ES2632583T3

ES2632583T3 - Anticuerpo que se une a IL-17A e IL-17F

Info

Publication number: ES2632583T3
Application number: ES12700433.1T
Authority: ES
Inventors: Ralph Adams; Terence Seward Baker; Alastair David Griffiths Lawson
Original assignee: UCB Biopharma SRL
Current assignee: UCB Biopharma SRL
Priority date: 2011-01-14
Filing date: 2012-01-11
Publication date: 2017-09-14
Anticipated expiration: 2032-01-11
Also published as: HRP20171034T1; MY162790A; US20180346561A1; ME02734B; US20120183558A1; BR112013017951B1; AU2012206431A1; MX341489B; PL2663577T3; AR128047A2; DK2663577T3; EP3219728A1; US9988446B2; EP2663577A1; HUS2200001I1; JP6028737B2; JP2014505474A; NL301159I1; UA110358C2; CL2013002044A1

Abstract

Un anticuerpo neutralizante que se une a IL-17A humano e IL-17F humano con una cadena ligera y una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende la secuencia dada en la SEQ ID nº 7 y el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia dada en la SEQ ID nº 9.

Description

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resto de cisteína situado en el fragmento de anticuerpo. Cada molécula de polímero unida al fragmento de anticuerpo modificado puede estar unida por enlace covalente al átomo de azufre de un resto de cisteína situado en el fragmento. El enlace covalente será generalmente un enlace disulfuro o, en concreto, un enlace azufre-carbono. Cuando un grupo tiol se utiliza como punto de unión pueden utilizarse moléculas efectoras, por ejemplo derivados selectivos de tiol tales como derivados de maleimidas y de cisteína. Puede utilizarse un polímero activado como material de partida en la preparación de fragmentos de anticuerpo modificados con polímero como se describió anteriormente. El polímero activado puede ser cualquier polímero que contenga un grupo tiol reactivo tal como un ácido o éster α-halocarboxílico, p. ej. yodoacetamida, una imida, p. ej. maleimida, una vinilsulfona o un disulfuro. Dichos materiales de partida pueden obtenerse en el comercio (por ejemplo en Nektar, anteriormente Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, EE.UU.) o pueden prepararse a partir de materiales de partida disponibles en el mercado utilizando procedimientos químicos convencionales. Determinadas moléculas de PEG incluyen 20K metoxiPEG-amina (se puede adquirir en Nektar, anteriormente Shearwater; Rapp Polymere; y SunBio) y M-PEG-SPA (se puede adquirir en Nektar, anteriormente Shearwater).

En una realización, el anticuerpo es un fragmento Fab modificado que está PEGilado, es decir tiene PEG (poli(etilenglicol)) unido por enlace covalente a éste, p. ej. según el método descrito en la patente EP 0948544 [véase también "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, Nueva York, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris y S. Zalipsky (eds.), American Chemical Society, Washington DC y "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam y A. Dent, Grove Publishers, Nueva York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545]. En un ejemplo PEG está unido a una cisteína en la zona de bisagra. En un ejemplo, un fragmento de Fab modificado con PEG tiene un grupo maleimida unido por enlace covalente a un solo grupo tiol en una zona de bisagra modificada. Un resto de lisina puede estar unido por enlace covalente al grupo y a cada uno de los grupos amina en el resto de lisina puede estar unido a un polímero de metoxipoli(etilenglicol) que tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da. El peso molecular total del PEG unido al fragmento Fab puede ser por consiguiente de aproximadamente 40.000 Da.

En una realización, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para IL-17A humano e IL-17F, que es un fragmento Fab que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en la SEQ ID nº 9 y una cadena que comprende la secuencia dada en la SEQ ID nº 7 y que tiene en el extremo terminal C de su cadena pesada una zona de bisagra que contiene al menos un resto de cisteína al que está unida una molécula efectora. Preferiblemente la molécula efectora es PEG y está unida empleando los métodos descritos en los documentos (WO98/25971 y WO2004072116) por los cuales un grupo lisil-maleimida se une al resto de cisteína en el extremo terminal C de la cadena pesada, y cada grupo amino del resto lisilo tiene unido por enlace covalente al mismo un resto metoxipoli(etilenglicol) que tiene un peso molecular de aproximadamente

20.000 Da. El peso molecular total del PEG unido al anticuerpo es por consiguiente de aproximadamente 40.000 Da.

En otro ejemplo las moléculas efectoras pueden estar unidas a fragmentos de anticuerpo empleando los métodos descritos en las solicitudes de patente internacionales WO2005/003169, WO2005/003170 y WO2005/003171.

