 검출가능한, 명백하게 신규한 사이토카인이고, 그의 재조합 형태가 단백질 구조 및 세포기재 분석법 둘 다에서, 관련 사이토카인과 다르고 구별될 수 있는 것으로 규명되었다.
이러한 신규한 사이토카인은 IL-17 또는 다른 관련 사이토카인을 위한 결합 부위에 대한 경쟁적 억제제로서 작용하여, IL-17의 활성을 생체내 조정하는 작용을 할 수 있었다. IL-17A/F는 또한 자신을 위한 결합 부위 및(또는) 다른 관련 사이토카인을 위한 결합 부위를 하향 조절함으로써 다른 관련 사이토카인의 활성을 조정할 수 있었다. IL-17A/F는 세포내 어댑터 (adapter) 또는 IL-17A/F의 신호절달 활성 또는 다른 관련 사이토카인의 신호전달 활성에 영향을 미치는 작용을 하는 신호전달 분자를 통해 활성을 보일 수 있었다. IL-17A/F는 세포의 표면에서 또는 세포내 구획에서 발견되는 수용체 및 보조-수용체의 페어링에 영향을 미치는 능력을 갖는다.
따라서, 이들 연구는 이전에는 면역학적으로 활성을 갖지 않을 수도 있었던 특정 항원에 대하여 면역계가 반응하는 것을 증가시킬 수 있는 신규한 면역자극제 (즉, IL-17A/F)를 제공하고 확인하였다. 따라서, 새로 확인된 면역자극제는 중요한 임상적 응용성을 갖는다. IL-12와 같은 다른 공지된 면역자극제가 확인되었다 (문헌 [Gubler et al. PNAS 88, 4143 (1991)] 참조). 최근의 암 백신 실험에서, 시카고 대학 및 제네틱스 인스티튜트(Genetics Institute; 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재)의 연구원들은 흑색종의 치료를 위한 IL-12의 면역 자극 활성을 신뢰하였다 (문헌 [Peterson et al. Journal of Clinical Oncology 21 (12). 2342-48 (2003)]). 연구원들은 흑색종 세포의 하나 이상의 마커를 운반하는 순환 백혈구를 추출하고, 항원을 단리하고, 이들을 환자에게 다시 주입하였다. 보통 환자들은 자신의 인간 항원에 대해 면역 반응을 일으키지 않았다. 그 후에 환자들을 서로 다른 투여량의 IL-12 (수지상 세포에 의해 동시-자극된 T 세포의 증식을 유도할 수 있는 면역자극제)로 처치하였다. IL-12의 면역 자극 효과 때문에, 상기 처치는 환자 자신의 수지상 세포를 말초 혈액 단핵성 세포 (PBMC)로부터 제조하고, 항원으로 처리한 후에, 시험관내 배양하고, 환자에게 다시 주입하여 항암 반응을 자극했던, 선행 연구와 비교하였을 때 우수한 결과를 제공하였다 (문헌 [Thurner et al. J. Exp. Med . 190 (11), 1669-78 (1999)]). 이와 마찬가지로, 이러한 신규한 IL-17A/F 사이토카인 또는 그의 효능제는 그에 따라 면역자극제로서의 실용적인 유용성이 발견되었다. 반면 IL-17A/F 활성을 억제하는 분자 (길항제)는 면역 반응의 억제가 바람직할 때, 예컨대 자가면역 질환에서 실용적인 유용성이 발견될 것으로 예상되었다.
따라서, IL-17A/F의 면역학적 활성을 모방하거나 (효능제 항체) 또는 억제하는 (길항제 항체) 이러한 신규한 사이토카인의 항체는 치료 효능을 가질 것이다. 이러한 신규한 사이토카인의 활성을 억제하는 작용을 하는 소분자 또한 잠재적인 치료 용도를 가질 것이다.
실시예 3
혼성화 프로브로서 IL-17A/F의 용도
하기 방법은 혼성화 프로브로서 IL-17A/F를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 사용하는 것을 설명한다.
본원에 기재되어 있는 전장 또는 성숙한 IL-17A/F의 코딩 서열을 포함하는 DNA를 프로브로서 사용하여 인간 조직 cDNA 라이브러리 또는 인간 조직 게놈 라이브러리에서 동종 DNA (예컨대, IL-17A/F의 자연 발생하는 변이체를 코딩하는 것들)를 스크리닝하였다.
하기 고엄격 조건하에서 라이브러리 DNA를 함유하는 필터를 혼성화하고 세척하였다. 방사성 동위원소로 표지된 IL-17A/F-유래의 프로브를 필터에 50％의 포름아미드, 5x SSC, 0.1％의 SDS, 0.1％의 나트륨 피로포스페이트, 50 mM의 나트륨 포스페이트, pH 6.8, 2x 덴하르트 (Denhardt's) 용액, 및 10％의 덱스트란 술페이트 용액에서 42℃에서 20시간 동안 혼성화하였다. 0.1x SSC 및 0.1％의 SDS의 수용액에서 42℃에서 필터를 세척하였다.
전장 천연 서열 IL-17A/F를 코딩하는 DNA와 원하는 서열 동일성을 갖는 DNA를 그 후에 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 확인할 수 있었다.
실시예 4
이. 콜라이에서의 IL-17A/F의 발현
본 실시예는 이. 콜라이에서의 재조합 발현에 의해 IL-17A/F 폴리펩티드의 비-글리코실화 형태의 제조를 설명한다.
IL-17A/F 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 선택된 PCR 프라이머를 사용하여 초기에 증폭시켰다. 프라이머는 선택된 발현 벡터에서의 제한 효소 부위에 상응하는 제한 효소 부위를 함유해야 한다. 다양한 발현 벡터를 사용할 수 있었다. 적합한 벡터의 예로는 암피실린 및 테트라사이클린 내성을 위한 유전자를 함유하는 pBR322 (이. 콜라이로부터 유래됨; 문헌 [Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977)] 참조)가 있다. 벡터를 제한 효소로 분해하고 탈인산화시켰다. 그 후에 PCR 증폭된 서열을 벡터에 라이게이션하였다. 벡터는 바람직하게는 항생제 내성 유전자, trp 프로모터, 폴리-His 리더 (처음 6개의 STII 코돈, 폴리His 서열 및 엔테로키나아제 절단 부위를 포함함), IL-17A/F 폴리펩티드 코딩 영역, 람다 전사 종결자, 및 argU 유전자를 코딩하는 서열을 포함할 것이다.
그 후에 라이게이션 혼합물을 사용하여 선별된 이. 콜라이 균주를 상기 문헌 (Sambrook et al.,)에 기재된 방법으로 형질전환시켰다. 형질전환체를 LB 플레이트에서 성장하는 능력으로 확인하고 그 후에 항생제 내성 콜로니를 선택하였다. 플라스미드 DNA를 단리하고 제한 분석 및 DNA 서열분석에 의해 확인할 수 있었다.
선별된 클론을 항생제를 보충한 LB 배지와 같은 액체 배양 배지에서 밤새 성장시킬 수 있었다. 이어서 밤새 배양한 배양물을 사용하여 보다 큰 규모의 배양물을 접종할 수 있었다. 그 후에 세포를 원하는 광학 밀도까지 성장시키고, 그 동안 발현 프로모터가 작동하였다.
세포를 수시간 동안 더 배양한 후에, 세포를 원심분리에 의해 수거할 수 있었다. 원심분리에 의해 수득된 세포 펠렛을 당업계에 공지된 다양한 제제를 사용하여 가용화할 수 있고, 그 후에 가용화된 IL-17A/F 단백질을 단백질의 강력한 결합을 가능하게 하는 조건하에서 금속 킬레이팅 컬럼을 사용하여 정제할 수 있었다.
IL-17A/F 폴리펩티드를 하기의 절차를 사용하여 폴리-His 태그가 부착된 형태로 이. 콜라이에서 발현시킬 수 있었다. IL-17A/F 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 선택된 PCR 프라이머를 사용하여 초기에 증폭시켰다. 프라이머는 선택된 발현 벡터에서의 제한 효소 부위에 상응하는 제한 효소 부위, 및 효율적이고 신뢰할만한 번역 개시, 금속 킬레이팅 컬럼 상에서의 신속한 정제, 및 엔테로키나아제를 사용하는 단백질분해성 제거를 제공하는 다른 유용한 서열을 함유할 것이다. 그 후에 PCR-증폭되었고, 폴리-His 태그가 부착된 서열을 발현 벡터에 라이게이션하고, 그것을 사용하여 균주 52 (W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq)) 기원의 이. 콜라이 숙주를 형질전환시켰다. 형질전환체를 우선 카르베니실린 50 mg/ml을 함유하는 LB에서 3 내지 5의 O.D.600이 달성될 때까지 30℃에서 진탕시키면서 성장시켰다. 그 후에 배양물을 CRAP 배지 ((NH4)2SO4 3.57 g, 나트륨 시트레이트ㆍ2H2O 0.71 g, KCl 1.07 g, 디프코 (Difco) 효모 추출물 5.36 g, 물 500 mL 중의 세필드 히카아제 (Sheffield hycase) SF 5.36 g 뿐만 아니라, 110 mM의 MPOS, pH 7.3, 0.55％ (중량/부피)의 글루코스 및 7 mM의 MgSO4를 혼합함으로써 제조함)에서 50 내지 100배 희석시키고, 대략 20 내지 30시간 동안 30℃에서 진탕시키면서 성장시켰다. 샘플을 제거하여 SDS-PAGE 분석에 의해 발현을 입증하였고, 벌크 배양물을 원심분리하여 세포를 펠렛화하였다. 세포 펠렛을 정제 및 리폴딩(refolding)할 때까지 냉동하였다.
발효액 0.5 내지 1 L (펠렛 6 내지 10 g)로부터의 이. 콜라이 페이스트를 7 M의 구아니딘, 20 mM의 트리스, pH 8 완충액에 10 부피 (중량/부피)로 재현탁시켰다. 고체 나트륨 술파이트 및 나트륨 테트라티오네이트를 첨가하여 최종 농도가 각각 0.1 M 및 0.02 M이도록 제조하였고, 용액을 밤새 4℃에서 교반하였다. 이 단계에서 술파이트화에 의해 차단된 모든 시스테인 잔기를 갖는 변성 단백질이 생성되었다. 용액을 베크만 초원심분리기(Beckman Ultracentrifuge)에서 30분 동안 40,000 rpm으로 원심분리하였다. 상등액을 금속 킬레이팅 컬럼 완충액 (6 M의 구아니딘, 20 mM의 트리스, pH 7.4) 3 내지 5 부피로 희석하고 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과하여 정화하였다. 정화된 추출물을 금속 킬레이팅 컬럼 완충액으로 평형을 유지한 5 ml 퀴아젠 (Qiagen) Ni-NTA 금속 킬레이팅 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 50 mM의 이미다졸 (칼바이오켐(Calbiochem), 유트롤 (Utrol) 등급)을 함유하는 추가의 완충액, pH 7.4으로 세척하였다. 단백질을 250 mM의 이미다졸을 함유하는 완충액으로 용출하였다. 원하는 단백질을 함유하는 분획을 모으고 4℃에서 보관하였다. 단백질 농도를 아미노산 서열을 기준으로 한 소광 계수 계산치를 사용하여 280 nm에서 흡광도에 의해 측정하였다.
