BR112013017951B1 - Anticorpo de neutralização, sequência de dna isolada, vetor de clonagem ou expressão, processo para a produção do anticorpo, composição farmacêutica, uso de anticorpo e uso da composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

MOLÉCULAS DE ANTICORPO QUE LIGAM IL-17A E IL-17F. A invenção diz respeito às moléculas de anticorpo tendo especificidade para determinantes antigênicos tanto de IL-17A quanto de IL-17F, usos terapêuticos das moléculas de anticorpo e métodos para produzir as ditas moléculas de anticorpo.

Description

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA”

[0001] A presente invenção diz respeito às moléculas de anticorpo tendo especificidade para determinantes antigênicos tanto de IL-17A quanto de IL-17F. A presente invenção também diz respeito aos usos terapêuticos das moléculas de anticorpo e métodos para produzi-los.

[0002] IL-17A (originalmente chamada de CTLA-8 e também conhecida como IL-17) é uma citocina pró-inflamatória e o membro iniciador da família IL-17 (Rouvier et al. 1993, J. Immunol. 150: 5445-5456). Subsequentemente, cinco membros adicionais da família foram identificados (IL-17B - IL-17F) incluindo o mais intimamente relacionado, IL-17F (ML-1) que compartilha aproximadamente 55 % de homologia de sequência de aminoácido com IL-17A (Moseley et al., 2003, Cytokine Growth Factor Rev. 14: 155-174). IL-17A e IL-17F são expressados pelo subconjunto relacionado autoimune recentemente definido de células auxiliares T, Th17, que também expressa as citocinas de assinatura IL-21 e IL-22 (Korn et al., 2009, Annu. Rev. Immunol. 27:485-517.: 485-517). IL-17A e IL-17F são expressadas como homodímeros, mas também podem ser expressadas como o heterodímero IL-17A/F (Wright et al. 2008, J. Immunol. 181: 2799-2805). O sinal de IL-17A e F através dos receptores IL-17R, IL-17RC ou um complexo de receptor IL-17RA/RC (Gaffen 2008, Cytokine. 43: 402-407). Tanto IL-17A quanto IL-17F foram associadas com várias doenças autoimunes.

[0003] Consequentemente antagonistas duais de IL-17A e IL-17F podem ser mais eficazes do que um único antagonista no tratamento de doenças mediadas por IL- 17. Os anticorpos que ligam IL-17A e IL-17F foram descritos na WO2007/106769, WO2008/047134, WO2009/136286 e WO2010/025400.

[0004] A presente invenção fornece um anticorpo de neutralização melhorado que é capaz de ligar-se tanto a IL-17A quanto a IL-17F com alta afinidade. Em particular, o anticorpo da presente invenção é capaz de especificamente ligar-se tanto a IL-17A quanto a IL-17F isto é, o anticorpo não se liga a outras isoformas de IL-17. Preferivelmente, o anticorpo da presente invenção também se liga ao heterodímero IL-17A/IL-17F. Preferivelmente, o anticorpo da presente invenção neutraliza a atividade tanto de IL-17A quanto de IL-17F. Em uma forma de realização o anticorpo da presente invenção também neutraliza a atividade do heterodímero IL-17A/IL-17F. Os anticorpos da presente invenção portanto têm a propriedade vantajosa de que eles podem inibir a atividade biológica tanto de IL-17A quanto de IL-17F. Consequentemente, a presente invenção também fornece o uso de tais anticorpos no tratamento de e/ou profilaxia de uma doença mediada por cada um ou ambos de IL-17A ou IL-17F tal como doença autoimune ou inflamatória ou câncer.

[0005] Como aqui usado, o termo ‘anticorpo de neutralização’ descreve um anticorpo que é capaz de neutralizar a atividade de neutralização biológica tanto de IL-17A quanto de IL17F por exemplo pelo bloqueio de ligação pelo IL-17A e IL17F a um ou mais de seus receptores e pela ligação de bloqueio do heterodímero IL- 17A/IL-17F a um ou mais de seus receptores. Será avaliado que o termo ‘neutralizar’ como aqui usado refere-se a uma redução na atividade de sinalização biológica que pode ser parcial ou completa. Além disso, será avaliado que o grau de neutralização da atividade de IL-17A e IL-17F pelo anticorpo pode ser a mesma ou diferente. Em uma forma de realização o grau de neutralização da atividade do heterodímero IL- 17A/IL-17F pode ser o mesmo ou diferente como o grau de neutralização da atividade de IL-17A ou IL-17F.

[0006] Em uma forma de realização os anticorpos da presente invenção especificamente se ligam a IL-17A e IL-17F. Especificamente se ligam significa que os anticorpos têm uma afinidade maior para os polipeptídeos de IL-17A e IL-17F (que incluem o heterodímero IL-17A/IL-17F) do que para outros polipeptídeos. Preferivelmente os polipeptídeos de IL-17A e IL-17F são humanos. Em uma forma de realização o anticorpo também se liga à IL-17A e IL-17F de cinomolgo.

[0007] Os polipeptídeos de IL-17A ou IL-17F ou uma mistura dos dois ou células que expressam um ou ambos dos ditos polipeptídeos podem ser usados para produzir anticorpos que especificamente reconhecem ambos os polipeptídeos. Os polipeptídeos de IL-17 (IL-17A e IL-17F) podem ser polipeptídeos ‘maduros’ ou fragmentos ou derivados destes biologicamente ativos que preferivelmente incluem o sítio de ligação de receptor. Preferivelmente os polipeptídeos de IL-17 são os polipeptídeos maduros. Os polipeptídeos de IL-17 podem ser preparados pelos processos bem conhecidos na técnica a partir de células hospedeiras geneticamente engendradas que compreendem sistemas de expressão ou eles podem ser recuperados a partir de fontes biológicas naturais. No presente pedido, o termo “polipeptídeos” inclui peptídeos, polipeptídeos e proteínas. Estes são usados intercambiavelmente a menos que de outro modo especificado. O polipeptídeo IL-17 em alguns casos pode ser parte de uma proteína maior tal como uma proteína de fusão por exemplo fundido a um rótulo de afinidade. Os anticorpos gerados contra estes polipeptídeos podem ser obtidos, onde a imunização de um animal é necessária, pela administração dos polipeptídeos a um animal, preferivelmente um animal não humano, usando protocolos bem conhecidos e de rotina, ver por exemplo Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986). Muitos animais de sangue quente, tais como coelhos, camundongos, ratos, ovelhas, vacas ou porcos podem ser imunizados. Entretanto, camundongos, coelhos, porcos e ratos são no geral preferidos.

[0008] Os anticorpos para o uso na presente invenção incluem anticorpos inteiros e fragmentos funcionalmente ativos ou derivados destes e podem ser, mas não são limitados a, anticorpos monoclonais, multivalentes, multiespecíficos, biespecífico, humanizado ou quiméricos, anticorpos de domínio por exemplo, VH, VL, VHH, anticorpos de cadeia única, fragmentos Fv, Fab, fragmentos Fab’ e F(ab')2 e fragmentos de ligação de epítopo de qualquer um dos acima. Outros fragmentos de anticorpo incluem aqueles descritos nos pedidos de Patente Internacionais WO2005003169, WO2005003170 e WO2005003171. Outros fragmentos de anticorpo incluem os fragmentos Fab-Fv e Fab-dsFv descritos na WO2009040562 e WO2010035012 respectivamente. Os fragmentos de anticorpo e métodos de produzi-los são bem conhecidos na técnica, ver por exemplo Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181; Adair e Lawson, 2005. Therapeutic Antibodies. Drug Design Reviews - Online 2(3): 209-217.

[0009] Os anticorpos para o uso na presente invenção incluem moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm um sítio de ligação de antígeno que especificamente liga um antígeno. As moléculas de imunoglobulina da invenção podem ser de qualquer classe (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA) ou subclasse de molécula de imunoglobulina.

[0010] Os anticorpos monoclonais podem ser preparados por qualquer método conhecido na técnica tal como a técnica de hibridoma (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497), a técnica de trioma, a técnica de hibridoma de célula B humana (Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4: 72) e a técnica de hibridoma de EBV (Cole et al., Monoclonals Antibodies and Cancer Therapy, pp 77-96, Alan R Liss, Inc., 1985).

[0011] Os anticorpos para o uso na invenção também podem ser gerados usando métodos de anticorpo de linfócito único pela clonagem e expressão de cDNAs da região variável da imunoglobulina gerados a partir de linfócitos únicos selecionados para a produção de anticorpos específicos por exemplo, pelos métodos descritos por Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15): 7843-7848l; WO92/02551; WO2004/051268 e Pedido de Patente Internacional número WO2004/106377.

[0012] Anticorpos humanizados são moléculas de anticorpo de espécies não humanas tendo uma ou mais regiões determinadoras de complementaridade (CDRs) das espécies não humanas e uma região de matriz de uma molécula de imunoglobulina humana (ver, por exemplo, US 5.585.089; WO91/09967).

[0013] Os anticorpos quiméricos são aqueles anticorpos codificados pelos genes da imunoglobulina que foram geneticamente engendrados de modo que os genes das cadeias leve e pesada são compostos de segmentos de gene da imunoglobulina que pertence às espécies diferentes. Estes anticorpos quiméricos são prováveis de serem menos antigênicos.

[0014] Os anticorpos bivalentes podem ser fabricados pelos métodos conhecidos na técnica (Milstein et al., 1983, Nature 305: 537-539; WO 93/08829, Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10: 3655-3659). Os anticorpos multivalentes podem compreender especificidades múltiplas ou podem ser monoespecíficos (ver por exemplo, a WO 92/22853 e WO05/113605).

[0015] Os anticorpos para o uso na presente invenção também podem ser gerados usando vários métodos de demonstração de fago conhecidos na técnica e incluem aqueles divulgados por Brinkman et al. (em J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50), Ames et al. (J. Immunol. Methods, 1995, 184: 177-186), Kettleborough et al. (Eur. J. Immunol. 1994, 24: 952-958), Persic et al. (Gene, 1997 187 9-18), Burton et al. (Advances in Immunology, 1994, 57: 191-280) e WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; e US 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 e 5.969.108. Técnicas para a produção de anticorpos de cadeia única, tais como aquelas descritas na US 4.946.778 também podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia única que ligam IL-17A e IL-17F. Também, camundongos transgênicos, ou outros organismos, que incluem outros mamíferos, podem ser usados para expressar anticorpos humanizados.