La presente invención también proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica la(s) cadena(s) pesada y/o ligera de una molécula de anticuerpo de la presente invención. Preferiblemente, la secuencia de ADN codifica la cadena pesada o ligera de una molécula de anticuerpo de la presente invención. La secuencia de ADN de la presente invención puede comprender ADN sintético, por ejemplo producido mediante tratamiento químico, ADNc, ADN genómico o cualquiera de sus combinaciones.

Las secuencias de ADN que codifican una molécula de anticuerpo de la presente invención pueden obtenerse mediante métodos muy conocidos por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican una parte o la totalidad de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo pueden sintetizarse según se desee a partir de determinadas secuencias de ADN, o en base a las correspondientes secuencias de aminoácidos.

El ADN que codifica las secuencias marco del receptor está ampliamente disponible para los expertos en la técnica y puede sintetizarse fácilmente basándose en sus conocidas secuencias de aminoácidos.

Se pueden usar técnicas normalizadas de biología molecular para preparar secuencias de ADN que codifican la molécula de anticuerpo de la presente invención. Las secuencias de ADN deseadas pueden sintetizarse completa o parcialmente mediante el uso de técnicas de síntesis de oligonucleótidos. Pueden emplearse técnicas de mutagenia dirigida al sitio y de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) según convenga.

Ejemplos de secuencias adecuadas se proporcionan en la SEQ ID nº 8; SEQ ID nº 10; SEQ ID nº 13; SEQ ID nº 14; SEQ ID nº 17, SEQ ID nº 18 y SEQ ID nº 19.

La presente invención también se refiere a un vector de clonación o de expresión que comprende una o más secuencias de ADN de la presente invención. Por consiguiente, se proporciona un vector de clonación o de expresión que comprende una o más secuencias de ADN que codifican un anticuerpo de la presente invención. Preferiblemente, el vector de clonación o de expresión comprende dos secuencias de ADN, que codifican la cadena ligera y la cadena pesada de la molécula de anticuerpo de la presente invención, respectivamente junto con

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secuencias señal adecuadas. Preferiblemente, un vector según la presente invención comprende las secuencias dadas en la SEQ ID nº 14 y SEQ ID nº 18. En una realización un vector según la presente invención comprende las secuencias dadas en la SEQ ID nº 13 y la SEQ ID nº 17.

Los métodos generales mediante los cuales se pueden construir vectores, los métodos de transfección y los métodos de cultivo son bien conocidos por los expertos en la técnica. A este respecto, se hace referencia a Current Protocols in Molecular Biology, 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, Nueva York y al manual de Maniatis producido por Cold Spring Harbor Publishing.

También se proporciona una célula anfitriona que comprende uno o más vectores de clonación o expresión que comprenden una o más secuencias de ADN que codifican un anticuerpo de la presente invención. Se puede usar cualquier sistema célula anfitriona/vector adecuado para la expresión de las secuencias de ADN que codifican la molécula de anticuerpo de la presente invención. Se pueden utilizar sistemas bacterianos, por ejemplo E. coli, y otros sistemas microbianos, o también se pueden utilizar sistemas de expresión de células anfitrionas eucariotas, por ejemplo de mamífero. Las células anfitrionas de mamífero idóneas incluyen células CHO, de mieloma o de hibridoma.

La presente invención también proporciona un procedimiento para la producción de una molécula de anticuerpo según la presente invención que comprende el cultivo de una célula anfitriona que contiene un vector de la presente invención en condiciones adecuadas para conducir a la expresión de proteínas a partir de ADN que codifica la molécula de anticuerpo de la presente invención, y el aislamiento de la molécula de anticuerpo.

La molécula de anticuerpo puede comprender solamente un polipéptido de la cadena pesada o ligera, en cuyo caso solamente una secuencia que codifica el polipéptido de la cadena pesada o la cadena ligera se necesita utilizar para transfectar las células anfitrionas. Para la producción de productos que comprenden tanto cadenas pesadas como ligeras, la estirpe celular puede transfectarse con dos vectores, un primer vector que codifica un polipéptido de la cadena ligera y un segundo vector que codifica un polipéptido de la cadena pesada. Alternativamente, puede utilizarse un solo vector, incluyendo el vector secuencias que codifican polipéptidos de la cadena ligera y la cadena pesada.