샘플을 20 mM의 Tris, pH 8.6, 0.3 M의 NaCl, 2.5 M의 우레아, 5 mM의 시스테인, 20 mM의 글리신 및 1 mM의 EDTA로 이루어진, 신선하게 제조된 리폴딩 완충액으로 서서히 희석함으로써 단백질을 리폴딩하였다. 리폴딩 부피는 최종 단백질 농도가 50 내지 100 마이크로그램/ml이도록 선택하였다. 리폴딩 용액을 4℃에서 12 내지 36시간 동안 부드럽게 교반하였다. 리폴딩 반응을 TFA를 0.4％ (pH는 대략 3임)의 최종 농도까지 첨가함으로써 중지하였다. 단백질을 추가로 정제하기 전에, 용액을 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과하고 아세토니트릴을 2 내지 10％의 최종 농도까지 첨가하였다. 리폴딩 단백질을 이동 완충액으로 0.1％의 TFA를 사용하고 아세토니트릴 10 내지 80％의 구배로 용출하는 포로스 (Poros) R1/H 역상 컬럼에서 크로마토그래피하였다. A280 흡광도를 갖는 분획의 분취물을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분석하였고 동종성 리폴딩 단백질을 함유하는 분획을 모았다. 일반적으로, 적절하게 리폴딩된 종류의 대부분의 단백질은 최저 농도의 아세토니트릴에서 용출되는데, 그 이유는 이들 종류가 역상 수지와의 상호작용으로부터 보호된 소수성 내부로 가장 밀집되어 있기 때문이다. 응집된 종류는 통상적으로 보다 높은 아세토니트릴 농도에서 용출되었다. 원하는 형태로부터 잘못 폴딩된 형태의 단백질을 분해하는 것 외에도, 역상 단계는 또한 샘플로부터 내독소를 제거하였다.
원하는 폴딩된 IL-17A/F 폴리펩티드를 함유하는 분획을 모으고 아세토니트릴을 용액에 질소를 부드럽게 흐르게 하여 제거하였다. 단백질을 투석 또는 제형 완충액으로 평형을 유지하고 멸균 여과된 G25 수퍼파인 (Superfine) (파마시아; Pharmacia) 수지를 사용하는 겔 여과에 의해, 0.14 M의 염화나트륨 및 4％의 만니톨을 함유하는 20 mM의 Hepes, pH 6.8로 제형하였다.
실시예 5
포유동물 세포에서 IL-17A/F의 발현
본 실시예는 포유동물 세포에서의 재조합 발현에 의해 IL-17A/F 폴리펩티드의 잠재적으로 글리코실화된 형태의 제조를 설명한다.
벡터, pRK5 (1989년 3월 15일자로 공개된 유럽 특허 제307,247호 참조)를 발현 벡터로서 사용하였다. 임의로, IL-17A/F DNA를 상기 문헌 (Sambrook, et al.)에 기재된 바와 같은 라이게이션 방법을 사용하여 선택된 제한 효소를 갖는 pRK5에 라이게이션하여 IL-17A/F DNA를 삽입하였다. 생성된 벡터를 pRK5-IL-17A/F라고 명명하였다.
한 실시양태에서, 선택된 숙주 세포는 293 세포일 수 있다. 인간 293 세포 (ATCC CCL 1573)를 조직 배양 플레이트에서 태아 소 혈청 및, 임의로는 영양 성분 및(또는) 항생제를 보충한 DMEM과 같은 배지에서 군락으로 성장시켰다. pRK5-IL-17A/F DNA 약 10 ㎍을 VA RNA 유전자 (문헌 [Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)])를 코딩하는 DNA 약 1 ㎍과 혼합하고 1 mM의 Tris-HCl, 0.1 mM의 EDTA, 0.227 M의 CaCl2 500 ㎕에 용해시켰다. 이 혼합물에 50 mM의 Hepes (pH 7.35), 280 mM의 NaCl, 1.5 mM의 NaPO4 500 ㎕를 적가하고, 10분 동안 25℃에서 침전물을 형성하였다. 침전물을 현탁시키고 293 세포에 첨가하여 약 4시간 동안 37℃에서 정치하였다. 배양 배지를 탈기하고 PBS 중 20％의 글리세롤 2 ml를 30초 동안 첨가하였다. 그 후에 293 세포를 무혈청 배지로 세척하고, 신선한 배지를 첨가하고, 세포를 약 5일간 인큐베이션하였다.
형질감염 약 24 시간 후에 배양 배지를 제거하고 배양 배지 (단독) 또는 200 μCi/ml 35S-시스테인 및 200 μCi/ml 35S-메티오닌을 포함하는 배양 배지로 교체한다. 12 시간의 인큐베이션 후, 조건화 배지를 모아 스핀 필터로 농축시켜 15％ SDS 겔에 로딩한다. 처리된 겔을 건조시키고 적절한 시간 동안 필름에 노출시켜 IL-17A/F 폴리펩티드의 존재를 확인할 수 있다. 형질감염된 세포를 포함하는 배양물을 추가로 인큐베이션할 수 있고 (무혈청 배지 중에), 선택한 생물분석법으로 배지를 시험한다.
별법의 기술로, 문헌 [Somparyrac et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., 12:7575 (1981)]에 기재되어 있는 덱스트란 술페이트 방법을 이용하여 IL-17A/F를 293 세포에 일시적으로 도입시킬 수도 있다. 293 세포를 스피너 (spinner) 플라스크에서 최고 밀도가 되도록 배양하고 700 ㎍의 pRK5-IL-17A/F DNA를 첨가한다. 우선, 세포를 원심분리하여 스피너 플라스크로부터 농축하고 PBS로 세척한다. DNA-덱스트란 침전물을 4 시간 동안 세포 펠렛 상에서 인큐베이션한다. 세포를 20％ 글리세롤로 90 초 동안 처리하고 조직 배양 배지로 세척한 후, 조직 배양 배지, 5 ㎍/ml의 소 인슐린 및 0.1 ㎍/ml의 소 트랜스페린을 포함하는 스피너 플라스크에 다시 넣는다. 약 4 일 후에 조건화 배지를 원심분리하고 여과시켜 세포와 세포 용해물을 제거한다. 발현된 IL-17A/F를 포함하는 샘플을 농축시켜, 선택한 방법, 예를 들어, 투석 및(또는) 컬럼 크로마토그래피로 정제할 수 있다.
다른 실시양태에서, IL-17A/F 폴리펩티드를 CHO 세포에서 발현시킬 수 있다. pRK5-IL-17A/F를 공지된 시약, 예를 들어, CaPO4 또는 DEAE-덱스트란을 사용하여 CHO 세포로 형질감염시킬 수 있다. 상기한 바 같이, 세포 배양물을 인큐베이션할 수 있고, 배지를 배양 배지 (단독) 또는 35S-메티오닌과 같은 방사성 표지를 함유하는 배지로 교체할 수 있다. IL-17A/F 폴리펩티드의 존재를 확인한 후, 배양 배지를 무혈청 배지로 교체할 수 있다. 바람직하게는, 배양물을 약 6 일 동안 인큐베이션하고 조건화 배지를 수거한다. 발현된 IL-17A/F 폴리펩티드를 함유하는 배지를 농축하여 선택한 어떤 방법으로도 정제할 수 있다.
에피토프 태그가 부착된 IL-17A/F도 CHO 숙주 세포에서 발현시킬 수 있다. IL-17A/F를 pRK5 벡터로 서브클로닝할 수 있다. 서브클론 삽입체를 PCR을 통해 폴리-His 태그와 같은 선택된 에피토프 태그가 부착된 형태로 배큘로바이러스 발현 벡터에 프레임에 맞게 융합시킬 수 있다. 폴리-His 태그가 부착된 IL-17A/F 삽입체를 안정한 클론 선택을 위해 DHFR과 같은 선별 마커를 포함하는 SV40 구동 벡터로 서브클로닝할 수 있다. 최종적으로, CHO 세포를 (상기에서와 같이) SV40 구동 벡터로 형질감염시킬 수 있다. 발현을 확인하기 위해서 상기와 같은 방법으로 표지할 수 있다. 그 후, 폴리-His 태그가 부착된 IL-17A/F 발현물을 함유하는 배양 배지를 농축시켜 Ni2 +-킬레이트 친화성 크로마토그래피와 같이 선택된 어떤 방법으로도 정제할 수 있다.
IL-17A/F 폴리펩티드는 또한 일시적 발현 방법을 통해 CHO 및(또는) COS 세포에서 발현시킬 수 있거나, 다른 안정한 발현 방법을 통해 CHO 세포에서 발현시킬 수 있다.
하기 실험 방법을 이용하여 CHO 세포에서의 안정한 발현을 수행한다. 단백질은 각 단백질의 가용성 형태 (예를 들어, 세포외 도메인)의 코딩 서열이 힌지, CH2 및 CH2 도메인을 포함하는 IgG1 불변 영역 서열에 융합된 IgG 구조물 (이뮤노어드헤신)로서 발현되고(되거나) 폴리-His 태그가 부착된 형태이다.
PCR 증폭에 이어 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, Johnn Wiley and Sons (1997)]에 기재된 표준 방법을 이용하여 각 DNA를 CHO 발현 벡터에 서브클로닝한다. CHO 발현 벡터는 관심있는 DNA의 5' 및 3'에 적합한 제한 부위를 갖도록 제작되어 cDNA가 편리하게 셔틀링 (shuttling)될 수 있게 된다. CHO 세포에서 발현에 사용되는 벡터는 문헌 [Lucas et al., Nucl . Acids Res. 24:9 (1774-1779 (1996)]에 기재된 바와 같으며, 대상 cDNA와 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)를 발현시키기 위해 SV40 초기 프로모터/인핸서를 사용한다. DHFR 발현은 형질감염 후 플라스미드의 안정적 유지를 선별할 수 있게 한다.
원하는 플라스미드 DNA 12 ㎍을 시판되는 형질감염 시약 수퍼펙트 (등록상표, Superfect) (퀴아젠 제품), 도스퍼 (등록상표, Dosper) 또는 퓨진 (등록상표, Fugene; 베링거 만하임 (Boehringer Mannheim))을 이용하여 약 1000만개의 CHO 세포에 도입한다. 문헌 [Lucas et al., 상기 문헌]에 기재된 방법에 따라 세포를 성장시킨다. 약 3 ×107개의 세포를 하기에 기재된 바와 같은 추후 배양 및 생산을 위해 앰플에 동결시킨다.