[0016] A triagem de anticorpos pode ser realizada usando ensaios para medir a ligação à IL-17A humana e IL-17F humana, por exemplo, os ensaios BIAcore® descritos aqui nos Exemplos. Os ensaios de neutralização adequados são conhecidos na técnica, ver por exemplo, a WO2008/047134 e os Exemplos aqui.

[0017] Os resíduos em domínios variáveis de anticorpo são convencionalmente numerados de acordo com um sistema inventado por Kabat et al. Este sistema é apresentado em Kabat et al., 1987, em Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (a seguir “Kabat et al. (supra)”). Este sistema de numeração é usado no presente relatório descritivo exceto onde de outro modo indicado.

[0018] As designações de resíduo de Kabat nem sempre correspondem diretamente com a numeração linear dos resíduos de aminoácido. A sequência de aminoácido linear real pode conter menos ou mais aminoácidos do que na numeração de Kabat estrita que corresponde a um encurtamento de, ou inserção em, um componente estrutural, seja matriz ou região determinadora de complementaridade (CDR), da estrutura de domínio variável básica. A numeração de Kabat correta dos resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo pelo alinhamento de resíduos de homologia na sequência do anticorpo com uma sequência numerada de Kabat “padrão”.

[0019] As CDRs do domínio variável de cadeia pesada estão localizadas nos resíduos 31 a 35 (CDR-H1), resíduos 50 a 65 (CDR-H2) e resíduos 95 a 102 (CDR- H3) de acordo com o sistema de numeração de Kabat. Entretanto, de acordo com Chothia (Chothia, C. e Lesk, A. M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)), o equivalente de alça para CDR-H1 estende-se do resíduo 26 ao resíduo 32. Assim a ‘CDR-H1’, como aqui usada, compreende os resíduos de 26 a 35, como descritos por uma combinação do sistema de numeração de Kabat e a definição de alça topológica de Chothia.

[0020] As CDRs do domínio variável de cadeia leve são localizadas nos resíduos 24-34 (CDR-L1), resíduos 50-56 (CDR-L2) e resíduos 89-97 (CDR-L3) de acordo com o sistema de numeração de Kabat.

[0021] Em uma forma de realização a presente invenção fornece um anticorpo de neutralização tendo especificidade para IL-17A humana e IL-17F humana, que compreende uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 4 para CDR-L1, a sequência dada na SEQ ID NO: 5 para CDR-L2 e a sequência dada na SEQ ID NO: 6 para CDR-L3 (Ver a Figura 1c).

[0022] As moléculas de anticorpo da presente invenção preferivelmente compreendem uma cadeia pesada complementar.

[0023] Consequentemente, em uma forma de realização a presente invenção fornece um anticorpo de neutralização tendo especificidade para a IL-17A humana e IL-17F humana, que compreende ainda uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende pelo menos um de uma CDR tendo a sequência dada na SEQ ID NO: 1 para a CDR-H1, uma CDR tendo a sequência dada na SEQ ID NO: 2 para a CDR-H2 e uma CDR tendo a sequência dada na SEQ ID NO: 3 para a CDR-H3 (Ver a Figura 1c).

[0024] Em uma outra forma de realização a presente invenção fornece um anticorpo de neutralização tendo especificidade para a IL-17A humana e IL-17F humana, que compreende uma cadeia pesada, em que pelo menos duas de CDR- H1, CDR-H2 e CDR-H3 do domínio variável da cadeia pesada são selecionadas das que seguem: a sequência dada na SEQ ID NO: 1 para a CDR-H1, a sequência dada na SEQ ID NO: 2 para a CDR-H2 e a sequência dada na SEQ ID NO: 3 para a CDR- H3. Por exemplo, o anticorpo pode compreender uma cadeia pesada em que CDR- H1 tem a sequência dada na SEQ ID NO: 1 e CDR-H2 tem a sequência dada na SEQ ID NO: 2. Alternativamente, o anticorpo pode compreender uma cadeia pesada em que CDR-H1 tem a sequência dada na SEQ ID NO: 1 e CDR-H3 tem a sequência dada na SEQ ID NO: 3, ou o anticorpo pode compreender uma cadeia pesada em que CDR-H2 tem a sequência dada na SEQ ID NO: 2 e CDR-H3 tem a sequência dada na SEQ ID NO: 3. Para se evitar dúvidas, é entendido que todas as permutas são incluídas.

[0025] Em uma outra forma de realização a presente invenção fornece um anticorpo de neutralização tendo especificidade para a IL-17A humana e IL-17F humana, que compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 1 para a CDR-H1, a sequência dada na SEQ ID NO: 2 para a CDR-H2 e a sequência dada na SEQ ID NO: 3 para a CDR-H3.

[0026] Em uma forma de realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 1 para a CDR-H1, a sequência dada na SEQ ID NO: 2 para a CDR-H2 e a sequência dada na SEQ ID NO: 3 para a CDR-H3 e uma cadeia leve em que o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 4 para a CDR-L1, a sequência dada na SEQ ID NO: 5 para a CDR-L2 e a sequência dada na SEQ ID NO: 6 para a CDR- L3.

[0027] Em uma forma de realização o anticorpo fornecido pela presente invenção é um anticorpo monoclonal.

[0028] Em uma forma de realização o anticorpo fornecido pela presente invenção é uma molécula de anticorpo enxertada na CDR que compreende cada uma das CDRs fornecidas nas SEQ ID NOS: 1 a 6. Como aqui usado, o termo ‘molécula de anticorpo enxertada na CDR’ refere-se a uma molécula de anticorpo em que a cadeia pesada e/ou leve contêm uma ou mais CDRs (que incluem, se desejado, uma ou mais CDRs modificadas) de um anticorpo doador (por exemplo, um anticorpo monoclonal de murino) enxertadas em uma matriz de região variável de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo aceitador (por exemplo, um anticorpo humano). Para uma revisão, ver Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998. Em uma forma de realização ao invés da CDR inteira ser transferida, apenas um ou mais dos resíduos determinadores de especificidade de qualquer uma das CDRs descritas aqui acima são transferidas para a matriz de anticorpo humana (ver por exemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). Em uma forma de realização apenas os resíduos determinadores de especificidade de uma ou mais das CDRs aqui descritas acima são transferidos para a matriz de anticorpo humana. Em uma outra forma de realização apenas os resíduos determinadores de especificidade de cada uma das CDRs descritas aqui acima são transferidos para a matriz de anticorpo humana.

[0029] Quando as CDRs ou resíduos determinadores de especificidade são enxertados, qualquer sequência de matriz da região variável aceitadora apropriada pode ser usada com respeito à classe/tipo do anticorpo doador a partir do qual as CDRs são derivadas, que incluem as regiões de matriz de camundongo, primata e ser humano. Preferivelmente, o anticorpo enxertado na CDR de acordo com a presente invenção tem um domínio variável que compreende regiões de matriz aceitadoras de ser humano assim como uma ou mais das CDRs ou resíduos determinadores de especificidade descritos acima. Assim, é fornecido em uma forma de realização um anticorpo neutralizador enxertado na CDR em que o domínio variável compreende regiões de matriz aceitadoras humanas e CDRs doadoras não humanas.

[0030] Os exemplos de matrizes humanas que podem ser usadas na presente invenção são KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY e POM (Kabat et al., supra). Por exemplo, KOL e NEWM podem ser usadas para a cadeia pesada, REI pode ser usada para a cadeia leve e EU, LAY e POM podem ser usadas tanto para a cadeia pesada quanto para a cadeia leve. Alternativamente, as sequências da linha germinativa humanas podem ser usadas; estas estão disponíveis em: http: //vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/

[0031] Em um anticorpo enxertado de CDR da presente invenção, as cadeias pesadas e leve aceitadoras não necessariamente precisam ser derivadas do mesmo anticorpo e podem, se desejado, compreender cadeias compósitas tendo as regiões de matriz derivadas de cadeias diferentes.

[0032] A região de matriz preferida para a cadeia pesada do anticorpo enxertado de CDR da presente invenção é derivada da sequência VH3 subgrupo humano 1-3 3-07 junto com JH4, como anteriormente descrito na WO2008/047134. Consequentemente, é fornecido um anticorpo neutralizador enxertado de CDR que compreende pelo menos uma CDR doadora não humana em que a região de matriz de cadeia pesada é derivada da sequência de subgrupo humana 1-3 3-07 junto com JH4. A sequência de JH4 humana é como segue: (YFDY)WGQGTLVTVSS. O motivo YFDY é parte da CDR-H3 e não é parte da matriz 4 (Ravetch, J V. et al., 1981, Cell, 27, 583-591).

[0033] A região de matriz preferida para a cadeia leve do anticorpo enxertado de CDR da presente invenção é derivada da sequência VK1 do subgrupo da linha germinativa humana 2-1-(1) L4 junto com JK1, como anteriormente descrito na WO2008/047134. Consequentemente, é fornecido um anticorpo neutralizador enxertado de CDR que compreende pelo menos uma CDR doadora não humana em que a região de matriz de cadeia leve é derivada da sequência de subgrupo humana VK1 2-1-(1) L4 junto com JK1. A sequência JK1 é como segue: (WT)FGQGTKVEIK. O motivo WT é parte da CDR-L3 e não é parte da matriz 4 (Hieter, PA., et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 1516-1522).

[0034] Também, em um anticorpo enxertado de CDR da presente invenção, as regiões de matriz não precisam ter exatamente a mesma sequência como aquelas do anticorpo aceitador. Por exemplo, resíduos não usuais podem ser mudados para resíduos que ocorrem mais frequentemente para esta classe ou tipo de cadeia aceitadora. Alternativamente, os resíduos selecionados nas regiões de matriz aceitadora podem ser mudados de modo que eles correspondam ao resíduo encontrado na mesma posição no anticorpo doador (ver Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324). Tais mudanças devem ser mantidas no mínimo necessário para recuperar a afinidade do anticorpo doador. Um protocolo para selecionar resíduos nas regiões de matriz aceitadoras que podem precisar ser mudadas é apresentado na WO 91/09967.