Como los anticuerpos de la presente invención son útiles en el tratamiento y/o profilaxis de un proceso patológico, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende una molécula de anticuerpo de la presente invención en combinación con uno o más excipientes, diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Por consiguiente, se proporciona el uso de un anticuerpo según la presente invención para la preparación de un medicamento. La composición normalmente se suministrará como parte de una composición farmacéutica estéril, que normalmente incluirá un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica de la presente invención puede además comprender un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

La presente invención también proporciona un procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica

: o de diagnóstico que comprende añadir y mezclar la molécula de anticuerpo de la presente invención junto con uno

: o más excipientes, diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables.

La molécula de anticuerpo puede ser el único principio activo en la composición farmacéutica o de diagnóstico o puede estar acompañada por otros principios activos incluidos otros ingredientes del anticuerpo, por ejemplo anti-TNF, anti-IL-1β, anti-linfocito T, anticuerpos anti-IFNγ o anti-LPS, o ingredientes que no son de anticuerpos tales como xantinas o un inhibidor de pequeñas moléculas.

Las composiciones farmacéuticas preferiblemente comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de la invención. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz " como se emplea en esta memoria se refiera a una cantidad de un agente terapéutico necesario para tratar, mejorar o evitar una enfermedad o afección elegida como objetivo, o para presentar un efecto terapéutico o preventivo detectable. Para cualquier anticuerpo, la cantidad terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente bien en ensayos en cultivo celular o en modelos animales, normalmente en roedores, conejos, perros, cerdos o primates. El modelo animal puede además utilizarse para determinar el intervalo de concentración apropiado y la vía de administración. Dicha información puede utilizarse entonces para determinar las dosis y vías de administración útiles en personas.

La cantidad exacta terapéuticamente eficaz para un paciente humano dependerá de la gravedad de la enfermedad, la salud general del paciente, la edad, el peso y el sexo del paciente, la alimentación, el tiempo y frecuencia de administración, la combinación o combinaciones de fármacos, las sensibilidades a la reacción y la tolerancia/respuesta al tratamiento. Esta cantidad puede determinarse por experimentación rutinaria y está en el criterio del médico. Generalmente, una cantidad terapéuticamente eficaz estará entre 0,01 mg/kg y 50 mg/kg, preferiblemente entre 0,1 mg/kg y 20 mg/kg. Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse convenientemente en formas de dosis unitaria que contienen una cantidad predeterminada de un principio activo de la invención por dosis.

Las composiciones pueden administrarse individualmente a un paciente o pueden administrarse en combinación (p. ej. simultánea, sucesivamente o por separado) con otros agentes, fármacos u hormonas.

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La dosis a la que se administra la molécula de anticuerpo de la presente invención depende de la naturaleza de la afección que debe tratarse, de la magnitud de la inflamación presente y de si la molécula de anticuerpo se está utilizando profilácticamente o para tratar una afección existente.

La frecuencia de la dosis dependerá de la vida media de la molécula de anticuerpo y de la duración de su efecto. Si la molécula de anticuerpo tiene una corta vida media (p. ej. 2 a 10 horas) puede ser necesario administrar una o más dosis al día. Alternativamente, si la molécula de anticuerpo tiene una larga vida media (p. ej. 2 a 15 días) puede ser necesario solamente administrar una dosis una vez al día, una vez a la semana o incluso una vez cada 1 o 2 meses.

El vehículo farmacéuticamente aceptable no debería inducir la producción de anticuerpos perjudiciales para quien recibe la composición y no debería ser tóxico. Los vehículos idóneos pueden ser macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente tales como proteínas, polipéptidos, liposomas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivos.

Pueden utilizarse sales, por ejemplo sales de ácidos minerales, tales como hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos y sulfatos, o sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos.

Vehículos farmacéuticamente aceptables en composiciones terapéuticas pueden contener líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Además, en dichas composiciones pueden estar presentes sustancias, tales como agentes humectantes o emulsionantes o sustancias amortiguadoras del pH. Dichos vehículos permiten que las composiciones farmacéuticas sean formuladas como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas y suspensiones, para ingestión por el paciente.