플라스미드 DNA를 포함하는 앰플을 수조에 넣어 해동한 후 볼텍싱하여 혼합한다. 내용물을 배지 10 ml가 함유된 원심분리 튜브에 피펫으로 넣고 1000 rpm에서 5 분간 원심분리한다. 상등액을 흡입해 내고 세포를 10 ml의 선별 배지 (0.2 ㎛ 투석 여과된 5％ 소 태아 혈청을 포함하는 0.2 ㎛ 여과된 PS20)에 재현탁시킨다. 세포를 90 ml의 선별 배지를 포함하는 100 mL 스피너에 분주한다. 1 내지 2일 후, 세포를 150 mL 선별 배지로 채워진 250 mL 스피너로 옮겨 37℃에서 인큐베이션한다. 2 내지 3일 후에 250 mL, 500 mL 및 2000 mL 스피너에 3 ×105 세포/mL를 시딩한다. 세포 배지를 원심분리하고 생산 배지에 재현탁하여 신선한 배지로 교체한다. 임의의 적합한 CHO 배지를 사용할 수 있으나, 미국 특허 제5,122,469호 (1992년 6월 16일자로 허여됨)에 기재된 생산 배지를 실제로 사용할 수 있다. 3 L 생산 스피너에 1.2 ×106 세포/mL가 되도록 시딩한다. 시딩 당일, 세포 수와 pH를 측정한다. 제1 일, 스피너로부터 샘플을 취하고 여과된 공기의 살포를 개시한다. 제2 일, 스피너로부터 샘플을 취하고 온도를 33℃로 바꾸고 500 g/L 글루코스 30 ml 및 10％ 소포제 0.6 ml (예를 들어, 35％ 폴리디메틸 실록산 유체, 다우 코닝 (Dow Corning) 365 의약품 등급 유체)를 첨가한다. 전체 생산기 동안, 필요한 경우 pH를 약 7.2로 조정한다. 10일 후 또는 생존률이 70％ 미만으로 떨어질 때, 세포 배양물을 원심분리하여 모으고 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과시킨다. 여액을 4℃에 보관하거나, 즉시 컬럼 상에 로딩하여 정제할 수 있다.
폴리-His 태그가 부착된 구조물의 경우, Ni-NTA 컬럼 (퀴아젠 제품)을 이용하여 단백질을 정제한다. 정제하기 전에 이미다졸을 5 mM 농도로 조건화 배지에 첨가한다. 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 포함하는 20 mM Hepes (pH 7.4) 완충액으로 평형화된 6 mL Ni-NTA 컬럼 상에 4℃에서 4 내지 5 mL/분의 유속으로 조건화 배지를 주입한다. 로딩 후, 컬럼을 추가의 평형 완충액으로 세척하고, 0.25 M 이미다졸을 포함하는 평형 완충액으로 단백질을 용출한다. 이어서, 고도로 정제된 단백질을 25 mL의 G25 수퍼파인 (파마시아 제품) 컬럼으로 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl 및 4％ 만니톨을 함유하는 보관 완충액 (pH 6.8)에서 염을 제거하고 -80℃에서 보관한다.
이뮤노어드헤신 (Fc를 포함함) 구조물은 다음과 같이 조건화 배지로부터 정제한다. 조건화 배지를 20 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.8)으로 평형화된 5 mL 단백질 A 컬럼 (파마시아 제품)에 주입한다. 로딩 후, 컬럼을 평형 완충액으로 철저하게 세척한 후, 100 mM 시트르산 (pH 3.5)으로 용출한다. 1 ml의 분획을 275 ㎕의 1 M 트리스 완충액 (pH 9)이 함유된 튜브에 모음으로써 용출된 단백질을 즉시 중화시킨다. 이어서, 폴리-His 태그가 부착된 단백질에 대해 상기한 바와 같이 보관 완충액 중에서 고도로 정제된 단백질로부터 염을 제거한다. SDS 폴리아크릴아미드 겔 및 에드만 (Edman) 분해법에 의한 N-말단 아미노산 서열분석으로 균일도를 측정한다.
실시예 6
효모에서 IL-17A/F의 발현
다음 방법은 효모에서 원하는 IL-17A/F 폴리펩티드의 재조합 발현에 대해 기재한다.
우선, ADH2/GAPDH 프로모터로부터 IL-17A/F를 세포내 생산 또는 분비하도록 효모 발현 벡터를 제작한다. IL-17A/F 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및 프로모터를 IL-17A/F 폴리펩티드의 세포내 발현을 위해 선택한 플라스미드의 적합한 제한 효소 부위에 삽입한다. 분비의 경우, IL-17A/F를 코딩하는 DNA를 IL-17A/F 발현을 위해 ADH2/GAPDH 프로모터, 천연 서열 IL-17A/F 신호 펩티드 또는 기타의 포유동물 신호 펩티드 또는 예를 들어, 효모 알파-인자 또는 인버타제 분비 신호/리더 서열, 및 링커 서열 (필요한 경우)을 코딩하는 DNA와 함께 선택된 플라스미드에 클로닝할 수 있다.
그 후, 효모 세포 (예를 들어, 효모 균주 AB110)를 상기 기재된 발현 플라스미드로 형질전환시키고 선택된 발효 배지에서 배양할 수 있다. 형질전환된 효모 상등액을 10％ 트리클로로아세트산으로 침전시키고 SDS-PAGE로 분리한 후 겔을 쿠마시 블루로 염색하여 분석할 수 있다.
이어서, 원심분리로 발효 배지로부터 효모 세포를 제거하고 선택된 카트리지 필터를 사용하여 배지를 농축시켜 재조합 IL-17A/F 폴리펩티드를 단리하고 정제할 수 있다. IL-17A/F 폴리펩티드를 포함하는 농축액을 선택된 컬럼 크로마토그래피 수지를 사용해서 더 정제할 수 있다.
실시예 7
배큘로바이러스로 감염된 곤충 세포에서 IL-17A/F의 발현
다음 방법은 배큘로바이러스로 감염된 곤충 세포에서 IL-17A/F 폴리펩티드의 재조합 발현에 대해 기술한다.
IL-17A/F를 코딩하는 서열을 배큘로바이러스 발현 벡터에 포함되어 있는 에피토프 태그의 상류에 융합시킨다. 상기 에피토프 태그는 폴리-His 태그 및 이뮤노글로불린 태그 (예를 들어, IgG의 Fc 영역)를 포함하고 있다. 시판되는 플라스미드, 예를 들어, pVL1393 (노바겐 (Novagen))에서 유래한 플라스미드를 비롯한 여러 가지 플라스미드를 사용할 수 있다. 간략하게, IL-17A/F를 코딩하는 서열 또는 IL-17A/F의 코딩 서열의 원하는 부분, 예를 들어, 막횡단 단백질의 세포외 도메인을 코딩하는 서열 또는 단백질이 세포외 단백질이라면 성숙한 단백질을 코딩하는 서열을 5' 및 3' 영역에 상보적인 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭한다. 5' 프라이머는 인접한 (선택된) 제한 효소 부위를 포함할 수 있다. 그 후 생성물을 선택된 제한 효소로 절단하여 발현 벡터에 서브클로닝한다.
재조합 배큘로바이러스는 리포펙틴 (깁코-BRL로부터 구입)을 이용하여 상기 플라스미드 및 배큘로골드 (상표명, BaculoGold) 바이러스 DNA (파밍젠 (Phamingen))를 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) ("Sf9") 세포 (ATCC CRL 1711)에 동시에 형질감염시켜 생성된다. 28 ℃에서 4 내지 5 일 동안 인큐베이션한 후에, 방출된 바이러스를 수거하여 이후의 증폭에 사용한다. 바이러스 감염 및 단백질 발현은 문헌 [O'Reilley et al., Baculovirus Expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)]에 기재된 바와 같이 수행된다.
그 후, 폴리-His 태그가 부착된 IL-17A/F 발현물을 예를 들어, Ni2 +-킬레이트 친화성 크로마토그래피로 다음과 같이 정제할 수 있다. 문헌 [Rupert et al., Nature, 362: 175-179 (1993)]에 기재된 바와 같이 재조합 바이러스로 감염된 Sf9 세포로부터 추출액을 제조한다. 간략하게, Sf9 세포를 세척하여 초음파 처리 완충액 (25 ml Hepes, pH 7.9; 12.5 mM MgCl2; 0.1 mM EDTA; 10％ 글리세롤; 0.1％ NP-40; 0.4 M KCl)에 재현탁시키고 빙상에서 20 초 동안 2회 초음파 처리한다. 초음파 처리물을 원심분리로 제거하고 상등액을 로딩 완충액 (50 mM 인산, 300 mM NaCl, 10％ 글리세롤, pH 7.8)에 50 배 희석하여 0.45 ㎛ 필터로 여과시킨다. Ni2+-NTA 아가로스 컬럼 (퀴아젠으로부터 구입)을 5 ml 충진 부피로 준비하여 물 25 ml로 세척하고 로딩 완충액 25 ml로 평형화시킨다. 여과시킨 세포 추출물을 1분 당 0.5 ml로 컬럼에 로딩한다. 컬럼을 로딩 완충액으로 A280이 기준선에 도달할 때까지 세척하고, 점 분획 수집을 시작한다. 다음으로, 2 차 세척 완충액 (50 mM 인산; 300 mM NaCl, 10％ 글리세롤, pH 6.0)으로 컬럼을 세척하여 비특이적으로 결합된 단백질을 용출시킨다. A280이 기준선에 다시 도달하면, 컬럼을 2 차 세척 완충액 중의 0 내지 500 mM의 이미다졸 구배로 전개시킨다. 1 ml 분획들을 모아 SDS-PAGE 및 은 염색 또는 알칼리성 포스파타제에 결합된 Ni2 +-NTA (퀴아젠 제품)로 웨스턴 블롯팅하여 분석한다. 용출된 His10 태그가 부착된 IL-17A/F를 포함하는 분획을 모아 로딩 완충액으로 투석한다.
별법으로, IgG 태그가 부착된 (또는 Fc 태그가 부착된) IL-17A/F의 정제는 공지된 크로마토그래피 기술 (예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼 크로마토그래피)을 이용하여 수행될 수도 있다.
실시예 8
IL-17A/F에 결합하는 항체의 제조
이 실시예는 IL-17A/F에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체의 제조 방법을 설명한다.
모노클로날 항체를 제조하는 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Goding, 상기 문헌]에 기재되어 있다. 사용될 수 있는 면역원에는 정제된 IL-17A/F 폴리펩티드, IL-17A/F 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질 및 세포 표면 상에 재조합 IL-17A/F 폴리펩티드를 발현하는 세포가 포함된다. 당업자는 과도한 실험 없이 면역원을 선택할 수 있다.