[0035] Preferivelmente, em uma molécula de anticorpo enxertada na CDR da presente invenção, se a cadeia pesada aceitadora tem a sequência de VH3 humana 1-3 3-07 junto com JH4, então as regiões de matriz da cadeia pesada aceitadoras compreendem, além de uma ou mais CDRs doadoras, um resíduo doador pelo menos na posição 94 (de acordo com Kabat et al., (supra)). Consequentemente, é fornecido um anticorpo enxertado na CDR, em que pelo menos o resíduo na posição 94 do domínio variável da cadeia pesada é um resíduo doador.

[0036] Preferivelmente, em uma molécula de anticorpo enxertada na CDR de acordo com a presente invenção, se a cadeia leve aceitadora tem a sequência humana do subgrupo VK1 2-1-(1) L4 junto com JK1, então nenhum dos resíduos doadores são transferidos isto é, apenas as CDRs são transferidas. Consequentemente, é fornecido um anticorpo enxertado de CDR em que apenas as CDRs são transferidas para a matriz doadora.

[0037] Os resíduos doadores são resíduos do anticorpo doador, isto é, o anticorpo a partir dos quais as CDRs foram originalmente derivadas. Na presente invenção o anticorpo conhecido como CA028_0496 (anteriormente descrito na WO2008/047134) foi melhorado pela mudança cinco resíduos na cadeia leve. Três resíduos foram nas CDRs e dois na matriz. Consequentemente em uma forma de realização o domínio variável de cadeia leve compreende um resíduo de arginina na posição 30, um resíduo de serina na posição 54, um resíduo de isoleucina na posição 56, um resíduo de ácido aspártico na posição 60 e um resíduo de arginina na posição 72.

[0038] Consequentemente, em uma forma de realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 7 (gL7).

[0039] Em uma outra forma de realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 96 % de identidade com a sequência dada na SEQ ID NO: 7. Em uma forma de realização o anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 97, 98 ou 99 % de identidade com a sequência dada na SEQ ID NO: 7.

[0040] Em uma forma de realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 9 (gH9).

[0041] Em uma outra forma de realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 60 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 9. Em uma forma de realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96, 97, 98 ou 99 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 9.

[0042] Em uma forma de realização um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 7.

[0043] Em uma outra forma de realização da invenção, o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 60 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 9 e o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 96 % de identidade com a sequência dada na SEQ ID NO: 7. Preferivelmente, o anticorpo compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 ou 99 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 96, 97, 98 ou 99 % de identidade com a sequência dada na SEQ ID NO: 7.

[0044] “Identidade”, como aqui usado, indica que em qualquer posição particular nas sequências alinhadas, o resíduo de aminoácido é idêntico entre as sequências. “Similaridade”, como aqui usado, indica que, em qualquer posição particular nas sequências alinhadas, o resíduo de aminoácido é de um tipo similar entre as sequências. Por exemplo, leucina pode ser substituído no lugar de isoleucina ou valina. Outros aminoácidos que podem ser frequentemente substituídos no lugar de um outro incluem mas não são limitados a: - fenilalanina, tirosina e triptofano (aminoácidos tendo cadeias laterais aromáticas); - lisina, arginina e histidina (aminoácidos tendo cadeias laterais básicas); - aspartato e glutamato (aminoácidos tendo cadeias laterais ácidas); - asparagina e glutamina (aminoácidos tendo cadeias laterais de amida); e - cisteína e metionina (aminoácidos tendo cadeias laterais que contêm enxofre). Os graus de identidade e similaridade podem ser facilmente calculados (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nova Iorque, 1988; Biocomputing, Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nova Iorque, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A. M., e Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nova Iorque, 1991).

[0045] A molécula de anticorpo da presente invenção pode compreender uma molécula de anticorpo completa tendo cadeias pesadas e leves de tamanho natural ou um fragmento destas, tal como um anticorpo de domínio por exemplo, fragmento VH, VL, VHH, Fab, Fab modificado, Fab’, F(ab’)2, Fv ou scFv. Outros fragmentos de anticorpo incluem os fragmentos Fab-Fv e Fab-dsFv descritos na WO2009040562 e WO2010035012 respectivamente. Em uma forma de realização o fragmento de anticorpo da presente invenção é selecionado do grupo que consiste de um fragmento Fab, Fab’, F(ab’)2, scFv e Fv.

[0046] Será avaliado que os anticorpos da presente invenção, em particular os fragmentos de anticorpo descritos acima, podem ser incorporados em outros formatos de anticorpo, em particular, anticorpos multiespecíficos, tais como anticorpos bi ou tri específicos, onde uma especificidade é fornecida por um anticorpo da presente invenção isto é especificidade para IL-17A e IL-17F (que incluem o heterodímero IL-17A/F). Consequentemente, em uma forma de realização a presente invenção fornece um anticorpo multiespecífico que compreende um ou mais dos fragmentos de anticorpo descritos aqui acima.

[0047] Os exemplos de anticorpos multiespecíficos incluem os anticorpos bi, tri ou tetra-valente, Bis-scFv, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, bicorpos e tricorpos (ver por exemplo, Holliger e Hudson, 2005, Nature Biotech 23(9): 1126-1136; Schoonjans et al., 2001, Biomolecular Engineering, 17 (6), 193-202). Outros anticorpos multiespecíficos incluem fragmentos Fab-Fv, Fab-dsFv, Fab-Fv-Fv. Fab-Fv-Fc e Fab-dsFv-PEG descritos na WO2009040562, WO2010035012, WO2011/08609, WO2011/030107 e WO2011/061492 respectivamente.

[0048] Os domínios da região constante da molécula de anticorpo da presente invenção, se presentes, podem ser selecionados tendo consideração com a função proposta da molécula de anticorpo, e em particular as funções efetoras que podem ser requeridas. Por exemplo, os domínios da região constante podem ser os domínios IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM humanos. Em particular, os domínios da região constante de IgG humana podem ser usados, especialmente dos isótipos IgG1 e IgG3 quando a molécula de anticorpo é intencionada para usos terapêuticos e funções efetoras de anticorpo são requeridas. Alternativamente, os isótipos IgG2 e IgG4 podem ser usados quando a molécula de anticorpo é pretendida para propósitos terapêuticos e funções efetoras de anticorpo não são requeridas, por exemplo, para simplesmente bloquear a atividade de IL-17. Será avaliado que variantes de sequência destes domínios de região constante também podem ser usadas. Por exemplo, moléculas de IgG4 em que a serina na posição 241 foi mudada para prolina como descrito em Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108 podem ser usadas. É particularmente preferido o domínio constante de IgG1. Também será entendido por uma pessoa habilitada na técnica que os anticorpos podem passar por uma variedade de modificações pós translacionais. O tipo e grau destas modificações frequentemente dependem da linhagem de célula hospedeira usada para expressar o anticorpo assim como das condições de cultura. Tais modificações podem incluir variações na glicosilação, oxidação de metionina, formação de dicetopiperazina, isomerização de aspartato e desamidação de asparagina. Uma modificação frequente é a perda de um resíduo básico de terminal carbóxi (tal como lisina ou arginina) devido à ação de carboxipeptidases (como descrito em Harris, RJ. Journal of Chromatography 705: 129-134, 1995). Consequentemente, a lisina de terminal C da cadeia pesada de anticorpo, por exemplo, como dada na Figura 2 (a), SEQ ID NO: 15, pode estar ausente

[0049] Em uma forma de realização a cadeia pesada de anticorpo compreende um domínio CH1 e a cadeia leve do anticorpo compreende um domínio CL, capa ou lambda.

[0050] Em uma forma de realização preferida o anticorpo fornecido pela presente invenção é um anticorpo de neutralização tendo especificidade para a IL-17A humana e IL-17F humana em que a região constante de cadeia pesada compreende a região constante de IgG1 humana. Consequentemente, a presente invenção fornece um anticorpo em que a cadeia pesada compreende ou consiste da sequência dada na SEQ ID NO: 15 (Ver a figura 2a).

[0051] Em uma forma de realização da invenção, o anticorpo compreende uma cadeia pesada, em que a cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 60 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 15. Preferivelmente, o anticorpo compreende uma cadeia pesada, em que a cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 15

[0052] Em uma forma de realização uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção compreende uma cadeia leve que compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 11 (Ver a Figura 1d).

[0053] Em uma forma de realização da invenção, o anticorpo compreende uma cadeia leve, em que a cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 60 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 11. Preferivelmente, o anticorpo compreende uma cadeia leve, em que a cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 11.

[0054] Em uma forma de realização a presente invenção fornece um anticorpo em que a cadeia pesada compreende ou consiste da sequência dada na SEQ ID NO: 15 e a cadeia leve compreende ou consiste da sequência dada na SEQ ID NO: 11.

[0055] Em uma forma de realização da invenção, o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 60 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 15 e a cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 60 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 11. Preferivelmente, o anticorpo compreende uma cadeia pesada, em que a cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 15 e uma cadeia leve, em que a cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou 98 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 11.

[0056] A molécula de anticorpo de qualquer aspecto da presente invenção preferivelmente tem uma alta afinidade de ligação, preferivelmente picomolar. Será avaliado que a afinidade de ligação de um anticorpo de acordo com a presente invenção para a IL-17A humana pode ser diferente da afinidade de ligação do mesmo anticorpo para IL-17F humana e/ou o heterodímero IL-17A/F. Em um exemplo a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade para IL- 17A que é maior do que a sua afinidade para IL-17F. Em um exemplo a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade para IL-17A que é pelo menos 5 vezes maior do que a sua afinidade de ligação para IL-17F. Em um exemplo a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade para IL-17A que é a mesma como a sua afinidade para IL-17F. Em um exemplo a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade picomolar tanto para IL-17A quanto para IL- 17F.

[0057] A afinidade pode ser medida usando qualquer método adequado conhecido na técnica, que inclui BIAcore®, como descrito nos Exemplos aqui, usando IL-17A e IL-17F naturais ou recombinantes isolados ambos dos quais existem como homodímeros.

[0058] Preferivelmente a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade de ligação para IL-17A de 50 pM ou menos. Em uma forma de realização a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade de ligação para IL- 17A de 20 pM ou menos. Em uma forma de realização a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade de ligação para IL-17A de 10 pM ou menos. Em uma forma de realização a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade de ligação para IL-17A de 5 pM ou menos. Em uma forma de realização o anticorpo da presente invenção tem uma afinidade para IL-17A de 3,2 pM.