Las formas preferidas para administración incluyen formas adecuadas para administración parenteral, p. ej. por inyección o infusión, por ejemplo por inyección intravenosa rápida o infusión continua. Cuando el producto es inyectable o por infusión, puede tomar la forma de una suspensión, solución o emulsión en un vehículo aceitoso o acuoso y puede contener agentes formuladores, tales como agentes de suspensión, conservantes, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, la molécula de anticuerpo puede estar en forma anhidra, para redisolución antes de su uso con un líquido estéril apropiado.

Una vez formuladas, las composiciones de la invención pueden administrarse directamente al paciente. Los pacientes a tratar pueden ser animales. Sin embargo, se prefiere que las composiciones se adapten para administración a pacientes humanos.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención puede ser administrada por cualquier número de vías incluidas, pero no limitadas a, las vías oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea (por ejemplo, véase el documento WO 98/20734), subcutánea, intraperitoneal, intranasal, entérica, tópica, sublingual, intravaginal o rectal. Pueden utilizarse también inyectores para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Por lo general, las composiciones terapéuticas pueden prepararse como inyectables, bien como soluciones o suspensiones líquidas. Pueden prepararse también formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección.

La administración directa de las composiciones generalmente se llevará a cabo por inyección, por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o se administrará al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones pueden administrarse también en una lesión. El tratamiento a dosis puede ser un programa de una sola dosis o un programa de múltiples dosis.

Cabe destacar que el principio activo en la composición será una molécula de anticuerpo. Como tal, será sensible a la degradación en el tubo digestivo. Por lo tanto, si la composición ha de administrarse por una vía que utiliza el tubo digestivo, la composición necesitará contener agentes que protejan el anticuerpo de la degradación pero que liberen el anticuerpo una vez ha sido absorbido en el tubo digestivo.

Una exposición completa de vehículos farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).

En una realización se proporciona la formulación en forma de una formulación para administraciones tópicas, que incluyen la inhalación.

Los preparados inhalables adecuados incluyen polvos inhalables, aerosoles dosimétricos que contienen gases propulsores o disoluciones inhalables sin gases propulsores. Los polvos inhalables según la descripción que contienen la sustancia activa pueden consistir solamente en las sustancias activas anteriormente mencionadas o en una mezcla de las sustancias activas anteriormente mencionadas con un excipiente fisiológicamente aceptable.

Estos polvos inhalables pueden incluir monosacáridos (por ejemplo, glucosa o arabinosa), disacáridos (por ejemplo, lactosa, sacarosa, maltosa), oligo-y polisacáridos (por ejemplo, dextranos), polialcoholes (por ejemplo, sorbitol, manitol, xilitol), sales (por ejemplo, cloruro de sodio, carbonato de calcio) o mezclas de estos entre sí. Se utilizan de modo adecuado mono-o disacáridos, y la lactosa o la glucosa, en particular, pero no exclusivamente, se utilizan en forma de sus hidratos.

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Las partículas para deposición en el pulmón requieren un tamaño de partícula menor de 10 micras, tal como 1-9 micras por ejemplo de 0,1 a 5 µm, en particular de 1 a 5 µm. El tamaño de partícula del principio activo (tal como el anticuerpo o fragmento) tiene una gran importancia.

Los gases propulsores que se pueden utilizar para preparar los aerosoles inhalables son conocidos en la técnica. Los gases propulsores adecuados se seleccionan entre hidrocarburos tales como n-propano, n-butano o isobutano e hidrocarburos halogenados, tales como derivados clorados y/o fluorados de metano, etano, propano, butano, ciclopropano o ciclobutano. Los gases propulsores anteriormente mencionados se pueden utilizar como tales o en mezclas de los mismos.

Los gases propulsores particularmente adecuados son derivados de alcano halogenados seleccionados entre TG 11, TG 12, TG 134a y TG227. De los hidrocarburos halogenados mencionados anteriormente, TG134a (1,1,1,2tetrafluoroetano) y TG227 (1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano) y sus mezclas son particularmente adecuados.

Los aerosoles inhalables que contienen gas propulsor también pueden contener otros ingredientes, tales como codisolventes, estabilizantes, agentes tensioactivos, antioxidantes, lubricantes y medios para ajustar el pH. Todos estos ingredientes son conocidos en la técnica.

Los aerosoles inhalables que contienen un gas propulsor según la invención pueden contener hasta 5% en peso de principio activo. Los aerosoles según la invención contienen, por ejemplo, de 0,002 a 5% en peso, de 0,01 a 3% en peso, de 0,015 a 2% en peso, de 0,1 a 2% en peso, de 0,5 a 2% en peso o de 0,5 a 1% en peso de principio activo.