프로인트 완전 면역보강제 중에 유화된 IL-17A/F 면역원 1 내지 100 ㎍을 피하 또는 복강내 주사하여 마우스, 예를 들어, BALB/c를 면역화시켰다. 별법으로, 면역원을 MPL-TDM 면역보강제 (미국 몬타나주 해밀톤 소재의 리비 이뮤노케미칼 ㄹ리서치 (Ribi Immunochemical Research)) 중에 유화시켜 동물의 뒷발바닥에 주사하였다. 이어서, 면역화된 마우스를 10 내지 12 일 후에 선택된 면역보강제 중에 유화된 추가 면역원으로 부스팅하였다. 그 이후, 수주 동안 마우스를 추가 면역화 주사로 부스팅할 수도 있다. 안와 후방 채혈법으로 마우스로부터 혈청 샘플을 주기적으로 채취하여 ELISA 분석에서 시험함으로써 항-IL-17A/F 항체를 검출하였다.
적합한 항체 역가가 검출된 후, 항체에 대해 "양성"인 동물에게 IL-17A/F를 최종 정맥주사할 수 있었다. 3 내지 4 일 후에 마우스를 희생시키고 비장 세포를 수거하였다. 이어서, 비장 세포를 선택된 뮤린 골수종 세포주, 예를 들어, ATCC 기탁번호 CRL 1597로부터 입수가능한 P3X63AgU.1과 융합시켰다 (35％ 폴리에틸렌 글리콜 사용). 융합은 비-융합 세포, 골수종 하이브리드 및 비장세포 하이브리드의 증식을 억제하는 HAT (하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘) 배지를 함유하는 96 웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅될 수 있는 하이브리도마 세포를 생성시켰다.
하이브리도마 세포를 IL-17A/F와의 반응성에 대해 ELISA로 스크리닝하였다. IL-17A/F에 대한 원하는 모노클로날 항체를 분비하는 "양성" 하이브리도마 세포를 확인하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
유전적으로 순계 BALB/c 마우스가 항-IL-17A/F 모노클로날 항체를 포함하는 복수를 생성하도록 양성 하이브리도마 세포를 복강내 주사할 수 있다. 별법으로, 하이브리도마 세포는 조직 배양 플라스크 또는 롤러병 (roller bottle)에서 성장시킬 수 있다. 복수 내에서 생성된 모노클로날 항체는 황산암모늄 침전에 이어 수행된 겔 배제 크로마토그래피를 통해 정제할 수 있다. 별법으로, 항체의 단백질 A 또는 단백질 G의 결합에 기초하는 친화성 크로로마토그래피를 이용할 수도 있다.
실시예 9
특이적 항체를 사용한 IL-17A/F 폴리펩티드의 정제
천연 또는 재조합 IL-17A/F 폴리펩티드를 단백질 정제 분야의 다양한 표준 기술을 통해 정제할 수 있다. 예를 들어, 프로 (pro)-IL-17A/F 폴리펩티드, 성숙한 IL-17A/F 폴리펩티드 또는 프리 (pre)-IL-17A/F 폴리펩티드를, 관심있는 IL-17A/F 폴리펩티드에 특이적인 항체를 이용하는 면역친화성 크로로마토그래피로 정제한다. 통상적으로, 면역친화성 컬럼은 항-IL-17A/F 폴리펩티드 항체를 활성화된 크로마토그래피 수지에 공유결합적으로 커플링시킴으로써 제작한다.
폴리클로날 이뮤노글로불린은 면역 혈청으로부터 황산암모늄 침전법 또는 고정화 단백질 A (미국 뉴저지주 피스카타웨이에 소재하는 파마시아 LKB 바이오테크놀로지 (Pharmacia LKB Biotechnology) 제품) 상에서의 정제법을 통해 면역 혈청으로부터 얻는다. 이와 마찬가지로, 모노클로날 항체는 황산암모늄 침전법 또는 고정화 단백질 A 상의 크로마토그래피에 의해 마우스 복수액으로부터 얻는다. 부분 정제된 이뮤노글로불린을 CnBr-활성화 세파로스 (상표명) (파마시아 LKB 바이오테크놀로지 제품)와 같은 크로마토그래피 수지에 공유결합적으로 부착시킨다. 항체를 수지에 커플링시키고, 수지를 차단하고, 유도체 수지를 제조업자의 지침에 따라 세척한다.
이러한 면역친화성 컬럼은 IL-17A/F 폴리펩티드를 가용성 형태로 함유하는 세포로부터 분획을 얻어 IL-17A/F 폴리펩티드를 정제하는 데 사용한다. 상기 분획은 디터전트의 첨가 또는 당업계에 공지되어 있는 다른 방법에 의해 온전한 세포를 용해시키거나 차등 원심분리를 통해 수득된 세포 이하 분획을 용해시켜 얻는다. 별법으로, 신호 서열을 포함하는 가용성 IL-17A/F 폴리펩티드는 세포가 성장하는 배지 내로 유용한 양만큼 분비시킬 수 있다.
가용성 IL-17A/F 폴리펩티드 함유 제제를 면역친화성 컬럼에 통과시키고, 컬럼을 IL-17A/F 폴리펩티드의 선택적인 흡수를 허용하는 조건 (예를 들어, 디터전트의 존재 하의 고이온 강도 완충액) 하에 세척한다. 이어서, 컬럼을 항체/IL-17A/F 폴리펩티드 결합을 방해하는 조건 (예를 들어, 약 pH 2 내지 3과 같은 저 pH 완충액 또는 고농도의 카오트로프 (chaotrope), 예를 들어, 우레아 또는 티오시아네이트 이온) 하에 용출시키고, IL-17A/F 폴리펩티드를 수집한다.
실시예 10
약물 스크리닝
본 발명은 IL-17A/F 폴리펩티드 또는 그의 결합 단편을 사용하여 임의의 다양한 약물 스크리닝 기법으로 화합물을 스크리닝하기 위해 특히 유용하다. 이러한 시험에 사용된 IL-17A/F 폴리펩티드 또는 단편은 용액 중에 유리되어 있거나, 고체 지지체에 고착되거나, 세포 표면에서 유지되거나, 세포내에 위치할 수 있다. 약물 스크리닝의 한 방법에서는 IL-17A/F 폴리펩티드 또는 단편을 발현하는 재조합 핵산을 사용하여 안정하게 형질전환된 진핵 또는 원핵 숙주 세포를 이용한다. 약물을 경쟁적 결합 분석으로 상기 형질전환된 세포에 대해 스크리닝한다. 생존형 또는 고정형의 상기 세포는 표준 결합 분석을 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, IL-17A/F 폴리펩티드 또는 단편과 시험되는 제제 사이의 복합체 형성을 측정할 수 있다. 별법으로, 시험되는 제제의 의해 유발된 IL-17A/F 폴리펩티드와 그의 표적 세포 또는 표적 수용체 사이의 복합체 형성의 감소를 검사할 수 있다.
따라서, 본 발명은 IL-17A/F 폴리펩티드-관련 질환 또는 장애에 영향을 끼칠 수 있는 약물 또는 임의의 다른 활성제를 스크리닝하기 위한 방법을 제공한다. 이들 방법은 상기 제제를 IL-17A/F 폴리펩티드 또는 그의 단편과 접촉시키고, 당업계에 공지된 방법으로 (i) 활성제와 IL-17A/F 폴리펩티드 또는 단편 사이의 복합체의 존재 또는 (ii) IL-17A/F 폴리펩티드 또는 단편과 세포 사이의 복합체의 존재에 대해 분석하는 것을 포함한다. 이러한 경쟁적 결합 분석에서, IL-17A/F 폴리펩티드 또는 단편은 대개 표지화시킨다. 적합한 인큐베이션 후, 유리 IL-17A/F 폴리펩티드 또는 단편을 결합형으로 존재하는 것으로부터 분리시키며, 유리 또는 비복합된 표지의 양은 특정 활성제의 IL-17A/F 폴리펩티드에 결합하는 능력 또는 IL-17A/F 폴리펩티드/세포 복합체를 억제하는 능력의 척도이다.
또다른 약물 스크리닝 기법은 폴리펩티드에 적합한 결합 친화도를 갖는 화합물에 대한 고처리량 스크리닝을 제공하고, WO 84/03564 (1984. 9. 13일자 공개)에 상세히 기재되어 있다. 간단히 서술하면, 다수의 상이한 작은 펩티드 시험 화합물을 플라스틱 핀 또는 몇몇 다른 표면과 같은 고상 기질 상에 합성한다. IL-17A/F 폴리펩티드를 가하여, 펩티드 시험 화합물을 IL-17A/F 폴리펩티드와 반응시키고 세척한다. 결합된 IL-17A/F 폴리펩티드는 당업계에 공지된 방법으로 검출한다. 정제된 IL-17A/F 폴리펩티드는 또한 상기 언급한 약물 스크리닝 기법에 사용하기 위해 플레이트 상에 직접 코팅될 수 있다. 또한, 비중화 항체를 사용하여 펩티드를 포획하여 이를 고체 지지체 상에 고정시킬 수 있다.
본 발명은 또한 IL-17A/F 폴리펩티드에 결합할 수 있는 중화 항체가 IL-17A/F 폴리펩티드 또는 그의 단편에 결합하는데 있어서 시험 화합물과 특이적으로 경쟁하는 경쟁적 약물 스크리닝 분석의 이용을 고려한다. 이러한 방식으로, 항체를 IL-17A/F 폴리펩티드와 하나 이상의 항원 결정자를 공유하는 임의의 펩티드의 존재를 검출하기 위해 사용할 수 있다.
실시예 11
합리적인 약물 고안
합리적 약물 고안의 목표는 관심있는 생물 활성 폴리펩티드 (즉, IL-17A/F 폴리펩티드) 또는 이들이 상호작용하는 소분자, 예를 들어, 효능제, 길항제 또는 억제제의 구조적 유사체를 제조하는 것이다. 이들 예 중 임의의 것들을 IL-17A/F 폴리펩티드의 보다 활성적이거나 보다 안정한 형태인 약물, 또는 생체내 IL-17A/F 폴리펩티드의 기능을 강화하거나 억제하는 약물을 형성하기 위해 이용할 수 있다 (문헌 [Hodgson, Bio/Technology, 9: 1921 (1991)] 참조).
한 연구에서, IL-17A/F 폴리펩티드 또는 IL-17A/F 폴리펩티드-억제제 복합체의 3차원 구조를 X-선 결정법, 컴퓨터 모델링 또는 가장 통상적으로 상기 두 방법의 조합에 의해 결정한다. 분자의 구조를 밝히고 활성 부위(들)을 결정하기 위해 IL-17A/F 폴리펩티드의 형태와 전하량 모두를 확인해야 한다. 덜 빈번하지만, IL-17A/F 폴리펩티드의 구조에 관한 유용한 정보는 상동성 단백질의 구조에 기초하여 모델링함으로써 얻을 수 있다. 두 경우 모두, 관련 구조 정보를 IL-17A/F 폴리펩티드 유사 분자를 고안하거나 유효한 억제제를 확인하기 위해 사용한다. 합리적 약물 고안의 유용한 예는 문헌 [Braxton and Wells, Biochemistry, 31:7796-7801 (1992)]에 나타낸 바와 같이 활성 또는 안정성을 증대시킨 분자, 또는 문헌 [Athauda et al., J. Biochem ., 113:742-746 (1993)]에 나타낸 바와 같이 천연 펩티드의 억제제, 효능제 또는 길항제로서 작용하는 분자를 포함할 수 있다.