[0059] Preferivelmente a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade de ligação para IL-17F de 100 pM ou menos. Em uma forma de realização o anticorpo da presente invenção tem uma afinidade para IL-17F de 50 pM ou menos. Em uma forma de realização o anticorpo da presente invenção tem uma afinidade para IL-17F de 23 pM.

[0060] Será avaliado que a afinidade dos anticorpos fornecidos pela presente invenção pod ser alterada usando qualquer método adequado conhecido na técnica. A presente invenção portanto também diz respeito às variantes das moléculas de anticorpo da presente invenção, que têm uma afinidade melhorada para IL-17A e/ou IL-17F. Tais variantes podem ser obtidas pelos vários protocolos de maturação por afinidade que incluem mutar as CDRs (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), embaralhar as cadeias (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), o uso de cepas mutadoras da E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), embaralhamento de DNA (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), demonstração de fago (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) e PCR sexual (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan et al. (supra) debate estes métodos de maturação por afinidade.

[0061] Se desejado um anticorpo para o uso na presente invenção pode ser conjugado a uma ou mais molécula(s) efetora(s). Será avaliado que a molécula efetora pode compreender uma molécula efetora única ou duas ou mais de tais moléculas assim ligadas como para formar uma porção única que pode ser ligada aos anticorpos da presente invenção. Onde é desejado obter um fragmento de anticorpo ligado a uma molécula efetora, isto pode ser preparado pelos procedimentos químicos padrão ou de DNA recombinante em que o fragmento de anticorpo é ligado diretamente ou via um agente de ligação à molécula efetora. As técnicas para conjugar tais molécula efetoras aos anticorpos são bem conhecidas no ramo (ver, Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2a Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982 , Immunol. Rev., 62: 119-58 e Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). Os procedimentos químicos particulares incluem, por exemplo, aqueles descritos na WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 e WO03031581. Alternativamente, onde a molécula efetora é uma proteína ou polipeptídeo a ligação pode ser obtida usando procedimentos de DNA recombinante, por exemplo, como descrito na WO 86/01533 e EP0392745.

[0062] O termo molécula efetora como aqui usado inclui, por exemplo, agentes antineoplásticos, medicamentos, toxinas, proteínas biologicamente ativas, por exemplo, enzimas, outro anticorpo ou fragmentos de anticorpo, polímeros sintéticos ou que ocorrem naturalmente, ácidos nucléicos e fragmentos destes por exemplo, DNA, RNA e fragmentos destes, radionuclídeos, particularmente radioiodeto, radioisótopos, metais quelados, nanopartículas e grupos repórter tais como compostos fluorescentes ou compostos que podem ser detectados pela espectroscopia de RMN ou ESR.

[0063] Os exemplos de moléculas efetoras podem incluir citotoxinas ou agentes citotóxicos que incluem qualquer agente que seja nocivo para (por exemplo, matar) as células. Os exemplos incluem combrestatinas, dolastatinas, epotilonas, estaurosporina, maitansinóides, espongistatinas, rizoxina, halicondrinas, roridinas, hemiasterlinas, taxol, citochalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, diidróxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glicocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, e puromicina e análogos ou homólogos destes.

[0064] As molécula efetoras também incluem, mas não são limitados a, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercapto-purina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil descarbazina), agentes alquilantes (por exemplo, mecloretamina, tioepa clorambucila, melfalan, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (antigamente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (antigamente actinomicina), bleomicina, mitramicina, antramicina (AMC), caliqueamicinas ou duocarmicinas), e agentes anti-mitótico (por exemplo, vincristina e vinblastina).

[0065] Outras moléculas efetoras podem incluir radionuclídeos quelados tais como 111In e 90Y, Lu177, Bismuto213, Califórnio252, Irídio192 e Tungstênio188/Rênio188; ou medicamentos tais como, mas não limitados a, alquilfosfocolinas, inibidores da topoisomerase I, taxóides e suramin.

[0066] Outras moléculas efetoras incluem proteínas, peptídeos e enzimas. As enzimas de interesse incluem, mas não são limitadas a, enzimas proteolíticas, hidrolases, liases, isomerases, transferases. Proteínas, polipeptídeos e peptídeos de interesse incluem, mas não são limitados a, imunoglobulinas, toxinas tais como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, ou toxina da difteria, uma proteína tal como insulina, fator de necrose de tumor, interferon α, interferon β, fator de crescimento de nervo, fator de crescimento derivado de plaqueta ou ativador de plasminogênio, um agente trombótico ou um agente antiangiogênico, por exemplo, angiostatina ou endostatina, ou, um modificador de resposta biológica tal como uma linfocina, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6), fator estimulador de colônia de granulócito macrófago (GM-CSF), fator estimulador de colônia de granulócito (G-CSF), fator de crescimento de nervo (NGF) ou outro fator de crescimento e imunoglobulinas.

[0067] Outras moléculas efetoras podem incluir substâncias detectáveis úteis por exemplo, em diagnóstico. Os exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos protéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, nuclídeos radioativos, metais que emitem pósitron (para o uso na tomografia de emissão de pósitron), e íons metálicos paramagnéticos não radioativos. Ver no geral Patente U.S. No. 4.741.900 para íons metálicos que podem ser conjugados aos anticorpos para o uso como diagnósticos. As enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, ou acetilcolinesterase; os grupos protéticos adequados incluem estreptavidina, avidina e biotina; os materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila e ficoeritrina; os materiais luminescentes adequados incluem luminol; os materiais bioluminescentes adequados incluem luciferase, luciferina, e aequorina; e os nuclídeos radioativos adequados incluem 125I, 131I, 111In e 99Tc.

[0068] Em um outro exemplo a molécula efetora pode aumentar a meia-vida do anticorpo in vivo, e/ou reduzir a imunogenicidade do anticorpo e/ou realçar a liberação de um anticorpo através de uma barreira epitelial ao sistema imune. Os exemplos de moléculas efetoras adequadas deste tipo incluem polímeros, albumina, proteínas de ligação de albumina ou compostos de ligação de albumina tais como aqueles descritos na WO05/117984.

[0069] Onde a molécula efetora é um polímero a mesma, no geral, pode ser um polímero sintético ou um que ocorra naturalmente, por exemplo, um polímero de polialquileno, polialquenileno ou polioxialquileno de cadeia reta ou ramificada opcionalmente substituído ou um polissacarídeo ramificado ou não ramificado, por exemplo, um homo- ou hetero- polissacarídeo.

[0070] Os substituintes opcionais particulares que podem estar presentes nos polímeros sintéticos mencionados acima incluem um ou mais grupos hidróxi, metila ou metóxi.

[0071] Os exemplos particulares de polímeros sintéticos incluem poli(etileno glicol), poli(propileno glicol) poli(álcool vinílico) ou derivados destes de cadeia reta ou ramificada opcionalmente substituídos, de modo especial poli(etileno glicol) opcionalmente substituído tal como metoxipoli(etileno glicol) ou derivados destes.

[0072] Os polímeros que ocorrem naturalmente particulares incluem lactose, amilose, dextrano, glicogênio ou derivados destes.

[0073] “Derivados” como aqui usado é intencionado a incluir derivados reativos, por exemplo, grupos reativos seletivos em tiol tais como maleimidas e os semelhantes. O grupo reativo pode ser ligado diretamente ou através de um segmento ligador ao polímero. Será avaliado que o resíduo de um tal grupo em alguns casos formará parte do produto como o grupo de ligação entre o fragmento de anticorpo e o polímero.

[0074] O tamanho do polímero pode ser variado como desejado, mas no geral estará em uma faixa de peso molecular médio de 500 Da a 50000 Da, preferivelmente de 5000 a 40000 Da e mais preferivelmente de 20000 a 40000 Da. O tamanho do polímero em particular pode ser selecionado com base no use pretendido do produto por exemplo, capacidade para localizar a certos tecidos tais como tumores ou prolongar a meia-vida em circulação (para revisão ver Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). Assim, por exemplo, quando o produto é intencionado a deixar a circulação e penetrar no tecido, por exemplo, para o uso no tratamento de um tumor, pode ser vantajoso usar um polímero de peso molecular pequeno, por exemplo, com um peso molecular em torno de 5000 Da. Para aplicações onde o produto permanece na circulação, pode ser vantajoso usar um polímero de peso molecular mais alto, por exemplo, tendo um peso molecular na faixa de 20000 Da a 40000 Da.

[0075] Os polímeros particularmente preferidos incluem um polímero de polialquileno, tal como um poli(etileno glicol) ou, especialmente, um metoxipoli(etileno glicol) ou um derivado destes, e especialmente com um peso molecular na faixa de cerca de 15000 Da a cerca de 40000 Da.

[0076] Em um exemplo anticorpos para o uso na presente invenção são ligados às porções de poli(etileno glicol) (PEG). Em um exemplo particular o anticorpo é um fragmento de anticorpo e as moléculas de PEG podem ser ligadas através de qualquer cadeia lateral de aminoácido disponível ou grupo funcional de aminoácido terminal localizado no fragmento de anticorpo, por exemplo, qualquer grupo amino livre, imino, tiol, hidroxila ou carboxila. Tais aminoácidos podem ocorrer naturalmente no fragmento de anticorpo ou podem ser engendrados no fragmento usando métodos de DNA recombinante (ver por exemplo, US 5.219.996, US 5.667.425, WO98/25971). Em um exemplo a molécula de anticorpo da presente invenção é um fragmento Fab modificado em que a modificação é a adição à extremidade de terminal C da sua cadeia pesada de um ou mais aminoácidos para permitir a ligação de uma molécula efetora. Preferivelmente, os aminoácidos adicionais formam uma região de dobradiça modificada que contém um ou mais resíduos de cisteína aos quais a molécula efetora pode ser ligada. Os sítios múltiplos podem ser usados para ligar duas ou mais moléculas de PEG.