Como alternativa, las administraciones tópicas en el pulmón también pueden ser mediante la administración de una disolución líquida o una formulación en suspensión, por ejemplo empleando un dispositivo tal como un nebulizador, por ejemplo, un nebulizador conectado a un compresor (por ejemplo, el nebulizador Pari LC-Jet Plus(R) conectado a un compresor Pari Master(R) fabricado por Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.).

El anticuerpo de la invención puede administrarse dispersado en un disolvente, p. ej., en forma de una solución o una suspensión. Puede ponerse en suspensión en una disolución fisiológica apropiada, por ejemplo, disolución salina u otro disolvente o disolución tamponada farmacológicamente aceptable. Las disoluciones tamponadas conocidas en la técnica pueden contener de 0,05 mg a 0,15 mg de edetato disódico, de 8,0 mg a 9,0 mg de NaCl, de 0,15 mg a 0,25 mg de polisorbato, de 0,25 mg a 0,30 mg de ácido cítrico anhidro, y de 0,45 mg a 0,55 mg de citrato de sodio por 1 ml de agua de manera que se logre un pH de aproximadamente 4,0 a 5,0. Una suspensión puede contener, por ejemplo, el anticuerpo liofilizado.

Las suspensiones o en formulaciones en disolución terapéuticas también pueden contener uno o más excipientes. Los excipientes son muy conocidos en la técnica e incluyen tampones (p. ej., tampón citrato, tampón fosfato, tampón acetato y tampón bicarbonato), aminoácidos, urea, alcoholes, ácido ascórbico, fosfolípidos, proteínas (p. ej., albúmina del suero), EDTA, cloruro de sodio, liposomas, manitol, sorbitol, y glicerol. Las disoluciones o suspensiones se pueden encapsular en liposomas o microesferas biodegradables. La formulación se proporcionará generalmente en una forma sustancialmente estéril empleando procedimientos de fabricación estériles.

Esto puede incluir la producción y esterilización por filtración del disolvente/solución tamponado utilizado para la formulación, la suspensión aséptica del anticuerpo en la solución disolvente tamponada, y la distribución de la formulación en receptáculos estériles mediante métodos conocidos para los expertos en la técnica.

La formulación nebulizable según la presente descripción puede ser proporcionada, por ejemplo, en forma de unidades de dosis unitaria (p. ej., recipientes de plástico o viales sellados) envasados en sobres de aluminio. Cada vial contiene una dosis unitaria en un volumen, p. ej., de 2 ml de disolvente/disolución tampón.

Los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden ser adecuados para administración mediante nebulización.

Está previsto también que el anticuerpo de la presente invención pueda administrarse empleando genoterapia. Para conseguir esto, se introducen en un paciente secuencias de ADN que codifican las cadenas pesada y ligera de la molécula de anticuerpo bajo el control de componentes de ADN apropiados de manera que las cadenas de anticuerpo se expresan en las secuencias de ADN y se ensamblan in situ.

La presente invención proporciona además una molécula de anticuerpo para su empleo en el control de enfermedades inflamatorias. Preferiblemente, la molécula de anticuerpo puede utilizarse para reducir el proceso inflamatorio o para prevenir el proceso inflamatorio.

La presente invención además proporciona la molécula de anticuerpo de la presente invención para su empleo en el tratamiento o profilaxis de un trastorno patológico que está mediado por IL-17A e/o IL-17F o está relacionado con un aumento en la concentración de IL-17A e/o IL-17F. Preferiblemente, el proceso patológico se selecciona del grupo consistente en infecciones (vírica, bacteriana, micótica y parasitaria), choque endotóxico relacionado con infección, artritis, artritis reumatoide, artritis psoriásica, artritis idiopática juvenil generalizada (JIA), lupus eritematoso diseminado (SLE), asma, enfermedad obstructiva crónica de las vías respiratorias (COAD), neumopatía obstructiva

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figuras 1a y 1b. En el anticuerpo CA028_00496.g3 la secuencia de la región variable de la cadena pesada es la misma que la del anticuerpo CA028_00496 original. En cambio, la región variable de la cadena ligera difiere en 5 aminoácidos. Los cinco restos que difieren entre la cadena ligera del anticuerpo CA028_00496 y del anticuerpo CA028_00496.g3 están subrayados en la figura 1a.