표적-특이적 항체를 단리하고, 상기한 바와 같이 기능 분석에 의해 선택한 다음, 그의 결정 구조를 해석하는 것도 가능하다. 이 방법으로 원칙적으로 후속적인 약물 고안의 기준이 될 수 있는 파마코어(pharmacore)를 얻는다. 기능성 약리 활성 항체에 대한 항-이디오타입 항체 (항-id)를 생성함으로써 단백질 결정법을 모두 회피하는 것도 가능하다. 거울상의 거울상으로서, 항-id의 결합 부위는 원래 수용체의 유사체일 것으로 기대될 것이다. 이어서, 항-id를 사용하여 화학적 또는 생물학적으로 생성된 펩티드 뱅크로부터 펩티드를 확인하고 단리시킬 수 있을 것이다. 이어서, 단리된 펩티드는 파마코어로서 작용할 것이다.
본 발명에 의해, X-선 결정법과 같은 분석적 연구를 수행하기 위해 충분한 양의 IL-17A/F 폴리펩티드를 입수할 수 있다. 또한, 본원에 제공된 IL-17A/F 폴리펩티드 아미노산 서열 지식은 X-선 결정법 대신 또는 그에 덧붙여 컴퓨터 모델링 기법을 이용하는데 지침을 제공할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (75)

  1. (a) 서열 3 및 서열 4의 서열을 갖는 인터루킨-17/인터루킨-17F (IL-17A/F) 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열,
    (b) 서열 3의 서열에서 아미노산 잔기 1 내지 23의 신호 펩티드가 결여된 서열 및 서열 4의 서열에서 아미노산 잔기 1 내지 30의 신호 펩티드가 결여된 서열을 갖는 IL-17A/F 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열,
    (c) 서열 5 및 서열 6으로 이루어진 뉴클레오티드 서열, 또는
    (d) 서열 5의 뉴클레오티드 46 내지 513 및 서열 6의 뉴클레오티드 40 내지 531로 이루어진 뉴클레오티드 서열
    로 이루어진 단리된 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 IL-17A/F 폴리펩티드가 서열 3 및 서열 4의 서열을 갖는, 공유결합적으로 연결된 이종이량체성 복합체인 단리된 핵산 분자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 공유결합적으로 연결된 이종이량체성 복합체가 서열 3과 서열 4 사이에 2개의 쇄간 디술피드 연결기를 갖는 것인 단리된 핵산 분자.
  4. 제1항에 있어서, 서열 3 및 서열 4의 서열을 갖는 IL-17A/F 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 단리된 핵산 분자.
  5. 제1항에 있어서, 서열 3의 서열에서 아미노산 잔기 1 내지 23의 신호 펩티드가 결여된 서열 및 서열 4의 서열에서 아미노산 잔기 1 내지 30의 신호 펩티드가 결여된 서열을 갖는 IL-17A/F 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 단리된 핵산 분자.
  6. 제1항에 있어서, 서열 5 및 서열 6으로 이루어진 단리된 핵산 분자.
  7. 제1항에 있어서, 서열 5의 뉴클레오티드 46 내지 513 및 서열 6의 뉴클레오티드 40 내지 531로 이루어진 단리된 핵산 분자.
  8. 제1항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  9. 제8항에 있어서, 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 의해 인식되는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 것인 벡터.
  10. 제8항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  11. 제10항에 있어서, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 이. 콜라이 (E. coli) 세포, 효모 세포 또는 배큘로바이러스에 감염된 곤충 세포인 숙주 세포.
  12. 제10항의 숙주 세포를 IL-17A/F 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에서 배양하는 단계, 및
    상기 세포 배양물로부터 상기 IL-17A/F 폴리펩티드를 회수하는 단계
    를 포함하는, IL-17A/F 폴리펩티드의 제조 방법.
  13. (a) 서열 3 및 서열 4의 서열을 갖는 IL-17A/F 폴리펩티드의 아미노산 서열, 또는
    (b) 서열 3의 서열에서 아미노산 잔기 1 내지 23의 신호 펩티드가 결여된 서열 및 서열 4의 서열에서 아미노산 잔기 1 내지 30의 신호 펩티드가 결여된 서열을 갖는 IL-17A/F 폴리펩티드의 아미노산 서열
    로 이루어진 단리된 폴리펩티드.
  14. 제13항에 있어서, 상기 IL-17A/F 폴리펩티드가 서열 3 및 서열 4로 이루어진 이종이량체성 복합체인 단리된 폴리펩티드.
  15. 제14항에 있어서, 상기 이종이량체성 복합체가 서열 3과 서열 4 사이에 2개의 쇄간 디술피드 연결기를 갖는 것인 단리된 폴리펩티드.
  16. 제13항에 있어서, 서열 3 및 서열 4로 이루어진 단리된 폴리펩티드.
  17. 제13항에 있어서, 서열 3의 서열에서 아미노산 잔기 1 내지 23의 신호 펩티드가 결여된 서열 및 서열 4의 서열에서 아미노산 잔기 1 내지 30의 신호 펩티드가 결여된 서열로 이루어진 단리된 폴리펩티드.
  18. 이종 아미노산 서열에 융합된 제13항에 따른 폴리펩티드로 이루어진 키메라 분자.
  19. 제18항에 있어서, 상기 이종 아미노산 서열이 에피토프 태그 서열 또는 이뮤노글로불린의 Fc 영역인 키메라 분자.
  20. (a) 서열 3 및 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 IL-17A/F 폴리펩티드,
    (b) 상기 IL-17A/F 폴리펩티드의 효능제,
    (c) 상기 IL- 17A/F 폴리펩티드의 길항제, 또는
    (d) 상기 IL-17A/F 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체, 및
    제약상 허용되는 담체
    를 포함하는, 포유동물에서 면역 관련 질환을 치료하기 위한 제약 조성물.
  21. 제13항에 따른 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
  22. 제21항에 있어서, 모노클로날 항체, 인간화 항체 또는 단일쇄 항체인 단리된 항체.
  23. 제21항에 있어서, 비인간 상보성 결정 영역 (CDR) 잔기 및 인간 프레임워크 영역 (FR: framework region) 잔기를 갖는 모노클로날 항체인 단리된 항체.
  24. 제21항에 있어서, 표지되고 고체 지지체 상에 고정된 단리된 항체.
  25. 제21항에 있어서, 항체 단편, 모노클로날 항체, 단일쇄 항체, 또는 항-이디오타입 (idiotype) 항체인 단리된 항체.
  26. 제25항에 있어서, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3이라고 지칭되는 3개의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 CDR-H1은 서열 9 내지 42의 아미노산 잔기 7 내지 16에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것인, IL-17A/F에 결합할 수 있는 단리된 항체.
  27. 제25항에 있어서, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3이라고 지칭되는 3개의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 CDR-H2는 서열 9 내지 42의 아미노산 잔기 30 내지 46에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것인, IL-17A/F에 결합할 수 있는 단리된 항체.
  28. 제25항에 있어서, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3이라고 지칭되는 3개의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 CDR-H3은 서열 9 내지 42의 아미노산 잔기 78 내지 적어도 아미노산 잔기 96에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것인, IL-17A/F에 결합할 수 있는 단리된 항체.
  29. 제25항에 있어서, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3이라고 지칭되는 3개의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 CDR-H1은 서열 9 내지 42의 아미노산 잔기 7 내지 16에서 선택된 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 CDR-H2는 서열 9 내지 42의 아미노산 잔기 30 내지 46에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것인, IL-17A/F에 결합할 수 있는 단리된 항체.
  30. 제25항에 있어서, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3이라고 지칭되는 3개의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 CDR-H1은 서열 9 내지 42의 아미노산 잔기 7 내지 16에서 선택된 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 CDR-H3은 서열 9 내지 42의 아미노산 잔기 78 내지 적어도 아미노산 잔기 96에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것인, IL-17A/F에 결합할 수 있는 단리된 항체.
  31. 제25항에 있어서, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3이라고 지칭되는 3개의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 CDR-H2는 서열 9 내지 42의 아미노산 잔기 30 내지 46에서 선택된 아미노산 서열로 이루어지며, 상기 CDR-H3은 서열 9 내지 42의 아미노산 잔기 78 내지 적어도 아미노산 잔기 96에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것인, IL-17A/F에 결합할 수 있는 단리된 항체.
  32. 제25항에 있어서, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3이라고 지칭되는 3개의 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 CDR-H1은 서열 9 내지 42의 아미노산 잔기 7 내지 16에서 선택된 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 CDR-H2는 서열 9 내지 42의 아미노산 잔기 30 내지 46에서 선택된 아미노산 서열로 이루어지며, 상기 CDR-H3은 서열 9 내지 42의 아미노산 잔기 78 내지 적어도 아미노산 잔기 96에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것인, IL-17A/F에 결합할 수 있는 단리된 항체.
  33. 제25항에 있어서, 항-IL-17A/F 효능제 항체인 단리된 항체.
  34. 제25항에 있어서, 항-IL-17A/F 길항제 항체인 단리된 항체.
  35. 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 서열 48, 서열 49, 서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55, 서열 56, 서열 57, 서열 58, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 63, 서열 64, 서열 65, 서열 66, 서열 67, 서열 68, 서열 69, 서열 70, 서열 71, 서열 72, 서열 73, 서열 74, 서열 75 및 서열 76의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되고, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 25, 서열 26, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 31, 서열 32, 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 또는 서열 42로 도시된 Fab 단편을 코딩하며, 여기서 상기 Fab 단편은 IL-17A/F에 결합할 수 있는 단리된 핵산 분자.
  36. 제20항에 있어서, (a), (b) 또는 (d)가
    (i) 포유동물에서 T-림프구의 증식을 증가시킬 수 있거나, 또는
    (ii) 포유동물의 조직 내로 염증 세포의 침윤을 증가시킬 수 있는
    제약 조성물.
  37. 제20항에 있어서, (c) 또는 (d)가
    (i) 포유동물에서 T-림프구의 증식을 저해할 수 있거나, 또는
    (ii) 포유동물의 조직 내로 염증 세포의 침윤을 감소시킬 수 있는
    제약 조성물.
  38. 제20항에 있어서, (a), (b), (c) 또는 (d)의 치료상 유효량을 포함하는 제약 조성물.
  39. 용기,
    상기 용기 상의 라벨, 및
    상기 용기 내에 함유된 제20항에 따른 제약 조성물
    을 포함하며, 상기 용기 상의 라벨은 상기 조성물이 면역 관련 질환의 치료에 사용될 수 있음을 지시하는 것인 제조품.