[0077] Preferivelmente as moléculas de PEG são covalentemente ligadas através de um grupo tiol de pelo menos um resíduo de cisteína localizada no fragmento de anticorpo. Cada molécula de polímero ligada ao fragmento de anticorpo modificado pode ser covalentemente ligada ao átomo de enxofre de um resíduo de cisteína localizado no fragmento. A ligação covalente no geral será uma ligação de dissulfeto ou, em particular, uma ligação de enxofre-carbono. Onde um grupo tiol é usado como o ponto de ligação moléculas efetoras apropriadamente ativadas, por exemplo, derivados seletivos em tiol tais como derivados de maleimidas e cisteína podem ser usados. Um polímero ativado pode ser usado como o material de partida na preparação de fragmentos de anticorpo modificados com polímero como descrito acima. O polímero ativado pode ser qualquer polímero que contenha um grupo reativo de tiol tal como um ácido ou éster a-halocarboxílicos, por exemplo, iodoacetamida, uma imida, por exemplo, maleimida, um vinil sulfona ou um dissulfeto. Tais materiais de partida podem ser comercialmente obtidos (por exemplo, da Nektar, antigamente Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) ou podem ser preparados a partir de materiais de partida comercialmente disponíveis usando procedimentos químicos convencionais. As moléculas de PEG particulares incluem 20K metóxi-PEG-amina (obtenível da Nektar, antigamente Shearwater; Rapp Polymer; e SunBio) e M-PEG-SPA (obtenível da Nektar, antigamente Shearwater).

[0078] Em uma forma de realização, o anticorpo é um fragmento Fab modificado que é PEGuilado, isto é, tem PEG (poli(etileno glicol)) covalentemente ligado a ele, por exemplo, de acordo com o método divulgado na EP 0948544 [ver também “Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications”, 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, Nova Iorque, “Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications”, 1997, J. Milton Harris e S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC e “Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences”, 1998, M. Aslam e A. Dent, Grove Publishers, Nova Iorque; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54: 531-545]. Em um exemplo PEG é ligado a uma cisteína na região de dobradiça. Em um exemplo, um fragmento Fab modificado com PEG tem um grupo maleimida covalentemente ligado a um único grupo tiol em uma região de dobradiça modificada. Um resíduo de lisina pode ser covalentemente ligado ao grupo maleimida e a cada um dos grupos amina no resíduo de lisina pode ser ligado um polímero de metoxipoli(etileno glicol) tendo um peso molecular de aproximadamente 20.000 Da. O peso molecular total do PEG ligado ao fragmento Fab portanto pode ser de aproximadamente 40.000 Da.

[0079] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece uma molécula de anticorpo de neutralização tendo especificidade para a IL-17A humana e IL-17F humana, que é um fragmento Fab modificado tendo uma cadeia pesada que compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve que compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 7 e tendo na extremidade de terminal C da sua cadeia pesada uma região de dobradiça modificada contendo pelo menos um resíduo de cisteína ao qual uma molécula efetora é ligada. Preferivelmente a molécula efetora é PEG e é ligada usando os métodos descritos na (WO98/25971 e WO2004072116) por meio da qual um grupo lisil maleimida é ligado ao resíduo de cisteína na extremidade de terminal C da cadeia pesada, e cada grupo amino do resíduo de lisina tem covalentemente ligado a ele um resíduo de metoxipoli(etileno glicol) tendo um peso molecular de cerca de 20.000 Da. O peso molecular total do PEG ligado ao anticorpo é portanto de aproximadamente 40.000 Da.

[0080] Em um outro exemplo as moléculas efetoras podem ser ligadas aos fragmentos de anticorpo usando os métodos descritos nos Pedidos de Patente Internacional WO2005/003169, WO2005/003170 e WO2005/003171.

[0081] A presente invenção também fornece uma sequência de DNA isolada que codifica a(s) cadeia(s) pesada(s) e/ou leve(s) de uma molécula de anticorpo da presente invenção. Preferivelmente, a sequência de DNA codifica a cadeia pesada ou a leve de uma molécula de anticorpo da presente invenção. A sequência de DNA da presente invenção pode compreender DNA sintético, por exemplo produzido pelo processamento químico, cDNA, DNA genômico ou qualquer combinação destes.

[0082] As sequências de DNA que codificam uma molécula de anticorpo da presente invenção podem ser obtidas pelos métodos bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, as sequências de DNA que codificam parte ou todas das cadeias pesadas e leves de anticorpo podem ser sintetizadas como desejado a partir de sequências de DNA determinadas ou com base nas sequências de aminoácido correspondentes.

[0083] O DNA que codifica as sequências de matriz aceitadora é amplamente disponível a aqueles habilitados na técnica e pode ser facilmente sintetizado com base nas suas sequências de aminoácido conhecidas.

[0084] As técnicas padrão da biologia molecular podem ser usadas para preparar sequências de DNA que codificam a molécula de anticorpo da presente invenção. As sequências de DNA desejadas podem ser sintetizadas completamente ou em parte usando técnicas de síntese de oligonucleotídeo. As técnicas de mutagênse direcionada ao sítio e reação da cadeia da polimerase (PCR) podem ser usadas como apropriado.

[0085] Os exemplos de sequências adequadas são fornecidos na SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19.

[0086] A presente invenção também diz respeito a um vetor de clonagem ou expressão que compreende uma ou mais sequências de DNA da presente invenção. Consequentemente, é fornecido um vetor de clonagem ou expressão que compreende uma ou mais sequências de DNA que codifica um anticorpo da presente invenção. Preferivelmente, o vetor de clonagem ou expressão compreende duas sequências de DNA, que codifica a cadeia leve e a cadeia pesada da molécula de anticorpo da presente invenção, respectivamente junto com as sequências de sinal adequadas. Preferivelmente, um vetor de acordo com a presente invenção compreende as sequências dadas na SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 18. Em uma forma de realização um vetor de acordo com a presente invenção compreende as sequências dadas na SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 17.

[0087] Os métodos gerais pelos quais os vetores podem ser construídos, métodos de transfecção e métodos de cultura são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Neste aspecto, referência é feita a “Current Protocols in Molecular Biology”, 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, Nova Iorque e o Maniatis Manual produzido pela Cold Spring Harbor Publishing.

[0088] Também é fornecida uma célula hospedeira que compreende um ou mais vetores de clonagem ou expressão que compreende uma ou mais sequências de DNA que codifica um anticorpo da presente invenção. Qualquer sistema de célula hospedeira/vetor adequado pode ser usado para a expressão das sequências de DNA que codifica a molécula de anticorpo da presente invenção. Bacteriano, por exemplo, E. coli, e outros sistemas microbianos podem ser usados ou eucariótico, por exemplo, mamífero, sistemas de expressão de célula hospedeira também podem ser usados. As células hospedeiras mamíferas adequadas incluem células CHO, mieloma ou hibridoma.

[0089] A presente invenção também fornece um processo para a produção de uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção que compreende cultivar uma célula hospedeira que contém um vetor da presente invenção sob condições adequadas para levar à expressão da proteína de DNA que codifica a molécula de anticorpo da presente invenção, e isolar a molécula de anticorpo.

[0090] A molécula de anticorpo pode compreender apenas um polipeptídeo de cadeia pesada ou leve, caso este em que apenas uma sequência que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada ou cadeia leve necessita ser usada para transfectar as células hospedeiras. Para a produção de produtos que compreendem cadeias tanto pesadas quanto leves, a linhagem de célula pode ser transfectada com dois vetores, um primeiro vetor codificando um polipeptídeo de cadeia leve e um segundo vetor codificando um polipeptídeo de cadeia pesada. Alternativamente, um único vetor pode ser usado, o vetor incluindo sequências que codificam polipeptídeos de cadeia leve e cadeia pesada.

[0091] Como os anticorpos da presente invenção são úteis no tratamento e/ou profilaxia de uma condição patológica, a presente invenção também fornece uma composição farmacêutica ou de diagnóstico que compreende uma molécula de anticorpo da presente invenção em combinação com um ou mais de um excipiente, diluente ou carregador farmaceuticamente aceitável. Consequentemente, é fornecido o uso de um anticorpo de acordo com a presente invenção para a fabricação de um medicamento. A composição usualmente será fornecida como parte de uma composição estéril, farmacêutica que normalmente incluirá um carregador farmaceuticamente aceitável. Uma composição farmacêutica da presente invenção pode adicionalmente compreender um adjuvante farmaceuticamente aceitável.

[0092] A presente invenção também fornece um processo para a preparação de uma composição farmacêutica ou de diagnóstico que compreende adicionar e misturar a molécula de anticorpo da presente invenção junto com um ou mais de um excipiente, diluente ou carregador farmaceuticamente aceitáveis.

[0093] A molécula de anticorpo pode ser o único ingrediente ativo na composição farmacêutica ou de diagnóstico ou pode ser acompanhada por outros ingredientes ativos que incluem outros ingredientes de anticorpo, por exemplo, anticorpos anti- TNF, anti-IL-1 β, anti-célula T, anti-IFNY ou anti-LPS, ou ingredientes que não de anticorpo tais como xantinas ou um inibidor de molécula pequena.

[0094] As composições farmacêuticas preferivelmente compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo da invenção. O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” como aqui usado refere-se a uma quantidade de um agente terapêutico necessária para tratar, melhorar ou prevenir uma doença ou condição alvejadas, ou exibir um efeito terapêutico ou preventivo detectáveis. Para qualquer anticorpo, a quantidade terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente em ensaios de cultura de célula ou em modelos de animal, usualmente em roedores, coelhos, cães, porcos ou primatas. O modelo de animal também pode ser usado para determinar a faixa de concentração apropriada e a via de administração. Tal informação pode ser depois usada para determinar doses úteis e vias para a administração em seres humanos.

[0095] A quantidade terapeuticamente eficaz precisa para um indivíduo humano dependerá da severidade do estado de doença, da saúde geral do indivíduo, da idade, peso e gênero do indivíduo, dieta, tempo e frequência de administração, combinação(ões) de medicamento, sensibilidades de reação e tolerância/resposta à terapia. Esta quantidade pode ser determinada pela experimentação de rotina e está dentro do julgamento do médico. No geral, uma quantidade terapeuticamente eficaz será de 0,01 mg/kg a 50 mg/kg, preferivelmente de 0,1 mg/kg a 20 mg/kg. As composições farmacêuticas podem ser convenientemente apresentadas em formas de dose unitária contendo uma quantidade predeterminada de um agente ativo da invenção por dose.

[0096] As composições podem ser administradas individualmente a um paciente ou pode ser administrada em combinação (por exemplo, simultânea, sequencial ou separadamente) com outros agentes, medicamentos ou hormônios.

[0097] A dose na qual a molécula de anticorpo da presente invenção é administrada depende da natureza da condição a ser tratada, do grau da inflamação presente e se a molécula de anticorpo está sendo usada profilaticamente ou para tratar uma condição existente.