Ejemplo 2: Biacore

Como se describe a continuación, el formato de ensayo fue captura del anticuerpo CA028_00496.g3 por un anticuerpo específico para IgG Fc anti-humano inmovilizado, seguido de valoración de IL-17A humano e IL-17F humano sobre la superficie capturada.

análisis por interacción Se llevó a cabo análisis por interacción biamolecular utilizando un Biacore 3000 (Biacore AB). Los análisis se llevaron a cabo a 25°C. Fc específico de IgG anti-humano en cabra del fragmento F(ab')2 Affinipure (Jackson ImmunoResearch) se inmovilizó en un CM5 Sensor Chip (Biacore AB) mediante química de acoplamiento de aminas hasta un nivel de aproximadamente 6.000 unidades de respuesta (UR). Se utilizó tampón HBS-EP (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 0,15M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 0,005%, Biacore AB) como tampón corriente con un caudal de 10µl/minuto (min). Una inyección de 10 µl de CA028_00496.g3 a 0,5 µg/ml se utilizó para captura por el Fc de IgG anti-humana inmovilizado. IL-17A humana (generada en la propia empresa por UCB) se valoró sobre el CA028_00496.g3 capturado de 5nM a un caudal de 30 µl/min durante 3 min seguido de una disociación de 20 min. IL-17F humana (R&D systems) se valoró sobre el CA028_00496.g3 capturado de 10nM a un caudal de 30 µl/min durante 3 min seguido de una disociación de 5 min. La superficie se regeneró a un caudal de 10µl/min mediante una inyección de 10 µl de HCl 40 mM seguida de una inyección de 5 µl de NaOH 5 mM.

Tabla 1 Afinidad de CA028_00496.g3 contra IL-17F e IL-17A humanos

Ka (M-1s -1): Kd (s-1) KD (M) KD (pM)

hIL-17F: 2,49E+06 8,74E-05 3,51E-11 35

3,49E+06: 5,08E-05 1,46E-11 15

2,99E+06: 6,91E-05 2,31E-11 23

hIL-17A: 4,66E+06 2,04E-05 4,38E-12 4,4

4,52E+06: 8,66E-06 1,92E-12 1,9

4,59E+06: 1,45E-05 3,17E-12 3,2

Se analizaron curvas de unión sustraído el fondo dos veces referenciado empleando el programa informático BIAevaluation (versión 4.1) siguiendo procedimientos normalizados. Se determinaron parámetros cinéticos del algoritmo de ajuste. Los datos se detallan en la tabla 1, los valores promedio se destacan en gris.

El valor de la afinidad determinado para IL-17A que se une al anticuerpo original CA028_0496 fue 16 pM y 1.750 pM para IL-17F. En cambio, el anticuerpo CA028_0496 g3 mejorado tiene una afinidad por IL-17A de 3,2 pM y por IL17F de 23 pM. La afinidad del anticuerpo CA028_0496 por IL-17F se mejoró 70 veces sin reducir la afinidad del anticuerpo por IL-17A. De hecho, la afinidad por IL-17A se aumentó cinco veces.

La afinidad de CA028_0496 g3 por el heterodímero IL-17A/F aumentó también (se hizo como se describe en el documento WO2008/047134) donde se encontró que la afinidad era de 26 pM (datos no mostrados).

Ejemplo 3

La potencia de CA028_00496.g1 (previamente descrita en el documento WO2008/047134) y CA028_00496.g3 para la neutralización de IL-17F humano se determinó empleando un bioanálisis de células HeLa. Se obtuvieron células Hela del banco de células en ATCC (ATCC CCL-2). Se cultivaron células en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) enriquecido con suero de ternero fetal al 10%, penicilina, gentamicina y glutamina. Se colocaron 1x104 células en placas de 96 pocillos de cultivo hístico de fondo redondo. Se incubaron las células durante la noche y se lavaron una vez en tampón de ensayo. Se estimularon células HeLa con una combinación de IL-17F humano recombinado (125 ng/ml) y factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-α) (1 ng/ml) durante 48 horas en presencia de concentraciones variables de los anticuerpos. En la estirpe celular HeLa, IL-17F se sinergiza con TNF-alfa para estimular la producción de IL-6 que puede cuantificarse empleando un equipo de análisis de MSD específico. La cantidad resultante de IL-6 segregada se midió empleando la tecnología analítica Meso Scale Discovery (MSD) y

Claims

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