  40. 치료상 유효량의 (a) 제13항의 폴리펩티드, (b) 상기 폴리펩티드의 효능제, (c) 상기 폴리펩티드의 길항제, 또는 (d) 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체, 및
    1종 이상의 제약상 허용되는 담체
    를 포함하는, 포유동물에서 면역 관련 질환을 치료하기 위한 제약 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 면역 관련 질환이 전신성 홍반 루푸스, 류마티스성 관절염, 골관절염, 유년형 만성 관절염, 척추관절증, 전신성 경화증, 특발성 염증성 근병증, 쇼그렌 증후군, 전신성 맥관염, 유육종증, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 혈소판 감소증, 갑상선염, 진성 당뇨병, 면역-매개 신장 질환, 중추신경계 또는 말초신경계의 탈수초성 질환, 특발성 탈수초성 다발성 신경병증, 길랑-바레 증후군, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 간담즙성 질환, 감염성 또는 자가면역 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 간경변, 육아종성 간염, 경화성 담관염, 염증성 장질환, 글루텐 (gluten) 민감성 장질환, 휘플병, 자가면역 또는 면역-매개 피부 질환, 수포성 피부 질환, 다형성 홍반, 접촉성 피부염, 건선, 알레르기성 질환, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 음식물 과민증, 두드러기, 폐의 면역 질환, 호산구성 폐렴, 특발성 폐섬유증, 과민성 폐렴, 이식 관련 질환, 이식편 거부반응 또는 이식편 대 숙주 질환인 제약 조성물.
  42. IL-17A/F 폴리펩티드를 함유할 것으로 예상되는 샘플을 항-IL-17A/F 항체에 노출시켜 상기 샘플의 성분에 대한 상기 항체의 결합 여부를 결정하는 단계
    를 포함하는, IL-17A/F 폴리펩티드를 함유할 것으로 예상되는 샘플에서 IL-17A/F 폴리펩티드의 존재 여부를 결정하는 방법.
  43. (a) 인간을 제외한 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 샘플, 및
    (b) 동일 세포 유형의 공지된 정상 조직 세포의 대조군 샘플
    에서 IL-17A/F 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 검출하는 것을 포함하며, 여기서 대조군 샘플에 비해 시험 샘플에서의 상기 유전자 발현 수준이 더 높거나 더 낮은 것이 상기 시험 조직 세포를 얻은 포유동물에 면역 관련 질환이 존재함을 나타내는 것인, 인간을 제외한 포유동물에서 면역 관련 질환을 진단하는 방법.
  44. (a) 항-IL-17A/F 항체를 인간을 제외한 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 샘플과 접촉시키는 단계, 및
    (b) 상기 항체와 시험 샘플 내의 폴리펩티드 사이의 복합체 형성을 검출하는 단계
    를 포함하며, 여기서 상기 복합체의 형성이 상기 시험 조직 세포를 얻은 포유동물에 면역 관련 질환이 존재함을 지시하는 것인, 인간을 제외한 포유동물에서 면역 관련 질환을 진단하는 방법.
  45. 서열 3 및 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 IL-17A/F 폴리펩티드 복합체에 정상적으로 반응하는 세포를 상기 폴리펩티드 복합체 (a) 및 후보 화합물 (b)와 접촉시키고,
    상기 세포의 (a)에 대한 반응성 결여 여부를 결정하는 것
    을 포함하는, 서열 3 및 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 IL-17A/F 폴리펩티드 복합체의 활성을 억제하는 화합물의 동정 방법.
  46. 서열 3 및 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 IL-17A/F 폴리펩티드 복합체를 정상적으로 발현하는 세포를 후보 화합물과 접촉시키는 단계, 및
    상기 폴리펩티드 복합체 코딩 유전자 발현의 결여 여부를 결정하는 단계
    를 포함하는, 서열 3 및 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 IL-17A/F 폴리펩티드 복합체 코딩 유전자의 발현을 억제하는 화합물의 동정 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 후보 화합물이 안티센스 핵산인 방법.
  48. 서열 3 및 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 IL-17A/F 폴리펩티드 복합체에 정상적으로 반응하는 세포를 후보 화합물과 접촉시키는 단계, 및
    상기 세포의 상기 후보 화합물에 대한 반응성을 측정하는 단계
    를 포함하는, 서열 3 및 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 IL-17A/F 폴리펩티드 복합체의 활성을 모방하는 화합물의 동정 방법.
  49. 서열 3 및 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 IL-17A/F 폴리펩티드 복합체 (a) 또는 상기 (a)의 효능제 (b)를 유효량으로 포함하는, T 림프구의 증식을 자극하기 위한 제약 조성물.
  50. 서열 3 및 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 IL-17A/F 폴리펩티드 복합체의 길항제를 유효량으로 포함하는, T-림프구의 증식을 억제하기 위한 제약 조성물.
  51. 서열 3 및 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 IL-17A/F 폴리펩티드 복합체 (a) 또는 상기 (a)의 효능제 (b)를 유효량으로 포함하는, 포유동물의 조직 내로 염증 세포의 침윤을 증대시키기 위한 제약 조성물.
  52. 서열 3 및 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 IL-17A/F 폴리펩티드 복합체의 길항제를 유효량으로 포함하는, 포유동물의 조직 내로 염증 세포의 침윤을 감소시키기 위한 제약 조성물.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 염증 세포가 단핵구, 호산구 또는 다핵 호중구 (PMN)인 제약 조성물.
  54. (a) 숙주 세포를, 서열 3에 나타낸 인간 IL-17 폴리펩티드 및 서열 4에 나타낸 인간 IL-17F 폴리펩티드를 코딩하는 동량의 cDNA 발현 벡터로 동시에 형질감염시키는 단계,
    (b) 상기 숙주 세포를 서열 3 및 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 IL-17A/F 폴리펩티드 복합체의 발현에 적합한 조건 하에 배양시키고, 세포 배양물로부터 상기 IL-17A/F 폴리펩티드 복합체를 회수하는 단계
    를 포함하는, 서열 3 및 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 IL-17A/F 폴리펩티드 복합체의 제조 방법.
  55. 제35항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  56. 제55항에 있어서, 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포로 의해 인식되는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 것인 벡터.
  57. 제55항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  58. 제57항에 있어서, CHO 세포, 이. 콜라이 세포, 효모 세포 또는 배큘로바이러스에 감염된 곤충 세포인 숙주 세포.
  59. 제58항의 숙주 세포를, 제35항에 따른 단리된 핵산 분자에 의해 코딩되는 항체의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계, 및
    상기 세포 배양물로부터 상기 항체를 회수하는 단계
    를 포함하는, 제35항에 따른 단리된 핵산 분자에 의해 코딩되는 항체의 제조 방법.
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Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7771719B1 (en) 2000-01-11 2010-08-10 Genentech, Inc. Pharmaceutical compositions, kits, and therapeutic uses of antagonist antibodies to IL-17E
EP2333069A3 (en) 1998-05-15 2011-09-14 Genentech, Inc. Therapeutic uses of IL-17 homologous polypeptides
US20040043397A1 (en) * 2000-01-11 2004-03-04 Genentech, Inc. IL-17 homologous polypeptides and therapeutic uses thereof
US20030203451A1 (en) * 2000-08-24 2003-10-30 Genentech, Inc. IL-17 homologous polypeptides and therapeutic uses thereof
US7718397B2 (en) 2000-03-21 2010-05-18 Genentech, Inc. Nucleic acids encoding receptor for IL-17 homologous polypeptides and uses thereof
US20030096969A1 (en) 2000-06-02 2003-05-22 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20070160576A1 (en) * 2001-06-05 2007-07-12 Genentech, Inc. IL-17A/F heterologous polypeptides and therapeutic uses thereof
CA2523672C (en) 2003-04-29 2012-07-17 Avi Biopharma, Inc. Compositions for enhancing transport of molecules into cells
SI1641822T1 (sl) 2003-07-08 2013-08-30 Genentech, Inc. IL-17 A/F heterologni polipeptidi in njihove terapevtske uporabe
US7501247B2 (en) 2004-05-03 2009-03-10 Schering Corporation Method of treating skin inflammation
US20050287593A1 (en) 2004-05-03 2005-12-29 Schering Corporation Use of cytokine expression to predict skin inflammation; methods of treatment
US20050288246A1 (en) 2004-05-24 2005-12-29 Iversen Patrick L Peptide conjugated, inosine-substituted antisense oligomer compound and method
BRPI0511952A (pt) 2004-06-10 2008-01-29 Zymogenetics Inc receptor solúvel isolado, anticorpo ou fragmento de anticorpo, e, métodos de reduzir inflamação induzida por il-17a ou induzida por il-17f, de tratar um mamìfero afetado com uma doença inflamatória, e uma condição patológica em um indivìduo associada com atividade de zcytor14
GB0425569D0 (en) 2004-11-19 2004-12-22 Celltech R&D Ltd Biological products
EP2292758A3 (en) * 2004-12-20 2013-12-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Uses of mammalian cytokine; related reagents
AU2006214473A1 (en) * 2005-02-14 2006-08-24 Wyeth Interleukin-17F antibodies and other IL-17F signaling antagonists and uses therefor
WO2006088925A2 (en) * 2005-02-14 2006-08-24 Wyeth Use of il17-f in diagnosis and therapy of airway inflammation
US8067571B2 (en) 2005-07-13 2011-11-29 Avi Biopharma, Inc. Antibacterial antisense oligonucleotide and method
AU2006284841B2 (en) 2005-09-01 2012-11-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Use of IL-23 and IL-17 antagonists to treat autoimmune ocular inflammatory disease
US20070249533A1 (en) 2005-09-28 2007-10-25 Levin Steven D Il-17a and il-17f antagonists and methods of using the same
US20070238658A1 (en) * 2005-09-28 2007-10-11 Levin Steven D IL-17A and IL-17F Antagonists and Methods of Using the Same
KR20080099264A (ko) * 2006-02-13 2008-11-12 제넨테크, 인크. Ｒｅｌｔ를 표적화하기 위한 방법 및 조성물
US7910703B2 (en) 2006-03-10 2011-03-22 Zymogenetics, Inc. Antagonists to IL-17A, IL-17F, and IL-23P19 and methods of use
US7790163B2 (en) 2006-03-10 2010-09-07 Zymogenetics, Inc. Antibodies that bind both IL-17A and IL-17F and methods of using the same
AU2007226627B2 (en) * 2006-03-10 2012-09-20 Zymogenetics, Inc. Antibodies that bind both IL-17A and IL-17F and methods of using the same
WO2007147019A2 (en) 2006-06-13 2007-12-21 Zymogenetics, Inc. Il-17 and il-23 antagonists and methods of using the same