[0098] A frequência de dose dependerá da meia-vida da molécula de anticorpo e da duração do seu efeito. Se a molécula de anticorpo tem uma meia-vida curta (por exemplo, de 2 a 10 horas) pode ser necessário dar uma ou mais doses ao dia. Alternativamente, se a molécula de anticorpo tem uma meia vida longa (por exemplo, de 2 a 15 dias) pode ser necessário dar apenas uma dosagem uma vez ao dia, uma vez por semana ou mesmo uma vez a cada 1 ou 2 meses.

[0099] O carregador farmaceuticamente aceitável por si só não deve induzir a produção de anticorpos nocivos para o indivíduo que recebe a composição e não deve ser tóxico. Os carregadores adequados podem ser macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas tais como proteínas, polipeptídeos, lipossomas, polissacarídeos, ácidos polilácticos, ácidos poli glicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido e partículas virais inativas.

[00100] Os sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser usados, por exemplo, sais de ácido mineral, tais como cloridretos, bromidretos, fosfatos e sulfatos, ou sais de ácidos orgânicos, tais como acetatos, propionatos, malonatos e benzoatos.

[00101] Os carregadores farmaceuticamente aceitáveis em composições terapêuticas podem adicionalmente conter líquidos tais como água, solução salina, glicerol e etanol. Adicionalmente, substâncias auxiliares, tais como agentes de umectação ou emulsificantes ou substâncias de tamponização de pH, podem estar presentes em tais composições. Tais carregadores possibilitam que as composições farmacêuticas sejam formuladas como tabletes, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas fluidas e suspensões, para a ingestão pelo paciente.

[00102] As formas preferidas para a administração incluem formas adequadas para a administração parenteral, por exemplo, pela injeção ou infusão, por exemplo, pela injeção de bolo ou infusão contínua. Onde o produto é para injeção ou infusão, o mesmo pode tomar a forma de uma suspensão, solução ou emulsão em um veículo oleoso ou aquoso e o mesmo pode conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, preservantes, estabilizantes e/ou dispersantes. Alternativamente, a molécula de anticorpo pode estar na forma seca, para reconstituição antes do uso com um líquido estéril apropriado.

[00103] Uma vez formuladas, as composições da invenção podem ser administradas diretamente ao indivíduo. Os indivíduos a serem tratados podem ser animais. Entretanto, é preferido que as composições sejam adaptadas para a administração aos indivíduos humanos.

[00104] As composições farmacêuticas desta invenção podem ser administradas por qualquer número de vias que incluem, mas não limitadas às vias oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutânea (por exemplo, ver a WO 98/20734), subcutânea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual, intravaginal ou retal. Hipopulverizações também podem ser usadas para administrar as composições farmacêuticas da invenção. Tipicamente, as composições terapêuticas podem ser preparadas como injetáveis, como soluções ou suspensões líquidas. As formas sólidas adequadas para solução em, ou suspensão em veículos líquidos antes da injeção também podem ser preparadas.

[00105] A liberação direta das composições no geral será realizada pela injeção, subcutânea, intraperitoneal, intravenosa ou intramuscularmente, ou liberadas ao espaço intersticial de um tecido. As composições também podem ser administradas dentro de uma lesão. O tratamento de dosagem pode ser um programa de dose única ou um programa de dose múltipla.

[00106] Será avaliado que o ingrediente ativo na composição será uma molécula de anticorpo. Como tal, o mesmo será suscetível à degradação no trato gastrointestinal. Assim, se a composição deva ser administrada por uma via usando o trato gastrointestinal, a composição necessitará conter agentes que protejam o anticorpo da degradação, mas que liberem o anticorpo uma vez que o mesmo tenha sido absorvido a partir do trato gastrointestinal.

[00107] Um debate completo de carregadores farmaceuticamente aceitáveis está disponível em Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).

[00108] Em uma forma de realização a formulação é fornecida como uma formulação para as administrações tópicas que incluem inalação.

[00109] As preparações inaláveis adequadas incluem pós inaláveis, aerossóis de medição que contêm gases propelentes ou soluções inaláveis livres de gases propelentes. Pós inaláveis de acordo com a divulgação que contêm a substância ativa podem consistir unicamente das substâncias ativas mencionadas acima ou de uma mistura das substâncias ativas mencionadas acima com excipiente fisiologicamente aceitável.

[00110] Estes pós inaláveis podem incluir monossacarídeos (por exemplo, glicose ou arabinose), dissacarídeos (por exemplo, lactose, sacarose, maltose), oligo- e polissacarídeos (por exemplo, dextranos), poliálcoois (por exemplo, sorbitol, manitol, xilitol), sais (por exemplo, cloreto de sódio, carbonato de cálcio) ou misturas destes entre si. Os mono- ou dissacarídeos são adequadamente usados, o uso de lactose ou glicose, particularmente mas não exclusivamente na forma de seus hidratos.

[00111] As partículas para deposição no pulmão requerem um tamanho de partícula menor do que 10 mícrons, tal como de 1 a 9 mícrons por exemplo, de 0,1 a 5 μm, em particular de 1 a 5 μm. O tamanho de partícula do ingrediente ativo (tal como o anticorpo ou fragmento) é de importância primária.

[00112] Os gases propelentes que podem ser usados para preparar os aerossóis inaláveis são conhecidos na técnica. Os gases propelentes adequados são selecionados dentre os hidrocarbonetos tais como n-propano, n-butano ou isobutano e haloidrocarbonetos tais como derivados clorados e/ou fluorados de metano, etano, propano, butano, ciclopropano ou ciclobutano. Os gases propelentes mencionados acima podem ser usados por si só ou em misturas destes.

[00113] Os gases propelentes particularmente adequados são derivados de alcano selecionados dentre TG 11, TG 12, TG 134a e TG227. Dos hidrocarbonetos halogenados mencionados acima, TG134a (1,1,1,2-tetrafluoroetano) e TG227 (1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano) e misturas destes são particularmente adequados.

[00114] Os aerossóis inaláveis que contêm gás propelente também podem conter outros ingredientes tais como co-solventes, estabilizantes, agentes ativos na superfície (tensoativos), antioxidantes, lubrificantes e meios para ajustar o pH. Todos estes ingredientes são conhecidos na técnica.

[00115] Os aerossóis inaláveis que contêm o gás propelente de acordo com a invenção podem conter até 5 % em peso de substância ativa. Os aerossóis de acordo com a invenção contêm, por exemplo, de 0,002 a 5 % em peso, de 0,01 a 3 % em peso, de 0,015 a 2 % em peso, de 0,1 a 2 % em peso, de 0,5 a 2 % em peso ou de 0,5 a 1 % em peso de ingrediente ativo.

[00116] Alternativamente as administrações tópicas ao pulmão também podem ser pela administração de uma formulação de solução ou suspensão líquidas, por exemplo, utilizando um dispositivo tal como um nebulizador, por exemplo, um nebulizador conectado a um compressor (por exemplo, o nebulizador Pari LC-Jet Plus(R) conectado a um compressor Pari Master(R) fabricados pela Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.).

[00117] O anticorpo da invenção pode ser liberado disperso em um solvente, por exemplo, na forma de uma solução ou uma suspensão. O mesmo pode ser colocado em suspensão em uma solução fisiológica apropriada, por exemplo, solução salina ou outro solvente farmacologicamente aceitável ou uma solução tamponada. As soluções tamponadas conhecidas na técnica podem conter 0,05 mg a 0,15 mg de edetato de dissódio, de 8,0 mg a 9,0 mg de NaCl, de 0,15 mg a 0,25 mg de polissorbato, de 0,25 mg a 0,30 mg de ácido cítrico anidro, e de 0,45 mg a 0,55 mg de citrato de sódio por 1 ml de água de modo a obter um pH de cerca de 4,0 a 5,0. Uma suspensão pode utilizar, por exemplo, anticorpo liofilizado.

[00118] As formulações de suspensões ou solução terapêuticas podem conter também um ou mais excipientes. Os excipientes são bem conhecidos na técnica e incluem tampões (por exemplo, tampão de citrato, tampão de fosfato, tampão de acetato e tampão de bicarbonato), aminoácidos, uréia, álcoois, ácido ascórbico, fosfolipídeos, proteínas (por exemplo, albumina sérica), EDTA, cloreto de sódio, lipossomas, manitol, sorbitol e glicerol. As soluções ou suspensões podem ser encapsuladas em lipossomas ou microesferas biodegradáveis. A formulação no geral será fornecida em uma forma substancialmente estéril utilizando processos de fabricação estéreis.

[00119] Isto pode incluir a produção e esterilização pela filtração do solvente/solução tamponada usados para a formulação, suspensão asséptica do anticorpo na solução de solvente tamponado estéril, e dispensa da formulação em receptáculos estéreis pelos métodos familiares a aqueles de habilidade comum na técnica.

[00120] A formulação nebulizável de acordo com a presente divulgação pode ser fornecida, por exemplo, como unidades de dose única (por exemplo, recipientes ou frascos plásticos selados) embalados em envelopes de folha metálica. Cada frasco contém uma dose unitária em um volume, por exemplo, 2 ml, de solvente/solução tampão.

[00121] Os anticorpos aqui divulgados podem ser adequados para a liberação via nebulização.

[00122] Também é considerado que o anticorpo da presente invenção possa ser administrado pelo uso da terapia de gene. De modo a obter isto, as sequências de DNA que codificam as cadeias pesada e leve da molécula de anticorpo sob o controle de componentes de DNA apropriados são introduzidos em um paciente tal que as cadeias de anticorpo sejam expressadas a partir das sequências de DNA e montadas in situ.

[00123] A presente invenção também fornece uma molécula de anticorpo para o uso no controle de doenças inflamatórias. Preferivelmente, a molécula de anticorpo pode ser usada para reduzir o processo inflamatório ou prevenir o processo inflamatório.

[00124] A presente invenção também fornece a molécula de anticorpo da presente invenção para o uso no tratamento ou profilaxia de um distúrbio patológico que é mediado pela IL-17A e/ou IL-17F ou está associado com um nível aumentado de IL- 17A e/ou IL-17F.