GB0620729D0 (en) * 2006-10-18 2006-11-29 Ucb Sa Biological products
TWI426918B (zh) * 2007-02-12 2014-02-21 Merck Sharp & Dohme Ｉｌ-２３拮抗劑於治療感染之用途
WO2008109379A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting il17a gene expression and uses thereof
AU2008230843B2 (en) 2007-03-26 2012-08-30 Zymogenetics, Inc. Soluble IL-17RA/RC fusion proteins and related methods
TW200902064A (en) * 2007-03-28 2009-01-16 Wyeth Corp Methods and compositions for modulating IL-17F/IL-17A biological activity
WO2008121385A2 (en) * 2007-03-30 2008-10-09 Children's Hospital Medical Center Compositions and methods useful for modulating spondyloarthropathies
EP2392597B1 (en) * 2007-04-27 2014-04-02 ZymoGenetics, Inc. Antagonists to IL-17A, IL-17F, and IL-23P19 and methods of use
WO2008133684A1 (en) 2007-04-27 2008-11-06 Zymogenetics, Inc. Antibodies that bind both il-17a and il-17f and methods of using the same
US20100016215A1 (en) 2007-06-29 2010-01-21 Avi Biopharma, Inc. Compound and method for treating myotonic dystrophy
GB0807413D0 (en) 2008-04-23 2008-05-28 Ucb Pharma Sa Biological products
KR20110025649A (ko) 2008-05-05 2011-03-10 노비뮨 에스 에이 항-ｉｌ-１７ａ／ｉｌ-１７ｆ 교차-반응성 항체 및 그의 사용 방법
US8790642B2 (en) 2008-08-29 2014-07-29 Genentech, Inc. Cross-reactive and bispecific anti-IL-17A/F antibodies
PE20160652A1 (es) 2009-05-05 2016-07-09 Novimmune Sa Anticuerpos que se unen a il-17f
US20130064788A1 (en) * 2009-10-10 2013-03-14 Eleven Biotherapeutics, Inc. Il-17 family cytokine compositions and uses
EP2513148B1 (en) * 2009-12-16 2016-08-31 AbbVie Biotherapeutics Inc. Anti-her2 antibodies and their uses
WO2011140484A1 (en) 2010-05-06 2011-11-10 Singulex, Inc Methods for diagnosing, staging, predicting risk for developing and identifying treatment responders for rheumatoid arthritis
CA3090304A1 (en) * 2010-05-13 2011-11-17 Sarepta Therapeutics, Inc. Antisense modulation of interleukins 17 and 23 signaling
RU2012149227A (ru) 2010-05-20 2014-06-27 Аблинкс Нв Биологические материалы, относящиеся к her3
BR112013017951B1 (pt) 2011-01-14 2022-09-27 UCB Biopharma SRL Anticorpo de neutralização, sequência de dna isolada, vetor de clonagem ou expressão, processo para a produção do anticorpo, composição farmacêutica, uso de anticorpo e uso da composição farmacêutica
US20140105855A1 (en) * 2011-04-06 2014-04-17 Kenan Christopher Garcia Structural based design of il-17 dominant negative mutants
UA117218C2 (uk) 2011-05-05 2018-07-10 Мерк Патент Гмбх Поліпептид, спрямований проти il-17a, il-17f та/або il17-a/f
US9161948B2 (en) 2011-05-05 2015-10-20 Sarepta Therapeutics, Inc. Peptide oligonucleotide conjugates
US9284283B2 (en) 2012-02-02 2016-03-15 Ensemble Therapeutics Corporation Macrocyclic compounds for modulating IL-17
WO2013177101A2 (en) 2012-05-22 2013-11-28 Bristol-Myers Squibb Company Bispecific antibodies and methods of using the same
MX359817B (es) 2012-08-16 2018-10-11 Ipierian Inc Anticuerpos que se enlazan a tau.
US8980270B2 (en) 2013-01-18 2015-03-17 Ipierian, Inc. Methods of treating a tauopathy
NZ630610A (en) 2014-02-14 2019-05-31 Ipierian Inc Tau peptides, anti-tau antibodies, and methods of use thereof
EP3107567A4 (en) * 2014-02-19 2017-10-25 Cangene Corporation Methods of modulating an immune response
CN106573032B (zh) * 2014-05-21 2022-03-18 哈佛大学的校长及成员们 Ras抑制肽和其用途
CN107148283A (zh) 2014-10-31 2017-09-08 豪夫迈·罗氏有限公司 抗il‑17a和il‑17f交叉反应性抗体变体、包含其的组合物及其制备和使用方法
RU2020141422A (ru) 2014-11-05 2021-01-13 Дженентек, Инк. Способы получения двуцепочечных белков в бактериях
CA2966558C (en) 2014-11-05 2024-03-12 Genentech, Inc. Methods of producing two chain proteins in bacteria
CN104784687A (zh) * 2015-04-27 2015-07-22 苏州大学附属第一医院 重组绿脓杆菌鞭毛钩蛋白FlgE的用途
US11020417B2 (en) 2015-06-04 2021-06-01 Sarepta Therapeutics, Inc Methods and compounds for treatment of lymphocyte-related diseases and conditions
KR20190091331A (ko) * 2016-12-07 2019-08-05 주식회사 아모라이프사이언스 세포 거동 조절용 3 차원 미세환경 구조물, 세포 거동조절용 3 차원 표면, 어레이 및 3 차원 미세환경구조물의 제조방법
BR112019012647A2 (pt) 2016-12-19 2019-11-19 Sarepta Therapeutics Inc conjugados de oligômero de salto de éxon para distrofia muscular
CN109206515B (zh) * 2017-07-06 2021-10-12 北京伟峰益民科技有限公司 一种全人源抗人白介素17a抗体及其应用
CN111218425B (zh) * 2019-01-17 2022-02-08 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 人源化转基因动物
JP7434593B2 (ja) * 2020-05-14 2024-02-20 エリクシロン・イミュノセラピューティクス・（ホンコン）・リミテッド 抗ｐｄ－ｌ１抗体及び抗ｐｄ－ｌ１／ｉｌ１０融合タンパク質

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001046420A2 (en) * 1999-12-23 2001-06-28 Genentech, Inc. Il-17 and il-17r homologous polypeptides and therapeutic uses thereof

Family Cites Families (197)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US577300A (en) 1897-02-16 Printing-press
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
US4657760A (en) 1979-03-20 1987-04-14 Ortho Pharmaceutical Corporation Methods and compositions using monoclonal antibody to human T cells
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
ZA811368B (en) 1980-03-24 1982-04-28 Genentech Inc Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
NZ201705A (en) 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4943529A (en) 1982-05-19 1990-07-24 Gist-Brocades Nv Kluyveromyces as a host strain
US4870009A (en) 1982-11-22 1989-09-26 The Salk Institute For Biological Studies Method of obtaining gene product through the generation of transgenic animals
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
AU2353384A (en) 1983-01-19 1984-07-26 Genentech Inc. Amplification in eukaryotic host cells
WO1984003506A1 (en) 1983-03-08 1984-09-13 Commw Serum Lab Commission Antigenically active amino acid sequences
US4708871A (en) 1983-03-08 1987-11-24 Commonwealth Serum Laboratories Commission Antigenically active amino acid sequences
NZ207394A (en) 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4675187A (en) 1983-05-16 1987-06-23 Bristol-Myers Company BBM-1675, a new antibiotic complex
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
AU3145184A (en) 1983-08-16 1985-02-21 Zymogenetics Inc. High expression of foreign genes in schizosaccharomyces pombe
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4736866B1 (en) 1984-06-22 1988-04-12 Transgenic non-human mammals
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
EP0229046B1 (fr) 1985-03-30 1994-05-04 BALLIVET, Marc Procede d'obtention d'adn, arn, peptides, polypeptides ou proteines, par une technique de recombinaison d'adn
US6492107B1 (en) 1986-11-20 2002-12-10 Stuart Kauffman Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
NZ215865A (en) 1985-04-22 1988-10-28 Commw Serum Lab Commission Method of determining the active site of a receptor-binding analogue
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
EP0272253A4 (en) 1986-03-07 1990-02-05 Massachusetts Inst Technology METHOD FOR IMPROVING GLYCOPROTE INSTABILITY.
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US4946783A (en) 1987-01-30 1990-08-07 President And Fellows Of Harvard College Periplasmic protease mutants of Escherichia coli
US5010182A (en) 1987-07-28 1991-04-23 Chiron Corporation DNA constructs containing a Kluyveromyces alpha factor leader sequence for directing secretion of heterologous polypeptides
IL87737A (en) 1987-09-11 1993-08-18 Genentech Inc Method for culturing polypeptide factor dependent vertebrate recombinant cells
GB8724885D0 (en) 1987-10-23 1987-11-25 Binns M M Fowlpox virus promotors
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
ATE105585T1 (de) 1987-12-21 1994-05-15 Univ Toledo Transformation von keimenden pflanzensamen mit hilfe von agrobacterium.
US5266684A (en) 1988-05-02 1993-11-30 The Reagents Of The University Of California Peptide mixtures
US5571689A (en) 1988-06-16 1996-11-05 Washington University Method of N-acylating peptide and proteins with diheteroatom substituted analogs of myristic acid
AU4005289A (en) 1988-08-25 1990-03-01 Smithkline Beecham Corporation Recombinant saccharomyces
US5663143A (en) 1988-09-02 1997-09-02 Dyax Corp. Engineered human-derived kunitz domains that inhibit human neutrophil elastase
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5009772A (en) 1989-02-27 1991-04-23 Kerr-Mcgee Corporation Solvent extraction process
JPH04503957A (ja) 1989-03-07 1992-07-16 ジェネンテク，インコーポレイテッド 脂質とオリゴヌクレオチドの共有結合コンジュゲート
DE68927344T2 (de) 1989-04-28 1997-02-20 Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh Hefezellen der Gattung-Schwanniomyces
FR2646437B1 (fr) 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
JPH04505261A (ja) 1989-05-10 1992-09-17 スローン―ケツテリング・インステイテユート・フオー・キヤンサー・リサーチ ポルｉｉｉプロモーターの制御下の転写可能な外来ｄｎａを含む安定的に形質転換された真核細胞
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
DE69029036T2 (de) 1989-06-29 1997-05-22 Medarex Inc Bispezifische reagenzien für die aids-therapie
FR2649120B1 (fr) 1989-06-30 1994-01-28 Cayla Nouvelle souche et ses mutants de champignons filamenteux, procede de production de proteines recombinantes a l'aide de ladite souche et souches et proteines obtenues selon ce procede
WO1991004753A1 (en) 1989-10-02 1991-04-18 Cetus Corporation Conjugates of antisense oligonucleotides and therapeutic uses thereof
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
EP0498843B1 (en) 1989-10-24 1996-06-12 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5498538A (en) 1990-02-15 1996-03-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Totally synthetic affinity reagents
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
JPH06500011A (ja) 1990-06-29 1994-01-06 ラージ　スケール　バイオロジー　コーポレイション 形質転換された微生物によるメラニンの製造
ES2246502T3 (es) 1990-08-29 2006-02-16 Genpharm International, Inc. Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
US5770434A (en) 1990-09-28 1998-06-23 Ixsys Incorporated Soluble peptides having constrained, secondary conformation in solution and method of making same
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
WO1992009300A1 (en) 1990-11-21 1992-06-11 Iterex Pharmaceuticals Ltd. Partnership Synthesis of equimolar multiple oligomer mixtures, especially of oligopeptide mixtures
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
US5206161A (en) 1991-02-01 1993-04-27 Genentech, Inc. Human plasma carboxypeptidase B
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP0586505A1 (en) 1991-05-14 1994-03-16 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
JPH07501451A (ja) 1991-11-25 1995-02-16 エンゾン・インコーポレイテッド 多価抗原結合タンパク質
AU675929B2 (en) 1992-02-06 1997-02-27 Curis, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
ATE149570T1 (de) 1992-08-17 1997-03-15 Genentech Inc Bispezifische immunoadhesine
AU678787B2 (en) 1992-10-23 1997-06-12 Immunex Corporation Methods of preparing soluble, oligomeric proteins
CA2149329C (en) 1992-11-13 2008-07-15 Darrell R. Anderson Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
DK0674506T3 (da) 1992-12-02 2001-01-08 Alkermes Inc Væksthormonholdige mikrosfærer med styret frigivelse
ATE186219T1 (de) 1993-03-24 1999-11-15 Berlex Biosciences Kombination von antihormonale und bindende moleküle zur krebsbehandlung
US5536637A (en) 1993-04-07 1996-07-16 Genetics Institute, Inc. Method of screening for cDNA encoding novel secreted mammalian proteins in yeast
US6274711B1 (en) 1993-06-14 2001-08-14 Inserm, Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Purified mammalian CTLA-8 antigens and related reagents
US6562333B1 (en) * 1993-06-14 2003-05-13 Schering Corporation Purified mammalian CTLA-8 antigens and related reagents
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
AU7104294A (en) 1994-06-10 1996-01-05 Symbiotech, Inc. Method of detecting compounds utilizing genetically modified lambdoid bacteriophage
US5627024A (en) 1994-08-05 1997-05-06 The Scripps Research Institute Lambdoid bacteriophage vectors for expression and display of foreign proteins
WO2001016318A2 (en) 1999-09-01 2001-03-08 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
ATE197398T1 (de) 1994-09-09 2000-11-11 Takeda Chemical Industries Ltd Zubereitung mit verzögerter freigabe eines metallsalz eines peptids
US6214388B1 (en) 1994-11-09 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Immunoliposomes that optimize internalization into target cells
AU4289496A (en) 1994-12-02 1996-06-19 Chiron Corporation Method of promoting an immune response with a bispecific antibody
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5837234A (en) 1995-06-07 1998-11-17 Cytotherapeutics, Inc. Bioartificial organ containing cells encapsulated in a permselective polyether suflfone membrane
ATE204468T1 (de) 1995-06-07 2001-09-15 Alkermes Inc Mittel zur verzögerten freisetzung von menschlichem wachstumshormon
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
ZA965368B (en) 1995-07-14 1997-01-14 Novo Nordisk As A pharmaceutical formulation
CA2227220A1 (en) * 1995-07-19 1997-02-06 Genetics Institute, Inc. Human ctla-8 and uses of ctla-8-related proteins
US6074849A (en) 1995-07-19 2000-06-13 Genetics Institute, Inc. Polynucleotides encoding human CTLA-8 related proteins
US6902735B1 (en) 1995-07-19 2005-06-07 Genetics Institute, Llc Antibodies to human IL-17F and other CTLA-8-related proteins
AU6785496A (en) 1995-09-07 1997-03-27 Novo Nordisk A/S Phage display for detergent enzyme activity
DE19544393A1 (de) 1995-11-15 1997-05-22 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Synergistische herbizide Mischungen
AU2582897A (en) 1996-03-15 1997-10-01 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the diagnosis, prevention, and treatment of neoplastic cell growth and proliferation
PT904541E (pt) 1996-03-20 2005-01-31 Dyax Corp Purificacao de activador de plasminogenio tecidual (tpa)
WO1997046251A1 (en) 1996-06-06 1997-12-11 Lajolla Pharmaceutical Company aPL IMMUNOREACTIVE PEPTIDES, CONJUGATES THEREOF AND METHODS OF TREATMENT FOR aPL ANTIBODY-MEDIATED PATHOLOGIES
DE69731226T2 (de) 1996-06-10 2006-03-09 The Scripps Research Institute, La Jolla Verwendung von substrat-subtraktionsbibliotheken zur unterscheidung von enzymspezifitäten
US5766905A (en) 1996-06-14 1998-06-16 Associated Universities Inc. Cytoplasmic bacteriophage display system
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
WO1998014277A1 (en) 1996-10-04 1998-04-09 Whatman, Inc. Device and method for simultaneous multiple chemical syntheses
AU4474497A (en) 1996-10-08 1998-05-05 U-Bisys B.V. Methods and means for selecting peptides and proteins having specific affinity for a target
WO2002008284A2 (en) 2000-07-20 2002-01-31 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of disorders involving angiogenesis
EP0938497B1 (en) 1996-11-06 2007-02-28 Genentech, Inc. Constrained helical peptides and methods of making same
IL119586A (en) 1996-11-07 2001-09-13 Univ Ramot Discontinuous library of a single biological unit and a method for its preparation
IL119587A (en) 1996-11-07 2000-12-06 Univ Ramot Method of preparing and for obtaining bimolecular interactions
US20020177188A1 (en) 1998-05-15 2002-11-28 Genentech, Inc. IL-17 homologous polypeptides and therapeutic uses thereof
US6486303B1 (en) 1998-04-14 2002-11-26 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey Method for making hormone heterodimers
US20020182673A1 (en) 1998-05-15 2002-12-05 Genentech, Inc. IL-17 homologous polypedies and therapeutic uses thereof
CA2329274A1 (en) 1998-05-29 1999-12-02 Steven M. Ruben Interleukin-21
US6335155B1 (en) 1998-06-26 2002-01-01 Sunesis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapidly identifying small organic molecule ligands for binding to biological target molecules
WO2000020593A1 (en) 1998-10-02 2000-04-13 Eli Lilly And Company Il-17 homolog nucleic acids, polypeptides, vectors, host cells, methods and uses thereof
JP2000186046A (ja) * 1998-10-14 2000-07-04 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 慢性関節リウマチ治療剤及び診断方法
WO2000039585A1 (en) 1998-12-28 2000-07-06 Sunesis Pharmaceuticals, Inc. Identifying small organic molecule ligands for binding
EP1053751A1 (en) 1999-05-17 2000-11-22 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Compositions and methods for treating cell proliferation disorders
IL147336A0 (en) 1999-07-07 2002-08-14 Zymogenetics Inc Human cytokine receptor
CA2400472A1 (en) * 2000-02-08 2001-08-16 Amgen, Inc. Il-17 like molecules and uses thereof
AU6802801A (en) 2000-03-01 2001-09-24 Genentech Inc Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6479636B1 (en) 2000-04-11 2002-11-12 Honiron Corporation (A Louisiana Corporation) Sugarcane fractioning system
CA2410083A1 (en) 2000-05-24 2001-11-29 Schering Corporation Mammalian receptor proteins; related reagents and methods
EP1309620A2 (en) 2000-06-23 2003-05-14 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of disorders involving angiogenesis
WO2002033083A2 (en) 2000-10-13 2002-04-25 Eli Lilly And Company Methods of using a human il-17-related polypeptide to treat disease
MXPA03003407A (es) 2000-10-18 2004-05-04 Immunex Corp Metodos para el tratamiento de artritis reumatoide usando antagonistas il-17.
AU2002242142A1 (en) 2001-02-09 2002-08-28 Johns Hopkins University A cytokine related structurally to il-17
GB2372464B (en) 2001-02-22 2003-05-14 Vivascience Ltd Method of isolating a charged compound
US20070160576A1 (en) 2001-06-05 2007-07-12 Genentech, Inc. IL-17A/F heterologous polypeptides and therapeutic uses thereof
AU2002324625B2 (en) * 2001-08-07 2008-05-08 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors in the treatment of diseases
CN1711282B (zh) 2002-10-30 2010-05-26 健泰科生物技术公司 Il-17产生的抑制
RU2006101702A (ru) 2003-06-23 2006-09-10 Дженетикс Инститьют, Ллс (Us) Антитела против интерлейкина-22 и их применения
SI1641822T1 (sl) 2003-07-08 2013-08-30 Genentech, Inc. IL-17 A/F heterologni polipeptidi in njihove terapevtske uporabe
JP4833850B2 (ja) 2003-11-21 2011-12-07 ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム Ｉｌ−１７活性阻害による多発性硬化症を治療するための方法
AU2006214473A1 (en) * 2005-02-14 2006-08-24 Wyeth Interleukin-17F antibodies and other IL-17F signaling antagonists and uses therefor
US7858843B2 (en) 2005-06-06 2010-12-28 Genentech, Inc. Gene disruptions, compositions and methods relating thereto
US20070238658A1 (en) 2005-09-28 2007-10-11 Levin Steven D IL-17A and IL-17F Antagonists and Methods of Using the Same
US7790163B2 (en) 2006-03-10 2010-09-07 Zymogenetics, Inc. Antibodies that bind both IL-17A and IL-17F and methods of using the same
AU2007226627B2 (en) 2006-03-10 2012-09-20 Zymogenetics, Inc. Antibodies that bind both IL-17A and IL-17F and methods of using the same
WO2007147019A2 (en) 2006-06-13 2007-12-21 Zymogenetics, Inc. Il-17 and il-23 antagonists and methods of using the same
GB0620729D0 (en) 2006-10-18 2006-11-29 Ucb Sa Biological products
WO2009082624A2 (en) 2007-12-10 2009-07-02 Zymogenetics, Inc. Antagonists of il-17a, il-17f, and il-23 and methods of using the same
KR20110025649A (ko) 2008-05-05 2011-03-10 노비뮨 에스 에이 항-ｉｌ-１７ａ／ｉｌ-１７ｆ 교차-반응성 항체 및 그의 사용 방법
US8790642B2 (en) * 2008-08-29 2014-07-29 Genentech, Inc. Cross-reactive and bispecific anti-IL-17A/F antibodies
MX2011003184A (es) 2008-09-29 2011-04-21 Roche Glycart Ag Anticuerpos contra il17 humana y usos de los mismos.
EP2810652A3 (en) 2009-03-05 2015-03-11 AbbVie Inc. IL-17 binding proteins
PE20160652A1 (es) 2009-05-05 2016-07-09 Novimmune Sa Anticuerpos que se unen a il-17f

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001046420A2 (en) * 1999-12-23 2001-06-28 Genentech, Inc. Il-17 and il-17r homologous polypeptides and therapeutic uses thereof

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Publication number Publication date
DK1641822T3 (da) 2013-07-22
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