[00125] Preferivelmente, a condição patológica é selecionada do grupo que consiste de infecções (virais, bacterianas, fúngicas e parasíticas), choque endotóxico associado com infecção, artrite, artrite reumatóide, artrite psoriática, artrite idiopática juvenil de início sistêmico (JIA), lupo eritematoso sistêmico (SLE), asma, doença das vias aéreas obstrutiva crônica (COAD), doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), lesão pulmonar aguda, doença inflamatória pélvica, doença de Alzheimer, doença de Crohn, doença do intestino inflamatória, síndrome do intestino irritável, colite ulcerativa, doença de Castleman, espondilite ancilosante e outras espondiloartropatias, dermatomiosite, miocardite, uveíte, exoftalmos, tireoidite autoimune, Doença de Peironie, doença celíaca, doença da vesícula biliar, doença pilonidal, peritonite, psoríase, dermatite atópica, vasculite, adesões cirúrgicas, acidente vascular cerebral, diabete autoimune, diabete tipo I, artrite de lima, meningoencefalite, distúrbios inflamatórios imuno mediadas do sistema nervoso central e periférico tal como esclerose múltipla e síndrome de Guillain-Barr, outros distúrbios autoimunes, pancreatite, trauma (cirurgia), doença do enxerto versus hospedeiro, rejeição de transplante, distúrbios que incluem fibrose pulmonar, fibrose hepática, fibrose renal, escleroderma ou esclerose sistêmica, câncer (tanto de tumores sólidos tais como melanomas, hepatoblastomas, sarcomas, carcinomas de célula escamosa, cânceres de célula transicional, cânceres ovarianos quanto malignidades hematológicas e em particular leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crônica, leucemia linfática crônica, câncer gástrico e câncer colônico), doença cardíaca que inclui doenças isquêmicas tais como infartação miocárdica assim como aterosclerose, coagulação intravascular, reabsorção óssea, osteoporose, periodontite e hipocloridria.

[00126] Em uma forma de realização o anticorpo da presente invenção é usado no tratamento ou profilaxia de um distúrbio patológico selecionado do grupo que consiste de artrite, artrite reumatóide, psoríase, artrite psoriática, artrite idiopática juvenil de início sistêmico (JIA), lupo eritematoso sistêmico (SLE), asma, doença das vias aéreas obstrutivas crônicas, doença pulmonar obstrutiva crônica, dermatite atópica, escleroderma, esclerose sistêmica, fibrose pulmonar, doenças do intestino inflamatórias, espondilite ancilosante e outras espondiloartropatias e câncer.

[00127] Em uma forma de realização o anticorpo da presente invenção é usado no tratamento ou profilaxia de um distúrbio patológico selecionado do grupo que consiste de artrite, artrite reumatóide, psoríase, artrite psoriática, artrite idiopática juvenil de início sistêmico (JIA), lupo eritematoso sistêmico (SLE), asma, doença das vias aéreas obstrutivas crônicas, doença pulmonar obstrutiva crônica, dermatite atópica, escleroderma, esclerose sistêmica, fibrose pulmonar, Doença de Crohn, colite ulcerativa, espondilite ancilosante e outras espondiloartropatias e câncer.

[00128] Em uma forma de realização o anticorpo da presente invenção é usado no tratamento ou profilaxia de um distúrbio patológico selecionado do grupo que consiste de artrite, artrite reumatóide, psoríase, artrite psoriática, artrite idiopática juvenil de início sistêmico (JIA), lupo eritematoso sistêmico (SLE), asma, doença das vias aéreas obstrutivas crônicas, doença pulmonar obstrutiva crônica, dermatite atópica, escleroderma, esclerose sistêmica, fibrose pulmonar, Doença de Crohn, colite ulcerativa, espondilite ancilosante e outras espondiloartropatias.

[00129] Em uma forma de realização o distúrbio patológico é a artrite reumatóide.

[00130] Em uma forma de realização o distúrbio patológico é a Doença de Crohn.

[00131] Em uma forma de realização o distúrbio patológico é a colite ulcerativa.

[00132] Em um exemplo o anticorpo da presente invenção é usado no tratamento de uma doença inflamatória ou imuno relacionada. Em um exemplo a doença inflamatória ou imuno relacionada é selecionada do grupo que consiste de artrite reumatóide, Doença de Crohn e colite ulcerativa.

[00133] A presente invenção também fornece uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção para o uso no tratamento ou profilaxia da dor, particularmente dor associada com a inflamação.

[00134] A presente invenção fornece ainda o uso de uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de um distúrbio patológico que é mediado pela IL-17A e/ou IL-17F ou associado com um nível aumentado de IL-17A e/ou IL-17F. Preferivelmente o distúrbio patológico é uma das indicações médicas aqui descritas acima. A presente invenção fornece ainda o uso de uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia da dor, particularmente dor associada com a inflamação.

[00135] Uma molécula de anticorpo da presente invenção pode ser utilizada em qualquer terapia onde é desejado reduzir os efeitos da IL-17A e/ou IL-17F no corpo humano ou animal. A IL-17A e/ou IL-17F podem estar circulando no corpo ou podem estar presentes em um nível indesejavelmente alto localizado em um sítio particular no corpo, por exemplo, um sítio de inflamação.

[00136] Uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção é preferivelmente usada para o controle de doença inflamatória, doença autoimune ou câncer.

[00137] A presente invenção também fornece um método de tratar indivíduos humanos ou animais que sofrem de ou em risco de um distúrbio mediado pela IL- 17A e/ou IL-17F, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma molécula de anticorpo da presente invenção.

[00138] Uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção também pode ser usada em diagnóstico, por exemplo, no diagnóstico in vivo e formação de imagem de estados de doença que envolvem a IL-17A e/ou IL-17F.

[00139] A presente invenção é descrita ainda apenas por via de ilustração nos exemplos que seguem, que referem-se às Figuras anexas, em que:

[00140] Figura 1 a) Região de cadeia leve V de anticorpo CA028_0496g3 (SEQ ID NO: 7) b) Região de cadeia pesada V de anticorpo CA028_0496g3 (SEQ ID NO: 9) c) CDRH1 (SEQ ID NO: 1), CDRH2 (SEQ ID NO: 2), CDRH3 (SEQ ID NO: 3), CDRL1 (SEQ ID NO: 4), CDRL2 (SEQ ID NO: 5), CDRL3 (SEQ ID NO: 6) de anticorpo CA028_496g3. d) Cadeia leve de anticorpo CA028_496g3 (SEQ ID NO: 11). e) Cadeia leve de anticorpo CA028_496g3 que inclui a sequência de sinal (SEQ ID NO: 12).

[00141] Figura 2 a) Cadeia pesada de anticorpo CA028_496g3 (SEQ ID NO: 15). b) Cadeia pesada de anticorpo CA028_496g3 que inclui sequência de sinal (SEQ ID NO: 16). c) DNA que codifica a cadeia leve de anticorpo CA028_496g3 (nenhuma sequência de sinal) (SEQ ID NO: 13).

[00142] Figura 3 a) DNA que codifica a cadeia leve de anticorpo CA028_496g3 que inclui a sequência de sinal (SEQ ID NO: 14) b) DNA que codifica a região variável de cadeia leve de anticorpo CA028_496g3 (SEQ ID NO: 8) c) DNA que codifica região variável de cadeia pesada de anticorpo CA028_496g3 que inclui a sequência de sinal (SEQ ID NO: 10).

[00143] Figura 4: DNA (que inclui exons) que codifica a cadeia pesada de anticorpo CA028_496g3 sem sequência de sinal (SEQ ID NO: 17)

[00144] Figura 5: DNA (que inclui exons e sequência de sinal) que codifica cadeia pesada de anticorpo CA028_496g3 (SEQ ID NO: 18)

[00145] Figura 6: cDNA que codifica a cadeia pesada de anticorpo CA028_496g3 que inclui a sequência de sinal (SEQ ID NO: 19).

[00146] Figura 7: O efeito de anticorpos CA028_0496 (designado 496g1 na legenda) e CA028_00496.g3 (designado 496.g3 na legenda) na produção de IL-6 induzida pela IL-17F humana a partir de células Hela.

[00147] Exemplo 1: Produção de um anticorpo de neutralização melhorado que liga IL-17A e IL-17F

[00148] A isolação e humanização de anticorpo CA028_0496 foram anteriormente descritas na WO2008/047134. CA028_0496 é um anticorpo de neutralização humanizado que liga tanto IL-17A quanto IL-17F e compreende as regiões variáveis enxertadas gL7 e gH9, as sequências das quais são fornecidas na WO2008/047134. A matriz aceitadora da cadeia pesada é a sequência da linha germinativa VH3 1-3 3-07 com matriz 4 originando-se desta porção da linha germinativa da região JH humana JH4. A matriz aceitadora da cadeia leve é a sequência da linha germinativa humana VK1 2-1-(1) L4, com a matriz 4 originando-se desta porção da linha germinativa da região JK humana JK1.

[00149] O anticorpo CA028_00496 foi maturado por afinidade para melhorar a afinidade do anticorpo para IL-17F enquanto retém a afinidade para IL-17A. Ao contrário do anticorpo CA028_00496, o anticorpo maturado por afinidade, conhecido como CA028_00496.g3, foi expressado como uma IgG1 ao invés de uma IgG4. Os genes foram modificados para gerar as versões maturadas por afinidade pela mutagênese direcionada a oligonucleotídeo. A sequência de gene da região variável de cadeia leve maturada por afinidade (gL57) foi sub-clonada no vetor de expressão de cadeia leve humana pKH10.1 da UCB Celltech, que contém o DNA que codifica a região constante C-Capa humana (alotipo Km3). A sequência da região variável de cadeia pesada inalterada (gH9) foi sub-clonada no vetor de expressão pVhg1 FL da UCB Celltech, que contém o DNA que codifica as regiões constantes da cadeia pesada humana gama-1. Os plasmídeos foram co-transfectados em células CHO usando o procedimento da Lipofectamina® 2000 de acordo com as instruções do fabricante (InVitrogen, No. de catálogo 11668).

[00150] A sequência final das regiões variáveis maturadas por afinidade de anticorpo CA028_00496.g3 é dada nas Figuras 1a e 1b. No anticorpo CA028_00496.g3 a sequência da região variável de cadeia pesada é a mesma como aquela do anticorpo precursor CA028_00496. Ao contrário, a região variável de cadeia leve difere em 5 aminoácidos. Os cinco resíduos que diferem entre a cadeia leve de anticorpo CA028_00496 e o anticorpo CA028_00496.g3 estão sublinhados na Figura 1a.

[00151] Exemplo 2: BIACORE

[00152] Como descrito abaixo, o formato de ensaio foi a captura do anticorpo CA028_00496.g3 por um anticorpo específico de Fc de IgG anti-ser humano imobilizado, seguido pela titulação de IL-17A humana e IL-17F humana sobre a superfície de captura.

[00153] A Análise de Interação Biomolecular foi realizada usando um Biacore 3000 (Biacore AB). Os ensaios foram realizados a 25o C. O fragmento de F(ab’)2 Affinipure específico de Fc de IgG anti-ser humano de cabra (Jackson ImmunoResearch) foi imobilizado em um Chip Sensor CM5 (Biacore AB) por intermédio da química da ligação de amina a um nível de aproximadamente 6000 unidades de resposta (RU). Tampão HBS-EP (10 mM de HEPES pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,005 % de Tensoativo P20, Biacore AB) foi usado como o tampão de condução com uma taxa de fluxo de 10 μl/minuto (min). Uma injeção de 10 μ l de CA028_00496.g3 a 0,5 μ g/ml foi usada para captura pelo Fc de IgG anti-ser humano imobilizado. A IL-17A humana (gerada em casa pela UCB) foi titulada sobre o CA028_00496.g3 capturado a partir de 5 nM em uma taxa de fluxo de 30 μ l/min por 3 min seguido por uma dissociação de 20 min. A IL-17F humana (R&D systems) foi titulada sobre o CA028_00496.g3 capturado a partir de 10 nM em uma taxa de fluxo de 30 μ l/min por 3 min seguido por uma dissociação de 5 min. A superfície foi regerada em uma taxa de fluxo de 10 μ L/min por uma injeção de 10 μ l de HCl a 40 mM seguido por uma injeção de 5 μ l de NaOH a 5 mM.

[00154] Tabela 1 Afinidade de CA028_496.g3 contra IL-17F e IL-17A humanas

[00155] As curvas de ligação subtraídas do fundo de referência dupla foram analisadas usando o software BIAevaluation (versão 4.1) seguindo procedimentos padrão. Os parâmetros cinéticos foram determinados a partir do algoritmo de ajuste. Os dados são detalhados na Tabela 1, os valores médios são salientados em cinza.

[00156] O valor de afinidade determinado para a ligação do anticorpo original CA028_0496 à IL-17A foi de 16 pM e 1750 pM para a IL-17F. Ao contrário, o anticorpo melhorado CA028_0496 g3 tem uma afinidade para IL-17A de 3,2 pM e para IL-17F de 23 pM. A afinidade do anticorpo CA028_0496 para IL-17F foi melhorada em 70 vezes sem reduzir a afinidade do anticorpo para IL-17A. Na verdade, a afinidade para IL-17A foi aumentada cinco vezes.

[00157] A afinidade de CA028_0496 g3 também foi melhorada para o heterodímero IL-17A/F (fabricado como descrito na WO2008/047134) onde a afinidade foi encontrada ser de 26 pM (dados não mostrados).

[00158] Exemplo 3

[00159] A potência de CA028_00496.g1 (anteriormente descrita na WO2008/047134) e CA028_00496.g3 para a neutralização de IL-17F humana foi determinada usando um bioensaio de célula HeLa. As células Hela foram obtidas a partir do banco de célula na ATCC (ATCC CCL-2). As células foram cultivadas em meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10 % de soro de bezerro fetal, penicilina, gentamicina e glutamina. 1 x 104 células foram plaqueadas em placas de cultura de tecido de fundo plano de 96 reservatórios. As células foram incubadas durante a noite e lavadas uma vez em tampão de ensaio. As células HeLa foram estimuladas com uma combinação de IL-17F recombinante humana (125 ng/ml) e fator alfa de necrose de tumor (TNF-α) (1 ng/ml) por 48 horas na presença de concentrações variáveis dos anticorpos. Na linhagem de célula HeLa, IL-17F sinergisa com TNF-alfa para induzir a produção de IL-6 que pode ser quantificada usando um kit de ensaio de MSD específico. A quantidade resultante de IL-6 secretada foi medida usando a tecnologia de ensaio Meso Scale Discovery (MSD) e os valores IC50 calculados. CA028_00496.g1 e CA028_00496.g3 mostraram inibição dependente da dose da bioatividade de IL-17F como medida no bioensaio de célula HeLa (Figura 7). A atividade de CA028_00496.g1 e CA028_00496.g3 no ensaio HeLa foi expressado como a dose requerida para inibir 50 % da atividade de IL-17F (IC50). A IC50 para CA028_00496.g1 é de 92 mg/ml e para CA0 496.g3 é de 4 ng/ml.

[00160] A capacidade de CA028_00496.g3 para neutralizar IL-17A, como descrito anteriormente para CA028_00496.g1 na WO2008/047134, foi confirmada usando o mesmo ensaio em que a IL-17F foi substituída com IL-17A (dados não mostrados).

Claims (14)

1. Anticorpo de neutralização, caracterizado pelo fato de que se liga IL-17A humana e IL-17F humana tendo uma cadeia leve e uma cadeia pesada em que o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 7 e o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 9.

2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo também se liga ao heterodímero IL-17A/IL-17F.

3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo inteiro ou fragmento funcionalmente ativo do mesmo.

4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo é selecionado do grupo que consiste em um fragmento Fab, Fab’, F(ab’)2, scFv e Fv.

5. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo multiespecífico.

6. Anticorpo de neutralização que liga a IL-17A humana e a IL-17F humana de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que tem uma cadeia pesada que compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 15 e uma cadeia leve que compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 11.

7. Sequência de DNA isolada, caracterizada pelo fato de que codifica a cadeia pesada e a cadeia leve, em que o DNA que codifica a cadeia leve compreende a sequência dada em SEQ ID NO:8 ou SEQ ID NO:13 e o DNA que codifica a cadeia pesada compreende a sequência dada em SEQ ID NO:10 ou SEQ ID NO:17.

8. Vetor de clonagem ou expressão, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de DNA como definida na reivindicação 7.

9. Vetor de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende as sequências dadas na SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 17.

10. Processo para a produção do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira compreendendo: i) uma sequência de DNA que codifica a cadeia pesada do dito anticorpo; e ii) uma sequêdncia de DNA que codifica a cadeia leve do dito antiporpo; em que as sequências de DNA são fornecidas em um ou mais vetores de clonagem ou expressão; e isolar o anticorpo.

11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em combinação com um ou mais de um excipiente, diluente ou carregador farmaceuticamente aceitáveis.

12. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente outros ingredientes ativos.

13. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de uma condição patológica selecionada do grupo que consiste em infecções (virais, bacteriana, fúngicas e parasíticas), choque endotóxico associado com infecção, artrite, artrite reumatóide, artrite psoriática, artrite idiopática juvenil de início sistêmico (JIA), lupos eritematoso sistêmico (SLE), asma, doença das vias aéreas obstrutiva crônica (COAD), doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), lesão pulmonar aguda, doença inflamatória pélvica, doença de Alzheimer, doença de Crohn, doença do intestino inflamatória, síndrome do intestino irritável, Colite ulcerativa, doença de Castleman, espondilite ancilosante e outras espondiloartropatias, dermatomiosite, miocardite, uveíte, exoftalmos, tireoidite autoimune, Doença de Peyronie, doença celíaca, doença da vesícula biliar, doença Pilonidal, peritonite, psoríase, dermatite atópica, vasculite, adesões cirúrgicas, acidente vascular cerebral, diabete autoimune, Diabete Tipo I, artrite de Lima, meningoencefalite, distúrbios inflamatórios imuno mediados do sistema nervoso central e periférico tal como esclerose múltipla e síndrome de Guillain-Barr, outros distúrbios autoimunes, pancreatite, trauma (cirurgia), doença do enxerto versus hospedeiro, rejeição a transplante, distúrbios fibrosantes que incluem fibrose pulmonar, fibrose hepática, fibrose renal, escleroderma ou esclerose sistêmica, câncer (tanto tumores sólidos tais como melanomas, hepatoblastomas, sarcomas, carcinomas de célula escamosa, cânceres de célula transicional, cânceres ovarianos e malignidades hematológicas e em particular leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crônica, leucemia linfática crônica, câncer gástrico e câncer colônico), doença cardíaca que inclui doenças isquêmicas tais como infartação miocárdica assim como aterosclerose, coagulação intravascular, reabsorção óssea, osteoporose, periodontite e hipocloridria.

14. Uso de uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 11 ou na reivindicação 12, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de uma condição patológica selecionada do grupo que consiste em infecções (virais, bacteriana, fúngicas e parasíticas), choque endotóxico associado com infecção, artrite, artrite reumatóide, artrite psoriática, artrite idiopática juvenil de início sistêmico (JIA), lupos eritematoso sistêmico (SLE), asma, doença das vias aéreas obstrutiva crônica (COAD), doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), lesão pulmonar aguda, doença inflamatória pélvica, doença de Alzheimer, doença de Crohn, doença do intestino inflamatória, síndrome do intestino irritável, Colite ulcerativa, doença de Castleman, espondilite ancilosante e outras espondiloartropatias, dermatomiosite, miocardite, uveíte, exoftalmos, tireoidite autoimune, Doença de Peyronie, doença celíaca, doença da vesícula biliar, doença Pilonidal, peritonite, psoríase, dermatite atópica, vasculite, adesões cirúrgicas, acidente vascular cerebral, diabete autoimune, Diabete Tipo I, artrite de Lima, meningoencefalite, distúrbios inflamatórios imuno mediados do sistema nervoso central e periférico tal como esclerose múltipla e síndrome de Guillain-Barr, outros distúrbios autoimunes, pancreatite, trauma (cirurgia), doença do enxerto versus hospedeiro, rejeição a transplante, distúrbios fibrosantes que incluem fibrose pulmonar, fibrose hepática, fibrose renal, escleroderma ou esclerose sistêmica, câncer (tanto tumores sólidos tais como melanomas, hepatoblastomas, sarcomas, carcinomas de célula escamosa, cânceres de célula transicional, cânceres ovarianos e malignidades hematológicas e em particular leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crônica, leucemia linfática crônica, câncer gástrico e câncer colônico), doença cardíaca que inclui doenças isquêmicas tais como infartação miocárdica assim como aterosclerose, coagulação intravascular, reabsorção óssea, osteoporose, periodontite e hipocloridria.

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